JP2023123780A - 非プロトン性双性イオンを用いた未分化促進剤及び凍結保護剤 - Google Patents

非プロトン性双性イオンを用いた未分化促進剤及び凍結保護剤 Download PDF

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Abstract

【課題】ＤＭＳＯ等と同様に薬剤を溶解するが、培地に添加しても細胞の分化を誘導せず、未分化を促進することが可能な未分化促進剤を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の未分化促進剤は、下記式（１）
Figure 2023123780000085

（式中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンであり、Ｒ１は、分子鎖中に１又は２個の酸素原子を含んでいても良い炭素数１～８個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）で表される非プロトン性双性イオンを含むことを特徴とする。
【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り （公開１） 刊行物名 ：第１０回イオン液体討論会 要旨集 発行日 ：令和元年１１月２１日 （公開２） 刊行物名 ：第１０回イオン液体討論会 要旨集（ポスター） 発行日 ：令和元年１１月２１日
本発明は、未分化促進剤及び凍結保護剤に関する。
従来、細胞を用いたアッセイにおいて疎水性薬剤を培地に添加する場合には、その疎水性薬剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒に溶解してから培地に分散させている。しかし、ＤＭＳＯには、幹細胞の分化を誘導させる虞があることが知られている（非特許文献１～３）。これに対し、未分化状態を維持する培地として、タカラバイオ社製「Cellartis（登録商標）DEF-CS 500 Culture System」等が提供されているが、さらなる改良の余地があった。
また、ＤＭＳＯやグリセロールは、細胞を凍結保存する際の凍結保護剤としても広く用いられており、細胞や細胞小器官を保護するための最も効果的な試薬であることが示されている。凍結保護剤は、細胞凍結時に細胞内に形成される氷の結晶の成長を抑えるものである。ＤＭＳＯ等は細胞膜透過性であり、細胞の内外で氷晶の成長速度を遅らせ氷晶形成を阻害する。しかし、ＤＭＳＯ及びグリセロールは生理的に毒性であり、細胞とともにレシピエントに輸液されるか、または担当者の取り扱いにより、高血圧、吐き気及び嘔吐を引き起こすことが知られている。
さらに、ＤＭＳＯ等の凍結保護剤は、細胞の生存率を上げるため、さらにウシ血清アルブミン等のタンパク質と混合して用いることが多い。しかしながら、血清は、ウイルス等に汚染されるリスクがあり、また、ロットにより生物活性が異なるので、優良なロットの選定に多大な労力がかかる（特許文献１）。さらに、異種動物由来のタンパク質を用いることにより、再生医療における拒絶反応が懸念される。
一方、畜産業においては、精子の冷凍保存は重要な問題であるとされているが、精子の運動性を維持するためにグリセリンなどの冷凍保存剤に変えてベタインやカルニチンを用いることが提案されているが、いずれも培地に卵黄などの異種動物由来のタンパク質が用いられている（特許文献２及び３）。
特開２０１２－１０５５８５号公報（段落０００２） 特開平２－４２２号公報 特開２０１３－７８２７２号公報
Jiang, G., et al., Int. Immunopharmacol., 6 (7), 1204-1213 (2006). Young, D. A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759-765 (2004). Katkov, I. I., et al., Cryobiology, 53 (2), 194-205 (2006).
そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、ＤＭＳＯ等と同様に薬剤を溶解するが、培地に添加しても細胞の分化を誘導せず、未分化を促進することが可能な未分化促進剤を提供することを目的とする。なお、本発明における「未分化促進剤」は、未分化マーカーを増幅させ、未分化を積極的に促進する薬剤の他、分化を誘導せず、未分化状態を維持する薬剤をも意味する。
また、本発明は、従来のＤＭＳＯ等を含む凍結保護剤に代わり、毒性が低く、凍結・解凍後の細胞の生存率が高い新規な凍結保護剤を提供することを目的とする。さらに、血清から精製したタンパク質等と併用する必要がなく、それゆえウイルス等の汚染リスクが少なく、品質が一定であり、再生医療における拒絶反応を回避可能な凍結保護剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記従来の状況に鑑み、ＤＭＳＯ等と同様に薬剤を溶解するが、毒性が少なく培地に添加しても細胞周期や細胞の機能に影響が少ない添加剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、１分子内に正電荷と負電荷の両方を有する非プロトン性双性イオン（zwitterion）が、種々の疎水性薬剤を良好に溶解可能であると同時に、細胞の未分化を促進し、又は未分化状態を維持することを見出し発明を完成した。
また、本発明者らは、上記の非プロトン性双性イオンが、細胞に対して低毒性であり、それ単独で凍結保護剤として機能することを見い出し、発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）非プロトン性双性イオンを含む未分化促進剤。
（２）前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオンからなる群から選択されるカチオンである上記（１）に記載の未分化促進剤。
（３）前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン又はアンモニウムカチオンである上記（１）に記載の未分化促進剤。
（４）前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、置換基として分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～８個のアルキル基を１個以上有する上記（１）～（３）のいずれか１つに記載の未分化促進剤。
（５）前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位とアニオン部位との間が、分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～５個の１個以上のアルキレン基を介して結合される上記（１）～（４）のいずれか１つに記載の未分化促進剤。
（６）前記非プロトン性双性イオンが、下記式（１）
Figure 2023123780000001
 （式中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンであり、Ｒ１は、分子鎖中に１又は２個の酸素原子を含んでいても良い炭素数１～８個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
で表される上記（１）に記載の未分化促進剤。
（７）前記非プロトン性双性イオンが、下記式（２）又は式（３）
Figure 2023123780000003
 （式中、Ｒ１及びＲ２は、上記（６）で定義したとおりである。）
で表される上記（６）に記載の未分化促進剤。
（８）非プロトン性双性イオンを含む凍結保護剤。
（９）前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオンからなる群から選択されるカチオンである上記（８）に記載の凍結保護剤。
（１０）前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン又はアンモニウムカチオンである上記（８）に記載の凍結保護剤。
（１１）前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、置換基として分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～８個のアルキル基を１個以上有する上記（８）～（１０）のいずれか１つに記載の凍結保護剤。
（１２）前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位とアニオン部位との間が、分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～５個の１個以上のアルキレン基を介して結合される上記（８）～（１１）のいずれか１つに記載の凍結保護剤。
（１３）前記非プロトン性双性イオンが、下記式（１）
Figure 2023123780000004
 （式中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンであり、Ｒ１は、分子鎖中に１又は２個の酸素原子を含んでいても良い炭素数１～８個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
で表される上記（８）に記載の凍結保護剤。
（１４）前記非プロトン性双性イオンが、下記式（２）又は式（３）
Figure 2023123780000005
Figure 2023123780000006
 （式中、Ｒ１及びＲ２は、上記（１３）で定義したとおりである。）
で表される上記（１３）に記載の凍結保護剤。
（１５）一般式（４）で表される非プロトン性双性イオンを含む凍結保存用培地。
Ｒ４－Ｘ－Ｒ２－Ａ （４）
（式中、Ｒ４は炭素数１～７個のアルキル基、炭素数１～７個のアルケニル基、又はエーテル結合を含む炭素数１～７個のアルキル基であり、Ｘは双性イオンのカチオン部であり、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオンからなる群から選択されるカチオンを表し、Ａはアニオン部を表し、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンを表し、Ｒ２は、炭素数１～５個の置換基を有していても良いアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
（１６）一般式（４）において、Ｘは、窒素原子１個又は２個以上含む炭素数１～６個の環状構造を有し、窒素原子上には１個又は２個以上の置換基を有し、Ａはカルボキシル基又はスルホン酸基であり、カチオンは窒素上に存在するか又はＸ全体に非局在化しており、アニオンはカルボキシル基又はスルホン酸基上に存在する、上記（１５）に記載の凍結保存用培地。
（１７）前記非プロトン性双性イオンが、下記式（１）
Figure 2023123780000007
 （式中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンであり、Ｒ１は、炭素数１～７個のアルキル基、炭素数１～７個のアルケニル基、又はエーテル結合を含む炭素数１～７個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
で表される上記（１５）又は（１６）に記載の凍結保存用培地。
（１８）前記非プロトン性双性イオンが、下記式（２）又は式（３）
Figure 2023123780000008
Figure 2023123780000009
 （式中、Ｒ１及びＲ２は、上記（１７）で定義したとおりである。）
で表される上記（１５）～（１７）のいずれか１つに記載の凍結保存用培地。
（１９）Ｒ１又はＲ４が炭素数１～７個のアルケニル基である上記（１５）～（１８）のいずれか１つに記載の凍結保存用培地。
（２０）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンと水のみからなる凍結保存用培地。
