JP2024542811A - 操作された細胞侵入による受容体－リガンド特異性を発見するための方法及び組成物 - Google Patents

操作された細胞侵入による受容体－リガンド特異性を発見するための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、リガンド－受容体相互作用を解明し、核酸及びタンパク質を標的細胞に送達し、シングルセルマルチオミクスを行うためのシステム、方法、及び組成物に関する。同族受容体－リガンド相互作用時に標的細胞にカーゴを送達するリガンドを提示する、操作されたレンチウイルスが開示される。ｐＭＨＣ／Ｔ細胞受容体及び抗原／Ｂ細胞受容体の相互作用を同定するためのｐＭＨＣ又は抗原エピトープ提示レンチウイルスを含む組成物及び方法も開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６３／２８６，５０７号及び２０２２年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６３／３８２，８６０号に対する優先権を主張する。前述の出願の開示は、図面を含め、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表の組み込み
付随する配列表の資料は、参照により本出願に組み込まれる。付随する配列表のテキストファイルは０７８４３０－５３８００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２６．ｘｍｌと題され、２０２２年１２月１日に作成され、１７ＫＢのサイズである。
本技術は、一般的に細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本技術は、リガンド－受容体特異性の発見及び同定並びに遺伝子及びタンパク質の送達のための方法及び組成物に関する。本技術はまた、Ｔ細胞受容体とＭＨＣペプチドとの間、抗体と抗原との間、又はＢ細胞受容体とＢ細胞抗原（細胞内／分泌エピトープ／細胞表面抗原エピトープを含む）との間の相互作用及び他のリガンド－受容体の相互作用の解明に関する。
細胞はリガンド－受容体相互作用を介して互いにコミュニケーションを行う。豊富な細胞間コミュニケーションにより、特定の挙動及び細胞運命の決定を指示するための哺乳動物細胞の分子プログラムが形成される。例えば、Ｔ細胞表面上のＴＣＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面からの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原複合体を認識し、これと相互作用することができる。ＴＣＲ及び抗体遺伝子は体細胞組換えを経て、大規模かつ多様なレパートリー（ヒトでは約１０１６個のＴＣＲアルファ及びベータ配列）を達成し、これは娘細胞によってクローンとして受け継がれる。Ｔ細胞受容体とＢ細胞受容体との相互作用は非常に特異的であり、抗原特異的なＴ細胞及びＢ細胞の増殖及び分化を駆動する。ＴＣＲ－抗原相互作用の解明、特に、抗原特異性とＴＣＲ配列及びＴ細胞状態との関連付けは、抗原認識がどのようにＴ細胞の運命決定を駆動するかを理解するために不可欠である。ＴＣＲの抗原特異性を解明するために、以下を含む多様なアプローチが開発されている：（１）Ｔスキャン、ＳＡＢＲ、Ｔ細胞トロゴサイトーシス、及びサイトカイン捕捉アッセイなどの、人工ＡＰＣを使用してＴ細胞特異的ＭＨＣ抗原をスクリーニングするための細胞レポーターアッセイ（Ｊｏｇｌｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｋｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，２０２１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、（２）組み換えＴＣＲに対するＭＨＣ抗原をスクリーニングするための酵母ディスプレイプラットフォーム（Ｂｉｒｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、（３）抗原ペプチド刺激した際のサイトカイン産生（ＥＬＩＳｐｏｔ）などのＴ細胞ベースのアッセイ（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、（４）シングルセルシーケンシングにより抗原特異性及びＴＣＲ配列を捕捉するためのＤＮＡバーコード化（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＭＨＣペプチド多量体（ＴｅｔＴＣＲ－ｓｅｑ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。各技術には特有の利点があるにもかかわらず、初代Ｔ細胞に対する免疫原性ＭＨＣ抗原を迅速にスクリーニングし、抗原ランドスケープ、対形成したＴＣＲレパートリー、及びＴ細胞表現型の遺伝子発現を高スループットで同時に捕捉することは依然として困難である。既存の方法の多くは、異種細胞上における受容体又はリガンドの再発現を必要とするため、ヒトの臨床試料に直接適用することができない。Ｂ細胞受容体－抗原相互作用の研究にも同様の課題が当てはまり、抗体によって認識される既知の細胞内抗原エピトープに対処するという課題も加わる。
抗原特異的Ｔ細胞及びＢ細胞の細胞状態の特性評価における大きな進歩に関わらず、他のバイスタンダーＴ細胞又はＢ細胞を摂動する（ｐｅｒｔｕｒｂ）ことなく、これらの抗原特異的細胞を標的化し、それらの細胞状態及び挙動を選択的に改修することは依然として困難である。ｐＭＨＣ提示ナノ粒子を使用した最近の方法により、抗原特異的Ｔ細胞におけるｍＲＮＡ送達が可能になり、特定のＴ細胞を一時的に調節する多くの可能性が開かれた（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０２２）。ｐＭＨＣシュードタイプ化ウイルスを使用した最近の別の研究では、抗原特異的Ｔ細胞の遺伝子修飾が可能になっている（Ｇｕｏ ａｎｄ Ｅｌｌｅｄｇｅ， ２０２２）。しかしながら、抗原特異的Ｔ細胞以外に抗原特異的Ｂ細胞を選択的に操作する技術は依然として不足している。
したがって、リガンド－受容体の対形成を信頼性高く迅速に体系的に同定し、受容体の特異性を解明するための方法及び組成物が必要である。より具体的には、スケーラブルに、（１）多くの異なる種類のリガンドを提示し、（２）リガンドと細胞上の受容体とをマッチングさせ、（３）情報を記録し、（４）リガンドとマッチングする受容体を発現する細胞を操作することができる方法が必要である。シングルセルの分解能でリガンド－受容体の対形成を探索し、遺伝子又はタンパク質ペイロードを細胞特異的に送達するための方法及び組成物も必要とされている。
一態様では、本開示は、レンチウイルスの表面上に提示された異種リガンド、修飾されたウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（fusogen）（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、リガンドに対する内因性受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結された（例えば、融合された）レポータータンパク質、及びバーコード化されたＲＮＡ、を含む、操作されたレンチウイルスを提供する。
本開示の操作されたレンチウイルスの非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴の１つ以上が含むことができる。いくつかの実施形態では、フソゲンは、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇポリペプチドの位置Ｈ８、Ｋ４７、Ｙ２０９、及びＲ３５４のいずれか１つにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質は、Ｋ４７Ｑ置換及びＲ３５４Ａ置換を含む。
いくつかの実施形態では、リガンドは、タンパク質若しくはエピトープであるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ＭＨＣペプチド、抗体、抗原、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、若しくは細胞によって発現され得る他の形態の抗原であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞内抗原であるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、リガンドは、最適化された膜貫通ドメインに作動可能に連結されている（例えば、融合されている）。いくつかの実施形態では、最適化された膜貫通ドメインは、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＣＡＭ１、ＣＤ４３、ＣＤ１６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４９ｄ、又はＬＦＡ－１に由来する膜貫通ドメインである。
いくつかの実施形態では、リガンドは、最適化された膜貫通ドメイン及びシグナルペプチドに作動可能に連結されている（例えば、融合されている）。
いくつかの実施形態では、操作されたレンチウイルスは、欠陥のあるインテグラーゼタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、レポータータンパク質は、ＧＦＰ又はｍＮｅｏｎである。
いくつかの実施形態では、構造タンパク質は、ヌクレオカプシドタンパク質である。
いくつかの実施形態では、構造タンパク質は、Ｇａｇタンパク質である。
いくつかの実施形態では、バーコード化されたＲＮＡは、ウイルス粒子中にカプセル化される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、リガンド、例えば、タンパク質リガンドをコードする。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞、例えば、宿主細胞に送達される目的の遺伝子をコードする。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、次世代シーケンシング技術によって読み出される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、捕捉配列、例えば、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓシングルセルシーケンシングワークフローにおいて、試料由来又は試料内の分析物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）を捕捉又はハイブリダイズするために使用することができる配列を含む。
一態様では、本開示は、リガンド－受容体の対を同定するための方法であって、レンチウイルスの表面上に提示された異種リガンド、修飾されたウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、リガンドに対する内因性受容体、例えば、免疫受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に融合されたレポータータンパク質、及びバーコード化されたＲＮＡを含む、少なくとも１つの操作されたレンチウイルスを提供することと、レンチウイルスを細胞集団と合わせることと、レポーター遺伝子の存在に基づいて細胞集団を選別し、それによってリガンド－受容体の対を同定することとを含む、方法をさらに提供する。
本開示のリガンド－受容体の対を同定するための方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、操作されたレンチウイルスのプールを提供することを含み、プールは異なるリガンドを提示する。
いくつかの実施形態では、方法は、レンチウイルスを細胞と合わせ、ウイルス／細胞混合物を約４℃でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、レンチウイルスを細胞と合わせ、ウイルス／細胞混合物を室温でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、レンチウイルスを細胞と合わせ、ウイルス／細胞混合物を約３７℃でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス／細胞の混合物を約３０分間、若しくは約１時間、若しくは約２時間、又は約０．５時間～約２．５時間の任意の期間インキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスＲＮＡのシングルセルシーケンシングを行って、リガンド配列を同定するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞のトランスクリプトームのシングルセルシーケンシングを行って、受容体配列を同定するステップをさらに含む。
一態様では、本開示は、目的の分子、例えば、目的の核酸又はタンパク質をユーザー規定の標的細胞に送達する方法であって、レンチウイルスの表面上に提示された異種リガンド、修飾されたウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、リガンドに対する内因性受容体、例えば、免疫受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に融合されたレポータータンパク質、及びバーコード化されたＲＮＡ、を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、レンチウイルスを標的細胞を含む細胞混合物と接触させ、核酸又はタンパク質を標的細胞にのみ送達することとを含み、標的細胞は、レンチウイルス表面上のリガンドに特異的な受容体、例えば、免疫受容体を発現する、方法をさらに提供する。
本開示の対象分子を送達するための方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、ユーザー規定の標的細胞にカーゴを送達するために修飾される。
いくつかの実施形態では、目的の核酸は、操作されたレンチウイルス粒子の内部にパッケージ化される。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、レンチウイルスのｇａｇタンパク質と作動可能に連結されている（例えば、融合されている）。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質をレポーターに置き換える。いくつかの実施形態では、標的細胞はインビボにある。いくつかの実施形態では、標的細胞はエクソビボにある。いくつかの実施形態では、標的細胞はインビトロにある。いくつかの実施形態では、標的細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞又はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞であり、受容体はＴ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＢ細胞であり、受容体はＢ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は初代ヒト血液細胞（ＰＢＭＣ）である。
別の態様では、本開示は、免疫原性抗原を同定するための方法であって、レンチウイルスの表面上に提示された異種受容体タンパク質、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、受容体に対する天然抗原を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に融合されたレポーター導入遺伝子、及びバーコード化されたＲＮＡ（ＲＮＡは、抗原情報をコードする）を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、レンチウイルスを細胞集団と合わせることと、レポーターの存在に基づいて細胞集団を選別することを含む、方法をさらに提供する。
本開示の免疫原性抗原を同定するための方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスＲＮＡのシーケンシングを行って抗原配列を同定することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞受容体のＲＮＡのシーケンシングを行うステップをさらに含む。
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞受容体及び対形成されたＭＨＣペプチドを同定するための方法であって、ウイルス表面上に提示されたｐＭＨＣ、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、ＰＭＨＣに対するＴ細胞受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に融合されたレポーター導入遺伝子、及びバーコード化されたＲＮＡ、を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、レンチウイルスを細胞集団と合わせることと、レポーターの存在に基づいて細胞集団を選別し、それによってＴ細胞受容体を同定することとを含む、方法をさらに提供する。
本開示のＴ細胞受容体及び対形成されたＭＨＣペプチドを同定する方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞集団はヒト初代Ｔ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＭＨＣは、シグナルペプチド、ＰＭＨＣ、Ｇ４Ｓリンカー、ｂ２ｍ遺伝子、Ｇ４Ｓリンカー、及びＭＨ対立遺伝子を直列に含むＲＮＡによってコードされる。
いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスＲＮＡのシングルセルシーケンシングを行って、ＭＨＣペプチド配列を同定するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の受容体配列のシーケンシングを行って、ＭＨＣペプチド及びＴ細胞受容体配列を同定するステップをさらに含む。
さらに別の態様では、本開示はまた、Ｂ細胞受容体又は抗体を同定するための方法であって、レンチウイルス表面上に提示されたエピトープ（ここで、エピトープは、ＩＣＡＭ１膜貫通ドメインと作動可能に連結されている（例えば、融合されている））、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、細胞内エピトープに対するＢ細胞受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に融合したレポーター導入遺伝子、及びバーコード化されたＲＮＡ、を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、レンチウイルスをＢ細胞集団と合わせることと、レポーターの存在に基づいて細胞集団を選別し、それによってＢ細胞受容体又は抗体を同定することとを含む、方法を提供する。
本開示のＢ細胞受容体又は抗体を同定するための方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞表面膜タンパク質、細胞内タンパク質、分泌タンパク質、又はグリコシル化タンパク質である。
いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスＲＮＡのシングルセルシーケンシングを行って、抗原及びマッチングするＢ細胞受容体の配列を同定するステップをさらに含む。
本開示は、さらに、Ｂ細胞受容体に対する抗原を同定するための方法であって、レンチウイルスの表面上に提示された異種リガンド、修飾されたウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、リガンドに対する内因性受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に融合されたレポータータンパク質、及びバーコード化されたＲＮＡを含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、レンチウイルスをＢ細胞集団と合わせることと、レポーターの存在に基づいて細胞集団を選別し、それによってＢ細胞抗原を同定することとを含む、方法の少なくとも１つの実施形態を提供する。
本開示はまた、シングルセルマルチオミクスの方法であって、レンチウイルスの表面上に提示された異種リガンド、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、リガンドに対する内因性受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に融合されたレポーター導入遺伝子、及びＲＮＡ（ＲＮＡは、抗原配列及びシングルセルシーケンシングのための捕捉タグを含む）を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、シングルセルレベルでトランスクリプトーム及び表現型情報を同時に取得することとを含む、方法の少なくとも１つの実施形態を提供する。
いくつかの実施形態では、シングルセルシーケンシングは、液滴ベースのプラットフォームである。
いくつかの実施形態では、細胞の表現型は、ＣＩＴＥ－ｓｅｑによる表面マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、情報は、リガンド及び受容体の配列を含む。
いくつかの実施形態では、シングルセルマルチオミクスは、全細胞をインプットとして使用する。
いくつかの実施形態では、シングルセルマルチオミクスは、全細胞をインプットとして使用し、逆転写のステップを含む。
さらに別の態様では、本開示は、細胞混合物中の標的細胞集団を選択的に枯渇させるか又は濃縮するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の操作されたレンチウイルス、及び（ｂ）（ｉ）操作されたレンチウイルスの表面上に提示されたリガンドに特異的な受容体を発現する標的細胞集団、及び（ｉｉ）操作されたレンチウイルスの表面上に提示されたリガンドに特異的な受容体を発現しない非標的細胞集団を含む、細胞混合物を提供することと、操作されたレンチウイルスを細胞集団と接触させ、核酸又はタンパク質を標的細胞にのみ送達することと、標的細胞集団の増殖を特異的に阻害するか又は非標的細胞集団の増殖を阻害する試薬を添加して、それによって標的細胞集団を選択的に枯渇させるか又は濃縮することとを含む、方法を開示する。いくつかの実施形態では、受容体は免疫受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体はＢ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体はＴ細胞受容体である。
本開示の標的細胞集団を選択的に枯渇させるか又は濃縮するための方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的細胞は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）導入遺伝子を発現し、添加される試薬は、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を含むか、又はガンシクロビル（ＧＣＶ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ｓｈＲＮＡを発現して細胞死受容体ＦＡＳの発現を減少させて、標的集団の細胞死を防ぐ。いくつかの実施形態では、標的細胞集団は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＢ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は自己反応性免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、健康状態に関連する抗原に対して特異的である。いくつかの実施形態では、健康状態は、増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は微生物感染症である。いくつかの実施形態では、増殖性疾患はがんである。いくつかの実施形態では、微生物感染症は、細菌感染症、ウイルス感染症、又は微小真菌感染症である。
上記の概要は例示のみを目的としており、限定することを何ら意図するものではない。本明細書に記載した例示的な実施形態及び特徴に加えて、本開示のさらなる態様、実施形態、目的、及び特徴は、図面、発明の詳細な説明、及び特許請求の範囲から十分に明らかになるであろう。
本開示の様々な特徴を単一の実施形態の文脈で記載することができるが、特徴を別々に又は任意の好適な組み合わせで提供することもできる。対照的に、明確にするために本開示を別々の実施形態の文脈で記載することができるが、本開示を単一の実施形態で提供することもできる。
図１Ａ～１Ｇは、ウイルス表面上にリガンドタンパク質及びフソゲンを提示し、蛍光タンパク質を送達し、細胞侵入によるリガンド－受容体相互作用を記録するウイルス提示プラットフォームを示す。図１Ａは、例示的なオールインワンプラットフォームの概略図を示す。レンチウイルスは、（１）ウイルス表面上に提示されたユーザー規定のリガンドタンパク質、（２）インタクトな融合能力を有し、かつ、天然受容体との結合に欠陥がある修飾されたフソゲン、（３）ウイルス構造タンパク質と融合したカーゴタンパク質、並びに（４）追跡及び遺伝子送達のためのバーコード化されたウイルスＲＮＡなどの様々な成分において操作されている。
図１Ｂは、ＧＦＰ発現の実験設定及びウイルス感染から３日後のフローサイトメトリー分析の概略図を示す。Ｒａｊｉ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞をウイルスＲＮＡ中にＧＦＰをコードする３つの群のレンチウイルスに感染させる：（１）野生型ＶＳＶ－Ｇを有するウイルス（左）、（２）受容体結合変異ＶＳＶ－Ｇを有するウイルス（中央）、（３）ＶＳＶ－Ｇ変異体及び抗ＣＤ１９一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）を有するウイルス。
図１Ｃは、実験設定の概略図（上部）を示す。ＧＦＰタンパク質は、マトリクスタンパク質（ＭＡ－ＧＦＰ）若しくはヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ－ＧＦＰ）、又はウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ－ＧＦＰ）と融合されている。異なるウイルスタンパク質と融合したＧＦＰタンパク質を有するｓｃＦｖ－ＣＤ１９提示ウイルスをＲａｊｉ（ＣＤ１９＋）細胞又はＪｕｒｋａｔ（ＣＤ１９－）細胞とともに２時間インキュベートし、次いでフローサイトメトリーに供した。棒グラフ（下）は、異なるＧＦＰ融合ウイルスタンパク質を有するウイルスをインキュベートした際のＧＦＰ＋細胞の割合を示す。
図１Ｄは、図１Ｃと同様に、一時的なウイルスインキュベーション後のＧＦＰシグナルの例示的なフローサイトメトリープロットを示す。
図１Ｅは、初代ヒトＢ細胞におけるＧＦＰシグナルの実験設定及びウイルスインキュベーションあり又はなしのフローサイトメトリー分析の概略図を示す。ナイーブ及び活性化ヒト初代Ｂ細胞をＮＣ－ＧＦＰ融合ウイルス及びｓｃＦｖ－ＣＤ１９提示ウイルスとともに２時間インキュベートし、次いでフローサイトメトリー分析に供した。Ｂ細胞を生存ＣＤ２０＋細胞についてゲーティングした。
図１Ｆは、図１Ｅの群の表面ＣＤ１９発現のヒストグラム分析である。
図１Ｇは、ナイーブ及び活性化ヒトＢ細胞におけるｓｃＦｖ－ＣＤ１９ウイルス結合及びＣＤ１９表面発現を示す棒グラフである。図１Ｃ及び１ＦにおけるＰ値は、対応のないｔ検定によって計算される。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ ＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図１Ｈ～１Ｎは、ＥＮＴＥＲによる共刺激分子に対するリガンド－受容体の特定の相互作用を解読する方法を示す。図１Ｈは、プロテイナーゼＫの処理前及び処理後における異なる温度でのＲａｊｉ Ｂ細胞上のｓｃＦｖ－ＣＤ１９提示ウイルスのウイルス結合及び融合のフローサイトメトリー分析を示す。
図１Ｉは、図１ＨのＧＦＰ＋細胞の割合を示す棒グラフである。
図１Ｊは、実験設定の概略図を示す。ＣＤ４０を発現するＲａｊｉ Ｂ細胞を野生型ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）又はその同族受容体ＣＤ４０への結合が減少したＣＤ４０Ｌ変異体（Ｋ１４２Ｅ、Ｒ２０２Ｅ）のいずれかを提示するＧＦＰウイルスとともにインキュベートする。
図１Ｋは、野生型ＣＤ４０Ｅ又は変異ＣＤ４０Ｅ提示ＧＦＰウイルスとともにインキュベートした際のＲａｊｉ Ｂ細胞におけるＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析を示す。
図１Ｌは、図１ＫのＧＦＰ＋細胞の割合を示す棒グラフである。ｐ値は、対応のないｔ検定によって計算された。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図１Ｍは、免疫捕捉アッセイの概略図を示す。このアッセイでは、磁気ビーズを抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＶＳＶ－Ｇ、及びＩｇＧ抗体と結合させ、次いでＣＤ４０Ｌ提示ウイルスとともにインキュベートした。免疫捕捉されたウイルスをウイルスＲＮＡ単離及びＣＤ４０ＬのｑＲＴ－ＰＣＲに供した。
図１Ｎは、図１Ｍと同様に、異なる抗体結合ビーズによるＥＮＴＥＲウイルスの濃縮のｑＲＴ－ＰＣＲの結果を示す棒グラフを示す。すべてのｐ値は、対応のないｔ検定によって計算された。ｎ．ｓ．有意ではないｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
図２Ａ～２Ｆは、ＥＮＴＥＲがＭＨＣペプチド（ｐＭＨＣ）とＴＣＲとの間の相互作用を解明する方法を示す。図２Ａは、ｐＭＨＣ提示ウイルスの概略図、及びｐＭＨＣ提示ウイルスをインキュベートしたときに特定のＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析を示す。ＨＬＡ－Ａ０２０１（Ａ２）対立遺伝子によって提示される９マーのペプチド（ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～Ｉ６５）又はＨＬＡ－Ａ０１０１（Ａｌ）対立遺伝子によって提示される１１マーのＣＭＶペプチド（ｐｐ６５３６３～３７３）のいずれかを提示するＧＦＰ融合ウイルスを、同族抗原を認識する特定のＴＣＲ（例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５－ＴＣＲ又はＣＭＶ－ｐｐ６５３６３～３７３－ＴＣＲ）を発現するＴ細胞とともにインキュベートする。ＳＰ：シグナルペプチド；ペプチド：抗原ペプチド；Ｂ２Ｍ：ベータ－２－マイロクグロブリン。
図２Ｂは、様々なＨＬＡ－Ａ２提示ペプチドを提示するウイルスをインキュベートした際の特定のＴＣＲ（例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５－ＴＣＲ、ＣＭＶ ｐｐ６５４９５～５０３－ＴＣＲ、又はＦｌｕｍ１（５８～６６）－ＴＣＲ）を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析を示す。ＨＰＶ１６ Ｅ７８２～９１ペプチド提示ウイルスは、陰性対照として機能する。
図２Ｃは、ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６６抗原（左）を提示する２×１０８個のＥＮＴＥＲウイルス粒子をインキュベートしたとき、又は異なる量のｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６６ｐＭＨＣテトラマーとともにインキュベートした際のＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞のフローサイトメトリープロットを示す。
図２Ｄは、異なるＴＣＲ親和性を有する抗原変異体を提示するウイルスの結合効率（ＧＦＰ＋％）の比較を示す。１Ｇ４ｗｔ－ＴＣＲ Ｔ細胞を、変異体ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６６抗原変異体の野生型を提示するＥＮＴＥＲとともに２時間インキュベートした。ＣＭＶ－ｐｐ６５４９５～５０３－ＴＣＲ Ｔ細胞を陰性対照として使用した。ｐ２４タンパク質レベルを使用してウイルス力価を正規化した。
