JP2025166830A - 新規抗トロポニンｔ抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合する抗体を提供する。
【解決手段】ＣＤＲが以下：軽鎖可変ドメイン中の特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに、重鎖可変ドメイン中の特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むことを特徴とする抗体が提供される。
【選択図】図５
【解決手段】ＣＤＲが以下：軽鎖可変ドメイン中の特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに、重鎖可変ドメイン中の特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むことを特徴とする抗体が提供される。
【選択図】図５
Description
本発明は、心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する新規モノクローナル抗体であって、ＣＤＲが以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むことを特徴とし、ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗体に関する。
本明細書において、特許出願および製造者のマニュアルを含む多数の文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連すると見なされないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに具体的には、参照されるすべての文書は、それぞれ個々の文書が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されたのと同様に参照により組み込まれる。
心筋トロポニンは、心外傷の高感度および特異的なバイオマーカーである。特に心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）は、高度に心臓特異的であり、非心筋または他の組織損傷後に血清中に存在しない。加えてｃＴｎＴは、心筋梗塞を診断するために使用される他のものよりさらに持続性で高感度なバイオマーカーであることが示された。したがって一般に心筋トロポニンは、急性心筋虚血を診断するために一般に有用であり、ｃＴｎＴは特に有用である。
心筋トロポニンＴは、心疾患を有する患者において広く使用されるバイオマーカーである。心疾患を有する患者におけるその有用性は、Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎら、（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １４（２０１７）４７３～４８３によって近年概説された。ｃＴｎＴの使用は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を有することが疑われる患者において十分確立されているが、トロポニン測定は他の急性および非急性の状況においても使用される。ＡＭＩを有することが疑われる患者において、早期の意思決定は、迅速な処置およびさらなる診断評価を可能にするために極めて重要である。
トロポニンに対する新規の高感度アッセイは、明確にさらに低い濃度の検出を可能にする。これらのアッセイおよび非常に低いカットオフ濃度を使用して、いくつかの迅速な診断戦略が、急性の心臓の治療における診断を改善したことが報告された。さらに、トロポニンアッセイの非冠状動脈および非急性適用が、例えば心不全、肺塞栓または安定環状動脈疾患を有する患者におけるバイオマーカーとして、見込まれており、個々のリスク層別化を改善する可能性がある。
心筋トロポニンＴは、通常、少なくとも１つの抗体がｃＴｎＴを捕捉するために使用され、少なくとも第２の（標識化）抗体が試料中のｃＴｎＴを検出するために使用されるサンドイッチ型イムノアッセイで測定される。Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙによって販売されているｃＴｎＴに対する第５世代アッセイの場合も同様である。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＧＢに寄託された融合細胞クローン７．１ Ａ １２．２－２２（ＥＣＡＣＣ ８９０６０９０１）によって産生されるモノクローナル抗体１２．１Ａ１１．１１－７は、ｃＴｎＴに対するアッセイにおける最良の検出抗体としておよそ３０年間使用されている。１９８９年にこの抗体が生成されて以来、ｃＴｎＴの検出のためのさらに良好なモノクローナル抗体は現れていない。
過去数年間にわたって、種々のトロポニンの測定のためのこれまで以上に高感度のアッセイが、例えばかかるアッセイにおいて使用される検出抗体の標識のための最新の技術に基づいて、開発された。
多数の研究は、トロポニンに対する種々の高感度アッセイを、ＡＭＩを有することが疑われる患者のトリアージを改善する可能性および臨床診断の他の分野におけるそれらの有用性の両方について評価した。
最良の高感度トロポニンアッセイでさえ、ある一定の百分率で健康な個体におけるトロポニンを測定できないことが報告された（例えば、上記Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎら、を参照されたい）。明らかにアッセイ感度が、例えばｃＴｎＴの検出において最も重要であり、その目的のための改善は非常に望ましい。
この必要性は、特許請求の範囲において定義される実施形態を提供することによって本発明によって対処される。
抗体とｃＴｎＴとの複合体形成に悪影響を与えない一方で、ｃＴｎＴとかかる変異体抗体との間に形成される複合体の安定性に関して顕著な改善を示す、ある特定の変異が、抗体１２．１Ａ１１．１１－７の相補性決定領域（ＣＤＲ）に導入され得ることが驚くべきことに見出された。これらの驚くべき特性を介して、優れた感度を有するｃＴｎＴに対するアッセイは、実現可能である。
抗体とｃＴｎＴとの複合体形成に悪影響を与えない一方で、ｃＴｎＴとかかる変異体抗体との間に形成される複合体の安定性に関して顕著な改善を示す、ある特定の変異が、抗体１２．１Ａ１１．１１－７の相補性決定領域（ＣＤＲ）に導入され得ることが驚くべきことに見出された。これらの驚くべき特性を介して、優れた感度を有するｃＴｎＴに対するアッセイは、実現可能である。
したがって本発明は、心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する新規モノクローナル抗体であって、ＣＤＲが以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むことを特徴とし、ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗体に関する。
本発明の抗体は、心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する新規モノクロー
ナル抗体であって、ＣＤＲが以下：
（ａ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに
（ｂ）重鎖可変ドメイン中の
（ｉ）配列番号６のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３、
（ｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１；配列番号８のＣＤＲ２および配列番号１１のＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２および配列番号１３のＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１３のＣＤＲ３、（ｖ）配列番号６のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１０のＣＤＲ３、
（ｖｉ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１１のＣＤＲ３、（ｖｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３、
（ｖｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１０のＣＤＲ３、
（ｉｘ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３、または
（ｘ）配列番号５のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３
から選択される一連のＣＤＲ
のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むことを特徴とする新規モノクローナル抗体として記載される場合もある。
ナル抗体であって、ＣＤＲが以下：
（ａ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに
（ｂ）重鎖可変ドメイン中の
（ｉ）配列番号６のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３、
（ｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１；配列番号８のＣＤＲ２および配列番号１１のＣＤＲ３、（ｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２および配列番号１３のＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１３のＣＤＲ３、（ｖ）配列番号６のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１０のＣＤＲ３、
（ｖｉ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１１のＣＤＲ３、（ｖｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３、
（ｖｉｉｉ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１０のＣＤＲ３、
（ｉｘ）配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３、または
（ｘ）配列番号５のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３
から選択される一連のＣＤＲ
のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むことを特徴とする新規モノクローナル抗体として記載される場合もある。
重鎖可変ドメインに含まれるＣＤＲについて上に示される定義（ｉ）から（ｘ）は、本開示による重鎖ＣＤＲの選択肢の記載を表す。本定義は、本開示において示される重鎖可変ドメインに関連するすべての種々の実施形態における重鎖可変ドメインを記載および定義するために使用され得る。
抗体の全体構造は、当技術分野において周知であり、ジスルフィド結合によって繋がれた２本の重鎖および２本の軽鎖から構成される。重鎖および軽鎖は、それぞれ１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインからなる。抗原への結合特異性は、抗体を形成する軽鎖および重鎖の可変ドメインによってもたらされる。より具体的には、それらの特異性を決定し、特異的リガンドと接触する抗体の部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。ＣＤＲは、分子の最も可変性の部分であり、これらの分子の多様性に寄与する。各可変ドメインには３つのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３があり、４つのフレームワーク領域（ＦＷ）に埋め込まれる。本明細書において使用される場合、ＣＤＲ－ＨＣ（またはＣＤＲ（ＨＣ））は可変重鎖のＣＤＲ領域を示し、ＣＤＲ－ＬＣ（またはＣＤＲ（ＬＣ））は可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。同様に、ＦＷ－ＨＣ（またはＦＷ（ＨＣ））は可変重鎖のフレームワーク領域を示し、ＦＷ－ＬＣ（またはＦＷ（ＬＣ））は可変軽鎖のフレームワーク領域に関する。
本発明により使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、さらなる配列／構成成分が、具体的に述べられる配列および／または構成成分に加えて含まれてよいことを記している。しかし、この用語は、特許請求される主題が述べられる配列および／または構成成分から厳密になることも包含する。
本発明の抗体が述べられるアミノ酸配列より多くを含むこれらの実施形態では、追加的アミノ酸は、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両方に存在し得る。追加的配列は、例えば本明細書において下に詳細に考察されるとおり、例えば精製または検出のために導入された配列を含み得る。さらに、個々の配列は、述べられる配列を「含み」、それらは、追加的アミノ酸をＮ末端もしくはＣ末端または両方に含み得る。
本発明により、抗体は、配列番号１のヒト心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に特異的に結合する。本発明の抗体が上に詳述される追加的アミノ酸を含む場合にも、前記抗体が必然的にｃＴｎＴに特異的に結合しなければならないことは理解される。
用語「特異的に結合する」（本明細書において「特異的に相互作用する」とも称される）は、本発明により、抗体がｃＴｎＴだけに特異的に結合し、異なるタンパク質、具体的には同様の構造の異なるタンパク質、例えばトロポニンＩ（配列番号３３）などと交差反応しないまたは本質的にしないことを意味する。
抗体の特異性を分析するための対応法は、例えばＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓおよびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。好適な研究の非限定的例は、例えば、結合研究、構造的および／または機能的に密接に関連する分子を用いた遮断および競合研究である。これらの研究は、例えばＦＡＣＳ分析、フローサイトメトリー滴定分析（ＦＡＣＳ滴定）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を用いる）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光滴定または放射標識されたリガンド結合アッセイによるなどの方法によって実行され得る。さらなる方法として、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（競合ＥＬＩＳＡを含む）－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、およびＩＲＭＡ－検査が挙げられる。
本発明の内容では、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子全体およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどのその抗原結合断片に関する。さらに、用語は、改変および／または変更された抗体分子、ならびに組換え的にまたは合成的に生成された／合成された抗体に関する。用語「抗体」は、二機能性抗体、三機能性抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体および１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）もしくは抗体融合タンパク質のような抗体構築物も含む。
本明細書において使用される場合、「Ｆａｂ断片」は、１本の軽鎖ならびに１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。「Ｆａｂ’断片」は、１本の軽鎖ならびに、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の領域も含有する１本の重鎖の一部を、鎖間ジスルフィド結合がＦ（ａｂ’）２分子を形成するように２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖の間に形成され得るように含有する。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本の軽鎖および、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する２本の重鎖を、鎖間ジスルフィド結合が２本の重鎖の間に形成されるように含有する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖の間のジスルフィド結合によって互いに合わさっている２つのＦａｂ’断片から構成される。
Ｆａｂ／ｃ断片は、ＦｃおよびＦａｂ決定基の両方を含有し、ここで「Ｆｃ」領域は抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２つ以上ジスルフィド結合によって、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって互いに合わさっている。
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。「１本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」とも略される）は、本発明の内容では、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを有する抗体断片であり、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在している。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のため
の望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。１本鎖抗体の産生について記載される技術は、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．１１３（１９９４）、２６９～３１５に記載されている。
の望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。１本鎖抗体の産生について記載される技術は、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．１１３（１９９４）、２６９～３１５に記載されている。
本明細書において使用される場合、用語「完全ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。それでもなお、完全ヒト抗体は、マウスにおいて、マウス細胞において、もしくはマウス細胞由来の融合細胞において産生された場合はマウス（murine）炭水化物鎖を含む場合がある、またはラットにおいて、ラット細胞において、もしくはラット細胞由来の融合細胞において産生された場合はラット炭水化物鎖を含む場合がある。同様に、完全ヒト抗体は、ハムスターにおいて、ハムスター細胞、例えばＣＨＯ細胞などにおいて、またはハムスター細胞由来の融合細胞において産生された場合はハムスター炭水化物鎖を含む場合がある。一方、「マウス抗体」または「マウス（murine）抗体」は、マウス（マウス（murine））免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体であり、一方「ラット抗体」または「ウサギ抗体」は、それぞれラットまたはウサギ免疫グロブリン配列のみを含む抗体である。完全ヒト抗体と同様に、かかるマウス（murine）、ラットまたはウサギ抗体は、かかる動物またはかかる動物の細胞において産生される場合に、他の種からの炭水化物鎖を含有する場合がある。例えば抗体は、ハムスター細胞、例えばＣＨＯ細胞などにおいて、またはハムスター細胞由来の融合細胞において産生された場合はハムスター炭水化物鎖を含む場合がある。完全ヒト抗体は、例えば、完全ヒト抗体の産生およびスクリーニングを可能にする広く使用されているスクリーニング技術であるファージディスプレイによって産生され得る。同様に、ファージ抗体は、本発明の内容において使用され得る。ファージディスプレイ法は、例えばＵＳ５，４０３，４８４、ＵＳ５，９６９，１０８およびＵＳ５，８８５，７９３に記載されている。完全ヒト抗体の開発を可能にする別の技術は、マウス融合細胞技術の改変を含む。マウスは、それら自体のマウス遺伝子の代わりにヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するようにトランスジェニックにされる（例えば、ＵＳ５，８７７，３９７を参照されたい）。
用語「キメラ抗体」は、ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）のいずれかの別の種由来の抗体領域（例えば、定常領域）に融合されたまたはそれとキメラ化された、ヒトまたは非ヒト種の可変領域を含む抗体を指す。
上述のとおり、用語「抗体」は、抗体融合タンパク質などの抗体構築物も包含し、ここで抗体は、具体的なアミノ酸配列によって本明細書において定義されるドメインに加えて、例えば組換え的に産生された構築物の単離および／または調製のための追加的ドメイン（複数可）を含む。
本発明の抗体は、本発明において開示および定義されるＣＤＲを含む組換え抗体、例えば組換えヒト抗体またはヘテロハイブリッド抗体であるように産生され得る。
用語「組換え抗体」として、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製もしくは単離された抗体、などの組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべての抗体が挙げられる。組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域（存在する場合）を有する。しかし、かかる抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異導入（または、ヒトＩｇ配列についてのトランスジェニック動物が使用される場合はｉｎ ｖｉｖｏ体細胞変
