JP2020002181A - 膀胱癌処置のための処方物 - Google Patents

Abstract

【課題】膀胱癌処置のための処方物の提供。【解決手段】化学治療剤のプロリポソーム処方物およびリポソーム処方物を作製および使用するための組成物および方法を開示する。化学療法薬のプロリポソーム処方物およびリポソーム処方物ならびにかかる処方物を含む医薬および投薬形態を、膀胱癌および尿路上皮癌のための処置レジメンと共に使用することができる。それ故、本発明の処方物、医薬、および投薬形態は、膀胱内投与による膀胱癌の処置および尿路上皮癌の処置に適切である。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、いずれも２０１６年１月７日に出願された米国出願第６２／２７５，９４１号および同第６２／２７５，９３６号、ならびに２０１６年１１月１１日に出願された同第６２／４２１，１３７号への優先権を主張する。
発明の分野
本明細書中に記載の発明は、治療薬のプロリポソーム処方物およびリポソーム処方物、ならびに膀胱癌処置におけるその使用に関する。

背景
膀胱癌処置のための化学治療剤の投与は、一般に、尿道カテーテルを用いた膀胱内への薬物の直接膀胱内投与を含む。しかし、この化学療法薬投与アプローチは、膀胱癌を処置するためのパクリタキセル（タキソール（登録商標））などの化学療法薬の使用において問題がある（Ｈａｄａｓｃｈｉｋら、「Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ａｎｄ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｓ ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ」、ＢＪＵＩ．１０１：１３４７−１３５５（２００８）；Ｍｕｇａｂｅら、「Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ」、ＢＪＵＩ．１０３：９７８−９８６（２００８））。より具体的には、パクリタキセルは、例えば、膀胱内側のｐＨ環境（ｐＨ４．５〜８の範囲であり得る）で沈殿し、それにより、もはや生体利用できなくなる。パクリタキセルをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することができるが、膀胱癌処置の有効用量を溶液中に保持するためのＤＭＳＯの必要量は、薬学的に許容することができない。それ故、膀胱内投与することができ、且つ膀胱内側で沈殿しない安定な化学治療剤の処方物を処方することが必要である。薬物を沈殿させることなく広範なｐＨ値にわたって水性媒体中で分散することができる易流動性プロリポソーム粉末分散物に治療用量の化学治療剤を処方するための本明細書中に記載の組成物および方法によってこの要求が満たされる。

Ｈａｄａｓｃｈｉｋら、「Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ａｎｄ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｓ ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ」、ＢＪＵＩ．１０１：１３４７−１３５５（２００８）；Ｍｕｇａｂｅら、「Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ」、ＢＪＵＩ．１０３：９７８−９８６（２００８）

発明の概要
本発明は、化学治療剤のプロリポソーム処方物およびリポソーム処方物を作製および使用するための組成物および方法に関する。種々の態様では、本発明の組成物は、（ａ）タキサンまたはシスプラチン（化学治療剤として）、（ｂ）ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、および（ｃ）ジミリスチル（ｄｉｍｙｒｓｉｔｙｌ）ホスファチジルグリセロールナトリウム（ＤＭＰＧ）を含むプロリポソーム粉末分散物である。ａ：ｂ：ｃの重量比は１：（１．３〜４．５）：（０．４〜２．５）である。

本発明のいくつかの態様では、プロリポソーム粉末分散物中の化学治療剤はタキサンである。本発明の処方物を作製するために使用されるタキサンの例には、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、テセタキセル（ｔｅｓｅｔａｘｅｌ）、ＤＪ−９２７、ＴＰＩ２８７、ラロタキセル、オルタタキセル、ＤＨＡ−パクリタキセル、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例えば、タキサンは、（ａ）ドセタキセルであってよく、ａ：ｂ：ｃの重量比は１：（１．３〜２．０）：（０．４〜２．０）である。

他の態様では、化学治療剤はシスプラチンである。本発明のプロリポソーム分散物は、（ａ）シスプラチン、（ｂ）ＤＭＰＣ、および（ｃ）ＤＭＰＧに加えて、（ｄ）コレステロールも含むことができ、ａ：ｂ：ｃ：ｄの重量比は１：（２．５〜４．５）：（１．０〜２．５）：（０．５〜１）である。

本発明の種々の態様では、プロリポソーム粉末分散物は、（ａ）パクリタキセル、（ｂ）ＤＭＰＣ、および（ｃ）ＤＭＰＧを含むことができ、ａ：ｂ：ｃの重量比は１：（１．３〜３．８）：（０．４〜１．５）である。（ａ）タキサンまたはシスプラチン、（ｂ）ＤＭＰＣ、および（ｃ）ＤＭＰＧに加えて、本発明の処方物は、（ｄ）コレステロールを含むことができ、ａ：ｂ：ｃ：ｄの重量比は１：（１．３〜３．８）：（０．４〜１．５）：（０．５〜１）である。

いくつかの態様では、本発明は、任意の本発明のプロリポソーム粉末分散物および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物に関する。他の態様では、本発明は、任意の薬学的組成物を含む投薬形態に関する。

他の態様では、本発明は、タキサンまたはシスプラチンのリポソーム処方物を調製する方法に関する。リポソーム処方物を、任意の本発明のプロリポソーム粉末分散物を水性ビヒクルで水和することによって調製することができる。本発明の処方物を、撹拌（ｓｔｕｒｒｉｎｇ）、混合、および／または均質化によって第１の脂質および第２の脂質を水性ビヒクル中に分散して分散物を形成すること；第１の脂質および第２の脂質の分散物にタキサンまたはシスプラチンを添加すること；第１の脂質、第２の脂質、およびタキサンまたはシスプラチンの分散物を均質化してタキサンまたはシスプラチンを組み込んだリポソームを得ること；リポソームを均質化して分散物中にナノサイズのリポソーム粒子を得ること；ならびに抗凍結剤／凍結保護物質（ｃｒｙｏ／ｌｙｐｏｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を添加することによって調製することもできる。本発明のいくつかの態様では、分散物を凍結乾燥させてプロリポソーム粉末分散物を形成することができる。さらなる態様では、均質化工程を、高圧および／または脂質のＴｃ／Ｔｇより高い温度で行うことができる。

本発明のいくつかの態様では、本発明は、任意の本発明のリポソーム処方物を含む薬学的組成物に関する。

本発明はまた、患者に本発明の薬学的組成物を投与することによる、患者の膀胱癌を処置する方法に関する。いくつかの態様では、薬学的組成物を膀胱内送達によって投与することができ、癌は非筋肉侵襲性膀胱癌である。本発明の一定の態様では、タキサンまたはシスプラチンは、ｐＨ４．５〜８の任意のｐＨにて膀胱内で溶解したままである。

