JP2653246B2

JP2653246B2 - 脂肪乳剤の製法

Info

Publication number: JP2653246B2
Application number: JP3517231A
Authority: JP
Inventors: 純造関; 博文山本; 周二山根; 豊高橋; 紘一牛丸
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1990-11-06
Filing date: 1991-11-05
Publication date: 1997-09-17
Anticipated expiration: 2012-09-17

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、アムホテリシンＢを含有する脂肪乳剤の製
造過程において、アムホテリシンＢの有効量を脂肪乳剤
中に含有させるための技術に関する。

背景技術アムホテリシンＢは、開発されてから約30年を経過し
た今日でも、全身投与をすることができ、確実な効果を
期待することができる重要な抗真菌剤として汎用されて
いる。しかしこの物質は、溶血毒性、腎毒性等の重篤な
副作用が発現する欠点を有していた。

近年、リン脂質等からなるリポソーム製剤、又は、単
純脂質をリン脂質で乳化する脂肪乳剤製剤とすること等
により上記のアムホテリシンＢの欠点は解消されつつあ
った。

アムホテリシンＢはこれらの脂質には容易に溶解しな
いことが判っていた。そこでこれらの製剤を製造する方
法にはこれまで、アムホテリシンＢ及び脂質をクロロ
ホルム、メタノール又はジメチルスルホキサイド等の溶
媒に添加して溶解均一化した後に溶媒を除去し水を加え
て乳化する方法、アムホテリシンＢをデオキシコール
酸ナトリウムとともにジメチルアセトアミド等の溶媒に
溶解させた後に脂肪乳剤中に加える方法、の二つがあっ
た。では有害な溶媒が残留する危険を払拭することが
できず、またではと同様の欠点に加え、合成界面活
性剤であり刺激性や溶血性を有するデオキシコール酸ナ
トリウムが必ず製剤中に含有される欠点があるほか、ア
ムホテリシンＢが脂肪乳剤の粒子中に完全には封入され
ないという大きな欠点を有していた。

特開平１−160915号公報にはアムホテリシンＢのリポ
ソーム製剤において、予めクロロホルム／メタノール混
液中でプロトン化したジステアロイルホスファチジルグ
リセロールとアムホテリシンＢの複合体を形成した後乾
燥する技術が開示されているが、これとても製造中に有
害な溶媒を使用しなければならずその残留に大きな問題
があった。

上記の事情に鑑み、アムホテリシンＢ含有脂肪乳剤を
製造するに際して、有害な物質を用いることなく安定で
均一な脂肪乳剤を取得することが、本発明の当初からの
目的であった。

発明の開示本発明者らは、鋭意検討を行った結果、以下に示す製
造方法により、上記目的を達成することができることを
見出した。

本発明の要旨の一つは、アムホテリシンＢを含有する
脂肪乳剤の製造過程において、アムホテリシンＢを非晶
質化して均質に脂質に分散させるに際して、酸及びエタ
ノールを使用するという単純な操作にある。

本発明の要旨の二つめは、アムホテリシンＢを含有す
る脂肪乳剤の製造過程において、アムホテリシンＢを非
晶質化して均質に脂質に分散させるに際して、アムホテ
リシンＢの結晶の存在が確認できなくなるまでこれらを
物理的に練合するという単純な操作にある。ここに脂質
とは、リン脂質及び複合脂質を含む概念である。

上記に要旨を記載した二つの発明は、それぞれ別異の
発明であるが、産業上の利用分野及び解決しようとする
課題が同一である。

第一の発明について説明する。

本発明者らは、アムホテリシンＢがエタノールに容易
には溶解しない事実を踏まえ、エタノールを塩酸等の酸
によって酸性にすることによりアムホテリシンＢが極め
て容易にエタノール中に溶解する事実を発見し、これに
基づいて本発明を完成させたものである。

アムホテリシンＢを脂肪乳剤構成成分中に完全に分散
させ微細乳化後も安定に脂肪乳剤粒子中に封入させるた
めには、アムホテリシンＢを非晶質化した状態で脂肪乳
剤構成成分に分散させることが必要であるが、本発明に
より製造したアムホテリシンＢ脂肪乳剤中では、アムホ
テリシンＢが非晶質化していることがＸ線回折等により
確認されている。

