JP2020006130A - 脱細胞化組織の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】脱細胞化組織の細胞接着性を向上させることが可能な脱細胞化組織の製造方法の提供。
【解決手段】脱細胞化組織の製造方法は、液化ガスを含む流体を用いて、液化ガスが液体状態を維持する所定の環境下でＤＮＡが分解されている生体組織を脱脂する工程（Ｓ２）を含むことを特徴とする脱細胞化組織の製造方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、脱細胞化組織の製造方法に関する。

再生医療において、患者の欠損した器官を再生するための支持組織として、ヒトまたは異種哺乳動物の生体組織から、細胞質成分、細胞質ゾル成分、細胞骨格、細胞膜成分等の細胞成分が除去されている脱細胞化組織が再移植されている。脱細胞化組織は、エラスチン、コラーゲン（Ｉ型、ＩＶ型等）、ラミニン等の細胞外マトリックス成分を主成分とする。

特許文献１には、ポリエチレングリコール水溶液を用いて、生体組織の細胞を破壊する工程と、ＤＮａｓｅを用いて、細胞が破壊された生体組織に含まれるＤＮＡを分解させる工程と、ＰＢＳを用いて、ＤＮＡが分解した生体組織を洗浄する工程を含む脱細胞化組織の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

しかしながら、上述したような技術では、得られた脱細胞化組織（支持組織）には、脂溶性成分が残存しているため、脱細胞化組織（支持組織）に細胞を接着させようとしても、脱細胞化組織（支持組織）に細胞が接着しにくいという問題があった。

本発明の一態様は、脱細胞化組織の細胞接着性を向上させることが可能な脱細胞化組織の製造方法を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、脱細胞化組織の製造方法において、細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解させる工程と、液化ガスを含む流体を用いて、該ＤＮＡが分解した生体組織を脱脂する工程を含む。

本発明の一態様によれば、脱細胞化組織の細胞接着性を向上させることが可能な脱細胞化組織の製造方法を提供することができる。

本実施形態の脱細胞化組織の製造方法の一例を示すフローチャートである。 実施例の細胞破壊装置を示す概略図である。 実施例１及び比較例１の脱細胞化組織の細胞接着性の評価結果である。

以下、本発明の実施形態を図面を参照して説明する。

（脱細胞化組織の製造方法）
図１に、本実施形態の脱細胞化組織の製造方法の一例を示す。

脱細胞化組織の製造方法は、生体組織の細胞を破壊する工程（Ｓ０）と、細胞が破壊された生体組織に含まれるＤＮＡを分解する工程（Ｓ１）と、液化ガスを含む流体を用いて、ＤＮＡが分解された生体組織を脱脂する工程（Ｓ２）を含む。このため、ＤＮＡが分解した生体組織から脂溶性成分を十分に除去することができ、脱細胞化組織の細胞接着性を向上させることができる。

本明細書及び特許請求の範囲において、脱脂とは、生体組織より脂溶性成分を除去することである。

工程（Ｓ０）では、例えば、生体組織に細胞を破壊することが可能な液体を接触させる。

細胞を破壊することが可能な液体としては、特に限定されないが、界面活性剤、高圧水、液化ジメチルエーテル又は超臨界二酸化炭素を含む液体が好ましい。

工程（Ｓ１）では、例えば、細胞が破壊されている生体組織に、ＤＮＡを分解することが可能な液体を接触させる。

ＤＮＡを分解することが可能な液体としては、特に限定されないが、酵素又は界面活性剤を含む液体が好ましい。

酵素としては、特に限定されないが、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅＩ）、トリプシン等が挙げられる。

界面活性剤としては、特に限定されないが、イオン系界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、非イオン系界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）等が挙げられる。

液体としては、生理的に適合すれば、特に限定されないが、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、生理食塩水が好ましい。

細胞が破壊されている生体組織に、ＤＮＡを分解することが可能な液体を接触させる方法としては、特に限定されないが、細胞が破壊されている生体組織と、ＤＮＡを分解することが可能な液体を混合して撹拌する方法、細胞が破壊されている生体組織に、ＤＮＡを分解することが可能な液体を流通させる方法等が挙げられる。これらの中でも、ＤＮＡを分解することが可能な液体と細胞が破壊されている生体組織との接触の効率が高く、効率的にＤＮＡを分解することが可能な点で、細胞が破壊されている生体組織に、ＤＮＡを分解することが可能な液体を流通させる方法が好ましい。