異導入）に供されてよく、それにより組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連する一方で、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在しない配列である。
用語「組換え抗体」として、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製もしくは単離された抗体、などの組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべての抗体が挙げられる。組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域（存在する場合）を有する。しかし、かかる抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異導入（または、ヒトＩｇ配列についてのトランスジェニック動物が使用される場合はｉｎ ｖｉｖｏ体細胞変
異導入）に供されてよく、それにより組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連する一方で、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在しない配列である。
用語「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物に由来する軽鎖および重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス（murine）軽鎖と会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例として、キメラおよびヒト化抗体が挙げられる。
本発明による抗体は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲの述べられた組合せを含む。ＣＤＲが組み込まれるそれぞれの可変ドメインの周囲のフレームワーク配列は、さらなる負担を伴うことなく当業者によって選択され得る。例えば、下にさらに記載されるフレームワーク配列または添付の実施例において使用される具体的なフレームワーク配列は、使用され得る。
本発明によりＣＤＲは、具体的に述べられた配列を含むことができる、または最大１個のアミノ酸置換においてそれから異なっていてよい。そのため、各ＣＤＲ中の１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸によって置き換えられてよい。アミノ酸置換は、１本鎖のまたは１つの抗体のＣＤＲの一部に存在するが、すべてにおいてではないことも包含されることは、理解される。
本発明により用語「置換」は、アミノ酸の別のアミノ酸での置き換えを指す。したがって、アミノ酸の総数は同じままである。ある特定の位置でのアミノ酸の欠失および、異なる位置での１つ（もしくは複数の）アミノ酸（複数可）の導入は、用語「置換」によって明確に包含されない。本発明による置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよい。用語「保存的アミノ酸置換」は、当技術分野において周知であり、同様の構造的および／または化学的特性を有する異なるアミノ酸を用いたアミノ酸の置き換えを指す。かかる類似性として、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性が挙げられる。アミノ酸置換は、以下の群の１つのアミノ酸の１つが、同じ群の別のアミノ酸によって置換されている場合に保存的アミノ酸置換である：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる非極性（疎水性）アミノ酸；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる極性中性アミノ酸；アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる正荷電を有する（塩基性）アミノ酸；ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる負荷電を有する（酸性）アミノ酸。一実施形態では、任意（またはすべて）のＣＤＲにおける置換は、保存的アミノ酸置換である。同様に１つまたは複数のＣＤＲにおいてかかる置換アミノ酸を有する抗体が、必然的に配列番号１のｃＴｎＴに特異的に結合する抗体でなければならないことは理解される。
一実施形態では、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体は、（ｉ）軽鎖可変ドメイン中のＣＤＲが配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３またはＣＤＲあたり最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含み、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中のＣＤＲが配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗体であって、ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、Ｃ
ＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗体である。
ＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗体である。
一実施形態では本発明は、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、ＣＤＲが以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むことを特徴とし、ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗体を開示する。
さらに本発明は、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、
式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、
ならびに式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、
ＦＷが以下：
軽鎖における
ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号１５のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１６のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１７のアミノ酸配列；
および重鎖における
ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号２０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号２１のアミノ酸配列；
のアミノ酸配列またはこれらに少なくとも８５％同一であるその変種を含み、
ＣＤＲが、以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２
が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする、あるいはＣＤＲあたり最大１個のアミノ酸置換において異なっているこれらのＣＤＲの変種を含む抗体にも関する。
式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、
ならびに式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、
ＦＷが以下：
軽鎖における
ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号１５のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１６のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１７のアミノ酸配列；
および重鎖における
ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号２０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号２１のアミノ酸配列；
のアミノ酸配列またはこれらに少なくとも８５％同一であるその変種を含み、
ＣＤＲが、以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２
が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする、あるいはＣＤＲあたり最大１個のアミノ酸置換において異なっているこれらのＣＤＲの変種を含む抗体にも関する。
さらに本発明は、式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、
ならびに式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含む抗ｃＴｎＴ抗体であって、ＦＷが以下：
軽鎖における
ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号１５のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１６のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１７のアミノ酸配列；
および重鎖における
ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号２０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号２１のアミノ酸配列；
のアミノ酸配列またはこれらに少なくとも８５％同一であるその変種を含み、
ＣＤＲが、以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗ｃＴｎＴ抗体を開示する。
ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、
ならびに式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含む抗ｃＴｎＴ抗体であって、ＦＷが以下：
軽鎖における
ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号１５のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１６のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１７のアミノ酸配列；
および重鎖における
ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号２０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号２１のアミノ酸配列；
のアミノ酸配列またはこれらに少なくとも８５％同一であるその変種を含み、
ＣＤＲが、以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗ｃＴｎＴ抗体を開示する。
式Ｉに示される一次構造は、Ｎ末端からＣ末端への本発明の抗体の軽鎖可変ドメインの構成成分の順序を表す。式ＩＩに示される一次構造は、Ｎ末端からＣ末端への本発明の抗体の重鎖可変ドメインの構成成分の順序を表す。各場合において、フレームワーク領域（ＦＷ）１は、それぞれの可変鎖ドメインの最もＮ末端部分を表し、一方ＦＷ４は、それぞれの可変鎖ドメインの最もＣ末端部分を表す。
上に定義されるとおり、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、列挙したアミノ酸配列を「含む」。一実施形態では、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、前記アミノ酸配列からなる、すなわち本発明の抗トロポニンＴ抗体の軽鎖可変ドメイン（複数可）および重鎖可
変ドメイン（複数可）は、それぞれ式Ｉおよび式ＩＩにおいて表されるＦＷおよびＣＤＲからなり、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、列挙されたアミノ酸配列からなる。
変ドメイン（複数可）は、それぞれ式Ｉおよび式ＩＩにおいて表されるＦＷおよびＣＤＲからなり、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、列挙されたアミノ酸配列からなる。
ＣＤＲおよびその変種に関して、上に提供される定義および具体的に例示される実施形態を準用する。
フレームワーク領域に関して、ある特定の程度の変動も本明細書において想定される、すなわち個々のＦＷは、具体的に述べられるアミノ酸配列またはそれに少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。好ましくは、同一性は少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２．５％、より好ましくは少なくとも９５％であり、さらにより好ましくは同一性は、少なくとも９９％などの少なくとも９８％であり、最も好ましくは同一性は、少なくとも９９．５％である。異なるＦＷについて、実際の配列、ならびに例えばそれぞれのＦＷ配列の長さおよびそれぞれの可変鎖ドメイン内のその位置に依存して、異なる程度の配列同一性が許容可能であり得ることは理解される。
フレームワーク領域に関して、ある特定の程度の変動も本明細書において想定される、すなわち個々のＦＷは、具体的に述べられるアミノ酸配列またはそれに少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。好ましくは、同一性は少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２．５％、より好ましくは少なくとも９５％であり、さらにより好ましくは同一性は、少なくとも９９％などの少なくとも９８％であり、最も好ましくは同一性は、少なくとも９９．５％である。異なるＦＷについて、実際の配列、ならびに例えばそれぞれのＦＷ配列の長さおよびそれぞれの可変鎖ドメイン内のその位置に依存して、異なる程度の配列同一性が許容可能であり得ることは理解される。
本発明により、用語「％配列同一性」は、２つ以上のアライメントされたアミノ酸配列の同一アミノ酸のマッチ（「ヒット」）数を、アミノ酸配列の長さ全体（またはその比較される部分全体）を構成するアミノ酸残基数と比較して記載する。同一性パーセントは、同一残基の数を残基の総数で割り、商に１００を掛けることによって決定される。言い換えると、アライメントを使用して、同じであるアミノ酸残基の百分率（例えば、８５％同一性）は、２つ以上の（サブ）配列が、当技術分野において公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定される、比較ウインドウにわたるまたは指定の領域にわたる最大の対応について比較およびアライメントされる場合、または手作業でアライメントされ、目視で検査された場合に、２つ以上の配列またはサブ配列について決定され得る。
当業者は、例えばＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、［１９９７］Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２）、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、［１９９４］Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３～４６８０）またはＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．［１９８８］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４～２４４８）に基づくものなどのアルゴリズムを使用して、配列間の／内のパーセント配列同一性をどの様に決定するかを公知である。一実施形態では、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、本発明により使用される。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、および期待値（Ｅ）１０を初期設定として使用する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．［１９９２］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５～１０９１９）は、配列比較（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用する。したがってこれらの実施形態では、％配列同一性が示される場合、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された少なくとも８５％の配列同一性を有するすべてのアミノ酸配列は、前記実施形態の範囲内である。
具体的に述べられたそれぞれのアミノ酸配列と比較した、フレームワーク領域における変動の上に記載の程度は、アミノ酸（複数可）の置換、挿入、付加または欠失によるものであり得る。
用語「置換」は、本明細書において上で定義された。１つより多いアミノ酸が置換される場合、各アミノ酸は独立に別のアミノ酸を用いて置換される、すなわち除去される各アミノ酸について異なるアミノ酸が同じ位置に導入される。
用語「挿入」は、本発明により、１つまたは複数のアミノ酸の具体的に述べられるアミ
ノ酸配列への付加を指し、ここで付加は、ポリペプチドのＮまたはＣ末端への付加ではない。
ノ酸配列への付加を指し、ここで付加は、ポリペプチドのＮまたはＣ末端への付加ではない。
用語「付加」は、本発明により、１つまたは複数のアミノ酸の具体的に述べられるアミノ酸配列へのポリペプチドのＮもしくはＣ末端へのまたは両方への付加を指す。
本発明により使用される場合、用語「欠失」は、具体的に述べられるアミノ酸配列から１つまたは複数のアミノ酸を失うことを指す。
本発明により使用される場合、用語「欠失」は、具体的に述べられるアミノ酸配列から１つまたは複数のアミノ酸を失うことを指す。
一実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列における変動は、アミノ酸（複数可）の置換による。本明細書において上で定義されたとおり置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよい。用語「置換」に関して上に提供された定義および具体的に例示された実施形態を準用する。一実施形態では、フレームワーク領域中の置換は、保存的アミノ酸置換である。
さらなる実施形態では、ＣＤＲは、上に列挙した具体的な配列からなり（すなわち、いかなる変動も含まない）、上に列挙したフレームワーク領域（ＦＷ）は、上に列挙した具体的な配列内に最大で以下の量のアミノ酸変動を含む：
ＦＷ（ＬＣ）１ 最大３個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）２ 最大２個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）３ 最大４個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）４ 最大１個のアミノ酸変動；および
ＦＷ（ＨＣ）１ 最大３個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＨＣ）２ 最大２個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＨＣ）３ 最大４個のアミノ酸変動；および
ＦＷ（ＨＣ）４ 最大個の１アミノ酸変動。
ＦＷ（ＬＣ）１ 最大３個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）２ 最大２個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）３ 最大４個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）４ 最大１個のアミノ酸変動；および
ＦＷ（ＨＣ）１ 最大３個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＨＣ）２ 最大２個のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＨＣ）３ 最大４個のアミノ酸変動；および
ＦＷ（ＨＣ）４ 最大個の１アミノ酸変動。
さらなる実施形態では、ＦＷにおけるアミノ酸変動は、置換である。
さらなる実施形態では、軽鎖または重鎖可変ドメインフレームワーク領域に存在する変動の総量は、例えば最大８個のアミノ酸置換など、例えば最大６個のアミノ酸置換、最大４個のアミノ酸置換など、例えば最大３個のアミノ酸置換、最大２個のアミノ酸置換などの最大９個のアミノ酸置換である。さらなる実施形態では、軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域１から４を合わせた中に、または重鎖可変ドメインのフレームワーク領域１から４を合わせた中に１個だけのアミノ酸置換がある。
さらなる実施形態では、軽鎖または重鎖可変ドメインフレームワーク領域に存在する変動の総量は、例えば最大８個のアミノ酸置換など、例えば最大６個のアミノ酸置換、最大４個のアミノ酸置換など、例えば最大３個のアミノ酸置換、最大２個のアミノ酸置換などの最大９個のアミノ酸置換である。さらなる実施形態では、軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域１から４を合わせた中に、または重鎖可変ドメインのフレームワーク領域１から４を合わせた中に１個だけのアミノ酸置換がある。
