JP2020519312A5

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Publication number: JP2020519312A5
Application number: JP2020514325A
Authority: JP
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2021-07-26
Anticipated expiration: 2038-05-15

Claims

組換え酵素処方物を製造する方法であって、
（ｉ）組換え酵素及び核酸を含む組成物Ｉを提供するステップと、
（ｉｉ）前記核酸を分解するために前記組成物Ｉにヌクレアーゼを添加するステップと、これにより酵素及び分解された核酸を含む組成物ＩＩを提供し、
（ｉｉｉ）前記分解された核酸と複合体化させるために、組成物ＩＩに前記分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップと、これにより前記酵素及び複合体化した分解された核酸を含む組成物ＩＩＩを提供し、
（ｖ）マイクロ濾過により前記組成物ＩＩＩ又は前記組成物ＩＶを精製するステップと、これにより前記酵素を含む組成物Ｖを提供する、
を含む方法。
追加のステップ：
（ｉｖ）固体／液体分離により前記組成物ＩＩＩを精製するステップであって、これにより前記複合体化した分解された核酸を含む分離固相、並びに前記酵素を含む液体組成物ＩＶを提供する、ステップ
をさらに含む請求項１に記載の方法。
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、又は混合したエキソ／エンドヌクレアーゼからなる群から選択され、
前記ヌクレアーゼが、配列番号１又は配列番号２の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である、
請求項１に記載の方法。
追加のステップ：
（ｖｉ）追加のマイクロ濾過又は限外濾過により前記組成物Ｖを精製するステップであって、これにより前記酵素を含む組成物ＶＩを提供する、ステップ
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記沈殿剤が、カチオン性ポリマーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記沈殿剤が、キトサン、ポリアミン、ポリアミノ酸、及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記沈殿剤が、
− ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、及びポリ−Ｎ−メチルビニルアミン；並びに
− ポリアルギニン、ポリリジン、及びポリアクリルアミド
からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記沈殿剤が、
− カチオン性のポリアミンに基づく凝集剤、
− カチオン性のポリアクリルアミドに基づく凝集剤、
− 陰イオン性のポリアミンに基づく凝集剤、
− 硫酸アンモニウム、及び
− 塩化カルシウム
からなる群から選択される凝集剤である、又はそれを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記沈殿剤が、
− ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー、及びジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー、並びに
− ホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド、及びアクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー、並びに
− アクリルアミド−アクリル酸コポリマー
からなる群から選択される凝集剤である、又はそれを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記ステップ（ｉ）が、
（ｉ−ａ）前記酵素の遺伝子を発現ベクターにクローニングするサブステップ、
（ｉ−ｂ）前記遺伝子を有する前記発現ベクターを微生物宿主に導入するサブステップ、
（ｉ−ｃ）微生物宿主において前記酵素を細胞内発現させるサブステップ、すなわち前記組換え酵素を細胞内発現させる条件下で、前記微生物宿主を発酵させるサブステップ、及び
（ｉ−ｄ）細胞破壊により、前記微生物宿主から前記酵素を放出させるサブステップ、これにより前記組成物Ｉを提供する、すなわち、前記組換え酵素を放出させるために、細胞破壊により前記発酵させた細胞を破壊するサブステップ、これにより組換え酵素産物を含む未精製のライセートをもたらす、
のうちの１つ又は複数を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
ａ）微生物宿主において組換え酵素を細胞内発現させるステップと、
ｂ）細胞破壊により前記組換え酵素を放出させるステップと、これにより未精製のライセートをもたらし、
ｃ）プロセス溶液を含有する前記酵素産物内で核酸を分解するためにヌクレアーゼを添加するステップと、これにより酵素処理されたライセートをもたらし、
ｄ）核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップと、これにより複合体化したライセートをもたらし、
ｅ）液相から細胞デブリ及び核酸／沈殿剤複合体を取り除くために液体／固体分離を行うステップと、これにより清澄化したライセートをもたらし、
ｆ）残留固体及び／又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップと、これにより濾液をもたらす、
を含む、食品グレードの酵素産物を製造する方法。
前記ステップ（ｄ）において、１つ又は複数の適する凝集剤が添加される、請求項１１に記載の方法。
前記凝集剤が、
ａ）カチオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳＲｅｇＮｏ．２５９８８−９７−０）、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（ＣＡＳＲｅｇＮｏ．３１５６８−３５−１）、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー（ＣＡＳＲｅｇＮｏ．４２７５１−７９−１）等、
ｂ）カチオン性のポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド（ＣＡＳＲｅｇＮｏ．６７９５３−８０−４）、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー（ＣＡＳＲｅｇＮｏ．６９４１８−２６−４）等、
ｃ）陰イオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー（ＣＡＳＲｅｇＮｏ．２５９８７−３０−８；ＣＡＳＲｅｇＮｏ．９００３−０６−９）等、
ｄ）硫酸アンモニウム（ＣＡＳＲｅｇＮｏ．１００４３−０１−３）、
ｅ）塩化カルシウム（ＣＡＳＲｅｇＮｏ．１００３５−０４−８；ＣＡＳＲｅｇＮｏ．１００４３−５２−４）
からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
前記沈殿剤が、ポリエチレンイミン及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
使用される機能的に活性なヌクレアーゼが、配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、前記調製物が発現させた酵素産物を含有し、配列番号１又は配列番号２のヌクレアーゼに対して少なくとも７０％の同一性を有する検出可能な量のヌクレアーゼを更に含有し、０．０１ｎｇ／ｇ〜５０ｎｇ／ｇの間の残留ＤＮＡ濃度により特徴づけられる調製物。