なお、細胞が破壊されている生体組織と、ＤＮＡを分解することが可能な液体を混合して撹拌する場合、ＤＮＡを分解することが可能な液体を適宜交換してもよい。

細胞が破壊されている生体組織に、ＤＮＡを分解することが可能な液体を接触させる環境の温度は、４〜４０℃であることが好ましい。細胞が破壊されている生体組織に、ＤＮＡを分解することが可能な液体を接触させる温度が４℃以上であると、生体組織に含まれる細胞外マトリックスの氷結晶による損傷を抑制することができ、４０℃以下であると、生体組織に含まれるタンパク質の変性を抑制することができる。

工程（Ｓ２）では、例えば、工程（Ｓ１）により、ＤＮＡが分解された生体組織に、液化ガスを含む流体を接触させる。

本明細書及び特許請求の範囲において、液化ガスとは、常温常圧（０℃、１ａｔｍ（０．１０１３２５ＭＰａ）で気体である物質の液化物である。

液化ガスとしては、生体組織を脱脂することが可能であれば、特に限定されないが、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ホルムアルデヒド、ケテン、アセトアルデヒド、プロパン、ブタン、液化石油ガス等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、比較的低温低圧で液化する点で、エチルメチルエーテル、ジメチルエーテルが好ましく、ジメチルエーテルが特に好ましい。

ジメチルエーテルは、１〜４０℃、０．２〜５ＭＰａ程度で液化するため、装置のコストが安価となる。また、液化ジメチルエーテルは、常温常圧下で容易に気化することから、脱細胞化組織に残留しにくい。

工程（Ｓ２）は、液化ガスの液体状態を維持するため、気密状態の抽出槽内等の飽和蒸気圧以上の環境下で実施される。

ＤＮＡが分解された生体組織に、液化ガスを含む流体を接触させる方法としては、特に限定されないが、ＤＮＡが分解された生体組織を、液化ガスを含む流体に浸漬する方法等が挙げられる。

液化ガスを含む流体は、液化ガスとは異なる液体をさらに含んでいてもよい。

液化ガスとは異なる液体としては、生理的に適合すれば、特に限定されないが、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、生理食塩水が好ましい。

液化ガスとは異なる液体の添加量は、液化ガス中の溶解度以下となるようにすることが好ましい。これにより、液化ガスを含む流体を均一にすることができる。

ＤＮＡが分解された生体組織に、液化ガスを含む流体を接触させた後、常温常圧に戻すと、液化ガスは、気化するため、ＤＮＡが分解された生体組織から液化ガスが除去される。

脱細胞化組織の製造方法は、脱脂された生体組織を洗浄する工程（Ｓ３）をさらに含んでいてもよい。

本明細書及び特許請求の範囲において、洗浄とは、生体組織から水溶性成分を除去することである。

工程（Ｓ３）では、例えば、工程（Ｓ２）により、脱脂された生体組織に、生体組織を洗浄することが可能な液体を接触させる。

生体組織を洗浄することが可能な液体としては、生理的に適合すれば、特に限定されないが、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、生理食塩水が好ましい。

脱脂された生体組織に、生体組織を洗浄することが可能な液体を接触させる方法としては、特に限定されないが、脱脂された生体組織と、生体組織を洗浄することが可能な液体を混合して撹拌する方法、脱脂された生体組織に、生体組織を洗浄することが可能な液体を流通させる方法等が挙げられる。これらの中でも、効率的に洗浄することが可能な点で、脱脂された生体組織に、生体組織を洗浄することが可能な液体を流通させる方法が好ましい。

なお、脱脂された生体組織と、生体組織を洗浄することが可能な液体を混合して撹拌する場合、生体組織を洗浄することが可能な液体を適宜交換してもよい。

脱脂された生体組織に、生体組織を洗浄することが可能な液体を接触させる環境の温度は、４〜４０℃であることが好ましい。脱脂された生体組織に、生体組織を洗浄することが可能な液体を接触させる環境の温度が４℃以上であると、生体組織に含まれる細胞外マトリックスの氷結晶による損傷を抑制することができ、４０℃以下であると、生体組織に含まれるタンパク質の変性を抑制することができる。

（生体組織の細胞破壊方法）
生体組織の細胞を破壊する際には、例えば、生体組織に、細胞を破壊することが可能な液体を接触させる。

細胞を破壊することが可能な液体としては、特に限定されないが、液化ガスを含む液体、界面活性剤を含む液体等が挙げられる。これらの中でも、脱細胞化組織に、実質的に損傷がなく、液化ガスが残留しにくくなる点で、液化ガスを含む液体が好ましい。