本発明においては、アムホテリシンＢをエタノール中
に溶解させる必要がある。

アムホテリシンＢの溶解に用いるエタノールの量及び
加える酸の量は、アムホテリシンＢが完全に溶解するた
めに必要な量以上であることが必要である。必要以上の
大量のエタノールを用いることは、後の除去操作が容易
でなくなるため好ましくない。一般的には、アムホテリ
シンB1gに対しエタノール200ml以上加えることが必要で
ある。好ましくは300〜800ml、より好ましくは400〜600
mlのエタノールがよい。

本発明においてアムホテリシンＢをエタノールに溶解
させるときには、一般的には、エタノール中にアムホテ
リシンＢの原末結晶をまず分散する。分散にあたって
は、超音波分散機又はポリトロンホモジナイザー等の分
散機を用いるのが好ましい。これにより、溶解に長時間
を要する大きな結晶状態のものでも、次の酸を加え溶解
する操作において、分解が生じるおそれを除くことがで
きる。

本発明においては、上記のようにアムホテリシンＢを
エタノール中に分散させた後、酸を加える。

本発明に適用する酸は特に限定されないが、例えば、
硫酸、硝酸、燐酸等の無機酸のほか、クエン酸、乳酸、
マレイン酸等の有機酸を挙げることができる。なかでも
塩酸が最も好ましい。

アムホテリシンＢは酸性で比較的不安定であるため、
必要以上の高濃度の酸を加えることも好ましくない。

加える酸の量は、アムホテリシンB1gに対して１〜100
ミリモル、好ましくは２〜20ミリモル、より好ましくは
４〜10ミリモルである。

本発明においては、予め酸性エタノールを作製し、こ
れにアムホテリシンＢの結晶を加えて溶解してもよい。

本発明においては、上記により作製したアムホテリシ
ンＢの酸性エタノール溶液にリン脂質又はリン脂質と単
純脂質の混合物等を加える。

添加するリン脂質又はリン脂質と単純脂質の混合物の
量は、目的とする脂肪乳剤の処方により定めることがで
きる。この場合には、処方量全量を添加しても良いし、
その一部を後に添加することもできる。

一般に、重量比でアムホテリシンＢの0.5倍量以上が
好ましい。より好ましくは、アムホテリシンＢの0.5倍
量以上５倍量以下を用いることができる。更に好ましく
は、１〜２倍量である。

あまり大量の脂質を添加すると後に行うエタノール除
去に長時間を必要とし、また、後の乾燥操作の後ペース
ト状を呈し取り扱いが困難となる。

これらの脂質は、アムホテリシンＢの酸性エタノール
溶液にそのまま添加することもできるが、予め脂質をエ
タノール又は酸性エタノール溶液に溶解して添加するこ
ともできる。

アムホテリシンＢは酸性では比較的不安定で分解しや
すいので、本発明においては、アムホテリシンＢの酸性
エタノール溶液を脂質と混合した後、なるべく早く酸を
中和することが好ましい。

中和に用いるアルカリは特に限定されない。例えば、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、トリ
エチルアミン等を用いることができる。水酸化ナトリウ
ムは、塩酸と中和した際に食塩となるから本発明の目的
には好ましい。

本発明においては、アムホテリシンＢを溶解させる操
作を低温中で行うことができる。アムホテリシンＢは酸
性で比較的不安定であるので、低温での操作によりアム
ホテリシンＢの分解を未然に防止することができる。こ
の目的のためには、できるだけ、例えば−80℃の低温下
に操作を行うことが好ましい。

本発明においては、中和した後、用いたエタノールを
除去するため凍結乾燥、噴霧乾燥等の通常の方法により
乾燥処理することができる。

これによりアムホテリシンＢが完全に非晶質化し、エ
タノールを実質的に含有しないものを得ることができ
る。

また、中和後析出するものを濾過又は遠心操作により
集めて乾燥することもできる。乾燥後、ペースト状を呈
して取り扱いが困難な場合には、予め賦形剤又は増量剤
を添加することもできる。

このような賦形剤又は増量剤の代表的な例として、塩
類、糖類、タンパク質、多糖類、その他の高分子を挙げ
ることができる。具体的には、食塩やグルコース、マル
トース、アルブミン、デキストラン等を挙げることがで
きる。

このような乾燥処理のほか、選択透過性膜（例えば、
逆浸透膜）を利用してエタノールを除去することもでき
る。

本発明の脂肪乳剤を製造するにあたっては、中和後、
水を添加してアムホテリシンＢと添加した脂質を共沈析
出させることができる。そして、水で洗浄することによ
り中和時に生成した食塩や残存する酸、アルカリも容易
に除去することができる。

