JP2025523402A - 多重特異性抗体の精製方法 - Google Patents

多重特異性抗体の精製方法

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JP2025523402A JP2024572090A JP2024572090A JP2025523402A JP 2025523402 A JP2025523402 A JP 2025523402A JP 2024572090 A JP2024572090 A JP 2024572090A JP 2024572090 A JP2024572090 A JP 2024572090A JP 2025523402 A JP2025523402 A JP 2025523402A
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ティンワン・スン
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Abstract

第１の重鎖ポリペプチドと第１の軽鎖ポリペプチドとが会合して１つ以上の抗原結合ドメインを形成し、第２の重鎖ポリペプチドと第２の軽鎖ポリペプチドとが会合して１つ以上の抗原結合ドメインに結合する、４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供される。また、そのような多価結合タンパク質を精製する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年６月８日に出願された米国仮特許出願第６３／３５０，２５５号明細書；及び２０２２年９月８日に出願された欧州特許第２２３１５２０６．７号明細書の優先権の利益を主張し、その各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子配列表の参照
電子配列表（１８３９５２０３４１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ；サイズ：２１，２５１バイト；及び作成日：２０２３年５月３０日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、プロテインＬ及び／又はＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させた多価結合タンパク質、そのような多価結合タンパク質の生成方法、並びに多価結合タンパク質及び不純物（例えば、誤対合したポリペプチド）を含む組成物からそのような多価結合タンパク質を精製する方法に関する。
ヒト疾患の治療薬としての多価結合タンパク質（例えば、多価及び／又は多重特異性抗体及び抗体構築物）の開発は、大きな臨床的可能性を有している。しかしながら、抗体重鎖が比較的無秩序に抗体軽鎖と結合するように進化してきたため、多価結合タンパク質をＩｇＧ形式で産生することは、大きな課題であった。このような無秩序な対合の結果として、例えば、２つ以上の抗体重鎖（若しくは重鎖構築物）及び／又は２つ以上の抗体軽鎖（若しくは軽鎖構築物）を含む多価結合タンパクを生成することは、重鎖ホモ二量体及び／又はスクランブルされた重鎖／軽鎖ペアを含む望ましくない種の形成をもたらす可能性がある。正しく会合した多価結合タンパク質を、そのような望ましくない誤対合種からクロマトグラフィーによって分離することは、それらの構造及び分子量が類似しているため、困難となる可能性がある。さらに、インビトロでの会合反応及び／又は精製方法が複雑だと、多くの多価結合タンパク質プラットフォームの適用、特に、多くの治療薬パイプラインに必要とされるハイスループットなスクリーニングにおけるそれらの使用が制限される。
誤対合した重鎖／軽鎖の副生成物を除去し、多価結合タンパク質の収率を増大させる、改善されたタンパク質精製プロセスが当技術分野において必要とされている。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、κ１、κ３、又はκ４サブタイプ軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ１は、Ｃκサブタイプ軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔに対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとは異なる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドは、第２の重鎖ポリペプチドとは異なる種に由来する。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチドが、マウス重鎖免疫グロブリン及びマウス軽鎖免疫グロブリンに由来し、第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドが、ラット重鎖免疫グロブリン及びラット軽鎖免疫グロブリンに由来する。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチド及び第２の重鎖ポリペプチドは、それぞれＩｇＧ４のＣＨ３ドメインを含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドは、Ｋ４０９Ｒアミノ酸置換を含み、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆ４０５Ｌアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、二重特異性抗原結合タンパク質である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとが、異なる抗原に結合する。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ３－Ｌ－ＶＬ３ ［Ｉａ］
を含み、
多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含み、
式中、ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；Ｌは、アミノ酸リンカーであり；ＶＨ３とＶＬ３が会合して第３の抗原結合ドメインを形成する。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ３ ［Ｉｂ］
を含み、
多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩｂ］
を含み、
式中、ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインである。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、二重特異性であるか又は三重特異性である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及び第３の抗原結合ドメインが、２つ又は３つの異なる抗原に結合する。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインが第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインが第２の抗原に結合し、第３の抗原結合ドメインが第３の抗原に結合する。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインが第１の抗原に結合し、第３の抗原結合ドメインが第２の抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、３つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。
いくつかの実施形態では、３つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり：ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ軽鎖可変免疫グロブリンドメインであるか；又は
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ軽鎖可変免疫グロブリンドメインである。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、三重特異性であり、異なる３つの抗原標的に特異的に結合することができる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１ ［ＩＩＩｂ］
を含み、
多価結合タンパク質の第２の軽鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＬ４－Ｌ７－ＶＬ３－Ｌ８－ＣＬ２ ［ＩＶａ］
を含み、
式中、ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８は、アミノ酸リンカーであり；式ＩＩＩａのポリペプチドと式ＩＶａのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；ＶＨ４とＶＬ４とが会合して第４の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｃ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｅ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｆ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩｃ］
を含み、
式中、ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、四重特異性であり、４つの抗原標的（例えば、異なる４つの抗原標的）に特異的に結合することができる。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７又はＬ８は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１又はＣＬ２と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、ＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか；又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＬ２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか；又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１又はＣＬ２と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１又はＶＬ２と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、二重特異性抗原結合タンパク質である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとが、異なる抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、４つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１３－Ｌ３－ＶＨ４－ＣＨ１４ ［ＩＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ３－ＣＬ３－Ｌ４－ＶＬ４－ＣＬ４ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＨ１４は、第４の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｃ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｄ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｅ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｆ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｇ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｈ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｉ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ３とＶＨ３とが第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ４とＶＨ４とが第４の抗原結合ドメインを形成する。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの１つは、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、４つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ１１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ１－Ｌ３－ＶＬ２－Ｌ４－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１２ ［ＩＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ３－Ｌ７－ＶＬ４－Ｌ８－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｃ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ３とＶＨ３とが第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ４とＶＨ４とが第４の抗原結合ドメインを形成する。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及び／又はＣＬ２と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ３及び／又はＶＬ４のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及び／又はＶＬ４と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］
を含み、
多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ３－ＣＨ１３－Ｌ３－ＶＨ４－ＣＨ１４－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含む。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ１１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］
を含み、
多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含む。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、四重特異性であり、異なる４つの抗原標的に特異的に結合することができる。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
融合ポリペプチド－Ｌ１－ＣＨ１２ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
融合ポリペプチド－Ｌ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；Ｌ１及びＬ２は、アミノ酸リンカーであり；ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；ＶＬ１とＶＨ１とが抗原結合ドメインを形成する。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１又はＬ２は、独立して０アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１又はＬ２は、独立して少なくとも１アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
融合ポリペプチド－Ｌ３－ＣＨ１３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
融合ポリペプチド－Ｌ４－ＣＬ３ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ｂ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリンドメインであるか；又は
ｃ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリンドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成する。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はＬ４のうちの１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ２又はＣＬ３のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２又はＣＬ３と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１及び／又はＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及び／又はＶＬ２と比較して約９０％低減される。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ２又はＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ２又はＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ２又はＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上の置換を含むＣＬ２又はＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、ＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＣＨ２免疫グロブリン重鎖定常ドメインと、第１のＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含み、第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＣＨ２免疫グロブリン重鎖定常ドメインと、第２のＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多価結合タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を産生させる方法であって、結合タンパク質が産生されるように（例えば、多価結合タンパク質が宿主細胞によって発現される条件下で）本明細書に記載される宿主細胞を培養することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、結合タンパク質を宿主細胞から回収することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多価結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される多価結合タンパク質を精製する（例えば、本明細書に提供される多価結合タンパク質を１つ以上の不純物から分離する）方法が提供され、方法は、ａ）多価結合タンパク質を含む組成物（例えば、多価結合タンパク質及び誤対合又は誤会合したポリペプチドなどの不純物）を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること、並びにｂ）プロテインＬ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成することを含み、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合（又は誤会合）したポリペプチドを本質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である（例えば、誤対合又は誤会合したポリペプチドを含まない）。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中のポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合（又は誤会合）したポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多価結合タンパク質を精製する（例えば、本明細書に提供される多価結合タンパク質を誤対合又は誤会合したポリペプチドなどの１つ以上の不純物から分離する）方法が提供され、方法は、ａ）多価結合タンパク質及び誤対合（又は誤会合）したポリペプチドを含む組成物を結合及び溶出クロマトグラフィーでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること、並びにｂ）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成することを含み、プロテインＬ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合（又は誤会合）したポリペプチドを本質的に含まない。いくつかの実施形態では、プロテインＬ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である（例えば、誤対合又は誤会合したポリペプチドを含まない）。いくつかの実施形態では、プロテインＬ溶出液中のポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合又は誤会合したポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多価結合タンパク質を精製する（例えば、本明細書に提供される多価結合タンパク質を１つ以上の不純物から分離する）方法が提供され、方法は、ａ）多価結合タンパク質を含む組成物（例えば、多価抗原結合タンパク質及び誤対合又は誤会合したポリペプチドなどの不純物）を結合及び溶出モードでプロテインＡクロマトグラフィーに供し、プロテインＡ溶出液を生成すること、ｂ）プロテインＡ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること、並びにｃ）プロテインＬ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成することを含み、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合（又は誤会合）したポリペプチドを本質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である（例えば、誤対合又は誤会合したポリペプチドを含まない）。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中のポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合（又は誤会合）したポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多価結合タンパク質を精製する（例えば、本明細書に提供される多価結合タンパク質を１つ以上の不純物から分離する）方法が提供され、方法は、ａ）多価結合タンパク質を含む組成物（例えば、多価結合タンパク質及び誤対合又は誤会合したポリペプチドを含む組成物）を結合及び溶出モードでプロテインＡクロマトグラフィーに供し、プロテインＡ溶出液を生成すること、ｂ）プロテインＡ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること、並びにｃ）プロテインＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成することを含み、Ｌ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合（又は誤会合）したポリペプチドを本質的に含まない。いくつかの実施形態では、プロテインＬ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である（例えば、誤対合又は誤会合したポリペプチドを含まない）。いくつかの実施形態では、プロテインＬ溶出液中のポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合（又は誤会合）したポリペプチドである。
本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、多重特異性結合タンパク質を発現するように操作された宿主細胞に由来する。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、宿主細胞培養上清である。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、さらに誤対合したポリペプチドを含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、クロマトグラフィーの前に濾過される。本明細書の任意の実施形態による（又は本明細書に適用される）いくつかの実施形態では、方法は、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はプロテインＬクロマトグラフィーの後に、ポリッシュ工程をさらに含む。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、ポリッシュ工程は、サイズ排除クロマトグラフィーである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）－ｖＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、又はＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＬクロマトグラフィーは、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＬクロマトグラフィーカートリッジ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｌクロマトグラフィー、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）プロテインＬクロマトグラフィー、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆクロマトグラフィー、又はＫａｎＣａｐ（商標）Ｌクロマトグラフィーである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーは、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｋａｐｐａ ＸＬクロマトグラフィーである。本明細書の任意の実施形態による（又は適用される）いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わされる。
本明細書に記載される様々な実施形態の１つ、一部、又は全ての特徴を組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成してもよいことが理解されよう。本発明のこれらの及び他の態様は、当業者には明らかであろう。本発明のこれらの及び他の実施形態を、以下の発明を実施するための形態でさらに説明する。
例示的な二価結合タンパク質の概略図である。 例示的なＴｒｉｏｍａｂ（登録商標）二価結合タンパク質の概略図である。 例示的なＤｕｏｍａｂ（登録商標）二価結合タンパク質の概略図である。 「ノブ」重鎖に連結されたｓｃＦｖを含む、例示的なＡｂ－Ｎｂ三価結合タンパク質の概略図である。 「ノブ」重鎖に連結されたＶＨＨを含む、例示的なＡｂ－Ｎｂ三価結合タンパク質の概略図である。 左側にＣＯＤＶアームを含み、右側にＦａｂアームを含む、例示的なＣＯＤＶ多価結合タンパク質の概略図である。 ２つのＣＯＤＶアームを含む、例示的なＣＯＤＶ多価結合タンパク質の概略図である。 結合タンパク質の一方のアームのＣＬドメインとＣＨ１ドメインとが交換された、例示的なクロスマブ二価結合タンパク質の概略図である。 結合タンパク質の一方のアームのＶＬドメインとＶＨドメインとが交換された、例示的なクロスマブ二価結合タンパク質の概略図である。 各可変ドメインがＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む、例示的なタンデムＦａｂ多価結合タンパク質の概略図である。 Ｎ末端の可変ドメインがＶＬ及びＶＨドメインを含み、Ｃ末端の可変ドメインがＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む、例示的なタンデムＦａｂ多価結合タンパク質の概略図である。 Ｆａｂアームと融合タンパク質アームとを含む、例示的な多価結合タンパク質の概略図である。Ｆａｂアームは、単一のＦａｂで構成されている。 Ｆａｂアームと融合タンパク質アームとを含む、例示的な多価結合タンパク質の概略図である。Ｆａｂアームは、タンデムＦａｂで構成されている。 ＣＯＤＶ多価結合タンパク質を精製するための代表的な３工程のプロセスの概略図である。所望の産物は、点線の枠内に示される。ＣＯＤＶは、ノブ置換とホール置換とを含む。ＣＯＤＶのノブアームは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ ＫＯ変異（例えば、ＶＬドメインのＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー媒体に対する結合を減少させる変異）を含む。ＣＯＤＶのホールアームは、プロテインＬ ＫＯ変異（例えば、ＣＬドメインのプロテインＬに対する結合を低減させる変異）と、ＣＨ３ドメインのＲＦ変異（例えば、Ｈ４３５Ｒ及び４３６Ｆ変異であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）を含む（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３；７８－８５を参照されたい）。代表的な誤対合産物を、左上の所望の産物の隣に示す。このプロセスにおける３工程には、プロテインＡクロマトグラフィー（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（登録商標）、（ＭＳＳ））、続いてプロテインＬクロマトグラフィー、続いてＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＫＳ）クロマトグラフィーが含まれる。誤対合したタンパク質の除去が示される。 異なるＶＬカッパ及びラムダサブタイプのアミノ酸配列のアライメントを示す。Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．９，６７９－６８７，Ａｕｇｕｓｔ，２００１からの引用である。 潜在的なＰｒｏＬ ＫＯ変異体をスクリーニングした結果を示す。上部パネルは、評価した変異体を示す。下部パネルは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）Ｓｕｒｅクロマトグラフィー後のタンパク質の収率に基づく結果を示す。 アダリムマブＰｒｏＬ ＫＯバリアントのＰｒｏＬリガンドに対するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結合評価を示す。 アダリムマブＰｒｏＬ ＫＯバリアントのＴＮＦαに対するＢＬＩ結合評価を示す。 野生型と比較した、アダリムマブＰｒｏＬ ＫＯバリアントのプロテイン－Ｌ樹脂に対する結合の評価を示す。 潜在的なＫＳ ＫＯ変異体をスクリーニングした結果を示す。上部パネルは、評価した変異体を示す。下部パネルは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）Ｓｕｒｅクロマトグラフィー後のタンパク質の収率に基づく結果を示す。 アダリムマブＫＳ ＫＯバリアントのＫＳリガンドに対するＢＬＩ結合評価を示す。 アダリムマブＫＳ ＫＯバリアントのＴＮＦαに対するＢＬＩ結合評価を示す。 野生型と比較した、アダリムマブＫＳ ＫＯバリアントのＫＳ樹脂に対する結合の評価を示す。 ｐｒｏＬ ＫＯ変異を含むＶｋ２ ＦａｂアームのＬＣと、ｐｒｏ－Ｌ結合能力のあるＶｋ１ ＣＯＤＶアームのＬＣとを有する、三重特異性ＣＯＤＶを含有する抗体の２工程のクロマトグラフィーの概略図を示す。第１の工程は、ＭＳＳクロマトグラフィーである。次いで、目的のｔｒｉＡｂだけでなく、２×ＦａｂＬＣ及び２×ＣＯＤＶ ＬＣの誤対合種を含有するＭＳＳ溶出物質を、プロテイン－Ｌ樹脂上でさらに２工程で精製する。 クマシー染色された、三重特異性ＣＯＤＶの２工程の精製からの試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 ＭＳＳ精製後のアダリムマブの野生型及びＰｒｏＬ ＫＯ変異バージョンの分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）データを示す。予想された主ピークのパーセントを示す。 加速安定性試験（４０℃で２週間）の終了時に採取されたＷＴアダリムマブ及びＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ変異体の試料分析を示す。上部パネルは、クマシー染色された非還元及び還元試料のＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。下部パネルは、それぞれの対応する試料のａＳＥＣデータを示す。予想された主ピークのパーセントを示す。 ＷＴアダリムマブ及びＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ変異体に関する示差走査型蛍光分析（ｎａｎｏ－ＤＳＦ）データ、及び導出されたＴｍを示す。 ＭＳＳ精製後のアダリムマブの野生型及びＫＳ ＫＯ変異バージョンの分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）データを示す。予想された主ピークのパーセントを示す。 加速安定性試験（４０℃で２週間）の終了時に採取されたＷＴアダリムマブ及び３種のＣＬ変異体の試料分析を示す。上部パネルは、クマシー染色された非還元及び還元試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。下部パネルは、それぞれの対応する試料のａＳＥＣデータを示す。予想された主ピークのパーセント。 ＷＴアダリムマブ及び３種のＫＳ ＫＯ変異体に由来するＦ（ａｂ）’２のＤＳＣ分析を示す。 ＷＴアダリムマブ及び３種のＫＳ ＫＯ変異体に関するｎａｎｏ－ＤＳＦデータ、及び導出されたＴｍを示す。 ３工程の精製プロセス後の、クマシー染色された非還元及び還元試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。左側には、選択した高分子量バンドの識別が示されている。 ３工程の精製プロセス後の、クマシー染色された非還元及び還元試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。左側には、選択した高分子量バンドの識別が示されている。 ３工程の精製プロセスの一部としての、ＫＳ ＫＯ変異及びＰｒｏＬ ＫＯ変異を含む二重特異性抗体のＭＳＳ精製のクロマトグラムを示す。 ＭＳＳ工程、ＫＳ工程及びＰｒｏＬ工程のクロマトグラムを図２３Ｂに示す。 クマシー染色された、三重特異性ＣＯＤＶの精製からの試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 アミノ酸の番号付けがＥＵインデックスによる、Ｈｉｓ１９８Ａｒｇに置換された軽鎖を含むアダリムマブバリアントのクロマトグラムを示す。 アミノ酸の番号付けがＥＵインデックスによる、Ｇｌｎ１９９Ｔｒｐに置換された軽鎖を含むアダリムマブバリアントのクロマトグラムを示す。
概説
本発明は、第１の重鎖ポリペプチドと第１の軽鎖ポリペプチドとが会合して１つ以上の抗原結合ドメインを形成し、第２の重鎖ポリペプチドと第２の軽鎖ポリペプチドとが会合して１つ以上の抗原結合ドメインに結合する、４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、２つ以上の抗原に結合する。多価結合タンパク質の生成中に形成された、誤対合したポリペプチド鎖を含むタンパク質の存在を低減するために、１つの軽鎖にアミノ酸置換を導入して、Ｋａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に結合するのを本質的に防止し、他の軽鎖ポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、プロテインＬクロマトグラフィー材料に結合するのを本質的に防止する。また、多価結合タンパク質調製物中の誤対合したポリペプチドをさらに低減するために、多価結合タンパク質のＦｃ部分にノブイントゥーホール変異及びＲＦ変異（例えば、Ｈ４３５Ｒ及び４３６Ｆ変異であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）を含めてもよい。
本発明はまた、プロテインＡクロマトグラフィーを含むか又は含まずに、Ｋａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔクロマトグラフィー及びプロテインＬクロマトグラフィーを利用する、本発明の多価結合タンパク質を精製するための２工程及び３工程のクロマトグラフィー方法を提供する。誤対合したポリペプチドを含むタンパク質は、それらのＫａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔ結合及び／又はプロテインＬ結合の欠如に基づいて、多価結合タンパク質の調製物から除去される。
一般的な定義
本開示に従って使用される場合、以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０ヌクレオチド長の一本鎖又は二本鎖核酸ポリマーを指す。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドから構成されるヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾形態であり得る。このような修飾としては、ブロモウリジンなどの塩基修飾、アラビノシド及び２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース修飾、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、及びホスホロアミデートなどのヌクレオチド間連結修飾が挙げられる。「ポリヌクレオチド」という用語は、特に、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡを含む。
「単離ポリヌクレオチド」とは、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、若しくは合成由来のポリヌクレオチド、又はそれらのいくつかの組み合わせであり、（１）単離ポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部と会合しない、（２）天然では連結されることのないポリヌクレオチドと連結する、又は（３）より大きな配列の一部として天然には存在しない。
「単離ポリペプチド」とは、（１）通常見出される少なくとも一部の他のポリペプチドを含まない、（２）同一の源、例えば、同一種由来の他のポリペプチドを実質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現されている、（４）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、若しくは天然に会合する他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）「単離ポリペプチド」が天然に会合するポリペプチドの一部と（共有結合性若しくは非共有結合性相互作用によって）会合しない、（６）天然で会合することのないポリペプチドと（共有結合性若しくは非共有結合性相互作用によって）作動可能に会合する、又は（７）天然には存在しないものである。このような単離ポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他の合成由来のＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせによってコードされ得る。好ましくは、単離ポリペプチドは、その使用（治療、診断、予防、研究、又はその他）と干渉する、その自然環境で見られるポリペプチド又は他の汚染物質を実質的に含まない。
