JP2022158252A

JP2022158252A - Ｒｎａ蛍光体複合体

Info

Publication number: JP2022158252A
Application number: JP2021063014A
Authority: JP
Inventors: 祐一古旗; Yuichi FURUHATA
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2021-04-01
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2022-10-17

Abstract

【課題】高輝度かつ抗褪色性の蛍光ＲＮＡレポーターシステムを提供する。【解決手段】（１）５’→３’方向に：ＵＧＡＡＡからなる第１の末端オリゴヌクレオチド；ＧＵＨＧＡＧＵＤＧＭＧＵＧＵＧからなる第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチド；およびＧＧＣＵＣからなるヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列において１～３個のヌクレオチドが置換または挿入されたヌクレオチド配列からなる第１の中央オリゴヌクレオチドを含む第１のＲＮＡ分子；ならびに（２）５’→３’方向に：前記第１の中央オリゴヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性を有するヌクレオチド配列からなる第２の中央オリゴヌクレオチド；ＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣからなる第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチド；およびＵＵＵＣＡからなる第２の末端オリゴヌクレオチドを含む第２のＲＮＡ分子を含んでなる、ＲＮＡアプタマー。【選択図】なし

Description

本発明は、ＲＮＡ蛍光体複合体およびそれを作製するためのＲＮＡアプタマーに関する。

蛍光性低分子と、それを特異的に認識する発蛍光性ＲＮＡアプタマーとを用いた蛍光ＲＮＡレポーターシステムは、近年注目されている技術である。蛍光ＲＮＡレポーターは、ＧＦＰのような蛍光タンパク質のＲＮＡ模倣体であり、ＲＮＡの検出や可視化、特には生細胞内ＲＮＡイメージングのための強力なツールとなり得る。最初に報告された蛍光ＲＮＡレポーターシステムは、ＧＦＰの蛍光団の模倣体ＤＦＨＢＩと発蛍光性ＲＮＡアプタマーＳｐｉｎａｃｈとを用いたものである（非特許文献１）。Ｓｐｉｎａｃｈ／ＤＦＨＢＩ複合体は、インビトロにおいては、非常に弱い励起光を照射することよりＧＦＰと同等以上の蛍光特性を示したが、低マグネシウムイオン濃度下における蛍光強度は微弱であり、かつ、強い励起光照射によっては瞬時に褪色してしまうため、細胞内における使用には適しない。２０１４年には、低マグネシウムイオン濃度下における蛍光強度をある程度改善したＢｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔシステムが報告された（非特許文献２）。しかし、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の蛍光強度も、生細胞内ＲＮＡイメージングのためには依然として不十分である。そのため、より高輝度かつ抗褪色性の蛍光ＲＮＡレポーターシステムの開発が望まれている。

Ｐａｉｇｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔａｌ．，（２０１１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３（６０４２）：６４２－６４６Ｆｉｌｏｎｏｖ，Ｇ．Ｓ．ｅｔａｌ．，（２０１４），ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，１３６（４６）：１６２９９－１６３０８

本発明は、生細胞内ＲＮＡイメージングに適用可能な、高輝度かつ抗褪色性の蛍光ＲＮＡレポーターシステムを提供することを目的としてなされたものである。

これまでに報告されているＳｐｉｎａｃｈ／ＤＦＨＢＩまたはＢｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔシステムに基づく蛍光ＲＮＡレポーターシステムはいずれも、ＤＦＨＢＩまたはＤＦＨＢＩ－１Ｔに対する特異的認識能を獲得するための共通のステムループ構造に基づいて構築されていた。発明者らは、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔシステムに基づきつつも、上記改変上の制限を取り除くことにより、高輝度かつ抗褪色性の蛍光ＲＮＡレポーターを作出することに成功した。

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（１）５’→３’方向に：ＵＧＡＡＡからなる第１の末端オリゴヌクレオチド；ＧＵＨＧＡＧＵＤＧＭＧＵＧＵＧ（配列番号１）からなる第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチド、ここで、Ｈは、Ａ、ＣまたはＵであり、Ｄは、Ａ、ＧまたはＵであり、Ｍは、ＡまたはＣであり；およびＧＧＣＵＣからなるヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列において１～３個のヌクレオチドが置換または挿入されたヌクレオチド配列からなる第１の中央オリゴヌクレオチドを含む第１のＲＮＡ分子；ならびに（２）５’→３’方向に：前記第１の中央オリゴヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性を有するヌクレオチド配列からなる第２の中央オリゴヌクレオチド；ＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣ（配列番号２）からなる第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチド；およびＵＵＵＣＡからなる第２の末端オリゴヌクレオチドを含む第２のＲＮＡ分子を含んでなり；ここで、前記第１の末端オリゴヌクレオチドおよび前記第２の末端オリゴヌクレオチドが対合して第１のステム領域を形成し、前記第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチドおよび前記第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチドが一緒に蛍光体結合モチーフを形成し、前記第１の中央オリゴヌクレオチドおよび前記第２の中央オリゴヌクレオチドが対合して第２のステム領域を形成する、ＲＮＡアプタマーを提供するものである。

前記第１の中央オリゴヌクレオチドと前記第２の中央オリゴヌクレオチドは、少なくとも４ヌクレオチド長のスペーサーオリゴヌクレオチドにより連結されていることが好ましい。

前記スペーサーオリゴヌクレオチドは、４～１０ヌクレオチド長であることが好ましく、テトラループ配列を含むことが好ましい。

前記テトラループ配列は、ＵＮＣＧ、ＣＵＵＧおよびＡＧＮＮからなる群から選択されることが好ましく、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである。