本発明は、さらに、患者に本発明の薬学的組成物を投与することによる、患者の上部尿路上皮癌を処置する方法に関する。いくつかの態様では、上部尿路上皮癌を処置するために、薬学的組成物を、尿管および／または腎盂内に投与することができる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
プロリポソーム粉末分散物であって、
（ａ）タキサンまたはシスプラチン、
（ｂ）ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、および
（ｃ）ジミリスチル（ｄｉｍｙｒｓｉｔｙｌ）ホスファチジルグリセロールナトリウム（ＤＭＰＧ）
を含み、
ａ：ｂ：ｃの重量比が１：（１．３〜４．５）：（０．４〜２．５）である、プロリポソーム粉末分散物。
（項目２）
（ａ）が、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、テセタキセル、ＤＪ−９２７、ＴＰＩ２８７、ラロタキセル、オルタタキセル、ＤＨＡ−パクリタキセル、およびその混合物からなる群から選択されるタキサンである、項目１に記載のプロリポソーム粉末分散物。
（項目３）
（ａ）がドセタキセルであり、ａ：ｂ：ｃの重量比が１：（１．３〜２．０）：（０．４〜２．０）である、項目１に記載のプロリポソーム粉末分散物。
（項目４）
（ａ）がシスプラチンであり、（ｄ）コレステロールをさらに含み、ａ：ｂ：ｃ：ｄの重量比が１：（２．５〜４．５）：（１．０〜２．５）：（０．５〜１）である、項目１に記載のプロリポソーム粉末分散物。
（項目５）
プロリポソーム粉末分散物であって、
（ａ）パクリタキセル、
（ｂ）ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、および
（ｃ）ジミリスチル（ｄｉｍｙｒｓｉｔｙｌ）ホスファチジルグリセロールナトリウム（ＤＭＰＧ）
を含み、
ａ：ｂ：ｃの重量比が１：（１．３〜３．８）：（０．４〜１．５）である、プロリポソーム粉末分散物。
（項目６）
（ｄ）コレステロール
をさらに含み、
ａ：ｂ：ｃ：ｄの重量比が１：（１．３〜３．８）：（０．４〜１．５）：（０．５〜１）である、項目１または項目５に記載のプロリポソーム粉末分散物。
（項目７）
項目１〜６のいずれか１項に記載のプロリポソーム粉末分散物および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物。
（項目８）
タキサンまたはシスプラチンのリポソーム処方物を調製する方法であって、項目１〜６のいずれか１項に記載のプロリポソーム粉末分散物を水性ビヒクル中で水和することを含む、方法。
（項目９）
タキサンまたはシスプラチンの処方物を調製する方法であって、
（ｉ）撹拌、混合、および／または均質化によって水性ビヒクル中で第１の脂質および第２の脂質を分散させて分散物を得る、分散させる工程；
（ｉｉ）タキサンまたはシスプラチンを前記第１の脂質および前記第２の脂質の分散物に添加する工程；
（ｉｉｉ）前記第１の脂質、前記第２の脂質、および前記タキサンまたはシスプラチンの分散物を均質化して前記タキサンまたはシスプラチンを組み込んだリポソームを得る、均質化する工程；
（ｉｖ）前記リポソームを均質化して前記分散物中にナノサイズリポソーム粒子を得る、均質化する工程；および
（ｖ）抗凍結剤／凍結保護物質を添加する工程
を含む、方法。
（項目１０）
（ｖｉ）前記分散物を凍結乾燥させてプロリポソーム粉末分散物を形成させる、凍結乾燥させる工程も含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
工程（ｉｉｉ）を、高圧および／または前記脂質のＴｃ／Ｔｇより高い温度で行う、項目９に記載の方法。
（項目１２）
項目８または９に記載の方法によって調製されたリポソーム処方物および少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物。
（項目１３）
患者の膀胱癌を処置する方法であって、前記患者に項目１２に記載の薬学的組成物を投与する工程を含み、前記薬学的組成物を膀胱内送達によって投与し、前記癌が非筋肉侵襲性膀胱癌である、方法。
（項目１４）
前記タキサンまたはシスプラチンが、ｐＨ４．５〜８の任意のｐＨにて膀胱内で溶解したままである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
患者の上部尿路上皮癌を処置する方法であって、前記患者に項目１２に記載の薬学的組成物を投与する工程を含み、前記薬学的組成物を尿管および／または腎盂内に投与する、方法。

図１は、実施例６のリポソーム調製方法を使用して調製したパクリタキセルが組み込まれたリポソームの光学顕微鏡下の顕微鏡写真を示す（バーは１００μｍを示す）。

図２は、実施例８で検討するように、１０ｍｇ／ｋｇのプロリポソーム膀胱内パクリタキセル処方物（ＰＬＩＰ−００１、図２中でＴＳＤ−００１と呼ぶ）、１５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、１５ｍｇ／ｋｇのアブラキサン、または生理食塩水で処置した０、７、および１４日目の動物の体重のグラフを示す。

図３は、１０ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１（ＰＬＩＰ−００１を図３中でＴＳＤ−００１と呼ぶ）、１５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、１５ｍｇ／ｋｇのアブラキサン、または生理食塩水の投与後１４日目の動物の平均体重を示す。

図４は、１０ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１（ＰＬＩＰ−００１を図４中でＴＳＤ−００１と呼ぶ）、１５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、１５ｍｇ／ｋｇのアブラキサン、または生理食塩水の投与後１４日目の動物の平均膀胱重量を示す。

図５は、動物への１０ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１（ＰＬＩＰ−００１を図５中でＴＳＤ−００１と呼ぶ）、１５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、１５ｍｇ／ｋｇのアブラキサン、または生理食塩水の投与後１４日目の平均腫瘍領域を示す。

図６は、動物への１０ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、１５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、１５ｍｇ／ｋｇのアブラキサン、または生理食塩水の投与後１４日目の組織学的方法を使用して測定した平均腫瘍領域を示す。

図７は、動物に０．５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１（ＰＬＩＰ−００１を図７中でＴＳＤ−００１と呼ぶ）、２．５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル（ＤＭＳＯ中に溶解した純粋なパクリタキセル）、または生理食塩水を２１日間投与した後の２１日目の平均腫瘍領域を示す。

図８は、処置２１日目の０．５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、２．５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１、および非処方パクリタキセルの膀胱内投与後の２１日目の血漿パクリタキセルレベルを示す。

図９は、単離雄ブタ膀胱（ｅｘ ｖｉｖｏ）へのＰＬＩＰ−００１およびアブラキサン投与後のクライオミクロトーム切片由来の組織中のパクリタキセル濃度を示す。

詳細な説明
本発明は、化学治療剤のプロリポソーム処方物およびリポソーム処方物を作製および使用するための組成物および方法に関する。本発明の処方物ならびにかかる処方物を含む医薬および投薬形態を、膀胱癌のための処置レジメンと共に使用することができる。本発明の処方物、医薬、および投薬形態は、膀胱ならびに尿管および腎盂への化学治療剤の投与に適切である。本発明の処方物、医薬、および投薬形態は、処方された化学治療剤が膀胱内環境に典型的なｐＨレベル（ｐＨ４．５〜８の範囲であり得る）の水性尿環境で沈澱するのを防止することができる。

種々の膀胱癌型（非筋肉侵襲性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）が含まれる）を、本発明の組成物および方法によって処置する。本発明のプロリポソーム処方物およびリポソーム処方物を使用して、尿路上皮癌（移行上皮癌とも呼ばれる）を処置することができる。尿路上皮癌は最も一般的な膀胱癌型であり、全膀胱癌症例の約９０％を占める。これらの癌は、通常、症例の約７５％が表在性であり、膀胱壁のより深層に進行しない。本発明の処方物を使用して、他の膀胱癌型（扁平上皮癌または腺癌など）を処置することもできる。

表在性腫瘍の大部分（すなわち、膀胱の粘膜および固有層に限定される表在性腫瘍）を、泌尿器科医は、膀胱鏡的手術および特定の症例の場合は膀胱内薬物治療によって処置する。これらの表在性膀胱癌は頻繁に再発し、多病巣性であり得るが、処置後の生存率は一般に良好である。しかし、癌腫が膀胱の筋肉壁を貫通している場合（すなわち、膀胱壁のより深層、おそらく、子宮、膣、または前立腺などの隣接器官に浸潤する筋肉浸潤性膀胱癌に癌が進行している場合）、予後は典型的には不良である。およそ５０％の筋肉浸潤性膀胱癌患者が転移性疾患を発症するであろう。このため、膀胱癌の有効な治療が必要であることは自明である。

プロリポソーム処方物およびリポソーム処方物
本発明の膀胱癌の処置方法は、リポソーム（水難溶性薬物組み込み済みリポソームが含まれる）の懸濁液を投与する工程を含む。リポソームはナノサイズのリポソームであり得る。リポソームは、化学治療剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）または化学治療剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）の組み合わせを組み込んでいる。リポソームは、本発明のプロリポソーム粉末分散物の水和によって調製することができる。プロリポソーム粉末分散物は、当該分野で公知のように、例えば、以下の実施例１〜４ならびに米国特許第９，４４５，９９５号および同第６，７５９，０５８号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のキャストフィルム法によって形成することができる乾燥粉末である。リポソーム処方物を、水性ビヒクルへのプロリポソーム粉末分散物の分散によって調製することができる。