（２１）上記（２０）に記載の凍結保存用培地に、１種以上の細胞内浸透性物質からなる添加剤が加えられた凍結保存用培地。
（２２）細胞内浸透性物質がグリセリン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エチレングリコール、及びプロピレングリコールからなる群から選択される少なくとも１種である上記（２０）に記載の凍結保存用培地。
（２３）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含む細胞、組織又は個体の未分化促進剤。
（２４）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含む細胞、組織又は個体の冷凍保存剤。
（２５）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含む氷結晶形成抑制剤。
（２６）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含む未分化維持剤。
（２７）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含むガラス化剤。
（２８）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含む凍結乾燥剤。
（２９）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含む細胞、組織又は個体の脱水剤。
（３０）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含む細胞、組織又は個体の低温（常温以下）保存剤。
（３１）上記（１５）～（１９）のいずれか１つに記載の非プロトン性双性イオンを含む細胞、組織又は個体の低温（常温以下）輸送用溶液。
本発明の非プロトン性双性イオンを含む未分化促進剤は、ＤＭＳＯ等と同様に疎水性薬剤を溶解すると同時に、細胞の分化を誘導せず、未分化マーカーを増幅させ、未分化を促進することができる。
また、本発明の非プロトン性双性イオンを含む凍結保護剤は、毒性が低く、凍結・解凍後の細胞の生存率を高く維持することができる。また、この凍結保護剤は、血清もしくは血清から精製したタンパク質あるいはペプチド等と混合する必要なく、単独で用いることができるため、ウイルス等の汚染リスクがなく、再生医療における拒絶反応を回避することができる。
未分化特異的遺伝子発現解析（フィーダー細胞有り）の結果を示すグラフである。 未分化特異的遺伝子発現解析（フィーダー細胞無し）の結果を示すグラフである。 緩慢凍結法による生細胞数（ヒト皮膚線維芽細胞）を示すグラフである。 緩慢凍結法による生細胞数（マウス線維芽細胞）を示すグラフである。 緩慢凍結法による培養開始２４時間後の細胞状態を示す顕微鏡画像である。 緩慢凍結法による生細胞数（ヒト皮膚線維芽細胞）を示すグラフである。 急速凍結法による解凍後の生細胞数（ヒト皮膚線維芽細胞）を示すグラフである。 急速凍結法による解凍後の生細胞数（マウス線維芽細胞）を示すグラフである。 急速凍結法による培養開始２４時間後の生細胞数（ヒト皮膚線維芽細胞）を示すグラフである。 急速凍結法による培養開始２４時間後の生細胞数（マウス線維芽細胞）を示すグラフである。 本発明の培地添加剤の細胞周期に与える影響を示すグラフである。 本発明の培地添加剤のゼブラフィッシュの発生に対する影響に対する画像である。
以下、実施の形態に基づき本発明を詳細に説明する。
（未分化促進剤）
まず、本発明に係る未分化促進剤について説明する。本発明の一実施形態に係る未分化促進剤は、非プロトン性双性イオンを含む。なお、プロトン性双性イオンとは、プロトンの移動を介して分子内に電荷が無くなることが原理的に可能な双性イオンのことを指し、アミノ酸等の天然の双性イオンのほとんどすべてはこれに当てはまる。それに対して、通常の温和な条件下において分子内のアニオンとカチオンの間で移動可能なプロトンを有さない双性イオンを非プロトン性双性イオンと定義し、天然にはほとんど存在しない。このような非プロトン性双性イオンとしては、イオン液体様のカチオン部位とイオン液体様のアニオン部位とが共有結合により連結された物質を挙げることができる。好ましくは、非プロトン性双性イオンのカチオン部位とアニオン部位との間は、分鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～５個の１個以上のアルキレン基を介して結合される。ここで、ヘテロ原子の例としては、酸素、窒素、イオウ、リン等が挙げられる。アルキレン基の炭素数を１～５個にすることで、非プロトン性双性イオンの細胞に対する毒性をより弱めることができる。
一般に、有機イオン、特にイオン液体と認識されている有機イオン（イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン、ピペリジニウムカチオン等をカチオンとする有機塩）は、カチオンのアルキル鎖（ヘテロ元素を含み得る）が細胞膜へ挿入されることで毒性を示すことが知られている（Lim, G. S., Zidar, J., Cheong, D. W., Jaenicke, S. &Klahn, M. Impact of ionic liquids in aqueous solution on bacterial plasma membranes studied with molecular dynamics simulations. J. Phys. Chem. B 118, 10444-10459 (2014).）。その過程は以下の２段階からなる。
（１）有機塩のカチオンと脂質二重膜（細胞膜）のリン酸が静電相互作用によって接近する。
（２）有機塩のカチオンのアルキル鎖と脂質二重膜の脂質部位が疎水性相互作用することでカチオンのアルキル鎖が脂質二重膜へ挿入され、細胞膜が破壊される。
本発明者らは、カチオンのアルキル鎖の末端に、極性の高いアニオンを導入し非プロトン性双性イオンにすることで、毒性を抑えることが可能であることを見い出した。具体的には、アニオンを導入することでリン酸とアニオン間の静電反発が起こり、上記（１）を阻害することができる。また、アニオンを導入することで極性が高くなり、上記（２）の疎水性相互作用も抑制することができる。そのため、イミダゾリウム、ホスホニウム、アンモニウム、スルホニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム等をカチオンとする有機塩の毒性を大きく下げることができる。
本実施形態において、非プロトン性双性イオンのイオン液体様カチオンの例としては、１個以上の置換基を有するイミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオン等が挙げられる。その中でも置換基を有するイミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン又はアンモニウムカチオンが好ましく用いられる。また、各置換基は互いに同一でも異なっていても良く、例えば、分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～１８個のアルキル基及び炭素数１～１８個のアルコキシ基等から適宜選択することができる。特に、置換基は、分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～８個のアルキル基を１個以上有することが好ましい。アルキル鎖の炭素数を１～８個とすることで、細胞に対する毒性をより弱めることができる。ここでヘテロ原子としては、酸素、窒素、イオウ、リン等が挙げられる。
また、非プロトン性双性イオンのイオン液体様アニオンの例としては、スルホン酸イオン－ＳＯ３ －、カルボン酸イオン－ＣＯＯ－、リン酸イオン－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－（ここで、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である）等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
特に、未分化促進剤に含まれる非プロトン性双性イオンとして、下記式（１）
Figure 2023123780000010
 で表される非プロトン性双性イオンは好ましく用いられる。式（１）中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンである（ここで、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である）。なお、上記ヘテロ原子としては、酸素、窒素、イオウ、リン等が挙げられる。また、Ｒ３であるアルキル基の例として、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、プロピル基等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。すなわち、本実施形態に係る未分化促進剤に含まれる非プロトン性双性イオンとして、下記の式（２）及び式（３）で表される双性イオンが包含される。
Figure 2023123780000011
Figure 2023123780000012
また、式（１）～（３）において、Ｒ１は、分子鎖中に１又は２個の酸素原子を含んでいても良い炭素数１～８個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基である。Ｒ１の具体例として、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２－、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２－等が挙げられる。また、Ｒ２の具体例として、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
特に、未分化促進剤として、以下の非プロトン性双性イオンは、細胞毒性が低いため好適に用いられる。
Figure 2023123780000013
Figure 2023123780000014
Figure 2023123780000015
Figure 2023123780000016
Figure 2023123780000017
Figure 2023123780000018
Figure 2023123780000019
Figure 2023123780000020
Figure 2023123780000021
以上のような非プロトン性双性イオンを合成するに当たっては、当業者にとって一般的な有機合成法を適宜採用して行うことができる。すなわち、上記式（１）で表されるカチオンがイミダゾリウムイオンである非プロトン性双性イオンは、例えば、１－アルキルイミダゾールとエチルブロモアルキレートをアセトニトリル中で還流し、これをアニオン交換樹脂と混合した後、溶媒を減圧留去することでイミダゾリウムとカルボン酸からなる非プロトン性双性イオンを得ることができる。イミダゾールのアルキル基は、１個以上のヘテロ原子、例えば１又は２個の酸素原子を含んでいても良い。また、１－アルキルイミダゾールを、トリアルキルホスフィン、トリアルキルアミン、ジアルキルスルフォン、ピリジン、Ｎ－アルキルピロリジン等に変えることでカチオンがイミダゾリウムカチオン以外である非プロトン性双性イオンを合成することができる。また、ＮａＨをテトラヒドロフランと混合し、イミダゾール及び１－ブロモ－２－（２－メトキシエトキシ）エタンを添加することでオリゴエーテル鎖が導入されたイミダゾールを得ることができる。同様に様々な官能基を持つアルキルイミダゾールやトリアルキルホスフィン、トリアルキルアミン、ジアルキルスルフォン、ピリジン、Ｎ－アルキルピロリジン等を得ることができるので、これらをアニオン部分の試薬と反応させることで所望の非プロトン性双性イオンを得ることができる。