前記第２のステム領域は、ミスマッチまたはバルジを含んでもよい。

上記ＲＮＡアプタマーは、ＵＧＡＡＡＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＧＧＣＵＣＣＵＵＧＧＡＧＡＣＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣＵＵＵＣＡ（配列番号２８）を含んでなることが好ましい。

また、本発明は、一実施形態によれば、上記ＲＮＡアプタマーと、ＨＢＩ誘導体とを含んでなるＲＮＡ蛍光体複合体を提供するものである。

前記ＨＢＩ誘導体は、ＤＦＨＢＩまたはＤＦＨＢＩ－１Ｔであることが好ましい。

本発明に係るＲＮＡ蛍光体複合体は、従来のＲＮＡ蛍光体複合体を大きく上回る蛍光強度および抗褪色性を有する。また、本発明に係るＲＮＡ蛍光体複合体は、マグネシウムイオン依存性、熱安定性、フォールディング効率などの、蛍光ＲＮＡレポーターとしての性能に関連するその他の重要なパラメーターについても、従来のＲＮＡ蛍光体複合体を上回る。そのため、本発明に係るＲＮＡ蛍光体複合体は、生細胞内ＲＮＡイメージングのためのレポーターシステムとして有用である。

図１は、発蛍光性ＲＮＡアプタマーＢｒｏｃｃｏｌｉと、その循環置換変異体ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉの一次構造を示す図である。図２は、ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉの蛍光特性を示す図である。図３は、ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉにおいて第１のステム領域（ステムＢ’／Ｂ）を変更した変異体ｍ１～ｍ９の蛍光強度を示すグラフである。図４は、ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉのｍ８変異体に基づく変異体ｍ８－１～ｍ８－６の蛍光強度を示すグラフである。図５は、ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉのｍ８－１変異体においてループ配列等を変更した変異体ｍ８－１－１～ｍ８－１－１２の蛍光強度を示すグラフである。図６は、ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉ変異体であるＲｏｍａｎｅｓｃｏの一次構造を示す図である。図７は、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏおよび既報のＢｒｏｃｃｏｌｉ変異体の蛍光強度を示すグラフである。図８は、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ変異を導入したＢｒｏｃｃｏｌｉの蛍光強度を示すグラフである。図９は、ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびＲｏｍａｎｅｓｃｏの励起スペクトルを示す図である。図１０は、ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびＲｏｍａｎｅｓｃｏの蛍光スペクトルを示す図である。図１１は、ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびＲｏｍａｎｅｓｃｏの褪色速度を示すグラフである。図１２は、ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびＲｏｍａｎｅｓｃｏのＤＦＨＢＩ－１Ｔに対する親和性を示すグラフである。図１３は、ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびＲｏｍａｎｅｓｃｏのマグネシウムイオン依存性を示すグラフである。図１４は、ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびＲｏｍａｎｅｓｃｏの熱安定性を示すグラフである。図１５は、ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびＲｏｍａｎｅｓｃｏのフォールディング効率を示すグラフである。図１６は、ＢｒｏｃｃｏｌｉまたはＲｏｍａｎｅｓｃｏを組み入れたｔＲＮＡを発現する細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。図１７は、ＢｒｏｃｃｏｌｉまたはＲｏｍａｎｅｓｃｏを組み入れたｔＲＮＡを発現する細胞のフローサイトメトリー解析により得られたスキャッタグラムである。図１８は、ＢｒｏｃｃｏｌｉまたはＲｏｍａｎｅｓｃｏを組み入れたｔＲＮＡを発現する細胞の蛍光強度を示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

本発明は、第一の実施形態によれば、（１）５’→３’方向に：ＵＧＡＡＡからなる第１の末端オリゴヌクレオチド；ＧＵＨＧＡＧＵＤＧＭＧＵＧＵＧ（配列番号１）からなる第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチド、ここで、Ｈは、Ａ、ＣまたはＵであり、Ｄは、Ａ、ＧまたはＵであり、Ｍは、ＡまたはＣであり；およびＧＧＣＵＣからなるヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列において１～３個のヌクレオチドが置換または挿入されたヌクレオチド配列からなる第１の中央オリゴヌクレオチドを含む第１のＲＮＡ分子；ならびに（２）５’→３’方向に：前記第１の中央オリゴヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性を有するヌクレオチド配列からなる第２の中央オリゴヌクレオチド；ＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣ（配列番号２）からなる第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチド；およびＵＵＵＣＡからなる第２の末端オリゴヌクレオチドを含む第２のＲＮＡ分子を含んでなり；ここで、前記第１の末端オリゴヌクレオチドおよび前記第２の末端オリゴヌクレオチドが対合して第１のステム領域を形成し、前記第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチドおよび前記第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチドが一緒に蛍光体結合モチーフを形成し、前記第１の中央オリゴヌクレオチドおよび前記第２の中央オリゴヌクレオチドが対合して第２のステム領域を形成する、ＲＮＡアプタマーである。

本実施形態のＲＮＡアプタマーは、第１の構成部分として、ＵＧＡＡＡからなる第１の末端オリゴヌクレオチドおよびＵＵＵＣＡからなる第２の末端オリゴヌクレオチドが対合することにより形成される、第１のステム領域を含む。

本実施形態のＲＮＡアプタマーは、第２の構成部分として、ＧＵＨＧＡＧＵＤＧＭＧＵＧＵＧ（配列番号１）からなる第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチドおよびＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣ（配列番号２）からなる第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチドにより形成される蛍光体結合モチーフを含む。ここで、配列番号１のヌクレオチドにおいて、Ｈは、Ａ、ＣまたはＵであり、Ｄは、Ａ、ＧまたはＵであり、Ｍは、ＡまたはＣである。