リポソーム処方物を、以下の実施例６に記載の無有機溶媒法によって調製することもできる。一般に、第１の脂質および第２の脂質を、撹拌、混合、および／または均質化によって水性ビヒクル中に分散して分散物を形成させることができる。次いで、タキサンまたはシスプラチンを第１の脂質および第２の脂質の分散物に添加することができ、第１の脂質、第２の脂質、およびタキサンまたはシスプラチンの分散物を均質化してタキサンまたはシスプラチンを組み込んだリポソームを得ることができる。リポソームをさらに均質化して分散物中にナノサイズのリポソーム粒子を得ることができる。抗凍結剤／凍結保護物質を分散物に添加することができる。必要に応じて、分散物を凍結乾燥させてタキサンまたはシスプラチンのプロリポソーム粉末分散物を得ることができる。より一般的に、本方法を使用して、任意の脂質またはリン脂質と組み合わせた水難溶性薬物（例えば、タキサンまたはシスプラチン）の処方物を形成することができる。本発明の処方物の作製方法で使用することができる適切なリン脂質の例には、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＳＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ−ＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ｓｏｙ−ＰＣ）、ジミリストイル（ｄｉｍｙｒｓｉｔｙｌ）ホスファチジルグリセロールナトリウム（ＤＭＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジパルミトイルホスファート（ＤＰＰ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−グリセロール（ＤＳＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＳＧＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）、または上記リン脂質のいずれかの組み合わせが含まれる。

本発明のプロリポソーム粉末分散物およびリポソームは、第１のリン脂質であるジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および第２のリン脂質であるジミリスチル（ｄｉｍｙｒｓｉｔｙｌ）ホスファチジルグリセロールナトリウム（ＤＭＰＧ）を含むリン脂質成分を含む。

本発明のプロリポソーム粉末分散物は、少なくとも（ａ）化学治療剤、（ｂ）第１のリン脂質（ＤＭＰＣ）、および（ｃ）第２のリン脂質（ＤＭＰＧ）を含み、これらは相互に分散されており、水溶液との接触時にリポソームを形成する。例えば、プロリポソーム粉末分散物は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を、（１．０）：（１．３〜４．５）：（０．４〜２．５）の範囲の（ａ）：（ｂ）：（ｃ）重量／重量比で含み得る。プロリポソーム粉末分散物はまた、成分（ａ）〜（ｃ）に加えて、（ｄ）コレステロールを含むことができる。したがって、プロリポソーム処方物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を、（１．０）：（１．０〜４．５）：（０．１〜２．５）：（０．１〜２．０）の範囲の（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）重量／重量比で含み得る。

ＤＭＰＣおよびＤＭＰＧなどのリン脂質を水性環境に置いた場合、親水性頭部が直鎖状の立体配置に集合し、その疎水性尾部は本質的に相互に平行に整列する。次いで、疎水性尾部は水性環境を回避しようと試みるので、第２の分子の列は第１の列とテールが向かい合って整列する。水性環境（すなわち、二重層の端部での）との接触回避を最大にすると同時に表面積対体積比を最小にし、それにより、エネルギーが最小の配座を達成するために、リン脂質二重層またはラメラとして知られる２列のリン脂質はリポソームに収束する。その際、リポソーム（またはリン脂質球）はいくらかの水性媒体を捕捉し、球のコア内で任意の物質を水性媒体に溶解または懸濁することができる。この物質には、本発明のプロリポソーム粉末分散物の種々の成分（化学治療剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）など）が含まれる。

典型的には膀胱内への膀胱内送達による本発明の方法にしたがって化学治療剤の投与前に、化学療法薬を含むプロリポソーム粉末分散物を水または別の薬学的に許容され得る水性ビヒクル（例えば、生理食塩水）に水和し、その結果、リポソームが形成され、このリポソーム内に化学治療剤が封入される。水または水性ビヒクルに加えて、得られたリポソーム懸濁液は、凍結保護物質／抗凍結剤（ｌｙｏ／ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（マンニトール、スクロース、またはトレハロースなど）を含み得る。典型的には、リポソーム処方物の凍結保護物質／抗凍結剤成分の薬物成分とのｗ／ｗ比（凍結保護物質／抗凍結剤：薬物）は、約（０．５：１．０）〜（５．５：１．０）である。例えば、本発明の処置方法で用いるリポソーム懸濁液を、（ａ）化学治療剤、（ｂ）ＤＭＰＣ、および（ｃ）ＤＭＰＧを含むプロリポソーム粉末分散物と（ｅ）凍結保護物質／抗凍結剤とを（１．０）：（１．０〜４．５）：（０．１〜２．５）：（０．５〜５．５）で混合することによって調製することができる。

本発明のプロリポソーム処方物およびリポソーム処方物は、膀胱癌を処置するための当該分野で公知の種々の化学治療剤を収容することができる。本発明は、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル、ＤＪ−９２７、ＴＰＩ２８７、ラロタキセル、オルタタキセル、ＤＨＡ−パクリタキセル、カバジタキセル、およびテセタキセルが含まれる）、シスプラチン、またはその混合物、ならびに他の化学治療剤との組み合わせを収容するが、これらに限定されない。

例えば、タキサン誘導薬を含む本発明のプロリポソーム粉末分散物（「プロリポソーム膀胱内タキサン（ＰＬＩＴ）処方物」）は、（ａ）タキサン、（ｂ）第１のリン脂質（ＤＭＰＣ）、および（ｃ）第２のリン脂質（ＤＭＰＧ）を含み得る。プロリポソーム粉末分散物は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を、（１．０）：（１．０〜３．８）：（０．２〜１．５）；またはその間の任意の比から選択される（ａ）：（ｂ）：（ｃ）の重量／重量比で含むことができる。例えば、本発明のプロリポソーム分散物において、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）の重量／重量比は、それぞれ、（１．０）：（３．１５）：（１．００）；または（１．０）：（３．２０）：（１．０５）；または（１．０）：（３．２５）：（１．１０）；または（１．０）：（１．４３）：（０．５６７）のパクリタキセル：ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ比またはその間に含まれる任意の比であり得る。本発明のプロリポソーム粉末分散物は、表示の重量／重量比のうちのいずれか１つで、（ａ）タキサン、（ｂ）ＤＭＰＣ、および（ｃ）ＤＭＰＧから本質的になり得るか、これらの比のうちのいずれか１つでこれらの成分からなり得る。

本明細書中に記載のプロリポソーム粉末分散物はまた、タキサン、ＤＭＰＣ、およびＤＭＰＧに加えて、（ｄ）コレステロールを含み得る。したがって、本発明のプロリポソーム粉末分散物は、（１．０）：（１．０〜３．８）：（０．４〜１．５）：（０．５〜１）；またはその間に含まれる任意の比から選択される（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）重量／重量比であり得る。例えば、本発明のプロリポソーム粉末分散物は、（ａ）パクリタキセル、第１のリン脂質（ｂ）（ＤＭＰＣ）、第２のリン脂質（ｃ）（ＤＭＰＧ）、および（ｄ）（コレステロールである）を含み得、ここで、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）の重量／重量比は、（１．０）：（３．４０）：（１．２５）：（０．７０）；または（１．０）：（３．４５）：（１．３０）：（０．７５）；または（１．０）：（３．５０）：（１．３５）：（０．８０）；またはその間に含まれる任意の比である。本発明のプロリポソーム粉末分散物は、表示の重量／重量比のうちのいずれか１つで、（ａ）タキサン、（ｂ）ＤＭＰＣ、（ｃ）ＤＭＰＧ、および（ｄ）コレステロールから本質的になり得るか、これらの比のうちのいずれか１つでこれらの成分からなり得る。