本実施形態の未分化促進剤は、細胞そのものあるいは細胞を含む媒体、例えば、リン酸バッファー、水、各種培地等に添加して使用することができ、これによって細胞の未分化を促進し、又は未分化状態を維持することができる。未分化促進剤を添加する培地は、従来知られた種々の培地が適用可能であり、培養する細胞の種類等に応じて適宜選択される。合成培地、半合成培地及び天然培地のいずれでも良く、また、液体培地及び固体培地の両方が適用可能である。具体的には、ＹＭ培地、コーンミール培地、グルコース－ブイヨン培地、肉汁培地、ＳＩＭ培地等の細菌用培地、オートミール培地、麦芽汁、発酵試験培地、デンプン生成培地、酵母エキス等の真菌用培地、ＬＢ培地、Ｄａｖｉｓ培地、ＭＳ培地、ＴＧ培地、ＤＭＥＭ培地等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本実施形態の未分化促進剤は、各種アッセイ等を行うため各種薬剤とともに培地等に添加することができる。薬剤としては、特に限定されるものではなく、例えば、抗腫瘍剤、抗生物質、抗高脂血症剤、抗菌剤、アレルギー性疾患治療剤、高血圧治療剤、動脈硬化治療剤、血行促進剤、ホルモン剤、脂溶性ビタミン剤、糖尿病治療剤、抗アンドロゲン剤、強心用薬剤、不整脈用薬剤、消炎剤、催眠鎮静剤、精神安定剤、抗てんかん剤、抗うつ剤、消化器系疾患治療剤、利尿用薬剤、局所麻酔剤、抗凝固剤、抗ヒスタミン剤、抗ムスカリン剤、抗マイコバクテリア剤、免疫抑制剤、抗甲状腺薬、抗ウイルス剤、不安緩和性鎮静薬、収れん薬、β－アドレナリン受容体遮断薬、心筋変力作用剤、造影剤、コルチコステロイド、咳抑制剤、診断剤、診断用イメージング剤、利尿剤、ドパミン作用剤、脂質調整剤、筋肉弛緩薬、副交感神経作用薬、甲状腺カルシトニン、プロスタグラジン、放射性医薬、性ホルモン、刺激剤、食欲抑制剤、交感神経作用薬、甲状腺剤、血管拡張剤、イソフラボン、キサンテン等を挙げることができる。
培地に添加される非プロトン性双性イオンの濃度は、培地で培養される細胞の種類等に応じて適宜設定することができるが、本実施形態に係る非プロトン性双性イオンを含む未分化促進剤は、細胞に対する毒性が低く、そのため必要に応じて高い濃度で添加することが可能である。具体的には、培地中、終濃度が０．００１～１００重量体積％、好ましくは０．０１～９０重量体積％の濃度になるよう添加することができるが、この範囲に限定されるものではない。
培地で培養し得る細胞の種類は特に限定されず、任意の細胞が適用可能である。例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、細菌等の細胞が挙げられる。また、動物細胞としては、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等の細胞が挙げられる。さらに、細菌としては、乳酸菌、大腸菌、枯草菌、シアノバクテリア等が挙げられる。
また、細胞の種類も特に限定されず、例えば、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から適宜選択される。ここで「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。
また、「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味し、例えば、骨髄中の造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞等が挙げられる。
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞をいう。好ましくは、破骨細胞、線維芽細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ等が挙げられる。
「生殖細胞」としては、有性生殖のための配偶子、すなわち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子等が挙げられる。
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択しても良い。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌であり、軟部肉腫、悪性骨腫瘍等を含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」は、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもち、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。この例として、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ－６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）等が挙げられる。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。動物細胞、植物細胞、細菌の形質転換は、従来知られた方法を用いて行われる。
また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を培養する際に、細胞の増殖や分化に必要な環境を整えるために補助的に用いられるフィーダー細胞を必要に応じて含んでいても良い。フィーダー細胞としては、マウスの線維芽細胞等が挙げられる。これらのフィーダー細胞は、予めガンマ線照射や抗生物質によって増殖しないように処理することができる。
（凍結保護剤）
次に、本発明に係る凍結保護剤について説明する。本発明の一実施形態に係る凍結保護剤は、非プロトン性双性イオンを含む。なお、プロトン性双性イオンとは、プロトンの移動を介して分子内に電荷が無くなることが原理的に可能な双性イオンのことを指し、アミノ酸等の天然の双性イオンのほとんどすべてはこれに当てはまる。それに対して、通常の温和な条件下において分子内のアニオンとカチオンの間で移動可能なプロトンを有さない双性イオンを非プロトン性双性イオンと定義し、天然にはほとんど存在しない。このような非プロトン性双性イオンとしては、イオン液体様のカチオン部位とイオン液体様のアニオン部位とが共有結合により連結された物質を挙げることができる。好ましくは、非プロトン性双性イオンのカチオン部位とアニオン部位との間は、分鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～５個の１個以上のアルキレン基を介して結合される。ここで、ヘテロ原子の例としては、酸素、窒素、イオウ、リン等が挙げられる。アルキレン基の炭素数を１～５個にすることで、双性イオンの細胞に対する毒性をより弱めることができる。
一般に、有機イオン、特にイオン液体と認識されている有機イオン（イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン、ピペリジニウムカチオン等をカチオンとする有機塩）は、カチオンのアルキル鎖（ヘテロ元素を含み得る）が細胞膜へ挿入されることで毒性を示すことが知られている（Lim, G. S., Zidar, J., Cheong, D. W., Jaenicke, S. &Klahn, M. Impact of ionic liquids in aqueous solution on bacterial plasma membranes studied with molecular dynamics simulations. J. Phys. Chem. B 118, 10444-10459 (2014).）。その過程は以下の２段階からなる。
（１）有機塩のカチオンと脂質二重膜（細胞膜）のリン酸が静電相互作用によって接近する。
（２）有機塩のカチオンのアルキル鎖と脂質二重膜の脂質部位が疎水性相互作用することでカチオンのアルキル鎖が脂質二重膜へ挿入され、細胞膜が破壊される。
本発明者らは、カチオンのアルキル鎖の末端に、非常に極性の高いアニオンを導入し非プロトン性双性イオンにすることで、毒性を抑えることが可能であることを見い出した。具体的には、アニオンを導入することでリン酸とアニオン間の静電反発が起こり、上記（１）を阻害することができる。また、アニオンを導入することで極性が非常に高くなり、上記（２）の疎水性相互作用も抑制することができる。そのため、イミダゾリウム、ホスホニウム、アンモニウム、スルホニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム等をカチオンとする有機塩の毒性を大きく下げることができる。
本実施形態において、非プロトン性双性イオンのイオン液体様カチオンの例としては、１個以上の置換基を有するイミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオン等が挙げられる。その中でも置換基を有するイミダゾリウムカチオン及びホスホニウムカチオンが好ましく用いられる。また、各置換基は互いに同一でも異なっていても良く、例えば、分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～１８個のアルキル基及び炭素数１～１８個のアルコキシ基等から適宜選択することができる。特に、置換基は、分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～８個のアルキル基を１個以上有することが好ましい。アルキル鎖の炭素数を１～８個とすることで、細胞に対する毒性をより弱めることができる。ここでヘテロ原子としては、酸素、窒素、イオウ、リン等が挙げられる。
また、非プロトン性双性イオンのイオン液体様アニオンの例としては、スルホン酸イオン－ＳＯ３ －、カルボン酸イオン－ＣＯＯ－、リン酸イオン－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－（ここで、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である）等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
特に、凍結保護剤に含まれる非プロトン性双性イオンとして、下記式（１）
Figure 2023123780000022
 で表される非プロトン性双性イオンは好ましく用いられる。式（１）中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンである（ここで、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である）。なお、上記ヘテロ原子としては、酸素、窒素、イオウ、リン等が挙げられる。また、Ｒ３であるアルキル基の例として、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、プロピル基等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。すなわち、本実施形態に係る凍結保護剤に含まれる非プロトン性双性イオンとして、下記の式（２）及び式（３）で表される双性イオンが包含される。
Figure 2023123780000023
Figure 2023123780000024
また、式（１）～（３）において、Ｒ１は、分子鎖中に１又は２個の酸素原子を含んでいても良い炭素数１～８個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基である。Ｒ１の具体例として、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２－、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２－等が挙げられる。また、Ｒ２の具体例として、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
特に、凍結保護剤として、以下の非プロトン性双性イオンは、細胞毒性が低いため好適に用いられる。
Figure 2023123780000025
Figure 2023123780000026
Figure 2023123780000027
Figure 2023123780000028