天然に存在する抗体は、典型的には、四量体から構成される。このようなそれぞれの四量体は、典型的に、２つの同一のポリペプチド鎖のペアで構成され、各ペアは、１つの完全長の「軽」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）と、１つの完全長の「重」鎖（典型的には約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）とを有する。「重鎖」及び「軽鎖」という用語は、本明細書で使用される場合、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖及び各重鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に典型的に関与する約１００～１１０個又はそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能に関与する定常ドメインを画定する。従って、天然に生じた抗体では、完全長の重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）とを含み、ポリペプチドのアミノ末端にＶＨドメインがあり、カルボキシル末端にＣＨ３ドメインがあり、完全長の軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）とを含み、ポリペプチドのアミノ末端にＶＬドメインがあり、カルボキシル末端にＣＬドメインがある。
ヒト軽鎖は、典型的には、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖として分類され、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。同様に、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに細分化される。完全長の軽鎖及び重鎖内では、典型的に、可変ドメイン及び定常ドメインが約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖もまた約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれるＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９）を参照されたい。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、典型的に抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインには、典型的には、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された、全体構造が同一の比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が見られる。典型的には、各ペアの２つの鎖由来のＣＤＲには、フレームワーク領域が配置されており、これによって特異的なエピトープに結合することが可能となり得る。軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインは、典型的に、アミノ末端からカルボキシル末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。
「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域中に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、様々な方式に従って各様に定義されている。Ｋａｂａｔによって表される方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）ａｎｄ（１９９１））では、抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基の番号付け方式が提供されるだけでなく、３つのＣＤＲを定める厳密な残基の境界も提供される。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２；８７７－８３）は、アミノ酸配列のレベルでは非常に多様であるにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の特定の下位部分では、ほぼ同一のペプチド骨格の立体配座をとることを発見した。これらの下位部分は、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３、又はＨ１、Ｈ２、及びＨ３として表記され、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域と重鎖領域とを意味する。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと称されることがあり、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重なる境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重なるＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９；１３３－３９；ＭａｃＣａｌｌｕｍ，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）；７３２－４５；及びＬｅｆｒａｎｃ，２００３，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７；５５－７７に記載されている。なお他のＣＤＲ境界の定義は、本明細書の方式の１つに厳密に従わなくてもよいが、とはいえ、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとは重なるが、特定の残基若しくは残基の群、又はさらにＣＤＲ全体が抗原結合に大きく影響しないという予測又は実験上の知見を考慮して、これらを短縮するか、又は延長してもよい。本明細書で使用する方法は、これらの方式のいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用してもよいが、特定の実施形態では、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用する。アミノ酸配列を使用して予測されるＣＤＲを同定することは、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ，” Ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．，Ｄｕｅｂｅｌ Ｓ．，ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐ．３３－５１（２０１０）などの分野でよく知られている。また、重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を検査して、他の従来の方法、例えば他の重鎖及び軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによってＣＤＲの配列を同定し、配列の超可変領域を決定してもよい。番号付けされた配列は、目視か、又はＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２；４６７３－８０に記載されているＣＬＵＳＴＡＬプログラムスイートのようなアライメントプログラムを使用することによってアライメントしてもよい。フレームワーク領域とＣＤＲ領域とを正確に画定し、これによって配列ベースの割り当てを補正するために、分子モデルが慣習的に使用されている。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」という用語は、単量体形態か多量体形態かにかかわらず、抗体を消化することによって生じるか又は他の手段によって産生され、ヒンジ領域を含有することもある、非抗原結合断片の配列を含む分子を指す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、ヒト由来のものであることが好ましく、いずれの免疫グロブリンであってよいが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。Ｆｃ分子は、単量体ポリペプチドから構成され、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合によって連結されて二量体形態又は多量体形態にすることができる。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、及びＩｇＧＡ２）に応じて１～４つの範囲である。Ｆｃの一例は、ジスルフィド結合された二量体であり、ＩｇＧをパパイン消化することによって得られる。本明細書で使用される場合、「天然Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体、及び多量体形態を総称したものである。
Ｆ（ａｂ）断片は、典型的には、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインとを含み、Ｆ（ａｂ）断片のＶＨ－ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができない。本明細書で使用する場合、Ｆ（ａｂ）断片はまた、アミノ酸リンカーによって分離された２つの可変ドメインを含む１つの軽鎖と、アミノ酸リンカーによって分離された２つの可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む１つの重鎖とを含み得る。
Ｆ（ａｂ’）断片は、典型的には、１つの軽鎖と、２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるように定常領域（ＣＨ１ドメインからＣＨ２ドメインの間）の多くを含有する１つの重鎖の部分とを含む。
本明細書で使用される場合、「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の結合ドメインを含む天然に存在しない（又は組換えか若しくは操作された）分子であって、２つ以上の結合ドメインが２つ以上の標的抗原に結合する分子を指す。いくつかの例では、結合タンパク質は、４つのポリペプチド鎖、典型的には、会合して少なくとも１つの抗原結合ドメインを形成する第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチドと、会合して少なくとも１つの抗原結合ドメインを形成する第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドとを含む。
「組換え」分子とは、組換え手段によって調製、発現、生成、又は単離された分子のことである。
本開示の一実施形態は、２つ以上の抗原に対して生物学的及び免疫学的特異性を有する多価結合タンパク質を提供する。本開示の別の実施形態は、このような多価結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示の別の実施形態は、このような多価結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示のなお別の実施形態は、このような多価結合タンパク質を発現する（すなわち、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードする核酸分子又はベクターを含む）宿主細胞を提供する。
本明細書で使用される場合、「交換可能性」という用語は、結合タンパク質の形式の範囲内で、折り畳み及び最終的な結合親和性を保持した可変ドメインの互換性を指す。「完全な交換可能性」とは、結合親和性を保持することで証明されるような結合タンパク質の完全な機能性を維持しながら、式Ｉのポリペプチド鎖又は式ＩＩのポリペプチド鎖内で、ＶＨ１ドメインとＶＨ２ドメインの両順序、従ってＶＬ１ドメインとＶＬ２ドメインの順序を交換する（すなわち、順序を逆にする）ことが可能であることを指す。さらに、ＶＨ及びＶＬという表記は、最終的な形式における特定のタンパク質鎖のドメインの位置のみを指すことに留意すべきである。例えば、ＶＨ１及びＶＨ２は、親抗体のＶＬ１及びＶＬ２ドメインに由来し、結合タンパク質のＶＨ１及びＶＨ２の位置に配置することができる。同様に、ＶＬ１及びＶＬ２は、親抗体のＶＨ１及びＶＨ２ドメインに由来し、結合タンパク質のＶＨ１及びＶＨ２の位置に配置することができる。従って、ＶＨ及びＶＬという表記は、現在の位置を指すものであり、親抗体における元々の位置を指すものではない。従って、ＶＨドメインとＶＬドメインとは「交換可能」である。
本明細書で使用される場合、「抗原」又は「標的抗原」又は「抗原標的」という用語は、結合タンパク質が結合することができ、さらにその抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生させるために動物に使用することができる分子又は分子の一部を指す。標的抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。結合タンパク質によって認識される各標的抗原に関して、結合タンパク質は、標的抗原を認識するインタクトな抗体と競合することができる。
「単一特異性結合タンパク質」という用語は、１つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
「一価結合タンパク質」という用語は、１つの抗原結合部位を有する結合タンパク質を指す。
「二重特異性結合タンパク質」という用語は、異なる２つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
「二価結合タンパク質」という用語は、２つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。
「三重特異性結合タンパク質」という用語は、異なる３つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
「三価結合タンパク質」という用語は、３つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。特定の実施形態では、三価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、２つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、３つの抗原標的に結合することができる。
「四重特異性結合タンパク質」という用語は、異なる４つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
「四価結合タンパク質」という用語は、４つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。特定の実施形態では、四価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、２つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、３つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、４つの抗原標的に結合することができる。
「単離」結合タンパク質は、その自然環境の成分から同定及び分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の夾雑物成分は、結合タンパク質の診断用途又は治療用途と干渉する材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質溶質又は非タンパク質溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、（１）ローリー法で測定した場合に抗体が９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を十分に得られる程度まで、又は（３）クマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いて、還元条件下又は非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質になるまで精製される。組換え細胞内にインサイチュで存在する結合タンパク質は、その結合タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離結合タンパク質に含まれる。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」又は「実質的に精製された」という用語は、存在する優勢な種である（すなわち、モル基準で組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富にある）化合物又は種を指す。いくつかの実施形態では、このような用語は相対的なものであり、必ずしも絶対的な純度を意味するものではない。いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分とは、その種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％超を含む。なお他の実施形態では、種は本質的に均質（従来の検出方法によって組成物中に混入種を検出することができない）になるまで精製され、組成物は単一の高分子種から本質的になる。なおさらなる実施形態では、種は、その自然環境下で存在するよりも、並びに／又は実験室条件下で最初に合成及び／若しくは増幅されたときよりも純度の高い形態で存在するように、純度が改善されている。
本明細書で使用される場合、「中和」結合タンパク質とは、結合する標的抗原のエフェクター機能を阻害するか、又は実質的に低減させることができる分子を指す。本明細書で使用される場合、「実質的に低減する」とは、標的抗原のエフェクター機能を、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％低減させることを意味する。
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能なあらゆる決定因子、好ましくはポリペプチド決定因子が含まれる。特定の実施形態では、エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などの化学的に活性な分子表面基を含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。エピトープとは、抗体又は結合タンパク質が結合する抗原の領域のことである。特定の実施形態では、結合タンパク質が、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。いくつかの実施形態では、平衡解離定数が≦１０－８Ｍである場合、より好ましくは平衡解離定数が≦１０－９Ｍである場合、最も好ましくは解離定数が≦１０－１０Ｍである場合に、結合タンパク質が抗原に特異的に結合すると言われる。
結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。一般に、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と分析物（溶液中の結合タンパク質）間の結合相互作用をリアルタイムで測定するものである。表面プラズモン分析はまた、分析物（バイオセンサーマトリックス上の結合タンパク質）を固定化し、リガンド（標的抗原）を提示することによって実行することができる。本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の結合タンパク質と標的抗原間の相互作用の解離定数を指す。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、結合タンパク質又はその抗原結合断片が、エピトープを含有する抗原に、少なくとも約１×１０－６Ｍ、１×１０－７Ｍ、１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、１×１０－１２Ｍ、若しくはそれ以上のＫｄで結合するか、及び／又は非特異的抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性でエピトープに結合する能力を指す。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、軽鎖及び重鎖のドメインが折り畳まれて交差した二重可変領域の免疫グロブリンとなるのに十分な可動性をもたらすように免疫グロブリンドメイン間に挿入される１つ以上のアミノ酸残基を指す。リンカーは、配列レベルでそれぞれ可変ドメイン間、又は可変ドメインと定常ドメインと間の移行部に挿入される。免疫グロブリンドメインのおおよその大きさは十分に理解されているため、ドメイン間の移行部を特定することができる。ドメインの移行部の正確な位置は、実験データによって実証されているように、又はモデリング若しくは二次構造を予測する技術によって推定することができるように、βシート又はαへリックスなどの二次構造要素を形成することのないペプチドストレッチを特定することによって決定することができる。例えば、図１Ｆに示す例示的な多価結合タンパク質に関しては、リンカーは、Ｌ１（ＶＬ２のＣ末端とＶＬ１ドメインのＮ末端との間の軽鎖に位置する）；及びＬ２（ＶＬ１のＣ末端とＣＬドメインのＮ末端との間の軽鎖に位置する）を指す。重鎖リンカーは、Ｌ３（ＶＨ１のＣ末端とＶＨ２ドメインのＮ末端との間に位置する）；及びＬ４（ＶＨ２のＣ末端とＣＨ１ドメインのＮ末端との間に位置する）として知られている。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に導入するのに用いられる、あらゆる分子（例えば、核酸、プラスミド、又はウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一種は「プラスミド」であり、環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指し、これにさらなるＤＮＡセグメントを挿入することができる。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに挿入することができる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入するときに宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これによって宿主ゲノムと共に複製することができる。さらに、特定のベクターは、これに作動的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるため、「プラスミド」という用語と「ベクター」という用語は、本明細書では互換的に用いられ得る。しかしながら、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
本明細書で使用される場合、「組換え宿主細胞」（又は「宿主細胞」）という語句は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。組換え宿主細胞又は宿主細胞は、特定の対象の細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すことが意図される。変異又は環境の影響によって後の世代に特定の改変が生じる可能性があるため、このような後代は事実上親細胞と同一ではない可能性があるが、それでもなお、このような細胞は本明細書で使用するような「宿主細胞」の用語の範囲内に含まれる。細菌、酵母、バキュロウイルス、及び哺乳動物発現系（並びにファージディスプレイ発現系）を含む、多種多様な宿主細胞発現系を使用して、結合タンパク質を発現させることができる。好適な細菌発現ベクターの一例は、ｐＵＣ１９である。結合タンパク質を組換え発現させるために、結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ断片を有する１つ以上の組換え発現ベクターによって、ポリペプチド鎖を宿主細胞に発現させるように宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトし、好ましくは、宿主細胞が培養される培地中に分泌させて、その培地から結合タンパク質を回収することができる。
本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞が新しいＤＮＡを含有するように改変されている場合、細胞は形質転換されている。例えば、細胞がその天然状態から遺伝子改変されている場合、細胞は形質転換されている。形質転換後、この形質転換ＤＮＡを、細胞の染色体に物理的に組み込むことによって細胞のＤＮＡと組換えてもよく、又は複製することなくエピソームエレメントとして一過的に維持してもよく、又はプラスミドとして独立して複製してもよい。ＤＮＡが細胞分裂しながら複製される場合、細胞は安定的に形質転換されていると見なされる。本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、細胞による外因性又は外来性ＤＮＡの取り込みを指し、外来性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当技術分野でよく知られている。このような技術を使用して、１つ以上の外来性ＤＮＡ分子を好適な宿主細胞に導入することができる。
本明細書で使用され、ある物体に適用される「天然に存在する」という用語は、その物体が自然界で見ることができ、人によって操作されていないという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、人によって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然に存在するものである。同様に、本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」とは、自然界で見られないか、又は人によって構造的に改変若しくは合成されている物体を指す。
本明細書で使用される場合、２０種の従来型アミノ酸とその略語は、従来の用法に従う。２０種の従来型アミノ酸の立体異性体（例えば、ｄ－アミノ酸）；α－，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸などの非天然アミノ酸及び類縁体、並びに他の非従来型アミノ酸もまた、結合タンパク質のポリペプチド鎖に好適な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例としては、４－ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、σ－Ｎ－メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチドの表記法では、標準的な用法及び慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシル末端方向である。
天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、以下の分類に細分化され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
（２）極性親水性：Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（４）脂肪族疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（５）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；及び
（１０）芳香族疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。
保存的アミノ酸置換は、これらの分類のうちの１つのメンバーと同一の分類の別のメンバーとの交換を伴い得る。非保存的置換は、これらの分類のうちの１つのメンバーと別の分類のメンバーとの交換を伴い得る。
当業者であれば、よく知られた技法を使用して、多価結合タンパク質のポリペプチド鎖の好適なバリアントを決定することができる。例えば、当業者であれば、活性に重要であると思われない領域を標的とすることによって、活性を損なうことなく変更することができる、ポリペプチド鎖の好適な領域を同定することができる。或いは、当業者は、類似のポリペプチドの中に保存されている分子の残基及び部分を同定することができる。加えて、生物活性又は構造に重要となる可能性がある領域であっても、生物活性を損なうことなく、又はポリペプチド構造に有害な影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換を行うことができる。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」又は「治療組成物」という用語は、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる化合物又は組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」又は「生理学的に許容される担体」という用語は、結合タンパク質の送達を達成又は増強するのに好適な１つ以上の製剤材料を指す。
１つ以上の結合タンパク質を含む医薬組成物に関して使用される場合、「有効量」及び「治療的有効量」という用語は、所望の治療結果を生み出すのに十分な量又は用量を指す。より具体的には、治療的有効量とは、治療される症状に関連する臨床的に定義された病理学的プロセスの１つ以上を、ある期間で阻害するのに十分な結合タンパク質の量である。有効量は、使用される特定の結合タンパク質に応じて、また、治療される患者及び障害の重症度に関連する種々の要因及び条件に応じて異なる可能性がある。例えば、結合タンパク質をインビボ投与する場合、患者の年齢、体重、及び健康状態だけでなく、前臨床動物研究で得られた用量反応曲線及び毒性データなどの要因を、それらの要因の中で考慮する。所与の医薬組成物の有効量又は治療有効量を決定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
本開示の一実施形態によって、薬学的に許容される担体及び治療的有効量の結合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。
特許出願、特許公報、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号を含む、本明細書で引用される全ての参照文献は、あたかもそれぞれの個々の参照文献が具体的且つ個々に示され、参照により組み込まれるかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及び／又はプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が低減された多価結合タンパク質
例示的な二価結合タンパク質
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、κ１、κ３、又はκ４サブタイプ軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ１は、Ｃκサブタイプ軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。本実施形態の一例を、図１Ａに示す。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）のＣＬ１のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）のＣＬ１の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３；７８－８５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔによる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＢＣ，２８８（３７）；Ｐ２６５８３－２６５９３を参照されたい。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１のＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる第１又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとは異なる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドは、第２の重鎖ポリペプチドとは異なる種に由来する。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第１の軽鎖ポリペプチドは、第２の軽鎖ポリペプチドとは異なる種に由来する。本実施形態の一例を、図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチドが、それぞれマウス重鎖免疫グロブリン及びマウス軽鎖免疫グロブリンに由来し、第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドが、それぞれラット重鎖免疫グロブリン及びラット軽鎖免疫グロブリンに由来する。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチドが、それぞれラット重鎖免疫グロブリン及びラット軽鎖免疫グロブリンに由来し、第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドが、それぞれマウス重鎖免疫グロブリン及びマウス軽鎖免疫グロブリンに由来する。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチド及び第２の重鎖ポリペプチドは、それぞれＩｇＧ４のＣＨ３ドメインを含む。本実施形態の一例を、図１Ｃに示す。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドは、Ｋ４０９Ｒアミノ酸置換を含み、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆ４０５Ｌアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる （図１Ｃを参照されたい）。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドは、Ｆ４０５Ｌアミノ酸置換を含み、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｋ４０９Ｒアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、二重特異性抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとが、異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとが、同一の抗原上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
例示的な三価結合タンパク質
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ３－Ｌ－ＶＬ３ ［Ｉａ］
を含み、
第１の軽鎖ポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］
を含み、
第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含み、
第２の軽鎖ポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とがアミノ酸リンカーＬを介して連結される。いくつかの実施形態では、ＶＬ３は、プロテインＬクロマトグラフィー材料に結合しない。いくつかの実施形態では、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｌは、０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、０アミノ酸長のリンカーは、結合タンパク質にリンカーが存在しないことを示す。いくつかの実施形態では、Ｌは、少なくとも１アミノ酸長である。本実施形態の一例を、図１Ｄに示す。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ３ ［Ｉｂ］
を含み、
第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩｂ］
を含む。
本実施形態の一例を、図１Ｅに示す。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、二重特異性である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、三重特異性である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及び第３の抗原結合ドメインが、２つ又は３つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインが第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインが第２の抗原に結合し、第３の抗原結合ドメインが第３の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとが第１の抗原に結合し、第３の抗原結合ドメインが第２の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質（例えば、三重特異性抗体）のＣＬ１のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）のＣＬ１の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ３の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３；７８－８５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３；７８－８５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質（例えば、三重特異性抗体）のＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）のＣＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ１のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ１の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ３の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３；７８－８５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３；７８－８５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＢＣ，２８８（３７）；Ｐ２６５８３－２６５９３を参照されたい。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１のＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる第１又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
例示的なＣＯＤＶ多価結合タンパク質
いくつかの実施形態では、３つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、３つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり：ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。本実施形態の一例を、図１Ｆに示す。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、三重特異性であり、異なる３つの抗原標的に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの１つは、独立して０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、０アミノ酸長のリンカーは、結合タンパク質にリンカーが存在しないことを示す。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）の第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１ ［ＩＩＩｂ］
を含み、
結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）の第２の軽鎖ポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＬ４－Ｌ７－ＶＬ３－Ｌ８－ＣＬ２ ［ＩＶａ］
