JP2025540657A - 抗ｃｄ３抗体 - Google Patents

抗ｃｄ３抗体

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Abstract

本発明は、ヒトCD3に特異的に結合する抗体を提供する。前記抗体は、単特異性（各結合部位が同じ標的、すなわちCD3に結合する）、ヒトCD3を含む2つの標的に対する少なくとも2つの結合部位を有する二重特異性、または多重特異性（ヒトCD3を含む複数の標的に対する複数の結合部位を有する）であることができる。前記抗体は、がん、感染症、及び免疫疾患などの各種疾患の治療に使用することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2022年11月18日に提出された米国特許出願第63/426,626号の利益を主張するものであり、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
配列表
本出願は、2023年11月12日に作成された66,000バイトのXMLファイル603846SEQLST内の配列を含み、これは参照により組み込まれる。
獲得免疫システムによる抗原特異的な免疫反応は、複数の正負の制御因子によって制御される複雑な生物学的プロセスである。ナイーブT細胞はまず、抗原提示細胞（APC）上の主要組織適合性複合体（MHC、ヒトタンパク質についてはHLAとも呼ばれる）分子によって提示された対応するペプチド抗原を認識すると、TCRα及びβ（又はγ及びδ）鎖並びにCD3分子を含むT細胞受容体（TCR）複合体を介して刺激される。T細胞の活性化におけるTCR及びMHC（又はHLA）間の最初の相互作用は、シグナル1と呼ばれる。T細胞の最適な活性化及び増殖には、T細胞に発現するCD28スーパーファミリーのCD28及びICOSなどの共刺激分子とAPCに発現するそれぞれのカウンター受容体との相互作用による第2のシグナルが必要である（シグナル2）。さらに、TNF受容体スーパーファミリーに属するCD40、OX40、GITR、CD27、HVEM、及び4-1BBなど、他の共刺激分子によって、免疫システムはポジティブに制御され、PD-1、TIGIT、TIM-3、LAG-3、BTLA、VISTA、CD96、及びCD112Rなどのチェックポイント分子によってネガティブに制御される。これらの共刺激分子とチェックポイント分子は、細胞の種類と発生段階に依存して発現し、体内の免疫応答を繊細に制御する。さらに、サイトカイン及びケモカインなどのさまざまな分泌タンパク質は、特定の免疫細胞のサブセットの活性化、分化、増殖、維持、及び抑制を促進することにより、免疫応答の調節に関与している。サイトカインのT細胞に対する作用は、T細胞の活性化、分化、及び増殖に必要な第3のメカニズムであるシグナル3としてよく知られている。総説については、Curtsinger et al., Curr. Opin. Immunol. 22:333-340, 2010；Mahoney et al., Nat. Rev. Drug Discov. 14:561-584, 2015；Mercier et al., Front. Immunol. 6:418, 2015；Baumeister et al., Annu. Rev. Immunol. 34:539-573, 2016；Hurton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 113:E7788-E7797, 2016；Torphy et al., Int. J. Mol. Sci. 18:2642, 2017；Punt et al., Kuby Immunology, Eighth Edition. W.H. Freeman and Co., New York, 2018を参照のこと。
成熟T細胞には、CD4+ヘルパーT細胞及びCD8+細胞傷害性T細胞の2つの大きなグループがある。CD4+ヘルパーT細胞はさらにTH1、TH2、TH9、TH17、TH22、TFH、及びTreg細胞に分類され、それぞれ特定の機能及び特徴的なサイトカイン発現パターンを有する。CD4+ヘルパーT細胞の主な機能は、免疫防御システムにおいて適切かつタイムリーな反応を行えるように、B細胞及びCD8+細胞傷害性T細胞などの他の免疫細胞を調節することである。一方、CD8+細胞傷害性T細胞の主な機能は、病原体により感染又は形質転換された細胞を抗原特異的に破壊することである。シグナル1及び2によって活性化されると、CD8+細胞傷害性T細胞は、パーフォリン及びグランザイムを分泌し、これらが相乗的に作用して標的細胞のアポトーシスを誘導する。CD8+細胞傷害性T細胞は、腫瘍細胞の除去にも重要な役割を果たしている。総説については、Taniuchi, Annu. Rev. Immunol. 36:579-601, 2018；Punt et al., supra；Saravia et al., Cell. Mol. Immunol. 16:634-643, 2019；Raskov et al., Br. J. Cancer 124:359-367, 2021を参照のこと。
二重特異性抗体は、2つの異なる抗原に結合できる組み換えモノクローナル抗体である。最近の研究では、T細胞に発現するCD3及びがん関連表面分子に結合する二重特異性抗体が、T細胞とがん細胞を橋渡しし、がん細胞に対するT細胞媒介性細胞傷害作用を誘発することが報告されている。このタイプの二重特異性抗体は、T細胞エンゲージャーと呼ばれる。急性リンパ芽球性白血病の治療薬であるBlincyto（登録商標）（ブリナツモマブ、抗CD19/CD3）、多発性骨髄腫の治療薬であるTecvayli（登録商標）（テクリスタマブ、抗BCMA/CD3）及び、濾胞性リンパ腫の治療薬であるLunsumio（登録商標）（モスネツズマブ、抗CD20/CD3）など、いくつかのT細胞エンゲージャーが、がんの治療用ヒト治療薬として販売承認されている。他にも多くのT細胞エンゲージャーが、がんの治療薬として臨床試験で評価されている。総説については、Middelburg et al., Cancers, 13:287, 2021, Ma et al., Front. Immunol. 12:Article 6266116, 2021, Wang et al., EMBO Mol. Med. 13:e14291, 2021；Arvedson et al., Annu. Rev. Cancer Biol. 6:17-34, 2022を参照のこと。
本発明は、ヒトCD3に特異的に結合する抗体であって、配列番号1に由来するCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む成熟重鎖可変領域、並びに、配列番号2に由来するCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む成熟軽鎖可変領域を含む、抗体を提供する。任意に、CDRH1、CDRH2及びCDRH3は、それぞれ配列番号43～45を含み、並びに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3は、それぞれ配列番号46～48を含む。任意に、前記抗体は、マウス抗体である。任意に、前記抗体は、キメラ化又はベニア化されている。任意に、前記抗体は、ヒト化抗体であって、ヒト化成熟重鎖可変領域及びヒト化成熟軽鎖可変領域を含む。任意に、前記ヒト化成熟重鎖可変領域のKabatナンバリングによる位置30、49、93及び94は、それぞれN、A、V及びRによって占められる。任意に、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域の位置36、46、49、66及び71は、それぞれV、G、G、L及びAによって占められる。任意に、前記成熟重鎖可変領域は、配列番号1を含むアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域は、配列番号2を含むアミノ酸配列を有する。任意に、前記成熟重鎖可変領域は、配列番号4を含むアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域は、配列番号6、17又は27のいずれかを含むアミノ酸配列を有する。任意に、前記成熟重鎖可変領域は、配列番号4からなる、又は、実質的にからなるアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域は、配列番号6、17又は27からなる、又は、実質的にからなるアミノ酸配列を有する。任意に、前記抗体は、前記成熟重鎖可変領域に融合した重鎖定常領域、及び、前記成熟軽鎖可変領域に融合した軽鎖定常領域をさらに含む。
任意に、前記抗体は、成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域の複数のペアを含む多重特異的抗体であって、そのペアの1つは、配列番号1に由来するCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む前記成熟重鎖可変領域、並びに、配列番号2に由来するCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む前記成熟軽鎖可変領域を含み、そのペアの他方は、標的抗原に結合する。
任意に、前記抗体は、成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域の2つのペアを含む二重特異的抗体であって、そのペアの1つは、配列番号1に由来するCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む前記成熟重鎖可変領域、並びに、配列番号2に由来するCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む前記成熟軽鎖可変領域を含み、そのペアの他方は、標的抗原に結合する。
任意に、前記標的抗原は、がん関連抗原、免疫細胞抗原、又は病原体もしくは病原体感染細胞上の抗原である。
任意に、前記成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域のペアの1つは、scFvであり、前記成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域のペアの他方は、前記成熟重鎖可変領域に連結された重鎖定常領域、及び、前記成熟軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域をさらに含む。任意に、配列番号1に由来するCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む前記成熟重鎖可変領域、並びに、配列番号2に由来するCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む前記成熟軽鎖可変領域は、scFvとして連結されており、前記ペアの他方の成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域は、それぞれ重鎖定常領域及び軽鎖定常領域に連結されている。
任意に、前記scFvは、前記重鎖定常領域に連結されている。任意に、前記scFvは、前記scFvの前記成熟軽鎖可変領域を介して前記重鎖定常領域に連結されている。任意に、前記scFvは、配列番号31又は33を含む配列を有する。任意に、前記scFvは、配列番号31又は33からなる、又は実質的にからなる配列を有する。任意に、前記scFvは、前記scFvの前記成熟重鎖可変領域を介して前記重鎖定常領域に連結されている。任意に、前記scFvは、配列番号29を含む配列を有する。任意に、前記scFvは、配列番号29からなる、又は実質的にからなる配列を有する。任意に、前記scFvは、前記ペアの他方の成熟重鎖可変領域又は成熟軽鎖可変領域のN末端と連結されている。
本発明は、scFvの形態を有する、又はscFvを含む抗体をさらに提供する。scFvは、リンカーを介して成熟軽鎖可変領域に一本鎖として融合した成熟重鎖可変領域を含む。任意に、前記抗体は、配列番号29、31又は33のいずれかを含む配列を有する。任意に、前記抗体は、配列番号29、31又は33のいずれかからなる、又は実質的にからなる配列を有する。
本発明は、上記に記載される、又は本明細書中の他の箇所で開示されるいずれかの抗体を含む医薬組成物をさらに提供する。
本発明は、がんを治療するための方法であって、がんを有する患者に上記に記載される、又は本明細書中の他の箇所で開示される抗体を投与することを含み、前記標的抗原は、がん関連抗原である方法をさらに提供する。
本発明は、免疫疾患を治療するための方法であって、前記免疫疾患を有する患者に上記に記載される、又は本明細書中の他の箇所で開示される抗体を投与することを含む方法をさらに提供する。
本発明は、病原体感染を治療するための方法であって、前記標的抗原が前記病原体又は病原体感染細胞の抗原であるかにかかわらず、前記病原体に感染した患者に上記に記載される、又は本明細書中の他の箇所で開示される抗体を投与することを含む方法をさらに提供する。
成熟SP34 VH、HuSP34 VH1、及びヒトアクセプターM24236 VHのアミノ酸配列のアラインメント。残基番号はKabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health、Bethesda、MD、1987年及び1991年）に従って割り当てられている。Kabatら（上記）の定義によるCDR配列は、SP34 VHに下線で示されている。記号「-」は、対応する位置にアミノ酸残基が存在しないことを示す。
成熟SP34 VL、HuSP34 VL1、及びヒトアクセプターY14738 VLのアミノ酸配列のアラインメント。残基番号はKabatら（上記）に従って割り当てられている。Kabatら（上記）の定義によるCDR配列は、SP34 VLに下線で示されている。記号「-」は、対応する位置にアミノ酸残基が存在しないことを示す。
SpeI及びHindIIIサイト（下線部）で挟まれたHuSP34 VH1遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号57）と、推定アミノ酸配列（配列番号58）。
NheI及びEcoRIサイト（下線部）で挟まれたHuSP34 VL1遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号59）と、推定アミノ酸配列（配列番号60）。
pHuSP34A（A）、pHuSP34C（B）及びpJB554（C）の模式図。
Jurkat Dual細胞に対するHuSP34A、HuSP34C及びHuSP34Vの結合のフローサイトメトリー分析。
成熟SP34 VL、HuSP34 VL3、HuSP34 VL4、及びヒトアクセプターL37309 VLのアミノ酸配列のアラインメント。残基番号はKabatら（上記）に従って割り当てられている。Kabatら（上記）の定義によるCDR配列は、SP34 VLに下線で示されている。記号「-」は、対応する位置にアミノ酸残基が存在しないことを示す。
NheI及びEcoRIサイト（下線部）で挟まれたHuSP34 VL3遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号61）と、推定アミノ酸配列（配列番号62）。
NheI及びEcoRIサイト（下線部）で挟まれたHuSP34 VL4遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号63）と、推定アミノ酸配列（配列番号64）。
JB554及びJB559二重特異性抗体の模式図。
Ramos細胞に対するJB554によるT細胞媒介性細胞傷害作用（A）及びEGFR陽性のHT-29細胞に対するJB559によるT細胞媒介性細胞傷害作用（B）。
JB554によるJurkat Dual細胞の活性化（A）及びRamos細胞に対するJB554によるT細胞媒介性細胞傷害作用（B）。
HT-29細胞に対するJB559によるT細胞媒介性細胞傷害作用（A及びB）。
HL-60細胞に対するJB564によるT細胞媒介性細胞傷害作用。
定義
本発明の抗体は、典型的には単離された形態で提供される。これは、抗体が典型的には、その生産又は精製から生じる干渉タンパク質及び他の不純物に対して少なくとも50％w/w純粋であることを意味するが、抗体が、過剰な薬学的に許容される担体又はその使用を容易にすることを目的とした他のビヒクルと組み合わされる可能性を排除するものではない。二重特異性抗体は、生産又は精製に起因する干渉タンパク質及び不純物に対して少なくとも60、70、80、90、95又は99% w/w純粋な場合がある。多くの場合、抗体は、その精製後に残る主要な高分子種である。
抗体の標的抗原への、又は二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体の標的抗原への特異的結合は、少なくとも106、107、108、109、又は1010M-1のアフィニティを意味する。標的と特異的に結合する抗体は、標的に対する抗体とも呼ぶことができる。アフィニティは異なる標的に対して異なることがある。特異的な結合は、検出可能なほど高い大きさであり、少なくとも1つの無関係な標的に対して起こる非特異的な結合と区別できるものである。特異的な結合は、特定の官能基間の結合又は特定の空間的な適合（例えば、鍵と鍵穴の型）の形成の結果である可能性があり、一方、非特異的な結合は典型的には、ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合は、2つの同一結合部位を有する抗体が１つの標的に対してのみ結合すること、又は、2つの異なる結合部位を有する二重特異性抗体がこれらの2つの結合部位の標的に対してのみ結合することを必ずしも意味するものではない。
基本的な抗体の構造単位は、サブユニットのテトラマーである。各テトラマーは、2つの同一のポリペプチド鎖のペアを含み、各ペアは、1つの「軽」（約25kDa）及び1つの「重」鎖（約50～70kDa）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識に関わる約100～110個以上のアミノ酸を含む可変領域が含まれている。この可変領域は、最初は切断可能なシグナルペプチドと結合して発現する。シグナルペプチドを含まない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれることもある。従って、例えば、軽鎖成熟可変領域とは、軽鎖シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域を意味する。しかし、可変領域を参照するとき、必ずしもシグナル配列が存在するわけではなく、実際、シグナル配列は、本発明の抗体が発現及び分泌されると切断される。重鎖と軽鎖の可変領域のペアは、抗体の結合領域を定義する。軽鎖と重鎖のそれぞれのカルボキシ末端部分は、軽鎖定常領域と重鎖定常領域を定義する。重鎖定常領域は、主にエフェクター機能を担っている。IgG抗体では、重鎖定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3領域に分かれている。IgAでは、重鎖定常領域はCH1、CH2、及びCH3に分けられる。CH1領域は、ジスルフィド結合及び非共有結合によって軽鎖定常領域に結合する。ヒンジ領域は、抗体の結合領域とエフェクター領域の間に柔軟性を与えるとともに、四量体サブユニット内の2つの重鎖定常領域の間に分子間ジスルフィド結合のサイトを提供する。CH2及びCH3領域は、エフェクター機能とFcRn結合の主要な部位である。
軽鎖は、カッパ又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをIgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEとして定義する。軽鎖と重鎖では、可変領域と定常領域が約12個以上のアミノ酸を含む「J」セグメントで結合しており、重鎖には約10個以上のアミノ酸を含む「D」セグメントが含まれている（一般に、Fundamental Immunology（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989）, Ch. 7を参照）（全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）。