Figure 2023123780000029
Figure 2023123780000030
Figure 2023123780000031
Figure 2023123780000032
Figure 2023123780000033
以上のような非プロトン性双性イオンを合成するに当たっては、当業者にとって一般的な有機合成法を適宜採用して行うことができる。すなわち、上記式（１）で表されるカチオンがイミダゾリウムイオンである非プロトン性双性イオンは、例えば、１－アルキルイミダゾールとエチルブロモアルキレートをアセトニトリル中で還流し、これをアニオン交換樹脂と混合した後、溶媒を減圧留去することでイミダゾリウムとカルボン酸からなる非プロトン性双性イオンを得ることができる。イミダゾールのアルキル基は、１個以上のヘテロ原子、例えば１又は２個の酸素原子を含んでいても良い。また、１－アルキルイミダゾールを、トリアルキルホスフィン、トリアルキルアミン、ジアルキルスルフォン、ピリジン、Ｎ－アルキルピロリジン等に変えることでカチオンがイミダゾリウムカチオン以外である非プロトン性双性イオンを合成することができる。また、ＮａＨをテトラヒドロフランと混合し、イミダゾール及び１－ブロモ－２－（２－メトキシエトキシ）エタンを添加することでオリゴエーテル鎖が導入されたイミダゾールを得ることができる。同様に様々な官能基を持つアルキルイミダゾールやトリアルキルホスフィン、トリアルキルアミン、ジアルキルスルフォン、ピリジン、Ｎ－アルキルピロリジン等を得ることができるので、これらをアニオン部分の試薬と反応させることで所望の非プロトン性双性イオンを得ることができる。
以上の非プロトン性双性イオンを含む凍結保護剤は、ＤＭＳＯやグリセロール等の従来の凍結保護剤に代替するものとして利用することができる。すなわち、細胞懸濁液もしくは遠心分離によって回収した細胞に本実施形態の凍結保護剤を添加し、フリーザー中で凍結することができる（緩慢凍結法）。本実施形態の凍結保護剤は、細胞バンクにおける株化細胞等の凍結保存、畜産分野における種の保存、家畜増産のための精子・卵・受精卵の凍結保存、生殖医療における生殖細胞の凍結保存等、種々の分野における細胞の凍結保存に用いることができ、解凍後に高い生存率を維持することができる。緩慢凍結法において、細胞懸濁液もしくは遠心分離によって回収した細胞に添加される非プロトン性双性イオンの濃度は、細胞の種類等に応じて適宜設定することができるが、本実施形態に係る非プロトン性双性イオンを含む凍結保護剤は、ＤＭＳＯ等に比べて細胞に対する毒性が低く、そのため必要に応じて高い濃度で添加することが可能である。具体的には、細胞懸濁中、非プロトン性双性イオンが０．１～９０重量％の濃度になるよう添加することができるが、この範囲に限定されるものではない。
緩慢凍結法において、本実施形態の凍結保護剤には、必要に応じてＤＭＳＯ、グリセロール、スクロース、トレハロース、プロピレングリコール、アセトアミド等の従来の凍結保護用の化合物を混合して用いることができる。本実施形態の凍結保護剤における、これら化合物の含有量は、多過ぎると細胞に対する毒性が高くなるため、例えば３０重量％未満とすることが好ましい。また、本実施形態の凍結保護剤には、必要に応じて、細胞の生存率を高めるため、血清や、あるいは血清から精製したタンパク質又はペプチドを適宜混合することができる。このようなタンパク質又はペプチドとしては、ウシ血清アルブミン、カルボキシル化ポリリジン、あるいは、昆虫や植物、魚類等に存在するような不凍タンパク質もしくは不凍糖タンパク質等から選択される一種以上を挙げることができる。本実施形態の凍結保護剤における、これらタンパク質又はペプチドの含有量は、そのタンパク質又はペプチドの種類によって異なるが、例えば２０重量％未満とすることができる。しかし、本実施形態における非プロトン性双性イオンは、タンパク質又はペプチドと併用せずに、それ単独で細胞の生存率が高い凍結保護剤として使用できるため、ウイルス等の汚染リスクがなく、再生医療における拒絶反応を回避することができる。
緩慢凍結法における細胞の凍結条件は、従来の条件に準じて適宜設定することができる。具体的には、細胞懸濁液における非プロトン性双性イオンの濃度等によって異なるが、例えば、－０．１～－１５℃／分の冷却速度で、０～－２００℃まで冷却することができる。
また、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞、受精卵等のように、凍結の際の細胞内外の氷晶形成による影響が大きい場合は、緩慢凍結法に代えて、急速凍結法（ガラス化法）により細胞を凍結することができる。急速凍結法では、細胞懸濁液における本実施形態の凍結保護剤の濃度を高くし、冷却速度を大きくする。具体的には、細胞懸濁液における凍結保護剤の濃度を０．５～９０重量％、冷却速度を－１５～－２００００℃／分、冷却温度を０～－２００℃の範囲として行うことが好ましい。一般に、凍結保護剤の濃度が高くなるほどガラス化し易くなるが、一方で浸透圧が高くなり、細胞への毒性も高くなる。本実施形態における非プロトン性双性イオンは毒性が比較的低いため濃度を高くすることができ、急速凍結法に用いる凍結保護剤として適している。
凍結する細胞の種類は特に限定されず、任意の細胞が適用可能である。例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、細菌等の細胞が挙げられる。また、動物細胞としては、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等の細胞が挙げられる。さらに、細菌としては、乳酸菌、大腸菌、枯草菌、シアノバクテリア等が挙げられる。
また、細胞の種類も特に限定されず、例えば、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から適宜選択される。ここで「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。
また、「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味し、例えば、骨髄中の造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞等が挙げられる。
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞をいう。好ましくは、破骨細胞、線維芽細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ等が挙げられる。
「生殖細胞」としては、有性生殖のための配偶子、すなわち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子等が挙げられる。
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択しても良い。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌であり、軟部肉腫、悪性骨腫瘍等を含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」は、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもち、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。この例として、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ－６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）等が挙げられる。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。動物細胞、植物細胞、細菌の形質転換は、従来知られた方法を用いて行われる。
（凍結保存用培地）
本発明に係る凍結保存用培地について説明する。本発明に係る凍結保存用培地は、一般式（４）で表される非プロトン性双性イオンを含む。
Ｒ４－Ｘ－Ｒ２－Ａ （４）
式中、Ｒ４は炭素数１～７個のアルキル基、炭素数１～７個のアルケニル基、又はエーテル結合を含む炭素数１～７個のアルキル基であり、Ｘは双性イオンのカチオン部であり、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオンからなる群から選択されるカチオンを表し、Ａはアニオン部を表し、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンを表し、Ｒ２は、炭素数１～５個の置換基を有していても良いアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。上記「エーテル結合を含む炭素数１～７個のアルキル基」は、分子鎖中に１個又は複数個（例えば１又は２個）の酸素原子を含む炭素数１～７個のアルキル基を意味する。
上記一般式（４）において、Ｘは、窒素原子１個又は２個以上含む炭素数１～６個の環状構造を有し、窒素原子上には１個又は２個以上の置換基を有し、Ａはカルボキシル基又はスルホン酸基であり、カチオンは窒素上に存在するか又はＸ全体に非局在化しており、アニオンはカルボキシル基又はスルホン酸基上に存在することが好ましい。
本実施形態の凍結保存用培地は、非プロトン性双性イオンが下記式（１）
Figure 2023123780000034
 （式中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンであり、Ｒ１は、炭素数１～７個のアルキル基、炭素数１～７個のアルケニル基、又はエーテル結合を含む炭素数１～７個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
で表される。
さらに、本実施形態の凍結保存用培地は、非プロトン性双性イオンが下記式（２）又は式（３）
Figure 2023123780000035
Figure 2023123780000036
 （式中、Ｒ１及びＲ２は、上記式（１）で定義したとおりである。）
で表される。
さらに、Ｒ１又はＲ４が炭素数１～７個のアルケニル基であることが好ましい。
このような非プロトン性双性イオンとしては、以下のようなものを挙げることができる。特に、未分化促進剤として、以下の非プロトン性双性イオンは、細胞毒性が低いため好適に用いられる。
Figure 2023123780000037
Figure 2023123780000038
Figure 2023123780000039
Figure 2023123780000040
Figure 2023123780000041
Figure 2023123780000042
Figure 2023123780000043
Figure 2023123780000044
Figure 2023123780000045
本発明の別の実施形態の凍結保存用培地は、一般式（５）で表される非プロトン性双性イオンを含む。
Ｒ４’－Ｘ’－Ｒ２’－Ａ’ （５）
（式中、
Ｒ４’は、炭素数１～１０個のアルキル基、炭素数１～７個のアルケニル基、又は分子鎖中に１又は２個の酸素原子を含む炭素数１～７個のアルキル基であり、
Ｘ’は、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオンからなる群から選択されるカチオンを表し、
Ａ’は、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３‘）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンを表し、
Ｒ２’は、炭素数１～５個の置換基を有していても良いアルキレン基であり、
Ｒ３’は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
本発明の別の実施形態の凍結保存用培地において、一般式（５）で表される非プロトン性双性イオンとしては、以下のようなものを挙げることができる。本実施形態の凍結保存用培地は、非プロトン性双性イオンとして以下から選択される少なくとも１種を含むことができる。