あるいは、本発明のプロリポソーム処方物およびリポソーム処方物は、例えば、一般にシスプラチンとして公知のシス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を化学治療剤として含み得る。シスプラチンを含む本発明のプロリポソーム粉末分散物（「プロリポソーム膀胱内シスプラチン（ＰＬＩＣ）処方物」）は、（ａ）シスプラチン、（ｂ）第１のリン脂質（ＤＭＰＣ）、および（ｃ）第２のリン脂質（ＤＭＰＧ）を含み得る。シスプラチンのプロリポソーム粉末分散物は、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を、（１．０）：（２．５〜４．５）：（１〜２．５）；またはその間の任意の比から選択される（ａ）：（ｂ）：（ｃ）重量／重量比で含み得る。例えば、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）重量／重量比は、（１．０）：（２．７）：（１．２）；または（１．０）：（２．７５）：（１．２１）；または（１．０）：（２．７６）：（１．２２）；または（１．０）：（２．７７）：（１．２）；または（１．０）：（２．７８）：（１．２２）；またはその間に含まれる任意の比であり得る。（ａ）がシスプラチンであるプロリポソーム粉末分散物では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）重量／重量比は、（１．０）：（２．７）：（１．２）；または（１．０）：（２．７５）：（１．２１）；または（１．０）：（２．７６）：（１．２２）；または（１．０）：（２．７７）：（１．２）；または（１．０）：（２．７８）：（１．２２）；またはその間に含まれる任意の比であり得る。本発明のプロリポソーム粉末分散物は、表示の重量／重量比のうちのいずれか１つで、（ａ）シスプラチン、（ｂ）ＤＭＰＣ、および（ｃ）ＤＭＰＧから本質的になり得るか、これらの比のうちのいずれか１つでこれらの成分からなり得る。

本発明のプロリポソーム粉末分散物では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）重量／重量比は、（１．０）：（４．１）：（２．１）；または（１．０）：（４．１５）：（２．２５）；または（１．０）：（４．１６）：（２．２６）；または（１．０）：（４．１７）：（２．２７）；またはその間の任意の比であり得る。（ａ）がシスプラチンであるプロリポソーム分散物では、第１のリン脂質（（ｂ））はＤＭＰＣであり、第２のリン脂質（（ｃ））はＤＭＰＧであり、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）重量／重量比は、（１．０）：（４．１）：（２．１）；または（１．０）：（４．１５）：（２．２５）；または（１．０）：（４．１６）：（２．２６）；または（１．０）：（４．１７）：（２．２７）；またはその間に含まれる任意の比であり得る。本発明のプロリポソーム粉末分散物は、表示の重量／重量比のうちのいずれか１つで、（ａ）シスプラチン、（ｂ）ＤＭＰＣ、および（ｃ）ＤＭＰＧから本質的になり得るか、これらの比のうちのいずれか１つでこれらの成分からなり得る。

シスプラチンのプロリポソーム粉末分散物は、（ａ）シスプラチン、（ｂ）ＤＭＰＣ、および（ｃ）ＤＭＰＧに加えて、（ｄ）コレステロールを含み得る。かかるシスプラチンの処方物は、（１．０）：（２．５〜４．５）：（１．０〜２．５）：（０．５〜１）；またはその間に含まれる任意の比から選択される（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）重量／重量比を含み得る。（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）重量／重量比は、例えば、（１．０）：（２．７）：（１．２）：（０．６）；または（１．０）：（２．７５）：（１．２１）：（０．６５）；または（１．０）：（２．７６）：（１．２２）：（０．７）；または（１．０）：（２．７７）：（１．２）：（０．７５）；または（１．０）：（２．７８）：（１．２２）：（０．８）；または（１．０）：（２．７８）：（１．２２）：（０．９）；またはその間に含まれる任意の比であり得る。

本発明のプロリポソーム粉末分散物およびリポソーム処方物を、化学治療剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチンなど）を必要とする個体に投与される薬学的処方物または投薬形態で使用することができる。本発明の薬学的処方物または投薬形態を、膀胱癌を処置するために投与することができる。より具体的には、治療での適用において、薬学的処方物または投薬形態を、膀胱癌の全ての症状を除去するか、膀胱癌の症状の少なくとも１つを少なくとも部分的に緩和するのに十分な量で既に膀胱癌を罹患している個体に投与する。この用途に有効な化学治療剤の投薬量は、膀胱癌の病期、重症度、および経過、治療歴、個体の健康状態、体重、薬物に対する応答、ならびに／または担当医の判断に依存する。

以下の実施例１〜４に記載のように、化学治療剤のプロリポソーム粉末分散物を調製するために、化学治療剤（例えば、パクリタキセル）を脂質と共にエタノールに溶解することができ、ロータリーフラッシュエバポレーターを使用して薄膜に流延することができる。乾燥させた膜を、規定食塩液または水または任意の他の薬学的に許容され得る水性ビヒクルを使用して水和することができる。これにより、リポソーム分散物が得られる。次いで、リポソーム分散物を、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ（商標）−Ｃ５（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｃａｎａｄａ）または類似の高圧ホモジナイザーまたは所望の粒径を達成することができる当該分野で公知の適切な装置を使用して押し出すことができる。本発明のリポソームでは、粒子をナノサイズにすることができる。本発明のリポソームの粒径は、一般に、７００ｎｍまで（ｕｐ １０ ７００ ｎｍ）、５００ｎｍまで、２５０ｎｍまで、２００ｎｍまで、または１００ｎｍまでであり得る。

本発明のリポソーム分散物に、適切な賦形剤を外部から添加し、凍結乾燥させてプロリポソーム粉末分散物を得ることができる（すなわち、賦形剤を「外部から」添加する）。例えば、本発明のプロリポソーム粉末分散物を、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤と混合することができる。例示的な薬学的に許容され得る賦形剤には、（ａ）抗凍結剤、充填剤、または増量剤（例えば、マンニトール、デンプン、ラクトース（例えば、ラクトース一水和物）、スクロース、グルコース、トレハロース、およびケイ酸など）；（ｂ）結合剤（例えば、セルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｂｅｎｅｃｅｌ（商標）として市販されている）、ヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌ（商標）（Ａｓｈｌａｎｄ Ｉｎｃ−Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）として市販されている）が含まれる）、デンプン、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアゴムなど）、（ｃ）吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物など）が含まれるが、これらに限定されない。

膀胱内送達
本発明の処方物および投薬形態を使用して、治療用量の化学治療剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルなどのタキサン、および／またはシスプラチン）を膀胱に膀胱内送達させることができる。膀胱内治療は、尿道カテーテルの挿入によって治療剤を膀胱内へ直接点滴注入する工程を含む。典型的な膀胱内点滴注入プロトコールでは、無菌カテーテル留置を、直鎖状カテーテルまたはクーデ（男性）カテーテルを用いて行うことができる。膀胱を完全に空にする。挿入中のこぼれやはねを防止するためにシリンジの先端にアダプタを取り付ける処置を施したカテーテルチップシリンジを挿入することができる。あるいは、投薬バイアルに取り付けたプライミング済みチューブをカテーテルに挿入することができ、化学治療剤を、重力流または穏やかな注射によって点滴注入する。患者を痛みについて評価することができる。チューブをそのままにしてシリンジまたは投薬バイアルを除去することができる。カテーテルを圧迫して閉じ、カテーテルまたはプラグカテーテルを、任意の液滴を吸収させるための滅菌カーゼを使用して表示のように除去する。患者が溶液の保持に問題を有する場合、フォーリーカテーテルを使用することができ、化学治療剤が膀胱内に規定の時間（通常、１〜２時間）留まるように点滴注入後にカテーテルのプラグをカテーテルの末端に挿入することができる。患者の動きやすさに応じて、カテーテルを所望の滞留時間の終了時に除去することができるか、患者を排尿バッグに連結して化学治療剤を排出することができる。カテーテルを適切に除去して破棄した時点で、会陰部を漏れについて調査し、患者を痛みについて再評価する。患者に１〜２時間の処置を維持しようとしていることを伝える。過去を鑑みて、患者は、横たわり、１５分毎に左側から右側に位置を変え、次いで、後ろに位置を変えてカテーテルから気泡を追い出して膀胱の全領域に接触して投薬を確実にするように指示されている。