図２Ｅは、ＴＣＲ－Ｔ細胞混合実験の実験設定（上）及びフローサイトメトリー分析（下）の概略図を示す。Ｆｌｕ－ｍ１５８～６６－ＴＣＲ Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染料によって標識し、次いで、ＣＭＶ－ｐｐ６５４９５～５０３－ＴＣＲ Ｔ細胞と異なる比率で混合した。混合Ｔ細胞集団をＨＬＡ－Ａ２：ｍ１提示ＧＦＰウイルスとともに２時間インキュベートし、次いでフローサイトメトリーに供した。２つのＴ細胞集団の１：１０００混合物並びにＶｉｏｌｅｔ＋集団及びＶｉｏｌｅｔ－集団についてゲーティングしたＴ細胞のＧＦＰシグナルを示す代表的なフローサイトメトリープロット。
図２Ｆは、図２Ｅ及び図２ＪのＥＮＴＥＲのシグナル／ノイズ比を示す棒グラフである。
図２Ｇは、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＬＡ－ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ、及びＨＬＡ－Ａ２再構成ＨＬＡ－ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ａ２及びＢ２Ｍ表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。
図２Ｈは、ＨＬＡ－Ａ２ペプチド提示ＧＦＰウイルスを２時間インキュベートし、続いてＰＥテトラマーを染色したときのＣＭＶ－ｐｐ６５４９５～５０３－ＴＣＲ Ｔ細胞のフローサイトメトリープロットを示す。Ｍ１（５８～６６）（インフルエンザ抗原）提示ウイルス及びＭ１（５８～６６）テトラマーは陰性対照である。
図２Ｉは、ＣＭＶ－ｐｐ６５４９５～５０３－ＴＣＲ Ｔ細胞のテトラマー強度及びＣＤ３表面発現を示すヒストグラムプロット（左）及び棒グラフ（右）を示す。
図２Ｊは、Ｔ細胞混合実験の実験設計（上）及びフローサイトメトリー分析（下）の概略図を示す。Ｆｌｕ－ｍ１５８～６６－ＴＣＲ Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染料によって標識し、次いで、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５－ＴＣＲ Ｔ細胞と異なる比率で混合した。混合Ｔ細胞集団をＨＬＡ－Ａ２：ｍ１提示ＧＦＰウイルスとともに２時間インキュベートし、次いでフローサイトメトリーに供した。２つのＴ細胞集団の混合物及びＶｉｏｌｅｔ＋及びＶｉｏｌｅｔ－集団についてゲーティングしたＴ細胞のＧＦＰシグナルを示す代表的なフローサイトメトリープロット。
図２Ｋは、図２ＪのＥＮＴＥＲの感度（左）及び特異性（右）を示す棒グラフを示す。
図３Ａ～３Ｆは、ウイルス表面上に細胞内抗原を提示し、ＢＣＲと抗原との相互作用を解明するためのＥＮＴＥＲの最適化を示す。図３Ａは、実験設計の概略図を示す。レンチウイルスの組み立て及び出芽中に、特定の宿主細胞表面タンパク質はウイルスの表面に組み込まれ得る。文献から選択された宿主タンパク質のＴＭドメインは、細胞内抗原ＨＰＶ１６ Ｌ２に由来するＢ細胞エピトープと融合される。これらのＨＰＶエピトープ提示ＧＦＰウイルスをこのＨＰＶエピトープを標的化するＢＣＲを発現するＢ細胞（オンターゲット）又はＢＣＲを発現しないＢ細胞（オフターゲット）とともにインキュベートする。
図３Ｂは、異なるＴＭドメインと融合されたＨＰＶエピトープを提示するＧＦＰウイルスとともにインキュベートしたＢ細胞におけるＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析を示す。ＢＣＲを発現しないＢ細胞は、陰性対照として機能する。
図３Ｃは、図３ＢのＧＦＰ＋Ｂ細胞の割合を示す棒グラフを示す。
図３Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ抗原又は陰性対照としてＨＰＶ Ｌ２抗原を提示するＥＮＴＥＲウイルスをインキュベートしたときにのＲＢＤ－ＢＣＲ＋Ｂ細胞におけるＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析を示す（左）。棒グラフは、オンターゲット又はオフターゲットＥＮＴＥＲウイルスをインキュベートしたときのＧＦＰ＋細胞の存在比率（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を示す（右）。
図３Ｅは、Ｂ細胞混合実験の実験設定（上）及びフローサイトメトリー分析（下）の概略図を示す。ＲＢＤ－ＢＣＲ＋Ｂ細胞をｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ染料によって標識し、次いで、ＨＰＶ－ＢＣＲ＋Ｂ細胞と異なる比率で混合した。混合Ｂ細胞集団をＩＣＡＭ１ ＴＭドメインと融合したＲＢＤ抗原を提示するＧＦＰウイルスとともにインキュベートし、フローサイトメトリーに供した。代表的なフローサイトメトリープロットは、２つのＢ細胞集団の１：１０００混合並びにｖｉｏｌｅｔ＋及びｖｉｏｌｅｔ－集団についてゲーティングされたＢ細胞のＧＦＰシグナルを示す。
図３Ｆは、図３Ｅ及び図３ＩのＥＮＴＥＲのシグナル／ノイズ比を示す棒グラフである。
図３Ｇ～３Ｐは、ＥＮＴＥＲによるＢ細胞の抗原特異性の解明並びにカーゴ送達効率及び特異性の特性決定のために行った実験の結果を概略的に纏めたものである。図３Ｇは、ＨＥＲ２提示ウイルス又はＲＢＤ提示ウイルスとともにインキュベートされたＨＥＲ２－ＢＣＲ＋Ｂ細胞のうちのＧＦＰ＋細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
図３Ｈは、図３Ｇと同様にＧＦＰ＋細胞の割合を示す棒グラフである。
図３Ｉは、Ｂ細胞混合実験の実験設計（上）及びフローサイトメトリー分析（下）の概略図を示す。ＲＢＤ－ＢＣＲ＋Ｂ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔで標識し、ＨＰＶ－ＢＣＲ＋Ｂ細胞と異なる比率で混合した。混合Ｂ細胞集団をＩＣＡＭ１ ＴＭドメインと融合したＲＢＤ抗原を提示するＧＦＰウイルスとともにインキュベートし、フローサイトメトリーに供した。代表的なフローサイトメトリープロットは、２つのＢ細胞集団の混合並びにＶｉｏｌｅｔ＋及びＶｉｏｌｅｔ－集団についてゲーティングされたＢ細胞のＧＦＰシグナルを示す。
図３Ｊは、図３ＩのＥＮＴＥＲの感度を示す棒グラフである。
図３Ｋは、図３ＩのＥＮＴＥＲの感度を示す棒グラフである。
図３Ｌは、異なる抗原特異性を有する細胞種における野生型ＶＳＶ－Ｇを有するウイルスの送達効率を示す棒グラフを示す。ｐ値は、対応のないｔ検定によって計算された。ｎ．ｓ．有意ではないＰ＞０．０５。
図３Ｍは、Ｔ細胞混合実験におけるカーゴ送達のフローサイトメトリー分析を示す。ｍＳｃａｒｌｅｔ発現ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞をＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ Ｔ細胞と混合し、次いで、ｐｐ６５４９５～５０３抗原を提示し、かつ、ＨＳＶ－ＴＫ及びＧＦＰを含む導入遺伝子を有するＥＮＴＥＲウイルスに感染させた。
図３Ｎは、Ｂ細胞混合実験におけるカーゴ送達のフローサイトメトリー分析を示す。ｍＳｃａｒｌｅｔ発現ＲＢＤ ＢＣＲ＋Ｂ細胞をＨＥＲ２ ＢＣＲ＋Ｂ細胞と混合し、次いで、ＨＥＲ２抗原を提示し、かつ、ＨＳＶ－ＴＫ及びＧＦＰを含む導入遺伝子を有するＥＮＴＥＲウイルスに感染させた。
図３Ｏは、多様なＦＡＳ ｓｈＲＮＡ又は対照ｓｈＲＮＡで形質導入したＴ細胞におけるＦＡＳの表面発現を示すヒストグラムプロットである。
図３Ｐは、抗ＦＡＳ誘導アポトーシス及び細胞死の際のＴ細胞のアネキシンＶ及び７－ＡＡＤゲーティングを示す代表的なフロープロットである。
図４Ａ～４Ｍは、ＥＮＴＥＲによって抗原特異的Ｔ細胞又は抗原特異的Ｂ細胞の選択的枯渇又は増殖が可能になることを示すために行われた実験の結果を概略的に纏めたものである。図４Ａは、抗原特異的Ｔ細胞におけるカーゴ送達の概略図である（左）。ＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞又はＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞を、ｐｐ６５４９５～５０３を提示し、かつ、ＧＦＰトランス遺伝子をカーゴとして有するＥＮＴＥＲウイルスに個別に感染させた。感染２日後のＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞とＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞との間のＧＦＰ発現を示す代表的なヒストグラムプロット。
図４Ｂは、図４Ａと同様にＧＦＰ＋細胞の割合を示す棒グラフである。
図４Ｃは、抗原特異的Ｂ細胞におけるカーゴ送達の概略図である（左）。ＨＥＲ２ ＢＣＲ＋Ｂ細胞又はＲＢＤ ＢＣＲ＋Ｂ細胞を、ＨＥＲ２を提示し、かつ、ＧＦＰ導入遺伝子ををカーゴとして有するＥＮＴＥＲウイルスに個別に感染させた。感染の２日後のＨＥＲ２ ＢＣＲ＋Ｂ細胞とＲＢＤ ＢＣＲ＋Ｂ細胞との間のＧＦＰ発現を示す代表的なヒストグラムプロット。
図４Ｄは、図４Ｃと同様にＧＦＰ＋細胞の割合を示す棒グラフである。
図４Ｅは、異なる抗原特異的Ｔ細胞のプールにおける自殺遺伝子送達の概略図である。ＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞とｍＳｃａｒｌｅｔを発現するＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞とを一緒に混合し、次いで、ｐｐ６５４９５～５０３を提示し、かつ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）導入遺伝子を有するＥＮＴＥＲウイルスに感染させた。感染２日後にガンシクロビル（ＧＣＶ）薬を添加してＨＳＶ－ＴＫ発現細胞を死滅させ、細胞の生存を４日間モニタリングした。
図４Ｆは、ＧＣＶ処理後４日目における生存Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。
図４Ｇは、ＧＣＶ薬物処理した際の、ＧＦＰ遺伝子を有するＥＮＴＥＲ又はＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を有するＥＮＴＥＲに感染したＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞の数とＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞の数との間の倍数濃縮の速度論的分析の結果を概略的に纏めたものである。
図４Ｈは、異なる抗原特異的Ｂ細胞のプールにおける自殺遺伝子送達の概略図である。ＨＥＲ２ ＢＣＲ＋Ｂ細胞とｍＳｃａｒｌｅｔを発現するＲＢＤ ＢＣＲ＋Ｂ細胞とを一緒に混合し、次いで、ｐｐ６５４９５～５０３を提示し、かつ、ＨＳＶ－ＴＫ導入遺伝子を有するＥＮＴＥＲウイルスに感染させた。感染２日後にＧＣＶ薬剤を添加してＨＳＶ－ＴＫ発現細胞を死滅させ、細胞の生存を４日間モニタリングした。
図４Ｉは、ＧＣＶ処理後４日目における生存Ｂ細胞の数を示す棒グラフである。
図４Ｊは、ＧＣＶ薬物処理した際の、ＧＦＰ遺伝子を有するＥＮＴＥＲ又はＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を有するＥＮＴＥＲに感染したＨＥＲ２ ＢＣＲ＋Ｂ細胞の数とＲＢＤ ＢＣＲ＋Ｂ細胞の数との間の倍数濃縮の速度論分析の結果を概略的に纏めたものである。
図４Ｋは、異なる抗原特異的Ｔ細胞のプールにおけるｓｈＲＮＡ送達の概略図である。ＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞とｍＳｃａｒｌｅｔを発現するＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞とを一緒に混合し、ｐｐ６５４９５～５０３を提示し、かつ、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ又は対照ｓｈＲＮＡを有するＥＮＴＥＲウイルスに感染させた。抗ＦＡＳ抗体を添加してアポトーシスを誘導した。
図４Ｌは、オフターゲットＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞（非感染群）及び対照ｓｈＲＮＡ又はＦＡＳ ｓｈＲＮＡで形質導入したオンターゲットＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞におけるＦＡＳの表面発現を示す棒グラフである。
図４Ｍは、図４Ｋと同様に、生存細胞（アネキシンＶ及び７－ＡＡＤ二重陰性によってゲーティングされている）についてｓｈＣｔｒｌ群によって正規化されたＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞／ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞の倍数濃縮を示す棒グラフである。Ｐ値は、対応のないｔ検定によって計算される。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
図４Ｎ～４Ｗは、ＥＮＴＥＲを最適化して抗原特異的初代ヒトＴ細胞を検出するために行った実験の結果を概略的に纏めたものである。図４Ｎは、ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５抗原ペプチド提示ＧＦＰウイルス（該ウイルスＲＮＡはインタクトであるか又は該ウイルスＲＮＡにシーケンシング捕捉タグが挿入されている）とともにインキュベートした際のＴＣＲ（ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ又はＣＭＶ ｐｐ６５－ＴＣＲ）を発現するＴ細胞におけるＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析である。
図４Ｏは、図４ＮのＧＦＰ＋細胞の割合を示す棒グラフである。Ｐ値は、対応のないｔ検定によって計算された。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
図４Ｐは、実験設計の概略図である。ドナーから単離したＴ細胞をＧＦＰ又はｍＮｅｏｎ蛍光タンパク質のいずれかを有するｐｐ６５４９５～５０３提示ウイルスとともにインキュベートし、次いでｐｐ６５４９５～５０３テトラマー及び他の抗体で染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。最初にＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングして、テトラマーを陽性対照としてｐｐ６５特異的Ｔ細胞を測定し、次いでｐｐ６５テトラマー＋Ｔ細胞におけるＧＦＰシグナルをモニタリングした。
図４Ｑは、図４Ｐと同様に、ＣＭＶ感染ドナー由来の初代ヒトＴ細胞におけるテトラマー及びＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析である。
図４Ｒは、図４Ｑのｐｐ６５テトラマー＋Ｔ細胞のうちのＧＦＰ＋細胞及びＧＦＰ－細胞の割合を示す棒グラフである。Ｐ値は、対応のないｔ検定によって計算された。＊ｐ＜０．０５。
図４Ｓは、ｐｐ６５４９５～５０３ウイルス又は陰性対照ウイルス（ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５）とともにインキュベートした後のｐｐ６５テトラマー＋Ｔ細胞のうちのＧＦＰ＋細胞を示す代表的なフローサイトメトリープロットである。
図４Ｔは、実験設計の概略図である。ＰＢＭＣをＣＭＶ血清陽性ＨＬＡ－Ａ２＋ドナーから単離し、１２種の異なるＣＭＶ抗原ペプチドのプール（１０μｇ／ｍＬ）とともに１０日間インキュベートした。ペプチド誘導増殖前又は増殖後の初代Ｔ細胞をｐｐ６５抗原提示ｍＮｅｏｎウイルスとともに２時間インキュベートし、次いで抗体で染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。
図４Ｕは、１５日間の増殖後のｐｐ６５４９５～５０３ペプチド濃縮Ｔ細胞におけるｐｐ６５４９５～５０３テトラマーとｐｐ６５４９５～５０３提示ｍＮｅｏｎウイルスとの共染色を示す代表的なフローサイトメトリープロットである。これらのＴ細胞は、生存ＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞についてゲーティングされている。
図４Ｖは、図４Ｔと同様に、プールされたＣＭＶペプチド誘導増殖前又は増殖後の４人の異なるＣＭＶ血清陽性ドナー由来のＧＦＰ＋Ｔ細胞（１２個のプールされたＨＬＡ－Ａ２：ＣＭＶ抗原ｍＮｅｏｎウイルスによって染色）の割合を示す代表的なフローサイトメトリープロットである。
図４Ｗは、ｐｐ６５４９５～５０３テトラマー又はｐｐ６５４９５～５０３提示ＥＮＴＥＲウイルスとともにインキュベートしたＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ Ｔ細胞のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ分析を示すＭＡプロットである。ｌｏｇ２倍数変化及び調整ｐ値＜０．０１を伴う遺伝子は赤で強調表示されている。
図５Ａ～５Ｆは、抗原ペプチド配列、ＴＣＲ配列、及びトランスクリプトームの大規模並列測定のためのＥＮＴＥＲ－ｓｅｑを概略的に示す。図５Ａは、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑワークフローの概略図を示す。個々のｐＭＨＣを提示するプールされたウイルスのライブラリをＴ細胞とともに２時間インキュベートした。液滴ベースのシングルセルゲノミクスプロファイリングのためにＧＦＰ＋Ｔ細胞を選別する（例えば、遺伝子発現及びＶ（Ｄ）Ｊ免疫プロファイリングのための１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５’キット）。
図５Ｂは、液滴ベースのシングルセル捕捉のためのウイルスＲＮＡ操作戦略を示す。１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ捕捉タグをＢ２ＭとＨＬＡ－Ａ２との間のリンカー領域に挿入する。１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＰＣＲハンドをＣＭＶプロモーターの後に挿入する。ＣＭＶ：ＣＭＶプロモーター；ＳＰ：シグナルペプチド配列；ペプチド：抗原ペプチド；Ｂ２Ｍ：ベータ２マイロクグロブリン；ＭＨＣクラスＩ：ＨＬＡ－Ａ０２０１対立遺伝子；ＬＴＲ：長鎖末端反復配列；ＴＳＯ：テンプレートスイッチングオリゴ配列。
図５Ｃは、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑのためのＴ細胞混合実験の概略図を示す。
図５Ｄは、各細胞バーコード（ドット）に関連するＰｐ６５（４９５～５０３）－ＴＣＲ Ｔ細胞ＵＭＩカウント数（ｘ軸）及びＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５－ＴＣＲ ＵＭＩカウント数（ｙ軸）を示す。ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５－ＴＣＲ＋Ｔ細胞（水色）、Ｐｐ６５（４９５～５０３）－ＴＣＲ＋Ｔ細胞（赤色）、及びダブレット（緑色、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５－ＴＣＲ及びＰｐ６５（４９５～５０３）－ＴＣＲの両方）として色が割り当てられている。
図５Ｅは、総ＵＭＩカウントのうちのｐｐ６５（４９５～５０３）抗原ＵＭＩカウントの濃縮比（左）及び総ＵＭＩカウントのうちのｎｙｅｓｏ１５７～１６５抗原ＵＭＩカウントの濃縮比（右）によって色付けされた、ダブレットを除外した後のＴＣＲ ＵＭＩカウントの散布図を示す。
図５Ｆは、ダブレットを除外した後の各細胞バーコード（ドット）に関連するｐｐ６５（４９５～５０３）抗原ＵＭＩカウント数（ｘ軸）及びｎｙｅｓｏ１５７～１６５抗原ＵＭＩカウント数数（ｙ軸）を示す。ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５－ＴＣＲ＋Ｔ細胞（水色）及びＰｐ６５（４９５～５０３）－ＴＣＲ＋Ｔ細胞（赤色）として色が割り当てられている。
図５Ｇ～５Ｎは、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑによるＴ細胞サブセットの特性評価のために行った実験の結果を概略的に纏めたものである。図５Ｇは、ＥＮＴＥＲ誘導遺伝子シグネチャの除去前又は除去後のクラスタリングによるＣＭＶ特異的Ｔ細胞（黄色）及びバイスタンダーＴ細胞（青色）を示すＵＭＡＰプロットである。
図５Ｈは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞サブセットの１０種のクラスターを示すＵＭＡＰプロットである。
図５Ｉは、ＣＩＴＥ－ｓｅｑからの表面タンパク質ＣＤ１２７の量及びナイーブＴ細胞の遺伝子（ＣＣＲ７、ＳＥＬＬ、及びＬＥＦ１）の発現を示すＵＭＡＰプロットを示す。
図５Ｊは、細胞溶解分子の遺伝子発現を示すＵＭＡＰプロットを示す。
図５Ｋは、ＭＡＩＴ細胞のマーカーの遺伝子発現を示すＵＭＡＰプロットを示す。
図５Ｌは、各サブセット／クラスターのマーカー遺伝子の発現を示すＵＭＡＰプロットを示す。
図５Ｍは、ドナーの起源を示すＵＭＡＰプロットである。
図５Ｎは、ドナーの起源によって分けられた、ＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞（ＥＮＴＥＲ＋）及びバイスタンダーＴ細胞（ＥＮＴＥＲ－）の１０種のクラスターのＴ細胞サブセットの割合を示す。
図６Ａ～６Ｉは、エクスビボで増殖されたＣＭＶ特異的初代Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑの結果を概略的に纏めたものである。図６Ａは、ＣＭＶ抗原ペプチド誘導Ｔ細胞増殖及びＥＮＴＥＲ－ｓｅｑワークフローの概略図を示す。
図６Ｂは、ＣＭＶ抗原提示ウイルスが結合した細胞（ＥＮＴＥＲ＋、黄色で色付けされている）又は結合していない細胞（ＥＮＴＥＲ－、青色で色付けされている）を示すＵＭＡＰプロットである。
図６Ｃは、ＣＤ４５ＲＡ（ナイーブマーカー）及びＣＤ４５ＲＯ（メモリーマーカー）の表面タンパク質発現のＣＩＴＥ－ｓｅｑを示すＵＭＡＰプロットを示す。
図６Ｄは、異なる色で標識されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの１０種のクラスターを示すＵＭＡＰプロットである。
図６Ｅは、ドナー＃１（黒で色付けされている）及びドナー＃２（灰色で色付けされている）における特定のＣＭＶ抗原エピトープを認識するＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。
図６Ｆは、図６Ｅから同定された上位３つのＣＭＶ抗原エピトープに対する細胞あたりのＣＭＶ抗原エピトープの量を示すＵＭＡＰプロットを示す。
図６Ｇは、異なるＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞のうちのエフェクター機能又はＴｒｅｇシグネチャに関連する代表的な遺伝子発現の列スケール化した発現を示すヒートマップである。
図６Ｈは、各クロノタイプにおける細胞数によって色付けされたＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞のクローン増殖サイズを示すＵＭＡＰプロット（左）である。バイオリンプロット（右）は、抗原エピトープによって色付けされた異なるＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞におけるクローンサイズの分布を示す。
図６Ｉは、ＣＤＲ３クローンによって色分けされたｐｐ６５４９５～５０３特異的ＴＣＲクローンにおけるサイトカイン及び転写因子の発現のバイオリンプロットである。簡略化モデル（右）。
図６Ｊ～６Ｐは、エクスビボで増殖されたＣＭＶ特異的Ｔ細胞のＴＣＲクロノタイプ分析の結果を纏めたものである。図６Ｊは、ＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞（ＥＮＴＥＲ＋）及びバイスタンダーＴ細胞（ＥＮＴＥＲ－）のクローン増殖サイズを示すＵＭＡＰプロットを示す。
図６Ｋ：ドナーによって色付けされたＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲクロノタイプ。各円は、同一のＣＤＲ３ヌクレオチド配列を有するクロノタイプを表す。円のサイズは各クロノタイプの細胞数を表す。
図６Ｌは、クローン増殖サイズと細胞傷害性遺伝子スコアとの相関関係を示す散布図を示す。
図６Ｍは、クローン増殖サイズと疲弊遺伝子スコア又は活性化遺伝子スコアとの相関関係を示す散布図を示す。
図６Ｎは、同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する収斂（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ＴＣＲクロノタイプを示すｐｐ６５４９５～５０３特異的ＴＣＲクローンの概要表である。
図６Ｏは、ＵＳ８７４～８２及びＵＬ１００２００～２０８特異的ＴＣＲクローンの概要表である。
図６Ｐは、ＣＤＲ３クローンによって分けられ、かつ、１０個のクラスターによって色付けされた、ｐｐ６５４９５～５０３特異的ＴＣＲクローンにおけるＴ細胞サブセットの割合を示す。図６Ｌ～６Ｍにおける係数及びｐ値はピアソン相関によって計算される。
図７Ａ～７Ｋは、ＣＭＶ血清陽性患者の血液から直接（例えば、インビトロ増殖なしで）単離された初代ＣＭＶ特異的Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑの結果を概略的に纏めたものである。図７Ａは、患者の血液からの初代Ｔ細胞の単離及びＥＮＴＥＲ－ｓｅｑワークフローの概略図を示す。
図７Ｂは、ＣＭＶ抗原提示ウイルスが結合した細胞（ＥＮＴＥＲ＋、黄色で色付けされている）又は結合していない細胞（ＥＮＴＥＲ－、青色で色付けされている）を示すＵＭＡＰプロット（左）である。ＵＭＡＰプロット（右）は、異なる色で標識されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの１３種のクラスターを示す。
図７ＣはＣＤ４５ＲＡの表面タンパク質発現を示すＵＭＡＰプロットを示す。ＣＩＴＥ－ｓｅｑからのＣＤ４５ＲＯ及び代表的な遺伝子の発現。
図７Ｄは、異なるクラスターにわたる多様な機能（例えば、Ｉ型ＩＦＮ、細胞傷害性など）に関連する遺伝子の発現のスケール化されたｚスコアを示すヒートマップである。
図７Ｅは、抗原エピトープによって色付けされたＣＭＶ抗原特異性を示すＵＭＡＰプロットである。
図７Ｆは、各クロノタイプにおける細胞数によって色付けされたＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞のクローン増殖サイズを示すＵＭＡＰプロット（左）である。
図７Ｇは、異なるクローンサイズを有するＴ細胞における細胞あたりのｐＭＨＣ結合数を示すバイオリンプロットである。Ｐ値はＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により計算された。ｎ．ｓ．ｐ＞０．０５；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
図７Ｈは、ペプチド誘導増殖前及び増殖後のドナー＃１（オレンジ色）及びドナー＃２（青色）由来のｐｐ６５特異的Ｔ細胞におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯの表面発現を示すＣＩＴＥ－ｓｅｑ密度プロットである。
図７Ｉは、ペプチド誘導増殖前及び増殖後のドナー＃１及びドナー＃２由来のｐｐ６５特異的Ｔ細胞におけるＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯを示すフローサイトメトリープロットを示す。
図７Ｊは、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞の上位３つのＴＣＲクローンにおけるペプチド誘導増殖前及び増殖後のＩ型 ＩＦＮ ＩＳＧ遺伝子スコア及び細胞傷害性遺伝子スコアの分布を示す密度プロットである（左）。密度プロットは、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞の上位３つのＴＣＲクローンにおけるペプチド誘導増殖前及び増殖後のＩＬ１３及びＥＯＭＥＳの発現を示す（右）。
図７Ｋは、エクスビボ増殖の際のＣＭＶ特異的Ｔ細胞の表現型移行の提案モデルである。
図７Ｌ～７Ｔは、患者の血液から直接単離されたＣＭＶ特異的Ｔ細胞のクローン内表現型の多様性の結果を概略的に纏めたものである。図７Ｌは、多様な機能（Ｉ型ＩＦＮ ＩＳＧ、細胞傷害性、ケモカイン、及び転写因子）に関連する重要な遺伝子の発現を示すＵＭＡＰプロットを示す。
図７Ｍは、ＥＮＴＥＲ誘導遺伝子シグネチャの除去前及び除去後の患者の血液試料から直接単離された初代Ｔ細胞のサブセットクラスタリングを示すＵＭＡＰプロットを示す。
図７Ｎは、異なるＣＭＶ抗原エピトープに対するＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞の密度を示すＵＭＡＰ埋め込み密度プロットを示す。
図７Ｏは、ペプチド誘導増殖前及び増殖後の共有ＴＣＲを有するＵＳ８７４～８２特異的Ｔ細胞の割合を示す棒グラフである。
図７Ｐは、ドナーによって分けられ、かつ、ＴＣＲ ＣＤＲ３配列によって色付けされた、増殖前の新鮮なＰＢＭＣから単離されたＵＳ８７４～８２特異的Ｔ細胞の数を示す。増殖前及び増殖後の共有ＴＣＲ配列は黒で囲まれている。
図７Ｑは、増殖前及び増殖後の細胞数及び存在比率の指標を含むＵＳ８７４～８２特異的Ｔ細胞（Ｅから同定）の上位のＴＣＲクローンの概要表である。
図７Ｒは、ＣＤＲ３クローンによって分けられ、かつ、１３種のクラスターによって色付けされた、ｐｐ６５４９５～５０３特異的ＴＣＲクローンにおけるＴ細胞サブセットの数を示す。
図７Ｓは、異なるＴＣＲクローン特異的Ｔ細胞間の多様な機能に関連する遺伝子の発現を示すヒートマップである。
図７Ｔは、ペプチド誘導増殖前及び増殖後の異なるＴＣＲクローン特異的Ｔ細胞におけるＩＬ１３及びＩＬ４の発現を示す密度プロットを示す。
本開示は、一般的に、ＭＨＣペプチド／Ｔ細胞受容体及び抗原／Ｂ細胞受容体（抗体）の対を含む受容体－リガンド対形成の同定、並びに解明するため、例えば、リガンドタンパク質を提示し、ペイロードを送達し、受容体特異性を記録するのためのシステム、組成物、及び方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、Ｔ細胞受容体とＭＨＣペプチドとの間、抗体と抗原との間、又はＢ細胞受容体とＢ細胞抗原（細胞内／分泌エピトープ／細胞表面抗原エピトープを含む）との間の相互作用、及び他のリガンド受容体（例えば、ＣＤ４０リガンド対ＣＤ４０）間の相互作用を解明することに関する。本開示はまた、ユーザー規定の標的細胞へのタンパク質又は核酸の送達のための組成物及び方法に関する。特に、本開示のいくつかの実施形態は、リガンド－受容体相互作用を解明し、標的細胞にカーゴを送達し、リガンド－受容体相互作用を細胞状態と結び付けるためのモジュラーウイルス提示及び送達プラットフォームに関する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、（１）ウイルス表面上にユーザー規定のリガンドタンパク質を提示すること、（２）同族リガンド提示ウイルスの受容体特異的細胞侵入を達成するためにフソゲンを操作すること、（３）操作されたウイルスを追跡するために蛍光タンパク質を有すること、（４）対形成されたリガンド－受容体を認識した際にカーゴを送達すること、及び（５）シーケンシングによってリガンド情報を記録するためにウイルスＲＮＡを修飾することを含む複数のレベルで操作することができる。この技術は「ＥＮＴＥＲ」（「操作されたリガンド－受容体相互作用によるレンチウイルス媒介細胞侵入」（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｅｎｔｒｙ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｌｉｇａｎｄ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ））と呼ばれ、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ、抗体－抗原、共刺激リガンド－受容体、及びＢ細胞抗原－ＢＣＲを含む相互作用の対を体系的に脱オーファン化することができる。いくつかの実施形態では、ＥＮＴＥＲによって受容体特異的な様式で遺伝子を送達することが可能となり、抗原特異的Ｔ細胞及びＢ細胞における細胞挙動の選択的な操作が可能となる。いくつかの実施形態では、ＥＮＴＥＲを液滴ベースのシングルセルゲノムプロファイリング（ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑ）と組み合わせて、個々のヒト初代Ｔ細胞における抗原特異性、ＴＣＲレパートリー、遺伝子発現、及び表面タンパク質ランドスケープを測定することができる。