を含み、
式中、ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８は、アミノ酸リンカーであり、式ＩＩＩａのポリペプチドと式ＩＶａのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し、ＶＨ４とＶＬ４とが会合して第４の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ軽鎖可変免疫グロブリンドメインであり；
ｃ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｅ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｆ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）の第２の重鎖ポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩｃ］
を含み、
式中、ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインである。本実施形態の一例を、図１Ｇに示す。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、四重特異性であり、異なる４つの抗原標的に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７又はＬ８のうちの１つは、独立して０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、０アミノ酸長のリンカーは、結合タンパク質にリンカーが存在しないことを示す。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７又はＬ８は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。
一実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つ以上の（例えば、３つの）異なる抗原標的又は標的タンパク質に特異的に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性及び／又は三価結合タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［Ｉ］
を含み、
第２のポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
を含み、
第３のポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
を含み、
第４のポリペプチド鎖は、次式で表される構造：
ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結する免疫グロブリンのヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し、ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が、２つの個々の抗原結合部位を形成する交差配向を有する。いくつかの実施形態では、ＶＨ１とＶＬ１が結合ペアを形成し、第１の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、ＶＨ２とＶＬ２が結合ペアを形成し、第２の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドが、第３の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、ＶＨ３（例えば、第３のポリペプチドのＶＨ３）とＶＬ３（例えば、第４のポリペプチドのＶＬ３）とが結合ペアを形成し、第３の抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つ、２つ、又は３つの抗原標的又は標的タンパク質（例えば、１つの抗原標的、異なる２つの抗原標的、又は異なる３つの抗原標的）に特異的に結合する、３つの抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、３つの抗原標的に結合する。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、異なる３つの抗原標的に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合部位のうちの２つが、同一の抗原標的に結合する。これらの実施形態では、結合タンパク質は、同一の結合ドメインを２つ含むか、若しくは異なる結合ドメインを含み、及び／又は異なる抗原若しくは同一の抗原標的上の異なるエピトープと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合部位のうちの３つが、同一の抗原標的に結合する。これらの実施形態では、結合タンパク質は、同一の結合ドメインを３つ含むか、若しくは異なる結合ドメインを含み、及び／又は異なる抗原若しくは同一の抗原標的上の異なるエピトープと特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＣＬ１の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、ＶＬ４（存在する場合）及び／又はＶＬ３のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ４（存在する場合）及び／又はＶＬ３の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３；７８－８５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＶＬ４（存在する場合）及び／又はＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ４（存在する場合）及び／又はＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。いくつかの実施形態では、ＶＬ４（存在する場合）及び／又はＶＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＣＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及び／又はＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ１及び／又はＶＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３；７８－８５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＢＣ，２８８（３７）；Ｐ２６５８３－２６５９３を参照されたい。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１のＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる第１又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
例示的なクロスマブ二価結合タンパク質
いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であり；４つのポリペプチド鎖は、次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＬ２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインである。ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。本実施形態の一例を、図１Ｈに示す。
いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であり；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＬ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する。本実施形態の一例を、図１Ｉに示す。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１又はＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＣＬ１又はＣＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ１又はＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ１又はＶＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、ＶＬ３又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＢＣ，２８８（３７）；Ｐ２６５８３－２６５９３を参照されたい。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１のＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる第１又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、二重特異性抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質ドメインの第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合が、異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
例示的なタンデムＦａｂ結合タンパク質
いくつかの実施形態では、４つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され、４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１３－Ｌ３－ＶＨ４－ＣＨ１４ ［ＩＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ３－ＣＬ３－Ｌ４－ＶＬ４－ＣＬ４ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１４は、第４の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ軽鎖可変免疫グロブリンドメインであり；
ｃ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｄ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｅ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｆ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｇ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｈ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｉ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ３とＶＨ３とが第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ４とＶＨ４とが第４の抗原結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの１つは、独立して０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、０アミノ酸長のリンカーは、結合タンパク質にリンカーが存在しないことを示す。いくつかの実施形態では、Ｌ２及び／又はＬ４は存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、４つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ１１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ１－Ｌ３－ＶＬ２－Ｌ４－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１２ ［ＩＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ３－Ｌ７－ＶＬ４－Ｌ８－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｃ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｅ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｆ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ３とＶＨ３とが第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ４とＶＨ４とが第４の抗原結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、又はＬ８のうちの１つは、独立して０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、０アミノ酸長のリンカーは、結合タンパク質にリンカーが存在しないことを示す。いくつかの実施形態では、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ７、又はＬ８のうちの少なくとも１つは存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、又はＬ８は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１又はＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多重特異性結合タンパク質のＣＬ１又はＣＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３及び／又はＶＬ４のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＶＬ３及び／又はＶＬ４の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。いくつかの実施形態では、ＶＬ３又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］
を含み、
第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ３－ＣＨ１３－Ｌ３－ＶＨ４－ＣＨ１４－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含む。本実施形態の一例を、図１Ｊに示す。
いくつかの実施形態では、多価結合ペプチドの第１の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ１１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］
を含み、
第２の重鎖ポリペプチドは、次式で表される構造：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含む。本実施形態の一例を、図１Ｋに示す。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＢＣ，２８８（３７）；Ｐ２６５８３－２６５９３を参照されたい。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１のＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それと相対するなどの）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる第１又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、四重特異性であり、異なる４つの抗原標的に特異的に結合することができる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
融合タンパク質を含む例示的な多価結合タンパク質
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインと標的結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１のポリペプチド鎖（例えば、第１の重鎖ポリペプチド）：
ＶＨ１－ＣＨ１１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第２のポリペプチド鎖（例えば、第１の軽鎖ポリペプチド）：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第３のポリペプチド（例えば、第２の重鎖ポリペプチド）：
融合ポリペプチド－Ｌ１－ＣＨ１２ ［ＩＩＩ］又は
Ｌ１－ＣＨ１２ ［ＩＩＩａ］
及び、次式で表される構造を含む、第４のポリペプチド（例えば、第２の軽鎖ポリペプチド）：
融合ポリペプチド－Ｌ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］又は
Ｌ２－ＣＬ２ ［ＩＶａ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１１は、第１のＣＨ１免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１２は、第２のＣＨ１免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；Ｌ１及びＬ２は、アミノ酸リンカーであり；ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；ＶＬ１とＶＨ１とが抗原結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）は、［ＩＩＩ］を含む第３のポリペプチドと、式［ＩＶ］を含む第４のポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）は、［ＩＩＩａ］を含む第３のポリペプチドと、式［ＩＶ］を含む第４のポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）は、［ＩＩＩ］を含む第３のポリペプチドと、式［ＩＶａ］を含む第４のポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）は、［ＩＩＩ］を含む第３のポリペプチドと、式［ＩＶ］を含む第４のポリペプチドとを含み、それぞれの融合ポリペプチドが標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原は同一である。いくつかの実施形態では、標的抗原は異なる。いくつかの実施形態では、結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）は、［ＩＩＩ］を含む第３のポリペプチドと、式［ＩＶ］を含む第４のポリペプチドとを含み、融合ポリペプチドが二量体化し、単一の標的に結合する。上記に記載される実施形態の一例を、図１Ｌに示す。いくつかの実施形態では、Ｌ１及び／又はＬ２は、独立して０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、０アミノ酸長のリンカーは、結合タンパク質にリンカーが存在しないことを示す。いくつかの実施形態では、Ｌ１及び／又はＬ２は、独立して少なくとも１アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＣＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、ＶＬ１のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。いくつかの実施形態では、ＶＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインと標的結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１のポリペプチド鎖（例えば、第１の重鎖ポリペプチド）：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第２のポリペプチド鎖（例えば、第１の軽鎖ポリペプチド）：
ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第３のポリペプチド鎖（例えば、第２の重鎖ポリペプチド）：
融合ポリペプチド－Ｌ３－ＣＨ１３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第４のポリペプチド鎖（例えば、第２の軽鎖ポリペプチド）：
ＣＬ３ ［ＩＶａ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ｂ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｃ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインと標的結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１のポリペプチド鎖（例えば、第１の重鎖ポリペプチド）：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第２のポリペプチド鎖（例えば、第１の軽鎖ポリペプチド）：
ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第３のポリペプチド鎖（例えば、第２の重鎖ポリペプチド）：
ＣＨ１３ ［ＩＩＩａ］、
及び、次式で表される構造を含む、第４のポリペプチド鎖（例えば、第２の軽鎖ポリペプチド）：
融合ポリペプチド－Ｌ３－ＣＬ３ ［ＩＶｂ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ｂ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｃ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、０アミノ酸長のリンカーは、結合タンパク質にリンカーが存在しないことを示す。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ３のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まない多価結合タンパク質のＣＬ３の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及び／又はＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及び／又はＶＬ２の結合と比較して約９０％低減される。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、ＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質のＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる。いくつかの実施形態では、ＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる。
いくつかの実施形態では、２つの抗原結合ドメインと標的結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）が提供され；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１のポリペプチド鎖（例えば、第１の重鎖ポリペプチド）：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第２のポリペプチド鎖（例えば、第１の軽鎖ポリペプチド）：
ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第３のポリペプチド鎖（例えば、第２の重鎖ポリペプチド）：
融合ポリペプチド－Ｌ３－ＣＨ１３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第４のポリペプチド鎖（例えば、第２の軽鎖ポリペプチド）：
融合ポリペプチド－Ｌ４－ＣＬ３ ［ＩＶ］
を含み、
式中、ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ｂ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｃ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、各融合ポリペプチドは、標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原は同一である。いくつかの実施形態では、標的抗原は異なる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドが二量体化し、単一の標的に結合する。上記に記載される実施形態の一例を、図１Ｍに示す。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＣＨ２免疫グロブリン重鎖定常ドメインと、第１のＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含み、多価結合タンパク質の第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＣＨ２免疫グロブリン重鎖定常ドメインと、第２のＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それと相対する）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それに相対する）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスにより、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２のＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する（例えば、それに相対する）位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
リンカー
好適なリンカーの例としては、単一のグリシン（Ｇｌｙ）残基；ジグリシンペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）；トリペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）；４つのグリシン残基のペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１））；５つのグリシン残基のペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２））；６つのグリシン残基のペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号３））；７つのグリシン残基のペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号４））；８つのグリシン残基のペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号５））が挙げられる。他のアミノ酸残基の組み合わせとして、ペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号６）、ペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号７）、ペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号８）、及びペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）などが使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、例えば、（配列番号６）ｎ（式中、ｎは０～５の整数である）、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）などであるか又はこれらを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号１１）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号１２）、又はＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号１３）であるか又はこれらを含む。他の好適なリンカーとしては、単一のＳｅｒ残基又は単一のＶａｌ残基；ジペプチドＡｒｇ－Ｔｈｒ、Ｇｌｎ－Ｐｒｏ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ、Ｔｈｒ－Ｌｙｓ、及びＳｅｒ－Ｌｅｕ；Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号１３）；Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号１４）；Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ（配列番号１５）；Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ（配列番号１６）；Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号１７）；Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号１８）；Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号１９）；Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ（配列番号２０）；Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号２１）；Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（配列番号２２）；並びにＨｉｓ－Ｉｌｅ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（配列番号２３）が挙げられる。上記に列挙した例は、本開示の範囲をいかなる形であっても限定することを意図するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、及びプロリンからなる群より選択される、ランダムに選択されたアミノ酸を含むリンカーは、結合タンパク質に好適であることが示されている。リンカー配列のさらなる説明に関しては、例えば、国際公開第２０１２１３５３４５号パンフレットを参照されたい。
リンカー中のアミノ酸残基の同一性及び配列は、リンカー内で達成するために必要とされる二次構造要素のタイプに応じて異なり得る。例えば、グリシン、セリン、及びアラニンは、最大限の柔軟性を有するリンカーとして最良のものである。グリシン、プロリン、スレオニン、及びセリンのいくつかの組み合わせは、より強固で伸長したリンカーが必要とされる場合に有用である。必要であれば、任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基と組み合わせてリンカーと見なし、所望の特性に応じたより大きなペプチドリンカーを構築してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多価結合タンパク質のリンカーは、（例えば、国際公開第２０１２／１３５３４５号パンフレットに記載されているように）抗体の可変ドメインと抗体の定常ドメインとの間の接合部に天然に存在する配列に由来する配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、内在性ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとの間、又は内在性ＶＬドメインとＣＬドメイン（例えば、カッパ若しくはラムダ）との間の移行部に見られる配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、内在性ヒトＶＨドメインとＣＨ１ドメインとの間、又は内在性ヒトＶＬドメインとＣＬドメイン（例えば、ヒトカッパ若しくはラムダ）との間の移行部に見られる配列を含む。
Ｆｃ領域及び定常ドメイン
いくつかの実施形態では、本開示の多価結合タンパク質は、１つ以上のＦｃバリアントを含む。いくつかの例では、本明細書で使用される場合、「Ｆｃバリアント」という用語は、天然Ｆｃから改変されているが、サルベージレセプターであるＦｃＲｎ（新生児型Ｆｃ受容体）の結合部位を依然として含む分子又は配列を指す。例示的なＦｃバリアント、及びそれらのサルベージレセプターとの相互作用は、当技術分野において公知である。従って、「Ｆｃバリアント」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含み得る。いくつかの例では、天然Ｆｃには、本発明の抗体様結合タンパク質に必要とされない構造的特徴又は生物活性をもたらすために除去され得る領域が含まれる。従って、「Ｆｃバリアント」という用語は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現時のＮ末端の不均質性、（４）グリコシル化、（５）相補体との相互作用、（６）サルベージレセプター以外のＦｃ受容体に対する結合、又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響又は関与する、１つ以上の天然Ｆｃ部位若しくは残基を欠くか、又は１つ以上のＦｃ部位若しくは残基が改変された分子又は配列を含む。
結合タンパク質の収率を改善するために、ＣＨ３ドメインは、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号パンフレット、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９；６１７－２１；及びＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６；６７７－８１におけるいくつかの実施例に詳細に記載されている、「ノブイントゥーホール」技術によって改変することができる。具体的には、２つのＣＨ３ドメインを含む両重鎖のヘテロ二量体化が向上するように、これら２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面が改変される。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々が「ノブ」になり得るが、他方は「ホール」となる。ジスルフィド架橋を導入することで、ヘテロ二量体がさらに安定化し（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０；２６－３５）、収率が向上する。特定の実施形態では、ノブは、単一の可変ドメインを有するポリペプチドの第２のペア上に存在する。他の実施形態では、ノブは、交差配向を有するポリペプチドの第１のペア上に存在する。なお他の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ノブインホール（ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ）を含まない。いくつかの実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する（例えば、それに相対する）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＢＣ，２８８（３７）；Ｐ２６５８３－２６５９３を参照されたい。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（例えば、ノブ置換）であり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。さらに又は代替的に、いくつかの実施形態では、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する（例えば、それと相対する）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（例えば、ホール置換）であり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、本開示の結合タンパク質は、血清半減期を改善するための１つ以上の変異を含む（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６（１）：３４６－５６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、変異は、ヒトＩｇＧ１の４２８及び４３４位に対応する（例えば、それに相対する）位置に置換を含み、番号付けはＥＵインデックスにより、アミノ酸置換は、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、クロマトグラフィー材料に対する親和性を調節することによって精製を改善するための１つ以上の変異を含む。例えば、ヘテロ二量体結合タンパク質は、ヘテロ二量体形態の２つのＦｃ領域の一方が、プロテインＡに対する結合を低減又は排除する変異を含む場合、それらのホモ二量体から分離して選択的に精製することができることが知られている。これは、ヘテロ二量体形態が、いずれかのホモ二量体形態よりもプロテインＡベースの精製に対して中間的な親和性を有することとなり、例えば、異なるｐＨを使用することによってプロテインＡから選択的に溶出させることができるためである（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１７９４３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、変異は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する（例えば、それに相対するなどの）位置に置換を含み、番号付けはＥＵインデックスにより、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、本開示の多価結合タンパク質は、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体によって媒介される抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び／又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減させるための１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５及び／又は２３９位に対応する（例えば、それと相対する）位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／又はＰ３２９Ａであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。
いくつかの実施形態では、上述した変異の種類は、任意の順序又は組み合わせで組み合わせることができる。例えば、本開示の結合タンパク質は、「ノブ」及び「ホール」変異、血清半減期を改善するための１つ以上の変異、ＩｇＧ４の安定性を改善するための１つ以上の変異、精製を改善するための１つ以上の変異、及び／又は上述のエフェクター機能を低減させるための１つ以上の変異のうちの２つ以上を含み得る。
多価結合タンパク質の精製方法
例示的なクロマトグラフィー材料
プロテインＡ
ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）のプロテインＡ（ＳＰＡ又は「プロテインＡ」）は、最初に発見された免疫グロブリン結合分子の１つであり、過去数十年間で幅広く研究されてきた。プロテインＡは、免疫グロブリンに親和性があることから、抗体、抗体構築物、及びＦｃ含有融合タンパク質の検出及び精製におけるツールとして広範な用途が見出されており、５つの免疫グロブリン結合ドメインからなるものであり、それぞれがＦｃ領域内の重鎖を介して多くの哺乳動物種由来のタンパク質、とりわけ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と結合することができる。第一世代のプロテインＡ樹脂のリガンドとして天然型のプロテインＡが使用されていたが、現在では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生された組換え型（ｒプロテインＡ）が最も流通している。市販のプロテインＡクロマトグラフィー材料としては、限定はされないが、本明細書の下記に詳述されるものが挙げられる。