膀胱内薬物送達デバイスおよびこのデバイスを膀胱内に配置する方法の例は、以下の米国特許出願に記載されている：米国特許出願公開第２０１５０１６５１７８号；同第２０１２／０２０３２０３号；同第２０１２／００８９１２２号；同第２０１２／００８９１２１号；同第２０１１／０２１８４８８号；同第２０１１／０２０２０３６号；同第２０１１／０１５２８３９号；同第２０１１／００６０３０９号；同第２０１０／０３３１７７０号；同第２０１０／０３３０１４９号；同第２０１０／０００３２９７号；同第２００９／０１４９８３３号；および同第２００７／０２０２１５１号（これらは全てその全体が本明細書中で参考として援用される）。

膀胱内送達に加えて、本発明の処方物および投薬形態を、当該分野で公知の適切なカテーテルデバイスおよびプロトコールを使用して尿管および／または腎盂に投与することができる。かかる化学治療剤の送達を使用して、例えば、上部尿路上皮癌を処置することができる。

本発明の処方物および投薬形態を薬物送達デバイスから送達させる場合、処方物および投薬形態を、種々の形態のデバイスに収容することができ、この種々の形態は、デバイスがプロリポソーム粉末分散物、リポソーム処方物、薬学的処方物、および投薬形態を膀胱内の尿中および／または腎臓系の他の部分に放出する特定の機構に依存し得る。投薬形態は、デバイスを使用する前に有利に化学治療剤の安定な貯蔵を容易にすることが可能であり、且つ薬剤が溶液または懸濁液の形態で収容される場合に可能な体積より小さな体積で化学治療剤を有利に貯蔵することが可能である固体、半固体、または他の非液体形態（例えば、粉末または圧縮粉末）であり得る。

本発明の処方物を使用する場合、化学治療剤は、膀胱内送達後にヒト尿中にて典型的な尿ｐＨ４．５〜８で溶解したままであり得る。さらに、本発明の処方物は、化学治療剤を膀胱壁に接着させ、化学療法薬は排尿中に３日間まで維持され得る。

非経口投与
本発明のプロリポソーム粉末分散物、リポソーム処方物、薬学的処方物、および投薬形態を使用して、患者への治療用量のタキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）またはシスプラチンの非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）送達用の組成物として調製することができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、筋肉内、脳室内、または皮下への各投与経路が含まれる。

注射用組成物を、従来の形態で、溶液もしくは懸濁液、注射前に液体で溶液または懸濁液にするのに適切な固体形態、または乳液のいずれかとして調製することができる。注射液、溶液、および乳液は、１つまたは複数の賦形剤も含み得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールである。さらに、必要に応じて、投与すべき薬学的組成物は、少量の非毒性補助剤（湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤、および他の薬剤（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアート、およびシクロデキストリンなど）など）も含み得る。

当該分野で公知の適切な薬学的賦形剤を本発明のプロリポソーム粉末分散物と組み合わせて、薬学的処方物または投薬形態を作製することができる。

併用処置
本発明のプロリポソーム粉末分散物、リポソーム処方物、薬学的処方物、および投薬形態を、化学療法に関連する有害作用（嘔気、嘔吐、無食欲、下痢、味覚喪失、脱毛の可能性（ｈａｉｒ ｌｏｓｓ ｍａｙ ｏｃｃｕｒ）、手足のしびれ感／刺痛／冷感／青変、腕または脚の痛み／発赤／腫脹、反射消失、平衡感覚の喪失、歩行困難、筋肉の痙攣／攣縮／脱力、頸部痛または背部痛、口腔または舌の痛み、関節痛、脚または足のむくみ、精神的／気分の変化、頭痛、頻脈／不整脈、血尿、コーヒー残渣様吐物、黒色便または血便、排尿痛または排尿困難、腰痛または脇腹痛（ｓｉｄｅ ｐａｉｎ）、または視力変化（例えば、視朦、色彩の識別困難（ｓｅｅｉｎｇ ｃｏｌｏｒｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ））が含まれる）の重症度を低下させるか排除する他の治療剤と組み合わせて投与することができる。

場合によっては、本発明のプロリポソーム粉末分散物、薬学的処方物、および投薬形態を別の治療剤と共に投与することが適切である。例えば、パクリタキセルプロリポソーム粉末分散物を、膀胱癌処置のための併用治療の一部として投与される薬学的処方物または投薬形態（ゲムシタビンが含まれる）中で使用することができる。本発明のシスプラチンプロリポソーム粉末分散物を、膀胱癌処置のための併用治療の一部として投与される薬学的処方物または投薬形態（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）が含まれる）中で使用することができる。パクリタキセルプロリポソーム粉末分散物を、併用治療の一部として投与される薬学的処方物または投薬形態（プロリポソームシスプラチン処方物が含まれる）中で使用することもできる。

併用療法を使用する場合、他の薬剤は同一の薬学的組成物中に含めて投与する必要がないが、物理的特徴および化学的特徴が異なるので、異なる経路によって投与することができる。例えば、最初の投与を確立されたプロトコールにしたがって実施することができ、次いで、認められた効果、投薬量、投与様式、および投与のタイミングに基づいて、さらに修正することができる。

複数の治療剤を、癌の病期および型、患者の状態、および使用される化合物の実際の選択に応じて、併用して（例えば、同時に、本質的に同時に、または同一の処置プロトコール内で）投与することができる。処置プロトコール中の各治療剤の投与順序および投与を繰り返す回数の決定は、処置される疾患および個体の状態の評価に基づき得る。

かかる組み合わせの各化学治療剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）を、個別の薬学的処方物または組み合わせ薬学的処方物に含めて連続的または同時に投与する。例えば、各治療剤を、組み合わせ薬学的処方物に含めて同時に投与することができる。当業者は、公知の治療剤の適切な用量を認識しているであろう。

本発明の組み合わせを、薬学的に許容され得る希釈剤またはキャリアと共に薬学的組成物の形態で使用するために都合よく提供することができる。

実施例
以下の実施例１〜４は、プロリポソーム膀胱内パクリタキセル（ＰＬＩＰ）処方物（それぞれ、ＰＬＩＰ−００３、ＰＬＩＰ−００６、ＰＬＩＰ−０２１、およびＰＬＩＰ−０２３）の調製を記載する。前述のＰＬＩＰ処方物を、表１〜４にそれぞれ記載の各処方物の全ての薬物および脂質成分を共に、５０℃の水浴中に配置することによって５００ｍＬ丸底フラスコ中の１０ｍＬのエタノールに溶解することによって調製した。減圧下でロータリーフラッシュエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ）を使用して乾燥させることによって脂質成分およびエタノールの混合物から薄膜に流延した。薄膜を、減圧下（１５０〜２００ｍｂａｒ）で室温にて一晩完全に乾燥させた。薄膜を、フラスコを５０℃の水浴に配置することによって２０ｍＬの生理食塩水を使用して水和した。フラスコを、Ｂｕｃｈｉロータリーフラッシュエバポレーターを使用して回転させて、リポソーム分散物を形成させた。次いで、分散物を、室温にてＮａｎｏ ＤｅＢｅｅ（登録商標）高圧ホモジナイザーを使用して高圧下で均質化して１００〜２００ｎｍの範囲の粒子サイズの単層リポソームを得た。次いで、調製した分散物を、ＥｍｕｓｉＦｌｅｘ（登録商標）−Ｃ５ホモジナイザーを使用して押し出した。１μｍから０．２μｍに減少したサイズの孔径を有するポリカーボネートメンブレンを使用して押し出した。この最終押し出し物に、それぞれ表１〜４に記載の量のマンニトールを添加し、混合物を凍結乾燥させてプロリポソーム粉末分散物を得た。