ＦＷとして本明細書に定義される式Ｉおよび式ＩＩの一部が、可変鎖領域のフレームまたはスキャホールドの一部を形成するアミノ酸配列であることから、前記配列内、特に保存的アミノ酸置換の形態での置換は、多くの場合、抗ｃＴｎＴ抗体の結合能力に影響を与えない。これは、これらのアミノ酸が典型的にはｃＴｎＴへの結合に直接関与しないこと、および好適な代替的アミノ酸へのそれらの置換がタンパク質の三次元構造およびフォールディングへの変化が生じないように設計され得るためである。一方、かかる置換は、ある種の宿主における発現の改善または例えば追加的ジスルフィド架橋の導入によるタンパク質の安定性についてなど多数の有益な効果をもたらし得る。
抗体の「結合親和性」は、以下の式：
Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ
式中：
Ｋｄ＝解離平衡定数［Ｍ］
ｋｄ＝解離速度定数［ｓ－１］
ｋａ＝結合速度定数［Ｍ－１ｓ－１］
に従って標的抗原上のエピトープと抗体の結合部位との間の相互作用の強度を測定する。
Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ
式中：
Ｋｄ＝解離平衡定数［Ｍ］
ｋｄ＝解離速度定数［ｓ－１］
ｋａ＝結合速度定数［Ｍ－１ｓ－１］
に従って標的抗原上のエピトープと抗体の結合部位との間の相互作用の強度を測定する。
抗体の結合親和性についてのさらなる関連パラメーターは、以下のとおりである：
ｔ／２＝解離複合体（dissociation complex）半減期＝ｌｎ２／ｋｄ／６０［分］
Ｒｍａｘ＝分析物の最大応答［ＲＵ］
ＭＲ：モル比＝分析物の最大応答（Ｒｍａｘ）比
一実施形態では、本明細書において上に開示されるｃＴｎＴに対するモノクローナル抗体は、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有してｃＴｎＴに結合する。
ｔ／２＝解離複合体（dissociation complex）半減期＝ｌｎ２／ｋｄ／６０［分］
Ｒｍａｘ＝分析物の最大応答［ＲＵ］
ＭＲ：モル比＝分析物の最大応答（Ｒｍａｘ）比
一実施形態では、本明細書において上に開示されるｃＴｎＴに対するモノクローナル抗体は、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有してｃＴｎＴに結合する。
本発明は、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択される重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体であって、
ヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合し、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有する抗体にさらに関する。
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択される重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体であって、
ヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合し、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有する抗体にさらに関する。
同様に本発明において開示されるのは、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン
を含む抗体であって、
ＣＤＲが以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、
ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とし、
ヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合し、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有する抗体である。
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン
を含む抗体であって、
ＣＤＲが以下：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、
ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とし、
ヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合し、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有する抗体である。
一実施形態では本開示は、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体に関する。
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体に関する。
本発明の抗ｃＴｎＴ抗体に関して本明細書で上に提供されるすべての定義および具体的
例示的実施形態、特に多様性の言及される程度および種類を準用する。
本発明により、ｃＴｎＴへの改善された結合特性（より良好なＫＤ値）を有し、それにより以前のアッセイと比較して優れた感度を有してｃＴｎＴの検出を可能にする新規抗ｃＴｎＴ抗体が提供される。
例示的実施形態、特に多様性の言及される程度および種類を準用する。
本発明により、ｃＴｎＴへの改善された結合特性（より良好なＫＤ値）を有し、それにより以前のアッセイと比較して優れた感度を有してｃＴｎＴの検出を可能にする新規抗ｃＴｎＴ抗体が提供される。
用語「ＫＤ」は、平衡解離定数（平衡結合定数の逆数）を指し、当技術分野において示される定義に従って本明細書において使用される。ＫＤ値を決定するための手段および方法は、下に簡潔に示され、示される実施例において詳細に記載される。
抗体、例えば抗ｃＴｎＴ抗体の結合特性は、Ｂｉａｃｏｒｅ技術が同義になる表面プラズモン共鳴分光法などのリアルタイムバイオセンサーに基づく分子相互作用測定を介して最も良好に決定される。実験の詳細は、実施例５に示され、動態学的データは、表３に示される。例えば、表３における組合せ「１２」として表示される抗体は、ｃＴｎＴへの改善された結合特性、すなわち、１．１８Ｅ＋０６１／Ｍｓの結合定数（ｋａ）；３．７Ｅ－０４の解離定数（ｋｄ）（約３１分間の解離についての半減時間、それにより３．２Ｅ－１０Ｍの全体的親和性定数（ＫＤ）に置き換えられる）を有する。
本発明において開示され、特許請求される変異抗体は、驚くべきことに抗体とｃＴｎＴとの複合体形成に悪影響を与えず、全ての変異抗体のＫａは親抗体についてと同じ範囲内である。他方で、良好なＫＤ値に置き換えられるｃＴｎＴとの間に形成された複合体の安定性に関する顕著な改善が達成され得る。
一実施形態では、本明細書において上に開示される本発明によるモノクローナル抗体は、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有してｃＴｎＴに結合する。
一般に、低いＫＤ値は、当技術分野において周知のとおり、より高いまたは改善された親和性に対応する。一実施形態では、変異体抗ｃＴｎＴ抗体は、５．８Ｅ－１０ＭのＫＤを有する親抗体のＫＤに等しいまたはより低い結合親和性を有する。
一般に、低いＫＤ値は、当技術分野において周知のとおり、より高いまたは改善された親和性に対応する。一実施形態では、変異体抗ｃＴｎＴ抗体は、５．８Ｅ－１０ＭのＫＤを有する親抗体のＫＤに等しいまたはより低い結合親和性を有する。
改変軽鎖および重鎖領域について上に述べられた配列は、添付の実施例において使用されたアミノ酸配列である。
本発明は、本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子にさらに関する。この核酸分子は、本明細書において本発明の第１の核酸分子と称される。さらに本発明は、本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子にも関する。この核酸分子は、本明細書において本発明の第２の核酸分子と称される。
本発明は、本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子にさらに関する。この核酸分子は、本明細書において本発明の第１の核酸分子と称される。さらに本発明は、本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子にも関する。この核酸分子は、本明細書において本発明の第２の核酸分子と称される。
本発明により、用語「核酸分子」は、本明細書において核酸配列またはポリヌクレオチドとも称され、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなどのＤＮＡを含む。
本発明の核酸分子は、例えば標準的化学合成方法および／もしくは組換え法によって合成され得る、または例えば化学合成と組換え法を組み合わせることによって半合成的に産生され得る。コード配列の転写制御エレメントへの、および／または他のアミノ酸コード配列へのライゲーションは、制限消化、ライゲーションおよび分子クローニングなどの確立された方法を使用して実行され得る。
本発明の核酸分子は、例えば標準的化学合成方法および／もしくは組換え法によって合成され得る、または例えば化学合成と組換え法を組み合わせることによって半合成的に産生され得る。コード配列の転写制御エレメントへの、および／または他のアミノ酸コード配列へのライゲーションは、制限消化、ライゲーションおよび分子クローニングなどの確立された方法を使用して実行され得る。
本発明により、本発明の第１の核酸分子は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉ）本明細書において上に定義される式Ｉのアミノ酸配列からなる；または
（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
軽鎖可変領域をコードする。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉ）本明細書において上に定義される式Ｉのアミノ酸配列からなる；または
（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
軽鎖可変領域をコードする。
同様に、本発明の第２の核酸分子は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖ）配列番号６のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；（ｉｘ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｘ）配列番号５のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｘｉ）本明細書において上に定義される式ＩＩのアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；または
（ｘｉｖ）配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
（ｘｖ）配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｖｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；または
（ｘｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｘ）配列番号３０のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；または
（ｘｘ）配列番号３１のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
（ｘｘｉ）配列番号３２のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
重鎖可変領域をコードする。
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖ）配列番号６のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；（ｉｘ）配列番号７のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｘ）配列番号５のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列もしくは最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むＣＤＲ３を含む；
（ｘｉ）本明細書において上に定義される式ＩＩのアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；または
（ｘｉｖ）配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
（ｘｖ）配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｖｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；または
（ｘｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｘ）配列番号３０のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；または
（ｘｘ）配列番号３１のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
（ｘｘｉ）配列番号３２のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
重鎖可変領域をコードする。
本発明は、本発明の第１の核酸分子、すなわち本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクターにさらに関する。本発明は、本発明の第２の核酸分子、すなわち本明細書において上に定義される本発明の抗体のいずれか１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクターにさらに関する。かかるベクターは、本明細書において「本発明の個別のベクター（複数可）」とも称される。
多数の好適なベクターが分子生物学の当業者に公知であり、その選択は所望の機能に依存する。ベクターの非限定的例として、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび例えば遺伝子工学において慣用されている他のベクターが挙げられる。当業者に周知である方法は、種々のプラスミドおよびベクターを構築するために使用できる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（同上）およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、（１９９４）に記載される技術を参照されたい。
一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。本発明による発現ベクターは、宿主において本発明の核酸分子の複製および発現を方向付けることができ、それにより、選択された宿主においてそれによりコードされた本発明の抗トロポニンＴ抗体の可変鎖ドメインの発現をもたらす。さらなる実施形態では、ベクター（複数可）は、本発明の前記可変鎖ドメインだけでなく、本発明の前記可変鎖ドメインを含む全長ＩｇＧ抗体も発現されることを確実にするためのさらなる配列を含む。
発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクターまたはインテグレーティングベクターであり得る。発現は、核酸分子の、例えば翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。一実施形態では、ベクターは、モノクローナルウサギ抗体の重鎖および／または軽鎖の一過的組換え発現のための真核生物発現プラスミドである。かかるベクターは、抗体発現のためだけでなく、例えば真核細胞、例えばＨＥＫ２９３もしくはその誘導体またはＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによる抗体産物のために特に開発された。
ベクターの非限定的例として、ｐＱＥ－１２、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、発現ベクターのｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）もしくはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１、ｐＪＯＥ、ｐＢ
ＢＲ１－ＭＣＳシリーズ、ｐＪＢ８６１、ｐＢＳＭｕＬ、ｐＢＣ２、ｐＵＣＰＫＳ、ｐＴＡＣＴ１、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴ、Ｅ－０２７ ｐＣＡＧ Ｋｏｓａｋ－Ｃｈｅｒｒｙ（Ｌ４５ａ）ベクターシステム、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ－ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ－１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ－１０（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ－Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに対する好適なプラスミドベクターの非限定的例は、例えばプラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ３．５Ｋ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。Ｘｅｎｏｐｕｓ胚、ゼブラフィッシュ胚ならびに多種多様な哺乳動物および鳥類細胞においてタンパク質を発現するために好適な別のベクターは、多目的発現ベクターｐＣＳ２＋である。
ＢＲ１－ＭＣＳシリーズ、ｐＪＢ８６１、ｐＢＳＭｕＬ、ｐＢＣ２、ｐＵＣＰＫＳ、ｐＴＡＣＴ１、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴ、Ｅ－０２７ ｐＣＡＧ Ｋｏｓａｋ－Ｃｈｅｒｒｙ（Ｌ４５ａ）ベクターシステム、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ－ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ－１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ－１０（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ－Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに対する好適なプラスミドベクターの非限定的例は、例えばプラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ３．５Ｋ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。Ｘｅｎｏｐｕｓ胚、ゼブラフィッシュ胚ならびに多種多様な哺乳動物および鳥類細胞においてタンパク質を発現するために好適な別のベクターは、多目的発現ベクターｐＣＳ２＋である。
一般に、ベクターは、１つまたは複数の複製開始点（ｏｒｉ）およびクローニングまたは発現のための遺伝系、宿主における選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば、抗菌薬耐性ならびに１つまたは複数の発現カセットを含有することができる。加えて、ベクターに含まれるコード配列は、転写制御エレメントおよび／または他のアミノ酸コード配列に、確立された方法を使用してライゲートされてよい。かかる制御配列は、当業者に周知であり、限定されることなく、転写の開始を確実にする制御配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ，Ｇ．Ｃ．ら、［２００１］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４７１～１４７６）ならびに任意選択で転写の終了および転写物の安定化を確実にする制御エレメントを含む。転写の開始を確実にするかかる制御エレメントの非限定的例は、プロモーター、翻訳開始コドン、エンハンサー、インスレーターおよび／または転写終結を確実にする制御エレメントを含み、これらは本発明の核酸分子の下流に含まれるものである。さらなる例として、Ｋｏｚａｋ配列ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位が隣接する介在配列、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列または、使用される発現系に応じて、細胞性コンパートメントへまたは培養培地へ発現されたタンパク質を方向付けることができるシグナル配列が挙げられる。ベクターは、正しいタンパク質フォールディングを促進するための１つまたは複数のシャペロンをコードする追加的な発現可能なポリヌクレオチドも含有する場合がある。
好適な複製開始点の追加的例として、例えば全長ＣｏｌＥ１、切断型ＣｏｌＥＩ、ＳＶ４０ウイルス性およびＭ１３複製開始点が挙げられる一方で、好適なプロモーターの追加的例として、限定されることなく、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫（Rous sarcome）ウイルス）、ｌａｃＺプロモーター、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧ－プロモーター（ニワトリβ－アクチンプロモーターとサイトメガロウイルス最初期エンハンサーとの組合せ）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１α－プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターＣａＭ－キナーゼプロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーター、Ｔ７もしくはＴ５プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体ウイルス（multiple nuclear polyhedrosis virus）（ＡｃＭＮＰ