ここで、液化ガスを含む液体は、細胞膜成分を溶解するため、生体組織の細胞を破壊することができる。

液化ガスとしては、生体組織の細胞を破壊することが可能であれば、特に限定されないが、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ホルムアルデヒド、ケテン、アセトアルデヒド、プロパン、ブタン、液化石油ガス等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、比較的低温低圧で液化する点で、エチルメチルエーテル、ジメチルエーテルが好ましく、ジメチルエーテルが特に好ましい。

ジメチルエーテルは、１〜４０℃、０．２〜５ＭＰａ程度で液化するため、装置のコストが安価となる。また、液化ジメチルエーテルは、常温常圧下で容易に気化することから、脱細胞化組織に残留しにくい。

液化ガスを含む液体を生体組織に接触させる場合は、液化ガスの液体状態を維持するため、気密状態の抽出槽内等の飽和蒸気圧以上の環境下で実施される。

細胞を破壊することが可能な液体を生体組織に接触させる方法としては、特に限定されないが、細胞を破壊することが可能な液体に生体組織を浸漬する方法等が挙げられる。

液化ガスを含む液体は、液化ガスとは異なる液体をさらに含んでいてもよい。

液化ガスとは異なる液体としては、特に限定されないが、エタノール、水、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）等が挙げられ、二種以上を併用してもよい。

液化ガスとは異なる液体の添加量は、液化ガス中の溶解度以下となるようにすることが好ましい。これにより、液化ガスを含む液体を均一にすることができる。

液化ガスの温度は、１〜４０℃であることが好ましく、１０〜３０℃であることがさらに好ましい。

液化ガスの圧力は、０．２〜５ＭＰａであることが好ましく、０．３〜０．７ＭＰａの範囲内であることがさらに好ましい。

液化ガスを含む液体を生体組織に接触させた後、常温常圧に戻すと、液化ガスは、気化するため、液化ガスを簡便に除去することができる。

なお、液化ガスを含む液体を生体組織に接触させる工程を複数回繰り返してもよい。

（生体組織）
生体組織としては、細胞壁を有する植物、菌類、古細菌、真正細菌、もしくは細胞壁を有しない動物のいずれかから得られる組織のことを意味する。特に限定されないが、葉、枝、樹木、花弁、茎、根、果肉、果皮及び種子や、ヒトまたは異種哺乳動物由来の皮膚、血管、心臓弁膜、角膜、羊膜、硬膜等を含む軟組織またはその一部、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳等を含む臓器またはその一部等、骨、軟骨、腱またはその一部等が挙げられる。

以下に、本発明の実施例を説明するが、本発明は、実施例に限定されない。

［実施例１］
（細胞が破壊されたラットの由来の脳組織のＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄）
細胞が破壊されたラット由来の脳組織を、ＤＮａｓｅＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ＭｇＣｌ_２（和光純薬工業社製）を含む生理食塩水に入れた後、振とうさせ、細胞が破壊されたラット由来の脳組織に含まれるＤＮＡを分解した。次に、ＤＮＡが分解されたラット由来の脳組織を、液化ジメチルエーテルに接触させ、脱脂した。次に、脱脂されたブタ由来の脳組織を、生理食塩水に入れた後、振とうさせ、洗浄した。その結果、ラット由来の脳組織の脱細胞化組織を得た。

［比較例１］
ＤＮＡが分解されたラット由来の脳組織を脱脂する際に、液化ジメチルエーテルの代わりに、エタノールを用いた以外は、実施例１と同様にして、ラット由来の脳組織の脱細胞化組織を得た。

次に、脱細胞化組織の細胞接着性を評価した。

［脱細胞化組織の細胞接着性］
実施例１及び比較例１のラット由来の脳組織の脱細胞化組織と、ラット由来の脳組織に、神経細胞を播種し、７日経過した後、神経細胞の存在位置において蛍光を発する蛍光色素を導入したサンプルの断面を、光学顕微鏡を用いて観察した。

図３に、脱細胞化組織の細胞接着性の評価結果を示す。なお、図３の左側がラット由来の脳組織の脱細胞化組織であり、右側がラット由来の脳組織である。

図３から、実施例１のラット由来の脳組織の脱細胞化組織は、比較例１のラット由来の脳組織の脱細胞化組織に比べて、蛍光を発する領域（図中、点線部）が大きいことから、液化ジメチルエーテルを用いて、ＤＮＡが分解されたラット由来の脳組織を脱脂することで、脱細胞化組織の細胞接着性が向上していることがわかる。