実施例１．ＰＬＩＰ−００３。

実施例２．ＰＬＩＰ−００６。

実施例３．ＰＬＩＰ−０２１。
表３

実施例４．ＰＬＩＰ−０２３。

実施例５．ＰＬＩＰ−００３、ＰＬＩＰ−００６、ＰＬＩＰ−０２１、およびＰＬＩＰ−０２３の有効度のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイベースのアプローチを使用して、ヒト膀胱上皮癌細胞株Ｔ２４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−４（商標））、５６３７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−９（商標））、およびＨＴ−１３７６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４７２（商標））に対するパクリタキセル処方物（ｆｏｒｍｕｌ ｔｉｏｎｓ）（ＰＬＩＰ−００３、ＰＬＩＰ−００６、ＰＬＩＰ−０２１、およびＰＬＩＰ−０２３）の阻害濃度（ＩＣ）_５０を決定した。アッセイで使用するために、パクリタキセル処方物を、２〜５ｍｇ／ｍＬのパクリタキセル濃度まで規定食塩液に再分散させた。分散処方物は、透明な溶液を形成した。純粋な、非処方のパクリタキセル溶液（６ｍｇ／１００μＬのＤＭＳＯ溶液）を、コントロール処方物として使用した。

細胞を５×１０^３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間培養した。分散パクリタキセル処方物および純粋な薬物コントロールを、プレートした細胞培養培地に添加した。処方物での処置の７２時間後、培地を吸引した。処置した細胞を、各ウェル中に１００μｌの１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）をおだやかに添加することによって固定し、プレートを４℃で少なくとも１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェル中に水を直接流すことなくプレートを水道水で５回洗浄し、プレートを室温で風乾し、５０μｌの０．４％ｗ／ｖ ＳＲＢ（１％酢酸溶液）を各ウェルに添加した。プレートを、ＳＲＢ溶液中にて室温で２０〜３０分間インキュベートした。その後、プレートを１％酢酸で５回洗浄し、室温で風乾した。タンパク質結合ＳＲＢを、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基溶液を各ウェルに添加し、５〜１０分間Ｔｒｉｓ溶液にＳＲＢを溶解することによって検出した。プレートを、マイクロプレートリーダーを使用して、５６５ｎｍの吸光度を読み取った。表５にＰＬＩＰ−００３、ＰＬＩＰ−００６、ＰＬＩＰ−０２１、ＰＬＩＰ−０２３、および非処方パクリタキセルのＩＣ５０値を報告する。

実施例６．ナノサイズの水難溶性薬物組み込み済みリポソーム小胞の別の調製方法を以下に示した。
１．脂質成分ＤＭＰＣおよびＤＭＰＧを秤量し、水性媒体に移した；
２．水性媒体を、脂質成分のＴｃ／Ｔｇより高い温度で保持した；
３．この脂質を、脂質混合物を静置するか、撹拌、混合、および／または均質化することによって水和した；
４．水難溶性薬物（修飾タキサン（パクリタキセルなど）または白金含有薬物（シスプラチンなど））を脂質分散物に添加し、薬物と脂質との混合物を撹拌し続けた；
５．リポソームを得るために、脂質＋薬物含有分散物を、高圧および脂質のＴｃ／Ｔｇより高い温度で均質化した。薬物がリポソームに組み込まれるまで均質化し続けた。顕微鏡下で任意の薬物結晶の不在についてリポソームを観察することによって薬物の組み込みを確認した；
６．薬物が組み込まれた時点で、ナノサイズの薬物が組み込まれたリポソーム小胞を得るために、その後の均質化を脂質のＴｃ／Ｔｇより僅かに高温、Ｔｃ／Ｔｇ、またはＴｃ／Ｔｇ未満で行った；
７．適切な抗凍結剤／凍結保護物質をリポソーム小胞に添加後、凍結乾燥させて、薬物が負荷されたプロリポソームを得た。

前述のナノサイズの薬物組み込み済みリポソーム小胞の別の調製方法の利点には、有機溶媒または刺激の強い溶媒（エタノール、クロロホルム、および／またはエーテルなど）が不必要なことが含まれる。さらに、本方法は、このプロセスに関与する単位操作数および／または装置数がより少ない。本方法はまた、実施例１〜４に記載のキャストフィルム法と比較して、薬物組み込み済みリポソーム小胞を得るために必要な時間が有意に少ない（２日間と比較して２時間の調製時間）。本方法のプロセスは、簡潔、迅速、且つ経済的である。

実施例７．ＰＬＩＰ−００１。実施例６に記載のナノサイズの水難溶性薬物組み込み済みリポソーム小胞の別の調製方法を使用して、表６に記載の成分を含むパクリタキセル処方物ＰＬＩＰ−００１を調製した。ＰＬＩＰ成分の量を、重量／重量比に基づくＰＴＸの量に比例して調整することができる。

実施例８．同所性マウスモデルにおけるヒト膀胱癌に対するＰＬＩＰ−００１の有効性評価。パクリタキセル（ＰＴＸ）は、転移性膀胱癌に対する活性が高い；したがって、ＰＴＸは、ＮＭＩＢＣの再発および進行を防止するためのアジュバント膀胱内治療の潜在的な候補である。ＰＴＸは親油性である。既存の処方物（例えば、タキソール／アブラキサン（登録商標））は、酸性の膀胱内水性環境で不溶である。適切に処方された場合、ＰＴＸが親油性を示すことは、尿路上皮の透過および粘膜下送達につながる可能性がある。以下の研究は、ＰＬＩＰ−００１処方ＰＴＸの膀胱への首尾の良い送達、ならびにＰＬＩＰ−００１についてのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの概念実証を示す。

同所性マウスモデルを利用して、パクリタキセルのプロリポソーム処方物を評価した。これらの研究のために膀胱癌細胞株ＫＵ７／ＧＦＰクローン６を使用した。ＫＵ７／ＧＦＰクローン６を緑色蛍光タンパク質で安定にトランスフェクトし、全てのｉｎ ｖｉｖｏ研究のためにこれらの細胞株を使用した。ＫＵ７／ＧＦＰクローン６細胞株は、Ｗａｔａｎａｂｅらに記載されている。細胞を、１０％ＦＣＳを補足した改変最小必須培地で成長させ、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。ＫＵ７／ＧＦＰ細胞由来の腫瘍をｉｎ
ｖｉｔｒｏで生成させた。腫瘍を、雌マウスの膀胱に移植した。ＫＵ７／ＧＦＰ腫瘍移植の７日後、マウスを、以下のいずれかを投与した４つの試験治療群に分けた：１０ｍｇパクリタキセル／ｋｇ体重（１０ｍｇ／ｋｇ）（ＰＬＩＰ−００１として投与）（群１）；１５ｍｇ／ｋｇ（ＰＬＩＰ−００１として投与）（群２）；１５ｍｇ／ｋｇ（アブラキサン（登録商標）、Ｃｅｌｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のパクリタキセルのナノ粒子アルブミン結合形態として投与）（群３）；または生理食塩水（群４）。前述の処方物および生理食塩水を、腫瘍移植後０日目、７日目、および１４日目に投与した。

表７、８、および９は、それぞれ、処置０、７、および１４日目の各群１〜４の動物の体重および平均体重値を示す。図２は、処置０、７、および１４日目の動物の体重のグラフを示す。

処置１４日目に測定した群１〜４の処置マウスの膀胱重量（Ｂ−Ｗ）を表１０に報告する。群の膀胱重量比較のための統計解析を表６に報告し、処置群の膀胱サイズを表１１に報告する。
（表中、^＊は膀胱外部の腫瘍の存在を示し、これはマウスに癌細胞を接種した時の膀胱穿孔によって生じたものと考えられる。腫瘍が膀胱外部にある場合、化学治療薬の膀胱内投与は腫瘍に有効でないと予想される）。

実施例９．腫瘍領域の測定によるパクリタキセルのプロリポソーム処方物の有効性評価。ＫＵ−７−ＧＦＰヒト膀胱癌同所性ＭｅｔａＭｏｕｓｅ（登録商標）モデル：ＧＦＰ発現ヒト膀胱癌細胞株ＫＵ−７を、ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｉｎｃ．細胞株バンクから入手した。ＫＵ−７−ＧＦＰ膀胱癌細胞を使用した膀胱内点滴注入によって動物に移植した。ケタミン、アセプロマジン、およびキシラジンの混合物を使用して動物を麻酔した。外科領域を、ヨウ素およびアルコールで滅菌した。下正中線腹部切開後の膀胱の適切な露呈後、膀胱に２４−Ｇ血管カテーテルを留置し、排液し、針で膀胱内膜を引っ掻くことによって損傷させた。ＫＵ−７−ＧＦＰ（１００μｌ ２×１０^６）細胞を膀胱内に点滴注入し、細胞を１時間留まらせるために巾着縫合（ｐｕｒｓｅ ｓｔｒｉｎｇ）で尿道を閉塞した。次いで、膀胱を腹腔に戻した。腹壁の切開部を６−０縫合糸で一層に閉じた。手術中、動物をイソフルラン麻酔下に保持した。上記の全操作手順を、７倍の顕微鏡下（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で行った。動物を、ＨＥＰＡ濾過下の遮蔽施設で保持した。