Ｖ）多角体プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるグロビンイントロンが挙げられる。エンハンサーの一例は、例えばＳＶ４０エンハンサーである。転写終結を
確実にする制御エレメントについての非限定的な追加的例として、ＳＶ４０－ポリＡ部位、ｔｋ－ポリＡ部位、ｒｈｏ－非依存性ｌｐｐターミネーターまたはＡｃＭＮＰＶ多角体ポリアデニル化シグナルが挙げられる。選択可能マーカーのさらなる非限定的例として、メトトレキサートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４）、１４３～１４９）、アミノグリコシド ネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン（paromycin）に対する耐性を
付与するｎｐｔ （Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａ、ＥＭＢＯ Ｊ．２（１９８３）、９８７～９９５）ならびに、ハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ、Ｇｅｎｅ ３２（１９８４）、４８１～４８５）が挙げられる。追加的な選択可能遺伝子は、記載されており、すなわちｔｒｐＢ、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにする；ｈｉｓＤ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにする（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８）、８０４７）；マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、細胞がマンノースを利用できるようにする（ＷＯ９４／２０６２７）、およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与する（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８７、Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．）またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のデアミナーゼ、ブラストサイジンＳに対する耐性を付与する（Ｔａｍｕｒａ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５）、２３３６～２３３８）。
Ｖ）多角体プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるグロビンイントロンが挙げられる。エンハンサーの一例は、例えばＳＶ４０エンハンサーである。転写終結を
確実にする制御エレメントについての非限定的な追加的例として、ＳＶ４０－ポリＡ部位、ｔｋ－ポリＡ部位、ｒｈｏ－非依存性ｌｐｐターミネーターまたはＡｃＭＮＰＶ多角体ポリアデニル化シグナルが挙げられる。選択可能マーカーのさらなる非限定的例として、メトトレキサートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４）、１４３～１４９）、アミノグリコシド ネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン（paromycin）に対する耐性を
付与するｎｐｔ （Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａ、ＥＭＢＯ Ｊ．２（１９８３）、９８７～９９５）ならびに、ハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ、Ｇｅｎｅ ３２（１９８４）、４８１～４８５）が挙げられる。追加的な選択可能遺伝子は、記載されており、すなわちｔｒｐＢ、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにする；ｈｉｓＤ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにする（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８）、８０４７）；マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、細胞がマンノースを利用できるようにする（ＷＯ９４／２０６２７）、およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与する（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８７、Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．）またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のデアミナーゼ、ブラストサイジンＳに対する耐性を付与する（Ｔａｍｕｒａ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５）、２３３６～２３３８）。
さらなる実施形態では、ベクターは、イントロンＡを含む５‘ＣＭＶプロモーターおよび３‘ＢＧＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含有する真核生物発現プラスミドである。発現カセットに加えて、プラスミドは、ｐＵＣ１８由来複製開始点および、Ｅ．ｃｏｌｉにプラスミド増幅のためのアンピリシン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含有できる。抗体の分泌のために、真核生物リーダー配列は、抗体遺伝子の５’にクローニングされてよい。
好適な細菌性発現宿主は、例えばＪＭ８３、Ｗ３１１０、ＫＳ２７２、ＴＧ１、Ｋ１２、ＢＬ２１（ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥなど）またはＲｏｓｅｔｔａ由来の株を含む。ベクター改変、ＰＣＲ増幅およびライゲーション技術について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌ［２００１］（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）を参照されたい。
本発明の核酸分子および／またはベクターは、例えば化学に基づく方法（ポリエチレンイミン、リン酸カルシウム、リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、ヌクレオフェクション）、非化学的方法（電気穿孔法、ソノポレーション、光学トランスフェクション（optical transfection）、遺伝子電気泳動転写、水力学的送達（hydrodynamic delivery）また
は細胞を本発明の核酸分子に接触させることで自然に生じる形質転換）、粒子に基づく方法（遺伝子銃、マグネトフェクション、インペールフェクション（impalefection））フ
ァージベクターに基づく方法およびウイルスでの方法による細胞への導入のために設計されてよい。例えば、レトロウイルス、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターは、標的細胞集団への核酸分子の送達のために使用され得る。加えて、バキュロウイルス系も本発明の核酸分子のための真核生物発現系においてベクターとして使用され得る。一実施形態では、本発明の核酸分子および／またはベクターは、リン酸カルシウムによる化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉの形質転換のためおよび／またはポリエチレンイミンもしくはリポフェクタミントランスフェクションによるＨＥＫ２９３および
ＣＨＯの一過性トランスフェクションのために設計される。
は細胞を本発明の核酸分子に接触させることで自然に生じる形質転換）、粒子に基づく方法（遺伝子銃、マグネトフェクション、インペールフェクション（impalefection））フ
ァージベクターに基づく方法およびウイルスでの方法による細胞への導入のために設計されてよい。例えば、レトロウイルス、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターは、標的細胞集団への核酸分子の送達のために使用され得る。加えて、バキュロウイルス系も本発明の核酸分子のための真核生物発現系においてベクターとして使用され得る。一実施形態では、本発明の核酸分子および／またはベクターは、リン酸カルシウムによる化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉの形質転換のためおよび／またはポリエチレンイミンもしくはリポフェクタミントランスフェクションによるＨＥＫ２９３および
ＣＨＯの一過性トランスフェクションのために設計される。
本発明は：
（ｉ）本明細書において上に定義される選択肢（ｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書において上に定義される選択肢（ｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子；
（ｉｉ）本明細書において上に定義される選択肢（ｉｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書において上に定義される選択肢（ｉｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子；または
（ｉｉｉ）本明細書において上に定義される選択肢（ｉｉｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書において上に定義される選択肢（ｉｉｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子
を含むベクターにさらに関する。
（ｉ）本明細書において上に定義される選択肢（ｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書において上に定義される選択肢（ｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子；
（ｉｉ）本明細書において上に定義される選択肢（ｉｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書において上に定義される選択肢（ｉｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子；または
（ｉｉｉ）本明細書において上に定義される選択肢（ｉｉｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書において上に定義される選択肢（ｉｉｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子
を含むベクターにさらに関する。
一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。
本発明のベクター、具体的にはベクターの種類または制御配列に関して、本明細書において上で提供されるすべての定義および具体的に例示される実施形態を準用する。この第２の種類のベクターは、少なくとも２つの核酸分子、すなわち１つは軽鎖可変ドメインをコードし１つは重鎖可変ドメインをコードする２つの核酸分子を含むベクターに関する。上の組合せから明らかであるとおり、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、本発明の機能性抗ｃＴｎＴ抗体の発現が可能であるようにベクターにおいて組み合わされる。この第２の種類のベクターは、本明細書において「本発明の組合せベクター」とも称される。
本発明のベクター、具体的にはベクターの種類または制御配列に関して、本明細書において上で提供されるすべての定義および具体的に例示される実施形態を準用する。この第２の種類のベクターは、少なくとも２つの核酸分子、すなわち１つは軽鎖可変ドメインをコードし１つは重鎖可変ドメインをコードする２つの核酸分子を含むベクターに関する。上の組合せから明らかであるとおり、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、本発明の機能性抗ｃＴｎＴ抗体の発現が可能であるようにベクターにおいて組み合わされる。この第２の種類のベクターは、本明細書において「本発明の組合せベクター」とも称される。
本発明は：
（ｉ）本発明の組合せベクター；または
（ｉｉ）本発明の第１の核酸分子、すなわち本発明による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個別のベクターおよび本発明の第２の核酸分子、すなわち本発明の重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個別のベクターであって、これら２つのベクターが上の選択肢（ｉ）から（ｉｉｉ）に定義される合致する軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクター
を含む宿主細胞または非ヒト宿主にさらに関する。
（ｉ）本発明の組合せベクター；または
（ｉｉ）本発明の第１の核酸分子、すなわち本発明による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個別のベクターおよび本発明の第２の核酸分子、すなわち本発明の重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個別のベクターであって、これら２つのベクターが上の選択肢（ｉ）から（ｉｉｉ）に定義される合致する軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクター
を含む宿主細胞または非ヒト宿主にさらに関する。
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であってよい。用語「原核生物」は、本発明のタンパク質の発現のためにＤＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を用いて形質転換、形質導入またはトランスフェクトされ得るすべての細菌を含むことが意図される。原核生物宿主は、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陰性およびグラム陽性細菌を含み得る。
用語「真核生物」は、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含むことが意図される。典型的な哺乳動物宿主細胞として、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９、Ｐｅｒ．Ｃ６およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ／０、ＳＰ２／０およびＣ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ１またはＣＯＳ７、ＣＶ１、ウズラＱＣ１－３細胞、マウスＬ細胞、マウス肉腫細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。本発明による例示的な哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の好適な真核生物宿主細胞として、限定されることなく、例えばＤＴ４０細胞などのニワトリ細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓなどの酵母が挙げられる。発現のために好適な昆虫細胞は、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｋｃ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９およびＳｆ２１またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ Ｈｉ５細胞である。好適なゼブラフィッシュ細胞株として、限定されることなく、ＺＦＬ、ＳＪＤまたはＺＦ４が挙げられる。
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓなどの酵母が挙げられる。発現のために好適な昆虫細胞は、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｋｃ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９およびＳｆ２１またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ Ｈｉ５細胞である。好適なゼブラフィッシュ細胞株として、限定されることなく、ＺＦＬ、ＳＪＤまたはＺＦ４が挙げられる。
記載されるベクター（複数可）は、宿主のゲノムにインテグレートされ得るか、または染色体外に維持され得るか、のいずれかである。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は核酸分子の高レベル発現のために好適な条件下に維持され、所望により、本発明の抗体の回収および精製が続き得る。上に記載の宿主細胞のために適切な培養培地および条件は、当技術分野において公知である。
一実施形態では、述べられる宿主は、ヒト細胞またはヒト細胞株などの哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、本発明のベクター（複数可）を用いて形質転換される宿主細胞は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯである。またさらなる実施形態では、本発明のベクター（複数可）を用いて形質転換される宿主細胞は、ＣＨＯである。これらの宿主細胞ならびに好適な培地および細胞培養条件は、当技術分野において記載されている、例えばＢａｌｄｉ Ｌ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００５ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２１（１）：１４８～５３、Ｇｉｒａｒｄ Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００２
Ｊａｎ；３８（１－３）：１５～２１およびＳｔｅｔｔｌｅｒ Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００７ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；２３（６）：１３４０～６を参照されたい。
Ｊａｎ；３８（１－３）：１５～２１およびＳｔｅｔｔｌｅｒ Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００７ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；２３（６）：１３４０～６を参照されたい。
本発明による用語「を含むベクター」に関して、本発明の抗ｃＴｎＴ抗体を産生するために宿主細胞に必要および／または十分であるさらなる核酸配列が、ベクター中に存在することは理解される。かかるさらなる核酸配列は、例えば、軽鎖の残部をコードする核酸配列および重鎖の残部をコードする核酸配列である。
本発明による宿主細胞または非ヒト宿主は、本明細書において上に定義される軽鎖および重鎖可変領域の両方をコードする１つのベクターを含むか、または一方のベクターが本発明による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を保有し、第２のベクターが本発明による合致する重鎖可変領域をコードする核酸分子を保有する２つの別々のベクターを含む。したがって、第１のベクターが本明細書において上の選択肢（ｉ）による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を保有する場合、それにより第２のベクターは同様に上の選択肢（ｉ）による重鎖可変領域をコードする核酸分子を保有する。同じことを選択肢（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に準用する。
したがって、各場合において、本明細書において上に記載される結合能力からなる本発明の抗ｃＴｎＴ抗体の産生を確実にするために、１つの抗体分子内に存在することが必要であるこれらの核酸分子の発現は、互いに関連付けられている。
本実施形態による宿主細胞は、例えば、多量の本発明の抗ｃＴｎＴ抗体を産生するために使用され得る。前記宿主細胞は、上に記載のベクター（複数可）を宿主に導入することによって産生される。宿主中の前記ベクター（複数可）の存在は、次に本発明の抗ｃＴｎＴ抗体の上に記載の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸分子の発現を媒介する。本明細書において上に記載のとおり、本発明のベクター（複数可）は、全長ＩｇＧ抗体の発現を可能にする配列をさらに含むことができ、それにより宿主細胞による全長ＩｇＧ抗体の産生をもたらし、ここで前記抗体は、本発明による可変軽鎖および／または重鎖ドメインの存在によって特徴付けられる。
本発明は、配列番号１のｃＴｎＴに特異的に結合する抗体の産生のための方法にさらに関し、方法は本発明の宿主細胞を好適な条件下で培養するステップおよび産生された抗体を単離するステップを含む。
本実施形態により、本発明の宿主中に存在するベクター（複数可）は、発現ベクター（複数可）、または宿主細胞のゲノムへの本発明の核酸分子（複数可）の、その発現が確実である様式での安定なインテグレーションを媒介するベクター（複数可）のいずれかである。本発明の抗ｃＴｎＴ抗体の軽鎖および重鎖ドメインそれぞれをコードする核酸分子が、抗体の発現が確実であるように良好に導入されている宿主細胞の選択のための手段および方法は、当技術分野において周知であり、記載されている（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｓ．Ｍ．＆
Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ，Ｍ．［２００７］Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：４２５～４３２；Ｍａｔａｓｃｉ，Ｍら、［２００８］Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：ｅ３７－ｅ４２；Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．［２００４］Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１３９３～１３９８）。
Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ，Ｍ．［２００７］Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：４２５～４３２；Ｍａｔａｓｃｉ，Ｍら、［２００８］Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：ｅ３７－ｅ４２；Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．［２００４］Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１３９３～１３９８）。
原核または真核生物宿主細胞を培養するための好適な条件は、当業者に周知である。例えば細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの細菌は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、通気下、典型的には４から約３７℃の温度で培養され得る。発現産物の収量および溶解度を増加させるために、培地は、緩衝されてよく、または両者を増強もしくは促進することが公知である好適な添加物を補充されてよい。誘導性プロモーターが宿主細胞に存在するベクター（複数可）中の本発明の核酸分子を調節する場合、ポリペプチドの発現は、例えばアンヒドロテトラサイクリンなどの適切な誘導剤の添加によって誘導され得る。好適な発現プロトコールおよび戦略は、当技術分野において記載されており（例えば、Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら、（２００４）．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、３２～４９においておよびＢａｌｄｉ，Ｌ．ら、（２００７）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９、６７７～６８４において）、必要に応じて、特定の宿主細胞が必要とすることおよび発現されるタンパク質の必要要件に適合され得る。
細胞型およびその具体的な必要要件に依存して、哺乳動物細胞培養は、例えば１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ＥまたはＤＭＥＭ培地において実行されてよい。細胞は、ＤＴ４０ニワトリ細胞では例えば３７℃または４１℃、５％ＣＯ２、水飽和雰囲気中に保たれてよい。
昆虫細胞培養のために好適な培地は、例えばＴＮＭ＋１０％ＦＣＳ、ＳＦ９００またはＨｙＣｌｏｎｅ ＳＦＸ－Ｉｎｓｅｃｔ培地である。昆虫細胞は、通常付着培養または懸濁培養として２７℃で増殖させる。
真核細胞または脊椎動物細胞のための好適な発現プロトコールは、当業者に周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ＆ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．［２００１］（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）から検索され得る。
一実施形態では、方法は、例えばＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞を使用して実行される。さらなる実施形態では、方法は、ＣＨＯ細胞を使用して実行される。
組換え産生手順において使用される宿主に依存して、発現される抗体は、グリコシル化されている場合とされていない場合がある。一実施形態では、プラスミドまたはウイルスは、本発明の抗体のコード配列ならびにそれに遺伝子的に融合されたＮ末端ＦＬＡＧタグ
および／またはＣ末端Ｈｉｓタグを含有して使用される。さらなる実施形態では、前記ＦＬＡＧ－タグの長さは、例えば正確に８アミノ酸などの約４から８アミノ酸である。上に記載されるベクターは、当業者に一般に公知の任意の技術を使用して宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。さらに、融合し、作動可能に連結した遺伝子を調製するため、ならびにそれらを例えば哺乳動物細胞および細菌において発現するための方法は、当技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、同上）。
および／またはＣ末端Ｈｉｓタグを含有して使用される。さらなる実施形態では、前記ＦＬＡＧ－タグの長さは、例えば正確に８アミノ酸などの約４から８アミノ酸である。上に記載されるベクターは、当業者に一般に公知の任意の技術を使用して宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。さらに、融合し、作動可能に連結した遺伝子を調製するため、ならびにそれらを例えば哺乳動物細胞および細菌において発現するための方法は、当技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、同上）。
形質転換された宿主は、バイオリアクターにおいて増殖させることができ、当技術分野において公知の技術によって最適な細胞増殖を達成するように培養され得る。次に本発明の抗体は、増殖培地から単離され得る。例えば、本発明の微生物によって発現された抗体の単離および精製は、例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、ＳｔｒｅｐタグＩＩもしくはＨｉｓ６タグなどの融合タグを使用する）、ゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィー）、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣまたは免疫沈降などの任意の従来の手段によってでよい。これらの方法は、当技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ＆ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．［２００１］（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）に一般に記載されている。
本発明により、用語「産生された抗体を単離すること」が本発明の抗ｃＴｎＴ抗体の単離を指すことは理解される。
本発明は、
（ｉ）本発明の抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸分子、
（ｉｉｉ）本発明のベクター、
（ｉｖ）本発明の宿主細胞、および／または
（ｖ）本発明の方法によって産生された抗体
のうちの少なくとも１つを含む組成物にさらに関する。
本発明は、
（ｉ）本発明の抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸分子、
（ｉｉｉ）本発明のベクター、
（ｉｖ）本発明の宿主細胞、および／または
（ｖ）本発明の方法によって産生された抗体
のうちの少なくとも１つを含む組成物にさらに関する。
本発明により使用される場合、用語「組成物」は、述べられた化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物に関する。それは、任意選択で、本発明の化合物の特徴を変更でき、それによりそれらの機能を、例えば、安定化、モジュレートおよび／または増強するさらなる分子を含み得る。組成物は、固体または液体形態であってよく、とりわけ粉末（複数可）、錠剤（複数可）または溶液（複数可）の形態であってよい。
組成物の構成成分は、１つまたは複数の容器、例えば、密封されたアンプルもしくはバイアルに、水溶液としてまたは再構成のための凍結乾燥製剤として包装されてよい。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌバイアルは５ｍｌの１％（ｗ／ｖ）または１０％（ｗ／ｖ）水溶液を用いて充填され、得られた混合物は凍結乾燥される。使用のための溶液は、例えば、治療使用のための注射用水または別の望ましい溶媒、例えば、診断目的のための緩衝液、のいずれかを使用して凍結乾燥化合物（複数可）を再構成することによって調製される。保存剤および、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどの他の添加剤も存在してよい。
組成物の種々の構成成分は、使用のための説明書を含むキットとして包装されてよい。
一実施形態では、本発明の組成物は、当技術分野において周知のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ法、例えばイムノアッセイなどの方法を当業者が実行できるようにする組成物である。
一実施形態では、本発明の組成物は、当技術分野において周知のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ法、例えばイムノアッセイなどの方法を当業者が実行できるようにする組成物である。
本発明の抗体を利用できるイムノアッセイの例は、直接または間接フォーマットいずれ
かでのイムノアッセイである。かかるイムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または発光、蛍光、化学発光または電気化学発光の検出に基づくイムノアッセイである。
かでのイムノアッセイである。かかるイムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または発光、蛍光、化学発光または電気化学発光の検出に基づくイムノアッセイである。
心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）は、例えば、ＵＳ６，３３３，３９７およびＵＳ６，３７６，２０６においてそれぞれ開示されるサンドイッチイムノアッセイによって最も良好に検出され、ｃＴｎＴの測定のためのアッセイの本質的にすべての続く世代において確認される。第５世代ｃＴｎＴ－アッセイ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙによって販売されているｃＴｎＴ（ｈｓ－ｃＴｎＴ）のための高感度アッセイでは、いまだサンドイッチイムノアッセイ原理が使用されている。このアッセイは、５ｎｇ／ｍｌの検出下限値（ＬＯＤ）を有してｃＴｎＴを検出できることから、高感度アッセイである。この良好なＬＯＤは、使用されるアッセイプロトコールに応じてそれぞれ９または１８分間の全体として非常に短いインキュベーション時間にもかかわらず達成される。このアッセイでは、サンドイッチは、ビオチン化捕捉抗体およびルテニル化（ruthenylated）検出抗体を含んで形成される。この複合体は、ストレプトアビジンコート磁気ビーズに結合し、未結合材料は洗浄除去される。当業者に明らかであるとおり、Ｋｄが顕著でない場合、いくらかの解離が生じ、ＬＯＤの低減に直接転換されるシグナルの低減をもたらすことから、非常に重要である。
当業者に明らかであるとおり、ｃＴｎＴの検出のための方法において本発明による抗体を使用することは有利である。
一実施形態では、本開示は：ａ）試料を本開示による抗ｃＴｎＴ抗体と、抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；ならびにｂ）抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体を測定するステップであって、その複合体の量が試料中のｃＴｎＴの濃度を示す、ステップを含む、試料中のｃＴｎＴを検出する方法に関する。例えば「抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体」における用語「／」は、非共有結合性複合体が、一方の抗ｃＴｎＴ抗体と他方のｃＴｎＴとの間に形成されていることを示すために使用される。
一実施形態では、本開示は：ａ）試料を本開示による抗ｃＴｎＴ抗体と、抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップ；ならびにｂ）抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体を測定するステップであって、その複合体の量が試料中のｃＴｎＴの濃度を示す、ステップを含む、試料中のｃＴｎＴを検出する方法に関する。例えば「抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体」における用語「／」は、非共有結合性複合体が、一方の抗ｃＴｎＴ抗体と他方のｃＴｎＴとの間に形成されていることを示すために使用される。
一実施形態では本発明は：ａ）試料をｃＴｎＴに対する第１の抗体およびｃＴｎＴに対する第２の抗体と、第１の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第２の抗ｃＴｎＴ抗体複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させるステップであって、第２の抗体が検出可能に標識化されている、ステップ；ならびにｂ）（ａ）において形成された複合体を測定するステップであって、複合体の量が試料中のｃＴｎＴの濃度を示し、第１のまたは第２の抗体が本発明による抗体である、ステップを含む、試料中のｃＴｎＴを検出する方法に関する。
当業者に明らかであるとおり、試料は、第１のおよび第２の抗体と任意の望ましい順序で、すなわち最初に第１の抗体、第２の抗体；第１の抗体より先に第２の抗体または同時に、第１の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第２の抗ｃＴｎＴ抗体複合体を形成するために十分な時間および条件下で接触されてよい。
当業者が容易に理解するとおり、特異的抗ｃＴｎＴ抗体とｃＴｎＴ抗原／分析物とのいずれかの間の複合体（＝抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体）の形成、またはｃＴｎＴに対する第１の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）および第２の抗ｃＴｎＴ抗体複合体を含む二次のもしくはサンドイッチ複合体（＝第１の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第２の抗ｃＴｎＴ抗体複合体）の形成のために、適切であるまたは十分である時間および条件を確立することは、日常的な実験に過ぎない。
抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体の検出は、任意の適切な手段によって実施され得る。
当業者は、かかる手段／方法を完全に熟知している。
用語「試料」または「目的の試料」または「検査試料」は、本明細書において互換的に用いられる。試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試料であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分析され、身体に戻されない。試料の例として、これだけに限らないが血液、血清、血漿、滑膜液、尿、唾液およびリンパ液などの液体試料または、組織抽出物、軟骨、骨、滑膜および結合組織などの固形試料が挙げられる。一実施形態では試料は、血液、血清、血漿、滑膜液および尿から選択される。一実施形態では試料は、血液、血清および血漿から選択される。一実施形態では試料は、血清または血漿である。
当業者は、かかる手段／方法を完全に熟知している。
用語「試料」または「目的の試料」または「検査試料」は、本明細書において互換的に用いられる。試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試料であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分析され、身体に戻されない。試料の例として、これだけに限らないが血液、血清、血漿、滑膜液、尿、唾液およびリンパ液などの液体試料または、組織抽出物、軟骨、骨、滑膜および結合組織などの固形試料が挙げられる。一実施形態では試料は、血液、血清、血漿、滑膜液および尿から選択される。一実施形態では試料は、血液、血清および血漿から選択される。一実施形態では試料は、血清または血漿である。
本明細書において使用される場合、用語「参照試料」は、目的の試料と実質的に同一の様式で分析され、その情報が目的の試料のものと比較される試料を指す。それにより参照試料は、目的の試料から得られた情報の評価を可能にする基準を提供する。参照試料は、健康なまたは正常な組織、器官または個体由来であってよく、それにより、組織、器官または個体の健康な状況の基準を提供する。正常な参照試料の状況と目的の試料の状況との間の差異は、疾患発症のリスクまたはかかる疾患もしくは障害の存在もしくはさらなる進行を示し得る。参照試料は、異常なまたは病的な組織、器官または個体由来であってよく、それにより組織、器官または個体の病的な状況の基準を提供する。異常な参照試料の状況と目的の試料の状況との間の差異は、疾患発症のリスクが低いことまたはかかる疾患または障害が存在しないこと、もしくはそれらが改善していることを示し得る。
用語、指標の「上昇した」または「増加した」レベルは、試料中のかかる指標のレベルが参照または参照試料におけるかかる指標のレベルと比較して高いことを指す。例えば、所与の疾患を罹患していない個体の同じ液体試料より高い量で、前記疾患を罹患している１個の個体の液体試料において検出可能であるタンパク質は、上昇したレベルを有する。
ある特定の実施形態では、サンドイッチは、ｃＴｎＴに対する第１の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）およびｃＴｎＴに対する第２の抗体を含んで形成され、ここで第２の抗体は検出可能に標識化されている。
多数の標識（色素とも称される）は、利用可能であり、一般に以下のカテゴリーに分類することができ、それらすべてを合わせておよびそれらそれぞれが本開示による実施形態を表す：
（ａ）蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら、”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，” Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｔｒａｎｓ．１（１９９７）１０５１～１０５８）によって記載されている。
（ａ）蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら、”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，” Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｔｒａｎｓ．１（１９９７）１０５１～１０５８）によって記載されている。
蛍光標識またはフルオロフォアとして、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、ＦＩＴＣ、５－カルボキシフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセインを含むフルオレセイン型標識；ＴＡＭＲＡを含むローダミン型標識；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；およびこれらの類似体が挙げられる。蛍光標識は、本明細書に開示される技術を使用して標的分子中に含まれるアルデヒド基にコンジュゲートされてよい。蛍光色素および蛍光標識試薬として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）およびＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から商業的に入手できるものが挙げられる。
（ｂ）発光色素
発光色素または標識は、化学発光および電気化学発光色素にさらに細分類され得る。
化学発光（chemiluminogenic）標識のさまざまなクラスとして、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似物、ジオキセタン、ペルオキシオキサリック酸（peroxyoxalic acid）およびそれらの誘導体に基づく系が挙げられる。免疫診断手順の
ために主にアクリジニウムに基づく標識が使用される（詳細な概説は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ
Ｃ．ら、Ｔａｌａｎｔａ ５１（２０００）４１５～４３９に示されている）。
発光色素または標識は、化学発光および電気化学発光色素にさらに細分類され得る。
化学発光（chemiluminogenic）標識のさまざまなクラスとして、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似物、ジオキセタン、ペルオキシオキサリック酸（peroxyoxalic acid）およびそれらの誘導体に基づく系が挙げられる。免疫診断手順の
ために主にアクリジニウムに基づく標識が使用される（詳細な概説は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ
Ｃ．ら、Ｔａｌａｎｔａ ５１（２０００）４１５～４３９に示されている）。