得られたものは、乾燥することもでき、また湿潤状態
のまま他の脂肪乳剤構成脂質と混合することもできる。
更に、適当な孔径の選択透過性膜を用いるとエタノール
除去と同時に脱塩をすることができる。

以上のようにして得られた非晶質化されたアムホテリ
シンＢを含むリン脂質又はリン脂質と単純脂質の混合物
は、通常知られる乳化操作によって所望の添加物や水を
加えて乳化処理することができる。

上記の工程でエタノールを除去して乾燥後に得られた
非晶質化されたアムホテリシンＢを含有する脂質、又は
上記のようにして水添加により得られた共沈物は、後に
脂肪乳剤処方として加えられるべきリン脂質若しくは単
純脂質又はこれらの混合物等ときわめて容易に混合し均
質化することができる。この事実は、本発明の有用な効
果の一つである。

本発明に係る脂肪乳剤の製造においては、乳化処理中
に熱を加えるまでもなく脂質等が容易に混合し均質化す
るから、工程の簡素化のみならず、熱に不安定なアムホ
テリシンＢの分解を未然に防止することができる。

本発明においては、混合又は練合に用いる器具及び装
置は、特に限定されない。乳鉢やポリトロンホモジナイ
ザー等を用いても良いし、軟膏製造時等によく用いられ
る一般的な混合練合装置でもよい。

本発明においては、エタノール除去操作を行うことな
く所望の添加物又は水を加えて乳化することができる。
これは、エタノールが製剤処方中に処方されている場合
にきわめて有用である。

以下、本発明に係る第二の発明を詳述する。

本発明においては、アムホテリシンＢは、粉末状のも
のを使用することができる。

本発明においては、上記の粉末状のアムホテリシンＢ
を脂質とともに練合するに際して、例えば、これらを乳
鉢等の容器に入れ、これを棒で物理的に練ることができ
る。本発明の実施にあたっては、他の方法、例えば、工
業的に常用することができる練合機等を使用することが
できる。練合に用いる器具又は装置は特に限定されるこ
とがない。軟膏製造時等に通常よく用いられる機械は、
本発明の実施に適用することができる。

アムホテリシンＢを非晶質化して均質に脂質に分散さ
せるに際して一定の圧力を付加させながら十分に成分を
混合させることが、本発明の効果を生じさせるための必
要にして十分な要件であることが判っている。本発明者
らによって見出された本発明の要点は、練合に際しての
上記の操作以外のいかなるところにも存在しない。

本発明による練合は、十分に行うことにより目的を達
成することができるので、それ以上操作を行う必要はな
い。このような物理的練合は、操作を継続することによ
りアムホテリシンＢの非晶質化が次第に達成されてゆく
ことが判っているから、通常使用されるべき解析手段に
よってアムホテリシンＢが非晶質化することを確認する
まですることができる。従って、このように確認できた
時点が、本発明の練合操作の終点となる。

このような解析手段としては、例えば、Ｘ線回折、電
子顕微鏡又は熱示差分析等による確認を使用することが
できる。

本発明の練合操作によって、アムホテリシンＢを含有
する脂質を、液状又は半固形ペースト状の物質として取
得することができる。この際にはいかなる溶媒を加える
ことも必要ではない。

本発明の脂肪乳剤の製造においては、上記の練合操作
の後、通常脂肪乳剤を製する際に行うべき操作を行うこ
とができる。例えば、上記のアムホテリシンＢを含有す
る脂質に、更に脂肪乳剤の構成成分であるリン脂質又は
単純脂質を加えて混合する。

本発明の脂肪乳剤の製造においては、その後所望量の
水を加えて、一般的な粗分散処理に続いて細乳化処理を
行うことができる。これによって均質化した安定なアム
ホテリシンＢ含有脂肪乳剤を取得することができる。

本発明においては、添加する脂質の量及びその温度
が、混合物の粘度に影響を与えることが判っている。単
純脂質は、アムホテリシンＢの量の対して、少なくとも
２倍量（重量比）以上が望ましい。これにより、アムホ
テリシンＢの結晶が容易に単純脂質中に分散し、混合効
率を高めることができる。リン脂質は、アムホテリシン
Ｂの量に対して、少なくとも0.5倍量以上であることが
望ましい。それ以下であると均一な混合が困難である。
リン脂質の量は、1.0倍以上であると更に望ましい。