各軽/重鎖ペアの成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、インタクト抗体は、2つの結合部位を有する、すなわち2価である。天然の抗体では、結合部位は同一である。二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合部位は、形態によって互いに同一であったり、異なっていたりする（例えば、Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321（1990）；Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53（1992）を参照）。可変領域はすべて、比較的保存されたフレームワーク領域（FR）に、相補性決定領域（CDR）とも呼ばれる3つの超可変領域が結合した、同一の典型的な構造を示す。各ペアの2本の鎖からのCDRは、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。N-末端からC-末端にかけて、軽鎖、重鎖ともにドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987及び1991）、又はChothia & Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917（1987）、Chothia et al., Nature 342:878-883（1989）の定義、又は以下の表１に示されるCDRの他の定義に従う。
Chothiaの定義によるCDR-H1は、ループの長さに応じてH32、H33、又はH34で終わりうる。これは、Kabatナンバリング法では追加残基の挿入を35A及び35Bに配置する一方で、Chothiaナンバリングではそれらを31A及び31Bに配置するためである。H35A及びH35B（Kabatナンバリング）が存在しない場合、ChothiaにおけるCDR-H1はH32で終わる。H35Aのみが存在する場合はH33で終わる。H35A及びH35Bの両方が存在する場合はH34で終わる。
また、Kabatは、異なる重鎖可変領域間又は異なる軽鎖可変領域間の対応する残基に同じ番号を割り当てる、広く使用されている番号付け規則（Kabatナンバリング）を提供する。Kabatナンバリングは、抗体重鎖定常領域に使用できるが、本願の場合のように、EUインデックス（EUナンバリングとも呼ばれる）がより一般的に使用される。抗体が、CDRの特定の定義（例えば、Kabat）によりCDRを含むと表現される場合、その定義は、抗体中に存在するCDR残基の最小数（すなわち、Kabat CDR）を規定する。これは、別の従来のCDR定義には該当するが、特定の定義には該当しない他の残基も存在することを排除するものではない。例えば、Kabatによって定義されるCDRを含む抗体は、可能性としては、CDRがKabat CDR残基を含み、他のCDR残基を含まない抗体、及びCDR H1が複合Chothia-Kabat CDR H1であり、他のCDRがKabat CDR残基を含み、他の定義に基づく追加のCDR残基を含まない抗体を含む。
用語「抗体」には、インタクトな抗体及びその結合フラグメントが含まれる。典型的には、フラグメントは、標的への特異的結合に関してフラグメントが由来するインタクトな抗体と競合し、個別の重鎖、軽鎖Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、ナノボディ、及びscFvを含む。フラグメントは、組換えDNA技術によって、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離によって生成することができる。用語「抗体」には、二重特異性抗体及び多重特異性抗体も含まれる。
用語「エピトープ」は、抗体又は二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体のアームが結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸又は1つ以上のタンパク質の三次フォールディングによって並置された非連続のアミノ酸から形成されうる。連続したアミノ酸から形成されたエピトープ（線状エピトープとも呼ばれる）は、典型的には変性溶媒にさらされても保持されるのに対し、三次フォールディングによって形成されたエピトープ（コンフォメーショナルエピトープとも呼ばれる）は、典型的には変性溶媒で処理されると失われる。一部の抗体は末端特異的エピトープに結合する。つまり、抗体は別のポリペプチドに融合して自由端を失った同一のポリペプチドと比較して、自由端を持つポリペプチドに選択的に結合する。エピトープは、典型的には、独特の空間的コンフォメーションをとる、少なくとも3個、より一般的には、少なくとも5個又は8～10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、X線結晶構造解析や2次元核磁気共鳴などを含む。例えば、Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed.（1996）を参照のこと。
「抗原」又は「標的抗原」という用語は、抗体又は二重特異性抗体の1つの結合部位によって結合される標的分子を示す。抗原は、任意の長さのタンパク質（天然、合成、又は組換え発現）、核酸、炭水化物などの分子である可能性がある。抗原には、受容体、リガンド、カウンター受容体、コートタンパク質などがある。
同一又は重複するエピトープを認識する抗体は、ある抗体が別の抗体の標的抗原への結合と競合する能力を示す単純なイムノアッセイで識別できる。また、抗体のエピトープは、抗原と結合した抗体のX線結晶構造解析により、接触残基を特定することでも定義できる。また、一方の抗体の結合を減少又は排除する抗原の全てのアミノ酸変異が他方の結合を減少又は排除する場合、2つの抗体は同一エピトープを持つ。一方の抗体の結合を減少又は排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の結合を減少又は排除する場合、2つの抗体は重複するエピトープを有する。
抗体間の競合は、試験下の抗体が参照抗体の共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイによって決定される（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990を参照）。過剰な試験抗体（例えば、少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍又は100倍）が、競合結合アッセイで測定されるように、参照抗体の結合を少なくとも50％、好ましくは75％、90％又は99％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。競合アッセイによって同定された抗体（競合抗体）には、参照抗体と同一のエピトープに結合する抗体、及び参照抗体によって結合されるエピトープに立体障害が生じるほど十分に近接した隣接エピトープに結合する抗体を含む。
「対象」という用語は、予防的又は治療的な治療を受けるヒト及び他の哺乳類の対象を含む。他の哺乳類の対象には、ヒトの状態の動物モデル（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類）及び獣医学的な対象を含む。
アミノ酸の置換を保存的又は非保存的に分類する目的で、アミノ酸は以下のようにグループ化される。グループI（疎水性側鎖）：met, ala, val, leu, ile、グループII（中性親水性側鎖）：cys, ser, thr、グループIII（酸性側鎖）：asp, gluグループIV（塩基性側鎖）：asn, gln, his, lys, argグループV（鎖の配向に影響を与える残基）：gly, pro、及びグループVI（芳香族側鎖）：trp, tyr, phe。保存的置換は、同一クラスのアミノ酸同士を置換することである。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することである。
パーセンテージ配列同一性は、可変領域の場合はKabatナンバリング規則、定常領域の場合はEUナンバリング規則によって最大限にアライメントされた抗体配列を用いて決定される。アラインメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖又は軽鎖の全成熟可変領域）を参照抗体の同一領域と比較する場合、対象抗体領域と参照抗体領域間の配列同一性百分率は、対象抗体領域と参照抗体領域の両方において同一アミノ酸が占有する位置の数を、ギャップを考慮せずに、これらの2領域のアライメントした位置の総数で割り、100を掛けて百分率に変換したものである。
列挙された1つ以上の要素を「含む」組成物又は方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含むこともある。例えば、抗体を含む組成物は、抗体のみを含有することもあり、又は抗体を他の成分と組み合わせて含有することもある。
「抗体依存性細胞傷害」又はADCCという用語は、抗体でコートされた標的細胞（すなわち、抗体が結合した細胞）と、溶解活性を有する免疫細胞（エフェクター細胞とも呼ばれる）との相互作用に依存する細胞死を誘導するメカニズムである。このようなエフェクター細胞には、ナチュラルキラー細胞、単球/マクロファージ、好中球などがある。ADCCは、細胞に結合した抗体のFc領域と、好中球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞などの免疫エフェクター細胞に存在するFcγ受容体（特にFcγRIとFcγRIII）との相互作用によって生じる。標的細胞は、媒介となるエフェクター細胞の種類に応じて、貪食又は溶解によって排除される。抗体でコートされた標的細胞の死は、エフェクター細胞活性の結果として起こる。
「抗体依存性細胞食作用」又はADCPとしても知られるオプソニン化の用語は、抗体でコートされた細胞が、免疫グロブリンFc領域に結合する食免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球、及び樹状細胞）によって、全体的に又は部分的に内在化される処理を指す。
用語「補体依存性細胞傷害」又はCDC（CMCとも呼ばれる）は、標的結合抗体のFcエフェクタードメインが一連の酵素反応を活性化し、結果として標的細胞膜に穴を形成する細胞死を誘導するメカニズムを指す。一般に、抗原-抗体複合体（例えば、抗体でコートされた細胞上のもの）は、補体成分C1qに結合して活性化し、これが補体カスケードを活性化して、標的細胞の死をもたらす。また、補体の活性化は、白血球上の補体受容体（例えば、CR3）に結合することによってADCCを促進する標的細胞表面への補体成分の沈着という結果になるかも知れない
FcRn受容体への抗体のpH依存性結合とは、抗体がそのような受容体に、pH60において、pH75よりも強く結合することを意味する。飲作用による内在化後のエンドソームにおける低いpHでのFcRnへの結合は、IgG抗体をリソソームにおける異化作用分解から救済する。救済されたIgG抗体は、次に、中性pHにてFcRnから解放され、血液循環に再利用される。このようなpH依存性FcRn結合が、IgG抗体（及び、本発明の二重特異性抗体）の長い血清半減期の分子メカニズムの基礎となる（Ghetie et al., Annu. Rev. Immunol. 18:739-766, 2000）。例えば、ヒトIgG抗体は、pH6.0にて、ヒト新生児型Fc受容体（FcRn）に結合する一方、pH7.5においては、FcRnに弱く結合するにすぎない。IgG抗体におけるFcRn結合部位は、CH2ドメインとCH3ドメインとの連結部に存在する。ミュー重鎖は、pH6.0又はpH7.5においてFcRnに結合しないので、天然IgMは、FcRn媒介経路を利用して、リソソームにおける分解から抗体を救済することができないため、一般に、天然IgG抗体よりも半減期が短い。
プロテインAは、もともと黄色ブドウ球菌の細胞壁において発見された、40～60kDaの表面タンパク質である。プロテインAは、マウスIgG2a及びIgG2bのほか、ヒトIgG1、IgG2及びIgG4に高い親和性で特異的に結合する。プロテインAは、ヒトIgG3、IgA又はIgMには結合しない。プロテインAは、抗体のアフィニティ精製に使用される。
プロテインGは、65kDa（G148プロテインG）及び58kDa（C40プロテインG）の連鎖球菌（Streptococcal）細胞表面タンパク質である。プロテインGは、血清アルブミン結合ドメインを含むがIgG結合には必要とされず、削除されていることが多い。プロテインGは、ヒトIgGの全てのアイソタイプに特異的に結合するが、IgA及びIgMには結合しない。プロテインGも、抗体精製に使用される。
I．全般的な事項
本発明は、ヒトCD3に特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、単特異性（各結合サイトが同一標的、すなわちCD3に結合する）、2つの標的に対する少なくとも2つの結合サイトを有し、その標的の1つはヒトCD3である二重特異性、又は多特異性（複数の標的に対する複数の結合サイトを有し、その標的の1つはヒトCD3である）であってもよい。これらの抗体は、がん、感染症、免疫疾患などの疾患の治療に使用することができる。
II．標的
ヒトCD3は、CD3デルタ（例えば、Swiss Prot P04234）、CD3ガンマ（例えば、Swiss Prot PO9693）、2分子のCD3エプシロン（例えば、Swiss Prot P07766）及び2分子のCD3ゼータ（例えば、Swiss Prot P20963）を含む複合体である。ヒトCD3及びそのサブユニットへの言及は、Swiss Protデータベースに示されている、例示されたヒト形態及びヒトにおけるその他の既知の対立遺伝子バリアントを含む。
二重特異性抗体又は多重特異性抗体の第２の標的となりうるタンパク質のクラスの1つは、がん関連抗原である。このような抗原は、がんによって発現され、典型的にはコントロールとなる正常組織よりも高いレベルで発現されている（過剰発現）。がん関連抗原の例としては、アルファ葉酸受容体（卵巣がん及び上皮がん）、CAIX（腎カルシノ―マ）、CD19（B細胞悪性腫瘍、CLL、ALL）、CD20（B細胞悪性腫瘍、リンパ腫）、CD22（B細胞悪性腫瘍）、CD23（CLL）、CD24（膵臓がん）、CD30（リンパ腫）、CD33（AML）、CD38（NHL）、CD44v7/8（子宮頸がん）、CEA（大腸がん）、EGFRvIII（膠芽腫）、EGP-2（多発性悪性腫瘍）、EGP-40（大腸がん）、EphA2（膠芽腫）、Erb-B2（乳がん、前立腺がん、大腸がん）、FBP（卵巣がん）、GD2（神経芽細胞腫、メラノーマ）、GD3（メラノーマ）、HER2（膵臓がん、卵巣がん、膠芽腫、骨肉腫）、HMW-MAA（メラノーマ）、IL-11Rα（骨肉腫）、IL-13Rα2（グリオーマ、膠芽腫）、KDR（腫瘍血管）、カッパ軽鎖（B細胞悪性腫瘍）、Lewis Y（各種癌）、L1（神経芽細胞腫）、MAGE-A1（メラノーマ）、メソセリン（中皮腫）、MUC1（乳がん及び卵巣がん）、MUC16（卵巣がん）NKG2D（骨髄腫、卵巣がん）、NY-ESO-1（多発性骨髄腫）、腫瘍胎児抗原（各種腫瘍）、PSCA（前立腺がん）PSMA（前立腺がん）、ROR1（B-CLL）、TAG-72（腺がん）、及びVEGF-R2（腫瘍新生血管）が挙げられる。（Sadelain et al.、Cancer Discov 3:388-98、2013）。標的にされうる他のがん関連抗原の例としては、アルファ-フェトプロテイン（AFP）、アルファ-アクチニン-4、A3、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BCMA、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、炭酸脱水酵素IX、CASP-8/m、CCLl9、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD123,CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CD155、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、結腸特異的抗原-p（CSAp）、CEA（CEACAM-5）、CEACAM-6、c-Met、クローディン6、クローディン18.2、DAM、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-1（TROP-2）、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、EphA10、線維芽細胞成長因子（FGF）、Flt-1、Flt-3、葉酸受容体、G250抗原、GAGE、GD2、gpA33、GPC3、gp100、GRO-ベータ、GUCY2C、HLA-DR、HLA-A*02:01:gp100,HM1.24、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG）及びそのサブユニット、HER2/neu、HMGB-1、低酸素誘導因子（HIF-1）、HSP70-2M、HST-2、IGF-1R、IFN-γ、IFN-、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、インスリン様成長因子-1（IGF-1）、インテグリンベータ 4、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、マクロファージ移動抑制因子（MIF）、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUC17、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、NY-ESO1膵臓がんムチン、p-カドヘリン、PD1受容体、胎盤成長因子、p53、PLAGL2、プロラクチン受容体、前立腺酸性ホスファターゼ、PSA、PSCA、PRAME、PSMA、PIGF、ILGF、ILGF-R、IL-6、IL-25、ROR1,RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、SSTR2、STEAP1、サバイビン、サバイビン-2B、TAC、TAG-72、テネイシン、TRAIL受容体、トランスフェリン受容体、TNF-α、Tn抗原、5T4、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘍壊死抗原、VEGFR、ED-Bフィブロネクチン、WT-1、17-1A-抗原、補体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管新生マーカー、bcl-2、bcl-6、Kras、癌遺伝子マーカー又は癌遺伝子産物が挙げられる（例えば、Sensi et al., Clin Cancer Res 2006, 12:5023-32、Parmiani et al., J Immunol 2007, 178:1975-79、Novellino et al., Cancer Immunol Immunother. 2005, 54:187-207を参照）。CD33は、シアル酸と結合し、主に急性骨髄性白血病などの骨髄由来のがんで過剰発現している。EGFRはEGFと結合し、主に胃がん、乳がん、子宮内膜がん、大腸がん、頭頸部がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、及び食道がんなどで過剰発現する。PD-L1はPD1と結合し、胃がん、肝細胞カルシノーマ、腎細胞カルシノーマ、食道がん、膵臓がん、卵巣がん、膀胱がんなどのがんで過剰に発現する。
別のクラスのタンパク質は、病原体又は病原体に感染した細胞の表面に発現する抗原である。別のクラスのタンパク質は、自己免疫疾患などの疾患に関連する免疫細胞に発現する抗原である。
III．CD3に対する抗体
例示的なCD3に対する抗体としては、SP34が挙げられる。この抗体は、配列番号1の成熟重鎖可変領域及び配列番号2の成熟軽鎖可変領域によって特徴付けられる。成熟重鎖可変領域のKabat CDR H1、H2及びH3は、それぞれ配列番号43-45によって提供され、成熟軽鎖可変領域のKabat CDR L1、L2及びL3は、それぞれ配列番号46-48によって提供される。SP34は、ヒトCD3のイプシロン鎖の細胞外ドメインに特異的に結合するアゴニスト抗体である。SP34によるCD3の架橋は、T細胞の活性化を誘導する。SP34は、ヒト及び幅広い非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル）のCD3に特異的に結合する。一方、T細胞エンゲージャーで広く使用されている他の抗CD3抗体（例えば、M291、OKT3）は、カニクイザルやアカゲザルに特異的に結合しないことが報告されている。非ヒト霊長類由来のCD3に特異的に結合する能力は、動物モデルにおける前臨床試験において有利である。本発明の他の抗体は、好ましくは、SP34のこの特性及び他の特性を共有している。
本発明の一部の抗体は、SP34と指定される抗体と同一又は重複するヒトCD3のエピトープに結合し、及び／又はSP34もしくはその成熟可変領域を共有する他の抗体と、ヒトCD3への結合を競合する。このような結合特異性を持つ他の抗体は、マウスにヒトCD3又は所望のエピトープを含むその一部を免疫し、任意にSP34と競合させて、ヒトCD3への結合についてスクリーニングすることにより、生産することができる。SP34と同一又は類似の結合プロファイルを示す抗体を同定するために、ヒトCD3抗原の変異型に対して抗体をスクリーニングすることができる。変異は、ヒトCD3の細胞外ドメイン全体、又はエピトープが位置することが知られているその一部について、1回に1残基ずつ、又はより広い間隔で、アラニン（又はアラニンがすでに存在する場合、セリン）に体系的に置換するものでありうる。