Figure 2023123780000046
Figure 2023123780000047
Figure 2023123780000048
以上のような非プロトン性双性イオンを合成するに当たっては、上記で述べたように、当業者にとって一般的な有機合成法を適宜採用して行うことができる。
上記式（４）又は式（５）で表される非プロトン性双性イオンは、水と併用して凍結保存用培地として用いることができる。例えば上記非プロトン性双性イオンは、非プロトン性双性イオンと水とを含む組成物、又は非プロトン性双性イオンと水からなる組成物を凍結保存用培地として用いることができる。上記非プロトン性双性イオンと水とを含む組成物は、１種以上の細胞内浸透性物質、例えばグリセリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、及びプロピレングリコールを含んでいても良い。また、上記非プロトン性双性イオンと水とを含む組成物は、栄養素（例えば細胞を増殖するための糖類等）、ペプチドやたんぱく質（例えば血清もしくは血清から精製したタンパク質あるいはペプチド等）を含まなくともよい。特に、上記非プロトン性双性イオンと水とを含む組成物は、当該組成物が冷凍保存剤として作用する場合、上記栄養素、ペプチドやたんぱく質を含まなくとも良い。
したがって、本発明は、上記式（４）又は式（５）で表される非プロトン性双性イオン及び水を含む凍結保存用培地、式（４）又は式（５）で表される非プロトン性双性イオンと水とからなる凍結保存用培地に関する。さらには、本発明は、上記式（４）又は式（５）で表される非プロトン性双性イオンを含む凍結保存剤にも関する。
本発明に係る非プロトン性双性イオンは、非プロトン性双性イオンと水とのみからなる組成物を凍結保存用培地として用いることもできる。凍結保存用培地は、細胞、組織及び個体のいずれのレベルでも用いることが可能である。本発明に係る凍結保存剤は、さらに、ペプチドやたんぱく質などを添加しなくても凍結保存用培地として用いることができる。
このような本発明に係る非プロトン性双性イオンと水とのみからなる凍結保存用培地に、従来の細胞浸透性物質を添加剤として添加しても良い。ここで細胞浸透性物質は、従来の凍結保存剤として培地への添加剤として用いられているものであれば添加剤として使用することができる。そのような物質としては、より具体的には、グリセリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、プロピレングリコールなどを挙げることができる。
このように、本発明に係る凍結保存用培地又は凍結保存剤には、血清もしくは血清から精製したタンパク質あるいはペプチド等と混合する必要がなく、単独で用いることができるため、ウイルス等の汚染リスクがなく、再生医療における拒絶反応を回避することができる。また、細胞増殖に必要な糖類などの栄養素を添加する必要もないので、微生物の影響を少なくすることが可能である。
上記非プロトン性双性イオンと水とを含む組成物、又は非プロトン性双性イオンと水からなる組成物を凍結保存用培地として用いる場合、非プロトン性双性イオンは、組成物に対して、通常１重量％以上、好ましくは５重量％以上として用いられ、上限は、通常３０重量％以下、好ましくは２０重量％以下、好ましくは１５重量％以下で用いられる。
また、凍結保存用培地としての、非プロトン性双性イオンと水とを含む組成物、又は非プロトン性双性イオンと水からなる組成物（非プロトン性双性イオン水溶液ともいう）１００重量部に対して、細胞浸透性物質を添加剤として追加して用いることができる。細胞浸透性物質は、非プロトン性双性イオン水溶液１００重量部に対して、通常は少なくとも１重量部、好ましくは１０重量部以上、上限は、通常３０重量部以下、好ましくは２０重量部以下、より好ましくは１５重量部以下を添加して用いることができる。なお、本明細書において、非プロトン性双性イオンの水溶液１００重量部に対して１重量部添加した場合を、非プロトン性イオンの水溶液に対して１％と記載する場合がある。
本発明は、上記式（４）又は式（５）で表される非プロトン性双性イオンを含む：細胞、組織又は個体の未分化促進剤；細胞、組織又は個体の冷凍保存剤；氷結晶形成抑制剤；未分化維持剤；ガラス化剤；凍結乾燥剤；細胞、組織又は個体の脱水剤；細胞、組織又は個体の低温（常温以下）保存剤；細胞、組織又は個体の低温（常温以下）輸送用溶液にも関する。
本発明にて用いる非プロトン性双性イオンの種類は、保存する細胞の由来や、種類に応じて適宜に選択することができる。当業者は、例えば以下のような観点から、非プロトン性双性イオンの種類やその濃度等を適宜選択することができる。非プロトン性双性イオンＣ１ｉｍＣ２Ｃ、Ｃ１ｉｍＣ３Ｃ、Ｃ１ｉｍＣ５Ｃなどは、マウス上皮線維芽細胞由来細胞及びヒト腎由来細胞に対してほぼ同様に使用ができると考えられる。Ｃ１ｉｍＣ３Ｃ、Ｃ１ｉｍＣ５Ｃに対する毒性は、ヒト腎由来細胞の方が濃度に対する感受性が異なるようである。また、ＶｉｍＣ３Ｃ、ＶｉｍＣ３Ｓ、Ｖｉｍ４Ｃ、ＶｉｍＣ４Ｓ、ＡｉｍＣ３Ｃ、ＡｉｍＣ３Ｓ、ＡｉｍＣ４ＳなどはＯＥ２ｉｍＣ３Ｃに対する相対的な評価では、ヒト腎細胞由来細胞の方が大きな効果をもたらすことが期待される。
本発明にて用いる非プロトン性双性イオンを含む培地は、細胞機能への影響が非常に少ない。例えば、細胞周期に対し従来から添加剤として用いられているＤＭＳＯは細胞周期に与える影響が大きいが、本発明にて用いる非プロトン性双性イオンは細胞周期にほとんど影響を与えない。また、上記非プロトン性双性イオンを受精卵の培地に用いる場合、従来から用いられるＤＭＳＯを添加した場合と異なり、正常に発生することが示されている。理論に拘束されるものではないが、本発明にて用いる非プロトン性双性イオンを培地に添加した場合にｉＰＳ細胞が未分化マーカーを放出し続ける理由の一つとして、当該非プロトン性双性イオンがｉＰＳ細胞の機能に影響を与えないことが考えられる。
上記非プロトン性双性イオン水溶液、すなわち非プロトン性双性イオンと水とを含む組成物、又は非プロトン性双性イオンと水からなる組成物のガラス転移点（Ｔｇ）は、－７０℃以下、好ましくは－７５℃以下、さらに好ましくは－８０℃である（特に１０重量％の非プロトン性双性イオン水溶液として）。本発明にて用いる非プロトン性双性イオンを凍結保存用培地又は凍結保存剤に用いる場合、冷凍保存される材料によっても好ましいＴｇは異なり、一般に、融点以下の温度においてなるべく結晶が育たない過冷却状態でガラス転移点まで到達し、それ以下の温度においてもガラス状態で保存される状態が良い。保存試料自身のＴｇ及び保存温度との関係で適切なＴｇを有する非プロトン性双性イオンを含む培地を選ぶことができる。このように適切な培地を選ぶことにより保存の質を改変することができる。
理論に拘束されるものではないが、従来から用いられているＤＭＳＯ系の培地と本発明にて用いる非プロトン性双性イオンとの違いは、細胞浸透性の違いによる影響が考えられる（例えば、Golan, M. etal. Afm monitoring the influence of selected cryoprotectants on regeneration of cryopreserved cells mechanical properties. Front Physiol 9, 804 (2018)）。すなわち、ＤＭＳＯやグリセリンは細胞内に侵入するが本発明にて用いる非プロトン性双性イオンは細胞内には侵入しないことが考えられる。また、細胞膜透過をするかどうかについてはコンピュータシミュレーションで示すことができる。本発明により細胞機能に影響せずに保存ができる要因の一つとして、非プロトン性双性イオンの細胞透過性が従来用いられていた保存用の添加剤と異なることが挙げられる。理論に拘束されるものではないが、本発明の非プロトン性双性イオンが冷凍保存に適し、また培地として用いても細胞機能に影響を与えないことの理由として、例えば、非プロトン性双性イオンが細胞膜を透過しないことにより：細胞外が高張液となって細胞内から自由水が排出され、細胞内における自由水による氷晶の生成が最低限に抑えられていること；細胞外にあっては、非プロトン性双性イオンの静電的な効果で細胞外の水の構造化が促進され、やはり大きな氷晶の生成が防止されていることが考えられる。
本発明に係る非プロトン性双性イオンに従来から用いられているグリセリンやジメチルスルホキシドを添加しても市販品と同等の保存性を示すことができる。
次に、実施例及び比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（細胞）
ヒト線維芽細胞－１（ｈＮＦ－１）（Human Normal Fibroblast 1）は、倉敷紡績株式会社より購入した。ヒト線維芽細胞－２（ｈＮＦ－２）（Human Normal Fibroblast 2）は、ヒト肺がん細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（英国フランシスクリック研究所Erik Sahai教授より入手）より樹立したものを用いた。マウス線維芽細胞（ｍＮＦ）（Mouse Normal Fibroblaast）は、Ｃ５７ＢＬ／６－ＥＧＦＰマウスより樹立したものを用いた。ヒト腎細胞は、英国フランシスクリック研究所Erik Sahai教授より入手した。
（評価物質）
本発明に用いられる非プロトン性双性イオンは、J. Am. Chem. Soc. 139, 16052-16055 (2017)を参考にして製造することができる。
（合成例１）ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ
Figure 2023123780000049
 １５．７ｇ（６５６ｍｍｏｌ）のＮａＨ（関東化学株式会社）を５０ｍＬのテトラヒドロフラン（富士フイルム和光純薬株式会社）に懸濁させ、１３．８ｇ（２０２ｍｍｏｌ）のイミダゾール（東京化成工業株式会社）を添加し、室温で２４時間撹拌した。３７．０ｇ（２０２ｍｍｏｌ）の１－ブロモ－２－（２－メトキシエトキシ）エタン（東京化成工業株式会社）を加え、７０℃で６時間撹拌した。白色の析出物を濾別し、ろ液を濃縮後、蒸留（１２５℃、１ｍｍＨｇ）により１－（２－（２－メトキシエトキシ）エチル）イミダゾールを得た。これを２５０ｍＬのアセトニトリルに溶解し、２９ｇ（１５０ｍｍｏｌ）のエチル４－ブロモブチレートを加え、８０℃で１６時間還流した。ジエチルエーテルで洗浄後、アニオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ ７８Ａ）のカラムに付した。溶出液を減圧留去することでＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを得た。
ＮＭＲデータ：δ=2.13-2.27 (4H, m, CH2CO and CH2CH2CO), 3.37 (3H, s, CH3O), 3.51-3.65 (4H,m, CH3OCH2CH2), 3.86 (2H, t, J = 3.6Hz, OCH2CH2N), 4.40 (2H, t, J=6.7Hz, NCH2CH2CH2COO), 4.66 (2H, t, J=3.7Hz, OCH2CH2N), 7.29 and 7.49 (2H, t, J= both 1.6 Hz, NCHCHN), 11.00 (1H, s, NCHN). 13C NMR (100 MHz; CDCl3; Me4Si) δ = 27.20 and 34.30 (NCH2CH2CH2COO), 48.94 (OCH2CH2N), 49.47 (NCH2CH2CH2COO), 58.65 (CH3O),69.19 (OCH2CH2N), 69.93 and 71.29 (OCH2CH2O), 121.22 and 122.58 (NCHCHN), 138.73(NCHN), 176.63 (CH2COO). Elemental analysis: OE2imC3C・2.5H2O (Found: C, 48.0; H, 8.4; N,9.3. Calc. for C12H25N2O6.5: C, 47.8; H, 8.4; N, 9.3%).