本発明においては、単純脂質とリン脂質の混合系を用
いることができる。リン脂質のみで混合する場合には、
操作時に加温することが望ましい。

本発明においてアムホテリシンＢを脂質中に練合する
に際しては、70℃以下で行うことが望ましい。これ以上
ではアムホテリシンＢが不安定となる。また10℃以下の
低温においては粘度が増すために本発明の実施には適切
ではない。

本発明においては、有機溶媒や合成界面活性剤等を全
く使用することなく目的を達成することができるから、
その残留することによる医薬品としての不利益をすべて
解消することができる。

本発明においては、アムホテリシンＢを予め脂肪乳剤
構成成分中に均質に混合することができるから、細乳化
後もアムホテリシンＢが安定に脂肪乳剤粒子中に封入さ
れることとなる。

本発明においては、物理的に練合する際に、適当量の
酸を加えることができる。酸の添加により、アムホテリ
シンＢの均質化が著しく促進されることが判っている。
酸を用いた場合は、練合の後に、酸を中和するのに必要
な量のアルカリを加える（最終pHは４〜８が好まし
い）。

本発明に適応する酸は特に限定を受けない。例えば、
塩酸、硫酸、硝酸、燐酸等の無機酸のほか、クエン酸、
乳酸、マレイン酸等の有機酸を挙げることができる。特
に、塩酸が好ましい。また、後の中和に用いるアルカリ
としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニア、トリエチルアミン等を挙げることができる。塩酸
を中和した際に食塩となるので、水酸化ナトリウムが好
ましい。

塩酸を用いた場合は、少量でよく、一般に２〜６モル
／濃度の希塩酸を添加するのが好ましい。あまり希薄
な酸を大量に加えると水が遊離し、練合が困難となる。
また、濃い酸を加え、必要以上に酸度が上昇するとアム
ホテリシンＢの安定性上好ましくない。塩酸の総添加量
はアムホテリシンＢ量や大豆油量、リン脂質量により大
きく異なるが、一般に練合物1gに対し10ミリモル以下で
よい。

このように酸の添加は均質化を促進する効果を有する
が、本発明の主たる効果である溶媒を用いることなくア
ムホテリシンＢの脂質への均質化を達成するという目的
のためには必須ではない。

本発明に係る第一の発明においても第二の発明におい
ても、リン脂質、単純脂質を使用して脂肪乳剤を製造す
る。

本発明で使用されるリン脂質としては、例えば、卵
黄、大豆、牛、豚等由来のリン脂質又は、純若しくは半
合成的に得られるリン脂質を挙げることができる。例え
ば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノール
アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシ
トール、ホスファチジルグリセロール等である。具体的
には、卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジル
コリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリ
ストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスフ
ァチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、
ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミ
トイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホ
スファチジルグリセロール等を挙げることができる。そ
れらの水素添加物も用いることができる。なかでも好ま
しい代表例として、精製卵黄レシチンを挙げることがで
きる。

本発明に使用される単純脂質としては、例えば、精製
大豆油、綿実油、菜種油、胡麻油、コーン油、落花生
油、サフラワー油、トリオレイン、トリリノレイン、ト
リパルミチン、トリステアリン、トリミリスチン、トリ
アラキドニン等の中性脂質を挙げることができる。ま
た、コレステリルオレート、コレステリルリノレート、
コレステリルミリステート、コレステリルパルミテー
ト、コレステリルアラキデート等のステロール誘導体も
挙げることができる。代表的な例としては、精製大豆油
を挙げることができる。

また、脂肪乳剤粒子に表面荷電を賦与するためにステ
アリルアミン、ジセチルホスフェート、ホスファチジン
酸、ホスファチジルグリセロール等の荷電を有する脂質
を用いることができる。

本発明のアムホテリシンＢ含有脂肪乳剤にあたって
は、従来から行われてきた種々の脂肪乳剤製造法をその
まま応用することができる。例えば、ホモミキサー等に
より粗乳化をおこなった後、マントン−ガウリン型等の
加圧噴射式ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、
超音波ホモジナイザー等により充分に微細化して形成せ
しめる方法が一般的である。この時、一般に知られる乳
化補助剤又は安定化剤として生理的に受け入れられるス
テロール類、脂肪酸又はそれらの誘導体等を加えること
もできる。これらの代表例としては、コレステロールや
オレイン酸等の脂肪酸等を挙げることができる。