SP34の結合特異性を有する抗体はまた、ファージディスプレイ法の変形型を用いて生産できる。Winter、WO 92/20791を参照のこと。この方法は、ヒト抗体を生産するのに特に適している。この方法では、選択されたマウス抗体の重鎖又は軽鎖可変領域のいずれかが出発材料として使用される。例えば、軽鎖可変領域を出発物質として選択した場合、ファージライブラリーは、メンバーが同一の軽鎖可変領域（すなわち、マウス出発物質）及び異なる重鎖可変領域を提示するように構成されている。重鎖可変領域は、例えば、再配列ヒト重鎖可変領域のライブラリーから得ることができる。ヒトCD3に強い特異的結合を示すファージ（例えば、少なくとも108及び好ましくは少なくとも109M-1）が選択される。その後、このファージ由来の重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーを構築するための出発物質として役立つ。このライブラリーでは、各ファージは、同一の重鎖可変領域（すなわち、第1のディスプレイライブラリーから特定された領域）及び異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、例えば、再配列ヒト可変軽鎖領域のライブラリーから取得できる。ここでも、CD3に対して強力な特異的結合を示すファージが選択される。得られた抗体は、典型的には、マウス出発物質と同一又は類似のエピトープ特異性を有する。
他の抗体は、SP34などの例示的な抗体の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAの変異誘発によって取得できる。成熟重鎖及び/又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列においてSP34と少なくとも90％、95％又は99％同一であり、その機能特性を保持するモノクローナル抗体、及び/又は少数の機能的に重要でないアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、欠失、若しくは挿入によってそれぞれの抗体とは異なるモノクローナル抗体も本発明に含まれる。SP34の対応するCDRと90％、95％、99％又は100％同一であるKabatの定義による少なくとも1つ、好ましくは全6つのCDRを有するモノクローナル抗体も含まれる。
本発明の抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の2つのペアを含む通常の四量体フォーマット、又はscFvなどのフラグメントの形態、もしくはそれらを含む形態で提供することができる。抗体は、開示されている成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域、ならびにそれらの組み合わせを含む、からなる、又は実質的にからなるものであってもよい。
A．非ヒト抗体
ヒトCD3に対する他の非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギ又はラットのモノクローナル抗体の生産は、例えば、ヒトCD3もしくはそのフラグメント、又は、任意に、上述のようにその共受容体タンパク質と共発現したヒトCD3を有する細胞で、動物を免疫することによって行うことができる。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual（CSHP NY, 1988）（すべての目的のために参照により組み込まれる）を参照のこと。このような免疫原は、天然のソースから、ペプチド合成によって、又は組換え発現によって得ることができる。任意に、免疫原は、キャリアータンパク質と融合又は複合体化した状態で投与することもできる。任意に、免疫原はアジュバントと一緒に投与できる。アジュバントには、以下のようにいくつかのタイプを使用できる。実験動物の免疫化には、完全フロイントアジュバントに続いて不完全アジュバントを用いることが好ましい。ポリクローナル抗体の生産には、典型的には、ウサギやモルモットが使用される。モノクローナル抗体の生産には、典型的には、マウスが使用される。抗体は、ヒトCD3に対する特異的結合についてスクリーニングされる。任意に、抗体は、ヒトCD3の特定の領域に対する結合についてさらにスクリーニングされる。このようなスクリーニングは、ヒトCD3の欠失バリアントのコレクションに対する抗体の結合を測定することで実施できる。結合は、例えば、ウエスタンブロット、FACS又はELISAによって評価できる。
B．ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体からのCDRがヒト「アクセプター」抗体配列に移植されている、遺伝子操作された抗体である（例えば、Queen, US 5,530,101及び5,585,089；Winter, US 5,225,539、Carter, US 6,407,213、Adair, US 5,859,205, 6,881,557、Foote, US 6,881,557を参照）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、又は、生殖細胞系領域配列であってもよい。従って、ヒト化抗体は、完全に又は実質的にドナー抗体に由来するCDRのいくつか又は全て、並びに、完全に又は実質的にヒト抗体配列に由来する、定常領域（存在する場合）及び可変領域フレームワーク配列を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体重鎖に由来する、少なくとも1つ、2つ、通常は3つ全てのCDR、並びに、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク配列及び定常領域配列に由来する、重鎖定常領域（存在する場合）及び重鎖可変領域フレームワーク配列を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体軽鎖に由来する、少なくとも1つ、2つ、通常は3つ全てのCDR、並びに、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列及び定常領域配列に由来する、軽鎖定常領域（存在する場合）及び軽鎖可変領域フレームワーク配列を有する。ナノボディ及びdAbsを除き、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体におけるCDRは、対応するCDR間で、対応残基（Kabatの規定による）の少なくとも85％、90％、95％又は100％が同一であるときは、非ヒト抗体における対応するCDRに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列又は抗体鎖の定常領域は、Kabatの定義による対応残基の少なくとも85％、90％、95％又は100％が同一であるときは、それぞれ、ヒト可変領域フレームワーク配列又はヒト定常領域に実質的に由来する。
ヒト化抗体は、しばしば、マウス抗体由来の6つ全てのCDR（好ましくは、Kabatの定義による）を取り込んでいるが、ヒト化抗体は、マウス抗体由来の全てよりも少ないCDR（例えば、少なくとも3つ、4つ又は5つのCDR）にて作製することもできる（例えば、Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002；Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320：415-428, 2002；Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999；Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000）。
いくつかの抗体では、CDRの一部のみ、すなわち、SDRと呼ばれる結合に必要なCDR残基のサブセットは、ヒト化抗体において結合を保持するために必要とされる。抗原に接触せず、SDR中に存在しないCDR残基は、以前の研究に基づいて（例えば、CDR H2中の残基H60～H65は必要とされない場合が多い）、Chothia超可変性ループ（Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987）の外側にあるKabat CDRの領域から分子モデリング及び/若しくは経験的に、又はGonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004に記載の通りに特定できる。このようなヒト化抗体では、1つ以上のドナーCDR残基が存在しないか、又はドナーCDR全体が除去されている位置において、その位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列中の対応する位置（Kabatナンバリングによる）を占めるアミノ酸でありうる。CDR中のドナーアミノ酸をアクセプターアミノ酸に置換する数は、競合する考慮事項のバランスを反映している。このような置換は、潜在的に、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減少させ、結果として潜在的な免疫原性を減少させる点で都合がよい。しかし、置換はまた、親和性の変化を生ずることがあり、親和性の顕著な低下は避けるのが好ましい。CDR内の置換の位置及び置換するアミノ酸も経験的に選択できる。
ヒトアクセプター抗体配列は、ヒトアクセプター配列の可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの間に高度な配列同一性（例えば、65～85％の同一性）を提供するために、任意に、多くの既知のヒト抗体配列の中から選択できる。ヒトアクセプター抗体配列は、ヒト抗体、又は2つもしくはそれより多くのヒト抗体の複合体、あるいはヒト抗体のコンセンサス由来でありうる。ヒトアクセプター配列は、生殖細胞系配列でありうる。重鎖ヒトアクセプター配列及び軽鎖ヒトアクセプター配列は、同一又は異なる由来、例えば、同一抗体の重鎖及び軽鎖、あるいは異なる抗体の重鎖及び軽鎖でありうる。
ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸は、CDR立体構造及び/又は抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づいて置換対象として選択できる。このような可能な影響の研究は、モデリング、特定の位置でのアミノ酸の特徴の検査、又は特定のアミノ酸の置換若しくは変異誘発の効果の経験的観察によるものである。
例えば、アミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択したヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、そのアミノ酸が、
（1）直接抗原と非共有結合する、
（2）CDR領域に隣接している、
（3）そうでなければ、CDR領域と相互作用する（例えば、CDR領域の約6オングストローム内である）
ことが合理的に予測される場合、ヒトフレームワークアミノ酸は、マウス抗体由来の等価のフレームワークアミノ酸によって置換できる。
他の置換候補は、ヒト免疫グロブリンにとってその位置のものとしては通常とは異なるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価位置のアミノ酸又はより典型的なヒト免疫グロブリンの等価位置由来のアミノ酸で置換できる。他の置換候補は、ヒト免疫グロブリンにとってその位置のものとしては通常とは異なるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。ヒトM24236 cDNAによってコードされるVH配列は、重鎖のヒト化のための例示的なアセプター配列である。Y14738 cDNAによってコードされるヒトVλ領域、又はL37309 cDNAによってコードされるヒト成熟Vκ領域は、軽鎖のヒト化のための例示的なアクセプター配列である。
例示的なSP34のヒト化重鎖可変領域は、HuSP34 VH1と名付けられ、配列番号4が割り当てられている。SP34可変領域の三次元モデルにより、アミノ酸が抗原結合部位の形成に重要な役割を果たす可能性のあると示された、Kabatナンバリングによるフレームワーク位置30、49、93、及び94においては、M24236 VHのアミノ酸残基は、マウスSP34 VHの対応する残基、すなわちN、A、V、及びRに置換することができる。HuSP34 VL1と名付けられた例示的なヒト化軽鎖可変領域は、配列番号6が割り当てられている。この軽鎖可変領域は、Kabatナンバリングによる36、46、49の位置にマウス残基への逆変異を含んでおり、これらの位置はV、G、及びGでそれぞれ占められている。カッパアクセプター配列に基づく別の例示的なヒト化軽鎖可変領域は、HuSP34 VL3と名付けられ、配列番号17が割り当てられている。このヒト化軽鎖は、Kabatナンバリングにより36、46、49、58、66、67、69、70、及び71の位置に逆変異を有し、これらの位置はV、G、G、V、L、I、D、K、及びAでそれぞれ占められている。別のヒト化軽鎖可変領域はHuSP34 VL4と指定され、配列番号27が割り当てられている。配列番号27は、結合には必要ではないが免疫原性を高める可能性のある一部の逆変異を削除した以外は、配列番号17と同一である。配列番号27に依然として存在している残りの逆変異は、36、46、49、66、及び71の位置にあり、V、G、G、L、及びAでそれぞれ占められている。
例示的な本発明のヒト化抗体は、配列番号4の成熟重鎖可変領域、及び配列番号6、17又は27、好ましくは配列番号27のいずれかの成熟軽鎖可変領域によって特徴付けられる。本発明はまた、配列番号4を含む成熟重鎖可変領域、及び配列番号6、17、又は27、好ましくは配列番号27のいずれかを含む成熟軽鎖可変領域を含むヒト化抗体を含む。また、本発明は、HuSP34 VH1（配列番号4）及びHuSP34 VL4（配列番号27）を含む、HuSP34Vと称されるヒト化抗CD3IgG1/カッパ抗体のバリアントも提供する。このようなバリアントは、典型的には、HuSP34Vの可変領域の配列から、少数（例えば、通常1、2、3、5、7、8、9又は10以下）の置換、欠失又は挿入によって異なる。このような違いは通常、フレームワークにあるが、CDRにも生じうる。例えば、重鎖の30、49、93及び94位置、軽鎖の36、46、49、66及び71位置の置換のサブセットのみを行うことができる。ヒト化mAbのCDRと接触していないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスmAb又は他のマウス又はヒト抗体の対応する位置からのアミノ酸の置換に対応することができ、多くの潜在的なCDR接触残基さえも置換されやすく、CDR内のアミノ酸さえも変化する可能性がある。CDR置換の一例は、CDR内の残基を、可変領域フレームワークを供給するために使用されるヒトアクセプター配列の対応する位置を占める残基で置換することである。
多くの場合、バリアントHuSP34V配列の可変領域で行われた置換は、置換されたHuSP34Vアミノ酸に対して保存的である。好ましくは、HuSP34Vの置換(保存的かどうかにかかわらず)は、ヒト化mAbの結合親和性又は効力、すなわち、そのヒトCD3に特異的に結合しアゴナイズする能力に実質的な影響を与えない。好ましくは、成熟バリアント軽鎖及び重鎖V領域配列は、それぞれのHuSP34V成熟軽鎖及び重鎖V領域と少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%同一である。さらに、他のヒト抗体アクセプター配列、特にHuSP34の可変領域フレームワーク配列と高い配列同一性を有する配列も、ヒト化抗体可変領域フレームワーク配列を提供するのに適している。
HuSP34Vのいくつかのバリアントでは、例示した抗体に関連して述べた、アクセプターからドナーへの置換の位置のうち、少なくとも1、2、3、4、5、7、又は8すべて、すなわち、重鎖のKabat位置30、49、93、及び94、並びに軽鎖のKabat位置36、46、49、66、及び71は、SP34の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の対応する位置を占める残基によって占められている。
C．キメラ化抗体及びベニア化抗体
本発明は、SP34のキメラ化形態及びベニア化形態をさらに提供する。
キメラ化抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス）の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域が、ヒトの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を実質的に又は完全に保持しており、約2/3がヒトの配列である。
ベニア化抗体は、非ヒト抗体のいくつかの、通常は全てのCDR、及び、非ヒト可変領域フレームワーク残基を保持するが、B細胞エピトープ又はT細胞エピトープに寄与するかも知れない他の可変領域フレームワーク残基、例えば、露出残基（Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991）が、ヒト抗体配列の対応位置由来の残基で置き換えられた、1種のヒト化抗体である。その結果、CDRが、非ヒト抗体に完全に又は実質的に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが、置換によって、ヒト様とされた抗体となる。SP34のベニア化形態。
D．ヒト抗体
ヒトCD3に対するヒト抗体は、以下に記載の様々な技術により得られる。いくつかのヒト抗体は、実施例に記載のマウスモノクローナル抗体の1種などの、特定のマウス抗体と同一エピトープ特異性を有するように、競合結合実験、Winterのファージディスプレイ法、又は他の方法により、選択される。また、ヒトCD3のフラグメントのみを使用することにより、特定のエピトープ特異性についてヒト抗体をスクリーニングできる。
ヒト抗体の生産方法には、トリオーマ法（Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367（1983）；Oestberg, U.S. Patent. No. 4,634,664；及びEngleman et al., U.S. Patent. No. 4,634,666）、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子組み換えマウスの使用（例えば、Lonberg et al., WO93/12227（1993）；US 5,877,397、US 5,874,299、US 5,814,318、US 5,789,650、US 5,770,429、US 5,661,016、US 5,633,425、US 5,625,126、US 5,569,825、US 5,545,806、Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826（1996）、及びKucherlapati, WO 91/10741（1991）を参照）、及びファージディスプレイ法（例えば、Dower et al., WO 91/17271、McCafferty et al.、WO 92/01047、US 5,877,218、US 5,871,907、US 5,858,657、US 5,837,242、US 5,733,743及び5,565,332を参照）及びWO 2008/081008に記載の方法（例えば、EBV などを用いたヒトから単離したメモリーB細胞の不死化、所望の特性のスクリーニング、及び組換え形態のクローニング及び発現など）を含む。
IV．二重特異性抗体
二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、構成抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のペアから形成される。構成抗体は、とりわけ、げっ歯類、キメラ化、ベニヤ化、ヒト化、霊長類化、霊長類、又はヒトでありうる。構成抗体は、同一種類のものでも、異なる種類のものでもよい。例えば、一方はヒト化で、他方はヒトでありうる。
二重特異性抗体又は多重特異性抗体の構成抗体の一つは、上述のヒトCD3に対する抗体である。他の構成抗体又は抗体は、ヒトCD3以外の抗原に結合する。例えば、他の構成抗体又は抗体は、除去すべき細胞に存在する標的と結合することができる。そのような細胞には、がん細胞、ウイルス、細菌又は真菌などの病原体、及びこれらに感染した細胞、ならびに免疫障害、特に自己免疫障害に関連する免疫細胞が含まれる。