［実施例２］
（ブタ由来の大動脈組織の細胞破壊）
図２に示す細胞破壊装置を用いて、ブタ由来の大動脈組織５５の細胞を破壊した。

具体的には、抽出槽５４に、ブタ由来の大動脈組織５５を仕込んだ。次に、分離槽６０を予めジメチルエーテルで置換し、バルブ５２、５３、５６、５８、５９を閉状態とした。次に、背圧弁５７の設定圧力を０．７ＭＰａとし、バルブ５２、５３、５６、５８を開状態とし、ポンプ５１を用いて、液化ジメチルエーテルを流通させ、液化ジメチルエーテルで抽出槽５４が満たされたところで、バルブ５３、５６を閉状態とし、ブタ由来の大動脈組織５５を液化ジメチルエーテルに浸漬し、リン脂質等の細胞膜成分を抽出した。次に、バルブ５３、５６を開状態とし、液化ジメチルエーテルの流量を１ｍＬ／ｍｉｎに調整して、抽出液を分離槽６０で回収した。次に、バルブ５８を閉状態とし、分離槽６０を装置から取り外し、ドラフト内で大気圧として、液化ジメチルエーテルを揮発させた。

上記の操作により、液化ジメチルエーテル６０ｍＬとブタ由来の大動脈組織５５を接触させた後、バルブ５３を閉状態とし、バルブ５６、５８、５９を開状態とし、抽出槽５４内の圧力を大気圧とし、抽出槽５４内の液化ジメチルエーテルを揮発させて排気した。その結果、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織を得た。

（細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織のＤＮＡ分解、脱脂及び洗浄）
細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織を、０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、０．０５ＭのＭｇＣｌ２（和光純薬工業社製）を含む生理食塩水に入れた後、振とうさせ、細胞が破壊されたブタ由来の大動脈組織に含まれるＤＮＡを分解させた。次に、ＤＮＡが分解したブタ由来の大動脈組織を、液化ジメチルエーテルに接触させ、脱脂した。次に、脱脂されたブタ由来の大動脈組織を、生理食塩水に入れた後、振とうさせ、洗浄した。その結果、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織を得た。

［比較例２］
ＤＮＡが分解されたラット由来の脳組織を脱脂する際に、液化ジメチルエーテルの代わりに、エタノールを用いた以外は、実施例２と同様にして、ブタ由来の大動脈組織の脱細胞化組織を得た。

［実施例３〜６］
生体組織として、ブタ由来の大動脈組織の代わりに、ブタ由来の海綿骨組織、ブタ由来の皮膚組織、ブタ由来の骨組織、ブタ由来の軟骨組織を用いた点以外は、実施例２と同様にして、脱細胞化組織を得た。

［比較例３〜６］
生体組織として、ブタ由来の大動脈組織の代わりに、ブタ由来の海綿骨組織、ブタ由来の皮膚組織、ブタ由来の骨組織、ブタ由来の軟骨組織を用いた点以外は、比較例２と同様にして、脱細胞化組織を得た。

実施例２〜６及び比較例２〜６の脱細胞化組織の細胞接着性を評価したところ、いずれの組織においても、液化ジメチルエーテルを用いて、ＤＮＡが分解されたブタ由来の生体組織を脱脂することで、脱細胞化組織の細胞接着性が向上していることがわかった。

特表２００５−５３１３５５号公報

Claims (7)

1. 液化ガスを含む流体を用いて、ＤＮＡが分解されている生体組織を脱脂する工程を含むことを特徴とする脱細胞化組織の製造方法。
2. 前記工程は、前記液化ガスが液体状態を維持する所定の環境下で実施されることを特徴とする請求項１に記載の脱細胞化組織の製造方法。
3. 前記所定の環境は、１〜４０℃、０．２〜５ＭＰａであることを特徴とする請求項２に記載の脱細胞化組織の製造方法。
4. 前記液化ガスは、エーテル類であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の脱細胞化組織の製造方法。
5. 前記エーテル類は、ジメチルエーテルであることを特徴とする請求項４に記載の脱細胞化組織の製造方法。
6. 細胞が破壊されている生体組織に含まれるＤＮＡを分解する工程を更に含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の脱細胞化組織の製造方法。
7. 前記脱脂された生体組織を洗浄する工程を更に含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の脱細胞化組織の製造方法。