本発明の製造方法を用いた脂肪乳剤の形状や粒子径
は、電子顕微鏡、光散乱方式の粒子径分析装置、メンブ
レンフィルターによる濾過等により容易に確認すること
ができる。

本発明の脂肪乳剤の製剤の任意の成分として、一般に
注射剤に用いられる添加剤及び補助物質などを挙げるこ
とができる。例えば、酸化防止剤、防腐剤、安定化剤、
等張化剤、緩衝剤等を挙げることができる。これらの添
加剤、補助物質等の要求量及び最適量は、その目的に応
じて変化させることができる。

上記のようにして得られるアムホテリシンＢ含有脂肪
乳剤は、必要に応じて滅菌（例えば濾過滅菌や高圧蒸気
滅菌等）し、窒素ガスと共にアンプル中に封入すること
ができる。又、必要に応じて凍結乾燥することができ
る。凍結乾燥させたアムホテリシンＢ含有脂肪乳剤は、
常法通り適当な溶液の添加によって復元することができ
る。

本発明により製造されたアムホテリシンＢ含有脂肪乳
剤よりなる製剤は、真菌感染症やウイルス感染症等の治
療又は予防を目的としてヒト又は種々の動物の静脈内に
投与するのが一般的である。この場合、脂肪乳剤粒子の
粒子径等の管理を十分に行う必要がある。一般に１μｍ
以上の粒子が混在すると、毛細血管を塞栓するなど種々
の毒性発現が知られているからである。

本発明の脂肪乳剤は、必要に応じて従来品同様、動脈
内、筋肉内、髄腔内及び皮下等に注射剤として投与する
こともできる。また、点眼剤、点鼻剤、経口投与剤、吸
入剤、膀胱注入剤、外用剤又は坐剤等としても製剤化し
使用することができる。この場合においても、医薬上許
容される基剤、賦形剤等の添加剤を任意の成分として挙
げることができる。

本発明により製造されたアムホテリシンＢ含有脂肪乳
剤よりなる製剤の投与量は、投与ルート、剤形、症状、
目的によって異なるが、脂肪乳剤として一般に、１〜10
00ml/回である。また、アムホテリシンＢとしての投与
量は、成人に対して一般に１〜200mg/回である。

本発明の脂肪乳剤は、必要に応じて凍結乾燥すること
により貯蔵に適する凍結乾燥製剤とすることができる。
このような凍結乾燥製剤の製法もまた本発明の技術的範
囲に含まれる。

発明を実施するための最良の形態以下に本発明に係る脂肪乳剤の製造方法に関する実施
例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１氷冷下において、アムホテリシンＢの原末結晶500mg
に対し、エタノール250mlを加え超音波ホモジナイザー
を用いて分散する。これに2N塩酸1.5mlを加え超音波ホ
モジナイザーを用いて溶解する。これとは別に室温にお
いて精製卵黄レシチン500mgに対し、エタノール50mlを
加え、超音波ホモジナイザーを用いて分散する。これに
2N塩酸1.0mlを加え超音波ホモジナイザーを用いて溶解
する。これを氷冷したのち、上記のアムホテリシンＢ酸
性エタノール溶液と充分混合し2N水酸化ナトリウム約2.
5mlを加えてpH7.0に調製する。

これを減圧下濃縮したのち、水50mlを加えてさらに減
圧下で濃縮する。共沈物を遠心で集めて水で繰り返し洗
浄した後凍結乾燥した。粉末Ｘ線回折測定の結果、得ら
れた乾燥物中でアムホテリシンＢは完全に非晶質化され
ていることが確認された。

このアムホテリシンＢを含有する凍結乾燥物6mgに、
精製大豆油0.5gおよび精製卵黄レシチン0.497gを加えて
混練し均質化する。これに、等張リン酸緩衝液を8ml加
えホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。等張リン酸
緩衝液を加えて10mlに定容した後、氷冷下、超音波ホモ
ジナイザー（ブランソンモデル185）で60分間乳化し
極めて微細なアムホテリシンＢを含有する脂肪乳剤を得
た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥製剤を得た。