ヒトCD3を標的とする抗体について、非ヒト、ヒト化、キメラ化、ベニア化、及びヒト抗体の生産方法が報告されている。同じ方法は、ヒトCD3の代わりに、関連する標的を標的とする他の抗体の生産にも応用できる。単特異性抗体として治療用途が承認されている抗体の多くは、二重特異性抗体に組み込むことができる。以下の表2は、がんの治療用に承認されている抗体の例である。
二重特異性抗体又は多重特異性抗体については、100以上のフォーマットが記載されている（例えば、Kontermann et al., Drug Discovery Today 20, 838-847（2015）；Sedykh et al., Drug Des. Devel. Ther. 2, 195-209（2018））。このようなフォーマットは、少なくとも2つの標的のそれぞれに対して少なくとも1つの結合部位を含む。いくつかのフォーマットは、各標的に対して2つ又はそれより多くの結合部位を含む。
いくつかのフォーマットは、各標的に対して1つずつ、2つの結合領域を有する通常の抗体と同様のテトラマー構造を有する。各結合領域は、対になった重鎖及び軽鎖の可変領域から形成され、これらの可変領域は重鎖及び軽鎖の定常領域にそれぞれ連結されている。そのような二重特異性抗体は、2つの結合部位とそれを形成する重鎖と軽鎖のペアが異なる点で、通常の抗体とは異なる。従って、そのような抗体は、2つの異なる重鎖と軽鎖のペアの会合を必要とする。
一方の抗体のCH3ドメイン内の大きなアミノ酸を小さなアミノ酸に置換し（「ノブ」）、他方の抗体のその逆（「ホール」）を行うことにより、ホモダイマーの形成や重鎖のミスペアリングを低減するために、「ノブ-イントゥ-ホール」アプローチが採用されている（Ridgway et al., Protein Eng 9:617-21, 1996；Atwell et al., J Mol Biol 270:26-35, 1997；及びU.S. Pat. No. 7,695,936）。そのようなフォーマットにおける軽鎖のミスペアリングは、いくつかの戦略によって減らすことができる。一つの戦略は、2つの異なる重鎖可変領域に対して共通の軽鎖可変領域を使用することである。しかし、これは一部の抗体にしか適用できない。また、ノブを含む半分子とホールを含む半分子を別々のバクテリアで発現させるというアプローチもある。また、CrossMabと呼ばれる別のアプローチでは、重鎖の一方のCH1ドメインと対応する軽鎖の定常CLドメインを交換して、設計された重鎖と軽鎖の間に正しいペアリングを誘導する（Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92, 2011；WO 2009/080251；WO 2009/080252；WO 2009/080253）。別のアプローチは、VH-VL及びCH1-CLの界面に追加の変異を導入することである（Lewis et al., Nat. Biotechnol., 32 (2014), pp. 191-198)。これらの変異は重鎖が軽鎖と優先的にペアになることを促す。別のアプローチは、プロテインA結合を促進する変異をFc領域の1つに導入し、中間的なプロテインA結合を有するヘテロダイマーペアを、より高い又は低いプロテインA結合を有するホモダイマーからアフィニティークロマトグラフィーによって選択することである（Tusdian et al, MAbs. 2016 May-Jun;8(4):828-38）。
他の二重特異性抗体は、同一重鎖と軽鎖のペアに複数の結合特異性を組み合わせることで、ミスペアリングの問題を回避している。これを行うための1つのアプローチは、デュアル可変ドメインと呼ばれ、2つの異なる重鎖可変領域を重鎖定常領域にタンデムに連結し、2つの異なる軽鎖可変領域を軽鎖定常領域にタンデムに連結することである（Correia et al., MAbs. 2013 May 1；5(3)：364-372）。このような抗体は、2つの同一のペアになった重鎖及び軽鎖が会合することにより、テトラマーとして組み立てることができる。組み立てられた抗体は、各標的に対する2つの異なる結合部位を含む。別のアプローチとしては、１つの標的の結合部位を提供するscFvを、別の標的の結合部位を提供する重鎖軽鎖の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のN末端に結合させる方法がある。このような二重特異性抗体は、四量体としても会合することができる。
本発明の実施例で採用されている別のアプローチは、任意にC末端のリジン残基を任意に省略して、一本鎖Fv（scFv）を重鎖定常領域のC末端に連結することにより、第2の結合特異性を組み込むことである。このような二重特異性抗体は、標準的な抗体と同様に、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のN末端に結合した重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって形成される第1結合部位を含む。重鎖のC末端は、第2結合部位を提供するscFvに結合している。scFvは典型的には、リンカーを介して結合され、さらにリンカーがscFvの重鎖と軽鎖の可変領域を結合している。scFvは、その軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の末端からリンカーを介してFc領域に結合できる。2つの同一のペアになった重鎖と軽鎖の複合体化によって組み立てられた場合、そのような二重特異性抗体は、2つの異なる特異性のそれぞれに対して2つの結合部位を含む。そのような二重特異性抗体のCD3及び他の標的への抗原結合アームは、どちらの方向にも取り付けることができる。すなわち、CD3に対する抗原結合アームはscFvの形態であり、他の標的に対する抗原結合アームは標準的な抗体フォーマットであってもよく、あるいはその逆であってもよい。重鎖及び軽鎖の定常領域のN末端に結合するアームは、重鎖と軽鎖の可変領域として別々に提供され、C末端に結合するアームはscFvフラグメントとして提供される。このフォーマットの利点は、2つの異なる結合空間が重鎖定常領域全体によって分離されることであり、これは細胞間の橋渡しを促進しうる。安定性を高めるために、scFvの重鎖及び軽鎖の可変領域それぞれに、システイン残基への置換を任意に導入することができる（例えば、Kabatナンバリングによる重鎖可変領域の位置44及び軽鎖可変領域の位置100）。
別のフォーマットでは、第1の標的に特異的に結合するscFvを重鎖定常領域に、別の標的に特異的に結合するscFvを軽鎖定常領域に連結する。このような抗体は、各結合部位の2つのコピーを含むテトラマーとして組み立てられる（Bs(scFv)4-IgG）（Zuo et al., Protein Eng 13:361-367, 2000）。
他のフォーマットは、定常領域なしに一本鎖でscFv結合領域を連結する。例えば、BiTeフォーマットは、リンカーを介して2つのscFvフラグメントをリンクしている（例えば、Ross et al., PLoS ONE 12(8)：e0183390, 2017を参照）。このようなフォーマットは、エフェクター機能を欠き、半減期が短い傾向にあるが、サイズが小さいことによるアクセス性や生産の容易さという利点がありうる。
上記フォーマットの多くは、重鎖及び軽鎖可変領域の間、又は可変領域と定常領域の間にリンカーペプチドを含む。リンカーは、柔軟性を与える短いペプチドであり、多くの場合、主にGly、Ala及び/又はSerによって占められている。いくつかの例示的なリンカーは、Gly-Gly-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Leu-Ala-Ala-Ala-Ala、及びそれらのマルチマーである。
SP34抗体について上述の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の任意の組み合わせ、及びそのキメラ化、ベニア化、及びヒト化形態、又は本明細書に記載の他のCD3抗体は、上記のフォーマットでscFvに組み込むことができる。例示的なscFvは、配列番号29、31、又は33のいずれかを、含む、からなる、又は実質的にからなる配列を有する。例示的な二重特異性抗体は、scFvの成熟軽鎖可変領域を介して別の抗体の重鎖定常領域に結合したscFvを含み、scFvは配列番号31又は33を含む配列を有する。別の例示的な二重特異性抗体は、scFvの成熟軽鎖可変領域を介して別の抗体の重鎖定常領域に結合したscFvを含み、scFvは配列番号29を含む、からなる、又は実質的にからなる配列を有する。
定常領域の選択
単特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体のフォーマットの多くは、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。定常領域の選択は、部分的には、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用、抗体依存性細胞貪食作用及び/又は補体依存性細胞傷害作用が望まれるかどうかに依存する。例えば、ヒトのアイソタイプIgG1及びIgG3は補体依存性細胞傷害作用を持ち、ヒトのアイソタイプIgG2及びIgG4は持たない。軽鎖定常領域は、ラムダ又はカッパでありうる。また、ヒトIgG1及びIgG3は、ヒトIgG2及びIgG4よりも強い細胞媒介性エフェクター機能を誘導する。ここで、ADCC、ADCP及びCDCは、二重特異性抗体の一方のアームによって結合されたがん細胞又は感染細胞に対する追加の作用機序を提供するのに有用であるが、他方のアームによってCD3をアゴナイズして免疫細胞を活性化するのには有用ではない。
軽鎖及び/又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端の1つ又は数個のアミノ酸、例えば、重鎖のC末端リジンは、分子の一部又は全部において欠失又は誘導体化されていてもよい。薬学的に許容される塩を形成するために、対イオンが存在してもよく、しなくてもよい。水又は他の溶媒が、抗体と結合して（例えば、水和物又は溶媒和物として）存在してもよく、しなくてもよい。 補体媒介性細胞傷害作用又はADCCなどのエフェクター機能を低下又は増加させるために（例えば、Winter et al., US Patent No. 5,624,821；Tso et al., US Patent No. 5,834,597；及びLazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006を参照）、又はヒトにおける半減期を延長させるために（例えば、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004を参照）、定常領域でアミノ酸置換を行うことができる。例えば、IgG Fcには、FcRn結合を増加させる多くの既知の変異がある。例示的な置換としては、250位のGln及び/又は428位のLeu、434位のSer又はAsn、252位のTyr、254位のThr、256位のGlu、及び434位のAlaが挙げられる（EUナンバリング）。FcRn結合の増加は、本発明のハイブリッドタンパク質がFcRnへの結合について内因性IgGとより強く競合する上で有利である。また、ADCC、ADCP又はCDCのいずれかを減少させるための多数の変異が知られている。(例えば、Winter et al., US Patent No. 5,624,821；Tso et al., US Patent No. 5,834,597；and Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006を参照）。例えば、234位、235位、236位及び/又は237位のアミノ酸残基のいずれかを置換すると、Fcγ受容体、特にFcγRI受容体に対する親和性が低下する（例えば、US 6,624,821を参照）。任意に、ヒトIgG2の234位、236位及び/又は237位のアミノ酸残基がAlaで置換され、235位がGln又はGluで置換される（例えば、US 5,624,821を参照）。エフェクター機能を低下させる他の置換としては、268位のAla、297位のGly又はAla、309位のLeu、322位のAla、327位のGly、330位のSer、331位のSer、238位のSer、268位のAla、309位のLeuを含む。
ヒトの定常領域は、異なる個体間でアロタイプの変化及びアイソアロタイプの変化を示す。すなわち、定常領域は、異なる個体において1つ以上の多型位置で異なりうる。アイソアロタイプは、アイソアロタイプを認識する血清が1つ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点でアロタイプと異なる。
組換え抗体の発現
単特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、典型的には組換え発現によって生産される。フォーマットに応じて、1つ、2つ又はそれより多くの抗体鎖の発現が必要となる場合がある。複数の鎖を発現させる場合、それらは同一ベクター又は異なるベクターから発現させることができる。組換えポリヌクレオチドコンストラクトは、典型的には、プロモーターのような、自然発生又は異種発現制御要素を含む、抗体鎖のコード配列に動作可能に連結された発現制御配列を含む。発現制御配列は、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションできるベクターのプロモーターシステムでありうる。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現及び二重特異性抗体の収集及び精製に適した条件で維持される。
これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主の染色体DNAの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。典型的には、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、アンピシリン耐性又はハイグロマイシン耐性を含む。
大腸菌（E.coli）は、抗体、特に抗体フラグメントの発現に有用な原核宿主の1つである。酵母などの微生物も発現に有用である。サッカロミセスは、所望に応じて発現制御配列、複製起点、終止配列などを有する適切なベクターを持つ酵母宿主である。典型的なプロモーターとしては、3-ホスホグリセリン酸キナーゼをはじめとする糖分解酵素が挙げられる。誘導性の酵母プロモーターとしてはとりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロームC、並びにマルトース及びガラクトースの利用を担う酵素に由来するプロモーターが挙げられる。
免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントの発現に、哺乳類細胞を用いることができる。Winnacker, From Genes to Clones（VCH Publishers, NY, 1987）を参照のこと。インタクトの異種タンパク質を分泌できる適切な宿主細胞系が多数開発されており、CHO細胞系、様々なCOS細胞系、HeLa細胞、HEK293細胞、L細胞並びに、Sp2/0及びNS0を含む非抗体産生骨髄腫が含まれる。細胞は非ヒト細胞であってもよい。これらの細胞に用いる発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列（Queen et al., Immunol. Rev. 89:49（1986））並びに、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含んでもよい。発現制御配列は、内在遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターを含んでもよい。Co et al., J. Immunol. 148:1149（1992）を参照のこと。
あるいは、抗体コード配列をトランスジーンに組み込んで、トランスジェニック動物のゲノム内に導入した後トランスジェニック動物の乳の中に発現させてもよい（例えば、U.S. Pat. No. 5,741,957；U.S. Pat. No. 5,304,489；及びU.S. Pat. No. 5,849,992を参照）。適切なトランスジーンとしては、カゼイン又はベータラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子由来のプロモーター及びエンハンサーと作動可能に連結された、軽鎖及び/又は重鎖のコード配列を含む。
目的とするDNAセグメントを含むベクターは、細胞宿主の種類に応じた方法により宿主細胞に導入できる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく用いられ、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃、又はウイルスベースのトランスフェクションを用いることができる。哺乳類細胞の形質転換に用いられる方法としては、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションを含む。トランスジェニック動物の作製には、トランスジーンをマイクロインジェクションにより受精卵母細胞内に注入するか胚性幹細胞のゲノム内に組み込み、そのような細胞の核を除核卵母細胞内に移入できる。
抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクター（1つ又は複数）を細胞培養物に導入した後、細胞プールを無血清培地中で抗体の生産力及び品質についてスクリーニングできる。次に、最も生産量の多い細胞プールをFACSTMベースのシングルセルクローニングに供して、モノクローナルラインを作製できる。培地1L当たり7.5 g超に相当する、1日当たり50 pg/細胞又は100 pg/細胞超の比生産速度を用いることができる。シングルセルクローンにより生産される抗体を濁度、ろ過特性、PAGE、IEF、UVスキャン、HP-SEC、炭水化物-オリゴ糖マッピング、質量分析並びに、ELISA又はBIACORETMなどの結合アッセイについて試験できる。次に、選択したクローンを複数のバイアルに保管し、後の使用のために凍結保存する。
発現後、抗体をプロテインA捕捉、HPLC精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該技術分野の標準的方法に従って精製できる（一般的にはScopes, Protein Purification（Springer-Verlag, NY, 1982）を参照）
コドン最適化、プロモーターの選択、転写エレメントの選択、ターミネーターの選択、無血清シングルセルクローニング、細胞バンキング、コピー数増幅のための選択マーカーの使用、CHOターミネーター、又はタンパク質力価の向上を含む、抗体の商業的生産の方法論を用いることができる（例えば、US 5,786,464；US 6,114,148；US 6,063,598；US 7,569,339；W02004/050884；W02008/012142；W02008/012142；W02005/019442；W02008/107388；W02009/027471；及びUS 5,888,809を参照）。
核酸
本発明は、上述の重鎖及び軽鎖のいずれかをコードする核酸をさらに提供する。任意に、そのような核酸は、シグナルペプチドをさらにコードし、核酸の定常領域コード配列にシグナルペプチドを連結して発現させることができ、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終了シグナルなどのコード配列の発現を確実にするための制御配列と作動可能に連結できる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、単離された形で生じさせることができ、又は1つ以上のベクターにクローニングできる。核酸は、例えば、固相合成又はオーバーラップするオリゴヌクレオチドのPCRによって合成できる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、1つの連続した核酸として、例えば、発現ベクター内で結合することができ、又は別々に、例えば、それぞれ独自の発現ベクターにクローン化することができる。
治療方法及び医薬組成物
本発明の二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、二重特異性抗体又は多重特異性抗体の1つのアームが、上記で開示されたような、がんで発現又は過剰発現された標的に結合するがんの治療に使用できる。二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、固形腫瘍、及び血液悪性腫瘍の治療に使用できる。血液悪性腫瘍には、白血病（例えば、T細胞大顆粒リンパ球白血病）、リンパ腫（ホジキン又は非ホジキン）、又は多発性骨髄腫を含む。固形腫瘍としては、皮膚（例えば、メラノーマ）、卵巣、子宮内膜、腎臓、肝臓、膵臓、膀胱、乳房、卵巣、前立腺、直腸、結腸、胃、腸、膵臓、肺、胸腺、甲状腺、腎臓、脳を含む。