本実施形態のＲＮＡアプタマーにおける蛍光体結合モチーフは、Ｂｒｏｃｃｏｌｉまたはその変異体の蛍光体結合モチーフに基づいている。したがって、本実施形態において「蛍光体」とは、ＧＦＰ由来の蛍光体４－ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン（ＨＢＩ）の誘導体を意味する。ＨＢＩ誘導体には、例えば、ＤＦＨＢＩ（（Ｚ）－４－（３，５－ジフルオロ－４－ヒドロキシベンジリデン）－１，２－ジメチル－１Ｈ－イミダゾール－５（４Ｈ）－オン）、ＤＦＨＢＩ－１Ｔ（（Ｚ）－４－（３，５－ジフルオロ－４－ヒドロキシベンジリデン）－２－メチル－１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５（４Ｈ）－オン）、ＤＦＨＯ（４－（３，５－ジフルオロ－４－ヒドロキシベンジリデン）－１－メチル－５－オキソ－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルバルデヒドオキシム）、ＢＩ（（Ｚ）－３－（（１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－４－イル）メチル）－５－（３，５－ジフルオロ－４－ヒドロキシベンジリデン）－２－メチル－３，５－ジヒドロ－４Ｈ－イミダゾール－４－オン）などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態のＲＮＡアプタマーにおける蛍光体結合モチーフは、任意のＨＢＩ誘導体と結合するものであってよいが、好ましくはＤＦＨＢＩまたはＤＦＨＢＩ－１Ｔと結合するものである。

本実施形態のＲＮＡアプタマーは、第３の構成部分として、第１の中央オリゴヌクレオチドおよび第２の中央オリゴヌクレオチドが対合することにより形成される、第２のステム領域を含む。ここで、「対合する」とは、２つのオリゴヌクレオチド間で塩基対が形成されることを意味しており、塩基対には、Ｇ：ＣおよびＡ：Ｕのみならず、ゆらぎ塩基対（Ｇ：Ｕ）も含まれ得る。

本実施形態のＲＮＡアプタマーにおける第２のステム領域は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉの骨格に基づいており、Ｂｒｏｃｃｏｌｉの骨格と同様の二本鎖構造が形成されればよい。すなわち、本実施形態のＲＮＡアプタマーにおける第１の中央オリゴヌクレオチドは、ＧＧＣＵＣからなるヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列において１～３個のヌクレオチドが置換または挿入されたヌクレオチド配列からなる。置換または挿入されるヌクレオチドの種類および位置は、特に限定されず、第１の中央オリゴヌクレオチドと第２の中央オリゴヌクレオチドとが対合して二本鎖を形成できる限り任意であってよい。

第２の中央オリゴヌクレオチドは、第１の中央オリゴヌクレオチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列からなる。言い換えれば、本実施形態のＲＮＡアプタマーにおける第２の中央オリゴヌクレオチドは、第１の中央オリゴヌクレオチドと第２の中央オリゴヌクレオチドとが対合して二本鎖を形成できることを限度として、第１の中央オリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な配列において、例えば３個以下、２個または１個のヌクレオチドが置換されたものであってよい。なお、配列の相補性は、当分野における慣用の計算アルゴリズム（ＮＣＢＩＢＬＡＳＴなど）を用いて計算することができる。

さらに、本実施形態のＲＮＡアプタマーにおける第２のステム領域は、第１の中央オリゴヌクレオチドと第２の中央オリゴヌクレオチドとが対合して二本鎖を形成できることを限度として、例えば１個、２個または３個のミスマッチまたはバルジを任意の位置に含んでもよい。

本実施形態のＲＮＡアプタマーにおける第２のステム領域は、好ましくは、Ｂｒｏｃｃｏｌｉの対応する骨格部分と同一である。すなわち、第１の中央オリゴヌクレオチドはＧＧＣＵＣからなることが好ましく、第２の中央オリゴヌクレオチドはＧＡＧＡＣからなることが好ましい。

本実施形態のＲＮＡアプタマーは、第４の構成部分として、少なくとも４ヌクレオチド長のスペーサーオリゴヌクレオチドを含むことができ、これにより、前記第１の中央オリゴヌクレオチドと前記第２の中央オリゴヌクレオチドとが連結されてよい。言い換えれば、本実施形態のＲＮＡアプタマーは、分割された２つのＲＮＡ分子から構成されてもよいし、スペーサーオリゴヌクレオチドにより連結された単一のＲＮＡ分子から構成されてもよい。本実施形態のＲＮＡアプタマーにおいて、スペーサーオリゴヌクレオチドは、上記第１～第３の構成部分の構造が維持される限り任意の長さであってよく、例えば、４～５０ヌクレオチド長、４～３０ヌクレオチド長、４～２０ヌクレオチド長、または４～１０ヌクレオチド長であってよい。また、スペーサーオリゴヌクレオチドは、上記第１～第３の構成部分の構造が維持される限り任意の配列を有してよく、任意の構造を形成してよいが、ループ構造またはヘアピン構造を形成することが好ましい。

本実施形態のＲＮＡアプタマーにおけるスペーサーオリゴヌクレオチドは、好ましくは４～１０ヌクレオチド長であり、テトラループ配列を含む。本実施形態のＲＮＡアプタマーにおけるテトラループ配列は、特に限定されず、例えば、ＧＮＲＡ、ＵＮＣＧ、Ｕ－ＴＵＲＮ、ＣＵＵＧ、ＡＧＮＮなどの任意の公知のテトラループ配列（Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである）であってよい。本実施形態のＲＮＡアプタマーにおけるテトラループは、好ましくは、ＵＮＣＧ、ＣＵＵＧまたはＡＧＮＮであり、特に好ましくはＵＵＣＧ、ＡＧＵＵまたはＣＵＧＧである。