腫瘍細胞移植の７日後、５０匹の動物を、５つの群（各処置群のマウスはｎ＝１０であった）に無作為に分けた。全群の全マウスへの処置を同日に開始し、この日を研究０日目と見なした。表１３および１４は研究デザインを示す。新たに再構成した処方物（５０μＬ）を、２４Ｇ／３／４インチのＩＶカテーテルを使用して膀胱内に点滴注入し、巾着縫合を使用して尿道を閉塞した。処方物を膀胱内に１時間保持した。１時間後、巾着縫合を切開し、膀胱を自然に空にした。０、７、１４、および２１日目において同一の手順に従った。

結果：プロリポソームパクリタキセル（ＰＬＩＰ）処方物で処置した動物は、生理食塩水群と比較して膀胱腫瘍領域の減少が認められた。純粋薬物処理群は、（ＤＭＳＯでの）溶解状態の薬物の過剰な曝露によって６匹を失い、これらの動物は全身毒性を生じた可能性がある。図８は、平均血漿レベルを示す。この平均血漿レベルは、ＰＬＩＰ群における薬物の体循環への曝露が最少である一方で、ＤＭＳＯに溶解した純粋な薬物ではパクリタキセルの血漿レベルが著しいことを示し、この著しいレベルは膀胱癌の処置には望ましくない。より低い用量に基づいて、より高い用量について研究し、市販品アブラキサン（登録商標）と比較した。１０ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ処方物は、１５ｍｇ／ｋｇのアブラキサンと類似の効果を示した。ＰＬＩＰ処方物の用量を増加させると、腫瘍領域がいくらか減少した（図５、６、および７）。
（表中、^＊は膀胱外部の腫瘍を示す）。

実施例１０．以下の研究デザイン２のマウスにおける転移を評価した：群１（１０ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１）、群２（１５ｍｇ／ｋｇのＰＬＩＰ−００１）、および群３（１５ｍｇ／ｋｇのアブラキサン）。表１８、１９、および２０は、以下の器官の転移の発生を示す：肝臓、腸間膜、横隔膜、および腎臓。
（ＥＶ＝膀胱外突出、すなわち、膀胱外部に存在する腫瘍）

実施例１１．パクリタキセル（ＰＴＸ）は、転移性膀胱癌に対する活性が高く、したがって、ＰＴＸはＮＭＩＢＣの再発および進行を防止するためのアジュバント膀胱内治療の潜在的な候補である。ＰＴＸは親油性である。既存の処方物（例えば、タキソール／アブラキサン）は、典型的には酸性の膀胱内水性環境で不溶である。適切に処方された場合、ＰＴＸが親油性を示すことは、尿路上皮の透過および粘膜下送達につながる可能性がある。本研究の目的は、ＰＴＸの膀胱への首尾の良い送達（リポソームを使用）ならびにＰＬＩＰのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの概念実証を証明することであった。

ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膀胱癌細胞株（Ｔ２４、ＫＵ７）を使用して、ＩＣ５０値を評価した。ＫＵ７−ＧＦＰ細胞株を接種したヌードマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏ研究を行った。ＫＵ７膀胱腫瘍接種後、毎週（３回）膀胱内点滴注入（３群：ＰＬＩＰ；ＰＴＸ／ＤＭＳＯ、またはＰＴＸ／Ｎａｂ；または生理食塩水）を行い、腫瘍成長を測定した。ラット種において薬物動態学研究を行った。ラット種におけるＧＬＰ遵守急性拡大毒性学／トキシコキネティクス研究も行った。ｅｘ ｖｉｖｏブタ膀胱モデルおよびＰＴＸ組織中濃度の比較（ＰＬＩＰ対アブラキサン）を行った。

研究番号１の結果：Ｔ２４ヒト膀胱癌のＩＣ５０は、ＰＬＩＰにおいては０．０１未満であるのに対し、アブラキサンＰＴＸ処方物においては０．５μｇ／ｍＬ超であった。ＰＬＩＰは、生理食塩水と比較して腫瘍サイズを有意に減少させ、且つ完全応答率を改善するのに有効であった（図７／表２２）。ＰＬＩＰは、ＰＴＸへの全身曝露が非常に減少し、ＰＴＸ／ＤＭＳＯより死亡率が低かった。ｅｘ ｖｉｖｏ単離ブタ膀胱モデルでは、ＰＬＩＰ（アブラキサンと比較して）は、全身曝露および関連する毒性を生じることなく膀胱内リポソームから膀胱の尿路上皮層および尿路上皮下層へのパクリタキセルの優れた移行を可能にする。図９を参照のこと。
（本表中の^＊は、生理食塩水コントロールと比較した統計的に有意な（ｐ＜０．０５）相違を示していた）

これらのデータは、ＰＬＩＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下にてヒト尿中で安定であり、試験したヒト膀胱腫瘍細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで活性が高く、アブラキサンと比較して高い濃度のＰＴＸを尿路上皮組織に送達させ、ＰＴＸの全身レベルを無視できることを証明している。

実施例１２．ブタ膀胱を使用したｅｘ ｖｉｖｏ接着／融合／輸送研究。実験：新鮮なブタ膀胱を食肉処理場から入手し（ｎ＝３）（雄）、いかなる残尿も排出した。切除した膀胱を、冷クレブス緩衝液で洗浄した。次いで、切除した膀胱を、冷タイロード緩衝液で洗浄し、実験開始までこの緩衝液中で保存した。膀胱を、５ｍＬのタイロード緩衝液（３７℃）を使用して尿道を通してリンスした。凍結乾燥したＰＬＩＰおよびアブラキサン処方物（６ｍｇ）を、５ｍＬのタイロード緩衝液（３７℃）で再構成した。処方物（５ｍＬ）を、尿道を通して膀胱内に添加した。添加直後に、０．５ｍＬの投与した処方物を取り出して（ａｓ ｗｉｔｈｄｒａｗｎ）ゼロ時間（Ｔ０）サンプルを評価した。次いで、膀胱を、水浴振盪機中の１５０ｍＬのタイロード緩衝液（３７℃）中に２時間置いた。２時間後、膀胱の内容物を空にし、分析のためにサンプルを回収した。膀胱を５ｍＬのタイロード緩衝液（３７℃）でリンスし、分析のためにサンプルを回収した（この工程を２回行った）。膀胱を切開し、小片を切り出した（１〜２ｇ）。組織の一片をクライオミクロトーム切削法のために使用した。クライオミクロトームを−１５℃で実施し、１０×５０μｍ切片を抽出のためにエッペンドルフチューブ中に回収した。筋層に到達するまで切片を切断した（薄片にするのは非常に困難であった）。切片または全体を、メタノールを使用して抽出し、処方物のアッセイで使用したＨＰＬＣ法を使用して分析した。結果は、ＰＬＩＰが尿路上皮層を貫通し、アブラキサンよりも（ｔｈａｔｎ）良好に薬物を送達させることができることを示した（図９）。しかし、２，５００μｍの尿路上皮層を超えた薬物レベルは認められなかった。固有層の深さは２，５００μｍである。ＰＬＩＰ処方物はパクリタキセルを膀胱の非筋層の解剖学的限界に送達して、この薬物のいかなる全身曝露も示すことなく腫瘍成長を防止するので、これは重要な本発明の特質である。