本発明の二重特異性抗体は、二重特異性抗体が、病原体上に存在する抗原又は病原体に感染した細胞で発現されるが対応する非感染細胞では発現されない抗原に特異的に結合する一つのアームを有する場合、病原性感染症を治療するために使用されうる。このような抗原は、病原体によってコードされうるか、又は病原体による感染に応答して細胞によって発現されうる。感染細胞に発現する抗原の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の糖タンパク質gp41及びgp120、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）のEnvタンパク質、単純ヘルペスウイルス（HSV）の糖タンパク質gB及びgH、インフルエンザヘマグルチニン（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）、及び呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のFタンパク質を含む。二重特異性抗体で治療可能な病原性感染症の例としては、ウイルス、細菌、原虫、真菌感染症を含む。ウイルス感染症の例としては、HIV、肝炎（A、B、又はC）、ヘルペスウイルス（例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV、エプスタインバールウイルス）、アデノウイルス、XMRV、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器シンシチアルウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デングウイルス、MLV関連ウイルス、パピローマウイルス、モルスカムウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス、及びアルボウイルス性脳炎ウイルスを含む。細菌感染症のいくつかの例としては、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎球菌及びコノコクシ（Conococci）、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、テタナス、ボツリヌス、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、ライム病菌、連鎖球菌、又はナイセリアを含む。病原性真菌の例としては、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラスマ、ニューモシスチス、スタキボトリスを含む。原生動物の例としては、クリプトスポリジウム、ジアルジアラムリア及びプラスモジウムを含む。
二重特異性抗体は、ヒトCD3に対する単特異性抗体と同様に、免疫疾患の治療にも使用することができる。免疫疾患の例としては、1型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、全身硬直症候群、関節リウマチ、重症筋無力症、及び紅斑性狼瘡などの自己免疫疾患が挙げられる。これらの疾患では、体は、その自己抗原の1つに対して細胞性及び/又は体液性免疫反応を起こし、その抗原を破壊し、場合によっては身体機能障害及び/又は死に至る結果をもたらす。自己免疫疾患は、本発明のモノクローナル抗体の1つを投与することにより治療される。本発明のモノクローナル抗体によって治療可能な他の免疫疾患としては、喘息、アレルギー、セリアック病、乾癬、及びブドウ膜炎が挙げられる。セリアック病、乾癬、及びブドウ膜炎は自己免疫疾患である。
単特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、発症を遅らせ、重症度を軽減し、さらなる悪化を抑制し、及び/又は状態の少なくとも1つの徴候又は症状を改善するような投与量、投与経路及び投与頻度を意味する有効なレジメで投与される。対象が既に疾患に罹患している場合、そのレジメは治療上有効なレジメと呼ぶことができる。対象が一般集団と比較して疾患のリスクが高いが、まだ症状を経験していない場合、レジメは予防的に有効なレジメと呼ぶことができる。いくつかの例では、治療的又は予防的な有効性は、個々の対象において、過去のコントロール又は同一対象における過去の経験と比較して観察できる。他の例では、治療的又は予防的な有効性は、前臨床試験又は臨床試験において、未治療の対象のコントロール集団と比較して、治療を受けた対象の集団で実証できる。
好ましくは、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、その構成抗体を個別に比較して、がん又は感染細胞に対して少なくとも相加的な活性を示し、より好ましくは相乗的な活性を示す。相乗効果は、Tallarida, Genes Cancer. 2011 Nov；2(11)：1003-1008に述べられているように、定量的に評価することが好ましい。また好ましくは、二重特異性抗体は、それぞれが二重特異性抗体と等モル濃度である、その構成抗体の混合物と比較して増加した活性を示す。このような活性は、例えば、二重特異性抗体の一方のアームに特異的に結合した抗原を発現するがん細胞、感染細胞又は免疫細胞に対する、ＣＤ３を発現する免疫細胞の存在下での細胞傷害作用又は細胞増殖抑制作用として測定できる。
単特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体の例示的な投与量は、0.01～20、又は0.5～5、又は0.01～1、又は0.01～0.5、又は0.05～0.5 mg/kg体重（例えば、0.1、0.5、1、2、3、4、又は5 mg/kg）、又は固定用量として10～1500 mgである。投与量は、患者の状態及び事前の治療に対する反応（もしあれば）、治療が予防的であるか治療的であるか、及び障害が急性であるか慢性であるか、などに依存する。
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、又は筋肉内で行うことができる。体循環への投与は、静脈内投与又は皮下投与が好ましい。静脈内投与は、例えば、30～90分などの時間をかけて注入することにより行うことができる。
投与の頻度は、他の要因の中でもとりわけ、循環系における抗体の半減期、対象の状態、投与経路に依存する。投与頻度は、毎日、毎週、毎月、四半期ごと、又は患者の状態の変化や治療対象の障害の進行に応じて不定期に行うことができる。静脈内投与の場合は、連続した治療期間中、週1回から四半期に1回の頻度が例示されるが、それより多い又は少ない頻度での投与も可能である。皮下投与の場合、例示的な投与頻度は、毎日から毎月であるが、それより多い又は少ない頻度での投与も可能である。
投与回数は、障害が急性であるか慢性であるか、及び治療に対する障害の反応に依存する。急性障害又は慢性障害の急性増悪の場合、1回から10回の投与で十分であることが多い。急性疾患や慢性疾患の急性増悪時には、1回のボーラス投与（任意に分割投与）で十分な場合もある。急性疾患や急性増悪の再発に対しては、治療を繰り返すことができる。慢性疾患に対しては、二重特異性抗体を定期的に、例えば、毎週、隔週、毎月、四半期、6ヶ月ごとに、少なくとも1年、5年、10年、又は対象の生涯にわたって投与できる。
医薬組成物は、好ましくは、ヒトへの非経口投与に適している（例えば、FDAの基準に従う）。非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは無菌かつ実質的に等張であり、GMP条件で生産される。医薬品組成物は、単位投与形態（すなわち、1回の投与のための投与量）で提供できる。医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を用いて製剤化できる。薬学的に許容されるとは、ヒトへの投与に適していることを意味し、例えば、FDAによって承認されているか、承認可能であることを意味する。処方は、選択した投与経路によって異なる。注射の場合、抗体は水溶液、好ましくはHank's液、Ringer's液、生理食塩水又は酢酸バッファーなどの生理学的に適合したバッファーで処方できる（注射部位の不快感を軽減するため）。この溶液には、懸濁剤、安定化剤、分散剤などの製剤用剤を含みうる。あるいは、抗体は、使用前に適切なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水で再構成するために凍結乾燥された形態であってもよい。
本発明の抗体による治療は、治療される障害に対して有効な他の治療と組み合わせることができる。がんの治療に使用する場合、本発明の抗体は、化学療法、放射線、幹細胞治療、手術、又はHER2抗原に対するハーセプチンTM（トラスツズマブ）、VEGFに対するアバスチンTM（ベバシズマブ）、又はEGF受容体に対する抗体、例えば、（アービタックスTM、セツキシマブ）、及びベクティビックスTM（パニツムマブ）又は表２に示される他の抗体、などの他の生物製剤による治療と組み合わせることができる。化学療法剤としては、クロラムブシル、シクロホスファミド又はメルファラン、カルボプラチナム、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン、メトトレキサート、フルダラビン、及びシタラビン、エトポシド又はトポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチンが挙げられる。感染症に対しては、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤などを併用して治療できる。
他の方法
本発明の抗体は、診断法、予後診断法、実験法にも利用できる。それらは、がんによって発現された抗原のレベル、又はがんを有する患者の循環中の抗原のレベルを測定し、そのレベルが測定可能であるか、あるいは上昇しているかどうかを判断し、従って、がんの治療を追跡し、導くために使用できる。なぜなら、抗原の測定可能なレベル又は上昇したレベルに関連するがんは、がんに結合するアームを含む二重特異性抗体による治療に最も感受性が高いからである。抗体は、とりわけ、ELISAアッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫組織化学に使用できる。抗体は、蛍光分子、スピン標識分子、酵素又は放射性同位元素で標識することができ、アッセイを行うために必要な全ての試薬を含むキットの形で提供されてもよい。
上又は下で引用された全ての特許出願、ウェブサイト、その他の出版物、アクセッション番号などは、全ての目的のために、個々の項目が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、その全体が参照により組み込まれる。ある配列の異なるバージョンが異なる時期にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効出願日におけるアクセッション番号に関連付けられたバージョンを意味する。有効出願日とは、該当する場合はアクセッション番号を参照して、実際の出願日と優先権出願の出願日のうち、どちらか早い方を指す。同様に、出版物やウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時期に公開されている場合、他に指示がない限り、本願の有効出願日に最も最近公開されたバージョンを意味する。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態、又は側面は、特に他に示されていない限り、他のものと組み合わせて使用できる。本発明は、明確さと理解のために、例示及び実施例を用いてある程度詳細に説明してきたが、添付の請求項の範囲内で特定の変更及び修正を実施できることは明らかであろう。
実施例1：全般的な手順、方法及び材料
遺伝子クローニング、変異誘発、プラスミド構築、タンパク質発現及び精製、細胞培養、ELISA、及びフローサイトメトリーは、Green及びSambrook（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th ed., 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）、Greenfield（Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed., 2014, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）、Kostelnyら（Int. J. Cancer 93:556-565, 2001）、Coleら（J. Immunol. 159:3613-3621, 1997）及びTsurushitaら（Methods 36:69-83, 2005）に記載の標準的な実験技術や、ベンダーのプロトコルに従って実施した。キメラ化、ヒト化、及びヒト IgG1/カッパ（又はラムダ）抗体におけるアミノ酸残基の位置については、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 及び 1991）のナンバリングシステムを使用した。
SP34は、ヒト及びカニクイザルのCD3イプシロンタンパク質に結合するマウスIgG3/ラムダモノクローナルアゴニスト抗体である。T細胞表面のCD3イプシロンタンパク質をSP34によって架橋すると、そのT細胞が活性化される。（Passano et al., EMBO J. 4:337-344, 1985；Yang et al., J. Immunol. 137:1097-1100, 1986；Salmeron et al., J. Immunol. 147:3047-3052, 1991；Perez-Aciego et al., J. Exp. Med. 174:319-326, 1991；Conrad et al., Cytom. A 71A:925-933, 2007；US Patents 8,236,308 and 10,066,015）。SP34の成熟重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列は、EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号1）である。SP34の成熟軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列は、QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL（配列番号2）である。
実施例2：ヒト化抗ヒトCD3抗体 [I]
ヒト化SP34のVH及びVLアミノ酸配列は、Tsurushitaら（前掲）に記載された一般的な手順に従って設計した。簡潔には、まずマウスSP34可変領域の三次元分子モデルを適切なソフトウェアを用いて構築した。次に、その分子モデルを用いて、CDR構造の形成に重要なフレームワークアミノ酸残基を特定した。並行して、SP34のVH及びVLとそれぞれ高い相同性を有すcDNA由来のヒトVH及びVLのアミノ酸配列をそれぞれ選択した。最後に、抗原結合部位の適切な形成に重要なフレームワークアミノ酸残基とともにCDR配列を、SP34のVH及びVLから対応する選択されたヒトのフレームワーク配列にグラフトした。
ヒト化SP34 VHの設計には、ヒト化のためのアクセプターとして、M24236 cDNA（GenBankアクセス番号：Sanz et al., J. Immunol. 142:883-887, 1989）（M24236 VH；配列番号3）によってコードされるヒトVH配列を選んだ。ヒトの生殖細胞系VHセグメントのIGHV3-15サブグループに属するM24236VHは、フレームワーク領域のアミノ酸配列に体細胞過剰変異がない。M24236 VHのフレームワークアミノ酸配列は、SP34 VHの配列と85.2%の同一性を有する。SP34 VHのCDR配列を、M24236 VHの対応する位置にまず移した。次に、SP34可変領域の三次元モデルが、アミノ酸残基が抗原結合部位の形成に重要な役割を果たす可能性があると示したフレームワーク位置３０、４９、９３及び９４において、M24236 VHのアミノ酸残基を、マウスSP34 VHの対応する残基に置換した。得られたHuSP34 VH1（配列番号4）と名付けられた成熟ヒト化VHのアミノ酸配列を、成熟SP34及びM24236 VHのアミノ酸配列とともに図1に示す。
ヒト化SP34 VLの設計には、ヒト化のためのアクセプターとして、Y14738 cDNA（GenBankアクセス番号：Paterson et al., Immunotechnol. 4:37-47, 1998）（Y14738 VL；配列番号5）によってコードされるヒトVλ領域を選んだ。ヒトの生殖細胞系VλセグメントのIGLV8-61サブグループに属するY14738 VLは、フレームワーク領域の配列に体細胞過剰変異がない。Y14738 VLのフレームワークアミノ酸配列は、SP34 VLの配列と67.1%の同一性を有する。SP34 VLのCDR配列を、Y14738 VLの対応する位置にまず移した。次に、SP34可変領域の三次元モデルが、アミノ酸残基が抗原結合部位の形成に重要な役割を果たす可能性があると示したフレームワーク位置36、46、及び49において、Y14738 VLのアミノ酸残基を、マウスSP34 VLの対応する残基に置換した。得られたHuSP34 VL1（配列番号6）と名付けられた成熟ヒト化VLのアミノ酸配列を、成熟SP34及びY14738 VLのアミノ酸配列とともに図2に示す。
HuSP34 VH1をコードする遺伝子は、シグナルペプチド（配列番号7）、スプライスドナーシグナル、5'末端のSpeIサイト及び3'末端のHindIIIサイトを含むエクソンとして合成した（図3）。HuSP34 VL1をコードする遺伝子は、同様に、シグナルペプチド（配列番号8）、スプライスドナーシグナル、5'末端のNheIサイト及び3'末端のEcoRIサイトを含むエクソンとして合成した（図4）。HuSP34 VH1及びVL1遺伝子は、ヒト化IgG1/ラムダ抗体の生産用哺乳類発現ベクターのSpeI及びHindIIIサイト（VH用）又はNheI及びEcoRIサイト（VL用）の間にクローニングした。得られたpHuSP34Aと名付けられた発現ベクターの模式図を、図5Aに示す。ヒト化抗CD3 IgG1/ラムダ抗体（HuSP34A）は、哺乳類細胞においてpHuSP34Aから生産される。
図5AのSalIサイトから時計回りに進むと、pHuSP34Aは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始するために、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）主要最初期プロモーター及びエンハンサー（図ではCMV-P）で始まる重鎖転写ユニットを含む。CMVプロモーターの後に、HuSP34 VH1をコードするVHエキソン、並びにCH1、ヒンジ、CH2及びCH3エキソンと、その間に介在するイントロンを含むヒトガンマ-1重鎖定常領域を含むゲノム配列、及びCH3エキソンの後に続くポリアデニル化部位が続く。CH2領域には、エフェクター機能を排除するために、234位及び235位（Eu番号、Kabat et al.、上記）のロイシンをアラニンに置換するアミノ酸置換が導入されている（Hazareh et al., J. Virol. 75:12161-12168, 2001）。重鎖遺伝子配列の後、軽鎖転写ユニットは、CMVプロモーターから始まり、HuSP34A VL1をコードするエクソン、イントロンの一部が先行するヒトラムダ-2鎖定常領域（Cλ2）を含むゲノム配列、Cλ2エクソンに続くポリアデニル化サイトが続く。軽鎖遺伝子の後には、SV40初期プロモーター（SV40-P）、ピューロマイシン耐性のためのピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（puro）、及びSV40ポリアデニル化サイトを含むセグメント（SV40-A）が続く。最後に、プラスミドは、細菌の複製起点（pUC ori）及びベータ-ラクタマーゼ遺伝子（β lactamase）を含むプラスミドpUC19の一部を含む。関連する制限酵素サイトの位置は、図5Aに示される。矢印は、転写の方向を示している。
pHuSP34Aにコードされるヒトガンマ-1重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、及びCH3領域のアミノ酸配列は、それぞれASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV（配列番号9）、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号10）、APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK（配列番号11）、及びGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号12）である。