Ｉ．一般的な技術
本発明の実施には、別途明示しない限り、当業者に周知である分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来の技術を用いる。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２０１２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｊｏｉｎｔｌｙ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｈｅｒｅｉｎ ａｓ “Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ２０１４）；Ｂｏｌｌａｇ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ｉ．（１９９７）．Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｄｏｙｌｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ；Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｆｅｒｒｅ，Ｆ．＆Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．（１９９４）．ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ａ．（２０１４）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ，（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ２０１４）；ａｎｄ Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．（２００３）．Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．などの文献で十分に説明されており、それらの開示内容は参照により本明細書に組み込まる。
ＩＩ．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語、表記法、及び他の科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解されている意味を有することを意図している。いくつかの場合では、一般的に理解されている意味を有する用語が明確にするため及び／又は参照を容易にするために本明細書で定義されており、本明細書にそのような定義が含まれていることは必ずしも当該技術分野で一般的に理解されているものとの実質的な違いを表すものと解釈されるべきではない。本明細書で説明又は参照されている技術及び手順の多くは、当業者によって十分に理解され、従来の方法論を使用して一般的に使用される。
単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、１つ以上の細胞（それらの混合物を含む）を含む。本明細書では、「Ａ及び／又はＢ」は、以下の選択肢：「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」、及び「Ａ及びＢ」のすべてを含むように使用される。
本明細書において使用される「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができる点でレトロウイルスの中で特有であり、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達できるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶはすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルス由来のベクターは、インビボでの有意な遺伝子導入レベルを達成するための手段を提供する。
「細胞」、「細胞培養物」、及び「細胞株」という用語は、特定の対象細胞、細胞培養物、又は細胞株を指すだけでなく、培養における移植又は継代の数に関係なく、そのような細胞、細胞培養物、又は細胞株の子孫又は潜在的な子孫も指す。すべての子孫が親細胞と完全に同一であるとは限らないことを理解する必要がある。これは、変異（意図的若しくは偶発的な変異など）又は環境の影響（メチル化若しくは他のエピジェネティックな修飾など）により、後続の世代で特定の修飾が生じる場合があるためであり、その結果、子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、子孫が元の細胞、細胞培養物、又は細胞株と同じ機能を保持している限り、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、若しくはシステムから導入されるか又はそれらの外部で生成される任意の物質を指す。
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、「スペーサー」又は「スペーサードメイン」とも称され、本発明の融合タンパク質中の２つのアミノ酸配列間に任意で配置されるアミノ酸又はアミノ酸配列を指す。
「生物学的試料」又は「試料」という用語は、個人又は対象から単離された固体又は液体の任意の試料を指す。例えば、動物（例えば、ヒト）、例えば、限定されないが生検材料（例えば、固体組織試料）又は血液（例えば、全血）から単離された任意の固体（例えば、組織試料）又は液体試料（例えば、血液）を指すことができる。このような試料は、例えば、新鮮であるか、固定されているか（例えば、ホルマリン、アルコール、又はアセトンで固定されている）、パラフィン包埋されているか、又は分析前に凍結されていてもよい。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、腫瘍（例えば、膵臓がん）から得られる。「試験生物学的試料」とは、分析、モニタリング、又は観察の対象となった生物学的試料である。同じ種類の生物学的試料（例えば、同じ種類の組織又は細胞）を含む「参照生物学的試料」は、試験生物学的試料の対照である。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の要素、例えば、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の物理的又は機能的な連結を意味し、これにより、それらの要素は意図された様式で作動することができる。例えば、本明細書に記載の核酸構築物（例えば、レンチウイルスベクター）又は核酸分子中のコード配列及びプロモーター配列の文脈で使用される場合の「作動可能に連結された」という用語は、コード配列及びプロモーター配列が、インフレームであり、空間的及び距離的に適切に離れており、転写因子又はＲＮＡポリメラーゼによるそれぞれの結合が転写に対して影響を及ぼすことを可能とすることを意味する。作動可能に連結された要素は、連続していてもよいし、又は非連続であってもよい（例えば、リンカーを介して互いに連結されている）ことを理解する必要がある。ポリペプチド構築物の文脈では、「作動可能に連結された」とは、構築物の記載された活性を提供するためのアミノ酸配列（例えば、異なるセグメント、部分、領域、又はドメイン）間における（例えば、直接的又は間接的に連結された）物理的な連結を指す。本明細書に開示されるポリペプチド又は核酸分子の作動可能に連結されたセグメント、部分、領域、及びドメインは、連続していてもよいし、又は非連続であってもよい（例えば、リンカーを介して互いに連結されている）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドの作動可能に連結されたセグメント、部分、領域、及びドメインは、互いにインフレームで融合されている。
本明細書に開示されるすべての遺伝子、遺伝子名、及び遺伝子産物は、本明細書に開示された組成物及び方法を適用することができる任意の種に由来する相同体に対応することが意図される。したがって、これらの用語には、ヒト及びマウス由来の遺伝子及び遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されない。特定の種由来の遺伝子又は遺伝子産物が開示される場合、この開示は例示のみを意図しており、それが現れる文脈が明示していない限り、限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、例えば、いくつかの実施形態では哺乳動物の核酸配列及びアミノ酸配列に関する本明細書に開示される遺伝子又は遺伝子産物は、他の哺乳動物、魚類、両生類、爬虫類、及び鳥類を含むがこれらに限定されない他の動物由来の相同及び／又はオーソロガス遺伝子及び遺伝子産物を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、遺伝子、核酸配列、アミノ酸配列、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質はヒトのものである。「遺伝子」という用語にはその変異体も含むことが意図される。
本明細書に記載の細胞集団は、任意の哺乳動物細胞集団であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ヒト、マウス、ラット、又は非ヒト霊長類の細胞集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団は体細胞集団又は生殖細胞集団である。いくつかの実施形態では、細胞集団は抗原特異的細胞（例えば、特定の抗原に結合する細胞）を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的細胞の集団は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的細胞の集団はＢ細胞及び／又はＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は均質な細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は異種の細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は対象から単離された細胞集団である。対象は、ヒト対象（例えば、疾患を患っているヒト対象）、マウス対象、ラット対象、又は非ヒト霊長類の対象であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞集団は対象の血液又は腫瘍から単離される。
値の範囲が提供されている場合、文脈が別途明示しない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在値（下限値の１０分の１の単位まで）及び示された範囲内の任意の他の示された値又は介在値は本開示に含まれると理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、示された範囲で具体的に除外される任意の制限を受けること条件として本開示内に含まれる。示された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれか又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
当業者に理解されるように、記載要件を提供することなどに関するあらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲には任意かつすべての可能なサブレンジ及びそれらのサブレンジの組み合わせも含まれる。任意の列挙された範囲は、同じ範囲を等分で少なくとも半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分けることを十分に記載し、それが可能であることを容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１、及び上３分の１などに容易に分けることができる。当業者に理解されるように、「最大で」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのすべての語は、記載された数字を含み、上記のようにその後にサブレンジに分けることができる範囲を指す。さらに、当業者に理解されるように、範囲には個々のメンバーが含まれる。したがって、例えば、１～３つの事物を有する群は１、２、又は３つの事物を有する群を指す。同様に、１～５つの事物を有する群は１、２、３、４、又は５つの事物を有する群を指すなどである。
本明細書では、「約」という用語の後に数値を用いて特定の範囲が提供される。本明細書では、「約」という用語は、その用語の後の正確な数値及びその用語の後の数値に近い数値又はおおよそのその数値についてのリテラルサポートを提供するために使用される。ある数字が具体的に記載された数字に近いか又は近似しているかを決定する場合、近いか又は近似している記載されていない数字は、それが提示される文脈において具体的に記載された数字と実質的に同等なものを提供する数字であり得る。近似の程度が文脈から別途明らかでない場合は、「約」は、提供された値のプラス若しくはマイナス１０％以内又は最も近い有効数字を四捨五入した値のいずれかを意味し、提供された値をすべての場合で含む。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、指定された値±最大１０％、最大±５％、又は最大±１％を示す。
本明細書に記載された開示の態様及び実施形態には、「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」の態様及び実施形態が含まれることが理解される。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、記載されていない追加の要素又は方法ステップを除外するものではない。本明細書で使用する場合、「からなる」とは、特許請求の範囲に記載された組成物又は方法において特定されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「から本質的になる」とは、特許請求の範囲に記載された組成物又は方法の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップを除外しない。特に組成物の成分の記載又は方法のステップの記載における「含む」という用語の本明細書での任意の記載は、記載される成分又はステップから本質的になる組成物及び方法を包含するものと理解される。
見出し、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、明細書及び特許請求の範囲を読み易くするためにのみ提供される。明細書又は特許請求の範囲における見出しの使用は、ステップ又は要素がアルファベット順若しくは数字順又ははそれらが提示されている順序で実施されることを必要とするものではない。
ＩＩＩ．本開示の組成物
操作されたレンチウイルス
本明細書では、ａ）細胞表面に特定のリガンドを提示し、ｂ）ウイルスがリガンドと天然で対形成する受容体を有する宿主細胞と融合させてその細胞にのみ侵入することを可能にする、変異したフソゲンを有し、ｃ）宿主細胞にレポーターを送達し、ｄ）ウイルスＲＮＡ上にタグ付けしてシングルセルシーケンシングを実施することができるように操作された、レンチウイルスを含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、欠陥のあるインテグラーゼを含み、その結果、ウイルスＲＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれず、それによって宿主ゲノムの組み込み誘導変異が回避されるようにさらに操作することができる。
リガンド
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたレンチウイルスは、ウイルス細胞表面上に提示された１つ以上のユーザー規定のリガンドを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、表面上にリガンドを提示するレンチウイルスに対して異種であり、例えば、リガンドは、別の細胞又は別のウイルスなどの異種供給源に由来する。好適なリガンド種の非限定的な例には、細胞表面受容体、接着タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質、リポタンパク質、及び表面に結合したリポ多糖、インテグリン、ムチン、並びにレクチンが含まれる。いくつかの実施形態では、リガンドは、タンパク質であるか、又はそれを含むことができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、エピトープであるか、又はそれを含むことができる。当業者は、「エピトープ」という用語が、抗原結合ポリペプチドの特定の抗原結合部位、例えば、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域と相互作用する抗原決定基を指すことを理解するであろう。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有することができる。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合し、異なる生物学的効果をもたらし得る。「エピトープ」という用語はまた、Ｂ細胞が応答する抗原上の部位を指す。これはまた、抗体が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、構造的又は機能的エピトープとして定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に寄与する残基を有する。エピトープは、線状であっても又は立体構造であってもよく、すなわち非線状アミノ酸から構成されてもよい。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面分子基である決定基を含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞表面タンパク質若しくは細胞内タンパク質又はそれらの一部であるか、あるいはそれらを含むことができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＭＨＣペプチド、抗体、細胞内抗原、分泌タンパク質、又は他の形態のタンパク質若しくはペプチドであるか、或いはそれらを含むことができる。
いくつかの実施形態では、リガンドが天然の膜貫通ドメインを含まない場合、シグナルペプチド及び膜貫通ドメインが追加されてリガンドと融合される。したがって、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＴＭドメインは、ウイルスのキャリーオーバー効率を促進し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、異種膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＣＡＭ１、ＣＤ４３、ＣＤ１６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４９ｄ、又はＬＦＡ－１に由来する異種膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＴＭは、最適化されたＴＭ（例えば、ＩＣＡＭ１、ＰＤＧＦＲに由来するＴＭなど）に置き換えられる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、レンチウイルスの産生に好適な細胞株（例えば、レンチウイルスを産生する一般的な細胞種であるＨＥＫ２９３Ｔ）の表面上に最初に提示されるように操作することができる。リガンドは、ウイルス粒子を生成するためにウイルス出芽中にウイルス表面上にキャリーオーバーすることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたレンチウイルスは、欠陥のあるインテグラーゼタンパク質を含む。
レポーター遺伝子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレンチウイルスは、レポーター（例えば、レポータータンパク質）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、レポーター（例えば、レポータータンパク質）をコードする核酸を含む。本明細書で使用する場合、レポーターとは一般的に、レトロウイルス及び／又は標的細胞で発現したときに検出することができるタンパク質又は遺伝子である。いくつかの実施形態では、細胞集団中の標的細胞又は標的細胞のサブセットにおけるレポーターの存在又は不存在により、細胞を選別すること（例えば、フローサイトメトリー及び／又は蛍光活性化細胞選別を使用して）が可能になる。
いくつかの実施形態では、レポーターは蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）であってもよい。例示的な蛍光タンパク質は、米国特許第７，０６０，８６９号に記載されるものであってもよい。特定のリガンドを提示する操作されたレンチウイルス粒子は、同族受容体－リガンドの相互作用の際に蛍光タンパク質を標的細胞に送達する。
いくつかの実施形態では、レポーターは、ＧＦＰよりも大幅に明るい単量体緑色蛍光タンパク質であるｍＮｅｏｎである。
いくつかの実施形態では、レポーターは、ウイルス構造遺伝子に作動可能に連結させる（例えば、融合させる）ことができる。いくつかの実施形態では、構造遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）又はＧａｇタンパク質であり得る。当業者は、本開示の教示から逸脱することなく、他の構造遺伝子を使用してもよいことを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、バーコード化されたＲＮＡは、ウイルス粒子、例えば、操作されたレンチウイルスによって生成されたウイルス粒子中にカプセル化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはリガンドをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞、例えば、宿主細胞に送達される目的の遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、次世代シーケンシング技術によって読み出される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは捕捉配列を含む。
フソゲン
本明細書で使用される「フソゲン」又は「融合分子」という用語は、一般に、ウイルスの表面に存在する場合に膜融合を促進、触媒、又は誘発することができる任意の分子を指す。本開示の組成物及び方法に好適なフソゲンの非限定的な例には、ウイルス由来のフソゲン、又は宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）において内因的に発現されるフソゲンが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のフソゲンは、糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のフソゲンは、ウイルス糖タンパク質である。本明細書に開示される組成物及び方法に好適な例示的なウイルスフソゲンには、ウイルス－宿主膜の融合を促進するためにエンベロープウイルスによって生成されるクラスＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのウイルス融合タンパク質に属するものが含まれる。これに関する追加の情報は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＶａｎｃｅ Ｔ．Ｄ．Ｒ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｊ．Ｅ．（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．Ｊｕｌ ６，３０（１３），Ｒ７５０－Ｒ７５４，２０２０）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、本開示のフソゲンは、クラスＩウイルス融合タンパク質、すなわち、コイルドコイル三量体を形成することができるものに属し、これには、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ＨＩＶ、及びエボラウイルスに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示のフソゲンは、クラスＩＩウイルス融合タンパク質、すなわち、融合中に二量体から三量体に移行し、融合後にヘアピン三量体となるβシートから主に構成される細長い細胞外ドメインを生成することができるものに属する。好適なクラスＩＩウイルス融合タンパク質には、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルス、及びダニ媒介脳炎ウイルスに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示のフソゲンは、クラスＩＩＩウイルス融合タンパク質、すなわち、前述の２つのクラスからの要素を組み合わせ、クラスＩと同様のコイルドコイル三量体化領域及びクラスＩＩのような細長いヘアピン三量体の両方を含む融合後の立体構造を採ることができるものに属する。好適なクラスＩＩＩウイルス融合タンパク質には、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、狂犬病ウイルスに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法のフソゲンは、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ－Ｇ）タンパク質であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法のフソゲンは、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ヒヒ内因性レトロウイルス（ＢａＥＶ）、マウス白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、ニパウイルス、ＲＤ１１４レトロウイルス、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ツパイア・パラミクソウイルス（Ｔｕｐａｉａ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）（ＴＰＭＶ）、若しくはＥＲＶＷ－１（例えば、シンシチン－１（Ｓｙｎｃｙｔｉｎ－１））などのヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）に由来するウイルス融合タンパク質であるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、操作されたレンチウイルスは、例えば、ウイルスと細胞膜との融合を促進するために、修飾されたフソゲンを含むことができる。フソゲンは、ウイルス表面糖タンパク質を必要とすることなくウイルスと細胞膜との融合を促進するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、フソゲンは、修飾された水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ－Ｇ）ウイルスエンベロープタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＶＳＶ－Ｇポリペプチドは、配列番号５６の配列であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質は、１つ以上の置換、例えば、ＶＳＶ－Ｇと細胞受容体との結合を無効にする置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇポリペプチドの位置Ｈ８、Ｋ４７、Ｙ２０９、及びＲ３５４のいずれか１つに対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。本明細書で言及される特定の位置のどのアミノ酸が本明細書に記載されていない別のＶＳＶ－Ｇアミノ酸配列のアミノ酸に「対応する」かを決定するために、アミノ酸配列、例えば、複数のＶＳＶ－Ｇポリペプチドの配列をどのようにアラインさせるかを知ることは当業者の知識の範囲内である。したがって、本明細書で使用される「対応する位置」という用語は、当該技術分野内で周知である。
本明細書に開示される修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質はまた、ＶＳＶ－Ｇの他の位置での保存的修飾及び置換（例えば、ＶＳＶ－Ｇと細胞受容体との結合を無効にするもの）を含むことができる。このような保守的な置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ １９７８（上記）及びＡｒｇｏｓ １９８９（上記）に記載されるものが含まれる。例えば、以下の群のうちの１つに属するアミノ酸は保存的変化を表す：群Ｉ：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；群ＩＩＩ：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；群ＩＶ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；群Ｖ：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び群ＶＩ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）置換、アルギニン（Ｒ）置換、アスパラギン（Ｎ）置換、アスパラギン酸（Ｄ）置換、ロイシン（Ｌ）置換、リジン（Ｋ）置換、フェニルアラニン（Ｆ）置換、リジン置換、グルタミン（Ｑ）置換、グルタミン酸（Ｅ）置換、セリン（Ｓ）置換、及びトレオニン（Ｔ）置換、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換には、アラニン置換が含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号５６の配列のＫ４７Ｑ置換又はＲ３５４Ａ置換に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質は、Ｋ４７Ｑ及びＲ３５４Ａ置換を含む。上記のように、ウイルス粒子を細胞膜と融合させることができる他のウイルスフソゲンも、ＥＮＴＥＲで好適に使用され得る。
シングルセルシーケンシング
ＥＮＴＥＲは、全細胞をインプットとして使用し、かつ、逆転写のステップを含む任意のシングルセル方法と組み合わせるために適用することができる。例えば、これは、５’又は３’アプローチを含む任意のシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓなど）、Ｂ細胞及びＴ細胞における免疫ＶＤＪ組み換えを同定するためのｓｃＴＣＲ／ＢＣＲ－ｓｅｑ（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、バーコード化された抗体を用いて表面マーカーを同定するためのＣＩＴＥ－ｓｅｑ／ＥＣＣＩＴＥ、シングルセルトランスクリプトームと組み合わせたＣＲＩＳＰＲを用いて遺伝子を摂動するためのシングルセルＣＲＩＳＰＲ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑなどの公開されている又は市販のシングルセルシーケンシング技術と互換性がある。