本実施形態において、第１の末端オリゴヌクレオチド、第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチド、第１の中央オリゴヌクレオチド、スペーサーオリゴヌクレオチド、第２の中央オリゴヌクレオチド、第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチドおよび第２の末端オリゴヌクレオチドは、直接連結されることが好ましいが、それぞれの連結部に、１または２ヌクレオチドが挿入されてもよい。挿入されるヌクレオチドは、上記各構成部分の構造が維持される限り、任意の種類であってよい。

本実施形態のＲＮＡアプタマーの特に好ましい具体例としては、ＵＧＡＡＡＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＧＧＣＵＣＣＵＵＧＧＡＧＡＣＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣＵＵＵＣＡ（配列番号２８）を含んでなるＲＮＡアプタマーを挙げることができる。

Ｂｒｏｃｃｏｌｉなどの蛍光ＲＮＡアプタマーのアプリケーションは種々報告されており（Ｎｅｕｂａｃｈｅｒ，Ｓ．ａｎｄＨｅｎｎｉｇ，Ｓ．，２０１９，Ａｎｇｅｗ．ＣｈｅｍｉｅＩｎｔ．Ｅｄ．，５８（５）：１２６６－１２７９）、本実施形態のＲＮＡアプタマーは、そのような公知の蛍光ＲＮＡアプタマーと同様に使用することができる。すなわち、本実施形態のＲＮＡアプタマーは、ＨＢＩ誘導体と結合して複合体を形成でき、かつ、複合体の発蛍光能が維持されることを限度として、第１および／もしくは第２のＲＮＡ分子の５’ならびに／または３’末端に任意の長さおよび配列からなる核酸が付加されてよい。

本実施形態のＲＮＡアプタマーは、当分野において公知の方法により、化学合成または遺伝子工学的手法により生合成することができる。例えば、本実施形態のＲＮＡアプタマーは、鋳型となるＤＮＡを調製し、それをＲＮＡポリメラーゼにより転写することによって製造することができる。なお、本実施形態のＲＮＡアプタマーは、すべてＲＮＡから構成されてもよいし、その一部に修飾ＲＮＡが含まれてもよい。修飾ＲＮＡとしては、例えば、ホスホロチオエート化ＲＮＡ、ボラノホスフェート化ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ、２’－Ｆ化ＲＮＡ、２’，４’－ＢＮＡ（別名ＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ））、などが挙げられる。

本実施形態のＲＮＡアプタマーは、それをコードする核酸を含む発現ベクターを用いることにより、細胞内で発現させてもよい。発現ベクターは、ＲＮＡアプタマーを導入する細胞の種類に応じて、適切なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを選択して用いることができる。

本実施形態のＲＮＡアプタマーは、Ｂｒｏｃｃｏｌｉなどの公知の蛍光ＲＮＡアプタマーよりもＨＢＩ誘導体に対して高い結合親和性を有する。さらに、本実施形態のＲＮＡアプタマーとＨＢＩ誘導体との複合体は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉなどの公知の蛍光ＲＮＡアプタマーとＨＢＩ誘導体との複合体と比較して、増大した蛍光強度および安定性を有する。そのため、本実施形態のＲＮＡアプタマーとＨＢＩ誘導体とを組み合わせて用いることにより、従来よりも高輝度かつ抗褪色性の発蛍光性ＲＮＡアプタマーレポーターシステムを提供することができる。

本発明は、第二の実施形態によれば、上記ＲＮＡアプタマーとＨＢＩ誘導体とを含んでなるＲＮＡ蛍光体複合体である。本実施形態における「ＨＢＩ誘導体」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態のＲＮＡ蛍光体複合体は、ＤＦＨＢＩまたはＤＦＨＢＩ－１Ｔを含んでなることが好ましく、配列番号３のＲＮＡ配列を含むＲＮＡアプタマーとＤＦＨＢＩまたはＤＦＨＢＩ－１Ｔとを含んでなることが特に好ましい。

本実施形態のＲＮＡ蛍光体複合体は、上記ＲＮＡアプタマーおよびＨＢＩ誘導体を接触させることにより調製することができる。具体的には、上記ＲＮＡアプタマーおよびＨＢＩ誘導体を含む溶液を調製し、一定時間インキュベートすればよい。溶液は、例えば、１～１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．０～９．０）や１～１００ｍＭのＴｒｉｓなどの当分野において一般的に用いられる緩衝液に対し、ＲＮＡアプタマーおよびＨＢＩ誘導体を添加して調製すればよい。溶液におけるＲＮＡアプタマーの終濃度は、例えば、１ｎＭ～１００μＭの範囲であってよい。溶液におけるＨＢＩ誘導体の終濃度は、例えば、１ｎＭ～１００μＭの範囲であってよい。インキュベート時間は適宜決定することができ、例えば、１分～１時間であってよい。

あるいは、上記ＲＮＡアプタマーおよびＨＢＩ誘導体を細胞に導入することにより、本実施形態のＲＮＡ蛍光体複合体を細胞内で形成させてもよい。この場合、ＲＮＡアプタマーは、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの周知の核酸導入方法により細胞に導入されてもよいし、ＲＮＡアプタマーをコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に導入して発現させてもよい。ＨＢＩ誘導体は、例えば、ＨＢＩ誘導体を添加した緩衝液または培地中で細胞をインキュベートすることにより細胞に導入され得る。緩衝液および培地には、細胞の種類に応じて適切なものを用いることができる。緩衝液または培地におけるＨＢＩ誘導体の終濃度は、例えば、１００ｎＭ～１００μＭの範囲であってよい。インキュベート時間は適宜決定することができ、例えば、１分～２時間であってよい。