pHuSP34Aにコードされるヒトラムダ-2定常領域（Cλ2）のアミノ酸配列は、GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS（配列番号13）である。
pHuSP34Aにコードされる重鎖のアミノ酸配列は、MLLGLKWVFFVVFYQGVHCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号14）である。成熟HuSP34A重鎖は、配列番号14の20位のグルタミン酸残基から始まる。
pHuSP34Aにコードされる軽鎖のアミノ酸配列は、MAWISLILSLLALSSGQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS（配列番号15）である。成熟HuSP34A軽鎖は、配列番号15の17位のグルタミン残基から始まる。
発現ベクターpHuSP34Aをチャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1の染色体に導入した。CHO-K1への安定したトランスフェクションは、エレクトロポレーションによって行った。トランスフェクションの前に、pHuSP34Aを制限酵素FspIを用いて直鎖化した（図5A）。約2.5 x 106 個の細胞を、20 μg の直線化プラスミドでトランスフェクトし、SFM4CHO 培地（HyClone、Logan、UT）に懸濁し、細胞を適切に希釈した後、96ウェルプレートに播種し、37°C、7.5% CO2インキュベーターで培養した。48時間後、安定的なトランスフェクト細胞を単離するために10 μg/mlのピューロマイシンを添加した。
セレクション開始から約10日後、96ウェルプレート中のCHO-K1安定トランスフェクトの培養上清を、サンドイッチELISAにより抗体産生について測定した。典型的な実験では、ELISAプレートのウェルを、PBS中のヤギ抗ヒトIgG、Fcγ特異的、ポリクローナル抗体で4°Cで一晩コートし、洗浄バッファー（0.05% Tween 20を含むPBS）で洗浄し、ELISAバッファー（2%スキムミルク及び0.05% Tween 20を含むPBS）でブロックした。洗浄バッファーでウェルを洗浄した後、ELISAバッファーで適切に希釈した試験用抗体をELISAプレートに塗布した。標準物質として、適切なヒト化IgG1/ラムダ（又は必要に応じてカッパ）抗体を使用した。ELISAプレートを室温で1時間インキュベートし、洗浄バッファーで洗浄した後、HRP結合ヤギ抗ヒトラムダ鎖（又は必要に応じてカッパ鎖）ポリクローナル抗体を用いて、結合した抗体を検出した。室温で0.5時間インキュベートし、洗浄バッファーで洗浄した後、ABTS基質（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を用いて発色を開始し、2%シュウ酸で停止した。405 nmで吸光度を測定した。
HuSP34Aを産生するCHO-K1安定トランスフェクト細胞（CHO-K1/pHuSP34A）を、細胞生存率が50%未満になるまでローラーボトル内のSFM4CHOで培養した。遠心分離及び濾過後、培養上清をタンパク質Aカラム（HiTrap MabSelect SuRe、GE Healthcare、Piscataway、NJ）に充填した。0.1 M NaClを含む0.1 Mグリシン-HCl緩衝液（pH 3.0）で抗体を溶出する前に、カラムをPBSで洗浄した。1 M Tris-HCl（pH 8.0）で中和した後、溶出した抗体の緩衝液を透析によりPBSに交換した。抗体濃度は、280 nmでの吸光度を測定して決定した（1.4 OD = 1 mg/ml）。
HuSP34AのヒトCD3への結合は、ヒトT細胞株Jurkat Dual（Invivogen、San Diego、CA）を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。典型的な実験では、HuSP34Aを、FACSバッファー（0.5% 牛血清アルブミン（BSA）及び0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS）中で、Jurkat Dual細胞と様々な濃度で30分間インキュベートした。FACSバッファーで洗浄した後、細胞をPE標識ヤギ抗ヒトIgG抗体で20分間インキュベートした。FACSバッファーで洗浄し、懸濁した後、細胞をフローサイトメトリーにかけた。図6に示すように、HuSP34AはJurkat Dual細胞に用量依存的に結合した。ソフトウェアPrism（GraphPad、San Diego、CA）を用いて算出した、Jurkat Dual細胞へのHuSP34Aの結合のEC50値は92 ng/mlであった。
実施例3：抗ヒトCD3抗体のヒト化 [II]
2つ目のヒト化SP34 VLは、別の方法で設計した。ヒト化のためのアクセプターとして、L37309 cDNA（GenBankアクセス番号：Ohlin et al., Mol. Immunol. 33：47-56, 1996）（L37309 VL；配列番号16）によってコードされるヒト成熟Vκ領域を使用した。ヒトの生殖細胞系VκセグメントのIGKV3-11サブグループに属するL37309 VLは、フレームワーク領域の配列に体細胞過剰変異がない。L37309 VLのフレームワークのアミノ酸配列は、SP34 VLの配列と51.3%の同一性を有する。SP34 VLのCDR配列を、L37309 VLの対応する位置にまず移した。次に、SP34可変領域の三次元モデルが、アミノ酸残基が抗原結合部位の形成に重要な役割を果たす可能性があると示したフレームワーク位置36、46、49、58、66、67、69、70及び71において、L37309 VLのアミノ酸残基をマウスSP34 VLの対応する残基に置換した。得られたHuSP34 VL3（配列番号17）と名付けられた成熟ヒト化VLのアミノ酸配列を、SP34及びL37309 VLの配列とともに図7に示す。
HuSP34 VL3をコードする遺伝子は、シグナルペプチド（配列番号18）、スプライスドナーシグナル、5'末端のNheIサイト及び3'末端のEcoRIサイトを含むエクソンとして合成した（図8）。HuSP34 VL3遺伝子は、NheI及びEcoRIサイトの間にクローニングし、pHuSP34AにおけるHuSP34 VL1を置換した。さらに、ヒトラムダ-2鎖定常領域（Cλ2）をヒトカッパ鎖定常領域（Cκ）のコード配列に置換した。得られたHuSP34 VH1及びVL3を含むヒト化抗CD3 IgG1/カッパ抗体（HuSP34C）を発現するためのプラスミドはpHuSP34Cと名付けた。pHuSP34Cの模式図を5Bに示す。pHuSP34Cにコードされるヒトカッパ鎖定常領域のアミノ酸配列は、RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号19）である。pHuSP34Cにコードされる重鎖のアミノ酸配列は、pHuSP34Aにコードされるもの（配列番号14）と同一である。pHuSP34Cにコードされる軽鎖のアミノ酸配列は、MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号20）である。成熟HuSP34C軽鎖は、配列番号20の21位のグルタミン酸残基から始まる。
発現ベクターpHuSP34Cは、上述の方法によりエレクトロポレーションによりCHO-K1細胞に導入した。HuSP34Cを発現するCHO-K1安定トランスフェクト細胞（CHO-K1/pHuSP34C）を、上述の方法によりSFM4CHOで増殖させた。HuSP34Cを、上述の方法によりタンパク質Aを用いてCHO-K1/pHuSP34Cの培養上清から精製した。HuSP34CのヒトCD3への結合は、上述の方法により、Jurkat Dual細胞を用いてフローサイトメトリーにより測定した。その結果を図6に示す。HuSP34Cは、用量依存的にJurkat Dual細胞に結合した。Jurkat Dual細胞へのHuSP34Cの結合のEC50値は209 ng/mlであった。
実施例4：HuSP34 VL3の変異誘発
ヒトにおける免疫原性の可能性を低減するため、HuSP34 VL3におけるマウス由来のフレームワーク残基の数を減らす試みがなされた（図7）。HuSP34 VL3のフレームワークの36、58、66、67、69及び70位のそれぞれにおいて、マウス由来のアミノ酸残基を、オーバーラップ延長PCR法を用いた部位特異的変異誘発により、ヒトL37309 VLアクセプターの対応する残基に置換した。これらのHuSP34 VL3バリアントは、HuSP34 VL3において、36位のバリンをチロシン（V36Y；配列番号21）、58位のバリンをイソロイシン（V58I；配列番号22）、66位のロイシンをグリシン（L66G；配列番号23）、67位のイソロイシンをセリン（I67S；配列番号24）、69位のアスパラギン酸をスレオニン（D69T；配列番号25）、70位のリジンをアスパラギン酸（K70D；配列番号26）に置換したものである。
6つのHuSP34 VL3バリアントをそれぞれ、pHSP34C中のHuSP34VL3と置き換えてHuSP34 VH1と組み合わせ、IgG1/カッパ抗体の形態で発現させた。HuSP34 VL3 L66GバリアントをHuSP34 VH1と組み合わせた場合、抗体の発現は著しく低下した。HuSP34 VH1とHuSP34 VL3 V36Yバリアントを組み合わせると、抗原結合が大幅に減少した。HuSP34 VL3 V58I、I67S、D69T、及びK70Dバリアントは、それぞれHuSP34 VH1と組み合わせた場合、HuSP34 VH1及びVL3の組み合わせ（HuSP34C）と同等の抗原結合性を示した。67位のマウス由来の疎水性イソロイシン残基のヒト由来の親水性セリン残基への置換（I67S）は、抗原結合親和性の低下は引き起こさず、HuSP34 VL3で許容された。同様に、（i）69 位のマウス由来の酸性アスパラギン酸残基のヒト由来の中性の親水性スレオニン残基への置換（D69T）及び（ii）70位のマウス由来の塩基性リジン残基のヒト由来の酸性アスパラギン酸残基への置換は（K70D）いずれも、親和性の低下を引き起こさなかった。
V58I、I67S、D69T、及びK70Dの変異をHuSP34 VL3に組み合わせて、HuSP34 VL4を作製した。成熟HuSP34 VL4の配列は、図7（配列番号27）に示す。HuSP34 VL4をコードする遺伝子は、HuSP34 VL3の部位特異的変異誘発により作製した。HuSP34 VL4遺伝子のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を図9に示す。
HuSP34 VL4遺伝子は、pHSP34CにおけるHuSP34 VL3を置き換えるために、NheI及びEcoRIサイトの間にクローニングした。得られたpHSP34Vと名付けられた発現ベクターは、HuSP34 VH1及びVL4を含むヒト化SP34 IgG1/カッパ抗体を発現する（HuSP34V）。pHuSP34Vにコードされる重鎖のアミノ酸配列は、pHuSP34Aにコードされるもの（配列番号14）と同一である。pHuSP34Vにコードされる軽鎖のアミノ酸配列は、MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号28）である。成熟HuSP34V軽鎖は、配列番号28の21位のグルタミン酸残基から始まる。
発現ベクターpHuSP34Vは、上述の方法によりエレクトロポレーションによりCHO-K1細胞に導入した。HuSP34Vを発現するCHO-K1安定トランスフェクタント（CHO-K1/pHuSP34V）を選択し、上述の方法によりSFM4CHOにて増殖させた。HuSP34Vは、上述の方法によりタンパク質Aを用いてCHO-K1/pHuSP34Vの培養上清から精製した。HuSP34VのヒトCD3への結合は、上述の方法により、Jurkat Dual細胞を用いてフローサイトメトリーにより測定した。その結果を図6に示す。HuSP34V は、用量依存的にJurkat Dual細胞に結合した。Jurkat Dual細胞へのHuSP34Vの結合のEC50値は234 ng/mlであった。
実施例5：抗CD20/CD3二重特異性抗体の作製及び特性評価
HuSP34AのVH及びVL領域は、N'-VH-リンカー-VL-C'の配向を持つ一本鎖Fv（scFv）形態に変換した。さらに、作製したscFvに、HuSP34 VH1の44位のグリシンをシステインに（図1）、HuSP34 VL1の100位のグリシンをシステインに、2つのアミノ酸置換を導入した（図2）（Brinkman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7538-7542, 1993）。VH及びVLエキソンを抗CD20抗体のものと置換した以外はpHuSP34Cと同一構造を有する抗体発現ベクターで、得られたHuSP34AのscFv形態（HuSP34A.scFv.HL.ds；配列番号29）を、その間に柔軟なポリペプチドリンカーを介して、CH3領域の最後から2番目のグリシン残基に融合した（CH3-HuSP34A.scFv. HL.ds；配列番号30）（図5B）。得られた発現ベクターはpJB509と名付けた。
HuSP34AのVH及びVL領域はまた、HuSP34 VH1の44位のグリシンがシステインに、HuSP34 VL1の100位のグリシンがシステインに2つのアミノ酸置換を持つN'-VL-リンカー-VH-C'の配向を有する別のscFv形態に変換された（HuSP34A.scFv.LH.ds；配列番号31）。CH3領域の最後から2番目のグリシン残基に融合したHuSP34A.scFv.LH.ds（CH3-HuSP34A.scFv.LH.ds；配列番号32）を用いて、pJB509中のCH3-HuSP34A.scFv.HL.dsを置換した。得られた発現ベクターはpJB510と名付けた。
発現ベクターpJB509及びpJB510を、ポリエチレンイミン（Durocher et al. Nucl. Acids Res. 30：e9, 2002）を用いて、ヒト胎児腎細胞株HEK293に個別にトランスフェクトし、組換え抗体を一過性に発現させた。HEK293細胞を、10%胎児牛血清（FBS；Life Technologies、Grand Island、NY）を含むDME培地で、37°C、7.5% CO2インキュベーターで培養した。上述の方法によりサンドイッチELISAにより測定した培養上清中の抗CD20/CD3二重特異性抗体の発現は、pJB509及びpJB510のいずれにおいても非常に低かった。HuSP34A.scFv.HL及びHuSP34A.scFv.LHを、他のキメラ又はヒト化IgG1抗体のCH3のC末端領域にそれぞれ結合させた場合も、抗体の発現は再び非常に低かった。
次に、HuSP34 VH1及びVL4をN'-VL-リンカー-VH-C'の配向で用いて、抗CD3 scFv抗体を形成した。さらに、このような作製したscFvに、HuSP34 VH1の44位のグリシンをシステインに、HuSP34 VL4の100位のグリシンをシステインに、2つのアミノ酸置換を導入した。得られたscFvはHuSP34V.scFv.dsと名付けた。HuSP34V.scFv.dsのアミノ酸配列は、EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号33）である。
HuSP34V.scFv.dsを、VH及びVLがキメラ化抗CD20抗体C2B8由来である以外はpHuSP34Cと同一構造を有するIgG1/カッパ抗体発現ベクター（図5B）で、それらを分離する柔軟なポリペプチドリンカーを介してCH3の最後から2番目のグリシン残基に融合した（CH3-HuSP34V.scFv.ds；配列番号34）（Reff et al. Blood 83:435-445, 1994；Maloney et al. Blood 84:2457-2466, 1994）。得られた発現ベクターはpJB554と名付けた。pJB554の模式図を、図5Cに示す。
pJB554にコードされる成熟C2B8 VHのアミノ酸配列は、QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA（配列番号35；https://go.drugbank.com/drugs/DB00073）である。
pJB554にコードされる成熟C2B8 VLのアミノ酸配列は、QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号36；https://go.drugbank.com/drugs/DB00073）である。
pJB554から発現した二重特異性抗CD20/CD3 IgG1/カッパ抗体は、JB554と名付けた。JB554の模式図を図10に示す。pJB554にコードされる重鎖の配列は、MGWSLILLFLVAVATRVLSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号37）である。成熟JB554重鎖は、配列番号37の20位のグルタミン残基から始まる。
pJB554にコードされる軽鎖の配列は、MDFQVQIISFLLISASVIMSRGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号38）である。成熟JB554の軽鎖は、配列番号38の23位のグルタミン残基から始まる。
発現ベクターpJB554を、上述の方法によりHEK293細胞にトランスフェクトした。pJB554からの抗CD20/CD3二重特異性抗体の発現は、pJB509及びpJB510の場合と比較して改善された。一過性に発現したJB554を、上述の方法によりタンパク質Aにより精製した。CD20及びCD3に結合できる二重特異性抗体であるJB554の、CD20陽性ヒトバーキットリンパ腫Ramos細胞に対するT細胞媒介性細胞傷害作用を、以下の通り評価した。精製したヒトCD3汎T細胞（Cat. # IQB-Hu1-T100、Lot # P19D0900、iQ Biosciences、Berkeley、CA）を、10% FBS、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mM HEPESを含むRPMI 1640培地（RPMI 1640完全培地）で、50 ng/mlの組換えヒトIL-2（Acro Biosystems、Newark、DE）の存在下、37°C、7.5% CO2インキュベーターで4日間インキュベートした（活性化T細胞）。蛍光色素（Calcein AM、BioLegend、San Diego、CA）で標識した10万個のRamos細胞を、150 ng/mlのJB554の存在下（又は非存在下）で96ウェルプレートのウェルに、100万個の活性化T細胞とともに200 μlのRPMI 1640完全培地で4時間インキュベートした。Ramos細胞の溶解の程度を監視するため、販売元の指示に従って培地中の蛍光を測定した。100%溶解のコントロールとして、上記と同様に単独でインキュベートし、SDSで細胞溶解処理したCalcein AM標識Ramos細胞の培養上清の蛍光を測定した。バックグラウンドコントロールとして、Calcein AM標識Ramos細胞を上記と同様に単独でインキュベートし、培養上清の蛍光を測定した。
Calcein AM標識Ramos細胞を用いた細胞傷害作用試験の結果を図11Aに示す。培養上清中の相対蛍光強度（RFU）値は、（i）Ramos細胞単独で23,911、（ii）SDS処理したRamos細胞で74,000、（iii）活性化T細胞とインキュベートしたRamos細胞で33,668、（iv）活性化T細胞及びJB554とインキュベートしたRamos細胞で82,104であった。抗CD20/CD3二重特異性抗体JB554は、活性化T細胞の存在下でRamos細胞の溶解を効率的に誘導した。
実施例6：抗EGFR/CD3二重特異性抗体の作製及び特性評価
CD3及び上皮成長因子受容体（EGFR）に結合する二重特異性抗体の発現ベクターを構築するため、pJB554のVH及びVL遺伝子を、マウス抗EGFR抗体225に由来する遺伝子で置換した（Masui et al. Cancer Res. 44:1002-1007, 1984；Gill et al. J. Biol. Chem. 259:7755-7760, 1984）。得られた発現ベクターはpJB559と名付けた。pJB559の構造は、VH及びVL配列を除き、pJB554と同一である（図5C）。
pJB559にコードされる成熟225 VHのアミノ酸配列は、QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA（配列番号39；https://go.drugbank.com/drugs/DB00002）である。
pJB559にコードされる成熟225 VLのアミノ酸配列は、DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK（配列番号40；https://go.drugbank.com/drugs/DB00002）である。