ＩＶ．本開示の方法
リガンド－受容体の対を同定するための方法
本明細書では、（ｉ）本明細書に開示される少なくとも１つの操作されたレンチウイルスを提供し、（ｉｉ）レンチウイルスを細胞集団と合わせ、（ｉｉｉ）レポーター遺伝子の存在に基づいて細胞集団を選別し、それによってリガンド－受容体の対を同定することによって、リガンド－受容体の対を同定するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、操作されたレンチウイルスは、レンチウイルスの表面上に提示されたリガンド（ここで、リガンドは、レンチウイルスに対して異種である）、修飾されたウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ（例えば、レンチウイルスと宿主細胞との融合を促進、触媒、又は誘発することができ）、宿主細胞は、リガンドに対する内因性受容体、レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結された（例えば、融合された）レポータータンパク質、及びバーコード化されたＲＮＡを含む）を含む。
レンチウイルスを細胞集団と規定の期間にわたって合わせることができる。いくつかの実施形態では、期間は、秒、分、時、又は日で測定されてもよい。いくつかの実施形態では、期間は、０～３０秒、１５～４５秒、３０～６０秒、４５～９０秒、６０～９０秒、又は６０～１２０秒である。いくつかの実施形態では、ウイルスを細胞集団と合わせ、０～３０秒、１５～４５秒、３０～６０秒、４５～９０秒、６０～９０秒、又は６０～１２０秒間接触させる。いくつかの実施形態では、期間は、１～２分、１～５分、１～１０分、２～１０分、５～１０分、５～２０分、１０～２０分、２５～３０分、２５～６０分、３０～４５分、３０～４０分、４０～６０分、５０～７０分、又は６０～１２０分である。いくつかの実施形態では、レトロウイルスを細胞集団と合わせ、１～２分、１～５分、１～１０分、２～１０分、５～１０分、５～２０分、１０～２０分、２５～３０分、２５～６０分、３０～４５分、３０～４０分、４０～６０分、５０～７０分、又は６０～１２０分間接触させる。いくつかの実施形態では、期間は、１～２時間、１～５時間、１～３時間、２～５時間、３～６時間、３～１２時間、６～１２時間、１２～１８時間、１２～２４時間、１５～３０時間、１８～２４時間、２４～４８時間、２４～３６時間、又は３６～５０時間である。いくつかの実施形態では、ウイルスを細胞集団と合わせ、１～２時間、１～５時間、１～３時間、２～５時間、３～６時間、３～１２時間、６～１２時間、１２～１８時間、１２～２４時間、１５～３０時間、１８～２４時間、２４～４８時間、２４～３６時間、又は３６～５０時間接触させる。いくつかの実施形態では、期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は５～１５日である。いくつかの実施形態では、ウイルスを細胞集団と合わせ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は５～１５日間接触させる。一態様では、方法は、リガンド－受容体の対を同定するためにレンチウイルスと細胞とを２時間合わせることを含む。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスを細胞集団と４℃～４２℃、４℃～８℃、４℃～１０℃、８℃～１５℃、１０℃～２０℃、１８℃～２３℃、２０℃～３０℃、２５℃～３５℃、３０℃～４０℃、又は３７℃～４２℃の範囲の温度で合わせることができる。
いくつかの実施形態では、リガンド－受容体の対を同定するために、細胞集団及びウイルスを３７℃で約２時間インキュベートすることができる。しかしながら、修正は本開示の範囲内である。
Ｔ細胞受容体及び対形成されたｐＭＨＣを同定するための方法
さらに、本明細書では、Ｔ細胞受容体及び対形成されたｐＭＨＣを同定するための方法であって、（ｉ）本明細書に開示される操作されたレンチウイルスを提供することと、（ｉｉ）レンチウイルスを細胞集団と合わせることと、（ｉｉｉ）レポーターの存在に基づいて細胞集団を選別し、それによってＴ細胞受容体を同定することとを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、操作されたレンチウイルスは、ウイルス表面上に提示されたｐＭＨＣ、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、宿主細胞は、ｐＭＨＣに対するＴ細胞受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結された（例えば、融合された）レポーター導入遺伝子、及びバーコード化されたＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、方法は、異なるＭＨＣペプチド（例えば、ＭＨＣペプチドのプール）を提示するウイルスの混合物を提供する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞株の集団であり得る。別の実施形態では、細胞はヒト初代Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、一本鎖フォーマットが使用されるように提示されたｐＭＨＣを操作することができ（図２Ａ）、すなわち、ＲＮＡは、シグナルペプチド、抗原ペプチド、Ｇ４Ｓリンカー、ｂ２ｍ遺伝子、Ｇ４Ｓリンカー、及びＭＨ対立遺伝子を直列にコードすることができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスＲＮＡ及び細胞受容体の配列のシングルセルシーケンシングを行って、ＭＨＣペプチド配列及びＴＣＲ受容体情報を同定するステップをさらに含むことができる。
本明細書で提供される方法は、既知のｐＭＨＣプールを使用して新規のＴＣＲ受容体を同定することの他に、既知のＴ細胞受容体に対してマッチングするＭＨＣペプチドを同定するために使用することができる。例えば、以下の実施例に示すように、既知のＴ細胞受容体のアルファ鎖及びベータ鎖がＪｕｒｋａｔ－７６などのＴＣＲ陰性細胞株で発現している場合、ｐＭＨＣ候補を有するウイルスのプールを細胞と混合することができる。
Ｂ細胞受容体及び対形成された抗原を同定するための方法
本明細書では、Ｂ細胞受容体又は抗体を同定するための方法であって、本明細書に開示される操作されたレンチウイルスを提供することと、（ｉｉ）レンチウイルスとＢ細胞集団とを合わせることと、（ｉｉｉ）レポーターの存在に基づいて細胞集団を選別し、それによってＢ細胞抗原を同定することとを含む、方法も提供される。いくつかの実施形態では、操作されたレンチウイルスは、レンチウイルス表面上に提示されたエピトープ（ここで、エピトープは、ＩＣＡＭ１膜貫通ドメインと作動可能に連結される（例えば、融合される））、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ（例えば、レンチウイルスと宿主細胞との融合を促進、触媒、又は誘発することができ）、宿主細胞は、細胞内エピトープに対するＢ細胞受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結された（例えば、融合された）レポーター導入遺伝子、及びバーコード化されたＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞表面膜タンパク質、細胞内タンパク質、分泌タンパク質、又は細胞表面上で発現することができる他の形態（例えば、グリコシル化分子）である。
いくつかの実施形態では、方法は、抗原及びマッチングするＢ細胞受容体（ＢＣＲ、抗体）の情報を同定するために、ウイルスＲＮＡ及び細胞受容体の配列のシングルセルシーケンシングのステップをさらに含むことができる。さらなる態様では、方法は、新規の抗体／ＢＣＲ及び抗原の対を同定することができる。
目的の分子を細胞内に送達するための方法
いくつかの実施形態では、本開示は、目的の分子、例えば、目的の核酸又はタンパク質をユーザー規定の標的細胞に送達するための方法であって、レンチウイルスの表面上に提示された異種リガンド、修飾されたウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（ここで、フソゲンは、レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ（例えば、レンチウイルスと宿主細胞との融合を促進、触媒、又は誘発することができ）、宿主細胞は、リガンドに対する内因性受容体を含む）、レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結された（例えば、融合された）レポータータンパク質、及びバーコード化されたＲＮＡを含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、レンチウイルスを標的細胞を含む細胞混合物と接触させて、核酸又はタンパク質を標的細胞のみに送達することとを含み、標的細胞は、レンチウイルス表面上のリガンドに特異的な受容体を発現する、方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、リガンドは、カーゴをユーザー規定の標的細胞に送達するために修飾される。いくつかの実施形態では、目的の核酸は、操作されたレンチウイルス粒子内にパッケージ化される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、レンチウイルスのｇａｇタンパク質と作動可能に連結される（例えば、融合される）。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質をレポーターに置き換える。いくつかの実施形態では、標的細胞はインビボにある。いくつかの実施形態では、標的細胞はエクソビボにある。いくつかの実施形態では、標的細胞はインビトロにある。いくつかの実施形態では、標的細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞であり、受容体はＴ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＢ細胞であり、受容体はＢ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は初代ヒト血液細胞（ＰＢＭＣ）である。
目的の分子を細胞に送達するための方法
上記で概説したように、本開示の一態様は、細胞混合物中の標的細胞集団を選択的に枯渇させるか又は濃縮する方法であって、（ａ）請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス、並びに（ｂ）（ｉ）操作されたレンチウイルスの表面上に提示されたリガンドに特異的な受容体を発現する標的細胞集団、及び（ｉｉ）受容体を発現しない非標的細胞集団を含む、細胞混合物を提供することと、操作されたレンチウイルスを細胞集団と接触させて、核酸又はタンパク質を標的細胞にのみ送達することと、標的細胞集団の増殖を特異的に阻害するか又は非標的細胞集団の増殖を阻害する試薬を添加し、それによって標的細胞集団を選択的に枯渇させるか又は濃縮することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、受容体は免疫受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体はＢ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体はＴ細胞受容体である。
本開示の標的細胞集団を選択的に枯渇させるか又は濃縮するための方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的細胞は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）導入遺伝子を発現し、添加される試薬は、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を含むか、又はガンシクロビル（ＧＣＶ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞集団は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ｓｈＲＮＡを発現して細胞死受容体ＦＡＳの発現を減少させて、標的集団の細胞死を防ぐ。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＢ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は自己反応性免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、健康状態に関連する抗原に対して特異的である。いくつかの実施形態では、健康状態は、増殖性障害、炎症性障害、自己免疫障害、又は微生物感染症である。いくつかの実施形態では、増殖性障害はがんである。いくつかの実施形態では、微生物感染症は、細菌感染症、ウイルス感染症、又は微小真菌感染症である。
Ｖ．システム
本明細書では、ＥＮＴＥＲ（操作された受容体－リガンド相互作用によるレンチウイルス媒介性細胞侵入）と称されるシステムも提供され、これは、リガンドの提示、カーゴの送達、及び相互作用の記録などのための多様な用途を達成することができる多目的プラットフォームであることが示されている。ＥＮＴＥＲの例示的な用途には、リガンド－受容体相互作用の解明、シングルセルレベルでの受容体相互作用と細胞状態との関連付け、及び受容体に特異的な様式でのカーゴの送達が含まれる。本明細書でより詳しく記載するように、複数の機能を１つのプラットフォームに一元化することができることは大きな利点である。ＥＮＴＥＲは、複数の別個の単一目的の技術を集めて使いこなすのではなく、多くの重要な問題を解決する１つのプラットフォームをユーザーに提供する。第１に、本開示のいくつかの実施形態では、ｐＭＨＣ複合体、抗体、共刺激分子、及びＢ細胞抗原を含む、異種細胞表面タンパク質、細胞内エピトープ及び細胞外エピトープの提示を可能にするようにレンチウイルスを操作した。ＥＮＴＥＲは、酵母又はファージディスプレイプラットフォームと比較していくつかの利点を有する（例えば、表１を参照のこと）。酵母／ファージディスプレイプラットフォームにおけるグリコシル化パターンは、正しいＭＨＣ提示及び対形成されたＴＣＲの認識を妨げ得る哺乳動物システムとは異なる。さらに、酵母又はファージディスプレイは、正しいフォールディング、安定性、及びＭＨＣの提示を達成するために大幅な最適化を必要とする。さらに、複数のＨＬＡペプチドの組み合わせを提示することができることを本出願人が立証できているように、ＥＮＴＥＲは、ヒト細胞内で行われ、ヒトのグリコシル化及びタンパク質のフォールディングパターンを可能にする。さらに、酵母及びファージディスプレイプラットフォームでのスクリーニングには可溶性組み換えＴＣＲが必要であるので、多様なＴＣＲを並行して試験することは困難となる。対照的に、ＥＮＴＥＲにより、研究者は初代Ｔ細胞試料をスクリーニングすることができ、これによってヒトＴＣＲレパートリーの幅広い多様性を調べることが可能となる（例えば、表１を参照のこと）。ＥＮＴＥＲはまた、ｐＭＨＣ－ＴＣＲ相互作用の解明に関してＴスキャンなどの細胞溶解性Ｔ細胞レポーターアッセイよりも優れているが、その理由は、後者は、シングルセルレベルでｐＭＨＣとＴＣＲとの対形成を記録できないためである。
第２に、いくつかの実施形態では、受容体特異的な様式でカーゴを送達するようにＥＮＴＥＲを操作することができる。受容体－リガンド相互作用によってウイルスの融合及び感染が駆動されるようにレンチウイルスを操作した。組み込み欠陥を有する機構を柔軟に使用して、研究者がカーゴを一時的に又は安定的に送達することを選択し得るようにこのシステムをさらに操作した。いくつかの実施形態では、ＥＮＴＥＲは、ＡＡＶなどの既存のモダリティと比較して優れた細胞種特異性を達成することができるため、遺伝子治療又はＲＮＡ医薬での用途を有し得る。いくつかの実施形態では、ＥＮＴＥＲは、細胞死を誘導するか又は細胞死から保護する遺伝子カーゴの特異的な送達に基づいて、抗原特異的Ｔ細胞を選択的に枯渇又は増殖させることができる（例えば、図４を参照のこと）。ＥＮＴＥＲによって抗原特異的Ｂ細胞の枯渇が可能となり、これにより病原性自己抗原特異的Ｂ細胞を根絶して自己免疫障害を潜在的に処置することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＮＴＥＲは、シングルセルレベルでリガンド－受容体相互作用と分子設計図とを関連付けするために使用することができる。例えば、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、リガンド－受容体相互作用を解明する能力とシングルセルゲノミクスの力とを組み合わせて、細胞－細胞コミュニケーション及び細胞状態を大規模並列で解明する。ｐＭＨＣに対するＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、概念的にはｐＭＨＣテトラマー分子のＤＮＡバーコード化ライブラリと類似しているが、いくつかの潜在的な利点を有する。さらに、ＥＮＴＥＲは、市販のＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣテトラマーに比べてコストを低くすることできる。ＥＮＴＥＲは、ＤＮＡバーコードを有するｐＭＨＣテトラマーをインハウスで生成することと比較して、どの研究室でも簡単に行うことができる（表２を参照のこと）。ｐＭＨＣテトラマーへのＤＮＡ結合では、結合反応中に不均一なバーコードオリゴヌクレオチドのローディングを受け得るが、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑライブラリは、レンチウイルス生物学を活用し、これは各ウイルス粒子に対してバーコード化ウイルスＲＮＡの２つのコピーを保証する。ウイルス様粒子あたりのＤＮＡバーコードの均一な分布により、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑによってｐＭＨＣ結合強度の定量化が可能になり、これはＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣテトラマーを使用した研究で調べられていない。本明細書で記載した実験データにより、高度に増殖したＴＣＲクローンはより高いｐＭＨＣ結合に関連することが明らかにされたが（例えば、図７Ｇを参照のこと）、このことはおそらく、ｐＭＨＣに対するＴＣＲ親和性がより高いこと又は増殖したクローンにおけるＴＣＲ表面密度がより高いことに起因する。
最後に、本明細書でより詳しく記載されているように、ＥＮＴＥＲは、試薬あたりのモル基準でｐＭＨＣテトラマーよりも感度が高い（図２Ｃを参照のこと）。いくつかの実施形態では、優れた感度は、ＥＮＴＥＲで提示されるｐＭＨＣの数が多いことに起因し得る。ＨＩＶベースのレンチウイルス粒子は、ウイルス粒子あたり１４～１００個のエンベロープタンパク質分子を提示するが、ｐＭＨＣテトラマーは定義上、４つの連結された分子である。纏めると、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑにより、研究者はリガンド－受容体特異性を記録し、ナイーブ細胞の活性化、エフェクター細胞の増殖、メモリー細胞の形成、又はＴ細胞の枯渇を含む抗原依存性Ｔ細胞の運命などのこの相互作用の生物学的結果を読み出すことができる。同様に、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、感染症疾患及び自己免疫の文脈で抗原特異的Ｂ細胞の分子プログラムを理解するために使用されてもよい。
初代ＣＭＶ特異的Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑ分析は、単一の実験において数万個の初代Ｔ細胞にわたって抗原エピトープ、ＴＣＲレパートリー、遺伝子発現プログラム、及び表面タンパク質表現型のランドスケープを結び付けるプラットフォーム力を示す。このような多様なモダリティの大規模並列プロファイリングにより、ドナー特異的抗原の特異性及びウイルスエピトープの免疫原性が明らかになった。いくつかの実施形態では、ペプチド刺激前後のＴ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑにより、増殖の際の転写変化及び同じ抗原に応答するクローン間の表現型の多様性が明らかになった。このような転写変化及びＴｈ２サイトカイン発現におけるクローンの多様性は、同じｐＭＨＣ抗原に対する異なるＴＣＲ親和性／アビディティ／密度又は抗原提示細胞からの異なるプライミング環境によって影響を受け得る。急性リンパ性白血病患者におけるＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞のシングルセルプロファイリングに関する最近の研究により、再発患者と比較して、持続的な応答者においてＴｈ２発現の誘導が臨床効果と正の相関関係にあることが示された（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２２）。しかしながら、Ｔｈ２サイトカインがどのようにしてＣＤ８Ｔ細胞エフェクター機能を高めて長期寛解を達成することができるのか、及びそのような利益を感染症疾患に汎用することができるのかどうかは不明である。Ｔｈ２サイトカイン発現のＴＣＲクローン特異的誘導を示す本明細書に記載された実験データは、養子Ｔ細胞療法に対するＴＣＲ－Ｔ細胞の操作のためのＴＣＲの選択を知らせる得る。さらに、本明細書に記載するＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、Ｔ細胞のクローン性及び特異性が抗原特異的Ｔ細胞の分子表現型及び生理機能にどのように影響するかを包括的に理解するための洞察を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＮＴＥＲは、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞を単離及び濃縮して患者に再注入するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＮＴＥＲは、ワクチン開発又はがん免疫療法の合理的な設計のために免疫原性抗原又は優れたＴＣＲをスクリーニングするための発見の文脈でさらに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＮＴＥＲはまた、ウイルス抗原を標的化するＢＣＲのスクリーニングに適用されてもよく、これによりウイルス感染を予防するための治療用抗体の開発が促進される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＮＴＥＲは、遺伝子及びｓｈＲＮＡなどのカーゴの抗原特異的送達を可能にし、これにより抗原特異的Ｔ細胞及びＢ細胞の摂動及び操作が可能となる。この標的化送達戦略は、免疫関連の有害事象を引き起こすことなく疲弊した抗腫瘍Ｔ細胞を再活性化し、又は自己反応性Ｔ細胞若しくはＢ細胞を枯渇させて自己免疫を処置することに適用されてもよい。さらに別の実施形態では、ＥＮＴＥＲは、Ｇタンパク質共役受容体、接着分子、又はプロトカドヘリンなどの追加の受容体－リガンド対に拡張されてもよい。したがって、ＥＮＴＥＲは、免疫システムの域を超える細胞間関連性に対処するために使用されてもよい。
ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、リガンド－受容体相互作用を解明する能力とシングルセルゲノミクスの力とを組み合わせて細胞種及び細胞状態を大規模並列で解明することができる。ｐＭＨＣに対するＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、概念的にはＭＨＣテトラマー分子のＤＮＡバーコード化ライブラリに類似しているが、いくつかの潜在的な利点がある。ＭＨＣテトラマーライブラリでは、個々のペプチドを合成し、次いでＭＨＣテトラマーにローディングする必要があるため、大規模並列ＤＮＡ合成によって調製することができるＥＮＴＥＲ－ｓｅｑライブラリと比較して、コストが高く、リードタイムが長く、低スループットとなる。ＭＨＣテトラマーへのＤＮＡ結合は、結合反応中に不均一なバーコードオリゴヌクレオチドのローディングを受け得るが、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑライブラリは、レンチウイルス生物学を活用し、これは各ウイルス粒子に対してバーコード化されたウイルスＲＮＡの２つのコピーを保証する。最後に、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、ＭＨＣテトラマーと比較して感度が高いものであり得る。ＨＩＶベースのレンチウイルス粒子はウイルス粒子あたり１４～１００個のＥｎｖタンパク質分子を提示するが、ＭＨＣテトラマーは定義上、４つの連結した分子である。
ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑにより、研究者はリガンド－受容体特異性を記録し、この相互作用の生物学的結果、例えば、ナイーブ細胞の活性化、エフェクター細胞の増殖、メモリー細胞の形成、又はＴ細胞の疲弊などの抗原依存性Ｔ細胞の運命を読み出すことができる。同様に、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、自己免疫における自己抗体産生Ｂ細胞の分子プログラムを理解するために使用されてもよい。
ＥＮＴＥＲは、シングルセル分解能でリガンド－受容体相互作用と分子設計図とを関連付けする。ＥＮＴＥＲは、Ｔスキャンなどの細胞溶解性Ｔ細胞レポーターアッセイを上回る利点を有するが、その理由は、後者がシングルセルレベルでペプチド－ＭＨＣとＴＣＲとの対形成を記録することができず、これによりプール分析が不可能となるためである。
ＥＮＴＥＲは、免疫学及びそれ以外での橋渡し用途を有し得る。ＥＮＴＥＲは、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞を単離及び濃縮して、患者に再注入するために使用されてもよい。ＥＮＴＥＲの非組み込み特性により、養子Ｔ細胞療法が容易になる。ＥＮＴＥＲは、ワクチン開発及びがん免疫療法の合理的な設計のために、免疫原性抗原又は優れたＴＣＲをスクリーニングするための発見の文脈でさらに使用されてもよい。
明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明されている本開示の特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に言えば、開示の様々な特徴は、簡潔に言えば、単一の実施形態の文脈で説明されているものは、別々に、又は任意の好適なサブコンビネーションで提供することもできる。本開示に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、それぞれのすべての組み合わせが個別に明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素のすべてのサブコンビネーションも本開示によって具体的に包含され、あたかもそのようなサブコンビネーションのそれぞれが個別に明示的に本明細書に開示されているかのように本明細書に開示される。
本明細書に提供される一般的な方法の議論は、例示目的ためのみであることが意図される。他の代替方法及び代替物は、本開示を検討すれば当業者には明らかであり、本出願の趣旨及び範囲内に含まれるものとする。
本開示は、明確性及び理解の目的のために、例示及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、付随する特許請求の範囲内で特定の変更及び修正を行うことができることは明らかである。
本明細書全体にわたって、様々な特許、特許出願、及び他の種類の刊行物（例えば、原著論文、電子データベースエントリなど）が参照されている。本明細書に引用されているすべての特許、特許出願、及び他の刊行物の開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１
本実施例では、本開示のいくつかの実施形態に従って例示的なＥＮＴＥＲを示すために行った実験の結果を記載し、ＥＮＴＥＲは、リガンド受容体相互作用を捕捉及び解明し、標的細胞にカーゴを送達し、リガンド－受容体相互作用と細胞状態とを関連付けするためのモジュラーウイルス提示及び送達プラットフォームとして操作される。
レンチウイルスを、（ｉ）ウイルス表面上に提示されたリガンドタンパク質、（ｉｉ）提示されたリガンド及び修飾されたフソゲンによる宿主受容体標的化ウイルス侵入、（ｉｉｉ）ウイルスカプシドの融合による蛍光タンパク質送達、及び（ｉｖ）シングルセルシーケンシングのためのタグ付けされたウイルスＲＮＡを含む、複数のレベルで操作した（例えば、図１Ａを参照のこと）。
例えばユーザー規定のリガンドタンパク質を提示するウイルスを使用することによるレンチウイルスと宿主細胞との間の特異的なリガンド－受容体相互作用を達成するために、インタクトな融合能力を維持しながら天然受容体の結合が壊れているウイルスエンベロープタンパク質（フソゲンと称される）は、ウイルス表面上に提示されたユーザー規定のリガンドタンパク質と協働するように設計される。２つの別個のモジュール（リガンドタンパク質＋フソゲン）の協働により、ウイルスに提示されたリガンドと宿主受容体との相互作用が可能になり、フソゲンによる宿主細胞へのウイルスの融合がさらに促進される（図１Ａを参照のこと）。ウイルスエンベロープタンパク質である水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）は、レンチウイルスをシュードタイプ化するために使用される。ＶＳＶ－Ｇは多くの細胞種で発現している低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を認識してそれと相互作用できるため、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ウイルスは広範なトロピズムを有する。
これらの実験では、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞及びＲａｊｉ Ｂ細胞に、ＧＦＰ導入遺伝子を有するＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスを感染させた。これらのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞及びＲａｊｉ Ｂ細胞では強いＧＦＰ発現が観察されたが、形質導入効率は異なり、これは多様な細胞種におけるＬＤＬＲの変動する発現に起因する可能性がある（図１Ｂを参照のこと）。
宿主細胞上のＬＤＬＲの認識及び相互作用を防げるために、２つの点変異（Ｋ４７Ｑ、Ｒ３５４Ａ）を有するＶＳＶ－Ｇ変異体が設計された（Ｎｉｋｏｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。変異ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ウイルスを使用したＲａｊｉ（０．１％）細胞及びＪｕｒｋａｔ（０．６％）細胞では最小限のＧＦＰ発現が観察されたが（図１Ｂを参照のこと）、これは、宿主細胞上の特定の受容体のウイルス認識がウイルスの侵入及び組み込みの最初の重要なステップであることを示唆している。ＶＳＶ－Ｇ変異体が、対形成する受容体を発現する宿主細胞におけるウイルス感染のためにウイルス表面上のユーザー規定のリガンドと協働する良好なフソゲン候補であるかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、抗ＣＤ１９一本鎖抗体可変断片（ｓｃ－Ｆｖ）を含む十分に確立されたＣＤ１９－ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）をＶＳＶ－Ｇ変異体、ウイルストランスファーベクター中のＧＦＰ導入遺伝子、及びレンチウイルスのパッケージング成分とともに共発現させ、上清からウイルスを収集した。予想通り、このようなウイルスはＣＤ１９の発現レベルが高いＲａｊｉ Ｂ細胞に特異的に感染したが、ＣＤ１９陰性のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞には感染しなかった（図１Ｂを参照のこと）。したがって、本出願人は、天然のＶＳＶ－Ｇ／ＬＤＬＲ相互作用に依存する細胞侵入から、ユーザー規定のリガンドと対形成される宿主細胞受容体との間の相互作用に依存する細胞侵入まで、ウイルス融合を再プログラムすることができるウイルス提示プラットフォームを開発した。