実施例１３．雌スプレーグ・ドーリーラットにおける薬物動態学研究。雌スプレーグ・ドーリーラットの膀胱における単回膀胱内投与後のＰＬＩＰ対アブラキサン（登録商標）の血漿ＰＫプロフィールおよび膀胱濃度の評価を行った。ＰＬＩＰおよびアブラキサンを２時間にわたる膀胱内点滴注入のために１回投与し、投与２４時間後に観察した（表２３）。
^＊標的用量は、平均体重（およそ０．３００ｋｇ／ラット）に基づいた。

動物に、イソフルラン麻酔下にて膀胱内尿道カテーテルを使用した膀胱内への低速ボーラス点滴注入を介してＰＬＩＰまたはアブラキサン（登録商標）を投与し、その後に２時間膀胱に留まらせた。２時間という曝露期間は、技術的に実現が可能であることに基づいており、ラットの尿排出量に基づいて最大投与体積を考慮したものであった。投与／保持期間後、腹壁を介して膀胱を穏やかに圧迫することによって投与処方物を膀胱から排出させた。この研究中、評価項目は、死亡率のチェックおよび臨床的観察であった。ＰＫ分析のための血漿サンプルを、１日目に以下の標的時点で回収した：投与前ならびに点滴注入開始から１、２、３、４、６、および２４時間後。２４時間後、膀胱を回収し、パクリタキセル濃度分析のために急速凍結した。

死亡率や臨床的観察に対してＰＬＩＰに関連する効果はなかった。３ｍｇ／ｍＬ（１．５ｍｇ／動物）の濃度での保持時間２時間のＰＬＩＰの単回の膀胱内点滴注入により、全ての処置動物において血漿パクリタキセルは定量不可能なレベルであった（定量下限［ＬＬＯＱ］＝１ｎｇ／ｍＬ）。２匹の動物における濃度が、それぞれ、点滴注入開始から２．１７時間後に１．０４ｎｇ／ｍＬおよび点滴注入開始から３時間後に１．７６ｎｇ／ｍＬであったことを除いて、アブラキサン（登録商標）比較対照群において同一の用量（１．５ｍｇ／動物）で類似の結果が得られた。これらの所見は、ＰＬＩＰはラットにおける最大実現可能用量を膀胱内投与経路で投与した場合に全身に生物学的に利用されないという結論を支持している。

点滴注入開始から６時間後および２４時間後の膀胱組織分析の結果は、ＰＬＩＰまたはアブラキサン（登録商標）のいずれかの後に膀胱内へパクリタキセルが取り込まれること示した；しかし、６時間後の結果は各処置群内で変動があった。６時間後の膀胱中のパクリタキセル濃度は、４匹のＰＬＩＰ処置動物のうちの１匹および４匹のアブラキサン（登録商標）処置動物のうちの３匹においておよそ３００ｎｇ／ｇの範囲であった。ＰＬＩＰ群内で、６時間後の全処置動物のうちの１匹の動物の膀胱パクリタキセル濃度が最も低く（おおよそ４０ｎｇ／ｇ）、それに対して、この群の２匹の動物はおよそ１８００〜１９００ｎｇ／ｇの範囲の値であった。アブラキサン（登録商標）処置群において、１匹の動物の膀胱濃度がおおよそ８５００ｎｇ／ｇである一方で、残りの３匹の動物は全て３００ｎｇ／ｇの範囲であった。６時間後のデータの変動の理由は不明であるが、点滴注入物の排除を補助するための膀胱の機械的マッサージ後に膀胱内に残存する投与処方物に関連するのかもしれない。膀胱内面からの残存投与処方物の除去に役立つ尿流およびパクリタキセルの潜在的な代謝またはさらなる分布から予想されるように、点滴注入開始から２４時間後の膀胱パクリタキセル濃度は、６時間後より実質的に低かった。

実施例１４．プロリポソーム膀胱内シスプラチン（ＰＬＩＣ）処方物ＰＬＩＣ−００２の調製。１８．４ｍｇのシスプラチンを１５ｍＬの水に溶解することによってＰＬＩＣ−００２を調製した。シスプラチン水溶液を、室温で表２５に列挙した脂質成分を含む３ｍｌのエタノール溶液と合わせた。調製した分散物を、ＥｍｕｓｉＦｌｅｘ（登録商標）−Ｃ５ホモジナイザーを使用して押し出した。１μｍ〜０．２μｍに減少したサイズの孔径を有するポリカーボネートメンブレンを使用して押し出した。この最終押し出し物に、１００ｍｇのマンニトールを押し出し物と混合し、混合物を凍結乾燥させてプロリポソームを得た。

実施例１５．ＰＬＩＣ−００９の調製。９．８ｍｇのシスプラチンを１１ｍＬの生理食塩水に溶解することによってＰＬＣＰ−００９を調製した。シスプラチン水溶液を、室温で表２６中の脂質成分を含む４ｍｌのエタノール溶液と合わせた。次いで、調製した分散物を、ＥｍｕｓｉＦｌｅｘ（商標）−Ｃ５ホモジナイザーを使用して押し出した。１μｍ〜０．２μｍに減少したサイズの孔径を有するポリカーボネートメンブレンを使用して押し出した。この最終押し出し物に、２６ｍｇのマンニトールを押し出し物と混合し、混合物を凍結乾燥させてプロリポソームを得た。

実施例１６．シスプラチン（ＣＰＮ）プロリポソーム処方物の有効度のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイベースのアプローチを使用して、ヒト膀胱癌上皮細胞株Ｔ２４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−４（商標））、５６３７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−９（商標））、およびＨＴ−１３７６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４７２（商標））に対するシスプラチン処方物ＰＬＩＣ−００２およびＰＬＩＣ−００９の阻害濃度ＩＣ５０を決定した。本アッセイで使用するために、シスプラチン処方物を、２ｍｇ／ｍＬのシスプラチン濃度まで規定食塩液に再分散させた。再分散処方物は、透明な溶液を形成した。純粋なシスプラチン溶液１ｍｇ／ｍＬ規定食塩液（ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｌｉｎｅ）（非処方）を、コントロールとして使用した。シスプラチンが１ｍｇ／ｍＬ規定食塩液を超えると透明な溶液を形成しないと考えられるので、より高い濃度の純粋なシスプラチンを使用しなかった。

細胞を５×１０^３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間培養した。２ｍｇ／ｍＬのシスプラチン処方物および１ｍｇ／ｍＬの純粋な薬物コントロールを、１００μＬの用量のプレートした細胞培養培地に添加した。処方物での処置の７２時間後、培地を吸引した。次いで、処置した細胞を、各ウェル中に１００μｌの１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）をおだやかに添加することによって固定し、プレートを４℃で少なくとも１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェル中に水を直接流すことなくプレートを水道水で５回洗浄し、プレートを室温で風乾し、５０μｌの０．４％ｗ／ｖＳＲＢ（１％酢酸溶液）を各ウェルに添加した。プレートを、ＳＲＢ溶液中にて室温で２０〜３０分間インキュベートした。その後、プレートを１％酢酸で５回洗浄し、室温で風乾した。タンパク質結合ＳＲＢを、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基溶液を各ウェルに添加し、５〜１０分間Ｔｒｉｓ溶液にＳＲＢを溶解することによって検出した。プレートを、マイクロプレートリーダーを使用して、５６５ｎｍの吸光度を読み取った。表２７に、ＰＬＩＣ−００２、ＰＬＩＣ−００９、および純粋な薬物溶液のＩＣ５０値を報告する。

実施例１７．ドセタキセル処方物（ＤＴＬ−１０２７１６）の有効度のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析。

上記の実施例６と同一の方法を使用して、ドセタキセル処方物を調製した。処方物の平均粒径（ｐａｒｔｃｉｌｅ ｓｉｚｅ）（Ｚａｖｅ）は３８０ｎｍであった。上のパクリタキセルについて記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイベースのアプローチを使用して、ＫＵ−７細胞株に対するドセタキセル処方物の阻害濃度ＩＣ５０を決定した。ドセタキセル処方物のＩＣ５０は０．０００５ｎｇ／ｍＬであった。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。