（合成例２）ＯＥ２ｉｍＣ５Ｃ
Figure 2023123780000050
 合成例１において、エチル４－ブロモブチレートの代わりにエチル６－ブロモヘキサノエートに替えた以外は、合成例１と同様の手順により、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ５Ｃを合成した。
（合成例３）ＯＥ１ｉｍＣ３Ｃ
Figure 2023123780000051
 合成例１において、１－ブロモ－２－（２－メトキシエトキシ）エタンの代わりに１－ブロモー（２－メトキシ）エタンを用いた以外は合成例１と同様の手順により、非プロトン性双性イオンＯＥ１ｉｍＣ３Ｃを合成した。
（合成例４）Ｃ１ｉｍＣ３Ｃ
Figure 2023123780000052
 ２２．２ｇ（２７０ｍｍｏｌ）の１－メチルイミダゾールと（５３．７ｇ：２７０ｍｍｏｌ）のエチル４－ブロモブチレートを、２０ｍＬのアセトニトリルに溶解させ、５０℃で５ｈｒ撹拌した。析出物を除去後、減圧乾燥し、ジエチルエーテルで３回洗浄し、減圧乾燥した。残渣を陰イオン交換樹脂に付しＣ１ｉｍＣ３Ｃを得た。1H NMR (400 MHz; DMSO-d6; Me4Si) δ = 1.77 (2H, t, J = 6.4 Hz, CH2CO), 1.86 (2H, J = 7.3 Hz, quin, CH2CH2CO), 3.82 (3H, s, CH3N), 4.13 (2H, t, J = 6.8 Hz, NCH2CH2), 7.66 and 7.76 (2H, t, J = both 1.6 Hz, NCHCHN), 9.50 (1H, s, NCHN). 13C NMR (100 MHz; DMSO-d6; Me4Si) δ = 27.80 (CH2CH2CO), 35.36 (CH2CO), 36.10 (CH3N), 49.61 (NCH2CH2), 122.91 and 123.89 (NCHCHN), 137.700 (NCHN), 174.02 (CH2COO).
（合成例５）Ｃ１ｉｍＣ２Ｃ
Figure 2023123780000053
 合成例４で、エチル４―ブロモブチレートの代わりに、（β－プロピオラクトン）（富士フイルム和光純薬株式会社）を用い、水中で８０℃で１６時間撹拌した。減圧乾燥し、ジエチルエーテルで３回洗浄し、アルミナで副生成物を除いた後に減圧乾燥することでＣ１ｉｍＣ２Ｃを得た。
（合成例６）Ｃ４ｉｍＣ３Ｃ
Figure 2023123780000054
 合成例４において、１－メチルイミダゾールの代わりに４－ブチルイミダゾールを用いて、合成例４と同様の操作を行い、Ｃ４ｉｍＣ３Ｃを合成した。
（合成例７）Ｃ８ｉｍＣ３Ｃ
Figure 2023123780000055
 合成例４において、１－メチルイミダゾールの代わりに４－オクチルイミダゾール（東京化成工業株式会社）を用いて、合成例４と同様の操作を行い、Ｃ８ｉｍＣ３Ｃを合成した。
（合成例８）Ｃ４ｉｍＣ５Ｃ
Figure 2023123780000056
 合成例４において、１－メチルイミダゾールの代わりに４－ブチルイミダゾールを用い、エチル４－ブロモブチレートの代わりに、エチル６－ブロモヘキシレート（東京化成工業株式会社）を用いた以外は合成例４と同様の操作を行い、Ｃ４ｉｍＣ５Ｃを得た。
（合成例９）ＶｉｍＣ３Ｃ
Figure 2023123780000057
 合成例４において、１－メチルイミダゾールの代わりに、ビニルイミダゾール（東京化成工業株式会社）を用いた以外は、合成例４と同様の操作を行いＶｉｍＣ３Ｃを得た。
（合成例１０）ＡｉｍＣ３Ｃ
Figure 2023123780000058
 合成例４において、１－メチルイミダゾールの代わりに、アリルイミダゾール（東京化成工業株式会社）を用いた以外は合成例４と同様な操作を行い、ＡｉｍＣ３Ｃを得た。
（合成例１１）ＯＥ２ｉｍＣ３Ｓ
Figure 2023123780000059
 合成例１において、エチル４－ブロモブチレートの代わりにエチル４－ブロモブチレートを１，３－プロパンスルトンを用いた以外は、合成例１と同様の手順により、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｓを得た。
（合成例１２）Ｃ１ｉｍＣ３Ｓ
Figure 2023123780000060
 合成例１１において、１－（２－（２－メトキシエトキシ）エチル）イミダゾールの代わりに１－メチルイミダゾールを用いた以外は、合成例１と同様の手順により、非プロトン性双性イオンＣ１ｉｍＣ３Ｓを合成した。
（合成例１３）ＶｉｍＣ３Ｓ
Figure 2023123780000061
 合成例１２において、１－メチルイミダゾールの代わりに、１－ビニルイミダゾールを用いたい以外は、合成例１２と同様の操作を行い、ＶｉｍＣ３Ｓを得た。
（合成例１４）ＶｉｍＣ４Ｓ
Figure 2023123780000062
 合成例１２において、１－メチルイミダゾールの代わりに１－ビニルイミダゾール（東京化成工業株式会社）を用い、１，３－プロパンスルトンの代わりに、１，４－ブタンスルトン（東京化成工業株式会社）を用いた以外は合成例１２と同様の操作を行い、ＶｉｍＣ４Ｓを得た。
（合成例１５）ＡｉｍＣ３Ｓ
Figure 2023123780000063
 合成例１２において、１－メチルイミダゾールの代わりに１－アリルイミダゾールを用いた以外は合成例１２と同様な操作を行い、ＡｉｍＣ３Ｓを得た。
（合成例１６）ＡｉｍＣ４Ｓ
Figure 2023123780000064
 合成例１４において、１－メチルイミダゾールの代わりに１－アリルイミダゾールを用いた以外は合成例１４と同様な操作を行い、ＡｉｍＣ４Ｓを得た。
（合成例１７）Ｃ８ｉｍＣ４Ｓ
Figure 2023123780000065
 合成例１４において、１－メチルイミダゾールの代わりに１－オクチルイミダゾールを用いた以外は合成例１４と同様な操作を行い、Ｃ８ｉｍＣ４Ｓを得た。
（合成例１８）ＰｙＣ３Ｃ
Figure 2023123780000066
 合成例４において、１－メチルイミダゾールの代わりにピリジン（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いた以外は合成例４と同様な操作を行い、ＰｙＣ３Ｃを得た。
（合成例１９）ＰｙｒｒＣ３Ｃ
Figure 2023123780000067
 合成例４において、１－メチルイミダゾールの代わりにピロリジン（東京化成工業株式会社）を用いた以外は合成例４と同様な操作を行い、ＰｙｒｒＣ３Ｃを得た。
（合成例２０）Ｎ２，２，ＯＥ２，Ｃ３Ｃ
Figure 2023123780000068
 １５．７ｇ（６５６ｍｍｏｌ）のＮａＨ（関東化学株式会社）を５０ｍＬのテトラヒドロフラン（富士フイルム和光純薬株式会社）に懸濁させ、１４．６ｇ（２００ｍｍｏｌ）のジエチルアミン（東京化成工業株式会社）を添加し、室温で２４時間撹拌した。３６．６ｇ（２００ｍｍｏｌ）の１－ブロモ－２－（２－メトキシエトキシ）エタン（東京化成工業株式会社）を加え、７０℃で６時間撹拌した。白色の析出物を濾別し、ろ液を濃縮後、蒸留（１２５℃、１ｍｍＨｇ）により１－（２－（２－メトキシエトキシ）エチル）イミダゾールを得た。これを２５０ｍＬのアセトニトリルに溶解し、２９ｇ（１５０ｍｍｏｌ）のエチル４－ブロモブチレートを加え、８０℃で１６時間還流した。ジエチルエーテルで洗浄後、アニオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ ７８Ａ）のカラムに付した。溶出液を減圧留去することでＮ２，２，ＯＥ２，Ｃ３Ｃを得た。
１．未分化促進剤
（実施例１）
（１）非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ（被験物質）の合成
（２）未分化特異的遺伝子発現解析
1) ヒトｉＰＳ細胞培養
1-1) ヒトｉＰＳ細胞前培養
ヒトｉＰＳ細胞（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）は、ＳＮＬフィーダー細胞（セルバイオラボ社製）上に起眠し、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤）内で培養した。翌日、培地交換し、８０％コンフルエントになるまで、毎日培地交換を行った。８０％コンフルエントに到達した時点で細胞を回収して継代した。細胞の継代方法は以下の通りである。細胞をＤＰＢＳ（－）（no calcium, no magnesium, Thermo Fisher Scientific Inc.）で洗浄後、ＣＴＫ溶液（(0.25% trypsin + 1mg/ml collagenase IV + 1 mM CaCl2 + 20% KSR in DPBS (-))）で処理した。ＣＴＫ溶液除去し、ＤＰＢＳ（－）で２回洗浄した。培地を加えて、細胞をスクレーパーで回収し、ピペッティングにより５０～２００μｍ程度に細胞塊に砕いた後、ＳＮＬフィーダー細胞上へ適切な割合で細胞を播種した。
1-2) ヒトｉＰＳ細胞分散培養
上記継代方法におけるＣＴＫ溶液処理後、ＤＰＢＳ（－）で１回洗浄し、０．５ｘ ＴｒｙｐＬＥ（商標） Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦＩｓｈｅｒ製）でシングルセルにし、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（三菱ウェルファーマ社製）を含むｉＰＳ細胞培地９ｍｌを入れた１５ｍｌ遠心管に回収した。遠心（室温、１８０ｘｇ、５分）後、上清を除き、新たにＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２を含むｉＰＳ細胞培地で懸濁し、生細胞数のカウントを行った。ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２を含むヒトｉＰＳ細胞培地を用いて、目的の細胞濃度に調製し、試験に使用する培養器に播種した。
2) 本試験
2-1) 被験物質による処理（フィーダー細胞有り）
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２を含むヒトｉＰＳ細胞培地で５×１０３細胞／０．１ｍｌ／ウェルとなるように、９６ウェルプレート（前日にＳＮＬフィーダーを播種）に播種し、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤）で１日培養した。翌日、被験物質（３段階濃度：０．４、１．０及び２．０％（ｗ／ｖ））添加ヒトｉＰＳ細胞培地、並びに無添加ヒトｉＰＳ細胞培地に置換した。その後、８０％コンフルエントになるまで再培養し、発現解析に用いた。
2-2) 被験物質による処理（フィーダー細胞無し）
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２を含むヒトｉＰＳ細胞培地で５×１０３細胞／０．１ｍｌ／ウェルとなるように、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ（マトリクソーム社製）でコートした９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤）で１日培養した。翌日、被験物質（２段階濃度：１．０及び２．０％（ｗ／ｖ））添加ＳＮＬ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地（フィーダー細胞を培養後、フィーダー細胞を除いた培地。ただしフィーダー細胞由来の栄養が含まれる。）及び無添加ＳＮＬ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地に置換した。その後、８０％コンフルエントになるまで再培養し、発現解析に用いた。
3) 遺伝子発現解析
続いて、未分化特異的遺伝子Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４の発現量を測定した。なお、Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ３／４は、自己複製能の促進と未分化状態の維持に関わる転写因子であり、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞において高いレベルで発現しているため、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の未分化マーカーとして広く使用されている。以下の方法によって、未分化マーカーの発現量を定量した。