ウイルスの組み込み及び組み込みで誘導される宿主ゲノムの変異を回避しながらリガンド－受容体相互作用を捕捉するために（Ｒａｎｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、本出願人は、宿主ゲノムに組み込むことができないウイルスインテグラーゼ変異体（Ｄ６４Ｖ）を操作し（Ｃｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ＧＦＰタンパク質をウイルス構造タンパク質と融合し、リガンド提示ウイルスを追跡した。ＧＦＰを発現するためのウイルスの組み込みの代わりに、ＧＦＰタンパク質を有するリガンド提示ウイルスを使用して、対形成される受容体を発現する宿主細胞への一時的なウイルスの侵入を測定した。ＧＦＰの最適な融合パートナーとして機能するウイルスタンパク質を同定するために、本出願人は、マトリクスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、及びウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）と呼ばれるＨＩＶアクセサリタンパク質を含む３つのウイルスタンパク質を試験した（図１Ｃを参照のこと）。ウイルスの組み立て及び合成中に、ＭＡ及びＮＣはＧａｇ前駆体タンパク質からプロセシングされ、これはウイルス粒子あたり３０００コピーのＭＡ又はＮＣとしてシスで組み立てることができる（Ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８； Ｋｕｔｌｕａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＶＰＲは、ウイルス粒子あたり５００コピーのＶＰＲとして、Ｇａｇタンパク質との相互作用によりウイルス粒子にトランスで組み込まれる（Ｗｕｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＧＦＰがＮＣと融合する場合に、Ｒａｊｉ細胞の８０％がＣＤ１９－ＣＡＲ提示ウイルスによってによって結合されたことが観察され、ＭＡ－ＧＦＰ及びＶＰＲ－ＧＦＰよりも大幅に優れた性能を示した（図１Ｃを参照のこと）。
ＣＤ１９－ＣＡＲ提示ＮＣ－ＧＦＰウイルスがヒト血液由来の初代ＣＤ１９＋Ｂ細胞を認識してこれに結合することができるかどうかを調べるために、これらのウイルスをナイーブ又は活性化ヒト初代Ｂ細胞とともに２時間インキュベートし、フローサイトメトリーによってこれらのＢ細胞上のＧＦＰシグナルを検出した。Ｒａｊｉ Ｂ細胞株と同様に、活性化ヒト初代Ｂ細胞の８０％がＮＣ－ＧＦＰ標識ＣＤ１９－ＣＡＲ提示ウイルスによって結合されたが、ナイーブＢ細胞の６０％がＧＦＰ＋である（例えば、図１Ｄを参照のこと）。ナイーブＢ細胞と活性化Ｂ細胞との間のＣＤ１９発現の違いがＣＤ１９－ＣＡＲウイルスの結合の不一致の原因であり得る。実際、フローサイトメトリーの結果は活性化Ｂ細胞におけるＣＤ１９の表面発現がナイーブＢ細胞よりも有意に高いことを示し（例えば、図１Ｅ～１Ｆを参照のこと）、活性化Ｂ細胞上のウイルスの結合がより高いことと一致している。この結果は、受容体発現細胞へのリガンド提示ウイルスの結合がリガンドと対形成した受容体の発現レベルと定量的に相関していることを示している。さらに、ＣＤ１９－ＣＡＲウイルスのインキュベーション後、ＣＤ１９表面発現は劇的に減少し、これは、ＣＤ１９－ＣＡＲウイルスがＣＤ１９に特異的に結合し、ＣＤ１９抗原のマスキング又は表面ＣＤ１９の内在化の誘導のいずれかにより、ＣＤ１９を標的化するフローサイトメトリー抗体のその後の結合を妨げることを示している（図１Ｅ～１Ｆ）。表面ＣＤ１９の喪失がウイルス融合によって誘導された表面ＣＤ１９の内在化によるものか、又はその後のＣＤ１９抗体染色を妨げるＣＤ１９への特定のウイルス結合によるものかを決定するために、ウイルス結合及び融合アッセイを行った（例えば、図１Ｈを参照のこと）。結果は、プロテイナーゼＫ処理後にＧＦＰ＋細胞が５％しか存在しなかったことを示し、これは、表面結合ＧＦＰ標識ウイルスのプロテイナーゼＫ媒介による分解を妨げるためのウイルス融合を起こした細胞はごくわずかであったことを示している（図１Ｉを参照のこと）。したがって、表面ＣＤ１９の減少は内在化ではなく、主にＥＮＴＥＲウイルスからの特定のＣＤ１９結合／マスキングから生じ、これは、リガンド提示ウイルスが標的化受容体に対して非常に特異的であることをさらに強調している。
リガンド提示ＧＦＰ融合ウイルスが他のリガンド－受容体相互作用を介して標的細胞に特異的に結合することができるかどうかをさらに決定するために、野生型ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）又は変異ＣＤ４０Ｌのいずれかを提示するようにウイルスを操作した。ＣＤ４０Ｌ変異体は、ＣＤ４０に対する結合親和性の低下をもたらす２つの点変異（Ｋ１４２Ｅ、Ｒ２０２Ｅ）を含む（Ｐａｓｑｕａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。フローサイトメトリーの結果により、ＣＤ４０Ｌ変異体を提示するウイルスとともにインキュベートした場合、野生型ＣＤ４０Ｌと比較して、ＧＦＰ＋Ｒａｊｉ細胞が有意に減少することが示された（図１Ｊ～１Ｌ）。
リガンドタンパク質及びフソゲンがウイルス粒子表面上に組み込まれたことを確認するために、免疫捕捉アッセイを行い、抗体コーティング磁気ビーズによって所望のタンパク質を提示するウイルスをプルダウンした（例えば、図１Ｍを参照のこと）。具体的には、ＣＤ４０Ｌ及びフソゲン（ＶＳＶ－Ｇ変異体）を提示するウイルスを生成し、次いでそれぞれ抗ＣＤ４０Ｌビーズ、抗ＶＳＶ－Ｇビーズ、及びＩｇＧビーズとともにインキュベートした。インキュベーション及び十分な洗浄の後、その後のｑＲＴ－ＰＣＲ分析のためにウイルスＲＮＡを抽出した。ＩｇＧ陰性対照と比較して、抗ＣＤ４０Ｌ及び抗ＶＳＶ－Ｇ群ではウイルスＲＮＡの顕著な濃縮が見出され、リガンドタンパク質及びフソゲンがビリオン表面上に組み込まれていることが確認された（図１Ｎを参照のこと）。
纏めると、これらの結果により、本出願人のウイルス提示プラットフォーム、例えばＥＮＴＥＲは、一時的ウイルス結合のアッセイにおいて非常に特異的なリガンド－受容体相互作用を捕捉することができ、複数のカテゴリーの受容体－リガンド相互作用に適用することができることが示唆される。
したがって、特定のリガンドを提示する操作されたレンチウイルス粒子は、ゲノム組み込み及び導入遺伝子の転写なしに、同族受容体－リガンド相互作用の際に蛍光タンパク質を標的細胞に送達する。
実施例２
本実施例では、ＭＨＣペプチド（ｐＭＨＣ）を提示するウイルスを用いたＥＮＴＥＲがＴＣＲ特異性をどのようにマッピングするか、特にこのウイルス提示プラットフォームがｐＭＨＣとＴＣＲとの間の相互作用をどのように捕捉するかを示すために行った実験の結果について記載する。
本出願人は、ベータ２マイロクグロブリン（Ｂ２Ｍ）と融合したＭＨＣ及び共有結合したペプチドの一本鎖を提示するようにウイルスを操作した（例えば、図２Ａを参照のこと）。ＨＬＡペプチド提示ウイルスを産生するときのＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の内因性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ、ヒトＭＨＣ遺伝子座）の干渉を防ぐために、本出願人は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によってすべての潜在的なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ）をノックアウトすることにより、安定したＨＬＡノックアウト（ＫＯ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を作製した。Ｂ２Ｍの表面発現はＨＬＡ ＫＯ細胞において無く、これは、すべての内因性ＨＬＡ対立遺伝子が成功裏に欠失されたことを示唆している（図２Ｇを参照のこと）。Ｂ２Ｍ及びペプチドと融合されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＨＬＡ－Ａ２）の一本鎖はＨＬＡ ＫＯ細胞において過剰発現され、ＨＬＡ－Ａ２及びＢ２Ｍの高レベルの表面発現が観察された（例えば、図２Ｇを参照のこと）。
本出願人は、ＨＬＡ ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｐＭＨＣの一本鎖三量体、変異ＶＳＶ－Ｇ、及びＮＣ－ＧＦＰを含むウイルスＧａｇタンパク質を共発現させることにより、表面上にｐＭＨＣを提示するようにＧＦＰ融合レポーターウイルスを操作した。ウイルスを収集し、同族ｐＭＨＣ抗原を標的化するＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともにインキュベートした。これらのモジュラー成分を使用して、ヒトに最も多く見られるＨＬＡ対立遺伝子であるＨＬＡ－Ａ２上に９マーのペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）として十分に確立されたがん精巣抗原であるＮＹ－ＥＳＯ－１を提示するウイルスを成功裏に産生した（Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（図２Ａを参照のこと）。既知のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エピトープに特異的なＴ細胞の１．２６％と比較して、同族ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現Ｔ細胞の８８．２％がＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を有するＧＦＰウイルスによって標識された（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，２０２１）。同様に、異なるＨＬＡ対立遺伝子ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１上に１１マー（ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ）ペプチドとしてＣＭＶ抗原を提示するウイルスは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞ではなく、ＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔ細胞に特異的に侵入した（図２Ａを参照のこと）。本出願人はさらに、すべてＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子上に提示される、がん精巣抗原、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原（ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５）、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原（ｐｐ６５４９５～５０３）、及びインフルエンザマトリクスタンパク質抗原（ｍ１５８～６６）由来の多様な９マー抗原エピトープを提示するウイルスを操作した（Ｇｏｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｗｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。結果は、同族ＨＬＡ－Ａ２ペプチドを提示するＧＦＰ融合ウイルスとともに２時間インキュベートした後、ＴＣＲマッチングＴ細胞の８７％以上がＧＦＰ＋であったのに対し、これらのＴ細胞の１％のみが陰性対照抗原提示ＧＦＰウイルスによって標識されたことを示した（例えば、図２Ｂを参照のこと）。ｐＭＨＣ提示ウイルスがＴＣＲマッチングＴ細胞に非常に特異的に侵入することが異なる抗原ペプチドの長さ及び異なるＨＬＡ対立遺伝子を有するもので観察され、これは、多様なｐＭＨＣ抗原を提示するためのＥＮＴＥＲプラットフォームの汎用性を強調している。
ｐＭＨＣ提示ウイルスの特異性をさらに試験するために、ＣＭＶ ｐｐ６５４９５～５０３抗原特異的ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をｐｐ６５４９５～５０３提示ウイルスとともに最初にインキュベートし、次いで、広く使用されている市販のｐｐ６５４９５～５０３テトラマーで染色した。陰性対照として、これらのＴ細胞をインフルエンザｍ１５８～６６提示ウイルス及び市販のｍ１５８～６６テトラマーとともにインキュベートした（図２Ｈを参照のこと）。フローサイトメトリーの結果は、テトラマー陽性細胞の９０％以上がＧＦＰ＋であったことを示し、これは、ｐｐ６５４９５～５０３テトラマー染色がｐｐ６５４９５～５０３提示ＧＦＰウイルスの結合と強く一致していることを示している。陰性対照インフルエンザｍ１５８～６６テトラマー及びウイルスは、ｐｐ６５４９５～５０３ＴＣＲ Ｔ細胞を標識しなかった（例えば、図２Ｈを参照のこと）。さらに、ｐｐ６５４９５～５０３テトラマーの強度及びＣＤ３表面発現がｐｐ６５４９５～５０３提示ウイルスとの共インキュベーション後に大幅に減少することが観察され（例えば、図２１を参照のこと）、これは、ＣＤ１９－ＣＡＲ提示ウイルスの結合後にＲａｊｉ Ｂ細胞上のＣＤ１９の表面発現が減少した観察と同様である。この結果により、ｐＭＨＣ提示ウイルスがＴＣＲ－ＣＤ３複合体に特異的に結合してこれをマスクし、ｐＭＨＣテトラマー及び抗ＣＤ３抗体のその後の結合を妨げることが示された。
ｐＭＨＣテトラマーを参照として使用してｐＭＨＣ提示ウイルスの特異性を決定した後、本出願人は、試薬あたりのモル基準でのｐＭＨＣ提示ウイルスとｐＭＨＣテトラマーとの間の感度を比較した（例えば、実施例１１の一般的な方法を参照のこと）。結果は、２×１０８個のＥＮＴＥＲウイルス粒子が９５．７％のＴＣＲ－Ｔ細胞を染色することができるが、２×１０８個のｐＭＨＣテトラマーはＴＣＲ－Ｔ細胞を検出することができないことを示した（例えば、図２Ｃを参照のこと）。重要なことに、２×１０８個のＥＮＴＥＲウイルスの結合効率は８×１０９個のｐＭＨＣテトラマーと同様であり、これは、ＥＮＴＥＲウイルスがｐＭＨＣテトラマーよりも感度が高い（約４０倍）ことを示唆している。
ｐＭＨＣに対するＴＣＲ親和性がＴＣＲ発現Ｔ細胞へのｐＭＨＣ提示ウイルスの結合に影響を与えるかどうかをさらに決定するために、異なる既知のＴＣＲ親和性（Ｋｄが７～８５μＭの範囲である）を有するＮＹ－ＥＳＯ－１抗原変異体（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２１）を認識するＴＣＲ－Ｔ細胞株（１Ｇ４ｗｔ）を生成した。以前の実験で利用したＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞株（例えば、図２Ａ～２Ｃを参照のこと）は、ＴＣＲ上のいくつかの変異を除いて１Ｇ４ｗｔ ＴＣＲ Ｔ細胞株と非常に類似しており、ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５抗原に対する非常に高い結合親和性を有する（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。次いで、野生型ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）、Ｌ３Ａ変異体（ＳＬＡＭＷＩＴＱＣ）、及びＴ７Ａ変異体（ＳＬＬＭＷＩＡＱＣ）などの異なるｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５抗原ペプチド変異体を提示するようにＥＮＴＥＲを操作した。次いで、ウイルスの力価（ウイルスのｐ２４タンパク質レベルで示される）を正規化した後に、異なるＴＣＲ－Ｔ細胞を抗原変異体提示ウイルスとともにインキュベートした後、ＧＦＰ＋細胞の割合を測定した。結果は、ＥＮＴＥＲが、高力価のウイルス（４０ｎｇのｐ２４）を添加したときに１０．８ｕＭという低いＴＣＲ親和性を検出する感度を有することを示した。８４．９ｕＭなどの非常に低いＴＣＲ親和性では、高力価下でのＥＮＴＥＲによってオンターゲット細胞の２５％を依然として検出することができ（図２Ｄを参照のこと）、これは、ＥＮＴＥＲが認識することができるＴＣＲ親和性が広範囲であることを強調している。ＴＣＲ結合親和性は、ＥＮＴＥＲ認識効率と正の相関関係にあることが観察されており、これは、ＥＮＴＥＲを適用して、ｐＭＨＣ提示ウイルスの結合効率を測定することによって相対的なＴＣＲ親和性を推測し得ることを示唆している（例えば、図２Ｄを参照のこと）。
さらに、ｐＭＨＣウイルス提示プラットフォームの特異性及び感度を決定するために、本出願人は、オンターゲットＴ細胞（ｍ１５８～６６抗原を認識するＴＣＲ）とオフターゲットＴ細胞（ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５抗原を認識するＴＣＲ）とを異なる比率で混合し、次いで、ｍ１５８～６６抗原提示ＧＦＰウイルスとともにインキュベートした（例えば、図２Ｅ、２Ｊを参照のこと）。これら２つの異なるＴＣＲ Ｔ細胞株を区別するために、ｆｌｕ－Ｍ１ ＴＣＲ Ｔ細胞をｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ染料によって標識した。オンターゲットＧＦＰ＋細胞の存在比率及びオフターゲットＧＦＰ＋細胞の存在比率に基づいてシグナル／ノイズ比を計算した。標的Ｔ細胞の存在比率が１０００分の１という低い場合でも、シグナル／ノイズ比は１５０倍超であり、これは、ＥＮＴＥＲウイルス提示プラットフォームの特異性及び感度が高いことを示している（図２Ｆ、２Ｊ、及び２Ｋを参照のこと）。
纏めると、上記実験データにより、ＥＮＴＥＲがｐＭＨＣとＴＣＲとの間の相互作用を特異的かつ高感度で捕捉することが示される。
実施例３
本実施例では、Ｂ細胞抗原を提示するＥＮＴＥＲウイルスによるＢ細胞特異性の例示的な解明を示すために行った実験の結果について記載する。
Ｂ細胞は、侵入するウイルス由来の外来抗原及び自己抗原を特異的に標的化することができる非常に多様なＢＣＲを有する。ウイルス抗原特異的Ｂ細胞は、ウイルス感染を防ぐのに有益である抗体（ＢＣＲから分泌）を産生することができる。対照的に、自己抗原特異的Ｂ細胞は、自分自身を攻撃する有害な自己抗体を生成し、これは自己免疫障害の原因となる（Ｂｕｒｂｅｌｏ ｅ ｔａｌ．，２０２１；Ｔａｎ，１９８９）。したがって、Ｂ細胞の特異性を解明ことが重要であり、これにより、非常に有効な抗ウイルス抗体の開発が促進され、ワクチンが合理的な設計が推進され、自己反応性Ｂ細胞の形成についてより理解が深まる（Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。Ｔ細胞特異性の解明におけるＥＮＴＥＲの適用の成功に基づいて、本実施例では、ＢＣＲと抗原との間の相互作用を捕捉する実現可能性を調べるために行った実験の結果について記載する。
細胞表面上のＭＨＣによって提示される抗原ペプチドのＴＣＲ認識とは異なり、ＢＣＲは、細胞表面タンパク質に由来する抗原エピトープだけでなく、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、及び分泌タンパク質に由来する抗原エピトープも認識することができる。Ｂ細胞特異性を解明するためのＥＮＴＥＲの主な課題は、ウイルス表面上に天然の膜貫通（ＴＭ）ドメインを含まないＢ細胞抗原を提示することである。細胞内タンパク質由来の抗原エピトープをウイルス表面上に提示するために、本出願人は、Ｂ細胞抗原の最適な表面提示のためにＴＭドメインを操作することを試みた。ウイルス表面提示のためのＴＭドメイン候補を選択するために、本出願人は、ウイルス出芽中にウイルス表面に宿主タンパク質を組み込むＨＩＶ－１ウイルスの特有の能力を利用した。発生期のＨＩＶ－１ウイルスは、ウイルスの組み立て及び出芽プロセス中に、他の豊富に存在する宿主表面タンパク質を排除しながら特定の宿主ＴＭタンパク質を選択的に組み込むことができる（Ｂｕｒｎｉｅ ａｎｄ Ｇｕｚｚｏ， ２０１９）。本出願人は、ウイルスの質量分析、免疫捕捉アッセイ、及びフローヴィロメトリー（ｆｌｏｗ ｖｉｒｏｍｅｔｒｙ）法を用いた過去の文献から、ウイルス表面に組み込まれる非常に豊富に存在する宿主ＴＭタンパク質のリストを優先順位付けした（Ｂｕｒｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０２０； Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｃｈｅｒｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｇｒｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｊａｌａｇｕｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。この宿主ＴＭタンパク質のリストには、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－Ａ２）、接着分子（ＩＣＡＭ１、ＣＤ４３、ＣＤ１６２、ＣＤ６２Ｌ）、及びインテグリンファミリーメンバー（ＣＤ４９ｄ、ＬＦＡ－１）が含まれていた（例えば、図３Ａを参照のこと）。
これらの多様なＴＭドメインを伴うＢ細胞エピトープのウイルス提示の特異性及び効率を決定するために、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）マイナーカプシド抗原Ｌ２（ＨＰＶ１６ Ｌ２残基１７～３６）に由来するＢ細胞抗原エピトープを発現するようにウイルスを操作し、優先順位付けしたリストのＴＭドメインと融合した。次に、ＨＰＶ１６ Ｌ２Ｂ細胞エピトープを特異的に標的化するＢＣＲ発現Ｂ細胞株を生成した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＴＭドメインが融合され、かつ、Ｂ細胞エピトープを提示するウイルスをＨＰＶ－ＢＣＲを発現しているＢ細胞（オンターゲット）又はＢＣＲを発現していないＢ細胞（オフターゲット）とともにインキュベートした後、ＧＦＰ＋Ｂ細胞の割合を定量化して効率及び特異性を測定した（図３Ｂを参照のこと）。宿主タンパク質由来のＴＭドメインに加えて、Ｂ細胞エピトープと、出芽ウイルスにおいて組み立てることができるウイルスエンベロープタンパク質であるフソゲンＶＳＶ－Ｇ由来のＴＭドメインとを融合するようにウイルスをさらに操作した。結果により、ＩＣＡＭ１ ＴＭドメインが最も有力な候補であることが明らかになったが、それは、ＨＰＶ抗原特異的ＢＣＲ＋Ｂ細胞の９０％超がＧＦＰ＋であったためである（例えば、図３Ｂ～３Ｃを参照のこと）。これは、ＩＣＡＭ１が出芽ウイルスにおいてウイルスマトリクスタンパク質との相互作用により選択的に取得されることを示す以前の報告と一致している（Ｊａｌａｇｕｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
ＩＣＡＭ１ ＴＭドメインが、ＨＰＶ１６由来の線状エピトープに加えて他のＢ細胞抗原を提示するために適用することができるかどうかを試験するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質由来の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を提示するようにウイルスを操作した（図３Ｄを参照のこと）。結果は、スパイクＲＢＤ ＢＣＲ＋Ｂ細胞の８８％がＲＢＤ提示ウイルスによって標識されたことを示し、これは、最適化されたＴＭドメインを有するＥＮＴＥＲが、線状エピトープ（ＨＰＶ１６ Ｌ２１７～３６抗原）及び完全な抗原ドメイン（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ）の両方に対するＢ細胞特異性を解明するために適用することができることを示している。
細胞内及び細胞外Ｂ細胞抗原を提示するＥＮＴＥＲの能力の域を超えて、ＥＮＴＥＲが細胞表面Ｂ細胞抗原に対するＢ細胞特異性を解明することができるかどうかを決定するための追加実験を行った。天然のＴＭドメインを使用してＨＥＲ２を提示するようにＥＮＴＥＲを操作した。ＨＥＲ２は、乳がん細胞において過剰発現している上皮成長因子受容体である（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｆｆ，２０１１）。実験データにより、抗ＨＥＲ２ ＢＣＲ Ｂ細胞の７６％がＨＥＲ２提示ウイルスによって検出されたことが示され（図３Ｇ～３Ｈを参照のこと）、これは、ＥＮＴＥＲが細胞内タンパク質（ＨＰＶ Ｌ２）、細胞外タンパク質（スパイクＲＢＤ）、及び細胞表面タンパク質（ＨＥＲ２）由来の任意のＢ細胞抗原を提示することの汎用性を強調している。
加えて、ＥＮＴＥＲの特異性及び感度をさらに調べてＢＣＲとＢ細胞抗原との間の相互作用を解読するために、オンターゲットＢ細胞（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ抗原を認識するＢＣＲを有する）及びオフターゲットＢ細胞（ＨＰＶ Ｌ２抗原を認識するＢＣＲを有する）を異なる比率で混合し、スパイクＲＢＤ抗原提示ウイルスとともにインキュベートした（図３Ｅ及び３Ｉを参照のこと）。これらのオンターゲットＢ細胞とオフターゲットＢ細胞とを区別するために、オンターゲットＢ細胞をｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ染料で染色した。オンターゲットＧＦＰ＋細胞の存在比率及びオフターゲットＧＦＰ＋細胞の存在比率に基づいてシグナル／ノイズ比を計算した。シグナル／ノイズ比は約１００～２００倍であり（例えば、図３Ｆを参照のこと）、これは、Ｂ細胞抗原エピトープを提示するＴＭドメイン最適化ウイルスの大きな特異性及び感度を示している（例えば、図３Ｊ～３Ｋを参照のこと）。
纏めると、上記の実験データは、ＥＮＴＥＲがＢＣＲと抗原の相互作用を非常に特異的かつ高感度に成功裏に捕捉することができるプラットフォームであることを示している。
実施例４
本実施例では、ＥＮＴＥＲが標的カーゴ送達によって抗原特異的Ｔ細胞又は抗原特異的Ｂ細胞を除去又は増殖することができるかを調べるために行った実験について記載する。
まず、カーゴ送達の抗原特異性を試験するために、ＧＦＰトランス遺伝子をカーゴとして使用して送達効率及び特異性を測定した。野生型ＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化されたレンチウイルスを感染させたとき、ＴＣＲ又はＢＣＲの特異性に関わらず、同等の形質導入効率が観察された（例えば、図３Ｌを参照のこと）。次いで、ｐｐ６５４９５～５０３ｐＭＨＣリガンド、及びウイルスＲＮＡ上にＧＦＰ導入遺伝子を有するＶＳＶ－Ｇ変異体フソゲン、並びに野生型インテグラーゼを含む他のウイルス成分を提示するウイルスを操作する追加実験を行った（例えば、実施例１１の一般的な方法を参照のこと）。ｐｐ６５４９５～５０３ｐＭＨＣウイルスをｐｐ６５４９５～５０３を標的化するＣＭＶ ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞及び関連のない抗原を標的化するＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞に感染させた後、オンターゲットＴＣＲ－Ｔ細胞の８２％がＧＦＰを発現したのに対し、オフターゲットＴＣＲ－Ｔ細胞のわずか０．２２％がＧＦＰ＋であったことが観察された（例えば、図４Ａ～４Ｂを参照のこと）。同様に、追加実験を行い、Ｂ細胞抗原ＨＥＲ２を提示し、かつ、ＧＦＰトランス遺伝子をカーゴとして有するウイルスを操作した（例えば、図４Ｃを参照のこと）。実験データにより、ＨＥＲ２ ＢＣＲ＋Ｂ細胞ではＧＦＰ導入遺伝子の特異的な送達が示されたが、ＲＢＤ ＢＣＲ＋Ｂ細胞では示されなかった（例えば、図４Ｄを参照のこと）。
次に、ＥＮＴＥＲ媒介標的遺伝子送達が抗原特異的Ｔ細胞又はＢ細胞において正確な機能を発揮することができるかを調べるために、ガンシクロビル（ＧＣＶ）薬に反応する十分に確立された自殺遺伝子である単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子を有するようにｐＭＨＣ提示ウイルスを操作する追加実験を行った（Ｂｅｌｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞をｍＳｃａｒｌｅｔを発現するＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞と１：１の比率で混合し、次いで、自殺遺伝子を有するｐｐ６５４９５～５０３提示ウイルスを添加した。感染から３日後に、ＧＣＶ薬を添加してＨＳＶ－ＴＫを発現する細胞を死滅させ、細胞の生存を４日間モニタリングした（図４Ｅを参照のこと）。ウイルス感染後、混合Ｔ細胞プールのうちのオンターゲットＴ細胞において特異的なカーゴ送達が観察された（例えば、図３Ｍを参照のこと）。ＧＣＶ処理の４日後、オフターゲットＴ細胞に影響を与えることなく、オンターゲットＴ細胞（ＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋）が特異的に減少することが観察された（例えば、図４Ｆを参照のこと）。標的化された死滅がウイルス感染によって誘導されないかどうかを決定するために、陰性対照としてＧＦＰ遺伝子を有するウイルスを生成した。ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子送達は、ＧＦＰ遺伝子送達と比較して、オンターゲットＴ細胞の約８倍の大幅な減少をもたらすことが見出され（図４Ｇを参照のこと）、これにより、抗原特異的自殺遺伝子の送達によって１種のＴ細胞クローンの選択的な枯渇が達成されることがさらに立証された。抗原特異的遺伝子送達がＢ細胞に適用できるかどうかを試験するために、ＨＥＲ２ ＢＣＲ＋Ｂ細胞をｍＳｃａｒｌｅｔを発現するＲＢＤ ＢＣＲ＋Ｂ細胞と混合し、続いて自殺遺伝子を有するＨＥＲ２提示ウイルスを添加した（図４Ｈ及び３Ｎを参照のこと）。同様に、ＧＣＶ薬での処理後、結果は、対照ＧＦＰ遺伝子と比較して、自殺遺伝子送達によってオンターゲットＢ細胞の大幅な減少を示し（図４Ｉ～４Ｊを参照のこと）、これは、ＥＮＴＥＲが抗原特異的自殺遺伝子の送達によってＢ細胞プールのうちの１種のＢ細胞クローンを選択的に枯渇させることを可能にすることを示唆している。
対照的に、ＥＮＴＥＲが抗原特異的Ｔ細胞の選択的な生存及び保持を可能にするかどうかを調べるための追加実験も行った。これらの実験の目的は、抗原特異的Ｔ細胞における細胞死受容体ＦＡＳに対してショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を送達し、ＦＡＳ誘導性プログラム細胞死を防ぐことであった（Ｙｏｎｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ＦＡＳを標的化する複数のｓｈＲＮＡをスクリーニングした後、対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｔｒｌ）群と比較して劇的に減少したＦＡＳの表面発現によって反映されるノックダウン効率が最も高かったｓｈＦＡＳ＃２を選択した（図３０を参照のこと）。さらに、ｐｐ６５４９５～５０３提示ｓｈＦＡＳ＃２又はｓｈＣｔｒｌを生成し、オンターゲット（ＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋）及びオフターゲット（ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋）Ｔ細胞の混合プールにこれらのウイルスを感染させた（図４Ｋを参照のこと）。結果は、ｓｈＣｔｒｌ群又はオフターゲット非感染Ｔ細胞と比較して、ｓｈＦＡＳ＃２が感染したオンターゲットＴ細胞におけるＦＡＳタンパク質表面発現の大幅な減少を示し、これは、標的化されたｓｈＲＮＡ送達を示している（図４Ｌを参照のこと）。次に、これらの細胞を抗ＦＡＳ抗体で処理して、アネキシンＶ及び７－ＡＡＤ染色によって明らかとなるＦＡＳ媒介細胞死を誘発した（例えば、図４Ｋ及び３Ｐを参照のこと）。オンターゲット集団対オフターゲット集団の正規化後、ＦＡＳノックダウン後の生存細胞のうち、ｓｈＣｔｒｌ群と比較してオンターゲットＴ細胞の有意な増加が観察された（例えば、図４Ｍを参照のこと）。纏めると、本明細書に記載したデータは、ＥＮＴＥＲが標的化カーゴの送達によってリガンド－受容体特異性を有する複雑な細胞集団を操作することを可能にすることを示している。
実施例５