本実施形態のＲＮＡ蛍光体複合体は、高輝度かつ抗褪色性の発蛍光性ＲＮＡアプタマーレポーターであり、細胞内環境でも優れた蛍光活性、フォールディング効率および安定性を示す。そのため、本実施形態のＲＮＡ蛍光体複合体は、生細胞内ＲＮＡイメージングのために有用である。

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

＜１．循環置換変異体ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉの調製＞
Ｂｒｏｃｃｏｌｉ改変上の制限を取り除くために、Ｂｒｏｃｃｏｌｉのループ配列（ＵＵＣＧ）の上流の配列と下流の配列とを相互に置き換えた循環置換変異体ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉを作製した。ＢｒｏｃｃｏｌｉおよびｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉの一次構造を図１に示す。ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉでは、Ｂｒｏｃｃｏｌｉの２５番目のウラシルが５’末端となり、２０番目のアデニンが３’末端となる（図１、太字）。

Ｂｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号３）またはｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号４）のｃＤＮＡ配列にＴ７プロモーターの相補配列を付加した配列からなるＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈに委託して合成した。これを鋳型として、Ｔ７プライマー（配列番号３４）およびＫｌｅｎｏｗＦｌａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）を用いて、二本鎖ＤＮＡを調製した。ＳｃｒｉｐｔＭＡＸＴｈｅｒｍｏＴ７ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（東洋紡）を用いたインビトロ転写反応（３７℃、１５０分間）により、二本鎖ＤＮＡからＲＮＡを合成した。得られたＲＮＡを、ＭｉｃｒｏＢｉｏ－ＳｐｉｎＰ－３０カラム（バイオ・ラッド）を用いて精製した。変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ＲＮＡが正しい長さを有することを確認した。

Ｂｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号３）

ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号４）

１μＭのＲＮＡおよび１０μＭのＤＦＨＢＩ－１Ｔ（Ｌｕｃｅｒｎａ）／ＨＥＰＥＳバッファー（４０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１００ｍＭＫＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ_２）を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、分光蛍光光度計（ＦＰ－８３００，日本分光）を用いて、２５℃で蛍光を測定した。測定には以下のパラメータを用いた：励起波長４７０ｎｍ，スリット幅５ｎｍ，蛍光波長５０５ｎｍ，スリット幅５ｎｍ。

結果を図２に示す。ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉの蛍光強度、励起スペクトルおよび蛍光スペクトルは、Ｂｒｏｃｃｏｌｉと同等であった。

＜２．ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉへの変異導入＞
ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉの第１のステム領域（図１、ステムＢ’／Ｂ）の配列を変更した変異体ｍ１～ｍ９を上記１と同様の手順により調製し、ＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体を調製し、それらの蛍光を測定した。変異体ｍ１～ｍ９の配列を以下に示す。下線は、ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉからの変異箇所を示す。

変異体ｍ１（配列番号５）

変異体ｍ２（配列番号６）

変異体ｍ３（配列番号７）

変異体ｍ４（配列番号８）

変異体ｍ５（配列番号９）

変異体ｍ６（配列番号１０）

変異体ｍ７（配列番号１１）

変異体ｍ８（配列番号１２）

変異体ｍ９（配列番号１３）

結果を図３に示す。ステムＢ’／ＢがＵＧＡＡＡ／ＵＵＵＣＡに置換された変異体ｍ８とＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体が、大幅に上昇した蛍光強度を示した。

次いで、変異体ｍ８に、先行研究（Ａｇｅｅｌｙ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．，（２０１６），ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１１：２３９８－２４０６）に開示されたＢｒｏｃｃｏｌｉの蛍光強度を上昇させる変異を、単独または複数組み合わせてさらに導入した変異体ｍ８－１～ｍ８－６を、上記１と同様の手順により調製し、ＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体を調製し、蛍光を測定した。変異体ｍ８－１～ｍ８－６の配列を以下に示す。下線は、変異体ｍ８からの変異箇所を示す。

変異体ｍ８－１（配列番号１４）

変異体ｍ８－２（配列番号１５）

変異体ｍ８－３（配列番号１６）

変異体ｍ８－４（配列番号１７）

変異体ｍ８－５（配列番号１８）

変異体ｍ８－６（配列番号１９）

結果を図４に示す。変異体ｍ８に対してＣ８Ｕ変異のみを導入した変異体ｍ８－１とＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体が最も強い蛍光強度を示した。

最後に、変異体ｍ８－１の蛍光体結合モチーフにさらなる変異を導入した、またはループ領域を自然界に存在するＲＮＡループ配列により置換した、変異体ｍ８－１－１～ｍ８－１－１２を、上記１と同様の手順により調製し、ＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体を調製し、蛍光を測定した。変異体ｍ８－１－１～ｍ８－１－１２の配列を以下に示す。下線は、変異体ｍ８－１からの変異箇所を示す。

変異体ｍ８－１－１（配列番号２０）

変異体ｍ８－１－２（配列番号２１）

変異体ｍ８－１－３（配列番号２２）

変異体ｍ８－１－４（配列番号２３）

変異体ｍ８－１－５（配列番号２４）

変異体ｍ８－１－６（配列番号２５）

変異体ｍ８－１－７（配列番号２６）

変異体ｍ８－１－８（配列番号２７）

変異体ｍ８－１－９（Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ）（配列番号２８）

変異体ｍ８－１－１０（配列番号２９）

変異体ｍ８－１－１１（配列番号３０）

変異体ｍ８－１－１２（配列番号３１）

結果を図５に示す。ＵＮＣＧ型ループを有する変異体ｍ８－１、ＡＧＮＮ型ループを有する変異体ｍ８－１－８、ＣＵＵＧ型ループを有する変異体ｍ８－１－９、ＧＮＲＡ型ループを有する変異体ｍ８－１－１０、およびＵ－ＴＵＲＮ型ループを有する変異体ｍ８－１－１１など、幅広い種類の変異体とＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体が、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体よりも高い蛍光強度を示した。この結果から、ループ配列が蛍光強度に与える影響は小さいことが確認された。とりわけ、変異体ｍ８－１－９／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体が最も高い蛍光強度を示した（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の蛍光強度の３．７倍）。そこで、変異体ｍ８－１－９を「Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ」と命名し、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の蛍光特性をさらに解析することとした。Ｒｏｍａｎｅｓｃｏの一次構造を図６に示す。図６中、太字はｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉからの変異部分を示す。