電気化学発光標識として使用される主な関連標識は、それぞれルテニウムおよびイリジウムに基づく電気化学発光複合体である。電気化学発光（Electrochemiluminescense）（ＥＣＬ）は、高感度および選択的な方法として分析的応用において非常に有用であることが証明されている。それは、化学発光分析（バックグラウンド光学シグナルの非存在）の分析的有利点と、印加する電極電位による反応調節の容易さとを組み合わせている。一般に、ルテニウム複合体、特に、液相または液体固相界面においてＴＰＡ（トリプロピルアミン）を用いて再生される［Ｒｕ（Ｂｐｙ）３］２＋（約６２０ｎｍで光子を放出する）は、ＥＣＬ標識として使用される。近年、イリジウムに基づくＥＣＬ標識も記載されている（ＷＯ２０１２１０７４１９（Ａ１））。
（ｃ）放射性標識は、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇｎ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９ＴＣ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔまたは１３１Ｂｉなどの放射性同位元素（放射性核種）を利用する。
（ｄ）画像化および治療目的のための標識として好適な金属キレート複合体は、当技術分野において周知である（ＵＳ２０１０／０１１１８５６；ＵＳ５，３４２，６０６；ＵＳ５，４２８，１５５；ＵＳ５，３１６，７５７；ＵＳ５，４８０，９９０；ＵＳ５，４６２，７２５；ＵＳ５，４２８，１３９；ＵＳ５，３８５，８９３；ＵＳ５，７３９，２９４；ＵＳ５，７５０，６６０；ＵＳ５，８３４，４５６；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５（１９８３）１４７～１５７；Ｍｅａｒｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２（１９８４）６８～７８；Ｍｉｒｚａｄｅｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１（１９９０）５９～６５；Ｍｅａｒｅｓら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９０）、Ｓｕｐｐｌ．１０：２１～２６；Ｉｚａｒｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３（１９９２）３４６～３５０；Ｎｉｋｕｌａら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９５）３８７～９０；Ｃａｍｅｒａら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３）９５５～６２；Ｋｕｋｉｓら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８）２１０５～２１１０；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１６６３～１６７０；Ｃａｍｅｒａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１（１９９４）６４０～６４６；Ｒｕｅｇｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（１９９０）４２２１～４２２６；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１６６３～１６７０；Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（２００１）４４７４～４４８２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１１０５～１１１２；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０（１９９９）１０３～１１１；Ｍｉｅｄｅｒｅｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５（２００４）１２９～１３７；ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４（１９９８）２４８３～９０；Ｂｌｅｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １８（２００３）３５５～３６３；Ｎｉｋｕｌａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０（１９９９）１６６～７６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８）８２９～３６；Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３）６５～７４；Ｒｏｓｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１４（１９９９）２０９～２０）。
一実施形態では、サンドイッチは、ｃＴｎＴに対する第１の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）およびｃＴｎＴに対する第２の抗体を含んで形成され、ここで第２の抗体は検出可能に標識化されており、第１の抗ｃＴｎＴ抗体は、固相に結合できるまたは固相に結合されている。
一実施形態では、本発明において開示される抗ｃＴｎＴ抗体は、ｃＴｎＴを測定するためのイムノアッセイにおいて使用される。一実施形態では、本明細書において上に開示される抗ｃＴｎＴ抗体は、サンドイッチ型イムノアッセイにおいて使用される。一実施形態では、本発明において開示される抗ｃＴｎＴ抗体は、検出抗体として使用される。一実施形態では、本明細書において開示される抗ｃＴｎＴ抗体は、発光色素、特に化学発光色素または電気化学発光色素を用いて検出可能に標識化される。
これらおよび他の実施形態は、本発明の記載および実施例によって開示され、包含される。本発明により使用される方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、公立図書館およびデータベースから例えば電子デバイスを使用して検索され得る。例えば、インターネット上で利用できる公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、例えばｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ．でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにおいて利用できる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／、またはｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／などのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにおいて利用できるさらなるデータベースおよびアドレスは、当業者に公知であり、ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍでＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにおけるアドレスを使用して得ることもできる。
他に定義されない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含めて特許明細書が優先される。
本明細書で提供されるすべてのアミノ酸配列は、当技術分野において習慣的に行われているとおり最もＮ末端側の残基から始めて最もＣ末端側の残基で終わるように表されており（Ｎ→Ｃ）、本発明を通じてアミノ酸を同定するために使用される１文字または３文字コード略号は、アミノ酸について一般に使用されるものに対応する。
本明細書において、特に特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態に関して、従属請求項において言及される各実施形態は、前記従属請求項が従属する各請求項（独立または従属）の各実施形態と組み合わされることが意図される。例えば、３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣを列挙する独立請求項１、３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦを列挙する従属請求項２ならびに請求項１および２に従属し、３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩを列挙するする請求項３の場合、他を具体的に言及する場合を除いて、明細書が、組合せＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する実施形態を明白に開示することは理解される。
同様に、独立および／または従属請求項が選択肢を列挙しない場合に、従属請求項が複数の先行する請求項を遡って参照する場合、それによって網羅される主題の任意の組合せが明確に開示されると考えられることは、理解される。例えば、独立請求項１、請求項１を遡って参照する従属請求項２ならびに請求項２および１の両方を遡って参照する従属請
求項３の場合、請求項３および１の主題の組合せは、請求項３、２および１の主題の組合せであるとして明確かつ明白に開示されることになる。請求項１から３のいずれか一項を参照するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合せが明確かつ明白に開示される。
求項３の場合、請求項３および１の主題の組合せは、請求項３、２および１の主題の組合せであるとして明確かつ明白に開示されることになる。請求項１から３のいずれか一項を参照するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合せが明確かつ明白に開示される。
上記検討事項は、すべての添付される特許請求の範囲に準用する。非限定的例を示すために、請求項１３、１２および１（ｉ）の組合せは、請求項の構造の観点から明確かつ明白に予測される。同じことが例えば請求項１３、１１および４（ｉｉ）などの組合せに適用される。
ある特定の本発明の態様は、添付の図の方法によっても例示される。
以下の実施例は、本発明を例示する：
実施例１
材料および一般的方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載のとおり標準的方法をＤＮＡを操作するために使用した。分子生物学的試薬を製造者の説明書に従って使用した。
材料および一般的方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載のとおり標準的方法をＤＮＡを操作するために使用した。分子生物学的試薬を製造者の説明書に従って使用した。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列をＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施した二重鎖配列決定によって決定した。
ＤＮＡ配列をＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施した二重鎖配列決定によって決定した。
ＤＮＡおよびタンパク質配列分析ならびに配列データ管理
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．５．０を配列作成、マッピング、分析、アノテーションおよび例示のために使用した。
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．５．０を配列作成、マッピング、分析、アノテーションおよび例示のために使用した。
タンパク質化学および標識化技術
標準的タンパク質化学および標識化技術は、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに示されている。
標準的タンパク質化学および標識化技術は、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに示されている。
バイオインフォマティクス
バイオインフォマティクス法は、例えばＫｅｉｔｈ Ｊ．Ｍ．（ｅｄ．）“Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ” Ｖｏｌ．ＩおよびＶｏｌ．ＩＩ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５２５およびＶｏｌ．１５２６（２０１７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒにおいて、ならびにＭａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．＆ Ａｌｌｅｎ，Ｊ．“Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”ｉｎ：Ｄｕｂｅｌ Ｓ．＆ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ．Ｍ．（ｅｄｓ．）“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１４）に示されている。
バイオインフォマティクス法は、例えばＫｅｉｔｈ Ｊ．Ｍ．（ｅｄ．）“Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ” Ｖｏｌ．ＩおよびＶｏｌ．ＩＩ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５２５およびＶｏｌ．１５２６（２０１７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒにおいて、ならびにＭａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．＆ Ａｌｌｅｎ，Ｊ．“Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”ｉｎ：Ｄｕｂｅｌ Ｓ．＆ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ．Ｍ．（ｅｄｓ．）“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１４）に示されている。
電気化学発光イムノアッセイ
イムノアッセイおよび関連法は、例えばＷｉｌｄ Ｄ．（ｅｄ．）“Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ｅｌｓｅｖｉｅｒに示されている。電気化学発光標識としてのルテニウム複合体は、例えばＳｔａｆｆｉｌａｎｉ Ｍ．ら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２（２００３）７７８９～７７９８に示されている。典型的には、電気化学発光（ＥＣＬ）に基づくイムノアッセイの実施のため
にＥｌｅｃｓｙｓ ２０１０ ａｎａｌｙｚｅｒまたは後継システム、例えばＲｏｃｈｅ
ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｅ１７０、ｃｏｂａｓ ｅ ６０１ ｍｏｄｕｌｅ、ｃｏｂａｓ ｅ ６０２ ｍｏｄｕｌｅ、ｃｏｂａｓ ｅ ８０１ ｍｏｄｕｌｅおよびｃｏｂａｓ ｅ ４１１などを使用し、ならびにこれらの分析器のために設計されたＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ ａｓｓａｙｓを、他に示さない限り標準的条件下でそれぞれ使用した。
イムノアッセイおよび関連法は、例えばＷｉｌｄ Ｄ．（ｅｄ．）“Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ｅｌｓｅｖｉｅｒに示されている。電気化学発光標識としてのルテニウム複合体は、例えばＳｔａｆｆｉｌａｎｉ Ｍ．ら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２（２００３）７７８９～７７９８に示されている。典型的には、電気化学発光（ＥＣＬ）に基づくイムノアッセイの実施のため
にＥｌｅｃｓｙｓ ２０１０ ａｎａｌｙｚｅｒまたは後継システム、例えばＲｏｃｈｅ
ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｅ１７０、ｃｏｂａｓ ｅ ６０１ ｍｏｄｕｌｅ、ｃｏｂａｓ ｅ ６０２ ｍｏｄｕｌｅ、ｃｏｂａｓ ｅ ８０１ ｍｏｄｕｌｅおよびｃｏｂａｓ ｅ ４１１などを使用し、ならびにこれらの分析器のために設計されたＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ ａｓｓａｙｓを、他に示さない限り標準的条件下でそれぞれ使用した。
実施例２
ライブラリー構築
親抗体可変重鎖は、マウス（murine）由来（配列番号３４）である。変異ＨＣＣＤＲを含むライブラリーを、それぞれＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２および／またはＨＣＣＤＲ３における単一アミノ酸無作為化を目的として構築物した。第１のステップでは、４つの異なる親抗体フレームワーク領域の１つをそれぞれコードする４つのＤＮＡ断片を生成した。フレームワーク領域１、３および４を施設内でポリメラーゼ連鎖反応によって得た、フレームワーク領域２を表す短い断片２（４２ｂｐ）は、Ｍｅｔａｂｉｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧに発注した（図１Ａ参照）。断片をゲル精製し、定量した。これらのＤＮＡ断片の内の１つの１００ｎｇをＰＣＲ反応混合物に加える４つそれぞれにおけるポリヌクレオチド鋳型として使用した。ＣＤＲ領域を親ＣＤＲと同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリーの使用によって加え、前記ライブラリーのメンバーは、ＨＣＣＤＲそれぞれにおけるそれぞれの各コドン位置について１つのＮＮＫコドンを有するライブラリーメンバーを含むように設計した。ＣＤＲライブラリー中のポリヌクレオチドは、それぞれのＣＤＲに隣接するフレームワーク領域にハイブリダイズできる配列を付加的に含んだ。末端プライマーをネステッドＰＣＲ増幅のために使用した。それにより（図１Ｂ参照）、部分的に重複した配列を含む４個のＤＮＡ断片を生成した。重複ＰＣＲを、ＦＷ１配列の３’末端およびＦＷ４配列の５’末端にハイブリダイズする末端プライマーを用いて、４個の断片を直鎖状ＤＮＡライブラリー構築物に接続するために実施した（図１Ｃ参照）。典型的ＰＣＲ反応物は、ＭｇＳＯ４、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μＭフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２５０ｎｇ ＤＮＡ鋳型、５単位Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを含む１０μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液を含有する１００μｌ反応混合物にＰＣＲグレード水を用いて満たした。典型的ＰＣＲは、最初に９４℃、５分間の鋳型変性から開始し、３０サイクル（９４℃ ２分間、６０℃ ４５秒間、７２℃ １分間）を使用し、７２℃、５分間の最終伸長ステップを含んだ。プライマー、鋳型および断片配列を表１に列挙する。ライブラリー断片は、無細胞系における良好な転写および翻訳のために必要なすべての制御配列を含有した。当業者は、当技術分野の現行の方法に従って、かかるライブラリーを生成できる、例えばＨａｎｅｓ，Ｊ．＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７）、“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ”、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４、４９３７～４２を参照されたい。それにより２５０ｎｇの、３個のＨＣ ＣＤＲを含むＤＮＡライブラリーを生成し、約５・１０１１に対応するライブラリーメンバーをｉｎ ｖｉｔｒｏ提示アプローチのために使用した。
ライブラリー構築
親抗体可変重鎖は、マウス（murine）由来（配列番号３４）である。変異ＨＣＣＤＲを含むライブラリーを、それぞれＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２および／またはＨＣＣＤＲ３における単一アミノ酸無作為化を目的として構築物した。第１のステップでは、４つの異なる親抗体フレームワーク領域の１つをそれぞれコードする４つのＤＮＡ断片を生成した。フレームワーク領域１、３および４を施設内でポリメラーゼ連鎖反応によって得た、フレームワーク領域２を表す短い断片２（４２ｂｐ）は、Ｍｅｔａｂｉｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧに発注した（図１Ａ参照）。断片をゲル精製し、定量した。これらのＤＮＡ断片の内の１つの１００ｎｇをＰＣＲ反応混合物に加える４つそれぞれにおけるポリヌクレオチド鋳型として使用した。ＣＤＲ領域を親ＣＤＲと同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリーの使用によって加え、前記ライブラリーのメンバーは、ＨＣＣＤＲそれぞれにおけるそれぞれの各コドン位置について１つのＮＮＫコドンを有するライブラリーメンバーを含むように設計した。ＣＤＲライブラリー中のポリヌクレオチドは、それぞれのＣＤＲに隣接するフレームワーク領域にハイブリダイズできる配列を付加的に含んだ。末端プライマーをネステッドＰＣＲ増幅のために使用した。それにより（図１Ｂ参照）、部分的に重複した配列を含む４個のＤＮＡ断片を生成した。重複ＰＣＲを、ＦＷ１配列の３’末端およびＦＷ４配列の５’末端にハイブリダイズする末端プライマーを用いて、４個の断片を直鎖状ＤＮＡライブラリー構築物に接続するために実施した（図１Ｃ参照）。典型的ＰＣＲ反応物は、ＭｇＳＯ４、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μＭフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２５０ｎｇ ＤＮＡ鋳型、５単位Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを含む１０μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液を含有する１００μｌ反応混合物にＰＣＲグレード水を用いて満たした。典型的ＰＣＲは、最初に９４℃、５分間の鋳型変性から開始し、３０サイクル（９４℃ ２分間、６０℃ ４５秒間、７２℃ １分間）を使用し、７２℃、５分間の最終伸長ステップを含んだ。プライマー、鋳型および断片配列を表１に列挙する。ライブラリー断片は、無細胞系における良好な転写および翻訳のために必要なすべての制御配列を含有した。当業者は、当技術分野の現行の方法に従って、かかるライブラリーを生成できる、例えばＨａｎｅｓ，Ｊ．＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７）、“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ”、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４、４９３７～４２を参照されたい。それにより２５０ｎｇの、３個のＨＣ ＣＤＲを含むＤＮＡライブラリーを生成し、約５・１０１１に対応するライブラリーメンバーをｉｎ ｖｉｔｒｏ提示アプローチのために使用した。