本実施例は、ウイルス提示プラットフォームであるＥＮＴＥＲを液滴ベースのシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑと組み合わせて、シングルセルの分解能でリガンド－受容体相互作用及び分子設計図を捕捉する技術であるＥＮＴＥＲ－ｓｅｑを開発した実験の結果について記載する。したがって、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、ＭＨＣペプチド抗原特異性、ＴＣＲレパートリー、及び遺伝子発現プロファイルをシングルセルの分解能で捕捉する。いくつかの実施形態では、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑのワークフローは、（１）プールされたｐＭＨＣ提示ＧＦＰウイルスの生成、（２）これらのウイルスをヒトＴ細胞とともにインキュベートすること、（３）液滴ベースのシングルセルプロファイリングのためのウイルス標識ＧＦＰ＋細胞の選別（例えば、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓによる５プライムシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ／Ｖ（Ｄ）Ｊ－ｓｅｑ）、（４）遺伝子発現、Ｖ（Ｄ）Ｊ ＴＣＲレパートリー、及び抗原ペプチド配列を含む３つのシングルセルライブラリの生成及びシーケンシング（例えば、図５Ａを参照のこと）を含む。
一本鎖ＰＭＨＣ情報は、レンチウイルス粒子にパッケージ化されたウイルス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に保存される。ウイルスのｓｓＲＮＡは約４．６ｋｂであり、これにより液滴中で完全長ｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ）することが困難となる。各液滴のＲＴステップ中にウイルスＲＮＡ上のｐＭＨＣ情報を効率的に捕捉するために、Ｂ２ＭとＭＨＣとの間のリンカー領域に捕捉タグを挿入し、ＣＭＶプロモーターの隣に別のＰＣＲハンドルを挿入した（例えば、図５Ｂを参照のこと）。この捕捉タグは、ビーズ上で結合されたテンプレートスイッチオリゴ（ＴＳＯ）配列とハイブリダイズすることにより、市販の５’ＧＥＭビーズによる捕捉を可能にする。ＰＣＲハンドルは、ｃＤＮＡ増幅ステップ中に追加のプライマーのスパイキングなしに、標的化ペプチド配列を好都合に増幅することを可能とする（図５Ｂを参照のこと）。さらに、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ及びインデックスＰＣＲによって抗原ペプチド配列の標的化濃縮が可能となり、ディープシーケンシングのための最終的な抗原ライブラリが生成される。捕捉タグ及びＰＣＲハンドルの挿入は、ウイルス上のｐＭＨＣの提示及びＴＣＲ発現Ｔ細胞との特異的相互作用に影響を与えない（例えば、図４Ｎ～４Ｏを参照のこと）。
抗原特異性及びＴＣＲレパートリーのシングルセルプロファイリングについてＥＮＴＥＲ－ｓｅｑを評価するために、プールされたｐＭＨＣ提示ウイルスと混合されたＴＣＲ発現Ｔ細胞に対してＥＮＴＥＲ－ｓｅｑを行った。実際のＴ細胞集団を模倣するために、Ｔ細胞の１０％をｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５抗原を認識するＴＣＲ及びＣＭＶ ｐｐ６５４９５～５０３抗原を認識するＴＣＲを有するＴ細胞の９０％と混合し、次いで、ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５抗原又はｐｐ６５４９５～５０３抗原を提示するプールされたウイルスとともにインキュベートした（例えば、図５Ｃを参照のこと）。ダブレットを除外した後の特有のＴＣＲ配列の分析により、９．４％（ｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５－ＴＣＲ＋）対９０．６％（ＣＭＶ ｐｐ６５４９５～５０３－ＴＣＲ＋）のＴ細胞混合比が確認され、これは、インプットの混合比（１０％対９０％）と同様である（図５Ｄを参照のこと）。ＴＣＲ及び抗原ペプチドの分子バーコード（ＵＭＩ）のカウントを除外した後（方法）、信頼性の高い抗原ペプチド情報及びＴＣＲ配列を有する合計４１９８個のＴ細胞がさらに回収された。全ペプチドのうちの優勢な抗原ペプチドのＵＭＩの比率を計算した。抗原ペプチドと対形成されたＴＣＲとの高い一致が観察された（例えば、図５Ｅを参照のこと）。シングルセルレベルでＴＣＲ配列を抗原ペプチドにマッチングさせた結果、ｐｐ６５４９５～５０３＋細胞の９９．８％及びｎｙ－ｅｓｏ－１１５７～１６５＋細胞の９７．４％がそれぞれ対応するＴＣＲ配列とマッチングしたことが示された（例えば、図５Ｆを参照のこと）。
したがって、上記の実験データは、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑがＴＣＲレパートリー及び同族ＨＬＡ抗原ペプチドの相互作用をシングルセル分解能で高感度かつ堅牢に捕捉することができることを示している。
実施例６
本実施例は、最適化されたＥＮＴＥＲ－ｓｅｑが希少な抗原特異的初代ヒトＴ細胞を検出することを示すために行った実験の結果について記載する。特に、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、ヒト血液から直接単離された希少な抗原特異的初代Ｔ細胞に適用することができる。
ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子上に提示されるＣＭＶ－ｐｐ６５抗原エピトープを提示するＧＦＰウイルス及びＣＭＶ感染歴のあるＨＬＡ－Ａ２＋患者由来の初代Ｔ細胞を使用して、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑシステムの感度を最初に検証した。初代Ｔ細胞をｐｐ６５４９５～５０３抗原提示ウイルスとともにインキュベートし、次いで、陽性対照として機能する広く使用されているＣＭＶ ｐｐ６５４９５～５０３テトラマーで染色した。テトラマー染色分析により、Ｔ細胞の１％がｐｐ６５４９５～５０３抗原特異的であることが示された（図４Ｑを参照のこと）。ｐｐ６５４９５～５０３テトラマー陽性Ｔ細胞の８３％がＧＦＰウイルスによって標識された。フローサイトメトリーによる検出感度をさらに高めるために、ＧＦＰをＧＦＰよりも大幅に明るい単量体緑色蛍光タンパク質であるｍＮｅｏｎに置き換えた（図４Ｐ～４Ｑを参照のこと）。実際、ｐｐ６５４９５～５０３テトラマー陽性Ｔ細胞の９８％がｐｐ６５４９５～５０３エピトープを提示するｍＮｅｏｎウイルスによって回収されたが、陰性対照ウイルスによっては回収されず、これは、ＧＦＰウイルスよりも有意に高い効率を示している（例えば、図４Ｑ～４Ｓを参照のこと）。
実施例７
本実施例は、ペプチド濃縮ＣＭＶ特異的Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑがドナー特異的免疫原性ＣＭＶエピトープ及び抗原特異的分子表現型を明らかにできることを示すために行った実験の結果について記載する。
抗ウイルスＴ細胞は、ウイルスの複製及び拡散を制御するために不可欠である。インビトロで増殖させたＣＭＶ特異的Ｔ細胞の養子移植では、移植を受ける患者でのＣＭＶ感染を制御することの大きな有効性が示されている。しかしながら、ＣＭＶペプチドによって誘導されるインビトロ抗原特異的増殖がＣＭＶ特異的Ｔ細胞の分子表現型、クローン増殖、及び潜在的機能にどのように影響するかについてはほとんど研究されていない。
これらの実験では、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑを使用して、ＣＭＶ抗原ペプチド刺激によって増殖したＣＭＶ特異的Ｔ細胞の転写プログラム、抗原特異性、及びＴＣＲクローン性の特性評価を行った。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を濃縮及び増殖させるために、最初に、ＣＭＶ血清陽性ドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１２個のＣＭＶ抗原ペプチドのプールとともに１０日間培養した（Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｌｉｉｂｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｓｏｌａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）（例えば、図４Ｔを参照のこと）。ペプチドは自己抗原提示細胞によって処理及び提示され、次いでその後の増殖のためにＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞を刺激した。本開示のＥＮＴＥＲウイルスのペプチド濃縮Ｔ細胞に対する特異性を試験するために、ペプチドｐｐ６５４９５～５０３を使用してＴ細胞を増殖させ、次いでｐｐ６５４９５～５０３抗原提示ｍＮｅｏｎウイルスとともにインキュベートし、続いてｐｐ６５４９５～５０３テトラマーで染色した。フローサイトメトリー分析により、テトラマー＋Ｔ細胞の約９９％がウイルスによって標識されたことが示され（例えば、図４Ｕを参照のこと）、これは、ペプチド濃縮抗原特異的Ｔ細胞を検出するためのＥＮＴＥＲの高い特異性及び感度を示している。
これら１２種のＣＭＶ抗原エピトープを提示するＥＮＴＥＲウイルスのプールを調製し、４人の異なるＣＭＶ血清陽性ＨＬＡ－Ａ２陽性ドナー由来の増殖したＴ細胞とともにインキュベートした（図Ｓ４Ｇを参照のこと）。４人のドナーのうち２人（ドナー＃１で１９．４％、ドナー＃２で８．７８％）においてＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞の劇的な増殖が観察された（例えば、図４Ｖを参照のこと）。次に、これら２人のドナーから得た増殖したＴ細胞に対してＥＮＴＥＲ－ｓｅｑを行い、各ドナー試料を特有のハッシュタグ抗体で標識した。抗原特異的Ｔ細胞の表現型をさらに調べるために、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、及びＩＬ７Ｒを標的化するＤＮＡバーコード化抗体で細胞を染色することにより、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑをＣｆＴＥ－ｓｅｑと組み合わせた（例えば、図６Ａを参照のこと）。
ＧＦＰ＋（ＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞）及びＧＦＰ－（バイスタンダーＴ細胞）ＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、続いて液滴ベースのシングルセル捕捉を行った後、個々の細胞における遺伝子発現プログラム、ＣＭＶ抗原ペプチド、ＴＣＲレパートリー、及び表面タンパク質（ＣＩＴＥ－ｓｅｑタンパク質及びハッシュタグタンパク質を含む）をプロファイルするためのライブラリを生成した。結果は、ＣＭＶ抗原提示ウイルスと結合した細胞（ＥＮＴＥＲ＋）はウイルスが結合していない細胞（ＥＮＴＥＲ－）とは表現型が異なることを示した（例えば、図６Ｂを参照のこと）。このような表現型の違いがＥＮＴＥＲウイルスの結合によって誘導されるかどうかを試験するために、ＣＭＶ ｐｐ６５ＴＣＲ－Ｔ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータをｐｐ６５４９５～５０３提示ＥＮＴＥＲウイルス又はｐｐ６５４９５～５０３テトラマーのインキュベーションと比較した。要約すると、ＥＮＴＥＲ群とテトラマー群との間で発現が異なる２８個の遺伝子が同定された（２倍変化及び調整Ｐ値＜０．０１）（図４Ｗを参照のこと）。注目すべきことに、２８個の遺伝子のすべてがＥＮＴＥＲウイルス処理細胞において有意に上方制御され、主にＴＣＲ活性化（ＣＤ６９）及びＴＣＲシグナル伝達によって誘導される転写因子（ＦＯＳ、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ３、ＥＧＲ１など）に関連していた（例えば、図４Ｗを参照のこと）。この結果により、ｐＭＨＣ提示ウイルスの結合は、テトラマーの結合と比較して休止／ナイーブＣＭＶ ｐｐ６５ＴＣＲ－Ｔ細胞のＴＣＲ活性化を弱く誘導し得ることが示唆された。このＥＮＴＥＲ誘導による遺伝子上方制御がＣＭＶ特異的Ｔ細胞とバイスタンダーＴ細胞との間の表現型の違いをもたらすかどうかをさらに決定するために、ＥＮＴＥＲ誘導遺伝子シグネチャの有無によるライデンクラスタリングを行った（例えば、実施例１１の一般的な方法を参照のこと）。これらの２８個の遺伝子を除去した後のＣＭＶ特異的Ｔ細胞とバイスタンダーＴ細胞との間に明確な区別が見出され、これは、表現型の違いがＥＮＴＥＲウイルスの結合によって生じたのではないことを示唆している（図５Ｇを参照のこと）。
表面タンパク質ランドスケープ及び遺伝子発現を統合した後、ペプチド濃縮ＣＭＶ特異的Ｔ細胞（ＥＮＴＥＲ＋）が主にエフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ－）であったのに対し、ＥＮＴＥＲ－細胞がナイーブＴ細胞とセントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞との混合物であることが観察された（例えば、図６Ｃ及び５Ｈ～５Ｉを参照のこと）。ＥＮＴＥＲ－細胞と比較して、ＥＮＴＥＲ＋細胞は、ＩＦＮＧ、ＴＮＦ、並びにグランザイム及びパーフォリンを含む細胞傷害性分子などのエフェクター分子の高発現に基づいて潜在的に保護的なＴ細胞であった（例えば、図５Ｊを参照のこと）。シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑデータにより、すべてのＴ細胞は以下を含む１０個のクラスターにクラスター化された：（１）ナイーブＴ細胞：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、（２）ＴＣＭ：ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋、（３）最終分化エフェクターＴ細胞（ＴＥＭＲＡ）：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－、（４）粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）：ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ１６１＋ＣＸＣＲ６＋、（５）増殖性Ｔ細胞：ＣＤ４５ＲＡ＋ＫＩ６７＋、（６）ＩＬ４＋ＴＥＭ：ＣＤ４５ＲＯ＋ＩＬ４＋、（７）ＫＬＲＣ２＋ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＫＬＲＣ２＋、（８）ＣＳＴ７＋ＴＥＭ（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＳＴ７＋、（９）：ＨＳＰ＋ＴＥＭ：ＣＤ４５ＲＯ＋熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰＡ１Ａ）＋、（１０）：増殖ＴＥＭ：ＣＤ４５ＲＯ＋ＫＩ６７＋（例えば、図６Ｄ及び５Ｈ～５Ｌを参照のこと）。ドナー間のサブセット存在比率の比較により、ＥＮＴＥＲ－バイスタンダーＴ細胞は２人のドナー間で比較的類似しているのに対し、ＥＮＴＥＲ＋ＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞は２人のドナー間で表現型が異なっていることが示され、これは、２人のドナーがＣＭＶ抗原に対して異なる免疫応答を有し得ることを示唆している（例えば、図５Ｍ～５Ｎを参照のこと）。
ＣＭＶ抗原に対するドナー特異的免疫応答があるかどうかを決定するために、各ドナーの特定のＣＭＶ抗原エピトープを認識するＴ細胞の数を測定した。ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞は、両方のドナーにおいて最も優勢な抗原特異的Ｔ細胞であり、これは、ｐｐ６５４９５～５０３が最も一般的かつ免疫原性のＣＭＶ抗原であることを示唆している（例えば、図６Ｅを参照のこと）。これは、多くのドナーでＣＭＶ ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞が高い存在比率であることを示した以前の報告と一致している（Ｅｌｋｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。また、ドナー＃２では、ドナー＃１と比較してＵＳ８７４～８２及びＵＬ１００２００～２０８特異的Ｔ細胞の存在比率が高かったことが観察され、これはドナー特異的ウイルスエピトープ免疫原性を示している。興味深いことに、上位３つの抗原エピトープを遺伝子発現ＵＭＡＰプロットに反映したときに３つの異なるクラスターが観察され、これは、異なるエピトープが特有の遺伝子ＣＤ８＋Ｔ細胞の運命及び発現プログラムを駆動し得ることを示唆している（図６Ｆを参照のこと）。実際、ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞では、エフェクターサイトカイン（例えば、ＩＦＮＧ、ＦＡＳＬＧ、ＰＲＦ１など）及びエフェクターＴ細胞に不可欠な転写因子（例えば、ＺＥＢ２）の発現が高い（例えば、図６Ｇを参照のこと）。驚くべきことに、ＵＬ１００２００～２０８特異的Ｔ細胞では、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の特徴であるＦＯＸＰ３、ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）、及びＣＴＬＡ４の発現が高く（Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｃｈｕｒｌａｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）、これは、ＵＬ１００２００～２０８特異的Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞に似ていることを示している（例えば、図６Ｇを参照のこと）（Ｖｉｅｙｒａ－Ｌｏｂａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。したがって、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、ドナー特異的ウイルスエピトープを明らかにするだけでなく、同じウイルス由来の異なる抗原エピトープを認識する際の抗原特異的Ｔ細胞の別個の分子設計図も明らかにする。
実施例８
同じ抗原特異性の根底にあるクローン間表現型の多様性
本実施例は、同じ抗原特異性の根底にあるクローン間表現型の多様性を示すために行った実験の結果について記載する。ＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞のクローン増殖を調べるために、ＴＣＲレパートリー、抗原特異性、及びシングルセルレベルでの遺伝子発現の統合分析を行った。
これらの実験において、ＴＣＲクロノタイプはＣＤＲ３ヌクレオチド配列の同一性によって定義された（Ｙａｓｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ペプチド濃縮ＣＭＶ特異的Ｔ細胞（ＥＮＴＥＲ＋）は、バイスタンダーＴ細胞（ＥＮＴＥＲ－、ＴＣＲクローンあたり最大１７４個の細胞）と比較して、高いクローン増殖（ＴＣＲクローンあたり最大３８５６個の細胞）を示した（例えば、図６Ｊを参照のこと）。優勢なＴＣＲクロノタイプを参照として使用して、低い偽陰性率（ＦＮＲ＜３％）及び偽陽性率（ＦＰＲ＜１％）が計算及び観察され、これは、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑの初代Ｔ細胞に対する高い感度及び特異性を強調している（実施例１１の一般的な方法を参照のこと）。次に、２人のドナー間でＣＭＶ抗原特異的ＴＣＲクローンの重複があるかどうかを調べるために追加実験を行った。これらの実験の結果は、２人のドナーが重複のない特有の増殖されたＴＣＲクローンを有することを示し（例えば、図６Ｋを参照のこと）、これは、抗原特異的ＴＣＲクロノタイプは通常、ＴＣＲレパートリーの多様性が高いために、各個人に固有のものであることを示した以前の研究と一致している（Ｄｕｐｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｒｏｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。したがって、共有のＴＣＲの特異性はＴＣＲ配列のみからは予測することができず、ｐＭＨＣ結合データが必要であった。抗原特異性及びＴＣＲクローン増殖のさらなる統合分析により、異なるＣＭＶ抗原エピトープ特異的Ｔ細胞は異なる挙動のＴＣＲクローン増殖を示すことが示された（例えば、図６Ｈを参照のこと）。ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞のクローン増殖サイズは、ＵＬ１００２００～２０８特異的Ｔ細胞のクローン増殖サイズよりも有意に大きかった（例えば、図６Ｈを参照のこと）。例えば、ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞とＵＬ１００２００～２０８特異的Ｔ細胞とを比較して、ＴＣＲクローンの高い増殖は細胞傷害性遺伝子の高い発現と関連していた。実際、すべてのクロノタイプにおいて、細胞傷害性に関連する遺伝子の増殖はＴＣＲクローン増殖と有意に相関していた（ピアソン相関ｒ＝０．４８、ｐ＝０．０、図６Ｌ）。対照的に、クローン増殖と他の遺伝子シグネチャとの間の相関は比較的弱かった（Ｔ細胞疲弊遺伝子ではｒ＝０．１３、Ｔ細胞活性化遺伝子ではｒ＝０．０９）（例えば、図６Ｍを参照のこと）。
複数のＴＣＲヌクレオチド配列が同じ抗原エピトープを標的化する同じＣＤＲ３アミノ酸配列をコードできるため、次いで、各ＣＭＶ抗原エピトープに対する同一のＣＤＲ３アミノ酸配列に基づいてクロノタイプを統合した（図６Ｎ～６Ｏを参照のこと）。最も免疫原性の高いＣＭＶエピトープであるｐｐ６５４９５～５０３では、３つの優勢なＣＤＲ３クロノタイプが同定された。そのうち、２つのＴＣＲベータ鎖配列（ＣＡＳＳＦＱＧＹＴＥＡＦＦ；配列番号５４及びＣＡＳＳＹＱＴＧＡＳＹＧＹＴＦ；配列番号５５）はＩＥＤＢデータベースに公開されているｐｐ６５４９５～５０３特異的ＴＣＲと同一であり、これは本明細書に開示されたＥＮＴＥＲプラットフォームの特異性をさらに認証している（例えば、図６Ｏを参照のこと）。ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞におけるＣＤＲ３クロノタイプと遺伝子発現プロファイルとを組み合わせた場合、異なるクロノタイプが別個のサイトカインプロファイル、細胞溶解酵素、及び転写因子発現を含む別個の遺伝子発現表現型を示すことが発見され、これは、同じ抗原エピトープを標的化するクローン間表現型の多様性を示している（例えば、図６Ｉ及び６Ｐを参照のこと）。したがって、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑは、ＴＣＲ結合特異性及びＴＣＲ関連細胞状態の両方を機能的に特性評価することができる。
実施例９
本実施例では、患者由来の初代ＣＭＶ特異的Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑが細胞傷害性及びＩ型ＩＦＮ応答に関連する遺伝子のクローン内多様性を明らかにすることを示す実験の結果について記載する。
ＣＭＶ血清陽性患者における抗ウイルスＴ細胞のメモリーを解明するために、以前に同定された上位３つのＣＭＶ抗原エピトープを提示するようにＥＮＴＥＲウイルスを操作し、インビトロ増殖せずに患者の血液から直接単離した初代Ｔ細胞に対してＥＮＴＥＲ－ｓｅｑを行った（図７Ａを参照のこと）。ＣＩＴＥ－ｓｅｑ及び遺伝子発現プロファイルの統合分析により、患者のＣＭＶ特異的Ｔ細胞（ＥＮＴＥＲ＋）は主に最終分化エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－）であることが示された（例えば、図７Ｂ～７Ｃを参照のこと）。この観察結果は、ＣＭＶ血清陽性患者におけるＴＥＭＲＡ ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の蓄積を示した以前の研究（Ａｐｐａｙ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｅｒｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）と一致している。
サブセットクラスタリング後、細胞傷害機能、ケモカイン、共刺激／共阻害分子、及びＩ型ＩＦＮ応答に関連する遺伝子発現の多様なパターンを有するＣＭＶ特異的Ｔ細胞においてＴＥＭＲＡ集団の異質性が観察された（例えば、図７Ｄ及び７Ｌを参照のこと）。例えば、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞において、ＴＥＭＲＡ＃１クラスターは、ＩＦＮＧ、ＴＮＦ、及びＰＲＦ１などの細胞傷害性遺伝子の高い発現を含むがＧＺＭＫは含まず、ＴＥＭＲＡ ＃４クラスターは、ＩＦＮＧ－ＴＮＦ－ＰＲＦ１＋ＧＺＭＫ＋である（例えば、図７Ｃ及び７Ｌを参照のこと）。注目すべきことに、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞におけるＴＥＭＲＡ＃２クラスターは、すべての細胞傷害性遺伝子の低い発現を含むが、Ｉ型ＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）、例えばＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩＴ１、及びＯＡＳＬの高い発現を含む（例えば、図７Ｃ及び７Ｌを参照のこと）。ＩＳＧ遺伝子のこのような上方制御は、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の小さなサブセットにおけるＩ型ＩＦＮ応答の特異的誘導を反映しており、これはＣＭＶウイルスに応答するＩ型ＩＦＮの局所的産生又は患者における他の病原体由来のＩ型ＩＦＮのバイスタンダー産生によって刺激され得る。ＥＮＴＥＲウイルスの結合がＴ細胞の状態（Ｉ型ＩＦＮ応答など）に影響を与えるかどうかを試験するために、ＥＮＴＥＲ誘導遺伝子の有無によるライデンクラスタリングを比較したところ、非常に一致するクラスターが観察された。この結果は、ＥＮＴＥＲウイルスの結合が患者の血液から単離した初代Ｔ細胞のＴ細胞状態に最小限の影響しか与えないことを示唆している（図７Ｍを参照のこと）。
その後、患者におけるＣＭＶ特異的Ｔ細胞の抗原特異性、ＴＣＲレパートリー、及び遺伝子発現を統合した。予想通り、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞は、主に、広範囲のクローン増殖に関連するｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞であることが見出され、ｐｐ６５４９５～５０３が高い免疫原性のＣＭＶエピトープであることが確認された（例えば、図７Ｅ～７Ｆを参照のこと）。さらに、ＵＳ８７４～８２ｐＭＨＣ ＥＮＴＥＲウイルスによって標識された希少なＴ細胞集団（４３個）が観察された（図７Ｎを参照のこと）。ＴＣＲシーケンシングにより、休止状態のＵＳ８７４～８２特異的細胞の最大６０％がペプチド増殖ＵＳ８７４～８２特異的Ｔ細胞とＴＣＲを共有していることが明らかになり、それらのクローン同一性が確認された（例えば、図７Ｏを参照のこと）。興味深いことに、各ドナーにおける優勢なＴＣＲクローンを増殖に伴って追跡することにより、ドナー＃２は最も増殖したＴＣＲクローンを含むのに対し、ドナー＃１におけるＴＣＲクローンはほとんど増殖しないことが見出された（図７Ｐ～７Ｑを参照のこと）。これらの実験データは、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑが、増殖なしに、新鮮なＰＢＭＣ由来の非常に優勢なエピトープの存在下で複数の抗原特異性を検出することができることを示している。
ｐＭＨＣ提示ＥＮＴＥＲウイルスの結合の強さを測定するために、細胞あたりの結合したｐＭＨＣの数も定量化した。患者におけるＣＭＶ ｐｐ６５特異的Ｔ細胞のｐＭＨＣ結合の強さ及びＴＣＲクローン増殖を統合することにより、増殖度の低いＴ細胞よりも増殖度の高いＴ細胞クローン（クローンサイズ＞５０）においてｐＭＨＣの結合が有意に高いことが示された（例えば、図７Ｇを参照のこと）。ＥＮＴＥＲ ｐＭＨＣ結合はＴＣＲ親和性と正の相関関係にあるため（例えば、図２Ｆを参照のこと）、本明細書に記載された実験データにより、高いＴＣＲ親和性はより大きなＴ細胞クローンの増殖と関連し、それを駆動する可能性が高いことが示唆された。
ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞のうち、ペプチド濃縮ｐｐ６５特異的Ｔ細胞と同じＴＣＲ配列を有する３つの優勢なＴＣＲクローンが見出された。インビトロペプチド増殖Ｔ細胞と同様に、これらのｐｐ６５特異的ＴＣＲクローンは、同じ抗原エピトープを標的化するにもかかわらず、表現型の違いを示す（例えば、図７Ｒを参照のこと）。驚くべきことに、同じＴＣＲクローンにおいて表現型の異質性が観察された（例えば、図７Ｒ～７Ｓを参照のこと）。例えば、ＴＣＲクローン＃２は、Ｉ型ＩＦＮ ＩＳＧ＋ＴＥＭＲＡ、ストレスを受けた高ＩＦＮＧ・低ＦＡＳＬＧ ＴＥＭＲＡ、及び低ＩＦＮＧ・高ＦＡＳＬＧ ＴＥＭＲＡから構成される（例えば、図７Ｒ～７Ｓを参照のこと）。このデータにより、同じＴＣＲクローンの根底にあるクローン内表現型の多様性が明らかとなり、これは、Ｔ細胞の状態がＴＣＲ結合特異性及び局所微小環境の両方によって影響を受けることを示唆している。
実施例１０
本実施例は、エクスビボ抗原ペプチド誘導増殖の際のＣＭＶ特異的Ｔ細胞の表現型移行及びクローン多様性を示すために行った実験の結果について記載する。
抗原特異的増殖が抗ウイルスＴ細胞の分子表現型にどのように影響するかを理解するために、ペプチド誘導増殖前及び増殖後のＣＭＶ特異的Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑの比較を行った。抗原特異性、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ、及び転写プログラムを組み合わせることで、抗原特異的増殖の際にｐｐ６５特異的Ｔ細胞の表現型移行が起こることが観察された（例えば、図７Ｈを参照のこと）。患者の血液から直接単離したｐｐ６５特異的Ｔ細胞は、ほとんどがＴＥＭＲＡ Ｔ細胞、すなわち最終分化エフェクターメモリサブセットであった。抗原誘導増殖後、これらのＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ発現を失い、ＣＤ４５ＲＯ発現を獲得し、これは、これらのＴＥＭＲＡ Ｔ細胞がエフェクターメモリＴ細胞（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋）にさらに分化することができることを示唆している（例えば、図７Ｈを参照のこと）。この観察は、フローサイトメトリーによって両方のドナーにおいて認証された（例えば、図７Ｉを参照のこと）。
増殖の際の表現型の変化が抗ウイルスレパートリー全体の細胞状態の移行によって駆動されるのか又は特定のＴ細胞クローンの選択的増殖によって偏りがあるのかを調べるために追加実験を行った。これらの実験では、ＴＣＲ配列を「天然の」バーコードとして利用し、増殖前及び増殖後の各優勢なＴ細胞クローンの細胞状態を追跡した。ＩＦＮ－Ｉ ＩＳＧ遺伝子スコア及び細胞傷害性遺伝子スコアを計算して、Ｉ型ＩＦＮ刺激における細胞状態及び個々のＴ細胞の細胞傷害機能を反映させた（例えば、実施例１１の一般的な方法を参照のこと）。ＩＦＮ－Ｉ ＩＳＧ及び細胞傷害性スコアは、患者の各Ｔ細胞クローンにおいて休止時に非常に不均一であることが見出された（例えば、図７Ｊを参照のこと）。エクスビボ増殖後、ＩＦＮ－Ｉ ＩＳＧ及び細胞傷害性スコアはＴ細胞クローン全体にわたって著しく集中し、３つのクローンすべてにおいてＩ型ＩＦＮ ＩＳＧ遺伝子発現の喪失及び細胞傷害性遺伝子の上方制御が見出された（図７Ｊを参照のこと）。この結果により、ペプチド誘導増殖によりＴ細胞のエフェクター機能がさらに増強され得るが、患者において観察されるＩ型ＩＦＮ応答はエクスビボ増殖時には維持できないことが示唆された。