pJB559から発現した二重特異性抗EGFR/CD3 IgG1/カッパ抗体は、JB559と名付けた。JB559の模式図を図10に示す。JB559重鎖のアミノ酸配列は、MAVLALLFCLVTFPSCVLSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号41）である。成熟JB559重鎖は、配列番号41の20位のグルタミン残基から始まる。
JB559軽鎖のアミノ酸配列は、MRAPAQFLGFLLFWIPASRSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号42）である。成熟JB559軽鎖は、配列番号42の21位のアスパラギン酸残基から始まる。
発現ベクターpJB559を、上述の方法によりHEK293細胞にトランスフェクトした。一過性に発現したJB559を、上述の方法によりタンパク質Aにより精製した。EGFR及びCD3に結合できる二重特異性抗体であるJB559の、EGFR陽性ヒト結腸直腸腺癌HT-29細胞に対するT細胞媒介性細胞傷害作用を、以下の通り評価した。HT-29細胞を、まず、RPMI 1640完全培地中に40万細胞/mlの濃度で96ウェルプレートのウェルに播種した。48時間後、HT-29細胞をCalcein AMで標識し、上述の方法により、試験抗体（JB554又はJB559）の存在下（又は非存在下）で、500万細胞/mlの活性化T細胞とインキュベートした。100%溶解のコントロールとして、上記と同様に単独でインキュベートし、SDSで細胞溶解処理したCalcein AM標識HT-29細胞の培養上清の蛍光を測定した。バックグラウンドコントロールとして、Calcein AM標識HT-29細胞を上記と同様に単独でインキュベートし、培養上清の蛍光を測定した。
Calcein AM標識HT-29細胞を用いた細胞傷害作用試験の結果を図11Bに示す。培養上清中のRFU値は、（i）HT-29細胞のみで5,119、（ii）SDS処理したHT-29細胞で75,928、（iii）活性化T細胞とインキュベートしたHT-29細胞で7,945、（iv）活性化T細胞及びJB554とインキュベートしたHT-29細胞で7,101、（v）活性化T細胞及びJB559とインキュベートしたHT-29細胞で38,523であった。抗EGFR/CD3二重特異性抗体JB559は、活性化T細胞の存在下でHT-29細胞の溶解を誘導した。HT-29細胞に結合しない抗CD20/CD3二重特異性抗体JB554は、活性化T細胞の存在下ではHT-29細胞の溶解を誘導しなかった。
実施例7：抗CD20、抗EGFR、及び抗CD33 IgG1抗体の発現及び精製
マウス-ヒトキメラ化抗CD20 IgG1/カッパ抗体（ChC2B8）を発現する発現ベクターpChC2B8は、（i）CH3-HuSP34V.ScFv.ds領域（配列番号34）は、野生型ＣＨ３配列（配列番号12）に置き換えられ、（ii）CH2領域は、ヒトガンマ１重鎖の野生型CH2配列（配列番号49）をコードしている以外は、pJB554と同一構造を有する（図5C）と同一構造を有する。pChC2B8にコードされる軽鎖のアミノ酸配列は、pJB554にコードされる軽鎖の配列（配列番号38）と同一である。pChC2B8にコードされる重鎖のアミノ酸配列は、MGWSLILLFLVAVATRVLSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号50）である。成熟ChC2B8重鎖は、配列番号50の20位のグルタミン残基から始まる。
マウス-ヒトキメラ化抗EGFR IgG1/カッパ抗体（Ch225）を発現する発現ベクターpCh225は、（i）CH3-HuSP34V.scFv.ds領域（配列番号34）が野生型CH3配列（配列番号12）に置き換えられ、及び（ii）CH2領域がヒトガンマ-1重鎖の野生型CH2配列（配列番号49）をコードしている以外は、pJB559と同一構造を有する。pCh225にコードされる軽鎖のアミノ酸配列は、pJB559にコードされる軽鎖の配列（配列番号42）と同一である。pCh225にコードされる重鎖のアミノ酸配列は、MAVLALLFCLVTFPSCVLSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号51）である。成熟Ch225重鎖は、配列番号51の20位のグルタミン残基から始まる。
ヒト化抗CD33 IgG1抗体HuM195を発現する発現ベクターpHuM195（Co et al.、J. Immunol. 148:1149-1154, 1992；米国特許 5,693,761）は、VH領域及びVL領域がそれぞれHuM195VH（配列番号52）及びHuM195VL（配列番号53）をコードすることを除き、pChC2B8と同一構造を有する。pHuM195にコードされる重鎖のアミノ酸配列は、MGWSWIFFFLLSGTASVLSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号54）である。成熟HuM195重鎖は、配列番号54の20位のグルタミン残基から始まる。pHuM195にコードされる軽鎖の配列は、MEKDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGGAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号55）である。成熟HuM195軽鎖は、配列番号55の21位のアスパラギン酸残基から始まる。
pChC2B8、pCh225、及びpHuM195をそれぞれ上述の方法によりCHO-K1に安定的に導入した。ChC2B8、Ch225、及びHuM195 IgG1抗体は、上述の方法により、それぞれのCHO-K1安定トランスフェクタントの培養上清からタンパク質Aにより精製した。ChC2B8、Ch225、及びHuM195抗体について、還元条件下でのSDS-PAGE分析により、およそ50 kDaの重鎖及び25 kDaの軽鎖の2本の主要なバンドのみが確認された。
実施例8：CD20及びCD3に結合するJB554のさらなる特性評価
JB554を産生するCHO-K1安定発現細胞株（CHO-K1/pJB554）の作製は、上述の方法によりエレクトロポレーションにより実施した。SFM4CHO培地でのCHO-K1/pJB554細胞の増殖、及びタンパク質AによるJB554の精製は、上述の方法により行った。精製したJB554を還元条件下でSDS-PAGEで分析したところ、約75 kDaの重鎖及び25 kDaの軽鎖の2本の主要なバンドのみが確認された。
CHO-K1/pJB554細胞から精製したJB554の生物活性を、Jurkat Dualレポーター細胞（Invivogen、San Diego、CA）を用いて調べた。Jurkat Dual細胞では、細胞表面のCD3の架橋により細胞内のNF-κBシグナル伝達経路が活性化され、その結果、組換えLuciaルシフェラーゼの発現及び分泌が引き起こされる。約40万個のJurkat Dual細胞を、96ウェルプレートのウェル内で、10% FBSを含む200 μlのRPMI 1640培地で、20万個のCD20陽性Ramos細胞及び試験抗体の存在下（又は非存在下）で、37°C、7.5% CO2インキュベーター内で1日間インキュベートした。培養上清中のルシフェラーゼ活性を、QUANTI-Luc試薬（Invivogen）を用いて、販売元のプロトコルに従って3連で測定した。発光は、Synergy HTマイクロプレートリーダー（BioTek、Winooski、VT）を用いて測定した。平均相対発光単位（RLU）値は、（i）Jurkat Dual細胞のみで539、（ii）1 μg/mlのChC2B8（抗CD20 IgG1抗体）及び1 μg/mlのHuSP34V（抗CD3 IgG1抗体）でインキュベートしたJurkat Dual細胞で1,940、（iii）1 μg/mlのJB554（抗CD20/CD3二重特異性抗体）でインキュベートしたJurkat Dual細胞で827、（iv）1 μg/mlのJB559（抗EGFR/CD3二重特異性抗体）でインキュベートしたJurkat Dual細胞で459、（v）Ramos細胞でインキュベートしたJurkat Dual細胞で256、（vi）1 μg/mlのChC2B8、1 μg/mlのHuSP34V、及びRamos細胞でインキュベートしたJurkat Dual細胞で2,212、（vii）1 μg/mlのJB554及びRamos細胞でインキュベートしたJurkat Dual細胞で14,730、（viii）1 μg/mlのJB559及びRamos細胞でインキュベートしたJurkat Dual細胞で691であった。図12Aは、Jurkat Dualアッセイの標準偏差エラーバー付きRLU値を示す。Jurkat Dual細胞をJB554及びRamos細胞とともにインキュベートした場合のみ、培養上清で高レベルのルシフェラーゼ活性が観察された。
CHO-K/pJB554細胞から精製したJB554を、各試験抗体は1 μg/mlで使用した以外は上述のとおりに、Calcein AM標識Ramos細胞に対するT細胞媒介性細胞傷害作用についてさらに分析した。この実験に使用した活性化T細胞は、ヒトCD3汎T細胞（Cat. # IQB-Hu1-T100、iQ Biosciences、Berkeley、CA）のドナー3820由来であった。培養上清中の相対蛍光単位（RFU）値は、（i）Ramos細胞単独で18,474、（ii）SDS処理したRamos細胞で79,395、（iii）活性化T細胞とインキュベートしたRamos細胞で18,940、（iv）活性化T細胞、ChC2B8及びHuSP34VとインキュベートしたRamos細胞で19,220、（v）活性化T細胞及びJB554とインキュベートしたRamos細胞で79,395、及び（vi）活性化T細胞及びJB559とインキュベートしたRamos細胞で20,663であった（図12B）。抗CD20/CD3二重特異性抗体JB554は、活性化T細胞の存在下において、Ramos細胞の溶解を効率的に誘導したが、抗EGFR/CD3二重特異性抗体JB559、及び抗CD20抗体ChC2B8と抗CD3抗体HuSP34Vの組み合わせでは、Ramos細胞の溶解は効率的に誘導されなかった。
実施例9：EGFR及びCD3に結合するJB559のさらなる特性評価
JB559を産生するCHO-K1安定発現細胞株（CHO-K1/pJB559）の作製は、上述の方法によりエレクトロポレーションにより実施した。SFM4CHO培地でのCHO-K1/pJB559細胞の増殖、及びタンパク質AによるJB559の精製は、上述の方法により行った。精製したJB559を還元条件下でSDS-PAGEで分析したところ、約75 kDaの重鎖及び25 kDaの軽鎖の2本の主要なバンドのみが確認された。
CHO-K1/pJB559細胞から精製したJB559を、上述の方法によりCalcein AM標識HT-29細胞に対するT細胞媒介性細胞傷害作用を誘導する活性について分析した。各試験抗体は1 μg/mlで使用した。第1の細胞傷害作用実験に使用した活性化T細胞は、ヒトCD3汎T細胞（Cat. # IQB-Hu1-T100、iQ Biosciences、カリフォルニア州バークレー）のドナー3820由来であった。第2の実験では、ヒトCD3汎T細胞ドナー3661由来の活性化T細胞を使用した。第1の実験における培養上清の相対蛍光単位（RFU）値は、（i）HT-29細胞単独で6,112、（ii）SDS処理したHT-29細胞で75,173、（iii）活性化T細胞とインキュベートしたHT-29細胞で6,482、（iv）活性化T細胞、Ch225（抗EGFR IgG1抗体）及びHuSP34V（抗CD3 IgG1抗体）とインキュベートしたHT-29細胞で5,968、（v）活性化T細胞及びJB554（抗CD20/CD3二重特異性抗体）でインキュベートしたHT-29細胞で6,350、（vi）活性化T細胞及びJB559（抗EGFR/CD3二重特異性抗体）でインキュベートしたHT-29細胞で56,634であった（図13A）。第2の実験では、培養上清中のRFU値は、（vii）HT-29細胞単独で5,046、（viii）SDS処理したHT-29細胞で72,990、（ix）活性化T細胞とインキュベートしたHT-29細胞で6,114、（x）活性化T細胞、Ch225及びHuSP34VとインキュベートしたHT-29細胞で5,391、（xi）活性化T細胞及びJB554とインキュベートしたHT-29細胞で5,662、及び（xii）活性化T細胞及びJB559とインキュベートしたHT-29細胞で35,443であった（図13B）。HT-29細胞を用いた両方の実験において、抗EGFR/CD3二重特異性抗体JB559は、活性化T細胞の存在下においてHT-29細胞の溶解を効率的に誘導したが、抗CD20/CD3二重特異性抗体JB554、又はCh225とHuSP34Vの組み合わせは、HT-29細胞の溶解を効率的に誘導しなかった。
実施例10：抗EGFR/CD3二重特異性抗体JB559によるEGFR非依存的なT細胞の活性化の欠如
循環T細胞がEGFR非依存的にJB559によって活性化されるかどうかを調べるため、105個のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、10%FBSを含む200 μlのRPMI 1640培地中で、（i）試薬を添加しない、（ii）1 μg/mlのJB559を添加、又は（iii）8 x 104ヒトCD3/CD28 T細胞活性化ビーズ（抗CD3/CD28ビーズ、BioLegend、CA）を添加した96ウェルプレートのウェルに、37°C、7.5% CO2インキュベーターで3日間インキュベートした。このアッセイは、2連で実施した。JB559は、EGFR及びCD3に結合する二重特異性抗体である。EGFRは、PBMCでは発現しないか、発現してもごくわずかであると報告されている（http://proteinatlas.org）。
培養上清中のIFN-γ及びIL-2の発現レベルは、ELISA MAX Standard Set Human IFN-γ及びELISA MAX Standard Set Human IL-2キット（BioLegend）を用いてそれぞれ測定した。2連サンプルのIFN-γの発現レベルの平均値は、（a）試薬を添加しなかった場合で23.3 pg/ml、（b）JB559を添加した場合で11.6 pg/ml、（c）抗CD3/CD28ビーズを添加した場合で2,670 pg/mlであった。2連サンプルのIL-2の平均発現レベルは、（d）試薬を添加しなかった場合で33.8 pg/ml、（e）JB559を添加した場合で31.9 pg/ml、及び（f）抗CD3/CD28ビーズを添加した場合で11,500 pg/mlであった。EGFRを発現する細胞がない状態で、PBMCをJB559と3日間インキュベートしても、T細胞の活性化の兆候は見られなかった。
実施例11：抗CD33/CD3二重特異性抗体の作製及び特性評価
CD33及びCD3に結合する二重特異性抗体の発現ベクターを作製するために、pJB554のVH及びVL遺伝子を、それぞれHuM195 VH（配列番号52）及びHuM195 VL（配列番号53）をコードする遺伝子に置換した。得られたプラスミドはpJB564と名付けた。pJB564の構造は、VH及びVL配列を除き、pJB554と同一である（図5C）。pJB564から発現した抗CD33/CD3二重特異性抗体はJB564と名付けた。JB564の模式図を図10に示す。pJB564にコードされる重鎖のアミノ酸配列は、MGWSWIFFFLLSGTASVLSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号56）である。成熟JB564重鎖は、配列番号56の20位のグルタミン残基から始まる。pJB564にコードされる軽鎖のアミノ酸配列は、pHuM195にコードされる軽鎖の配列（配列番号55）と同一である。
JB564を産生するCHO-K1安定発現細胞株（CHO-K1/pJB564）の作製は、上述の方法によりエレクトロポレーションにより実施した。SFM4CHO培地でのCHO-K1/pJB564細胞の増殖、及びタンパク質AによるJB564の精製は、上述の方法により行った。精製したJB564を還元条件下でSDS-PAGEで分析したところ、およそ75 kDaの重鎖及び25 kDaの軽鎖の2つのポリペプチドで構成されていることがわかった。
JB564は、上述の方法により、活性化T細胞及び1 μg/mlの試験抗体の存在下（又は非存在下）で、Calcein AM標識ヒトCD33陽性HL-60細胞（Cat. # CCL-240、American Type Culture Collection、Manassas、VA）に対するT細胞媒介性細胞傷害作用を誘導する活性を分析した。培養上清中の相対蛍光単位（RFU）値は、（i）HL-60細胞単独で25,364、（ii）SDS処理したHL-60細胞で75,253、（iii）活性化T細胞とインキュベートしたHL-60細胞では22,895、（iv）活性化T細胞、HuM195（抗CD33 IgG1抗体）及びHuSP34V（抗CD3 IgG1抗体）とインキュベートしたHL-60細胞で25,756、（v）活性化T細胞及びJB559（抗EGFR/CD3二重特異性抗体）でインキュベートしたHL-60細胞で21,928、（vi）活性化T細胞及びJB564（抗CD33/CD3二重特異性抗体）とインキュベートしたHL-60細胞で68,226であった（図14）。抗CD33/CD3二重特異性抗体JB564は、活性化T細胞の存在下においてHL-60細胞の溶解を効率的に誘導したが、抗EGFR/CD3二重特異性抗体JB559、及びHuM195とHuSP34Vの組み合わせでは溶解は効率的に誘導されなかった。
配列表
配列番号1
成熟SP34 VHのアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号2
成熟SP34 VLのアミノ酸配列
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
配列番号3
成熟M24236 VHのアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDSLPPHRVWGQGTLVTVSS
配列番号4
成熟HuSP34 VH1のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号5
成熟Y14738 VLのアミノ酸配列
QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSYYPSWYQQTPGQAPRTLIYTTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCVLYMGGVWVFGGGTKLTVL
配列番号6
成熟HuSP34 VL1のアミノ酸配列
QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
配列番号7
HuSP34 VH1のシグナルペプチドのアミノ酸配列
MLLGLKWVFFVVFYQGVHC
配列番号8
HuSP34 VL1のシグナルペプチドのアミノ酸配列
MAWISLILSLLALSSG
配列番号9
pHuSP34Aにコードされる、ヒトガンマ-1重鎖のCH1領域のアミノ酸配列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
配列番号10
pHuSP34Aにコードされる、ヒトガンマ-1重鎖のヒンジ領域のアミノ酸配列
EPKSCDKTHTCPPCP
配列番号11
pHuSP34Aにコードされる、ヒトガンマ-1重鎖のCH2領域のアミノ酸配列
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
配列番号12
pHuSP34Aにコードされる、ヒトガンマ-1重鎖のCH3領域のアミノ酸配列
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号13
pHuSP34Aにコードされる、ヒトラムダ-2定常領域のアミノ酸配列
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS（配列番号13）
配列番号14
pHuSP34Aにコードされる、重鎖のアミノ酸配列
MLLGLKWVFFVVFYQGVHCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号15
pHuSP34Aにコードされる、軽鎖のアミノ酸配列
MAWISLILSLLALSSGQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号16
成熟L37309 VLのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号17
成熟HuSP34 VL3のアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号18
HuSP34 VL3のシグナルペプチドのアミノ酸配列
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG
配列番号19