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔは、カッパ軽鎖（ＬＣ）の定常領域に特異的に結合するアフィニティークロマトグラフィー材料である。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔのリガンドは、ＶＬ配列とは無関係に全てのヒトＣκ－ＬＣに高い親和性で結合する、ラクダ科の単一可変重鎖（ＨＣ）Ｉｇ（ＶＨＨ）ドメインから構成される。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔのリガンドは、主にＣκの残基と相互作用し、Ｖκ－Ｃκヒンジ領域の残基とある程度相互作用する。市販のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料としては、限定はされないが、本明細書の下記に詳述されるものが挙げられる。
プロテインＬ
プロテインＬは、ペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）という細菌の細胞壁のタンパク質であり（Ｂｊｏｅｒｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８８）“Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ－Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ Ｉｇ Ｌ－Ｃｈａｉｎｓ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０；１１９４－１１９７）、抗体又は抗体構築物（例えば、本明細書に記載される多価結合タンパク質）の抗原結合部位に干渉することなくカッパ軽鎖の可変領域に結合する（Ｎｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ ｆｒｏｍ Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ．”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６７；２２３４－２２３９）。プロテインＬは、カッパ軽鎖のＶ領域でＦＷ１と相互作用し、その結合はκ１、κ３、及びκ４サブタイプのＶＬに限定されている。市販のプロテインＬクロマトグラフィー材料としては、限定はされないが、本明細書の下記に詳述されるものが挙げられる。
例示的な２工程の精製プロセス
本明細書に記載される多価結合タンパク質の精製方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること、並びにｂ）プロテインＬ溶出液を結合及び溶出クロマトグラフィーでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成することを含み、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない。例えば、いくつかの実施形態では、（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬドメインと比較して）プロテインＬクロマトグラフィー材料に対するＶＬの結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む０又は２つのいずれかのＶＬドメインを含む結合タンパク質を望ましくないタンパク質種から分離して単離するのに好適な条件下で、多価結合タンパク質をプロテインＬと接触させる。このようにして生成されたプロテインＬ溶出液を、次いで、（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬドメインと比較して）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対するＣＬの結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む０又は２つのいずれかのＣＬドメインを含む結合タンパク質を望ましくないタンパク質種から分離して単離するのに好適な条件下で、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料と接触させる。また、本明細書に開示される多価結合タンパク質の精製方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）多価結合タンパク質及び誤対合した抗体を含む組成物を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること、並びにｂ）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成することを含み、プロテインＬ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない。
当技術分野で公知の結合及び溶出モードでプロテインＬ及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料を使用するのに好適な条件 いくつかの実施形態では、プロテインＬ及び／又はＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔは、例えば、クロマトグラフィー材料の一部として基材又は樹脂に結合されている。いくつかの実施形態では、プロテインＬクロマトグラフィーは、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＬクロマトグラフィーカートリッジ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｌクロマトグラフィー、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）プロテインＬクロマトグラフィー、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆクロマトグラフィー、又はＫａｎＣａｐ（商標）Ｌクロマトグラフィーである。さらに又は代替的に、本明細書に開示される精製プロセスのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーは、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｋａｐｐａ ＸＬクロマトグラフィーである。
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は、多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれか１つで純粋であり、これらの値の間の任意の範囲を含む。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質は、約９９％超で純粋である。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合ポリペプチドの約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％４％、３％、２％、又は１％未満のいずれかが、誤対合したポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質の約１％未満が、誤対合したポリペプチドである。
例示的な３工程の精製プロセス
本明細書に記載される多価結合タンパク質の精製方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＡクロマトグラフィーに供し、プロテインＡ溶出液を生成すること、ｂ）プロテインＡ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること、並びに（ｃ）プロテインＬ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成することを含み、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない。例えば、いくつかの実施形態では、それぞれＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換（ヒトＩｇＧ１に関して）（アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）を含む２つのＣＨ３ドメインを含む結合タンパク質を望ましくないタンパク質種から分離して単離するための条件下で、多価結合タンパク質をプロテインＡと接触させる。いくつかの実施形態では、それぞれＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ置換（ヒトＩｇＧ１に関して）（アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）を含む２つのＣＨ３ドメインを含む結合タンパク質を望ましくないタンパク質種から分離して単離するための条件下で、多価結合タンパク質をプロテインＡと接触させる。いくつかの実施形態では、それぞれＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換、並びにＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ置換（ヒトＩｇＧ１に関して）（アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）を含む２つのＣＨ３ドメインを含む結合タンパク質を望ましくないタンパク質種から分離して単離するための条件下で、多価結合タンパク質をプロテインＡと接触させる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第２のＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質の第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、さらに含む）。いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり（例えば、それに相対し）、番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり（又はそれに対応し）、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である。
（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬドメインと比較して）プロテインＬクロマトグラフィー材料に対するＶＬの結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む０又は２つのいずれかのＶＬドメインを含む結合タンパク質を望ましくないタンパク質種から分離して単離するのに好適な条件下で、プロテインＡ溶出液を次いでプロテインＬと接触させる。（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬドメインと比較して）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対するＣＬの結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む０又は２つのいずれかのＣＬドメインを含む結合タンパク質を望ましくないタンパク質種から分離して単離するのに好適な条件下で、プロテインＬ溶出液を次いでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料と接触させる。また、本明細書に記載される多価結合タンパク質の精製方法が提供され、方法は、（ａ）多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＡクロマトグラフィーに供し、プロテインＡ溶出液を生成すること、ｂ）プロテインＡ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること、並びに（ｃ）プロテインＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成することを含み、Ｌ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない。
結合及び溶出モードでプロテインＡ、プロテインＬ、及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料を使用するのに好適な条件は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、プロテインＡ、プロテインＬ、及び又はＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔのリガンドは、例えば、クロマトグラフィー材料の一部として基材又は樹脂に結合されている。本明細書に開示される精製プロセスのいずれかのいくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）－ｖＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、又はＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、プロテインＬクロマトグラフィーは、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＬクロマトグラフィーカートリッジ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｌクロマトグラフィー、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）プロテインＬクロマトグラフィー、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆクロマトグラフィー、又はＫａｎＣａｐ（商標）Ｌクロマトグラフィーである。さらに又は代替的に、本明細書に開示される精製プロセスのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーは、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｋａｐｐａ ＸＬクロマトグラフィーである。
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は、多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれか１つで純粋であり、これらの値の間の任意の範囲を含む。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質は、約９９％超で純粋である。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合ポリペプチドの約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％４％、３％、２％、又は１％未満のいずれかが、誤対合したポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質の約１％未満が、誤対合したポリペプチドである。
本明細書に開示される精製プロセスのいずれかのいくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、多重特異性結合タンパク質を産生するように操作された宿主細胞に由来する。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、宿主細胞培養上清である。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、誤対合したポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、クロマトグラフィー（例えば、第１のクロマトグラフィー工程）の前に濾過される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される精製プロセスは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー又はプロテインＬクロマトグラフィーの後にポリッシュ工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリッシュ工程は、サイズ排除クロマトグラフィーである。
本明細書に開示される精製プロセスのいずれかのいくつかの実施形態では、多価結合タンパク質を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わされる。例示的な薬学的に許容される担体及び賦形剤については、本明細書の他の箇所でさらに詳細に記載する。
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及び／又はプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が低減された多価結合タンパク質を産生する方法
核酸及びベクター
本明細書に記載される多価結合タンパク質をコードする核酸分子も企図される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多価結合タンパク質をコードする核酸（又は一連の核酸）が提供される。結合タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込み、このようなベクターを宿主細胞に導入するために、標準的な組換えＤＮＡ手法が使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄ．）を参照されたい。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般的に実施されているように、又は本明細書に記載されているように、製造業者の仕様書に従って実行され得る。具体的な定義が提供されていない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医化学及び薬化学の実験手順及び技術に関連して使用される専門用語は、周知であり且つ当技術分野で一般的に使用されているものである。同様に、化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、送達、及び患者の治療のために、従来の技術を使用してもよい。
本開示の他の態様は、本明細書に記載される結合タンパク質（例えば、多価結合タンパク質）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、単離核酸は、結合タンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導するように、異種プロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターとは、核酸の転写を誘導する核酸制御配列を指し得る。第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは結合タンパク質のコード配列に作動可能に連結されている。プロモーターの例としては、ウイルスのゲノム（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２型）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など）から得られたプロモーター、異種真核生物のプロモーター（例えば、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなど）、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０８（２）：１９３－９，１９９１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｍａｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ４３，２００５）、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主なオペレーター及びプロモーター領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、及び酵母α接合因子のプロモーターを挙げてもよいが、これらに限定されない。本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、若しくは本明細書に記載される任意の他の適切なプロモーター、又は当業者に容易に認識される他の適切なプロモーターの制御下にあってよい。
いくつかの実施形態では、単離核酸がベクターに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含み得る。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。好適なエンハンサーの例としては、哺乳動物遺伝子由来のエンハンサー配列（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、インスリンなど）、及び真核細胞ウイルス由来のエンハンサー配列（例えば、複製起点の後側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなど）を挙げてもよいが、これらに限定されない。好適なベクターの例としては、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、及びウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、麻疹ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を挙げてもよい。発現ベクターを使用して、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞などの宿主細胞をトランスフェクトすることができる。宿主中で発現及び複製することが可能な生物学的に機能的なウイルス及びプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で公知であり、目的のあらゆる細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
本開示の他の態様は、本明細書に記載される結合タンパク質のいずれかの第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖をコードする１つ以上のベクターを含むベクター系に関する。いくつかの実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖をコードする第１のベクターと、結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターと、結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖をコードする第３のベクターと、結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖をコードする第４のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１及び第２のポリペプチド鎖をコードする第１のベクターと、結合タンパク質の第３及び第４のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１及び第３のポリペプチド鎖をコードする第１のベクターと、結合タンパク質の第２及び第４のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１及び第４のポリペプチド鎖をコードする第１のベクターと、結合タンパク質の第２及び第３のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖をコードする第１のベクターを含む。ベクター系の１つ以上のベクターは、本明細書に記載されるベクターのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のベクターは、発現ベクターである。
単離宿主細胞
本開示の他の態様は、本明細書に記載される１つ以上の単離ポリヌクレオチド、ベクター、及び／又はベクター系を含む単離宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例としては、例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（例えば、Ｓ２細胞）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞（例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞）、及びスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞又はＳｆ９細胞）を挙げてもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の例としては、例えば、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、２９３細胞又は懸濁培養中で増殖するようにサブクローニングされた２９３細胞）、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ細胞、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝細胞癌株（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、並びに骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞）を挙げてもよい。
本開示の他の態様は、本明細書に記載される結合タンパク質のいずれかを産生する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、ａ）単離核酸、ベクター、及び／又はベクター系（例えば、本明細書に記載される単離核酸、ベクター、及び／又はベクター系のいずれか）を含む宿主細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細胞のいずれか）を、宿主細胞が結合タンパク質を発現するような条件下で培養すること；並びにｂ）宿主細胞から結合タンパク質を単離することを含む。タンパク質を発現させる条件下で宿主細胞を培養する方法は、当業者によく知られている。培養した宿主細胞から本明細書に記載される多価結合タンパク質を単離する方法は、当業者によく知られている。本明細書に記載される多価結合タンパク質を精製する方法は、本明細書の他の箇所に詳述されている。
多価結合タンパク質の例示的な使用
多価結合タンパク質は、１つ以上の標的抗原を検出及び定量化するための競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ方法で使用することができる。結合タンパク質は、使用されるアッセイ方法に適した親和性で１つ以上の標的抗原に結合する。
診断用途の場合、特定の実施形態では、検出可能部分によって結合タンパク質を標識してもよい。検出可能部分は、直接的又は間接的に検出可能なシグナルを生成することが可能なあらゆるものであり得る。例えば、検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、若しくは６７Ｇａなどの放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、若しくはルシフェリンなどの蛍光若しくは化学発光化合物；又はアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。
結合タンパク質はまた、インビボイメージングにも有用である。検出可能部分によって標識された結合タンパク質を動物に、好ましくはその血流に投与して、宿主中の標識抗体の存在及び位置をアッセイすることができる。結合タンパク質は、核磁気共鳴法、放射線、又は当技術分野で公知の他の検出手段にかかわらず、動物で検出可能なあらゆる部分によって標識することができる。
結合タンパク質はまた、細胞の活性化、腫瘍の標的化、サイトカイン活性の中和、ウイルス感染の中和、複数のシグナル伝達事象の組み合わせ、癌、関節炎、及び／又は炎症性障害を治療するために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても公知である）、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７－４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１としても公知である）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１ａとしても公知である）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－１ｂとしても公知である）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳとしても公知である）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３としても公知である）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２としても公知である）、ＣＣＬ１１（エオタキシンとしても公知である）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－１ｄとしても公知である）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣとしても公知である）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３ｂとしても公知である）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３ａとしても公知である）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ－２としても公知である）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２としても公知である）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫとしても公知である）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３としても公知である）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥの受容体であるＦＣＥＲ２としても公知である）、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０（Ｂ７－１としても公知である）、ＣＤ８６（Ｂ７－２としても公知である）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７（４１ＢＢとしても公知である）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４としても公知である）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとしても公知である）、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２としても公知である）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１としても公知である）、ＣＤ２７５（Ｂ７Ｈ２としても公知である）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３としても公知である）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても公知である）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１としても公知である）、ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリンとしても公知である）、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦとしても公知である）、ＣＳＦ－２（ＧＭ－ＣＳＦとしても公知である）、ＣＳＦ－３（ＧＣＳＦとしても公知である）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１としても公知である）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１としても公知である）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ－１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ（ＩＬ２５の受容体としても公知である）、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリンとしても公知である）、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤアーゼ－１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ－１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２（ＩＬ３３の受容体としても公知である）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ（ＩＬ７Ｒａの共受容体としても公知である）、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ、及びＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１としても公知である）から選択される、１つ、２つ、又は３つの抗原標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、上記の抗原標的の１つ以上は、ヒト抗原標的である。
いくつかの実施形態では、本開示の結合タンパク質は、癌を治療又は予防するために、それを必要とする患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、Ｔ細胞表面タンパク質と特異的に結合する１つの抗原結合部位と、腫瘍標的タンパク質に特異的に結合する別の抗原結合部位（例えば、Ｔ細胞表面タンパク質に特異的に結合する２つの抗原結合部位と、腫瘍標的タンパク質に特異的に結合する１つの抗原結合部位、又は腫瘍標的タンパク質に特異的に結合する２つの抗原結合部位と、Ｔ細胞表面タンパク質に特異的に結合する１つの抗原結合部位）を含む。特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位、ＣＤ２８に特異的に結合する抗原結合部位、並びにＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、Ｈｅｒ２、及びＬＡＭＰ１から選択される腫瘍標的タンパク質に特異的に結合する抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、化学療法剤と同時投与される。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。
いくつかの実施形態では、本開示の結合タンパク質は、炎症性疾患又は障害を治療又は予防するために、それを必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、それぞれＩＬ－４、ＩＬ－１３及びＴＮＦａから選択されるサイトカイン標的タンパク質と特異的に結合する３つの抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、抗炎症剤と同時投与される。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。
本開示はまた、結合タンパク質と、生体試料中の標的抗原レベルを検出するのに有用な他の試薬とを含むキットに関する。このような試薬としては、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性及び陰性対照試料、並びに検出試薬を挙げることができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される任意の結合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、ベクター系、及び／又は宿主細胞を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、容器と、容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されていてもよい。容器は、組成物それ自体か、又は症状を治療、予防及び／若しくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた組成物を収容するものであり、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針が貫通可能なストッパーのある静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。いくつかの実施形態では、ラベル又は添付文書には、選択された症状の予防、診断、及び／又は治療のために組成物を使用することが示されている。代替的に、又はさらに、製造品又はキットは、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びブドウ糖液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的且つユーザの観点から望ましい他の材料を含み得る。
多価結合タンパク質を含む治療組成物及びその投与
結合タンパク質を含む治療組成物又は医薬組成物は、本開示の範囲内である。このような治療組成物又は医薬組成物は、投与方法に適合するように選択された薬学的又は生理学的に許容される製剤化剤と混合した治療有効量の結合タンパク質、又は結合タンパク質－薬物コンジュゲートを含み得る。
許容される製剤材料は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であることが好ましい。
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄度、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着性、又は浸透性を改質、維持又は保持するための製剤材料を含み得る。適切な製剤材料としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン）、抗微生物剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（例えば、ホウ酸、重炭酸、トリス－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、又は他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトール又はグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン）、充填剤、単糖、二糖、及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、又はデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）、着色剤、香味剤及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、又は過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトール又はソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤又は湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０又はポリソルベート８０などのポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロール又はチロキサポール）、安定性増強剤（例えば、スクロース又はソルビトール）、張度増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム若しくは塩化カリウム、又はマンニトールソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／又は医薬アジュバント（例えば、あらゆる目的のために参考により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）及びその後続版を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態、及び所望の投与量に応じて当業者によって決定される。このような組成物は、結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響し得る。