対照的に、抗原活性化はまた、クローン間表現型の多様性を生じさせることができる。３つのｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞クローンのうちの３つすべてで、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）サイトカイン遺伝子ＩＬ１３の発現は低かったが、休止時にはメモリーＴ細胞転写因子ＥＯＭＥＳの広範な発現が見出された（例えば、図７Ｊを参照のこと）。抗原活性化及び増殖の際に、クローン１は、ＩＬ１３、ＥＯＭＥＳのいずれか又はその両方を発現する細胞を生成し、クローン３は、ＩＬ１３又はＥＯＭＥＳを相互に排他的に発現する細胞を生成し、クローン２は、ＥＯＭＥＳの発現頻度を増加させたがＩＬ１３の発現頻度は増加させなかった（図７Ｊを参照のこと）。一貫して、増殖の際に、ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞クローンは２つのＴｈ２サイトカインであるＩＬ４及びＩＬ１３の発現においてさらなるクローン多様性を示した（例えば、図７Ｔを参照のこと）。したがって、各ＴＣＲは同じ抗原を異なる方法で認識し、多様な転写プログラム及び細胞状態を駆動し得る。
纏めると、ＥＮＴＥＲ－ｓｅｑにより、患者のウイルス感染後のＴ細胞特異性、休止細胞状態、及び抗原誘導細胞運命の可能性の体系的な精査が可能になった。ペプチド誘導抗原特異的増殖後に特定のＴ細胞クローンにおけるＴｈ２サイトカイン遺伝子の上方制御を伴う、細胞傷害性及びＩ型ＩＦＮ応答におけるＴＥＭＲＡ Ｔ細胞からＴＥＭＴ細胞への抗ＣＭＶＴ細胞の移行（例えば、図７Ｋを参照のこと）。
実施例１１
実施例１～１０の一般的な材料及び方法
プラスミドのクローニング及び構築
プライマーはＩＤＴ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから注文し、遺伝子断片はｔｗｉｓｔ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ及びＩＤＴによって合成された。表３は、本研究で使用したベクター設計のリストを示す。一般的に、すべての構築物は、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって作成された。簡単に述べると、ｐＭＤ２．Ｇ（ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９）をＥｃｏＲＩで消化して、野生型ＶＳＶ－ｇ遺伝子断片を除去した。これは、ＶＳＶ－ｇ二重変異体を生成するためにＰＣＲプライマーによって導入された変異ＶＳＶ－ｇ（Ｋ３７Ｑ及びＲ３５４Ｑ）を用いて組み立てられた。ｐｓＰａｘ２（ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２６０）をＢｓｉＷＩ及びＳｐｈＩで消化し、ＭＡの後にｅＧＦＰを融合した。ＮＣ－ｅＧＦＰ／ＮＣ－ｍＮｅｏｎ融合を有するパッケージングベクターを生成するために、ｐｓＰＡＸ２－Ｄ６４Ｖ－ＮＣ－ＭＳ２（ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２９４４）をＳｐｈＩ及びＢｓｐＥＩで順次消化した。次いで、ｇａｇの一部及びｅＧＦＰ又はｍＮｅｏｎが骨格とともに組み立てられた。ＧＦＰ－ＶＰＲは、Ａｄｄｇｅｎｅ（＃８３３７４）から入手した。
ＨＰＶ１６＿Ｌ２抗原特異的ＢＣＲを生成するために、軽鎖及び重鎖をベクターＪＷＷ－１（ａｄｄｇｅｎｅ＃６６７４８）から別々に増幅し、２Ａペプチドによって接続した。次いで、これをＣＭＶプロモーター後のｐｉｇｇｙｂａｃベクターに挿入し（ＰＢ－ＣＭＶ）、その後に、この抗体を細胞表面上で発現させるためにＰＤＧＦＲ膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙを追加した。抗Ｈｅｒ２ ＢＣＲを供給源のトラスツズマブベクター（ａｄｄｇｅｎｅ＃６１８８３）から同じ方法でクローニングした。抗ＳＡＲ２－ＲＢＤ ＢＣＲを生成するために、ＲＢＤ抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片（タンパク質データバンク、アクセッション番号７ＢＷＪ、（Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０））をコドン最適化し、合成した（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏ）。その後、シグナルペプチドを各鎖に追加し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ及びＰＤＧＦＲ ＴＭ配列を用いて重鎖をさらに全長まで延長した。次いで、ＢＣＲを、ハイグロマイシン耐性を有するＳＦＦＶプロモーターによって駆動されるレンチウイルスベクターに挿入した。
ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０１８；クローン１Ｇ４、野生型（１Ｇ４ｗｔ）及びその変異型（ａ９５：ＬＹ）（高親和性を有する）、２Ａペプチドによって直列に連結されたアルファ鎖及びベータ鎖（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）の一本鎖フォーマットを合成し、ハイグロマイシン耐性を有するレンチウイルスベクターに挿入した。ＣＭＶウイルス由来のｐ５ペプチドに結合するＴＣＲ５をアルファ鎖（ａｄｄｇｅｎｅ＃１６４９９９）及びベータ鎖（ａｄｄｇｅｎｅ＃１６５０００）から増幅し、上記のＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲと同様に一本鎖フォーマットにした。
抗原及びＨＬＡペプチド複合体をウイルス表面上に提示するために、最初に、強力なＣＭＶプロモーター、複数のクローニング部位、及び発現を増強するためのＷＰＲＥ要素を有するクローニングレンチウイルスベクターを生成した。ＣＤ８ストーキング（ｓｔａｌｋｉｎｇ）リンカー及びＴＭを有するｓｃＦｖ ＣＤ１９（Ｍａｃｋａｌｌ研究室より提供）をレンチウイルスプラスミドに挿入し、続いて２Ａ－ピューロマイシン及び２Ａ－ｅＧＦＰを挿入することによって、ＣＤ１９－ＣＡＲベクターを生成した。ｓｃＦｖ ＣＤ１９及びＴＭを置き換えて、ＨＰＶ－Ｌ２抗原、ＣＤ４０Ｌ（ａｄｄｇｅｎｅ＃１２５７９５）、及びＣＤ４０Ｌ変異体（ａｄｄｇｅｎｅ＃１２５７９６）を含む他の抗原候補を生成した。ＴＭドメインのスクリーニングのために、ＴＭをＨＰＶ－Ｌ２抗原ウイルスベクターにおいて１０個の代替物で交換した（表４）。ＳＡＲ２スパイクＲＢＤドメインのＤＮＡ断片を合成し、上記の記載と同様に、レンチウイルス発現ベクターに挿入し、続いてＣＤ８ストーキングリンカー及びＴＭドメインを挿入した。Ｈｅｒ２提示では、天然のＴＭ及び追加の５５ａａ細胞質テールを含む切断型Ｈｅｒ２（ａ１～ａ７００）断片をＷＴＨＥＲ２（ａｄｄｇｅｎｅ＃１６２５７）から増幅し、上記のベクターに挿入した。
ｐＭＨＣ複合体を提示するために、シグナルペプチド、抗原ペプチド、Ｇ４Ｓリンカー、ベータ２マイロクグロブリン（Ｂ２Ｍ）、第２のＧ４Ｓリンカー、及びＨＬＡ対立遺伝子を直列に有する一本鎖ベクターを構築した。ヒト成長ホルモンシグナルペプチドからβ２マイロクグロブリンまでをコード化するＤＮＡを合成し、ＨＬＡ対立遺伝子とともにレンチウイルスベクターに挿入した。ここで、ＨＬＡ対立遺伝子Ａ０２０１をａｄｄｇｅｎｅベクター＃１１９０５２から増幅し、対立遺伝子Ａ０１０１をａｄｄｇｅｎｅ＃１６５００９から増幅した。２つのシステイン変異を導入して、ＨＬＡ対立遺伝子のＹ８４Ｃとペプチド後のＧ４Ｓリンカーに存在するＧ２Ｃとの間の二硫化物結合によるペプチド結合を安定化させた。これを１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシングプラットフォームに適合させるために、１０×ＴＳＯ配列（表６）を、Ｂ２Ｍとアミノ酸ＳＨＩＲＮをコードするＨＬＡとの間のリンカー、及びＣＭＶプロモーター後の５’ＵＴＲにおける１０×ＰＣＲハンドルにさらに挿入した（表６）。抗原ペプチドを２つのｅｓｐ３Ｉ部位に置き換えることによってクローニングベクターを構築し、該ベクターでは、様々なＨＬＡペプチド（表５）を好適に挿入することができる。
送達目的のために様々なベクターを生成した。最初に、ＶＳＶ－ｇ変異体と同じアプローチで、ｐＭＤベクター中のＶＳＶ－ＧをＲＢＤ、ＨＥＲ２、ｐｐ６５－ＨＬＡ－Ａ２などの異なるエンベロープタンパク質で置き換えた。次いで、カーゴ、例えば、ＨＳＶ－ＴＫ－２Ａ－ｅｇｆｐ（ａｄｄｇｅｎｅ＃３３３０８のＨＳＶ－ＴＫ）及びｅＧＦＰのみがレンチウイルスベクター中のＥｆｌａプロモーターによって駆動される、カーゴ送達ベクターを構築した。ｓｈＲＮＡの送達のために、蛍光マーカー及び選択マーカーとしてｅＧＦＰ及びピューロマイシンを含むレンチウイルスベクター中のヒトＵ６プロモーター下に異なるｓｈＲＮＡを配置した。細胞を赤色蛍光タンパク質で標識するために、ピューロマイシン耐性を有するレンチウイルスベクター中のＥＦ１ショートプロモーターの後にｍＳｃａｒｌｅｔ導入遺伝子を挿入した。
トランスフェクション及びレンチウイルスの産生
細胞株の感染及び産生のための通常のレンチウイルスを生成するために、６ウェルごとに、リポフェクタミン３０００を用いてＨＥＫ２９３Ｔをウイルス発現ベクター（２μｇ）、ｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ野生型）（１μｇ）、及びｐｓＰａｘ２（２μｇ）でトランスフェクトした。翌日に培地を交換し、ウイルス上清をそれぞれ４８時間及び７２時間で２回収集した。製造元のプロトコルに従って４×Ｌｅｎｔｉ－Ｘでウイルスを濃縮し、－８０℃で２０倍濃縮で保存した。特定の受容体を標的化し、かつ、組み込まれるウイルスを産生するために、代わりにＶＳＶ－Ｇ変異体を使用した。組み込まれることなく蛍光検出することができる抗原提示ウイルスを産生するために、ＶＳＶ－Ｇ変異体及びｐｓＰＡＸ２－Ｄ６４Ｖ（インテグラーゼ上のＤ６４Ｖ変異）ベクターの蛍光タンパク質融合体（ＮＣ－ｅＧＦＰ又はＮＣ－ｍＮｅｏｎ）を上記の比率に従って抗原発現ベクターと混合し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。ｐＭＨＣ提示ウイルスの場合、トランスフェクションにはＨＬＡ－ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。ウイルスを収集し、４０倍に濃縮し、－８０℃で保存した。カーゴ送達のためのレンチウイルスを生成するために、６ウェルごとに、リポフェクタミン３０００を用いてＨＥＫ２９３Ｔをカーゴ発現ベクター（１．６μｇ）、ｐＭＤ２．Ｇ ＶＳＶ－ｇ変異体（０．８μｇ）、ｐｓＰａｘ２（１．６μｇ）、及びエンベローププラスミド（１μｇ）でトランスフェクトした。ウイルスを上記のように収集し、４０倍に濃縮し、使用前に－８０℃で保存した。レンチウイルスの力価を、製造元のプロトコルに従ってＬｅｎｔｉ－Ｘ ＧｏＳｔｉｘ Ｐｌｕｓキット（Ｔａｋａｒａｂｉｏ）によって測定した。
細胞培養及び細胞株の産生
Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、及びＪｕｒｋａｔ関連細胞株を１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ関連細胞を１０％ＦＢＳ及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を標的化するＣａｓ９ＲＮＰのエレクトリポレーションによってＨＬＡ－ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を生成し、さらにＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃの表面発現に基づいてＨＬＡ－ＫＯ細胞を選別した。Ｒａｍｏｓ細胞を得た。Ｊｕｒｋａｔ ＴＣＲ陰性－７６細胞、並びにＣＭＶ ｐｐ６５ＴＣＲ及びｆｌｕ－ｍｌＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔを得た。ＢＣＲ及びＴＣＲ発現細胞を含む安定した細胞株を生成するために、Ｒａｍｏｓ細胞又はＪｕｒｋａｔ細胞をウイルスに感染させ、４～５日後に選別によって又は薬剤を使用して選択した。ＮＹＥＳＯ－ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＲＢＤ－ＢＣＲ Ｒａｍｏｓ細胞を赤色ｍＳｃａｒｌｅｔウイルスに感染させ、ピューロマイシンで選択して、ｍＳｃａｒｌｅｔ赤色蛍光標識細胞株を生成した。
レンチウイルス感染及びウイルスインキュベーションアッセイ
図１Ｂでは、３０μＬの濃縮レンチウイルスを１２ウェルプレート中の２５０Ｋ Ｒａｊｉ細胞又はＪｕｒｋａｔ細胞に添加した。３日後、ＧＦＰシグナルをフローサイトメトリーによって測定した。１Ｂの後の図では、２００Ｋ個の標的細胞をチューブに収集し、遠心分離後に上清を除去した。細胞ペレットを３０μＬの濃縮ＧＦＰ融合レンチウイルスに再懸濁し、３７℃でインキュベートした。２時間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリー抗体で４℃で１０分間染色し（必要な場合）、ＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、最後にフローサイトメトリーに供した。図２Ｄでは、異なるＴＣＲ親和性を有するｐＭＨＣ抗原変異体を提示するＥＮＴＥＲウイルスの結合を定量化するために、ウイルス力価を正規化し、１００Ｋ個のＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（１Ｇ４野生型又はａ９５：ＬＹ変異体）又はオフターゲットＣＭＶ－ｐｐ６５ ＴＣＲ＋Ｔ細胞を、抗原変異体を提示するＥＮＴＥＲウイルスのタイトレーション（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）（４ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎのｇｐ２４レベル）とともにインキュベートした。２時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーに供してＧＦＰ＋細胞を定量化した。図２Ｃでは、各試薬のモル基準あたりのｐＭＨＣ提示ＥＮＴＥＲウイルス及びｐＭＨＣテトラマーの感度を比較するために、１００Ｋ個のＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞をＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５抗原を提示する２×１０８個のＥＮＴＥＲウイルス（２０ｎｇのｐ２４）又は様々なＮＹ－ＥＳＯ－１１５７～１６５ｐＭＨＣテトラマー（２×１０８～８×１０９個）とともに２時間インキュベートした。各試薬のモル数の計算は以下の通りである。１０４個のウイルス粒子は１ｐｇのｐ２４タンパク質を含むため、２０ｎｇのｐ２４を有するウイルス＝２０＊１０００＊１０４＝２×１０８個のウイルス粒子となる。ｐＭＨＣテトラマーの場合、分子量は約５００ＫＤ（ＰＥ－ストレプトアビジン：約３００ＫＤ、ｐＭＨＣテトラマー：約２００ＫＤ（５０ＫＤモノマー＊４））であった。したがって、１μｇのｐＭＨＣテトラマー＝ｌμｇ＊１０６＊（６．０２×１０２３）／５００／１０００＝１．２×１０１２個のテトラマーとなる。
ウイルス結合及び融合アッセイ
２０μＬのＣＤ１９－ｓｃＦｖ提示ＧＦＰウイルスを２００Ｋ個のＲａｊｉ Ｂ細胞とともに４℃又は３７℃で２時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、細胞表面結合ウイルスを消化する０．５ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＫ処理に３７℃で１５分間供した。プロテイナーゼＫ処理前及び処理後の細胞をフローサイトメトリーに供し、ＧＦＰ陽性細胞の割合を定量化した。
免疫捕捉アッセイ
１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｄｙｎａ ｂｅａｄｓを１ｍＬのブロッキング緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で室温で２０分間インキュベートした。２μｇの抗ＣＤ４０Ｌ抗体（Ｃａｔ＃１５７００９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＶＳＶ－Ｇ抗体（クローン８Ｇ５Ｆ１１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｓｉｇｍａ）、又はＩｇＧ抗体を１００μＬのブロッキング緩衝液とともにビーズに添加し、４℃で３０分間回転させた。抗体結合ビーズを３回洗浄し、上清を除去した。３０μＬのＣＤ４０Ｌ提示ウイルスを３０μＬのブロッキング緩衝液とともにビーズに添加し、室温で１時間回転させた。同じバッチからの５μＬのＣＤ４０Ｌ提示ウイルスをインプット試料として調製した。ビーズを３回洗浄し、上清を除去した。１００μＬのＴｒｉｚｏｌをビーズ又はインプット試料に添加し、Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＫｉｔによるＲＮＡ抽出に供した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してＲＴ－ｑＰＣＲを行った。
レンチウイルスの標的化カーゴ送達
細胞を上記のように６μｇ／ｍｌのポリブレンを含む培地中でウイルスとともにインキュベートした。３日後にフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）を使用して送達効率及び特異性を評価した。必要な場合、フローサイトメトリー分析前において、最初に細胞をＰｅＣｙ７抗ヒトＩｇＧ（Ｂ細胞の場合、クローンＧ１８－１４５、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又はＡＰＣ抗ヒトＣＤ３（Ｔ細胞の場合、クローンＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。ＨＳＶ－ＴＫ細胞死滅アッセイでは、２つの細胞集団（そのうちの１つがｍＳｃａｒｌｅｔによって標識され（オフターゲット）、もう１つが非蛍光である（オンターゲット））を１：１の比率で混合し、ウイルスとともにインキュベートした。３日後、ガンシクロビル（ＧＣＶ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を添加して０．１ｇ／ｍｌの最終濃度にし、これを０日目としてカウントした。細胞培地及び薬剤は３日ごとに新しくした。２日後、３００ｐＬの細胞培養物を毎日採取し、ＩｇＧ又はＣＤ３で染色した後にフローサイトメトリーによって分析した。生存しているオンターゲット細胞とオフターゲット細胞との比率を計算し、日数に対してプロットした（０日目に対して正規化した）。あるいは、処置４日目における標的化集団又はＮＴ集団の生存細胞の生カウントも、ＴＫ送達とｅＧＦＰのみの送達との間で比較した。
ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ送達によるアポトーシスアッセイでは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を異なるｓｈＲＮＡに感染させ、ＰＥ－ＦＡＳ／ＣＤ９５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ｓｈＲＮＡノックダウンの効果を比較した。ＣＭＶ－Ｊｕｒｋａｔ（オンターゲット）及びｍＳｃａｒｌｅｔ＋ＮＹ－ＥＳＯ－Ｊｕｒｋａｔ（オフターゲット）の混合物をｓｈＲＮＡウイルスとともにインキュベートした。５日後、抗ＦＡＳ抗体（クローンＣＨ１１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を０．２５μｇ／ｍｌで添加し、アポトーシスを誘導した。細胞を１４時間後に採取し、製造元のプロトコルに従ってＡＰＣ抗アネキシンＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び７－ＡＡＤで染色した。次いで、試料をフローサイトメトリー（ＢＤＬＳＲ ＩＩ）で分析し、まず低７－ＡＡＤ集団及び低アネキシンＶ集団についてゲーティングした。次いで、形質導入されたオンターゲット細胞とオフターゲット細胞との比率をＦＡＳ ｓｈＲＮＡと対照ｓｈＲＮＡとの間で比較し、正規化した棒グラフを生成した。
混合細胞集団とのレンチウイルスのインキュベーション
Ｔ細胞混合実験では、Ｆｌｕ－ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を製造元のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染料（＃Ｃ３４５７１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって標識した。Ｖｉｏｌｅｔ標識されたＦｌｕ－ｍ１ ＴＣＲ＋Ｔ細胞を１：１、１：１０、１：１００、１：１０００を含む様々な比率でＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ＋Ｔ細胞と混合した。混合Ｔ細胞を４０μＬの濃縮ＨＬＡ－Ａ２－Ｆｌｕ抗原提示ＧＦＰウイルスとともに３７℃で２時間インキュベートした。Ｔ細胞をＣＤ３－ＡＰＣ（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体で染色し、２回洗浄し、フローサイトメトリーに供した。Ｂ細胞混合実験では、ＨＰＶ－ＢＣＲを発現するＲａｍｏｓ Ｂ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染料によって標識し、１：１、１：１０、１：１００、１：１０００を含む様々な比率でＨＰＶ－Ｌ２ ＢＣＲを発現するＲａｍｏｓ Ｂ細胞と混合した。混合細胞を４０μＬの濃縮ＲＢＤ抗原提示ＧＦＰウイルスとともに３７℃で２時間インキュベートした。Ｂ細胞をＩｇＧ－ＰＥ－Ｃｙ７抗体（クローンＧ１８－１４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、２回洗浄し、フローサイトメトリーに供した。メトリクスを以下のように計算した：
感度＝総オンターゲット細胞のうちのＧＦＰ＋オンターゲット細胞の割合
特異性＝１－（総オフターゲット細胞のうちのＧＦＰ＋オフターゲット細胞の割合）
シグナル／ノイズ比＝（総オンターゲット細胞のうちのＧＦＰ＋オンターゲット細胞の割合）／（総オフターゲット細胞のうちのＧＦＰ＋オフターゲット細胞の割合）。
ヒト初代免疫細胞の単離及び活性化
健康なドナー由来の軟膜を同意書とともにスタンフォード血液センターから入手した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｃａｔ＃０７８１１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）密度勾配遠心分離を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、凍結保存し、－８０℃で保存した。製造元のプロトコルに従ってＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃１９８４４、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｂ細胞を解凍したＰＢＭＣから陰性選択によって精製した。単離したＢ細胞を、１×１０６個の細胞／ｍＬで、１０％ＦＢＳ及び５５ｍＭ β－メルカプトエタノールを補充したＩＭＤＭ培地中でインキュベートし、ＣｅｌｌＸＶｉｖｏ Ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｄｅｒ（１：２５０希釈、Ｒ＆Ｄシステム）及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２（Ｃａｔ＃２００－０２－１０ｕｇ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）によって２日間活性化した。ＣＭＶ感染した（ＣＭＶ血清陽性）ＨＬＡ－Ａ２＋ドナー由来のＬＲＳチャンバーを同意書とともにスタンフォード血液センターから入手した。ＰＢＭＣを上記のように単離し、保存した。製造元のプロトコルに従ってＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃１９０５３、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍したＰＢＭＣから陰性選択によって精製した。
抗原特異的Ｔ細胞のペプチド濃縮
ＣＭＶエピトープ（ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子と互換可能である、表Ｓ３）をコードする短い９マーペプチドをＥｌｉｍｂｉｏによって凍結乾燥粉末として合成した。ペプチドをＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬで溶解させた。ＰＢＭＣを上記のドナー血液から単離した。ＰＢＭＣをＴ細胞培地（１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５５ｍＭベータメルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ培地）中でインキュベートした。個々のペプチド（１０μｇ／ｍＬ）又はプールされたペプチド（各ペプチドについて１μｇ／ｍＬ）をＰＢＭＣに添加し、Ｔ細胞培地中で１０日間インキュベートした。５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を２日ごとに添加した。ペプチド濃縮後、ＰＢＭＣをウイルス及び／又はＰＥテトラマーとともにインキュベートし、次いでフローサイトメトリーで分析した。
フローサイトメトリー
図１Ｄでは、Ｂ細胞をウイルスとともに２時間インキュベートし、次いで、細胞染色バッファー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中のＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸＴＭ（ＦｃＢｌｏｃｋ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９－ＡＰＣ（クローンＨＩＢ１９）、及びＣＤ２０－Ｖ４５０（クローンＬ２７）抗体で４℃で１０分間染色した。図２では、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をウイルスとともに２時間インキュベートし、次いで、ＣＤ３－ＡＰＣ（クローンＨＩＴ３ａ）及びペプチド（ＮＩＨテトラマーコア）をローディングしたＰＥ標識テトラマーで４℃で３０分間染色した。図５では、細胞をウイルスとともに２時間インキュベートし、次いで、ヒトＦｃブロック、ＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＢＶ７１１（クローンＳＫ１）、必要に応じてテトラマー－ＰＥ、及びｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅで４℃で３０分間染色した。染色後、細胞を細胞染色バッファーによって２回洗浄し、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって分析した。特定しない限り、すべての抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから取得した。テトラマーはＮＩＨ ｔｅｔｒａｍｅｒ ｃｏｒｅから取得した。
ＲＮＡ－ｓｅｑ実験及び分析
ＣＭＶ ｐｐ６５－ＴＣＲ＋Ｔ細胞を３０μＬのｐｐ６５４９５～５０３提示ＥＮＴＥＲウイルス又は１μｇのｐｐ６５４９５～５０３テトラマーとともに２時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＲＮＡ抽出に供した。オンカラムＤｎａｓｅ消化を備えたＱｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを抽出した。少なくとも１００ｎｇのＲＮＡを使用し、製造元の指示に従ってＴｒｕＳｅｑ（登録商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃２００２０５９４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、各試料に対してＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑでライブラリをシーケンシングし、２×１５０のペアエンドリード（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｒｅａｄ）が生成された。デフォルトのパラメータ（－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ １－－ａｌｉｇｎＥｎｄｓＴｙｐｅ ＥｎｄＴｏＥｎｄ－－ｏｕｔＳＡＭａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ＮＨ ＨＩ ＮＭ ＭＤ）を用いたＳＴＡＲにより、ＲＮＡ－ｓｅｑリードをヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。デフォルトのパラメータ（－－ｓｔｒａｎｄｅｄ＝ｒｅｖｅｒｓｅ-ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ－ａｔｔｒ＝ｇｅｎｅ＿ｎａｍｅ）を用いたＨＴｓｅｑカウントにより、遺伝子レベルでのアラインされたリードの定量化を行った。サイズ係数の正規化を伴うＤＥＳｅｑ２を使用して差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を同定するために生カウントを使用し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇによる調整ｐ値＜０．０１であり、かつ、遺伝子発現の変化の差が２倍超の場合にＤＥＧを同定した。
混合ＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑワークフロー
すべてのプライマーは合成され、ＩＤＴから注文した（表６）。異なるＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を一緒に混合し、上記のようにウイルス混合物を染色した。その後、ＧＦＰ＋細胞をＢＤ Ａｒｉａ ＩＩで選別した。市販の１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５’ＲＮＡキットをシングルセルあたりのＨＬＡペプチド、ＴＣＲ、及びトランスクリプトームを同時に読み出すようにカスタマイズした。選別後すぐに、細胞をＰＢＳ＋０．４％ＢＳＡで４℃で１回洗浄し、０．１μＭのカスタマイズされたＴＣＲａｌｐｈａ ＲＴプライマー（ｈｓ＿ＴＲＡｃ＿ＲＴ及びＮＹＥＳＯ＿ＴＲＡｃ＿ＲＴの混合物）でスパイクされたＲＴ（逆転写）混合物と混合し、１０×クロムにローディングした。製造元のプロトコルに従ってｃＤＮＡを増幅し、クリーンアップして、トランスクリプトームを生成した。
ｃＤＮＡのクリーンアップ中に、ＨＬＡペプチドのより短い断片及びＴＣＲ情報を含む上清をＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズとさらに混合して０．９倍にし、クリーンアップした。ＨＬＡペプチドをコードするライブラリを２ラウンドのネステッドＰＣＲ及び最終ラウンドのインデックスＰＣＲによって生成した。最初に、０．５ｕＭの１０×＿５ｐＲＮＡ＿Ｆｗ及びＨＬＡ＿ネステッド＿ｆｗを用いた８サイクルのＰＣＲ（９８℃で４５分、次いで、９８℃で２０秒、５９℃で２０秒、及び７２℃で３０秒を８回）によってＨＬＡペプチドｃＤＮＡを濃縮した。クリーンアップ後、５ｕｌの溶出液を、上記の０．５ｕｍのネステッドプライマー及びＩｌｌｕｍｉｎａアダプターＰ７＿Ｔｒｕ＿ＨＬＡ＿ｆｗ及びＰ５＿アダプタープライマーを用いる第２ラウンドのＰＣＲに使用した。最後に、５ｕｌの溶出液を採取し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｔｒｕｓｅｑベースのインデックスプライマーを用いて最終ライブラリを生成した。上記のプライマーはデュアルインデックスと互換性のある方法で設計されており、したがって、カスタマイズされたインデックスプライマー又は１０×デュアルインデックスプライマーのいずれかをここで使用することができる。
Ｊｕｒｋａｔ細胞株でのＴＣＲ情報を読み出すために、細胞のＴＣＲ同一性を推測するためのＴＣＲアルファのＶＤＪ部分をカバーするライブラリを生成した。まず、０．５μＭの１０×＿５ｐＲＮＡ＿Ｆｗ及び２つの異なるＴＣＲを標的化するｎｙｅｓｏ＿ＴＲＡｃ＿ｒｅｖとｈｓ＿ＴＲＡｃ＿ｒｅｖとの０．５ｕＭ混合物を用いたネステッドＰＣＲ（具体的には、９８℃で４５分、次いで、９８℃で２０秒、５９℃で２０秒、及び７２℃で３０秒を８回）により、ＴＣＲ ＤＮＡを濃縮した。次いで、５ｕｌの溶出液を採取し、８サイクル用のＩｌｌｕｍｉｎａアダプター（Ｐ７＿ＴＲＡｃ＿ｎｙｅｓｏ＿ＲｅｖとＰ７＿ＴＲＡｃ＿ｈｓ＿Ｒｅｖとの混合物）及びＰ５＿アダプターを用いた第２ラウンドのネステッドＰＣＲを行い、続いて、ＨＬＡライブラリと同様に最終インデックスＰＣＲを行った。