比較例として、先行研究（Ａｇｅｅｌｙ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．，（２０１６），ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１１：２３９８－２４０６）に開示された高輝度Ｂｒｏｃｃｏｌｉ変異体Ｂｒｏｃ２およびＢｒｏｃ３を、上記１と同様の手順により調製し、ＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体を調製し、蛍光を測定した。

Ｂｒｏｃ２（配列番号３２）

Ｂｒｏｃ３（配列番号３３）

結果を図７に示す。Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の蛍光強度と比較して、Ｂｒｏｃ２／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体は１．５４倍、Ｂｒｏｃ３／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体は１．８９倍の蛍光強度を示したのに対し、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体は３．７０倍の蛍光強度を示した。この結果から、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体は、従来公知の高輝度Ｂｒｏｃｃｏｌｉ変異体／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体よりも、はるかに高輝度であることが確認された。

さらに、比較例として、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏにおける変異に対応する変異をＢｒｏｃｃｏｌｉに対して導入した変異体（ＢｒｏｃｃｏｌｉＲｏｍａｎｅｓｃｏｍｕｔａｔｉｏｎ）およびｍ８－１変異体における変異に対応する変異をＢｒｏｃｃｏｌｉに対して導入した変異体（Ｂｒｏｃｃｏｌｉｍ８－１ｍｕｔａｔｉｏｎ）を、上記１と同様の手順により調製し、ＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体を調製し、蛍光を測定した。変異体ＢｒｏｃｃｏｌｉＲｏｍａｎｅｓｃｏｍｕｔａｔｉｏｎおよびＢｒｏｃｃｏｌｉｍ８－１ｍｕｔａｔｉｏｎの配列を以下に示す。下線は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉからの変異箇所を示す。

ＢｒｏｃｃｏｌｉＲｏｍａｎｅｓｃｏｍｕｔａｔｉｏｎ（配列番号３４）

Ｂｒｏｃｃｏｌｉｍ８－１ｍｕｔａｔｉｏｎ（配列番号３５）

結果を図８に示す。ＢｒｏｃｃｏｌｉＲｏｍａｎｅｓｃｏｍｕｔａｔｉｏｎ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体およびＢｒｏｃｃｏｌｉｍ８－１ｍｕｔａｔｉｏｎ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体のいずれも、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体よりも低い蛍光強度を示した。この結果から、上記実施例において見出された変異の組み合わせは、ｃｐＢｒｏｃｃｏｌｉの蛍光強度を大幅に増強する一方、Ｂｒｏｃｃｏｌｉの蛍光強度を増強するためには有効ではないことが明らかとなった。

＜３．Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の特性＞
（３－１）励起スペクトルおよび蛍光スペクトル
Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体とＢｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを、上記１と同様の手順により測定した。

励起スペクトルを図９、蛍光スペクトルを図１０に示す。Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の約４倍の蛍光強度を示す一方、スペクトルの形状はＢｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体と類似していることが確認された。

（３－２）褪色速度
ＲｏｍａｎｅｓｃｏまたはＢｒｏｃｃｏｌｉ（１μＭ）およびＤＦＨＢＩ－１Ｔ（５０ｎＭ）を含むＨＥＰＥＳバッファーを調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、分光蛍光光度計（ＦＰ－８３００，日本分光）を用いて、２５℃で蛍光を測定した。蛍光測定には微量測定用キュベット（５０μｌ）を用い、励起光のスリット幅を最大（２０ｎｍ）に設定して、溶液全体に励起光を照射した。測定には以下のパラメータを用いた：励起波長４７０ｎｍ，スリット幅２０ｎｍ，蛍光波長５０５ｎｍ，スリット幅１ｎｍ。得られたデータセットをＥｘｃｅｌを使用して解析し、各タイムポイントにおける蛍光強度を０秒における蛍光強度に対して正規化した。

結果を図１１に示す。測定開始後０．３秒間におけるＢｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の褪色速度は０．４９ユニット／秒であったのに対し、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の褪色速度は０．３９ユニット／秒であった。この結果から、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体よりも褪色しにくいことが明らかとなった。

（３－３）ＤＦＨＢＩ－１Ｔ親和性
５０ｎＭのＲｏｍａｎｅｓｃｏまたはＢｒｏｃｃｏｌｉを含むＨＥＰＥＳバッファーに対して異なる濃度のＤＦＨＢＩ－１Ｔを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）を用いて２５℃で蛍光強度を測定した。測定には以下のパラメータを用いた：励起波長４７０ｎｍ，スリット幅９ｎｍ，蛍光波長５１０ｎｍ，スリット幅２０ｎｍ。得られたデータセットを、Ｅｘｃｅｌのソルバーツールを使用して４パラメーターロジスティックモデルに基づく曲線にフィッティングし、ＤＦＨＢＩ－１Ｔの濃度増加と蛍光強度増加の関数から複合体の解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。