医薬組成物中の主なビヒクル又は担体は、性質上、水性又は非水性のいずれかであり得る。例えば、注射に好適なビヒクル又は担体は、水、生理食塩水溶液、又は人工脳脊髄液であり得るが、場合により非経口投与用の組成物に一般的な他の材料が補充され得る。さらなる例示的なビヒクルは、中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合された生理食塩水である。他の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、又は約ｐＨ４．０～５．５の酢酸塩緩衝液を含み、ソルビトール又は好適な代替物をさらに含み得る。本開示の一実施形態では、結合タンパク質組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥されたケーキ又は水性溶液の形態で、任意選択的な製剤化剤と混合することによって保存用に調製することができる。さらに、結合タンパク質は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。
本開示の医薬組成物は、非経口送達又は皮下送達用に選択することができる。或いは、組成物は、吸入用、又は経口などの消化管を介した送達用に選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当技術分野の範囲内である。
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液は、組成物を生理学的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には約５～約８のｐＨ範囲内で維持するために使用される。
非経口投与が企図される場合、使用される治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の結合タンパク質を含む、パイロジェンフリーの非経口で許容される水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、無菌蒸留水であり、その中で結合タンパク質が無菌等張液として製剤化され、適切に保存される。なお別の調製には、産物の制御放出又は持続放出をもたらし、そしてデポー注射により送達することが可能な物質、例えば、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸若しくはポリグリコール酸）、ビーズ、又はリポソームと共に所望の分子を製剤化することが含まれ得る。ヒアルロン酸を使用することもでき、ヒアルロン酸は、循環中の持続期間を増進する効果を有し得る。所望の分子を導入するための他の好適な手段としては、埋め込み型の薬物送達デバイスが挙げられる。
一実施形態では、医薬組成物を吸入用に製剤化することができる。例えば、結合タンパク質を吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。また、結合タンパク質の吸入溶液を、エアロゾル送達用の噴射剤と共に製剤化することもできる。なお別の実施形態では、溶液を噴霧することができる。
また、特定の製剤を経口投与することができることが企図される。本開示の一実施形態では、このように投与される結合タンパク質は、錠剤及びカプセルなどの固体剤形の配合に慣習的に使用されるそのような担体の有無にかかわらず製剤化することができる。例えば、カプセルでは、バイオアベイラビリティが最大になり、全身循環前の分解が最小になるときの胃腸管における時点で製剤の活性部分を放出するように設計することができる。結合タンパク質の吸収を促進するために、さらなる薬剤を含んでもよい。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。
別の医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性の賦形剤との混合物中に有効量の結合タンパク質を含み得る。錠剤を滅菌水又は別の適切なビヒクルに溶解することにより、溶液を単位用量形式で調製することができる。好適な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウム；又は結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、若しくはアカシア；又は滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、若しくはタルクなどの不活性希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。
持続性送達又は制御性送達製剤中に結合タンパク質を含む製剤を含む、さらなる本開示の医薬組成物は、当業者には明らかであろう。様々な他の持続性又は制御性送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子又は多孔ビーズ、及びデポー注射を製剤化するための技術も当業者に公知である。持続放出性調製物のさらなる例としては、成形物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル、又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸を挙げることができる。持続放出性組成物としては、リポソームを挙げることもでき、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかで調製することができる。
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には滅菌されていなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜に通して濾過することによって達成することができる。組成物を凍結乾燥させる場合、この方法による滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後のいずれかで実施することができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で又は溶液中で保存することができる。加えて、非経口組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針が貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアル中に入れられる。
医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体として、又は乾燥粉末若しくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中で保存することができる。そのような製剤は、即時使用が可能な形態で、又は投与前に再構成することが必要となる形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。
本開示はまた、単回用量投与ユニットを作製するためのキットも包含する。キットはそれぞれ、乾燥させたタンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。また、シングルチャンバー及びマルチチャンバー型のプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットも本開示の範囲に含まれる。
治療上使用される有効量の結合タンパク質医薬組成物は、例えば、治療上の文脈及び目的に依存する。従って、治療のために適切な投与レベルは、送達される分子、結合タンパク質を使用するための効能、投与経路、並びに患者のサイズ（体重、体表面、又は臓器の大きさ）並びに状態（年齢及び一般的な健康状態）に依存して部分的に変動することが、当業者であれば理解するであろう。従って、最適な治療効果を得るために、臨床医が投与量を滴定し、投与経路を変更することができる。
投与頻度は、使用される製剤中の結合タンパク質の薬物動態パラメーターに依存する。典型的に、臨床医は、所望の効果が得られる投与量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単回用量、２回以上の用量（同量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）として経時的に投与することができるか、又は埋め込み型デバイス若しくはカテーテルによる持続注入として投与することができる。適切な投与量のさらなる改良は、当業者によって日常的に行われており、当業者によって日常的に行われる作業の範囲内である。適切な用量反応データを使用することにより、適切な投与量を把握することができる。
医薬組成物の投与経路は、公知の方法、例えば、経口；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、若しくは病巣内経路による注射；持続放出性システム；又は埋め込み型デバイスに従う。所望であれば、組成物をボーラス注射によって投与しても、又は注入によって連続的に投与しても、又は埋め込み型デバイスによって投与してもよい。
所望の分子が吸着又は封入されている膜、スポンジ、又は他の適切な材料を埋め込むことによって、組成物を局所的に投与することもできる。埋め込み型デバイスが使用される場合、デバイスを任意の好適な組織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子を拡散、持続放出ボーラス、又は連続投与によって送達することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、増殖性疾患又は障害（例えば、癌）を予防及び／又は治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、治療的有効量の本明細書に記載される結合タンパク質の少なくとも１つを患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つ以上の抗癌療法（例えば、当技術分野で公知の任意の抗癌療法）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質が、１つ以上の抗癌療法の前に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質が、１つ以上の抗癌療法と同時に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質が、１つ以上の抗レトロウイルス療法の後に投与される。
いくつかの実施形態では、本開示は、炎症性疾患又は障害（例えば、癌）を予防及び／又は治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、治療的有効量の本明細書に記載される結合タンパク質の少なくとも１つを患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つ以上の抗炎症療法（例えば、当技術分野で公知の任意の抗炎症療法）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質が、１つ以上の抗炎症療法の前に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質が、１つ以上の抗炎症療法と同時に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質が、１つ以上の抗炎症療法の後に投与される。
本開示を限定することなく、本開示の多数の実施形態を例示の目的のために下記に記載する。
例示的な実施形態
本発明は、以下に列挙した例示的な実施形態を提供する。
１．２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、κ１、κ３、又はκ４サブタイプ軽鎖可変ドメインであり、
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ１は、Ｃκサブタイプ軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
２．２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
３．１つ以上の置換を含むＣＬ１のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔに対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較して約９０％低減される、実施形態１又は実施形態２に記載の多価結合タンパク質。
４．１つ以上の置換を含むＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較して約９０％低減される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
５．１つ以上の置換を含むＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
６．１つ以上の置換を含むＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態５に記載の多価結合タンパク質。
７．１つ以上の置換を含むＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
８．１つ以上の置換を含むＣＬ１中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態７に記載の多価結合タンパク質。
９．１つ以上の置換を含むＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１０．１つ以上の置換を含むＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態１～９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１１．１つ以上の置換を含むＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態１０に記載の多価結合タンパク質。
１２．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、実施形態２～１１のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１３．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、実施形態２～１２のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１４．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである、実施形態２～１３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１５．第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１３に記載の多価結合タンパク質。
１６．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１４に記載の多価結合タンパク質。
１７．プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１５又は１６に記載の多価結合タンパク質。
１８．アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１７に記載の多価結合タンパク質。
１９．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとは異なる、請求項２～１８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
２０．第１の重鎖ポリペプチドは、第２の重鎖ポリペプチドとは異なる種に由来する、請求項２～１９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
２１．第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチドが、マウス重鎖免疫グロブリン及びマウス軽鎖免疫グロブリンに由来し、第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドが、ラット重鎖免疫グロブリン及びラット軽鎖免疫グロブリンに由来する、請求項２～１１、１９又は２０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
２２．第１の重鎖ポリペプチド及び第２の重鎖ポリペプチドが、それぞれＩｇＧ４のＣＨ３ドメインを含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
２３．第１の重鎖ポリペプチドは、Ｋ４０９Ｒアミノ酸置換を含み、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆ４０５Ｌアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項２２に記載の多価結合タンパク質。
２４．二重特異性抗原結合タンパク質である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
２５．第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとが、異なる抗原に結合する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
２６．請求項２～１８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質であって、
第１の重鎖ポリペプチド鎖が、次式で表される構造：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ３－Ｌ－ＶＬ３ ［Ｉａ］
を含み、
第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含み、
式中、
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｌは、アミノ酸リンカーであり；
ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
２７．請求項２～１８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質であって、
第１の重鎖ポリペプチド鎖が、次式で表される構造：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ３ ［Ｉｂ］
を含み、
第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩｂ］
を含み、
式中、
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインである、多価結合タンパク質。
２８．ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる、請求項２６に記載の多価結合タンパク質。
２９．ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、請求項２６に記載の多価結合タンパク質。
３０．二重特異性又は三重特異性である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
３１．第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、及び第３の抗原結合ドメインが、２つ又は３つの異なる抗原に結合する、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
３２．第１の抗原結合ドメインが第１の抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインが第２の抗原に結合し、第３の抗原結合ドメインが第３の抗原に結合する、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
３３．第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとが第１の抗原に結合し、第３の抗原結合ドメインが第２の抗原に結合する、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
３４．３つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、多価結合タンパク質。
３５．３つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ軽鎖可変免疫グロブリンドメインであるか；又は
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ軽鎖可変免疫グロブリンドメインである、多価結合タンパク質。
３６．結合タンパク質は、三重特異性であり、異なる３つの抗原標的に特異的に結合することができる、実施形態３４又は３５に記載の多価結合タンパク質。
３７．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及び／又はＬ４のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
３８．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及び／又はＬ４は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
３９．実施形態３４又は３５に記載の多価結合タンパク質であって、
第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１ ［ＩＩＩｂ］
を含み、
第２の軽鎖ポリペプチド鎖が、次式で表される構造：
ＶＬ４－Ｌ７－ＶＬ３－Ｌ８－ＣＬ２ ［ＩＶａ］
を含み、
式中、
ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８は、アミノ酸リンカーであり；
式ＩＩＩａのポリペプチドと式ＩＶａのポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；
ＶＨ４とＶＬ４とが会合して第４の抗原結合ドメインを形成し；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｃ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｅ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
ｆ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、多価結合タンパク質。
４０．実施形態３９に記載の多価結合タンパク質であって、
第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩｃ］
を含み、
式中、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインである、多価結合タンパク質。
４１．結合タンパク質は、四重特異性であり、異なる４つの抗原標的に特異的に結合することができる、実施形態３９又は４０に記載の多価結合タンパク質。
４２．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及び／又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
４３．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及び／又はＬ８は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
４４．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１又はＣＬ２と比較して約９０％低減される、実施形態３４～４３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
４５．１つ以上の置換を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４と比較して約９０％低減される、実施形態３４～４４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
４６．ＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態３４～４５のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
４７．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態４６に記載の多価結合タンパク質。
４８．１つ以上の置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態３４～４５のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
４９．１つ以上の置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態４８に記載の多価結合タンパク質。
５０．１つ以上の置換を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、実施形態３４～４９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
５１．１つ以上の置換を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態３４～５０のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
５２．１つ以上の置換を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態５１に記載の多価結合タンパク質。
５３．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、実施形態３５～３８及び４０～５２のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
５４．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、実施形態３５～３８及び４０～５３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
５５．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである、実施形態３５～３８及び４０～５３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
５６．第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態５４に記載の多価結合タンパク質。
５７．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態５５に記載の多価結合タンパク質。
５８．プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態５６又は５７に記載の多価結合タンパク質。
５９．アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態５８に記載の多価結合タンパク質。
６０．２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＶ］
を含み；
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
６１．２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＬ２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＶ］
を含み；
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
６２．２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
６３．２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み；
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
６４．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１又はＣＬ２と比較して約９０％低減される、実施形態６０～６３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
６５．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１又はＶＬ２と比較して約９０％低減される、実施形態６０～６４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
６６．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０、又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態６０～６５のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
６７．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換である、実施形態６６に記載の多価結合タンパク質。
６８．１つ以上の置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態６０～６５のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
６９．１つ以上の置換を含むＣＬ１又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態６８に記載の多価結合タンパク質。
７０．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、実施形態６０～６９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
７１．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態６０～７０のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
７２．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態７１に記載の多価結合タンパク質。
７３．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、実施形態５７～６６のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
７４．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、実施形態６１～７３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
７５．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである、実施形態６１～７４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
７６．第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態７４に記載の多価結合タンパク質。
７７．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態７５に記載の多価結合タンパク質。
７８．プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態７６又は７７に記載の多価結合タンパク質。
７９．アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態７８に記載の多価結合タンパク質。
８０．二重特異性抗原結合タンパク質である、実施形態５６～７３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
８１．第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとが、異なる抗原に結合する、実施形態６０～８０のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
８２．４つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１３－Ｌ３－ＶＨ４－ＣＨ１４ ［ＩＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ３－ＣＬ３－Ｌ４－ＶＬ４－ＣＬ４ ［ＩＶ］
を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１４は、第４の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｃ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｄ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｅ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｆ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｇ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｈ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｉ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ３とＶＨ３とが第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ４とＶＨ４とが第４の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
８３．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、実施形態８２に記載の多価結合タンパク質。
８４．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、実施形態８２又は８３に記載の結合タンパク質。
８５．４つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ１１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ１－Ｌ３－ＶＬ２－Ｌ４－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１２ ［ＩＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
ＶＬ３－Ｌ７－ＶＬ４－Ｌ８－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ｃ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ３とＶＨ３とが第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ４とＶＨ４とが第４の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
８６．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、実施形態８５に記載の多価結合タンパク質。
８７．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、実施形態８５又は８６に記載の結合タンパク質。
８８．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及び／又はＣＬ２と比較して約９０％低減される、実施形態８２～８７のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
８９．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ３及び／又はＶＬ４のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及び／又はＶＬ４と比較して約９０％低減される、実施形態８２～８８のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
９０．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態８２～８９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
９１．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態９０に記載の多価結合タンパク質。
９２．１つ以上の置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態８２～８９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
９３．１つ以上の置換を含むＣＬ１及び／又はＣＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態９２に記載の多価結合タンパク質。
９４．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、実施形態８２～９３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
９５．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態８２～９４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
９６．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ３及び／又はＶＬ４中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態９５に記載の多価結合タンパク質。
９７．実施形態８２又は８６～９６のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質であって、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－ＣＨ１３－Ｌ３－ＶＨ４－ＣＨ１４－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含む、多価結合タンパク質。
９８．実施形態８３～９６のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質であって、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ１１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
を含む、多価結合タンパク質。
９９．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメイン及び／又は第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、実施形態９７に記載の多価結合タンパク質。
１００．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、実施形態９７又は９９に記載の多価結合タンパク質。