混合ＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑ分析
ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｏｖａｓｅｑ及びＭｉｓｅｑプラットフォームを使用して、ライブラリをシーケンシングした。シングルセルバーコードを提供するために、１０×ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒを使用してトランスクリプトームｆａｓｔｑファイルを分析した。カスタムＰｙｔｈｏｎ（登録商標）スクリプトを使用して、ＴＣＲライブラリのｆａｓｔｑファイルをＴＣＲアルファ鎖にマッピングした。細胞のバーコードあたりの各種ＴＣＲのＵＭＩカウントを計算した。ダブレットを除外するために、ｇｅｍバーコードあたり、優勢なＴＣＲのＵＭＩカウントが非優勢なＴＣＲ種のＵＭＩカウントの少なくとも１０倍になるように設定した。次に、ペプチド配列を特徴参照として用いてＣｅｌｌＲａｎｇｅｒカウントを使用して、ＨＬＡペプチドの読み出しを処理した。ｐｙｔｈｏｎ（登録商標）のｍａｔｐｌｏｔｌｉｂパッケージを使用して、ダウンストリーム分析及びプロットを生成した。
ＣＭＶ抗原ペプチド誘導によるエクスビボ増殖前又は増殖後の初代Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑワークフロー
ペプチド刺激したドナーＰＢＭＣを採取し、ＩＥ１８１～８９、ＩＥ１３１６～３２４、ＵＳ１５０Ａ１５２～１６１、ＵＳ８７４～８２、ＵＬ１００２００～２０８、ＵＬ４６１００～１０８、ｐｐ６５４１７～４２５、ｐｐ６５３２５～３３３、ｐｐ６５１８８～１９６、ｐｐ６５１２０～１２８、ｐｐ６５４９５～５０３、及びｐｐ６５１４～２２を含む、ＣＭＶ抗原エピトープを提示する１２種のウイルスの混合物で染色した。ＣＭＶ抗原のペプチド配列を表５に示す。２時間後、細胞をバーコード化抗体ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、及びＩＬ７Ｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｔｏｔａｌｓｅｑ－Ｃ、Ｃａｔ＃３０４１６３、Ｃａｔ＃３０４２５９、Ｃａｔ＃３５１３５６）、ｌｉｖｅ ｄｅａｄ染色、ＣＤ３－ＡＰＣ、及びＣＤ８－ＢＶ７１１で氷上で２０分間染色した。各ドナー由来の試料を固有のハッシュタグバーコード化抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｔｏｔａｌｓｅｑ－Ｃ、Ｃａｔ＃３９４６６１、Ｃａｔ＃３９４６６３）でも染色した。２回の洗浄後、ＣＤ８＋ＣＤ３＋ＧＦＰ＋細胞を選別し、製造元のプロトコルに従って５’ＲＮＡ及びＶＤＪキットを使用して１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームを実施した。ここで、製造元のプロトコルに従って、試料ごとに以下のライブラリ：１０×遺伝子発現ライブラリ、ＶＤＪライブラリ、及びフィーチャバーコード化ＣＩＴＥ－ｓｅｑライブラリ（ｆｅａｔｕｒｅ ｂａｒｃｏｄｅｄ ＣＩＴＥ－ｓｅｑ ｌｉｂｒａｒｙ）を得た。さらに、ＨＬＡペプチドライブラリも上記と同じ方法で生成した。最終ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ、Ｎｅｘｔｓｅｑ５５０、又はＮｏｖａｓｅｑ６０００のいずれかでシーケンシングした。ペプチド刺激／増殖することなく患者の血液試料から直接単離された初代Ｔ細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑでは、ユーザーのプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｃａｔ＃１７９５３、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、凍結保存された患者のＰＢＭＣ試料から総ＣＤ８＋Ｔ細胞を最初に精製した。次いで、上位３つのＥＮＴＥＲ ｐＭＨＣウイルス（ｐｐ６５４９５～５０３、ＵＳ８７４～８２、及びＵＬ１００２００～２０８）の混合物を３７℃で２時間調製した。抗体染色、フローサイトメトリー選別、及び１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓライブラリ生成のその後のステップは、上記のエクスビボで増殖されたＴ細胞と同じであった。
ＣＭＶ血清陽性ドナー由来の初代細胞のＥＮＴＥＲ－ｓｅｑ分析
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑリードをＧＲＣｈ３８ゲノムにアラインし、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒカウント（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して定量化した。抗体オリゴバーコードをフィーチャリファレンスとして使用し、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒカウントを使用して、ＣＩＴＥ－ｓｅｑリードを処理した。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ ｖｄｊ（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、ＴＣＲ－ｓｅｑリードをＶＤＪ互換性リファレンス（ｒｅｆｄａｔａ－ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ－ｖｄｊ－ＧＲＣｈ３８－ａｌｔｓ－ｅｎｓｅｍｂｌ－５．０．０）にマッピングした。ペプチド配列をフィーチャリファレンスとして使用し、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒカウントを使用して、ＨＬＡペプチドの読み出しを処理した。
ＳＣＡＮＰＹ（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を使用して、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ及びＣＩＴＥ－ｓｅｑのその後の分析を行った。検出された遺伝子が２００個未満であるか又はミトコンドリアＲＮＡの読み出しが１０％を超える細胞を分析から除外した。ドナーの起源を標識するバーコード化ハッシュタグ抗体のＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析を使用して、ダブレット細胞を除外した。細胞クラスタリングでは、まず生ＵＭＩカウントを合計カウントによって正規化してライブラリのサイズを修正し、次いで対数正規化した。デフォルトのパラメータを用いたｓｃａｎｐｙ．ｐｐ．ｈｉｇｈｌｙ＿ｖａｒｉａｂｌｅ＿ｇｅｎｅｓ（）を使用して、変動遺伝子（ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ）を呼び出した。変動ＴＣＲ転写産物からのクラスタリングバイアスを防ぐために、主成分分析（ＰＣＡ）の前に変動ＴＣＲ遺伝子を除去した。次いで、細胞あたりの総カウント及びミトコンドリア遺伝子の割合の効果を取り除き、データを単位分散にスケール化する。スケール化されたデータを変動遺伝子（ＴＣＲ遺伝子なし）に基づくＰＣＡ分析へのインプットとして使用した。最初の４０個の主成分を用いたライデングラフクラスタリング法を使用して、クラスターを同定した。ＥＮＴＥＲウイルス誘導遺伝子発現がＴ細胞の状態及びクラスタリングに影響を与えるかどうかを決定するために、バルクＲＮＡ－ｓｅｑデータから同定された２８個のＥＮＴＥＲウイルス誘導遺伝子の除去前及び除去後に、ライデングラフクラスタリングを行った。デフォルトのパラメータを用いたｓｃａｎｐｙ．ｔｌ．ｕｍａｐ（）及びｓｃａｎｐｙ．ｐｌ．ｕｍａｐ（）を使用して、ＵＭＡＰプロットを作成した。生の値又はｚスコアスケールの遺伝子発現を用いたｓｃａｎｐｙ．ｔｌ．ｈｅａｔｍａｐ（）を使用して、ヒートマッププロットを作成した。
ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＧＺＭＢ、及びＫＬＲＢ１などの既知のマーカーの発現を使用して、初期クラスターにアノテーションを施した。すべてのＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ３Ｅ＋ＣＤ８Ａ＋ＣＤ４－であった。ナイーブＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋であった。セントラルメモリー記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ）はＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋であった。エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞はＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－であった。ＣＤ４５ＲＡ（ＴＥＭＲＡ）を再び発現する最終分化エフェクター細胞はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＯ－であり、ＭＡＩＴ細胞はＫＬＲＢ１＋ＣＸＣＲ６＋ＴＲＡＶ１－２＋であった。ｃｔｒｌ＿ｓｉｚｅ＝５００、ｕｓｅ＿ｒａｗ＝Ｔｒｕｅを用いたｓｃａｎｐｙ．ｔｌ．ｓｃｏｒｅ＿ｇｅｎｅｓ（）を使用して、遺伝子スコアを計算した。細胞傷害性遺伝子の遺伝子セットは、十分に確立された細胞傷害性分子からキュレートされた。Ｔ細胞疲弊遺伝子、Ｔ細胞活性化遺伝子、及びＩ型ＩＦＮ応答遺伝子を以前の文献（Ｙｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１９）から選択した。
Ｓｃｉｒｐｙ（Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．，２０２０）を使用してＴＣＲ関連分析を行った。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ ｖｄｊによって生成されたコンティグアノテーションファイルをＴＣＲ分析のためにインプットとして使用した。ｓｃｉｒｐｙ．ｔｌ．ｃｈａｉｎ＿ｑｃ（）を使用してＴＣＲのクオリティを分析した。ＣＤＲ３ヌクレオチド配列の類似性に基づくデフォルトパラメータを用いたｓｃｉｒｐｙ．ｐｐ．ｉｒ＿ｄｉｓｔ（）及びｓｃｉｒｐｙ．ｔｌ．ｄｅｆｉｎｅ＿ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ（）を使用して、ＴＣＲクロノタイプを定義した。ｍｉｎ＿ｃｅｌｌｓ＝３を用いたｓｃｉｒｐｙ．ｔｌ．ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ＿ｎｅｔｗｏｒｋ（）を使用して、ＴＣＲクロノタイプをネットワーク上で視覚化した。ｗｅｂｌｏｇｏ（Ｃｒｏｏｋｓｅｔａｌ．，２００４）を使用してＣＤＲ３アミノ酸組成を生成した。任意の個々の抗原に対するＨＬＡペプチドの生カウントが６個以上である細胞を抗原特異的Ｔ細胞として標識した。細胞あたりの抗原ペプチド数をｌｏｇ（カウント＋ｌ）変換を使用して定量化した。ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を、クローンサイズが＞５０、＞１０、又は＞１である多様なクローン増殖細胞に分けた。異なるクローン増殖Ｔ細胞における細胞あたりの結合した抗原ペプチド数の分布をバイオリンプロットで示した。優勢なＴＣＲクロノタイプをバーコードとして使用し、ｋｄｅｐｌｏｔＱ機能を使用して２Ｄ密度プロットを生成し、抗原誘導増殖前及び抗原誘導増殖後で同じＴＣＲ配列を有するＴ細胞の細胞傷害性遺伝子スコア及びＩ型ＩＦＮ遺伝子スコアを示した。すべてのプロット（バイオリンプロット、散布図、密度プロット、及び棒グラフなど）をＰｙｔｈｏｎ（登録商標） ｍａｔｐｌｏｔｌｉｂ及びｓｅａｂｏｒｎによって生成した。
ＴＣＲをバーコードとして使用して、優勢な抗原特異的Ｔ細胞と同じＴＣＲ配列を有するＥＮＴＥＲ陰性集団において偽陰性Ｔ細胞が同定された。同様に、優勢なクローンを有するｐｐ６５特異的Ｔ細胞と他のＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞又はＥＮＴＥＲ陰性Ｔ細胞との間のＴＣＲ配列を追跡することによって、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞などの偽陽性抗原特異的Ｔ細胞を生成することができた。さらに、上位３つの抗原エピトープについて偽陰性率（ＦＮＲ）及び偽陽性率（ＦＰＲ）を計算した。ｐｐ６５４９５～５０３特異的Ｔ細胞では、ＦＮＲ＝０．１９％、ＦＤＲ＝０．３６％であった。ＵＳ８７４～８２特異的Ｔ細胞では、ＦＮＲ＝２．７３％、ＦＤＲ＝０．１８％であった。ＵＬ１００２００～２０８特異的Ｔ細胞では、ＦＮＲ＝０％、ＦＤＲ＝０．０７％であった。
本開示は、特定の実施形態（そのうちのいくつかは好ましい実施形態である）を参照して特に示され、記載されているが、本明細書に開示された本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更を加えることができることが当業者によって理解される必要がある。したがって、正確な要約及び本明細書に提示された開示内容に限定されることを意図するものではない。
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Claims (67)

  1. 操作されたレンチウイルスであって、
    前記レンチウイルスの表面上に提示された異種リガンド、
    修飾されたウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン（fusogen）、ここで、前記フソゲンは、前記レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、前記宿主細胞は、前記リガンドに対する内因性受容体を含む、
    レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結されたレポータータンパク質、及び
    バーコード化されたＲＮＡ
    を含む、操作されたレンチウイルス。
  2. 前記フソゲンが、修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質であるか、又はそれを含む、請求項１に記載の操作されたレンチウイルス。
  3. 前記修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質が、前記ＶＳＶ－Ｇポリペプチドの位置Ｈ８、Ｋ４７、Ｙ２０９、及びＲ３５４のいずれか１つにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載の操作されたレンチウイルス。
  4. 前記修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質が、Ｋ４７Ｑ置換及びＲ３５４Ａ置換を含む、請求項３に記載の操作されたレンチウイルス。
  5. 前記リガンドが、タンパク質若しくはエピトープであるか、又はそれを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  6. 前記リガンドが、ＭＨＣペプチド、抗体、抗原、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、若しくは細胞によって発現される他の形態の抗原であるか、又はそれらを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  7. 前記抗原が、細胞内抗原である、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  8. 前記リガンドが、最適化された膜貫通ドメインに作動可能に連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス
  9. 前記最適化された膜貫通ドメインが、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＣＡＭ１、ＣＤ４３、ＣＤ１６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４９ｄ、又はＬＦＡ－１に由来する膜貫通ドメインである、請求項８に記載の操作されたレンチウイルス。
  10. 前記リガンドが、最適化された膜貫通ドメイン及びシグナルペプチドに作動可能に連結されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  11. 欠陥のあるインテグラーゼタンパク質を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  12. 前記レポータータンパク質が、ＧＦＰ又はｍＮｅｏｎである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  13. 前記構造タンパク質が、ヌクレオカプシドタンパク質である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  14. 前記構造タンパク質が、Ｇａｇタンパク質である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  15. 前記バーコード化されたＲＮＡが、ウイルス粒子中にカプセル化されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  16. 前記ＲＮＡが、前記リガンドタンパク質をコードする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  17. 前記ＲＮＡが、前記宿主細胞に送達される目的の遺伝子をコードする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  18. 前記ＲＮＡが、次世代シーケンシング技術によって読み出しされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  19. 前記前記ＲＮＡが、捕捉配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス。
  20. リガンド－受容体の対を同定する方法であって、
    請求項１～１９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの操作されたレンチウイルスを提供することと、
    前記レンチウイルスを細胞集団と合わせることと、
    レポーター遺伝子の存在に基づいて前記細胞集団を選別し、それによってリガンド－受容体の対を同定することと
    を含む、方法。
  21. 前記方法が前記操作されたレンチウイルスのプールを提供することを含み、前記プールが異なるリガンドを提示する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記レンチウイルスを前記細胞と合わせ、前記ウイルス／細胞の混合物を約４℃でインキュベートすることを含む、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記レンチウイルスを前記細胞と合わせ、前記ウイルス／細胞の混合物を室温でインキュベートすることを含む、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記レンチウイルスを前記細胞と合わせ、前記ウイルス／細胞の混合物を約３７℃でインキュベートすることを含む、請求項２０に記載の方法。
  25. 前記ウイルス／細胞の混合物を約３０分間、若しくは約１時間、若しくは約２時間、又は約０．５時間～約２．５時間の任意の期間インキュベートすることを含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ウイルスＲＮＡのシングルセルシーケンシングを行って、前記リガンドの配列を同定するステップをさらに含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記細胞のトランスクリプトームのシングルセルシーケンシングを行って、前記受容体の配列を同定するステップをさらに含む、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. ユーザー規定の標的細胞に目的の核酸又は目的のタンパク質を送達する方法であって、
    請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルスを提供することと、
    前記レンチウイルスを、前記標的細胞を含む細胞混合物と接触させることと、
    前記核酸又はタンパク質を前記標的細胞のみに送達することであって、前記標的細胞が、前記レンチウイルスの表面上の前記リガンドに特異的な受容体を発現している、前記送達することと
    を特徴とする、方法。
  29. 前記リガンドが、ユーザー規定の前記標的細胞にカーゴを送達するために修飾されている、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記目的の核酸が、前記操作されたレンチウイルス粒子の内部にパッケージ化されている、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記目的のタンパク質が、前記レンチウイルスのレンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結されている、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記目的のタンパク質が、ｇａｇタンパク質に作動可能に連結されている、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記標的細胞が、インビボ、エクスビボ、又はインビトロにある、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記標的細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記標的細胞が、免疫細胞である、請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞又はＢ細胞である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ヒト細胞が、初代ヒト血液細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３５に記載の方法。
  39. 免疫原性抗原を同定する方法であって、
    以下：
    レンチウイルスの表面上に提示された異種受容体タンパク質、
    修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン、ここで、前記フソゲンは、前記レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、前記宿主細胞は、前記受容体に対する天然抗原を含む、
    レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結されたレポーター導入遺伝子、及び
    バーコード化されたＲＮＡ、ここで、前記ＲＮＡは、抗原情報をコードする、
    を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、
    前記レンチウイルスを細胞集団と合わせることと、
    レポーターの存在に基づいて前記細胞集団を選別することと
    を含む、方法。
  40. ウイルスＲＮＡのシーケンシングを行って、前記抗原の配列を同定するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記細胞受容体のＲＮＡのシーケンシングを行うステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  42. Ｔ細胞受容体及び対形成されたｐＭＨＣを同定する方法であって、
    以下：
    ウイルス表面上に提示されたｐＭＨＣ、
    修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン、ここで、前記フソゲンは、前記レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、前記宿主細胞は、前記ＰＭＨＣに対するＴ細胞受容体を含む、
    レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結されたレポーター導入遺伝子、及び
    バーコード化されたＲＮＡ、
    を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、
    前記レンチウイルスを細胞集団と合わせることと、
    レポーターの存在に基づいて前記細胞集団を選別し、それによって前記Ｔ細胞受容体を同定することと
    を含む、方法。
  43. 前記細胞集団が、ヒト初代Ｔ細胞を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ｐＭＨＣが、シグナルペプチド、ＰＭＨＣ、Ｇ４Ｓリンカー、ｂ２ｍ遺伝子、Ｇ４Ｓリンカー、及びＭＨ対立遺伝子を直列に含むＲＮＡによってコードされる、請求項４２に記載の方法。
  45. ウイルスＲＮＡのシングルセルシーケンシングを行って、前記ＭＨＣペプチドの配列を同定するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記細胞受容体の配列のシーケンシングを行って、前記ＭＨＣペプチド及び前記Ｔ細胞受容体の配列を同定するステップをさらに含む方法、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. Ｂ細胞受容体又は抗体を同定する方法であって、
    以下：
    レンチウイルス表面上に提示されたエピトープ、ここで、前記エピトープは、ＩＣＡＭ１膜貫通ドメインと作動可能に連結されている、
    修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン、ここで、前記フソゲンは、前記レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、前記宿主細胞は、細胞内エピトープに対するＢ細胞受容体を含む、
    レンチウイルス構造タンパク質と作動可能に連結されたレポーター導入遺伝子、及び
    バーコード化されたＲＮＡ、
    を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、
    前記レンチウイルスをＢ細胞集団と合わせることと、
    レポーターの存在に基づいて前記細胞集団を選別し、それによって前記Ｂ細胞受容体又は抗体を同定することと
    を含む、方法。
  48. 前記抗原が、細胞表面膜タンパク質、細胞内タンパク質、分泌タンパク質、又はグリコシル化タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
  49. ウイルスＲＮＡのシングルセルシーケンシングを行って、前記抗原及び一致するＢ細胞受容体の配列を同定するステップをさらに含む、請求項４７又は４８に記載の方法。
  50. Ｂ細胞受容体に対する抗原を同定する方法であって、
    請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルスを提供することと、
    前記レンチウイルスをＢ細胞集団と合わせることと、
    レポーターの存在に基づいて前記細胞集団を選別し、それによって前記Ｂ細胞抗原を同定することと
    を含む、方法。
  51. シングルセルマルチオミクスの方法であって、
    以下：
    レンチウイルスの表面上に提示された異種リガンド、
    修飾されたＶＳＶ－Ｇウイルスエンベロープタンパク質を含むフソゲン、ここで、前記フソゲンは、前記レンチウイルスを宿主細胞に融合させることができ、前記宿主細胞は、前記リガンドに対する内因性受容体を含む、
    レンチウイルス構造タンパク質に作動可能に連結されたレポーター導入遺伝子、及び
    ＲＮＡ、ここで、前記ＲＮＡは、抗原配列及びシングルセルシーケンシングのための捕捉タグを含む、
    を含む、操作されたレンチウイルスを提供することと、
    シングルセルレベルでトランスクリプトーム及び表現型情報を同時に取得することと
    を含む、方法。
  52. 前記シングルセルシーケンシングが、液滴ベースのプラットフォームである、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記細胞の表現型が、ＣＩＴＥ－ｓｅｑによる表面マーカーを含む、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記情報が、前記リガンド及び受容体の配列を含む、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記シングルセルマルチオミクスが、全細胞をインプットとして使用する、請求項５１に記載の方法。
  56. 前記シングルセルマルチオミクスが、全細胞をインプットとして使用し、逆転写のステップを含む、請求項５１に記載の方法。
  57. 細胞混合物中の標的細胞集団を選択的に枯渇させるか又は濃縮するための方法であって、
    （ａ）請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作されたレンチウイルス、及び
    （ｂ）細胞混合物であって、
    （ｉ）前記操作されたレンチウイルスの表面上に提示されたリガンドに特異的な受容体を発現する標的細胞集団、及び
    （ｉｉ）前記受容体を発現しない非標的細胞集団、を含む細胞混合物、
    を提供することと、
    前記操作されたレンチウイルスを前記細胞集団と接触させ、核酸又はタンパク質を前記標的細胞にのみ送達することと、
    前記標的細胞集団の増殖を特異的に阻害するか又は前記非標的細胞集団の増殖を阻害する試薬を添加して、それによって前記標的細胞集団を選択的に枯渇させるか又は濃縮する、
    を含む、方法。
  58. 前記標的細胞が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）導入遺伝子を発現し、前記添加される試薬が、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を含むか、又はガンシクロビルである、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記標的細胞が、ｓｈＲＮＡを発現して細胞死受容体ＦＡＳの発現を減少させ、前記標的集団の細胞死を防げる、請求項５７又は５８に記載の方法。
  60. 前記標的細胞集団が、免疫細胞を含む、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記免疫細胞が、Ｂ細胞を含む、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記免疫細胞が、自己反応性免疫細胞である、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記免疫細胞が、健康状態に関連する抗原に対して特異的である、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記健康状態が、増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は微生物感染症である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記増殖性疾患が、がんである、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記微生物感染症が、細菌感染症、ウイルス感染症、又は微小真菌感染症である、請求項６５に記載の方法。
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