結果を図１２に示す。Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１ＴのＫ_Ｄは２４６ｎＭであったのに対し、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１ＴのＫ_Ｄは１５１ｎＭであった。この結果から、ＲｏｍａｎｅｓｃｏはＢｒｏｃｃｏｌｉよりもＤＦＨＢＩ－１Ｔに対して高い親和性を有することが確認された。

（３－４）マグネシウムイオン依存性
ＲｏｍａｎｅｓｃｏまたはＢｒｏｃｃｏｌｉ（１μＭ）およびＤＦＨＢＩ－１Ｔ（１０μＭ）を、異なる濃度のＭｇＣｌ_２を含む４０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１００ｍＭＫＣｌバッファー中で混合した。３７℃で３０分間インキュベート後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）を用いて２５℃で蛍光強度を測定した。測定には以下のパラメータを用いた：励起波長４７０ｎｍ，スリット幅９ｎｍ，蛍光波長５１０ｎｍ，スリット幅２０ｎｍ。

結果を図１３に示す。１ｍＭのＭｇＣｌ_２存在下での蛍光強度と比較して、ＭｇＣｌ_２不在下でのＢｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の蛍光強度は４１％であったのに対し、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の蛍光強度は６５％であった。この結果から、ＲｏｍａｎｅｓｃｏはＢｒｏｃｃｏｌｉよりもマグネシウムイオン依存性が低いことが明らかとなった。

（３－５）熱安定性
ＲｏｍａｎｅｓｃｏまたはＢｒｏｃｃｏｌｉ（１μＭ）およびＤＦＨＢＩ－１Ｔ（１０μＭ）を含むＨＥＰＥＳバッファーを調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ７５００、サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて蛍光を測定した。測定には以下のパラメータを用いた：温度範囲１０～９０℃、温度間隔０．３℃、加熱速度４℃／分。得られたデータセットをＥｘｃｅｌを使用して解析し、最大値での強度に対して正規化した。

結果を図１４に示す。５０％蛍光強度を与える温度が、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体では４５℃であったのに対し、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体では４７℃であった。この結果から、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の方がＢｒｏｃｃｏｌｉ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体よりも熱安定性が高いことが明らかとなった。

（３－６）フォールディング効率
複合体のフォールディング効率を評価するために、次の２条件の溶液の蛍光強度を比較した：微量（１μＭ）のＲｏｍａｎｅｓｃｏまたはＢｒｏｃｃｏｌｉに対して過剰量（２０μＭ）のＤＦＨＢＩ－１Ｔを供給する（条件１）；微量（１μＭ）のＤＦＨＢＩ－１Ｔに対して過剰量（２０μＭ）のＲｏｍａｎｅｓｃｏまたはＢｒｏｃｃｏｌｉを供給する（条件２）。３７℃で３０分間インキュベート後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）を用いて２５℃で蛍光強度を測定した。測定には以下のパラメータを用いた：励起波長４７０ｎｍ，スリット幅９ｎｍ，蛍光波長５１０ｎｍ，スリット幅２０ｎｍ。条件１の蛍光強度を条件２の蛍光強度で割ることにより、複合体が正しくフォールディングされ、ＤＦＨＢＩ－１Ｔの蛍光を活性化できるＲｏｍａｎｅｓｃｏまたはＢｒｏｃｃｏｌｉの割合を決定した。

結果を図１５に示す。Ｂｒｏｃｃｏｌｉは全量のうち１４％しか正しく複合体をフォールディングしていないのに対し、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏは全量のうち２１％が正しく複合体をフォールディングした。この結果から、ＲｏｍａｎｅｓｃｏはＢｒｏｃｃｏｌｉよりもＤＦＨＢＩ－１Ｔとの複合体を効率よく形成することが明らかとなった。

以上の結果から、蛍光強度、褪色速度、ＤＦＨＢＩ－１Ｔ親和性、マグネシウムイオン依存性、熱安定性およびフォールディング効率のすべての特性において、ＲｏｍａｎｅｓｃｏはＢｒｏｃｃｏｌｉよりも優れていることが確認された。

＜４．哺乳類細胞におけるＲｏｍａｎｅｓｃｏ／ＤＦＨＢＩ－１Ｔ複合体の蛍光強度＞
（４－１）ＲＮＡ発現プラスミドの調製
ｐｃＰＵＲＵ６ベクター（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２００５；３３（１５）：１－９）をバックボーンベクターとして使用し、ｔＲＮＡＬｙｓスキャフォールドに組み込まれたＲｏｍａｎｅｓｃｏもしくはＢｒｏｃｃｏｌｉ（それぞれ「ｔＲｏｍａｎｅｓｃｏ」、「ｔＢｒｏｃｃｏｌｉ」と表記する）またはｔＲＮＡＬｙｓをＵ６プロモーターによって発現するプラスミドを構築した。表１に記載のオリゴヌクレオチド（ＦＡＳＭＡＣに委託して合成；小文字はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応に必要な相同領域を示す）を用いたＫｌｅｎｏｗ反応によりインサート断片を調製し、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ）により、ｔＲｏｍａｎｅｓｃｏ（配列番号４６）、ｔＢｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号４７）またはｔＲＮＡＬｙｓ（配列番号４８）を含むインサート全長を得た。得られたインサート全長をＰＣＲで増幅し、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて、ＢｆｕＡ１で切断したｐｃＰＵＲＵ６にクローニングした。