１０１．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである、実施形態９６～１００のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１０２．第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１０１に記載の多価結合タンパク質。
１０３．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１０１に記載の多価結合タンパク質。
１０４．プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１０２又は１０３に記載の多価結合タンパク質。
１０５．アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１０４に記載の多価結合タンパク質。
１０６．結合タンパク質は、四重特異性であり、異なる４つの抗原標的に特異的に結合することができる、実施形態８２～１０５のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１０７．抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１１ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
融合ポリペプチド－Ｌ１－ＣＨ１２ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
融合ポリペプチド－Ｌ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１及びＬ２は、アミノ酸リンカーであり；
ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
ＶＬ１とＶＨ１とが抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
１０８．Ｌ１又はＬ２は、独立して０アミノ酸長である、実施形態１０７に記載の多価結合タンパク質。
１０９．Ｌ１又はＬ２は、独立して少なくとも１アミノ酸長である、実施形態１０７又は１０８に記載の結合タンパク質。
１１０．２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；４つのポリペプチド鎖は、
次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
融合ポリペプチド－Ｌ３－ＣＨ１３ ［ＩＩＩ］、
及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
融合ポリペプチド－Ｌ４－ＣＬ３ ［ＩＶ］
を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
ａ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
ｂ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリンドメインであるか；又は
ｃ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリンドメインであり；
ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成する、多価結合タンパク質。
１１１．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はＬ４のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、実施形態１１０に記載の多価結合タンパク質。
１１２．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、実施形態１１０又は１１１に記載の結合タンパク質。
１１３．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ２又はＣＬ３のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２又はＣＬ３と比較して約９０％低減される、実施形態９９～１０４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１１４．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１及び／又はＶＬ２のプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及び／又はＶＬ２と比較して約９０％低減される、実施形態１０７～１１３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１１５．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ２又はＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１０７～１１４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１１６．１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＬ２又はＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換である、実施形態１１５に記載の多価結合タンパク質。
１１７．１つ以上の置換を含むＣＬ２又はＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１０７～１１４のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１１８．１つ以上の置換を含むＣＬ２又はＣＬ３中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１１７に記載の多価結合タンパク質。
１１９．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、実施形態１０７～１１８のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１２０．１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態１０７～１１９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１２１．ＶＬ１及び／又はＶＬ２中の１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、実施形態１２０に記載の多価結合タンパク質。
１２２．第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＣＨ２免疫グロブリン重鎖定常ドメインと、第１のＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含み、第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＣＨ２免疫グロブリン重鎖定常ドメインと、第２のＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含む、実施形態１０７～１２１のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１２３．第１のＣＨ３ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、実施形態１２２に記載の多価結合タンパク質。
１２４．第１のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、実施形態１２２又は１２３のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１２５．第２の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１２４に記載の多価結合タンパク質。
１２６．第１の重鎖ポリペプチドのＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１２５に記載の多価結合タンパク質。
１２７．プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１２６に記載の多価結合タンパク質。
１２８．アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、実施形態１２７に記載の多価結合タンパク質。
１２９．多価結合タンパク質が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１～１２８のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質。
１３０．実施形態１～１２９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質をコードする、１つ以上のポリヌクレオチド。
１３１．実施形態１３０に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、１つ以上のベクター。
１３２．実施形態１３０に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、又は実施形態１３１に記載の１つ以上のベクターを含む、宿主細胞。
１３３．結合タンパク質が産生されるように実施形態１２２に記載の宿主細胞を培養することを含む、多価結合タンパク質を産生する方法。
１３４．結合タンパク質を宿主細胞から回収することをさらに含む、実施形態１３３に記載の方法。
１３５．実施形態１～１２９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
１３６．実施形態１～１２９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質を精製する方法であって、
ａ）多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること、並びに
ｂ）プロテインＬ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成することを含み、
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない方法。
１３７．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である、実施形態１３６に記載の方法。
１３８．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中のポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合したポリペプチドである、実施形態１３６又は１３７に記載の方法。
１３９．実施形態１～１２９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質を精製する方法であって、
ａ）多価結合タンパク質及び誤対合した抗体を含む組成物を結合及び溶出クロマトグラフィーでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること、並びに
ｂ）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成することを含み、
プロテインＬ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない方法。
１４０．プロテインＬ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である、実施形態１３９に記載の方法。
１４１．プロテインＬ溶出液中のポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合したポリペプチドである、実施形態１３９又は１４０に記載の方法。
１４２．実施形態１～１２９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質を精製する方法であって、
ａ）多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＡクロマトグラフィーに供し、プロテインＡ溶出液を生成すること、
ｂ）プロテインＡ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること、並びに
ｃ）プロテインＬ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成することを含み、
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない方法。
１４３．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である、実施形態１４２に記載の方法。
１４４．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中のポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合したポリペプチドである、実施形態１４２又は１４３に記載の方法。
１４５．実施形態１～１２９のいずれか１つに記載の多価結合タンパク質を精製する方法であって、
ａ）多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＡクロマトグラフィーに供し、プロテインＡ溶出液を生成すること、
ｂ）プロテインＡ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること、並びに
ｃ）プロテインＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成することを含み、
Ｌ溶出液は多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない方法。
１４６．プロテインＬ溶出液中の多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である、実施形態１４５に記載の方法。
１４７．プロテインＬ溶出液中のポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合したポリペプチドである、実施形態１４５又は１４６に記載の方法。
１４８．多価結合タンパク質を含む組成物が、多重特異性結合タンパク質を発現するように操作された宿主細胞に由来する、実施形態１３６～１４７のいずれか１つに記載の方法。
１４９．多価結合タンパク質を含む組成物が、宿主細胞培養上清である、実施形態１３６～１４８のいずれか１つに記載の方法。
１５０．多価結合タンパク質を含む組成物が、誤対合したポリペプチドをさらに含む、実施形態１３６～１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．多価結合タンパク質を含む組成物が、クロマトグラフィーの前に濾過される、実施形態１３６～１５０のいずれか１つに記載の方法。
１５２．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はプロテインＬクロマトグラフィーの後に、ポリッシュ工程をさらに含む、実施形態１３６～１５１のいずれか１つに記載の方法。
１５３．ポリッシュ工程が、サイズ排除クロマトグラフィーである、実施形態１５２に記載の方法。
１５４．プロテインＡクロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）－ｖＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、又はＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーである、実施形態１４６～１５３のいずれか１つに記載の方法。
１５５．プロテインＬクロマトグラフィーは、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＬクロマトグラフィーカートリッジ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｌクロマトグラフィー、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）プロテインＬクロマトグラフィー、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆクロマトグラフィー、又はＫａｎＣａｐ（商標）Ｌクロマトグラフィーである、実施形態１３６～１５４のいずれか１つに記載の方法。
１５６．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーは、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｋａｐｐａ ＸＬクロマトグラフィーである、実施形態１３６～１５５のいずれか１つに記載の方法。
１５７．多価結合タンパク質を含む組成物が、薬学的に許容される担体と組み合わされる、実施形態１３６～１５６のいずれか１つに記載の方法。
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態及びその様々な使用を例示するものである。これらの実施例は、説明の目的のために記載されているに過ぎず、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
実施例１．Ｐｒｏ－Ｌ ＫＯ変異体の開発
ペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）のプロテインＬ（ＰｐＬ）は、ヒト抗体カッパ軽鎖のサブクラスの可変軽鎖（ＶＬ）領域と相互作用する、マルチドメインの細菌表面タンパク質である。ＰｐＬは、ヒト抗体のラムダ軽鎖と相互作用しない。そのため、プロテイン－Ｌの組換え型は、クロマトグラフィーマトリックスに固定化した場合に、様々な抗体及び抗体断片を精製するための幅広い用途を有する。
新規の精製手法を開発することができるように、抗体軽鎖（ＬＣ）のプロテイン－Ｌに対する結合を減少させるか、又は完全に抑制させる変異を特定した。ＴＮＦαを標的化する、十分に特性決定されている抗体であるアダリムマブの可変軽鎖フレームワーク－１（ＦＷ１）ドメインに、一連の単一、二重、若しくは三重アミノ酸置換及び／又は欠失を導入した。これらの異なる変異ＬＣを含有するアダリムマブバリアントを産生し、溶液中又は樹脂に固定化したプロテイン－Ｌリガンドの結合、並びに発現力価、標的タンパク質であるＴＮＦαとの相互作用、加速安定性、及び予測される免疫原性を含む他のいくつかの特性について、野生型バージョンと比較してこれらを特性決定した。
図３は、ヒトＶＬカッパ及びラムダサブタイプにおける残基のアライメントと、それらのＰｐＬ結合特性を示す。これらの遺伝子の生殖細胞系列で最も観察された残基が、サブタイプ毎に示されている。本発明者らの試験分子であるアダリムマブのＶＬ ＦＷ１に一連の変異を設計し、プロテイン－Ｌの結合を減少させるか又は完全に消失させる変化を特定するために、配列情報だけでなく、プロテイン－Ｌと抗体のＶＬ領域との相互作用の性質について報告されている構造データも使用した。
アダリムマブ野生型及び１１種のプロテイン－Ｌ結合ノックアウト変異体、すなわちＲ１８Ｔ－Ｔ２０Ｒ、ｄｅｌＳ７、Ｓ９Ｒ－Ｒ１８Ｔ－Ｔ２０Ｒ、Ｓ９Ｒ、Ｓ９Ｐ、Ｒ１８Ｔ、ｄｅｌ７－Ｓ９Ｐ、Ｓ１２Ｐ、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ、Ｒ１８Ｐ、及びＳ７Ｐ（図４の上部パネルを参照されたい）をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に発現させ、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムに通して精製し、タンパク質力価を評価した。野生型アダリムマブを参照として使用した。
アダリムマブの重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドを、製造元のプロトコールに従ってＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ａ１４６３５）を使用して１５～３０ｍＬのＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、細胞密度が２．８×１０６／ｍＬに到達したときに、振盪フラスコ内のＥｘｐｉ２９３発現培地中で培養した。２日目に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１及び２を培養培地に添加した。トランスフェクト細胞を、懸濁液中で８％ ＣＯ２で３７℃、１２５ｒｐｍの振盪速度で７日間連続培養した。
７日目に、２００ｇで１０分間遠心することによってトランスフェクト細胞を培養培地から取り出した。次いで、細胞培養上清をさらに３５００ｇで１５分間遠心し、細胞片を除去した。最後に、細胞培養上清を０．２２μＭのフィルターに通して濾過した。
濾過した細胞培養培地を５ｍＬのｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（Ｃｙｔｉｖａ＃１１－００３４－９５）に負荷する。精製手順は、図２の工程１で説明されている手順と同じである。
ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅで精製した後のタンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してＡ２８０ｎｍで測定した。タンパク質の収率は、細胞培養液量で除算したタンパク質量（タンパク質濃度×容量）によって算出した。プロテイン－Ｌノックアウト変異体の収率は、野生型アダリムマブの収率よりもわずかに低い（図４、下部パネル）。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、溶液中１００ｎＭのｐｒｏ－Ｌリガンド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ．）に対するアダリムマブのＶＬ ＦＷ１バリアントの結合について評価した。アダリムマブ野生型、１０種のプロテイン－Ｌノックアウト変異体、及びラムダ軽鎖陰性対照抗体を、結合緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含む）中で１００ｎＭに希釈し、次いでバイオレイヤー干渉システム（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いる抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１８－５０６０）に、１．０ｎｍの密度となるように負荷した。平衡後、１００ｎＭの組換えプロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）２１１８）に対する結合を、２５℃で１８０秒の会合と１８０秒の解離によって行った。結合反応を捕捉し、１：１結合モデルを用いて結合親和性をフィッティングした。Ｓ１２Ｐ変異体ではＰｒｏ－Ｌに対する結合が大幅に減少したが、Ｓ１２Ｐ＿Ｒ１８Ｐ二重変異体ではＰｒｏ－Ｌの結合が完全に消失した。
図５には、ｗａｖｅ－１（上部、バリアントＲ１８Ｔ－Ｔ２０Ｒ、ｄｅｌＳ７、Ｓ９Ｒ－Ｒ１８Ｔ－Ｔ２０Ｒ、Ｓ９Ｒ、Ｓ９Ｐ、及びＲ１８Ｔに対する結合を示す）、ｗａｖｅ－２（下部、バリアントｄｅｌ７－Ｓ９Ｐ、Ｓ１２Ｐ、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ、及びＲ１８Ｐに対する結合を示す）、並びにｗａｖｅ－３（下部、バリアントＳ７Ｐに対する結合を示す）におけるそれぞれのアダリムマブバリアント、野生型アダリムマブ、並びにラムダ軽鎖（プロテイン－Ｌに結合しない）を有する関連のない（ＴＮＦαに結合しない）陰性対照抗体の結合曲線が示されている。
溶液中１００ｎＭのＴＮＦα（ベンダーＸによる）に対するアダリムマブＶＬ ＦＷ１バリアントのＢＬＩ結合を評価した。アダリムマブ野生型、１０種のプロテイン－Ｌノックアウト変異体、及びラムダ軽鎖陰性対照抗体を、Ｏｃｔｅｔ結合緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含む）中で１００ｎＭに希釈し、次いでバイオレイヤー干渉システム（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いる抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１８－５０６０）に、１．０ｎｍの密度となるように負荷した。平衡後、１００ｎＭの組換えＴＮＦα抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０２９１－ＴＡ－０５０）に対する結合を、２５℃で１８０秒の会合と１８０秒の解離によって行った。結合反応を捕捉し、１：１結合モデルを用いて結合親和性をフィッティングした。これらのプロテイン－Ｌノックアウト変異体は、野生型アダリムマブと同じ抗原結合を維持している。
図６には、ｗａｖｅ－１（上部、バリアントＲ１８Ｔ－Ｔ２０Ｒ、ｄｅｌＳ７、Ｓ９Ｒ－Ｒ１８Ｔ－Ｔ２０Ｒ、Ｓ９Ｒ、Ｓ９Ｐ、及びＲ１８Ｔに対する結合を示す）、ｗａｖｅ－２（下部、バリアントｄｅｌ７－Ｓ９Ｐ、Ｓ１２Ｐ、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ、及びＲ１８Ｐに対する結合を示す）、並びにｗａｖｅ－３（下部、バリアントＳ７Ｐに対する結合を示す）におけるそれぞれのアダリムマブバリアント、野生型アダリムマブ、並びに関連のない（ＴＮＦαに結合しない）陰性対照抗体の結合曲線が示されている。
野生型と比較した、アダリムマブＶＬ ＦＷ１バリアントのプロテインＬ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ．）に対する結合を評価した。１ｍｇのｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂で精製された、中性ｐＨ緩衝液中のアダリムマブ野生型及び４種のプロテイン－Ｌノックアウト変異体を、１ｍＬのプロテインＬカラム（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）、８９９２８）に１ｍＬ／分の流速で負荷した。次いで、１０カラム体積（ＣＶ）のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。フロースルー及び洗浄緩衝液中のタンパク質を回収して合わせた。洗浄後、５ＣＶの酢酸ナトリウム５０ｍＭ（ｐＨ３．５）でカラムを溶出した。溶出したタンパク質を１Ｍ（ｐＨ９．０）のトリス緩衝液を使用して中和した。カラムをさらに５ＣＶのグリシン－ＨＣｌ ５０ｍＭ（ｐＨ２．５）で溶出し、溶出液をトリス緩衝液で中和した。フロースルーと２つの溶出液中のタンパク質量を、ＮａｎｏｄｒｏｐでＡ２８０ｎｍを用いて測定した。ｄｅｌＳ７－Ｓ９Ｐ及びＳ１２Ｐ変異体は、Ｐｒｏ－Ｌカラムから部分的にフロースルーしているが（結合していない）、Ｓ１２Ｐ＿Ｒ１８Ｐは、このカラムに対する結合を完全に喪失している。
図７に示されるように、負荷量を１．０に設定し、他の試料中に回収された抗体の相対レベルをその分率量として反映したものを示す。
実施例２．ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＫＳ）ＫＯ変異体の開発
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＫＳ）は、ラクダ由来の重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）のリガンドを固定化することによって構築されたアフィニティークロマトグラフィー材料である。ＫＳ樹脂は、カッパ軽鎖の定常領域（ＣＬ）だけに選択的、大容量且つ高親和性で結合する。
新規の精製手法の開発をさらに進展させるために、抗体ＬＣのＫＳリガンド及びＫＳアフィニティー樹脂に対する結合を減少させるか、又は完全に抑制させる変異を特定した。アダリムマブのＣＬドメインに一連の単一、二重、又は三重のアミノ酸置換を設計して試験した（図８、上部パネル）。これらの異なる変異ＬＣを含有するアダリムマブバリアントを産生し、ＢＬＩ又は樹脂に固定化したＫＳによるＫＳのリガンド結合、並びに発現力価、標的タンパク質であるＴＮＦαとの相互作用、加速安定性、及び予測される免疫原性を含む他のいくつかの特性について、野生型バージョンと比較して特性決定した。
野生型及び３種のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ結合ノックアウト変異体をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させ、図４に説明されているような方法を使用して、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティー樹脂によって精製した。３種のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ結合ノックアウト変異体は、野生型アダリムマブと比較して類似したタンパク質力価を有する（図８、下部パネル）。野生型アダリムマブを参照として使用した。
アダリムマブＣＬバリアントのＫＳリガンド（Ｃｙｔｉｖａ）に対するＢＬＩ結合を評価した（図９）。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ビオチン抗ＬＣ－カッパ（ヒト）コンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７１０３２９２１００）を、Ｏｃｔｅｔ結合緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含む）で希釈し、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１８－５０１９）に負荷し、次いで、バイオレイヤー干渉計（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）においてＯｃｔｅｔ結合緩衝液中で１００ｎＭの野生型アダリムマブ及び３種のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ結合ノックアウト変異体と結合させた。結合の痕跡及び反応を捕捉した。図９は、それぞれのアダリムマブバリアント及び野生型アダリムマブの結合曲線を示す。３種のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ結合ノックアウト変異体は全て、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔリガンドに対する結合を喪失している。
溶液中１００ｎＭのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０２９１－ＴＡ－０５０）に対するアダリムマブＣＬバリアントのＢＬＩ結合評価を図１０に示す。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオセンサー及び抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサーチップ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１８－５０６０）を使用して、図６について上記に説明したようにデータを生成した。それぞれのアダリムマブＣＬバリアント、野生型アダリムマブ、及び関連のない（ＴＮＦαに結合しない）陰性対照抗体の結合曲線を示す。
野生型と比較した、アダリムマブＣＬバリアントのＫＳ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）に対する結合の評価を図１１に示す。５ｍｇのｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂で精製された、中性ｐＨ緩衝液中のアダリムマブ野生型及び３種のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔノックアウト変異体を、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７５４５８１１）に１ｍＬ／分の流速で負荷した。次いで、１０カラム体積（ＣＶ）のリン酸緩衝生理食塩水でカラムを洗浄した。フロースルー及び洗浄緩衝液中のタンパク質を回収して合わせた。洗浄後、カラムを５ＣＶのグリシン－ＨＣｌ ５０ｍＭ（ｐＨ２．５）で溶出し、溶出緩衝液及び溶出液を１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）で中和した。フロースルー及び溶出液中のタンパク質量を、ＮａｎｏｄｒｏｐでＡ２８０ｎｍを用いて測定した。３種のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔノックアウト変異体は、全てＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムに結合せずにフロースルー中に存在している。図１１に示されるグラフでは、他の画分で回収された抗体の量と比較するために、初期負荷量がｍｇ単位で示されている。
実施例３：ｐｒｏ－Ｌに結合しないＬＣを使用した、誤対合したＬＣ多重特異性抗体種のアフィニティーベースの除去に関する原理証明試験
ｐｒｏ－Ｌの結合に適合しないＶｋ２ ＦａｂアームのＬＣと、ｐｒｏ－Ｌ結合能力のある非Ｖｋ２軽鎖とを有する、三重特異性ＣＯＤＶを含有する抗体。ｐｒｏ－Ｌ結合能力のあるＣＯＤＶアームのＬＣを発現させ、次いでＭＳＳ（Ｃｙｔｉｖａ）上で処理した（図１２）。次いで、目的のｔｒｉＡｂだけでなく、２×ＦａｂＬＣ及び２×ＣＯＤＶ ＬＣの誤対合種を含有するＭＳＳ溶出物質を、さらにプロテイン－Ｌ樹脂上で２工程で精製した。
図１３は、クマシー染色された、三重特異性ＣＯＤＶの２工程の精製からの試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。還元及び非還元条件下の両方におけるＭＳＳ溶出／ｐｒｏ－Ｌ負荷、Ｐｒｏ－Ｌ ＦＴ／洗浄、及びＰｒｏ－Ｌ溶出が示されている。ｐｒｏ－Ｌに対する２工程の精製では、予想した通り、ｐｒｏ－Ｌとの相互作用に適合しないＶｋ２ ＦａｂアームのＬＣが存在することにより、２×ＦａｂＬＣの誤対合種が選択的に除去される結果となった。
実施例４：Ｐｒｏ－Ｌ ＫＯ変異を含むアダリムマブバリアントのさらなる特性決定
ＭＳＳ精製後のアダリムマブの野生型及びＶＬ ＦＷ１変異バージョンの分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）データを図１４に示す。予想された主ピークのパーセントを示す。
図１５は、加速安定性試験（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃で２週間）の終了時に採取された野生型アダリムマブ及びＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ変異体の試料分析を示す。上部パネルは、クマシー染色された非還元及び還元試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％、ビス－トリス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０３２１ＢＯＸ）を示す。下部パネルは、それぞれの対応する試料のａＳＥＣデータを示す。予想された主ピークのパーセントを示す。
アダリムマブ野生型及びＰｒｏ－Ｌ ＫＯ Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ変異体を、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）で緩衝し、タンパク質濃度を０．５ｍｇ／ｍＬに正規化した。示差走査型蛍光分析（ｎａｎｏ－ＤＳＦ）データ及びＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓから導出されたＴｍを図１６に示す。対応するキャピラリー（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ ＰＲ－Ｃ００６）に９μｌの試料を負荷し、温度を２０℃で３分間平衡化してから１℃／分で９５℃に上昇させた。蛍光発光（３３０ｎｍ及び３５０ｎｍ）を温度の関数として記録した。蛍光強度の３３０ｎｍと３５０ｎｍの比の一次導関数の極大値を温度の関数として使用し、タンパク質の融解温度を求めた。
実施例５Ａ．ＫＳ ＫＯ変異を含むアダリムマブバリアントのさらなる特性決定
ＭＳＳ精製後のアダリムマブの野生型及びＣＬ変異バージョンの分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）データを、上記で説明されているように実行した。結果を図１７に示す。予想された主ピークのパーセントを示す。
加速安定性試験（４０℃で２週間）の終了時に採取されたＷＴアダリムマブ及び３種のＣＬ変異体の試料分析を図１８に示す。上部パネルは、クマシー染色された非還元及び還元試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。下部パネルは、それぞれの対応する試料のａＳＥＣデータを示す。予想された主ピークのパーセントを示す。
Ｆ（ａｂ）’２レベルでのアダリムマブのＷＴ及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ ＫＯ変異体のＤＳＣ分析を行った。
１ｍｇのアダリムマブの野生型及び３種のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ ＫＯ変異体を、３７℃で一晩、ＩｄｅＺプロテアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐ０７７０Ｓ）で消化した。翌日、５μｇの消化抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、Ｆ（ａｂ）’２がＦｃから完全に切断されていることを確認した。プロテアーゼで消化した抗体試料の残りを、１ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＣＨ１－ＸＬアフィニティー樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ４９４３４６２０１）に負荷した。ＰＢＳで洗浄した後、試料を５カラム体積のグリシン緩衝液０．１Ｍ（ｐＨ２．５）で溶出し、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和した。
試料を１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．０）で緩衝液交換し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）をＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ－ＤＳＣシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）上で２００℃／時間の走査速度にて１５～１０５℃で行った。結果を図１９に示す。緩衝液のみの標準物質でバックグラウンド除去を行った後に、タンパク質の熱容量（Ｃｐ）を温度の関数として示した。融解曲線からＴｍ（融点）を算出した。
図２０には、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂結合のノックアウトに関する、野生型アダリムマブ及び３種のＣＬ変異体の示差走査型蛍光分析（ｎａｎｏ－ＤＳＦ）データ、及び導出されたＴｍが示されている。使用したＤＳＦ方法は、図１６で説明したものと同じである。
実施例５Ｂ．ＫＳに結合しないＬＣを使用した、誤対合したＬＣ多重特異性抗体種のアフィニティーベースの除去に関する原理証明試験
ＣＯＤＶ軽鎖に単一のＱ１９９Ｋ変異を含む三重特異性ＣＯＤＶを、Ｅｘｐｉ２９３系を使用して発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーの後にＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーを使用して精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、２×ＣＯＤＶ ＬＣ三重特異性Ａｂ、２×Ｆａｂ ＬＣ三重特異性Ａｂ、及び所望のインタクトな三重特異性Ａｂが、プロテインＡ溶出液中に存在していることが実証された（図２４）。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔのフロースルー並びに２つの低ｐＨ溶出画分（ｐＨ１．７及び２．５）を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔのフロースルーには、予想した通り２×ＣＯＤＶ ＬＣ三重特異性Ａｂが主に含まれていたが、溶出液にはこの誤対合した混入物質がなく（図２４）、このことは、ＣＯＤＶアームのＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔノックアウト変異によって２×ＣＯＤＶ ＬＣ ｔｓＡｂ種を除去することができたことを示している。