3-1) ＦａｓｔＬａｎｅライセート（ＲＮＡ）抽出
ＦａｓｔＬａｎｅ Ｃｅｌｌ ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いＦａｓｔＬａｎｅライセート（ＲＮＡ）を抽出した。
3-2) ｃＤＮＡ合成
ＦａｓｔＬａｎｅライセート（ＲＮＡ）から、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
3-3) 定量ＰＣＲ
ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を用いて、９５℃、３０秒；（９５℃、５秒；６０℃、３０秒）×４０；Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの条件でＯＣＴ３／４とＮＡＮＯＧの定量ＰＣＲを実施した。遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した値で表し、陰性対照区（無添加）の発現量を１として算出した。実験はＮ＝３で行い、陽性対照区と比較し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ－ｔｅｓｔ（両側検定、対応無し）においてｐ値が０．０５未満のものを有意と判定した。
（３）解析結果
ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを添加しない場合に対するＮａｎｏｇ及びＯｃｔ３／４の相対的な発現量の測定結果を図１（フィーダー細胞有り）及び図２（フィーダー細胞無し）にそれぞれ示す（Ｎ＝３）。
図１及び図２に示すように、フィーダー細胞を含む場合、含まない場合のいずれも、双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを添加することにより、未分化マーカーを増幅させ、細胞の未分化を促進することが分かった。
２．凍結保護剤
（実施例２）
（１）細胞凍結実験１（緩慢凍結法）
（ａ）非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃの合成
合成例１により、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを合成した。
（ｂ）凍結保存液の調製
以下の組成を有する４種類の凍結保存液を準備した。
・ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）凍結保存溶液（富士フィルム和光純薬社製）（以下、「ＦＭ」）
・Ｈ２Ｏ
・５重量％ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ
・５重量％ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ／Ｈ２Ｏ
（ｃ）細胞の凍結保存
凍結対象とする細胞（２種類）をトリプシン処理にて遠沈回収し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて希釈して細胞濃度をそれぞれ計測した。細胞の種類と細胞濃度は以下のとおりである。
・ヒト皮膚線維芽細胞 ５．０×１０５細胞／１００μｌ
・マウス線維芽細胞Ｃ５７ＢＬ／６－ＧＦＰ ５．０×１０５細胞／１００μｌ
続いて、１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ分注して遠沈し、１００μｌの上記凍結保存液にそれぞれ懸濁し、細胞凍結容器Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（登録商標）を用いて、冷却速度－１℃／分、冷却温度－８０℃で凍結した。
（ｄ）細胞の解凍と生細胞数の計測
凍結保存バイアルに１ｍｌの培地を加えて融解し、遠沈して上清を除いた。続いて、遠沈により得られた細胞を培地に再懸濁し、生細胞数を計測した。その結果を図３及び図４に示す。その後、６ウェルプレートにて培養を開始した。
（ｅ）２４時間後の細胞状態の確認
培養開始から２４時間後に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にてサンプルを固定し、顕微鏡観察を行った。その結果を図５に示す。
（ｆ）実験結果
図３及び図４に示すように、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを含む凍結保存剤を用いた場合は、従来のＤＭＳＯより解凍後の細胞の生細胞数が多かった。このことから、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃは凍結保護剤として有効であることが分かった。特に、ヒト皮膚線維芽細胞を凍結・解凍した場合（図３）は、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃは市販の凍結保存液（ＦＭ）よりも優れていた。
また、図５に示すように、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを用いて凍結保存した細胞は、市販品（ＦＭ）と同様に、細胞がディッシュ底面に接着していることが確認され、細胞の機能が保たれていることが分かった。
（実施例３）
（２）細胞凍結実験２（緩慢凍結法）
（ａ）５種類の非プロトン性双性イオンの合成
実験に用いた非プロトン性双性イオンは上記合成例により基づいて合成した。
（ｂ）凍結保存液の調製
以下の組成を有する６種類の凍結保存液を準備した。
・５重量％ＯＥ２ｉｍＣ５Ｃ／Ｈ２Ｏ
・５重量％Ｃ１ｉｍＣ３Ｃ／Ｈ２Ｏ
・５重量％ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ／Ｈ２Ｏ
・５重量％Ｃ１ｉｍＣ３Ｓ／Ｈ２Ｏ
・５重量％Ｎ２，２，ＯＥ２，Ｃ３Ｃ／Ｈ２Ｏ
・ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）凍結保存溶液（富士フィルム和光純薬社製）（以下、「ＦＭ」）
（ｃ）細胞の凍結保存
凍結対象とする細胞をトリプシン処理にて遠沈回収し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて希釈して細胞濃度をそれぞれ計測した。細胞の種類と細胞濃度は以下のとおりである。
・ヒト皮膚線維芽細胞 ５．０×１０５細胞／１００μｌ
続いて、１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ分注して遠沈し、１００μｌの上記凍結保存液にそれぞれ懸濁し、細胞凍結容器Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（登録商標）を用いて、冷却速度－１℃／分、冷却温度－８０℃で凍結した。
（ｄ）細胞の解凍と生細胞数の計測
凍結保存バイアルに１ｍｌの培地を加えて融解し、遠沈して上清を除いた。続いて、遠沈により得られた細胞を培地に再懸濁し、生細胞数を計測した。その結果を図６に示す。
（ｅ）実験結果
図６に示すように、本発明の非プロトン性双性イオンはいずれも、十分に高い細胞生存率を維持することができ、凍結保護剤として有効であることが分かった。特に、カチオン部位がイミダゾリウムカチオンである非プロトン性双性イオンは、市販の凍結保存液（ＦＭ）と同等以上の性能を発揮することが明らかとなった。
（３）細胞凍結実験３（急速凍結法）
（実施例４）
（ａ）非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃの合成
上記１（１）と同様の手順により、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを合成した。
（ｂ）凍結保存液の調製
以下の組成を有する４種類の凍結保存液を準備した。
・ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞凍結保存液ＤＡＰ２１３（リプロセル社製）
・７５重量％ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ／Ｈ２Ｏ
・５０重量％ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ／Ｈ２Ｏ
・２５重量％ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ／Ｈ２Ｏ
（ｃ）細胞の凍結保存
凍結対象とする細胞（２種類）をトリプシン処理にて遠沈回収し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて希釈して細胞濃度をそれぞれ計測した。細胞の種類と細胞濃度は以下のとおりである。
・ヒト皮膚線維芽細胞 ８．２×１０５細胞／１００μｌ（Ｎ＝３）
・マウス線維芽細胞Ｃ５７ＢＬ／６－ＧＦＰ １．２×１０６細胞／１００μｌ（Ｎ＝３）
続いて、１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ分注して遠沈し、１００μｌの上記凍結保存液にそれぞれ懸濁し、直後に液体窒素にて１０～１５秒以内に急速凍結した。その後、液体窒素タンクにて３日間保存した。
（ｄ）細胞の解凍と生細胞数の計測
凍結保存バイアルを１ｍｌの培地にて急速融解し、遠沈して上清を除いた。続いて、遠沈により得られた細胞を培地に再懸濁し、生細胞数を計測した。その結果を図７及び図８に示す。その後、６ウェルプレートにて培養を開始した。
（ｅ）２４時間後の生細胞数の計測
培養開始から２４時間後の生細胞数を計測した。その結果を図９及び図１０に示す。
（ｆ）実験結果
図７及び図８に示すように、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを含む凍結保存剤を用いて急速凍結を行った場合の解凍後の生細胞数は、市販の凍結保存液ＤＡＰ２１３に匹敵する値であった。凍結保存液中の非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃの濃度は、低い濃度（２５重量％）とした方が細胞の生存率が高かった。
また、図９及び図１０に示すように、非プロトン性双性イオンＯＥ２ｉｍＣ３Ｃを含む凍結保存剤を用いて急速凍結を行い、２４時間培養した後の生細胞数についても、市販の凍結保存液ＤＡＰ２１３には劣るものの、同様に高い値が得られた。
（４）細胞凍結実験４（緩慢凍結法）
（実施例５）～（実施例２８）
（ａ）非プロトン性双性イオンの合成
実験に用いた非プロトン性双性イオンは上記合成例により基づいて合成した。
（ｂ）凍結保存液の調製
凍結保存液は、各例の非プロトン性双性イオンに精製水を加えて溶かし、５重量％、１０重量％の試験液を調整した。
（ｃ）細胞の凍結保存
凍結対象とする細胞をトリプシン処理にて遠沈回収し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて希釈して細胞濃度をそれぞれ計測した。細胞の種類と細胞濃度は以下のとおりである。
・マウス皮膚線維芽細胞 ５．０×１０５細胞／１００μｌ
・ヒト腎脂肪細胞 ５．０×１０５細胞／１００μｌ
続いて、１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ分注して遠沈し、１００μｌの上記凍結保存液にそれぞれ懸濁し、細胞凍結容器Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（登録商標）を用いて、冷却速度－１℃／分、冷却温度－８０℃で凍結した。
（ｄ）細胞の解凍と生細胞数の計測
凍結保存バイアルに１ｍｌの培地を加えて融解し、遠沈して上清を除いた。続いて、遠沈により得られた細胞を培地に再懸濁し、生細胞数を計測した。
結果は、ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃの生細胞数に対する比率で表した。
（ｅ）ガラス転移点、熱量
ガラス転移点及び熱量は、示差走査熱量測（ＤＳＣ）により求めた。冷却速度を－１℃とし、加熱速度を５℃として測定を行った。
Figure 2023123780000069
Figure 2023123780000070