実施例３
ｉｎ ｖｉｔｒｏ提示
Ｆａｂ提示のための緩衝液を調製し、４℃で転倒回転させながら一晩インキュベートした。洗浄緩衝液、ＷＢ、（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ；ｐＨ７．５、ＡｃＯＨを用いて調整、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ、３３ｍＭ ＫＣｌ、２００μｇ ｔ－ＲＮＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）；ビーズ洗浄緩衝液ＢＷＢ（１００ｍＭ ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）；停止緩衝液ＳＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、ＡｃＯＨを用いて調整、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）、３３ｍＭＫＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、８．２ｍＭ酸化型グルタチオン）；溶出緩衝液（５５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、ＡｃＯＨを用いて調整、１６５ｍＭ ＮａＣｌ、２２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ ＢＳＡ、５０００Ｕ ｒＲＮＡ（５０００Ｕ）、５０μｇ ｔＲＮＡ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ提示
Ｆａｂ提示のための緩衝液を調製し、４℃で転倒回転させながら一晩インキュベートした。洗浄緩衝液、ＷＢ、（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ；ｐＨ７．５、ＡｃＯＨを用いて調整、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ、３３ｍＭ ＫＣｌ、２００μｇ ｔ－ＲＮＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）；ビーズ洗浄緩衝液ＢＷＢ（１００ｍＭ ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）；停止緩衝液ＳＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、ＡｃＯＨを用いて調整、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）、３３ｍＭＫＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、８．２ｍＭ酸化型グルタチオン）；溶出緩衝液（５５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、ＡｃＯＨを用いて調整、１６５ｍＭ ＮａＣｌ、２２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ ＢＳＡ、５０００Ｕ ｒＲＮＡ（５０００Ｕ）、５０μｇ ｔＲＮＡ）。
必要量の磁気ビーズ（ストレプトアビジンコートビーズ）を１０μＬの初期懸濁物あた
り１００μＬ洗浄緩衝液（ＷＢ）を用い、４℃、一晩、転倒回転させてブロックした。標的／バックグラウンド試料あたり２５μＬのビーズをプレパニングステップのために、および２０μＬをパニングのために使用した。ビーズ保存緩衝液のアジ化ナトリウムを除去するために、ビーズをビーズ洗浄緩衝液（ＢＷＢ）を用いて４回、およびＷＢを用いて３回洗浄した。これらのステップは、ビーズを回収するために２分間磁場を適用し、続いて上清を廃棄することによって実施した。最後の洗浄ステップ後、ビーズをその最初の体積のＷＢ中に再懸濁した。
り１００μＬ洗浄緩衝液（ＷＢ）を用い、４℃、一晩、転倒回転させてブロックした。標的／バックグラウンド試料あたり２５μＬのビーズをプレパニングステップのために、および２０μＬをパニングのために使用した。ビーズ保存緩衝液のアジ化ナトリウムを除去するために、ビーズをビーズ洗浄緩衝液（ＢＷＢ）を用いて４回、およびＷＢを用いて３回洗浄した。これらのステップは、ビーズを回収するために２分間磁場を適用し、続いて上清を廃棄することによって実施した。最後の洗浄ステップ後、ビーズをその最初の体積のＷＢ中に再懸濁した。
ＰＵＲＥｆｒｅｘ（商標）ＤＳ ２．０を製造者の説明書に従って使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳を実施した。標的（Ｔ）のために１個およびバックグラウンド（ＢＧ）のために１個の１．５ｍＬ反応チューブを準備した。
発現鋳型（ＬＣ）および提示鋳型（ＨＣ）のＤＮＡ投入量は、２：１分子比を適用した。提示および発現鋳型をコードするＤＮＡの量は、すべてのＦａｂ提示サイクルにおいて一定に保った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応混合物を３７℃、１時間インキュベートした。インキュベーション後、反応を１００μＬの停止緩衝液を加えることによって停止させ、続いて１４０００ｒｐｍ、１５分間、１℃での遠心分離ステップを行った。他に言及しない限り、続くステップは、４℃で実施した。停止された翻訳混合物の上清を、調製したビーズ懸濁物に加え、３０分間、ロッキングプラットホームでインキュベートした。その後、懸濁物を三元複合体が残存している上清から非特異的結合分子を有するビーズを分離するために１３０００ｒｐｍ、１℃、１０分間で遠心分離した。プレパニングした上清（３００μＬ）を、ＷＢを用いて予めブロックした新たな２ｍＬ反応チューブに移し、さらなる使用まで氷上に保った。標的（組換えビオチン化ｃＴｎＴ）を３００μＬプレパニングした上清に１０ｎＭから５０ｎＭの範囲の最終濃度で加えた。ビオチン化ｃＴｎＴ濃度を選択圧を上昇させるためにすべてのサイクルにおいて減少させた。懸濁物を３０分間、ロッキングプラットホーム上でインキュベートした。溶液パニングステップは、ビオチン化ｃＴｎＴと三元複合体との間の特異的結合を可能にした。標的ｃＴｎＴに結合した三元複合体を２０分間インキュベーションステップにおいてストレプトアビジンビーズを用いて捕捉した。選択圧のさらなる増加は、２つの方法：抗原濃度を２ｎＭに減少させること、または非ビオチン化競合物を使用することによってのいずれかでサイクルＩＩＩにおいて達成した。後者ではパニングステップは、低いビオチン化ｃＴｎＴ濃度および過剰な競合物ｃＴｎＴを一晩用いて実行した。
洗浄ステップは、磁場において結合した標的三元複合体を有するビーズを捕捉するステップに続く上清の除去を含む。ビーズを５００μＬ氷冷ＷＢを用いて洗浄した。選択圧を洗浄ステップの持続時間を５分間から１時間に延長することによって次の提示サイクルにおいて増加させた。最終洗浄ステップを新たにブロックした２ｍＬ反応チューブにビーズを移すために使用した。続いてビーズを磁場を用いて捕捉し、上清を除去した。続く溶出ステップをＥＤＴＡを含有する１００μＬの１×ＥＢを加え、振とうしながら１０分間インキュベートすることによって実施した。ｍＲＮＡを三元複合体から遊離させた。その後溶出混合物を１４０００ｒｐｍ、１０分間、１℃で遠心分離した。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を、濃縮したＲＮＡを単離および精製するために製造者の説明書に従って使用した。ＲＮＡを１６μＬ ＲＮａｓｅ不含有水を用いて溶出した。選択ステップ由来のすべての残存ＤＮＡを消化するために、Ａｍｂｉｏｎ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）キットを製造者の説明書に従って使用した。残存ＤＮＡは、続くＰＣＲ反応において増幅され得ない。ＤＮａｓｅ不活性化後、懸濁物を２分間、１３０００ｒｐｍ、室温で遠心分離した。上清（５０μＬ）を氷上の新たな１．５ｍＬ反応チューブに移した。精製ＲＮＡは、逆転写（ＲＴ）のために直ちに使用した。すべての残存上清は－２０℃で保存した。
溶出したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。２つの反応物を、パニングステップにおける標的を含有する試料Ｔについて準備した。２つのさらなる反応物を試料ＢＧおよび水を含有する陰性対照のために調製した。試料の数に応じて、マスター混合物を調製し、プレミックスを氷上で０．２ｍＬ反応チューブに分注した。各反応物に１２μＬの溶出ＲＮＡおよび０．５μＬの逆転写酵素を入れた。陰性対照をＲＮＡの代わりに１２μＬのＲＮａｓｅ不含有水を用いて実行した。逆転写を４５分間、６５℃、ＰＣＲサーモサイクラーで実施した。続いてｃＤＮＡ試料を５分間、氷上でインキュベートし、続くステップで増幅した。残りの試料は、－２０℃で保存した。２つのＰＣＲ反応を実行した：第１のＰＣＲ「ＲＴでのＰＣＲ」は、プライマーＦｒｔおよびＲｒｔを用いて選択プールのｃＤＮＡを増幅するために実施した。プライマーＦ１ＡおよびＲ１Ａを使用する第２のＰＣＲ「ＲＴ－ＰＣＲでのＰＣＲ」をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のための調節エレメントを再度付着させるために適用した。両方の反応をＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。
選択プールの十分なＤＮＡ濃度をもたらすために、４つの反応物を試料ＴおよびＢＧのそれぞれについて準備した。
追加的に４つの対照試料を準備した。最初の２つの試料は、試料ＴのｍＲＮＡ単離後のＤＮＡ消化物由来およびＢＧであり、残っている可能性があるＤＮＡを増幅するＰＣＲによって検証した。３番目および４番目は、ＲＴの陰性対照およびＰＣＲグレード水を使用する「ＲＴでのＰＣＲ」での陰性対照であった。
追加的に４つの対照試料を準備した。最初の２つの試料は、試料ＴのｍＲＮＡ単離後のＤＮＡ消化物由来およびＢＧであり、残っている可能性があるＤＮＡを増幅するＰＣＲによって検証した。３番目および４番目は、ＲＴの陰性対照およびＰＣＲグレード水を使用する「ＲＴでのＰＣＲ」での陰性対照であった。
ＴのＰＣＲ産生物を調製用１％アガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製し、続いて定量し、「ＲＴ－ＰＣＲでのＰＣＲ」のための鋳型として使用した。選択プールの３つの反応物およびＤＮＡ鋳型の代わりにＰＣＲグレード水を用いた１つの陰性対照を調製した。各反応物について、２５０ｎｇの予め精製した「ＲＴでのＰＣＲ」を使用した。ＰＣＲ産生物を１％調製用アガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製し、続く適切な発現系へのサブクローニングのためにさらに改変した。
実施例４
濃縮結合剤のペリプラスマチック発現
濃縮Ｆａｂ結合剤を単離するために、マウス（murine）可変ＨＣを、ＦａｂのヒトＣＨ１ドメイン、マウス（murine）ＶＬドメインおよびヒトＣＬドメインを含有するｐｈｏＡＴＩＲ３－９ｂｉ Ｆａｂ ＴＮ－Ｔ Ｍ７ｃｈｉｍ発現ベクターにクローニングした（図２を参照されたい）。各選択プールは、発現ベクターへのクローニングを可能にするためのリーダー配列Ｔｉｒ９中に位置するＢｓｉＷＩ制限部位を伴う形で準備した。
濃縮結合剤のペリプラスマチック発現
濃縮Ｆａｂ結合剤を単離するために、マウス（murine）可変ＨＣを、ＦａｂのヒトＣＨ１ドメイン、マウス（murine）ＶＬドメインおよびヒトＣＬドメインを含有するｐｈｏＡＴＩＲ３－９ｂｉ Ｆａｂ ＴＮ－Ｔ Ｍ７ｃｈｉｍ発現ベクターにクローニングした（図２を参照されたい）。各選択プールは、発現ベクターへのクローニングを可能にするためのリーダー配列Ｔｉｒ９中に位置するＢｓｉＷＩ制限部位を伴う形で準備した。
第２の制限部位ＫｐｎＩは、ＨＣの可変領域の末端にあり、それにより付着させる必要はない。したがってＰＣＲは、ＢｓｉＷＩ制限部位を含有するフォワードプライマー５’ＧＣＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧ－３’（配列番号９５）、およびリバースプライマーＲｒｔ ５’－ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣ－３’（配列番号８８）を使用して実施した。ペリプラスマチック発現を９６ウエルディープウエルブロック（ＤＷＢ）で実施した。前培養（「マスター」）ＤＷＢをＩｎｔｅｇｒａ ＶＩＡＦｌｏ９６を使用してウエルあたり１ｍＬのＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）を用いて満たし、予めサブクローニングおよび形質転換を実行した単離したクローンを接種した。選択プールあたり約３００個のコロニーを取った。陰性対照として１ウエルを接種せずに残し；別のウエルを陽性対照としてＸＬ１ ｂｌｕｅ形質転換ＴｎＴ Ｍ－７（野生型）Ｆａｂ発現ベクターを接種した。ＤＷＢを空気透過性膜を用いて封をし、オービタルシェーカーインキュベーター（７５０ｒｐｍ）で一晩、３０℃でインキュベートした。続いて、マスターＤＷＢの各ウエルから５０μＬをＳｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．、Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．
、Ｋｌｉｍｏｗｓｋｉ，Ｌ．、Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．、Ｍｅｎｇ，Ｇ．、Ｓｉｍｓ，Ｐ．、Ｈｏｎｇ，Ｋ．、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．、Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．、Ｒａｎｃａｔｏｒｅ，Ｐ．＆ Ｙａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｇ．（２００２）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３、１３３～４７によって記載されたとおり１ウエルあたり１１５０ｍＬ Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）を用いて調製された新たな「発現」ＤＷＢに移した。ＤＷＢを空気透過性膜を用いて封をし、オービタルシェーカーインキュベーターで３０℃でインキュベートした。Ｆａｂ発現の誘導は、リン酸制限Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地を用いるｐｈｏＡプロモーターに基づく。２４時間後、Ｆａｂ発現を有する細胞を４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって採取し、さらなる使用まで－２０℃で保存した。
、Ｋｌｉｍｏｗｓｋｉ，Ｌ．、Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．、Ｍｅｎｇ，Ｇ．、Ｓｉｍｓ，Ｐ．、Ｈｏｎｇ，Ｋ．、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．、Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．、Ｒａｎｃａｔｏｒｅ，Ｐ．＆ Ｙａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｇ．（２００２）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３、１３３～４７によって記載されたとおり１ウエルあたり１１５０ｍＬ Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）を用いて調製された新たな「発現」ＤＷＢに移した。ＤＷＢを空気透過性膜を用いて封をし、オービタルシェーカーインキュベーターで３０℃でインキュベートした。Ｆａｂ発現の誘導は、リン酸制限Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地を用いるｐｈｏＡプロモーターに基づく。２４時間後、Ｆａｂ発現を有する細胞を４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって採取し、さらなる使用まで－２０℃で保存した。
前培養マスターＤＷＢを９５０μＬの４０％グリセロールを加え、－８０℃で保存する「グリセロールストック」のために使用した。細胞沈殿を５０μＬ Ｂ－ＰＥＲＩＩ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に、封をしたＤＷＢを５分間強くボルテックスし、追加的に１０分間、室温で振とうすることによって再懸濁した。細胞可溶化物を９５０μＬ Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に希釈し、遠心分離（１０分間、４０００ｒｐｍ）の前に１０分間インキュベートした。粗細胞抽出物を含有する発現ブロックをＳＰＲ動態学的調査でのさらなる使用まで４℃に保った。
実施例５
ＥＬＩＳＡスクリーニング
詳細なＢｉａｃｏｒｅ解析のための最良の変異体Ｆａｂ結合剤を明らかにするために事前に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実行した。ＥＬＩＳＡ設定を図３に示す。ビオチン化組換え心筋トロポニンＴ（１００ｎＭ）をストレプトアビジン－ＭＴＰ９６ウエルプレートに１時間、ＲＴでオービタルシェーカーで振とうすることによって捕捉した。抗原トロポニンＴを１００μＬ ＩＰ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．３、１％ＢＳＡ）に希釈した。続いてウエルをマイクロプレート洗浄器ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔを使用して３００μＬ １×洗浄緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ）を用いて３回洗浄した。洗浄後、変異抗ｃＴｎＴ Ｆａｂ結合剤を含有する粗細胞抽出物をＩＰ緩衝液に１：２に希釈し、トロポニンＴ捕捉ウエルに移した。再びウエルを３００μＬ １×洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。ヤギで産生させた抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）－ペルオキシダーゼ標識抗体（検出抗体）を１：４００００希釈（ＩＰ緩衝液中）でトロポニンＴ結合変異Ｆａｂ断片を検出するために使用した。未結合検出抗体を除去するために再びウエルを３００μＬ １×洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。マイクロプレートを１ウエルあたり１００μＬ ＡＢＴＳを用いて３０分間、ＲＴでインキュベートした。光学密度を４０５ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーＢｉｏＴｅｋ Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ ＸＳを用いて測定した。親抗ｃＴｎＴ抗体の野生型Ｆａｂを陽性対照として使用した。最初のヒットを同定し、その粗細胞抽出物を動態学的分析に供した。
ＥＬＩＳＡスクリーニング
詳細なＢｉａｃｏｒｅ解析のための最良の変異体Ｆａｂ結合剤を明らかにするために事前に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実行した。ＥＬＩＳＡ設定を図３に示す。ビオチン化組換え心筋トロポニンＴ（１００ｎＭ）をストレプトアビジン－ＭＴＰ９６ウエルプレートに１時間、ＲＴでオービタルシェーカーで振とうすることによって捕捉した。抗原トロポニンＴを１００μＬ ＩＰ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．３、１％ＢＳＡ）に希釈した。続いてウエルをマイクロプレート洗浄器ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔを使用して３００μＬ １×洗浄緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ）を用いて３回洗浄した。洗浄後、変異抗ｃＴｎＴ Ｆａｂ結合剤を含有する粗細胞抽出物をＩＰ緩衝液に１：２に希釈し、トロポニンＴ捕捉ウエルに移した。再びウエルを３００μＬ １×洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。ヤギで産生させた抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）－ペルオキシダーゼ標識抗体（検出抗体）を１：４００００希釈（ＩＰ緩衝液中）でトロポニンＴ結合変異Ｆａｂ断片を検出するために使用した。未結合検出抗体を除去するために再びウエルを３００μＬ １×洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。マイクロプレートを１ウエルあたり１００μＬ ＡＢＴＳを用いて３０分間、ＲＴでインキュベートした。光学密度を４０５ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーＢｉｏＴｅｋ Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ ＸＳを用いて測定した。親抗ｃＴｎＴ抗体の野生型Ｆａｂを陽性対照として使用した。最初のヒットを同定し、その粗細胞抽出物を動態学的分析に供した。