実施例２氷冷下において、アムホテリシンＢの原末結晶100mg
に対し、エタノール50mlを加えポリトロンホモジナイザ
ーを用いて分散する。これに2N塩酸0.3mlを加えポリト
ロンホモジナイザーを用いて溶解する。これとは別に室
温において精製卵黄レシチン500mgに対し、エタノール5
0mlを加え、ポリトロンホモジナイザーを用いて分散す
る。これに2N塩酸0.2mlを加え超音波ホモジナイザーを
用いて溶解する。これを氷冷したのち、上記のアムホテ
リシンＢ酸性エタノール溶液と充分混合し2N水酸化ナト
リウム約0.5mlを加えてpH7.0に調製する。

これを減圧下濃縮した後、水50mlを加えてさらに減圧
下で濃縮する。共沈物を遠心で集めて水で繰り返し洗浄
した後マルトース5gを加えて凍結乾燥した。粉末Ｘ線回
折測定の結果、得られた乾燥物中でアムホテリシンＢは
完全に非晶質化されていることが確認された。

アムホテリシンB30mgに対応する量の上記で得られた
凍結乾燥物に、精製大豆油0.6g及び精製卵黄レシチン0.
47gを加えて混練し、これに、0.24Mグリセリン水溶液8m
lを加えホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。そし
て、0.24Mグリセリン水溶液を加えて10mlに定容した
後、氷冷下、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデ
ル185）で60分間乳化し極めて微細なアムホテリシンＢ
を含有する脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し
凍結乾燥品を得た。

実施例３氷冷下において、アムホテリシンＢの原末結晶10gに
対し、エタノール20を加えポリトロンホモジナイザー
を用いて分散する。これにクエン酸18.5mgを加えポリト
ロンホモジナイザーを用いて溶解する。これとは別に室
温において精製卵黄レシチン30g及び精製大豆油3gをエ
タノール10にポリトロンホモジナイザーを用いて溶解
する。これを氷冷したのち、上記のアムホテリシンＢ酸
性エタノール溶液と充分混合し2N水酸化ナトリウムを加
えてpH7.0に調製する。

これを減圧下濃縮した後、共沈物を濾過で集めて水で
繰り返し洗浄した後自然乾燥した。粉末Ｘ線回折測定の
結果、得られた乾燥物中でアムホテリシンＢは完全に非
晶質化されていることが確認された。

アムホテリシンB2gに対応する量の上記で得られた乾
燥物に、精製大豆油20g及び精製卵黄レシチン30gを約60
℃で加温混合し、これに、0.24Mグリセリン水溶液を100
ml加えホモミキサーで撹拌し粗乳化液とする。粗乳化液
を水酸化ナトリウムで中和後、マイクロフルダイザーに
より高圧乳化し、きわめて微細なアムホテリシンＢを含
有する脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結
乾燥品を得た。

実施例４実施例３で濾過後に得られた湿潤状態の共沈物10mg
に、コレステリルオレート0.5g及び精製卵黄レシチン0.
5gを加え混合する。これに、0.24Mグリセリン水溶液8ml
を加えホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。粗乳化
液を水酸化ナトリウムで中和後、0.24Mグリセリン水溶
液を加えて10mlに定容した後、超音波ホモジナイザー
（ブランソンモデル185）で60分間乳化し極めて微細
なアムホテリシンＢを含有する脂肪乳剤を得た。また常
法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例５氷冷下において、アムホテリシンＢの原末結晶500mg
に対し、エタノール250mlを加え超音波ホモジナイザー
を用いて分散する。これに2N塩酸1.5mlを加え超音波ホ
モジナイザーを用いて溶解する。これとは別に室温にお
いてジパルミトイルホスファチジルグリセロール500mg
に対し、エタノール50mlを加え、超音波ホモジナイザー
を用いて分散する。これに2N塩酸1.0mlを加え超音波ホ
モジナイザーを用いて溶解する。これを氷冷した後、上
記のアムホテリシンＢ酸性エタノール溶液と充分混合し
2N水酸化ナトリウム約2.5mlを加えてpH7.0に調製する。