Figure 2023123780000071
Figure 2023123780000072
いずれの双性イオンも－７０℃以下のガラス転移点を観測した。マウス由来細胞とヒト由来細胞では、双性イオンごとに異なる傾向を示した。
（５）細胞周期に与える影響
（実施例２９）
細胞はヒト線維芽細胞を用いた。
試験区は、コントロールに対してＤＭＳＯ及びＨＬＳ（ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ）を１％添加区、２％添加区とした。
細胞周期分析は、５－ｅｔｈｙｎｙｌ－２´－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＥｄＵ）を用いたＣｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＥｄＵ細胞増殖アッセイ（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いメーカーのプロトコールに従い行った。細胞を１０μＭ ＥｄＵで１ｈｒインキュベーションし、トリプシン処理後、４％ＰＦＡで固定し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｐｉｃｏｌｙｌ ａｚｉｄｅでラベルした。細胞を４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ （ＤＡＰＩ）で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標） ＩＩＩ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。結果を図１１に示す。ＤＭＳＯ添加２％では、Ｇ０／Ｇ１期が延長されＳ期が大幅に短縮したのに対して、ＨＬＳ（ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ）２％に対しても、無添加の場合と比べてほとんど影響はなかった。
（６）ゼブラフィッシュの発生に与える影響
（実施例３０）
すべての実験は金沢大学動物実験委員会により承認されたプロトコールに基づいて行った。野生種のゼブラフィッシュＡＢ＊を、循環水システム中、２８．５℃、明１４ｈｒ／暗１０ｈｒのサイクルで生育させた。培地はＥ３培地（5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4）を用い、培地にＤＭＳＯ又はＨＬＳ（ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ）を１％、２％、５％、１０％を添加した。それぞれの試験区において受精後、１．５～２４時間培養した。培養後、胚はＥ３培地で２度洗浄し、色素沈着を防止するために１－ｐｈｅｎｙｌ－２－ｔｈｉｏｕｒｅａ（富士フイルム和光純薬）で処理をした。０．６ｍｇ／ｍＬの ｏ－ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ（東京化成）で１５分間染色し、４％パラホルムアルデヒド（富士フイルム和光純薬）で固定した。胚は、０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）リン酸緩衝生理食塩液で２回洗浄した。結果を表５及び図１２に示す。２％添加区において、ＤＭＳＯとＨＬＳ（ＯＥ２ｉｍＣ３Ｃ）の２％添加区までの生存率は両者とも同様であったが、５％添加区では生存率に大きな差が出た。また、５％ＤＭＳＯで生存していた受精卵は正常な発生をしなかった。
Figure 2023123780000073
（７）培地用添加剤としての使用
（実施例３１～６１）
（ａ）５種類の非プロトン性双性イオンの合成
実験に用いた非プロトン性双性イオンは上記合成例により基づいて合成した。
天然の非プロトン性双性イオンとして、クレアチン、ベタインを用いた。
（ｂ）凍結保存液の調製
凍結保存液は、検体である非プロトン性双性イオン５ｇ又は１０ｇを培地基剤である精製水に溶かして１００ｇとし、凍結保存液とした。
調製した保存液１００重量部に対して、添加剤を５重量部及び１０重量部を添加して、サンプルとした。
（ｃ）細胞の凍結保存
凍結対象とする細胞をトリプシン処理にて遠沈回収し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて希釈して細胞濃度をそれぞれ計測した。細胞の種類と細胞濃度は以下のとおりである。
・マウス皮膚線維芽細胞 ５．０×１０５細胞／１００μｌ
・ヒト腎脂肪細胞 ５．０×１０５細胞／１００μｌ
・Ｋ５６２ ５．０×１０５細胞／１００μｌ
続いて、１．５ｍｌチューブに１ｍｌずつ分注して遠沈し、１００μｌの上記凍結保存液にそれぞれ懸濁し、細胞凍結容器Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（登録商標）を用いて、冷却速度－１℃／分、冷却温度－８０℃で凍結した。
（ｄ）細胞の解凍と生細胞数の計測
凍結保存バイアルに１ｍｌの培地を加えて融解し、遠沈して上清を除いた。続いて、遠沈により得られた細胞を培地に再懸濁し、生細胞数を計測した。
結果は、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（富士フイルム和光純薬）の細胞生存数に対する比率で表した。
Figure 2023123780000074
Figure 2023123780000075

Claims (19)

  1. 非プロトン性双性イオンを含む未分化促進剤。
  2. 前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオンからなる群から選択されるカチオンである請求項１に記載の未分化促進剤。
  3. 前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン又はアンモニウムカチオンである請求項１に記載の未分化促進剤。
  4. 前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、置換基として分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～８個のアルキル基を１個以上有する請求項１～３のいずれか１項に記載の未分化促進剤。
  5. 前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位とアニオン部位との間が、分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～５個の１個以上のアルキレン基を介して結合される請求項１～４のいずれか１項に記載の未分化促進剤。
  6. 前記非プロトン性双性イオンが、下記式（１）
    Figure 2023123780000076
     （式中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンであり、Ｒ１は、分子鎖中に１又は２個の酸素原子を含んでいても良い炭素数１～８個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
    で表される請求項１に記載の未分化促進剤。
  7. 前記非プロトン性双性イオンが、下記式（２）又は式（３）
    Figure 2023123780000077
    Figure 2023123780000078
     （式中、Ｒ１及びＲ２は、請求項６で定義したとおりである。）
    で表される請求項６に記載の未分化促進剤。
  8. 非プロトン性双性イオンを含む凍結保護剤。
  9. 前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオンからなる群から選択されるカチオンである請求項８に記載の凍結保護剤。
  10. 前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン又はアンモニウムカチオンである請求項８に記載の凍結保護剤。
  11. 前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位が、置換基として分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～８個のアルキル基を１個以上有する請求項８～１０のいずれか１項に記載の凍結保護剤。
  12. 前記非プロトン性双性イオンのカチオン部位とアニオン部位との間が、分子鎖中に１個以上のヘテロ原子を有していても良い炭素数１～５個の１個以上のアルキレン基を介して結合される請求項８～１１のいずれか１項に記載の凍結保護剤。
  13. 前記非プロトン性双性イオンが、下記式（１）
    Figure 2023123780000079
     （式中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンであり、Ｒ１は、分子鎖中に１又は２個の酸素原子を含んでいても良い炭素数１～８個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
    で表される請求項８に記載の凍結保護剤。
  14. 前記非プロトン性双性イオンが、下記式（２）又は式（３）
    Figure 2023123780000080
    Figure 2023123780000081
     （式中、Ｒ１及びＲ２は、請求項１３で定義したとおりである。）
    で表される請求項１３に記載の凍結保護剤。
  15. 一般式（４）で表される非プロトン性双性イオンを含む凍結保存用培地。
    Ｒ４－Ｘ－Ｒ２－Ａ （４）
    （式中、Ｒ４は炭素数１～７個のアルキル基、炭素数１～７個のアルケニル基、又はエーテル結合を含む炭素数１～７個のアルキル基であり、Ｘは双性イオンのカチオン部であり、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニリウムカチオン及びピペリジニウムカチオンからなる群から選択されるカチオンを表し、Ａはアニオン部を表し、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンを表し、Ｒ２は、炭素数１～５個の置換基を有していても良いアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
  16. 一般式（４）において、Ｘは、窒素原子１個又は２個以上含む炭素数１～６個の環状構造を有し、窒素原子上には１個又は２個以上の置換基を有し、Ａはカルボキシル基又はスルホン酸基であり、カチオンは窒素上に存在するか又はＸ全体に非局在化しており、アニオンはカルボキシル基又はスルホン酸基上に存在する、請求項１５に記載の凍結保存用培地。
  17. 前記非プロトン性双性イオンが、下記式（１）
    Figure 2023123780000082
     （式中、Ａは、ＳＯ３ －、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ３）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ３）Ｏ－からなる群から選択されるアニオンであり、Ｒ１は、炭素数１～７個のアルキル基、炭素数１～７個のアルケニル基、又はエーテル結合を含む炭素数１～７個のアルキル基であり、Ｒ２は、炭素数３～５個のアルキレン基であり、Ｒ３は、水素もしくは分子鎖中にヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。）
    で表される請求項１５又は１６に記載の凍結保存用培地。
  18. 前記非プロトン性双性イオンが、下記式（２）又は式（３）
    Figure 2023123780000083
    Figure 2023123780000084
     （式中、Ｒ１及びＲ２は、請求項１７で定義したとおりである。）
    で表される請求項１５～１７のいずれか１項に記載の凍結保存用培地。
  19. 前記Ｒ１又はＲ４が炭素数１～７個のアルケニル基である請求項１５～１８のいずれか１項に記載の凍結保存用培地。
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