実施例６
ＳＰＲに基づく機能解析
詳細な動態学的調査を３７℃で、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｔ２００装置で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ－５シリーズＳセンサーを装置にマウントし、製造者の説明書に従ってプレコンディショニングした。システム緩衝液は、ＨＢＳ－ＥＴ（１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌ ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｆｌｕｋａ）を補充したシステム緩衝液であった。一実施形態では、抗ヒト抗体捕捉システムは、ＣＭ５バイオセンサー上に確立した。ＧＡＨＦ（ａｂ’）２、（ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２）（コード番号：１０９－００５－０９７、ロット番号１３．１２．２００５、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造者の説明書に従ってＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用して固定化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の３０μｇ／ｍｌ ＧＡＨＦ（ａｂ’）２をフローセル１、２、３および４に予備濃縮し、１０．０００ＲＵ ＧＡＨＦ（ａｂ’）２で固定化した。次にセンサーを１ＭエタノールアミンｐＨ８．５を用いて飽和させた。
ＳＰＲに基づく機能解析
詳細な動態学的調査を３７℃で、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｔ２００装置で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ－５シリーズＳセンサーを装置にマウントし、製造者の説明書に従ってプレコンディショニングした。システム緩衝液は、ＨＢＳ－ＥＴ（１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌ ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｆｌｕｋａ）を補充したシステム緩衝液であった。一実施形態では、抗ヒト抗体捕捉システムは、ＣＭ５バイオセンサー上に確立した。ＧＡＨＦ（ａｂ’）２、（ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２）（コード番号：１０９－００５－０９７、ロット番号１３．１２．２００５、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造者の説明書に従ってＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用して固定化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の３０μｇ／ｍｌ ＧＡＨＦ（ａｂ’）２をフローセル１、２、３および４に予備濃縮し、１０．０００ＲＵ ＧＡＨＦ（ａｂ’）２で固定化した。次にセンサーを１ＭエタノールアミンｐＨ８．５を用いて飽和させた。
記載のとおりキメラ抗ＴｎＴ抗体断片をＥ．ｃｏｌｉ細胞においてペリプラスマチックに発現させ、公知の方法によって溶解させた（技術的詳細について：Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｃ．＆ Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｅ．（２００４）；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，４５６～６２を参照されたい）。可溶化物を試料緩衝液に１：２０に希釈した。Ｆａｂ断片をそれらのヒト化フレームワーク領域を介して発現可溶化物から流速１０μｌ／分、１分間でバイオセンサー上に捕捉し、１０倍濃縮ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を用いる３０μｌ／分、２分間の洗浄ステップが続いた。応答単位（ＲＵ）でのＦａｂ断片捕捉レベル（ＣＬ）をモニターした。組換えヒトＴｎＴ（Ｒｏｃｈｅ、３７ｋＤａ）を試料緩衝液中９０ｎＭに希釈し、濃度シリーズをＴｎＴ濃度０ｎＭ、３０ｎＭ、１１ｎＭ、３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０ｎＭ、３．３ｎＭで作製した。分析物濃度シリーズは、結合フェーズ８０μｌ／分、３分間であり、解離フェーズを３分間モニターした。
分析物結合フェーズの最後、レポートポイントで、応答単位（ＲＵ）での「結合遅延（binding late）」（ＢＬ）をモニターした。各サイクルの動態学的速度決定後、捕捉システムを１５秒間の１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の注射に続く２回の１分間の１０ｍＭグリシンｐＨ１．７の注射、２０μｌ／分によって再生した。
ｃＴｎＴ分析物の動態学的パラメーターｋａ［１／Ｍｓ］、ｋｄ［１／ｓ］、ｔ１／２
ｄｉｓｓ［分］、ＫＤ［Ｍ］および結合化学量論（モル比）（詳細について：Ｓｃｈｒａｅｍｌ，Ｍ．＆ Ｂｉｅｈｌ，Ｍ．（２０１２）；Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９０１、１７１～８１を参照されたい）を各Ｆａｂ断片変異体についてＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて製造者の説明書に従って決定した。動態学的パラメーターは、ＣＤＲ変異部位に相関し、その抗原複合体安定性（ｔ１／２ ｄｉｓｓ）に従って表３に列挙する。
ｄｉｓｓ［分］、ＫＤ［Ｍ］および結合化学量論（モル比）（詳細について：Ｓｃｈｒａｅｍｌ，Ｍ．＆ Ｂｉｅｈｌ，Ｍ．（２０１２）；Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９０１、１７１～８１を参照されたい）を各Ｆａｂ断片変異体についてＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて製造者の説明書に従って決定した。動態学的パラメーターは、ＣＤＲ変異部位に相関し、その抗原複合体安定性（ｔ１／２ ｄｉｓｓ）に従って表３に列挙する。
動態学的パラメーターは、対応するＣＤＲにおいて同定された変異に相関した。このスクリーニングにおいて得られた変異体は、すべて１つより多いアミノ酸置換を含有した。次いで、スクリーニングにおいて同定された単一の置換およびすべての置換の種々の組合せ／変動を含む変異体Ｆａｂ－断片を作製および検査した。検査したすべての変異／組合せを表２に列挙する。
すべての上の変異体をＳＰＲによって分析し、それらの抗原複合体安定性（ｔ１／２ ｄｉｓｓ）に従って順位付けした（表３を参照されたい）。
抗体組合せ１２に含まれる個々の置換、すなわち番号９、１７および１９に含まれる変異（表３を参照されたい）を別々に分析した場合、３個の変異部位に、この変異抗体の親和性、複合体安定性およびＥＣＬアッセイ性能を改善する相乗効果があることが明らかになる。これは、それらに含まれる変異の相乗効果も実証する。
実施例７
ＨＥＫ細胞におけるキメラ抗体の発現
キメラヒト／マウス抗体を標準的手順により得た。対応するベクターおよびクローニング工程は、Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７ Ｍａｙ １２；２０４（１）：７７～８７に記載されている。
ＨＥＫ細胞におけるキメラ抗体の発現
キメラヒト／マウス抗体を標準的手順により得た。対応するベクターおよびクローニング工程は、Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７ Ｍａｙ １２；２０４（１）：７７～８７に記載されている。
ＳＰＲによって選択した数個のＦａｂ断片から、全長マウス（murine）／ヒトキメラ抗体、すなわちヒトＩｇＧ ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する抗体を構築し、産生した。重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを融合細胞クローン７．１ Ａ １２．２－２２（ＥＣＡＣＣ ８９０６０９０１）からＲＴ－ＰＣＲによって得て、別々のベクターにヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター領域の下流にクローニングし、ＢＧＨポリアデニル化シグナルが続いた。
懸濁適合ヒト胚性腎臓ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗体の一過的遺伝子発現（ＴＧＥ）のために使用した
：生細胞およそ２×１０Ｅ６個／ｍｌで、製造者の指針に従ってＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）トランスフェクション試薬によって複合体化された等量の両方の発現プラスミド（細胞培養物１Ｌあたり合計０．７ｍｇ）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、バルプロ酸、ＨＤＡＣ阻害物質を発現をブーストするために加えた（最終濃度：４ｍＭ）。毎日、培養物に６％（ｖ／ｖ）のダイズペプトン加水分解物ベースのフィード（hydrolysate-based feed）を補充した。トランスフェクションの７日後、培養上清を遠心分離によって回収し、抗体をそれから標準的手順により精製した。
：生細胞およそ２×１０Ｅ６個／ｍｌで、製造者の指針に従ってＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）トランスフェクション試薬によって複合体化された等量の両方の発現プラスミド（細胞培養物１Ｌあたり合計０．７ｍｇ）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、バルプロ酸、ＨＤＡＣ阻害物質を発現をブーストするために加えた（最終濃度：４ｍＭ）。毎日、培養物に６％（ｖ／ｖ）のダイズペプトン加水分解物ベースのフィード（hydrolysate-based feed）を補充した。トランスフェクションの７日後、培養上清を遠心分離によって回収し、抗体をそれから標準的手順により精製した。
実施例８
ＥＣＬ測定
実施例７により産生した抗体をサンドイッチイムノアッセイで検査した（図４を参照されたい）。ＩｇＧルテニウムコンジュゲートを生成し、親抗ｃＴｎＴ抗体の性能を変異抗ｃＴｎＴ抗体と比較するために、純正Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に含まれる元の標準的ルテニル化コンジュゲートの代わりにおよび比較のために使用した。変異ｍＡｂｓを異なる標識化化学量論でルテニウムにコンジュゲートした。一実施形態では、ルテニウム標識化モル比は、１：１０ 抗体ＩｇＧ：標識であった。抗ｃＴｎＴ抗体変種由来のルテニウムコンジュゲートをＥｌｅｃｓｙｓ
Ｒ２試薬に希釈し、測定をブランク対照を用いて、トロポニンＴ ｈｓアッセイプロトコールを使用してＣｏｂａｓ Ｅ１７０ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ、Ｉｄ．１１７３２２７７１２２、Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｍｕｌｔｉ Ａｓｓａｙ、Ｉｄ．０３６０９９８７１７０、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、トロポニンＴ ｈｓアッセイ仕様書を使用してトロポニンＴ ｈｓ ＣａｌＳｅｔからのＣａｌ１およびＣａｌ２（Ｉｄ．０５０９２７５２１９０、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。結果を図５に示す。組合せ番号１１および１２にそれぞれ存在する変異を含む抗体は、親（非変異）抗体と比較してシグナルノイズ比の改善を示す。
ＥＣＬ測定
実施例７により産生した抗体をサンドイッチイムノアッセイで検査した（図４を参照されたい）。ＩｇＧルテニウムコンジュゲートを生成し、親抗ｃＴｎＴ抗体の性能を変異抗ｃＴｎＴ抗体と比較するために、純正Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に含まれる元の標準的ルテニル化コンジュゲートの代わりにおよび比較のために使用した。変異ｍＡｂｓを異なる標識化化学量論でルテニウムにコンジュゲートした。一実施形態では、ルテニウム標識化モル比は、１：１０ 抗体ＩｇＧ：標識であった。抗ｃＴｎＴ抗体変種由来のルテニウムコンジュゲートをＥｌｅｃｓｙｓ
Ｒ２試薬に希釈し、測定をブランク対照を用いて、トロポニンＴ ｈｓアッセイプロトコールを使用してＣｏｂａｓ Ｅ１７０ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ、Ｉｄ．１１７３２２７７１２２、Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｍｕｌｔｉ Ａｓｓａｙ、Ｉｄ．０３６０９９８７１７０、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、トロポニンＴ ｈｓアッセイ仕様書を使用してトロポニンＴ ｈｓ ＣａｌＳｅｔからのＣａｌ１およびＣａｌ２（Ｉｄ．０５０９２７５２１９０、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。結果を図５に示す。組合せ番号１１および１２にそれぞれ存在する変異を含む抗体は、親（非変異）抗体と比較してシグナルノイズ比の改善を示す。
Claims (15)
- ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、ＣＤＲが以下：
（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに
（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のアミノ酸配列または最大１個のアミノ酸置換において異なっているその変種を含むことを特徴とし、
ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、
ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗体。 - 軽鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列のＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列のＣＤＲ３、またはＣＤＲあたり最大１個のアミノ酸置換において異なっているこれらのＣＤＲの１つまたは複数の変種を含み、重鎖可変ドメインが請求項１における（ｉｉ）において示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを含み、個々のＣＤＲが請求項１の（ｉｉ）において示された配列からなる、請求項１に記載の抗体。
- ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、ＣＤＲが以下（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに
（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の配列番号５；配列番号６の；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８の；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０の；配列番号１１の；配列番号１２の；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のアミノ酸配列を含むことを特徴とし、
ＣＤＲのうちの少なくとも２個が、配列番号６もしくは配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３から選択される、またはＣＤＲ１が配列番号７のものであり、ＣＤＲ２が配列番号８のものであり、ＣＤＲ３が配列番号１１のものもしくは配列番号１３のものであり、
ただし、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１でも配列番号１３でもない、またはｂ）本抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は同時にそれぞれ配列番号８および配列番号１２のものではないことを条件とする抗体。 - ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、
式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、
ならびに式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）
３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、
ＦＷが以下：
軽鎖における
ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号１５のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１６のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１７のアミノ酸配列；
および重鎖における
ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号２０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号２１のアミノ酸配列；
のアミノ酸配列またはこれらに少なくとも８５％同一であるその変種を含み、ＣＤＲが請求項１に定義される配列、または最大１個のアミノ酸置換において異なっているこれらの変種を含む、抗体。 - 式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、
ならびに式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、
ＣＤＲが請求項３において定義される配列を含み、ＦＷが以下：
軽鎖における
ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号１５のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１６のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１７のアミノ酸配列；
重鎖における
ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号２０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号２１のアミノ酸配列；
のアミノ酸配列またはこれらに少なくとも８５％同一であるその変種を含む、請求項３に記載の抗体。 - ３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有する、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。
- （ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択される重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体であって、
ヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合し、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有
する抗体。 - （ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン
を含む抗体であって、
ＣＤＲが請求項１において定義されるとおりであり、
抗体がヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合し、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有する、抗体。 - （ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、ならびに
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン
を含む抗体であって、
ＣＤＲが請求項１において定義されるとおりであり、
抗体が、ヒト心筋トロポニンＴに特異的に結合し、３７℃で１０分間以上のｔ／２－ｄｉｓｓを有する、抗体。 - （ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体。 - 請求項１から１０のいずれか一項に記載の軽鎖可変領域をコードする核酸分子。
- 請求項１から１０のいずれか一項に記載の重鎖可変領域をコードする核酸分子。
- 請求項１１に記載のおよび／または請求項１２に記載の核酸分子
を含むベクター。 - （ｉ）請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体
（ｉｉ）請求項１１もしくは１２に記載の核酸分子、および／または
（ｉｉｉ）請求項１３に記載のベクター、
のうちの少なくとも１つを含む組成物。 - 請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体のヒト心筋トロポニンＴへの結合を検出するステップを含む、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）を決定する方法。
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