表１．ｔＲｏｍａｎｅｓｃｏ、ｔＢｒｏｃｃｏｌｉまたはｔＲＮＡＬｙｓ調製のためのオリゴヌクレオチド

ｔＲｏｍａｎｅｓｃｏ（配列番号４６）

ｔＢｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号４７）

ｔＲＮＡＬｙｓ（配列番号４８）

トランスフェクションコントロールには、ｐＣＸ－ＣＲ（ｐＣＸ－ＥＧＦＰ（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９７；４０７（３）：３１３－９）中のＥＧＦＰ遺伝子をｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子に置換したもの）を作製し、使用した。具体的には、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００４；２２（１２）：１５６７－７２）をＰＣＲで増幅し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によりｐＣＸベクターに組み込んだ。ＰＣＲで増幅されたｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の配列をＤＮＡシーケンス解析によって確認した。

（４－２）生細胞蛍光イメージング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（理研ＢＲＣ）を、ポリリジンでコーティングされた３５ｍｍマルチウェルガラスボトムディッシュ（ＭａｔｓｕｎａｍｉＧｌａｓｓ）に約５．０×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種し、１０％ＦＢＳ（ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（ナカライテスク）中、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。ＦｕＧＥＮＥＨＤ試薬（プロメガ）を用いて、試薬に添付のプロトコルに従って、上で調製した発現ベクターを細胞にトランスフェクションした。ＲＮＡ発現プラスミドとｐＣＸ－ＣＲプラスミドの比率を４：１、ＤＮＡの総量を０．２μｇ／ウェルとした。トランスフェクションの２日後、イメージングを行う３０分前に、培養液を除去し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＳＯ_４、２０μＭのＤＦＨＢＩ－１Ｔおよび２μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含むＨＢＳＳに置換した。蛍光画像を、蛍光顕微鏡（ＩＸ８１、オリンパス）を用いて取得し、ＩｍａｇｅＪ１．５２ａソフトウェア（ＮＩＨ）で分析した。

結果を図１６に示す。図中の小窓には、同視野のヘキスト染色像を示す。ｔＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞からは、ｔＢｒｏｃｃｏｌｉ発現細胞よりもはるかに強い蛍光が観察された。

（４－３）フローサイトメトリー
上記（４－２）と同様の手順により、ＲＮＡ発現プラスミドとｐＣＸ－ＣＲプラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用意した。トランスフェクションの２日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ＦＢＳおよび４０μＭのＤＦＨＢＩ－１Ｔを含むＰＢＳに懸濁した。ＢＤＡｃｃｕｒｉＣ６ＰｌｕｓＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、ＦＩＴＣ（５３３／３０ｎｍ）とＰＥ（５８５／４０ｎｍ）の２つのフィルターと４８８ｎｍレーザーを使用して、細胞懸濁液を分析した。得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。蛍光強度上位５％の細胞の平均蛍光強度を計算した。

フローサイトメトリー解析により得られたスキャッタグラムを図１７に示す。ｔＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞は、ｔＢｒｏｃｃｏｌｉ発現細胞よりも高い蛍光強度を示す細胞を高い比率で含むことが確認された。また、ｔＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞およびｔＢｒｏｃｃｏｌｉ発現細胞の、蛍光強度上位５％の細胞の平均蛍光強度を図１８に示す。ｔＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞は、ｔＢｒｏｃｃｏｌｉ発現細胞よりも平均して３倍の蛍光強度を示すことが確認された。

Claims

（１）５’→３’方向に、
ＵＧＡＡＡからなる第１の末端オリゴヌクレオチド、
ＧＵＨＧＡＧＵＤＧＭＧＵＧＵＧ（配列番号１）からなる第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチド、ここで、Ｈは、Ａ、ＣまたはＵであり、Ｄは、Ａ、ＧまたはＵであり、Ｍは、ＡまたはＣであり、および
ＧＧＣＵＣからなるヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列において１～３個のヌクレオチドが置換または挿入されたヌクレオチド配列からなる第１の中央オリゴヌクレオチド
を含む第１のＲＮＡ分子、ならびに
（２）５’→３’方向に、
前記第１の中央オリゴヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相補性を有するヌクレオチド配列からなる第２の中央オリゴヌクレオチド、
ＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣ（配列番号２）からなる第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチド、および
ＵＵＵＣＡからなる第２の末端オリゴヌクレオチド
を含む第２のＲＮＡ分子
を含んでなり、
ここで、前記第１の末端オリゴヌクレオチドおよび前記第２の末端オリゴヌクレオチドが対合して第１のステム領域を形成し、
前記第１の蛍光体結合オリゴヌクレオチドおよび前記第２の蛍光体結合オリゴヌクレオチドが一緒に蛍光体結合モチーフを形成し、
前記第１の中央オリゴヌクレオチドおよび前記第２の中央オリゴヌクレオチドが対合して第２のステム領域を形成する、
ＲＮＡアプタマー。
前記第１の中央オリゴヌクレオチドと前記第２の中央オリゴヌクレオチドとが、少なくとも４ヌクレオチド長のスペーサーオリゴヌクレオチドにより連結されてなる、請求項１に記載のＲＮＡアプタマー。
前記スペーサーオリゴヌクレオチドが４～１０ヌクレオチド長であり、テトラループ配列を含む、請求項２に記載のＲＮＡアプタマー。
前記テトラループ配列が、ＵＮＣＧ、ＣＵＵＧおよびＡＧＮＮからなる群から選択され、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵである、請求項３に記載のＲＮＡアプタマー。
前記第２のステム領域がミスマッチまたはバルジを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー。
ＵＧＡＡＡＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧＧＧＣＵＣＣＵＵＧＧＡＧＡＣＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣＵＵＵＣＡ（配列番号２８）を含んでなる、請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー。
請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーと、ＨＢＩ誘導体とを含んでなるＲＮＡ蛍光体複合体。
前記ＨＢＩ誘導体がＤＦＨＢＩまたはＤＦＨＢＩ－１Ｔである、請求項７に記載のＲＮＡ蛍光体複合体。