実施例６：ＣＯＤＶ抗体の３工程のアフィニティー精製手順
多重特異性抗体用のｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びプロテイン－Ｌからなる典型的な３工程のアフィニティー精製手順を評価した。
第１の精製評価では、３工程のアフィニティー精製プロセスを使用して、ＣＯＤＶ三重特異性抗体を精製した。ＣＯＤＶアームの軽鎖にＱ１９９Ｋ ＫＳ ＫＯ変異を導入し、Ｆａｂアームの軽鎖にＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ ＰｒｏＬ ＫＯ変異を導入した。抗体はまた、ＣＯＤＶ重鎖にノブ変異、Ｆａｂアームの重鎖にホール変異を有していた。
第２の精製評価では、３工程のアフィニティー精製プロセスを使用してＣＯＤＶ三重特異性抗体を精製した。Ｆａｂアームの軽鎖にＱ１９９Ｋ ＫＳ ＫＯ変異を導入し、ＣＯＤＶの軽鎖にＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ ＰｒｏＬ ＫＯ変異を導入した。抗体はまた、ＣＯＤＶ重鎖にノブ変異、Ｆａｂアームの重鎖にホール変異を有していた。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞にタンパク質を発現させてから４～１４日後に、細胞培養上清を採取した。次いで、０．２μｍのＰＥＳフィルターユニット（又は同等品）で濾過し、あらゆる微粒子を除去する。
工程１：以下の条件を使用して、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティー精製を行った。
カラム：ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ＃１１－００３４－９５）
寸法：５ｍＬカラム（１６ｍｍ×２５ｍｍ）
初期設定流量：５ｍＬ／分（最大で約２０ｍＬ／分）
緩衝液：
Ａ：０．２ＭのＮａＯＨ
Ｂ：２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２
Ｃ：５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５
Ｄ：５０ｍＭのコハク酸
Ｅ：２０％のエタノール
負荷体積：樹脂１ｍＬ当たり３０ｍｇのＩｇＧを使用して、必要となるｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂の量を計算した。５ｍＬのカラムであれば、培養細胞上清中で１５０ｍｇ超のＩｇＧを捕捉することになる。
カラム操作：
４ＣＶの緩衝液Ａを、１５分間の接触時間で消毒する。
５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすぐ。
１５ＣＶの緩衝液Ｂで平衡化する。
抗体を含有する細胞培養上清を負荷した。
１０ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄した。
５ＣＶの緩衝液Ｃで１／１０の体積（２．５ｍＬ）のトリス１Ｍ（ｐＨ９）を含有するチューブ内に溶出して中和した。
カラムを５ＣＶの緩衝液Ｄでストリップし、６００ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムを含む容器に回収して中和した。これは、ＩｇＧ２で時々見られるようにＡｂが後に溶出する場合のためである。
１０ＣＶの緩衝液Ａでカラムを洗浄した。
５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ。
１０ＣＶの緩衝液Ｂで再度平衡化した。
１０ＣＶの緩衝液Ｅで洗浄し、４℃で保存する。
次工程のアフィニティー精製のために、中性ｐＨ緩衝液中の抗体を含有するｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ溶出液を準備した。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、Ａ２８０ｎｍを用いてタンパク質濃度を測定した。次工程のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー精製に使用するタンパク質量を、結合能を超えないように計算した。
工程２：以下の条件を使用して、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー精製を行った。
カラム：ＨｉＴｒａｐ ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ ５×１ｍＬ（Ｃｙｔｉｖａ １７５４５８１１）
寸法：１ｍＬプレパックカラム
初期設定流量：１ｍＬ／分
緩衝液：
Ｆ：１０ｍＭのＮａＯＨ、ｐＨ１２
Ｇ：０．１Ｍのグリシン緩衝液、ｐＨ２．５
Ｈ：０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ２．１
試料投入：ＭＳＳの中和タンパク質溶出液。
負荷体積：樹脂１ｍＬ当たり１５ｍｇのＩｇＧを使用して、どれほどの量のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂が必要になるのかを計算した。
カラム操作：
１）１０ＣＶの緩衝液Ｆを１５分間の接触時間で定置洗浄する。この高ｐＨ緩衝液中にカラムを過剰時間放置すると、カラムが損傷することになる。
２）５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ。
３）１０ＣＶの緩衝液Ｂで平衡化した。
ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ工程１．６からの中和タンパク質溶出液を、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムに負荷した。
５）１０ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄した。
６）５ＣＶの緩衝液Ｇで１／１０の体積のトリス１Ｍ（ｐＨ９）を含有するチューブ内に溶出し、ｐＨ７～８に中和した。
７）５ＣＶの緩衝液Ｈでカラムをストリップした。この低ｐＨ緩衝液中にカラムを過剰時間放置すると、カラムが損傷することになる。
８）１０ＣＶの緩衝液Ｆでカラムを洗浄した。この高ｐＨ緩衝液中にカラムを過剰時間放置すると、カラムが損傷することになる。
９）５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ。
１０）１０ＣＶの緩衝液Ｂで再度平衡化した。
１１）１０ＣＶの緩衝液Ｅで洗浄し、４℃で保存する。
次工程のプロテイン－Ｌアフィニティー精製のために、中性ｐＨ緩衝液中の抗体を含有するＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー溶出液を準備した。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、Ａ２８０ｎｍを用いてタンパク質濃度を測定した。次工程のアフィニティー精製に使用するタンパク質の量を、結合能を超えないように計算した。
工程３：以下の条件を使用して、プロテイン－Ｌアフィニティー精製を行った。
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ８９９２９ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ、１×５ｍＬ
寸法：１ｍＬプレパックカラム
初期設定流量：１ｍＬ／分
試料投入：ＫＳ樹脂からの中和タンパク質溶出液
負荷体積：樹脂床１ｍＬ当たり４～５ｍｇのヒトＩｇＧを使用して、どれほどの量のプロテイン－Ｌ樹脂が必要となるのかを計算した。
カラム操作：
１）１０ＣＶの緩衝液Ｆを１５分間の接触時間で定置洗浄する。この高ｐＨ緩衝液中にカラムを過剰時間放置すると、カラムが損傷することになる。
２）５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ。
３）１０ＣＶの緩衝液Ｂで平衡化した。
４）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ工程からの中和タンパク質溶出液を、プロテイン－Ｌカラムに負荷した。
５）１０ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄した。
６）５ＣＶの緩衝液Ｇで１／１０の体積のトリス１Ｍ（ｐＨ９）を含有するチューブ内に溶出し、ｐＨ７～８に中和した。
７）１０ＣＶの緩衝液Ｆでカラムを洗浄した。この高ｐＨ緩衝液中にカラムを過剰時間放置すると、カラムが損傷することになる。
８）５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ。
９）１０ＣＶの緩衝液Ｂで再度平衡化した。
１０）１０ＣＶの緩衝液Ｅで洗浄し、４℃で保存した。
第１の評価（ＣＯＤＶアームのＫＳ ＫＯ／ＦａｂアームのＰｒｏＬ ＫＯ）の結果を図２１に示し、第２の評価（ＦａｂアームのＫＳ ＫＯ／ＣＯＤＶアームのＰｒｏＬ ＫＯ）の結果を図２２に示す。
実施例７．二重特異性抗体の３工程のアフィニティー精製手順
実施例６で説明されているような、典型的な３工程のアフィニティー精製手順を評価した。二重特異性抗体は、トラスツズマブアームとペルツズマブアームとを含むものであった。トラスツズマブアームは、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ ＰｒｏＬ ＫＯ変異とノブ変異とを含み、ペルツズマブアームは、Ｑ１９９Ｋ ＫＳ ＫＯ変異とホール変異とを含むものであった。また、ペルツズマブアームは、ＣＨ３ドメインにＲＦ変異を含んでいた。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ溶出液の結果を図２３Ａに示す。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ溶出液、ＫＳ溶出液及びＰｒｏ－Ｌ溶出液の結果を図２３Ｂに示す。
実施例８：多価抗体の２工程のアフィニティー精製手順
多重特異性抗体用のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ及びプロテイン－Ｌからなる多価抗体について、典型的な２工程のアフィニティー精製手順を評価する。多価抗体は、２つの軽鎖と２つの重鎖とを含む。
多価抗体の一方の軽鎖にＱ１９９Ｋ ＫＳ ＫＯ変異を導入し、多価抗体の他方の軽鎖にＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ ＰｒｏＬ ＫＯ変異を導入する。
宿主細胞中で多価抗体を産生させる。タンパク質を発現させてから４～１４日後に、細胞培養上清を採取する。次いで、０．２μｍのＰＥＳフィルターユニット（又は同等品）で細胞培養上清を濾過し、あらゆる微粒子を除去する。
工程１：以下の条件を使用して、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー精製を行う。
カラム：ＨｉＴｒａｐ ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ ５×１ｍＬ（Ｃｙｔｉｖａ １７５４５８１１）
寸法：１ｍＬプレパックカラム
初期設定流量：１ｍＬ／分
緩衝液：
Ｆ：１０ｍＭのＮａＯＨ、ｐＨ１２
Ｇ：０．１Ｍのグリシン緩衝液、ｐＨ２．５
Ｈ：０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ２．１
試料投入：ＭＳＳの中和タンパク質溶出液。
負荷体積：樹脂１ｍＬ当たり１５ｍｇのＩｇＧを使用して、どれほどの量のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂が必要になるのかを計算する。
カラム操作：
１）１０ＣＶの緩衝液Ｆを１５分間の接触時間で定置洗浄する。この高ｐＨ緩衝液中にカラムを過剰時間放置すると、カラムが損傷することになる。
２）５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすぐ。
３）１０ＣＶの緩衝液Ｂで平衡化する。
濾過した細胞培養上清を、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムに負荷する。
５）１０ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄する。
６）５ＣＶの緩衝液Ｇで１／１０の体積のトリス１Ｍ（ｐＨ９）を含有するチューブ内に溶出し、ｐＨ７～８に中和する。多価抗体を含む画分を回収する。
７）５ＣＶの緩衝液Ｈでカラムをストリップする。
８）１０ＣＶの緩衝液Ｆでカラムを洗浄する。
９）５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすぐ。
１０）１０ＣＶの緩衝液Ｂで再度平衡化する。
１１）１０ＣＶの緩衝液Ｅで洗浄し、４℃で保存する。
次工程のプロテイン－Ｌアフィニティー精製のために、中性ｐＨ緩衝液中の抗体を含有するＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティー溶出液を準備する。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、Ａ２８０ｎｍを用いてタンパク質濃度を測定する。次工程のアフィニティー精製に使用するタンパク質の量を、結合能を超えないように計算する。
工程２：以下の条件を使用して、プロテイン－Ｌアフィニティー精製を行った。
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ８９９２９ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ、１×５ｍＬ
寸法：１ｍＬプレパックカラム
初期設定流量：１ｍＬ／分
試料投入：ＫＳ樹脂からの中和タンパク質溶出液
負荷体積：樹脂床１ｍＬ当たり４～５ｍｇのヒトＩｇＧを使用して、どれほどの量のプロテイン－Ｌ樹脂が必要となるのかを計算する。
カラム操作：
１）１０ＣＶの緩衝液Ｆを１５分間の接触時間で定置洗浄する。この高ｐＨ緩衝液中にカラムを過剰時間放置すると、カラムが損傷することになる。
２）５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすぐ。
３）１０ＣＶの緩衝液Ｂで平衡化する。
４）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ工程からの中和タンパク質溶出液を、プロテイン－Ｌカラムに負荷する。
５）１０ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄する。
６）５ＣＶの緩衝液Ｇで１／１０の体積のトリス１Ｍ（ｐＨ９）を含有するチューブ内に溶出し、ｐＨ７～８に中和する。多価抗体を含む画分を回収する。
７）１０ＣＶの緩衝液Ｆでカラムを洗浄する。
８）５ＣＶのＭｉｌｌｉＱ水ですすぐ。
９）１０ＣＶの緩衝液Ｂで再度平衡化する。
１０）１０ＣＶの緩衝液Ｅで洗浄し、４℃で保存した。
実施例９．さらなるＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＫＳ）ＫＯ変異体の開発
軽鎖のＫＳリガンド及びＫＳアフィニティー樹脂に対する結合を減少させるか、又は完全に抑制する置換又は置換の組み合わせを特定するために、抗体軽鎖（ＬＣ）のＣＬドメインにさらなる一連のアミノ酸置換を設計して試験した（例えば、実施例２を参照されたい）。アダリムマブは、カッパ軽鎖と、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のバリアントとを含む抗ヒトＴＮＦα抗体であり（アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）、これを例示的な抗体として使用した。（ｉ）Ｈ１９８Ｒ置換（アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）、（ｉｉ）Ｑ１９９Ｗ置換（アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）、又は（ｉｉｉ）Ｔ１０９Ｒ及びＳ２０２Ｒ置換（アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる）を含む２つの変異ＬＣを含むアダリムマブバリアントを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。それぞれのアダリムマブバリアントの発現力価を、プロテインＡバイオセンサーによってバイオレイヤー干渉法を用いて測定した。下記の表Ａを参照されたい。上清をプロテインＡクロマトグラフィーで精製し、精製タンパク質の濃度をＵＶ－２８０の吸収によって測定した。下記の表Ａを参照されたい。
アダリムマブバリアントのＫａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔカラムのリガンドに対する結合を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって分析した。リガンド（ＴＰＰ－１３４４３、ＥＦＦ－１８－０７０－１、ラマ抗ヒトＬＣ－カッパＶＨＨ単一ドメイン抗体［ビオチン］（カタログ番号：ＮＡＢＧ－１１８）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｒｅａｔｉｖｅｂｉｏｌａｂｓ．ｎｅｔ／Ａｎｔｉ－ＬＣ－ｋａｐｐａ－ＶＨＨ－Ｓｉｎｇｌｅ－Ｄｏｍａｉｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｂｉｏｔｉｎ－１９１５５．ｈｔｍ）をストレプトアビジンバイオセンサーに負荷し、バリアントの親和性を測定した。結果を下記の表Ａに示す。（ＢＬＩの列（反応％）を参照されたい）。
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製ＨｉＴｒａｐ Ｋａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔカラム及びＡＥＫＴＡ Ｐｕｒｅを使用して、アダリムマブバリアントとＫａｐｐａ Ｓｅｌｅｃｔカラムとの相互作用の喪失を確認した。Ｈｉｓ１９８Ａｒｇに置換された軽鎖を含むアダリムマブバリアントのクロマトグラムを図２５Ａに示し、Ｇｌｎ１９９Ｔｒｐに置換された軽鎖を含むアダリムマブバリアントのクロマトグラムを図２５Ｂに示す。
アダリムマブバリアントによる標的のＴＮＦαに対する安定性及び特異的結合が、軽鎖を置換することによって影響を受けないことを確認するために、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｍｅｔｈｏｄ：ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００）及び表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ、Ｍｅｔｈｏｄ：ＴＯＳ、ＡＧ－５１４（酵母由来のヒトＴＮＦα Ｍｉｌｔｅｎｙｉ カタログ番号１３０－０９４））を実行した。結果を下記の表Ｂ及びＣに示す。
本発明者によって発見又は提案された特定の実施形態の観点から、本発明を実施するのに好ましい様式を含むように本発明を説明してきた。本開示を考慮すれば、本発明の意図した範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態に多くの修正及び変更を加えることができることを当業者は理解されるであろう。例えば、コドンの縮退により、タンパク質配列に影響を及ぼすことなく基礎となるＤＮＡ配列に変更を加えることができる。さらに、生物学的機能等価物を考慮することにより、生物学的作用の種類又は量に影響を及ぼすことなくタンパク質の構造に変更を加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (157)

  1. ２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ２－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
    を含み；
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、κ１、κ３、又はκ４サブタイプ軽鎖可変ドメインであり、
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＣＬ１は、Ｃκサブタイプ軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
    ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
    ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  2. ２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
    を含み；
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
    ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
    ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  3. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔに対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較して約９０％低減される、請求項１又は請求項２に記載の多価結合タンパク質。
  4. 前記１つ以上の置換を含む前記ＶＬ２の前記プロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較して約９０％低減される、請求項１～３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  5. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１～４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  6. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項５に記載の多価結合タンパク質。
  7. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１～４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  8. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項７に記載の多価結合タンパク質。
  9. 前記１つ以上の置換を含む前記ＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、請求項１～８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  10. 前記１つ以上の置換を含む前記ＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項１～９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  11. 前記１つ以上の置換を含む前記ＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項１０に記載の多価結合タンパク質。
  12. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び／又は前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、請求項２～１１のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  13. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、請求項２～１２のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  14. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである、請求項２～１３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  15. 前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１３に記載の多価結合タンパク質。
  16. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載の多価結合タンパク質。
  17. プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１５又は１６に記載の多価結合タンパク質。
  18. 前記アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１７に記載の多価結合タンパク質。
  19. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとは異なる、請求項２～１８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  20. 前記第１の重鎖ポリペプチドは、前記第２の重鎖ポリペプチドとは異なる種に由来する、請求項２～１９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  21. 前記第１の重鎖ポリペプチド及び前記第１の軽鎖ポリペプチドが、マウス重鎖免疫グロブリン及びマウス軽鎖免疫グロブリンに由来し、前記第２の重鎖ポリペプチド及び前記第２の軽鎖ポリペプチドが、ラット重鎖免疫グロブリン及びラット軽鎖免疫グロブリンに由来する、請求項２～１１、１９又は２０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  22. 前記第１の重鎖ポリペプチド及び前記第２の重鎖ポリペプチドが、それぞれＩｇＧ４のＣＨ３ドメインを含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  23. 前記第１の重鎖ポリペプチドは、Ｋ４０９Ｒアミノ酸置換を含み、前記第２の重鎖ポリペプチドは、Ｆ４０５Ｌアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項２２に記載の多価結合タンパク質。
  24. 二重特異性抗原結合タンパク質である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  25. 前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインとが、異なる抗原に結合する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  26. 請求項２～１８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質であって、
    前記第１の重鎖ポリペプチド鎖が、次式で表される構造：
    ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ３－Ｌ－ＶＬ３ ［Ｉａ］
    を含み、
    前記第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
    ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
    を含み、
    式中、
    ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    Ｌは、アミノ酸リンカーであり；
    ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  27. 請求項２～１８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質であって、
    前記第１の重鎖ポリペプチド鎖が、次式で表される構造：
    ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＶＨ３ ［Ｉｂ］
    を含み、
    前記第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
    ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩｂ］
    を含み、
    式中、
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインである、
    多価結合タンパク質。
  28. ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較して前記プロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる、請求項２６に記載の多価結合タンパク質。
  29. ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、請求項２６に記載の多価結合タンパク質。
  30. 二重特異性又は三重特異性である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  31. 前記第１の抗原結合ドメイン、前記第２の抗原結合ドメイン、及び前記第３の抗原結合ドメインが、２つ又は３つの異なる抗原に結合する、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  32. 前記第１の抗原結合ドメインが第１の抗原に結合し、前記第２の抗原結合ドメインが第２の抗原に結合し、前記第３の抗原結合ドメインが第３の抗原に結合する、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  33. 前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインとが第１の抗原に結合し、前記第３の抗原結合ドメインが第２の抗原に結合する、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  34. ３つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ３－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
    を含み、
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
    式Ｉの前記ポリペプチドと式ＩＩの前記ポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；
    ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
    ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
    ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、
    多価結合タンパク質。
  35. ３つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ３－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ３－ＣＬ２ ［ＩＶ］
    を含み、
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
    式Ｉの前記ポリペプチドと式ＩＩの前記ポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；
    ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ３とＶＬ３とが会合して第３の抗原結合ドメインを形成し；
    ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｂ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｃ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ軽鎖可変免疫グロブリンドメインであるか；又は
    ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ軽鎖可変免疫グロブリンドメインである、
    多価結合タンパク質。
  36. 前記結合タンパク質は、三重特異性であり、異なる３つの抗原標的に特異的に結合することができる、請求項３４又は３５に記載の多価結合タンパク質。
  37. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及び／又はＬ４のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  38. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及び／又はＬ４は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  39. 請求項３４又は３５に記載の多価結合タンパク質であって、
    前記第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
    ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１ ［ＩＩＩｂ］
    を含み、
    第２の軽鎖ポリペプチド鎖が、次式で表される構造：
    ＶＬ４－Ｌ７－ＶＬ３－Ｌ８－ＣＬ２ ［ＩＶａ］
    を含み、
    式中、
    ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８は、アミノ酸リンカーであり；
    式ＩＩＩａの前記ポリペプチドと式ＩＶａの前記ポリペプチドとが、交差した軽鎖－重鎖ペアを形成し；
    ＶＨ４とＶＬ４とが会合して第４の抗原結合ドメインを形成し；
    ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ｃ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ｄ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｅ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであるか；又は
    ｆ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである、
    多価結合タンパク質。
  40. 請求項３９に記載の多価結合タンパク質であって、
    前記第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
    ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩｃ］
    を含み、
    式中、
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインである、
    多価結合タンパク質。
  41. 前記結合タンパク質は、四重特異性であり、異なる４つの抗原標的に特異的に結合することができる、請求項３９又は４０に記載の多価結合タンパク質。
  42. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及び／又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  43. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及び／又はＬ８は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  44. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２の前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１又はＣＬ２と比較して約９０％低減される、請求項３４～４３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  45. 前記１つ以上の置換を含む前記ＶＬ１、前記ＶＬ２、前記ＶＬ３及び／又は前記ＶＬ４の前記プロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３及び／又はＶＬ４と比較して約９０％低減される、請求項３４～４４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  46. 前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  47. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項４６に記載の多価結合タンパク質。
  48. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  49. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項４８に記載の多価結合タンパク質。
  50. 前記１つ以上の置換を含む前記ＶＬ１、前記ＶＬ２、前記ＶＬ３及び／又は前記ＶＬ４中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、請求項３４～４９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  51. 前記１つ以上の置換を含む前記ＶＬ１、前記ＶＬ２、前記ＶＬ３及び／又は前記ＶＬ４中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項３４～５０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  52. 前記１つ以上の置換を含む前記ＶＬ１、前記ＶＬ２、前記ＶＬ３及び／又は前記ＶＬ４中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項５１に記載の多価結合タンパク質。
  53. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び／又は前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、請求項３５～３８又は４０～５２のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  54. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、請求項３５～３８又は４０～５３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  55. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである、請求項３５～３８又は４０～５３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  56. 前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項５４に記載の多価結合タンパク質。
  57. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項５５に記載の多価結合タンパク質。
  58. プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項５６又は５７に記載の多価結合タンパク質。
  59. 前記アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項５８に記載の多価結合タンパク質。
  60. ２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＶ］
    を含み；
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、
    ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
    ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  61. ２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ２－ＣＬ２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＶ］