pHuSP34C及びpHuSP34Vにコードされる、ヒトカッパ定常領域のアミノ酸配列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号20
pHuSP34Cにコードされる、軽鎖のアミノ酸配列
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号21
成熟HuSP34 VL3 V36Yバリアントのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWYQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号22
成熟HuSP34 VL3 V58Iバリアントのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLIGDKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号23
成熟HuSP34 VL3 L66Gバリアントのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSGIGDKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号24
成熟HuSP34 VL3 I67Sバリアントのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLSGDKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号25
成熟HuSP34 VL3 D69Tバリアントのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGTKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号26
成熟HuSP34 VL3 K70Dバリアントのアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号27
成熟HuSP34 VL4のアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号28
pHuSP34Vにコードされる、軽鎖のアミノ酸配列
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号29
N'-VH-リンカー-VL-C'配向のHuSP34AのscFv形態（HuSP34A.scFv.HL.ds）のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL
配列番号30
HuSP34A.scFv.HL（CH3-HuSP34A.scFv.HL.ds）に融合したCH3領域のアミノ酸配列
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL
配列番号31
N'-VL-リンカー-VH-C'配向のHuSP34AのscFvフォーム（HuSP34A.scFv.LH.ds）のアミノ酸配列
QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号32
HuSP34A.scFv.LH.ds（CH3-HuSP34A.scFv.LH.ds）に融合したCH3領域のアミノ酸配列
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号33
N'-VL-リンカー-VH-C'配向のHuSP34VのscFvフォーム（HuSP34V.scFv.ds）のアミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号34
HuSP34V.scFv.ds（CH3-HuSP34V.scFv.ds）に融合したCH3領域のアミノ酸配列
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号35
成熟C2B8 VHのアミノ酸配列
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA
配列番号36
成熟C2B8 VLのアミノ酸配列
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
配列番号37
pJB554にコードされる、重鎖のアミノ酸配列
MGWSLILLFLVAVATRVLSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号38
pJB554にコードされる、軽鎖のアミノ酸配列
MDFQVQIISFLLISASVIMSRGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号39
成熟225 VHのアミノ酸配列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA
配列番号40
成熟225 VLのアミノ酸配列
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK
配列番号41
pJB559にコードされる、重鎖のアミノ酸配列
MAVLALLFCLVTFPSCVLSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号42
pJB559にコードされる、軽鎖のアミノ酸配列
MRAPAQFLGFLLFWIPASRSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号43 CDRH1 TYAMN
配列番号44: CDRH2 RIRSKYNNYATYYADSVKD
配列番号45 CDRH3 HGNFGNSYVSWFAY
配列番号46 CDRL1 RSSTGAVTTSNYAN
配列番号47 CDRL2 GTNKRAP
配列番号48 CDRL3 ALWYSNLWV
配列番号49
pChC2B8にコードされる、CH2領域のアミノ酸配列
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
配列番号50
pChC2B8にコードされる、重鎖のアミノ酸配列
MGWSLILLFLVAVATRVLSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号51
pCh225にコードされる、重鎖のアミノ酸配列
MAVLALLFCLVTFPSCVLSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号52
HuM195 VHのアミノ酸配列
MGWSWIFFFLLSGTASVLSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSS
配列番号53
HuM195 VLのアミノ酸配列
MEKDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGGAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK
配列番号54
pHuM195にコードされる、重鎖のアミノ酸配列
MGWSWIFFFLLSGTASVLSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号55
pHuM195にコードされる、軽鎖のアミノ酸配列
MEKDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGGAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号56
pJB564にコードされる、重鎖のアミノ酸配列
MGWSWIFFFLLSGTASVLSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号57
SpeI及びHindIIIサイトに挟まれたHuSP34 VH1遺伝子のヌクレオチド配列
ACTAGTACCACCATGCTGTTGGGGCTGAAGTGGGTTTTCTTTGTTGTTTTTTATCAAGGAGTGCATTGTGAAGTGCAGCTTGTGGAAAGTGGCGGAGGACTGGTGAAGCCAGGCGGATCACTGAGACTGTCCTGCGCAGCTAGTGGCTTCACCTTTAACACATACGCTATGAATTGGGTCCGACAGGCACCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCAAGGATCAGGTCCAAGTACAACAATTATGCAACCTACTATGCCGACTCTGTGAAGGATAGATTCACAATCAGTCGCGACGATTCCAAGAACACTCTGTATCTGCAGATGAACAGTCTGAAAACTGAAGACACCGCCGTGTACTATTGTGTGCGGCACGGAAACTTCGGCAATTCTTACGTCTCTTGGTTTGCTTATTGGGGACAGGGGACACTGGTCACTGTGTCTTCAGGTGAGTCCTAACTTCTCCCATTCTAAGCTT
配列番号58
シグナルペプチドを含むHuSP34 VH1のアミノ酸配列
MLLGLKWVFFVVFYQGVHCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号59
NheI及びEcoRIサイトに挟まれたHuSP34 VL1遺伝子のヌクレオチド配列
GCTAGCACCACCATGGCCTGGATTTCACTTATCCTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGCAGACTGTCGTGACACAGGAACCCTCATTTTCCGTCAGCCCTGGCGGAACAGTGACCCTGACCTGCAGATCTAGCACAGGCGCAGTGACCACAAGCAACTACGCCAACTGGGTCCAGCAAACTCCAGGCCAAGCTCCCAGAGGCCTGATCGGCGGCACCAACAAAAGGGCTCCAGGCGTGCCAGACAGATTCAGCGGCAGCATCCTTGGCAATAAGGCTGCCCTGACAATCACTGGAGCCCAGGCCGACGACGAGTCCGACTACTATTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTAGGTGAGTCCTTCCTCCTTTGTTATTGAATTC
配列番号60
シグナルペプチドを含むHuSP34 VL1のアミノ酸配列
MAWISLILSLLALSSGQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
配列番号61
NheI及びEcoRIサイトに挟まれたHuSP34 VL3遺伝子のヌクレオチド配列
GCTAGCGCCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTTCTCTGGCTCCCAGATACCACTGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGATCTAGCACAGGAGCCGTGACCACAAGCAACTATGCCAACTGGGTCCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGGGACTCATCGGAGGCACCAACAAAAGGGCTCCAGGAGTCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTCTGATTGGGGATAAAGCTACTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGAGGAGGCACCAAAGTCGAAATCAAACGTAAGTAGAATCCAAAGTGAATTC
配列番号62
シグナルペプチドを含むHuSP34 VL3のアミノ酸配列
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK
配列番号63
NheI及びEcoRIサイトに挟まれたHuSP34 VL4遺伝子のヌクレオチド配列
GCTAGCGCCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTTCTCTGGCTCCCAGATACCACTGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGATCTAGCACAGGAGCCGTGACCACAAGCAACTATGCCAACTGGGTCCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGGGACTCATCGGAGGCACCAACAAAAGGGCTCCAGGAATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTCTGAGCGGGACTGATGCTACTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGAGGAGGCACCAAAGTCGAAATCAAACGTAAGTAGAATCCAAAGTGAATTC
配列番号64
シグナルペプチドを含むHuSP34 VL4のアミノ酸配列
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGIPARFSGSLSGTDATLTISSLEPEDFAVYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK

Claims (27)

  1. ヒトCD3に特異的に結合する抗体であって、配列番号1に由来するCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む成熟重鎖可変領域、並びに、配列番号2に由来するCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む成熟軽鎖可変領域を含む、抗体。
  2. CDRH1、CDRH2及びCDRH3は、それぞれ配列番号43～45を含み、並びに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3は、それぞれ配列番号46～48を含む、請求項1に記載の抗体。
  3. マウス抗体である、請求項1に記載の抗体。
  4. キメラ化又はベニア化されている、請求項1に記載の抗体。
  5. ヒト化抗体であって、ヒト化成熟重鎖可変領域及びヒト化成熟軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体。
  6. 前記ヒト化成熟重鎖可変領域のKabatナンバリングによる位置30、49、93及び94は、それぞれN、A、V及びRによって占められる、請求項5に記載の抗体。
  7. 前記ヒト化成熟軽鎖可変領域の位置36、46、49、66及び71は、それぞれV、G、G、L及びAによって占められる、請求項6に記載の抗体。
  8. 前記成熟重鎖可変領域は、配列番号1を含むアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域は、配列番号2を含むアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗体。
  9. 前記成熟重鎖可変領域は、配列番号4を含むアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域は、配列番号6、17又は27のいずれかを含むアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗体。
  10. 前記成熟重鎖可変領域に融合した重鎖定常領域、及び、前記成熟軽鎖可変領域に融合した軽鎖定常領域をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体。
  11. 成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域の複数のペアを含む多重特異的抗体であって、そのペアの1つは、配列番号1に由来するCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む前記成熟重鎖可変領域、並びに、配列番号2に由来するCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む前記成熟軽鎖可変領域を含み、そのペアの他方は、標的抗原に結合する、請求項1～10のいずれか１項に記載の抗体。
  12. 成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域の2つのペアを含む二重特異的抗体であって、そのペアの1つは、配列番号1に由来するCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む前記成熟重鎖可変領域、並びに、配列番号2に由来するCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む前記成熟軽鎖可変領域を含み、そのペアの他方は、標的抗原に結合する、請求項1～10のいずれか１項に記載の抗体。
  13. 前記標的抗原は、がん関連抗原、免疫細胞抗原、又は病原体もしくは病原体感染細胞上の抗原である、請求項11又は12に記載の抗体。
  14. 前記成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域のペアの1つは、scFvであり、前記成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域のペアの他方は、前記成熟重鎖可変領域に連結された重鎖定常領域、及び、前記成熟軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域をさらに含む、請求項12又は13に記載の抗体。
  15. 配列番号1に由来するCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む前記成熟重鎖可変領域、並びに、配列番号2に由来するCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む前記成熟軽鎖可変領域は、scFvとして連結されており、前記ペアの他方の成熟重鎖可変領域及び成熟軽鎖可変領域は、それぞれ重鎖定常領域及び軽鎖定常領域に連結されている、請求項12又は13に記載の抗体。
  16. 前記scFvは、前記重鎖定常領域に連結されている、請求項15に記載の抗体。
  17. 前記scFvは、前記scFvの前記成熟軽鎖可変領域を介して前記重鎖定常領域に連結されている、請求項16に記載の抗体。
  18. 前記scFvは、配列番号31又は33を含む配列を有する、請求項17に記載の抗体。
  19. 前記scFvは、前記scFvの前記成熟重鎖可変領域を介して前記重鎖定常領域に連結されている、請求項16に記載の抗体。
  20. 前記scFvは、配列番号29を含む配列を有する、請求項19に記載の抗体。
  21. 前記scFvは、前記ペアの他方の成熟重鎖可変領域又は成熟軽鎖可変領域のN末端と連結されている、請求項15に記載の抗体。
  22. scFvの形態を有する、又はscFvを含み、前記scFvは、リンカーを介して前記成熟軽鎖可変領域に融合した前記成熟重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体。
  23. 配列番号29、31又は33のいずれかを含む配列を有する、請求項1に記載の抗体。
  24. 先行する請求項のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
  25. がんを治療するための方法であって、がんを有する患者に請求項11～23のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含み、前記標的抗原は、がん関連抗原である、方法。
  26. 免疫疾患を治療するための方法であって、前記免疫疾患を有する患者に請求項1～23のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
  27. 病原体感染を治療するための方法であって、前記標的抗原が前記病原体又は病原体感染細胞の抗原であるかにかかわらず、前記病原体に感染した患者に請求項11～23のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
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TWI841790B (zh) * 2019-09-30 2024-05-11 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 靶向cd3的抗體、雙特異性抗體及其用途

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