    を含み；
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
    ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
    ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  62. ２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＬ２－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＨ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
    を含み；
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
    ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  63. ２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
    を含み；
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ａ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させるか、又は
    ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ＶＨ１とＶＬ１とが会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが会合して第２の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  64. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２の前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１又はＣＬ２と比較して約９０％低減される、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  65. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ１又は前記ＶＬ２の前記プロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１又はＶＬ２と比較して約９０％低減される、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  66. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０、又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項６０～６５のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  67. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換である、請求項６６に記載の多価結合タンパク質。
  68. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項６０～６５のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  69. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項６８に記載の多価結合タンパク質。
  70. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ１又は前記ＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、請求項６０～６９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  71. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ１又は前記ＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項６０～７０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  72. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含むＶＬ１又はＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項７１に記載の多価結合タンパク質。
  73. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び／又は前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、請求項５７～６６のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  74. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、請求項６１～７３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  75. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである、請求項６１～７４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  76. 前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項７４に記載の多価結合タンパク質。
  77. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項７５に記載の多価結合タンパク質。
  78. 前記プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項７６又は７７に記載の多価結合タンパク質。
  79. 前記アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項７８に記載の多価結合タンパク質。
  80. 二重特異性抗原結合タンパク質である、請求項５６～７３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  81. 前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインとが、異なる抗原に結合する、請求項６０～８０のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  82. ４つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
    ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ３－ＣＨ１３－Ｌ３－ＶＨ４－ＣＨ１４ ［ＩＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
    ＶＬ３－ＣＬ３－Ｌ４－ＶＬ４－ＣＬ４ ［ＩＶ］
    を含み、
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１４は、第４の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
    ａ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｂ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ｃ）ＣＬ１及びＣＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及びＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ｄ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｅ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ｆ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ｇ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｈ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ｉ）ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＣＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ３とＶＨ３とが第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ４とＶＨ４とが第４の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  83. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、請求項８２に記載の多価結合タンパク質。
  84. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、請求項８２又は８３に記載の結合タンパク質。
  85. ４つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ１１ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド：
    ＶＬ１－Ｌ３－ＶＬ２－Ｌ４－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１２ ［ＩＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
    ＶＬ３－Ｌ７－ＶＬ４－Ｌ８－ＣＬ２ ［ＩＶ］
    を含み、
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ４は、第４の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ４は、第４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８は、アミノ酸リンカーであり；
    ａ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３及びＶＬ４は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及びＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ｂ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ｃ）ＣＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ４は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ４と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ３は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン又はκ２サブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ３とＶＨ３とが第３の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ４とＶＨ４とが第４の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  86. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、請求項８５に記載の多価結合タンパク質。
  87. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、又はＬ８のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、請求項８５又は８６に記載の結合タンパク質。
  88. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ１及び／又は前記ＣＬ２の前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ１及び／又はＣＬ２と比較して約９０％低減される、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  89. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ３及び／又は前記ＶＬ４の前記プロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ３及び／又はＶＬ４と比較して約９０％低減される、請求項８２～８８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  90. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ１及び／又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項８２～８９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  91. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ１及び／又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項９０に記載の多価結合タンパク質。
  92. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１及び／又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項８２～８９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  93. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ１及び／又は前記ＣＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項９２に記載の多価結合タンパク質。
  94. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ３及び／又は前記ＶＬ４中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、請求項８２～９３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  95. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ３及び／又は前記ＶＬ４中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項８２～９４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  96. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ３及び／又は前記ＶＬ４中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項９５に記載の多価結合タンパク質。
  97. 請求項８２又は８６～９６のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質であって、
    前記第１の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
    ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］
    を含み、
    前記第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
    ＶＨ３－ＣＨ１３－Ｌ３－ＶＨ４－ＣＨ１４－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
    を含む、多価結合タンパク質。
  98. 請求項８３～９６のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質であって、
    前記第１の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
    ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＣＨ１１－ＣＨ２－ＣＨ３ ［Ｉａ］
    を含み、
    前記第２の重鎖ポリペプチドが、次式で表される構造：
    ＶＨ３－Ｌ５－ＶＨ４－Ｌ６－ＣＨ１２－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩａ］
    を含む、
    多価結合タンパク質。
  99. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメイン及び／又は前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、請求項９７に記載の多価結合タンパク質。
  100. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、請求項９７又は９９に記載の多価結合タンパク質。
  101. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖであり；前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗである、請求項９６～１００のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  102. 前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１０１に記載の多価結合タンパク質。
  103. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１０１に記載の多価結合タンパク質。
  104. 前記プロテインＡクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１０２又は１０３に記載の多価結合タンパク質。
  105. 前記アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１０４に記載の多価結合タンパク質。
  106. 前記結合タンパク質は、四重特異性であり、異なる４つの抗原標的に特異的に結合することができる、請求項８２～１０５のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  107. 抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１１ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ１－ＣＬ１ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    融合ポリペプチド－Ｌ１－ＣＨ１２ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド鎖：
    融合ポリペプチド－Ｌ２－ＣＬ２ ［ＩＶ］
    を含み、
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    Ｌ１及びＬ２は、アミノ酸リンカーであり；
    ＣＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ；
    ＶＬ１とＶＨ１とが抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  108. Ｌ１又はＬ２は、独立して０アミノ酸長である、請求項１０７に記載の多価結合タンパク質。
  109. Ｌ１又はＬ２は、独立して少なくとも１アミノ酸長である、請求項１０７又は１０８に記載の結合タンパク質。
  110. ２つの抗原結合ドメインを形成する４つのポリペプチド鎖を含む多価結合タンパク質であって；前記４つのポリペプチド鎖は、
    次式で表される構造を含む、第１の重鎖ポリペプチド：
    ＶＨ１－ＣＨ１１－Ｌ１－ＶＨ２－ＣＨ１２ ［Ｉ］、
    次式で表される構造を含む、第１の軽鎖ポリペプチド鎖：
    ＶＬ１－ＣＬ１－Ｌ２－ＶＬ２－ＣＬ２ ［ＩＩ］、
    次式で表される構造を含む、第２の重鎖ポリペプチド：
    融合ポリペプチド－Ｌ３－ＣＨ１３ ［ＩＩＩ］、
    及び、次式で表される構造を含む、第２の軽鎖ポリペプチド：
    融合ポリペプチド－Ｌ４－ＣＬ３ ［ＩＶ］
    を含み、
    式中、
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＨ１１は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１２は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１３は、第３の免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
    ａ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１及びＶＬ２は、それぞれ１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及びＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、
    ｂ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリンドメインであるか；又は
    ｃ）ＣＬ３は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ３と比較してＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、これによって前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ２と比較してプロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合を低減させ、ＶＬ１は、λサブタイプ免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン若しくはκ２サブタイプ免疫グロブリンドメインであり；
    ＶＬ１とＶＨ１とが第１の抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２とＶＨ２とが第２の抗原結合ドメインを形成する、
    多価結合タンパク質。
  111. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、又はＬ４のうちの少なくとも１つは、それぞれ独立して０アミノ酸長である、請求項１１０に記載の多価結合タンパク質。
  112. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４は、それぞれ独立して少なくとも１アミノ酸長である、請求項１１０又は１１１に記載の結合タンパク質。
  113. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ２又は前記ＣＬ３の前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＣＬ２又はＣＬ３と比較して約９０％低減される、請求項９９～１０４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  114. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ１及び／又は前記ＶＬ２の前記プロテインＬクロマトグラフィー材料に対する結合が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＶＬ１及び／又はＶＬ２と比較して約９０％低減される、請求項１０７～１１３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  115. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ２又は前記ＣＬ３中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１１０、又は１９９に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１０７～１１４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  116. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＣＬ２又は前記ＣＬ３中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｔ１０９Ａ置換、Ｖ１１０Ｄ置換、Ｑ１９９Ｋ置換、Ｔ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｖ１１０Ｄ－Ｑ１９９Ｋ置換である、請求項１１５に記載の多価結合タンパク質。
  117. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ２又は前記ＣＬ３中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１０９、１９８、１９９、又は２０２に対応する位置にあり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１０７～１１４のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  118. 前記１つ以上の置換を含む前記ＣＬ２又は前記ＣＬ３中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｈ１９８Ｒ置換、Ｑ１９９Ｗ置換、又はＴ１０９Ａ－Ｓ２０２Ｒ置換であり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１１７に記載の多価結合タンパク質。
  119. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ１及び／又は前記ＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワークのアミノ酸置換である、請求項１０７～１１８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  120. 前記１つ以上のアミノ酸置換を含む前記ＶＬ１及び／又は前記ＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、１２又は１８に対応する位置にあり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項１０７～１１９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  121. 前記ＶＬ１及び／又は前記ＶＬ２中の前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ１２Ｐ置換、Ｒ１８Ｐ置換、Ｒ１８Ｑ置換、Ｓ１２Ｐ－Ｒ１８Ｐ置換、又はＳ１２Ｐ－Ｒ１８Ｑ置換であり、番号付けはＫａｂａｔによる、請求項１２０に記載の多価結合タンパク質。
  122. 前記第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＣＨ２免疫グロブリン重鎖定常ドメインと、第１のＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含み、前記第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＣＨ２免疫グロブリン重鎖定常ドメインと、第２のＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含む、請求項１０７～１２１のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  123. 前記第１のＣＨ３ドメイン及び／又は前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、請求項１２２に記載の多価結合タンパク質。
  124. 前記第１のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３５４及び３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗであり；第２のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、４０７、４３５、及び４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、番号付けはＥＵインデックスによるものであり、前記アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである、請求項１２２又は１２３のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  125. 前記第２の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１２４に記載の多価結合タンパク質。
  126. 前記第１の重鎖ポリペプチドの前記ＣＨ３は、プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１２５に記載の多価結合タンパク質。
  127. プロテインＡに対する結合を低減させる１つ以上のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１の４３５及び４３６位に対応する位置のアミノ酸置換であり、番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１２６に記載の多価結合タンパク質。
  128. 前記アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆであり、アミノ酸の番号付けはＥＵインデックスによる、請求項１２７に記載の多価結合タンパク質。
  129. 前記多価結合タンパク質が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～１２８のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質。
  130. 請求項１～１２９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  131. 請求項１３０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  132. 請求項１３０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  133. 多価結合タンパク質を産生する方法であって、前記結合タンパク質が産生されるように請求項１２２に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
  134. 前記結合タンパク質を前記宿主細胞から回収することをさらに含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. 請求項１～１２９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  136. 請求項１～１２９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質を精製する方法であって、
    ａ）前記多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること、並びに
    ｂ）前記プロテインＬ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること
    を含み、
    前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は前記多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない、方法。
  137. 前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の前記多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の前記ポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合したポリペプチドである、請求項１３６又は１３７に記載の方法。
  139. 請求項１～１２９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質を精製する方法であって、
    ａ）前記多価結合タンパク質及び誤対合した抗体を含む組成物を結合及び溶出クロマトグラフィーでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること、並びに
    ｂ）前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること
    を含み、
    前記プロテインＬ溶出液は前記多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない、方法。
  140. 前記プロテインＬ溶出液中の前記多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記プロテインＬ溶出液中の前記ポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合したポリペプチドである、請求項１３９又は１４０に記載の方法。
  142. 請求項１～１２９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質を精製する方法であって、
    ａ）前記多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＡクロマトグラフィーに供し、プロテインＡ溶出液を生成すること、
    ｂ）前記プロテインＡ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること、並びに
    ｃ）前記プロテインＬ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること
    を含み、
    前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液は前記多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない、方法。
  143. 前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の前記多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液中の前記ポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合したポリペプチドである、請求項１４２又は１４３に記載の方法。
  145. 請求項１～１２９のいずれか一項に記載の多価結合タンパク質を精製する方法であって、
    ａ）前記多価結合タンパク質を含む組成物を結合及び溶出モードでプロテインＡクロマトグラフィーに供し、プロテインＡ溶出液を生成すること、
    ｂ）前記プロテインＡ溶出液を結合及び溶出モードでＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーに供し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を生成すること、並びに
    ｃ）前記プロテインＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ溶出液を結合及び溶出モードでプロテインＬクロマトグラフィーに供し、プロテインＬ溶出液を生成すること
    を含み、
    前記Ｌ溶出液は前記多価結合タンパク質を含み、誤対合したポリペプチドを本質的に含まない、方法。
  146. 前記プロテインＬ溶出液中の前記多価結合タンパク質は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、又は少なくとも９５％純粋である、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記プロテインＬ溶出液中の前記ポリペプチドの１５％未満、１０％未満、又は５％未満が誤対合したポリペプチドである、請求項１４５又は１４６に記載の方法。
  148. 前記多価結合タンパク質を含む前記組成物が、前記多重特異性結合タンパク質を発現するように操作された宿主細胞に由来する、請求項１３６～１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記多価結合タンパク質を含む前記組成物が、宿主細胞培養上清である、請求項１３６～１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記多価結合タンパク質を含む前記組成物が、誤対合したポリペプチドをさらに含む、請求項１３６～１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. 前記多価結合タンパク質を含む前記組成物が、クロマトグラフィーの前に濾過される、請求項１３６～１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. 前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はプロテインＬクロマトグラフィーの後に、ポリッシュ工程をさらに含む、請求項１３６～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記ポリッシュ工程が、サイズ排除クロマトグラフィーである、請求項１５２に記載の方法。
  154. 前記プロテインＡクロマトグラフィーは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）－ｖＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、又はＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーである、請求項１４６～１５３のいずれか一項に記載の方法。
  155. 前記プロテインＬクロマトグラフィーは、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＬクロマトグラフィーカートリッジ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｌクロマトグラフィー、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）プロテインＬクロマトグラフィー、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆクロマトグラフィー、又はＫａｎＣａｐ（商標）Ｌクロマトグラフィーである、請求項１３６～１５４のいずれか一項に記載の方法。
  156. 前記ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーは、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｋａｐｐａ ＸＬクロマトグラフィーである、請求項１３６～１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記多価結合タンパク質を含む前記組成物が、薬学的に許容される担体と組み合わされる、請求項１３６～１５６のいずれか一項に記載の方法。
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