これを逆浸透膜を用いて濃縮した後、精製大豆油5g及
び精製卵黄レシチン4gを加えさらに混合練合する。これ
に、10％マルトース水溶液80mlを加えホモジナイザーで
撹拌し粗乳化液とする。そして、10％マルトース水溶液
を加えて100mlに定容した後、超音波ホモジナイザー
（ブランソンモデル185）で60分間乳化し極めて微細
なアムホテリシンＢを含有する脂肪乳剤を得た。また常
法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例６氷冷下において、アムホテリシンＢの原末結晶500mg
に対し、エタノール250mlを加え超音波ホモジナイザー
を用いて分散する。これに2N塩酸2.5mlを加え超音波ホ
モジナイザーを用いて溶解する。これに精製卵黄レシチ
ン500mgを加え、超音波ホモジナイザーを用いて充分に
溶解した後、2N水酸化ナトリウム約2.5mlを加えてpH7.0
に調製する。

これを減圧下濃縮した後、水50mlを加えてさらに減圧
下で濃縮する。共沈物を遠心で集めて水で繰り返し洗浄
した後凍結乾燥した。粉末Ｘ線回折測定の結果、得られ
た乾燥物中でアムホテリシンＢは完全に非晶質化されて
いることが確認された。

得られた乾燥物（アムホテリシンB3mgに対応する量）
及び精製卵黄レシチン0.4gを乳鉢にとり混合練合した。
これに、精製大豆油0.5g及び９％ラクトース水溶液8ml
を加えホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。そし
て、９％ラクトース水溶液を加えて10mlに定容した後、
超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル185）で60
分間乳化し極めて微細なアムホテリシンＢを含有する脂
肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を
得た。

実施例７実施例２で得られた乾燥物170mg、精製大豆油0.5g及
び水素添加卵黄レシチン0.4g、コレステロール0.1gを乳
鉢にとり混合練合する。これに、９％ラクトース水溶液
8mlを加えホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。そ
して、９％ラクトース水溶液を加えて10mlに定容した
後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル185）
で60分間乳化し極めて微細なアムホテリシンＢを含有す
る脂肪乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥
品を得た。

試験例1:粒子径の測定実施例１〜７で得られたアムホテリシンＢを含有する
脂肪乳剤の脂肪乳剤粒子の粒子径について、レーザー光
による動的光散乱粒子径測定装置を用いその粒子径につ
いて評価したところ、下記の結果を得た。また、いずれ
も１μｍ以上の粒子を含まなかった。実施例番号平均粒子径実施例番号平均粒子径１ 47nm ５ 47nm ２ 70nm ６ 45nm ３ 23nm ７ 61nm ４ 52nm 実施例８アムホテリシンＢの結晶3gに精製卵黄レシチン3gを加
えメノウ乳鉢を用い10分間充分に混合練合した。粉末Ｘ
線回折測定の結果、得られた混練物中でアムホテリシン
Ｂは完全に非晶質化されていることが確認された。この
アムホテリシンＢを含有する混練物6mgに、精製大豆油
0.5g及び精製卵黄レシチン0.497gを加えて、更に混練し
均質化する。これに、等張リン酸緩衝液を8ml加えホモ
ジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。そして、等張リン
酸緩衝液を加えて10mlに定容した後、氷冷下、超音波ホ
モジナイザー（ブランソンモデル185）で60分間乳化
し極めて微細なアムホテリシンＢを含有する乳剤を得
た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例９アムホテリシンＢの結晶0.1gに精製卵黄レシチン0.1g
を加えメノウ乳鉢を用い予備的に混合練合する。これに
2N塩酸0.5mlを加え直ちに混合練合した。粉末Ｘ線回折
測定の結果、得られた混練物中でアムホテリシンＢは完
全に非晶質化されていることが確認された。アムホテリ
シンB30mgに対応する量の上記で得られた混練物に、精
製大豆油0.6g及び精製卵黄レシチン0.47gを加えて混練
し、これに、0.24Mグリセリン水溶液8mlを加えホモジナ
イザーで撹拌し粗乳化液とする。そして、2N水酸化ナト
リウム0.5mlを加えて中和した後、0.24Mグリセリン水溶
液を加えて10mlに定容した後、氷冷下、超音波ホモジナ
イザー（ブランソンモデル185）で60分間乳化し極め
て微細なアムホテリシンＢを含有する乳剤を得た。また
常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例10 アムホテリシンＢの結晶10gに精製卵黄レシチン15gを
加え乳鉢を用い予備的に混合練合する。これに6N塩酸20
mlを加え直ちにポリトロンホモジナイザーを用いて混合
練合した。粉末Ｘ線回折測定の結果、得られた混練物中
でアムホテリシンＢは完全に非晶質化されていることが
確認された。アムホテリシンB2gに対応する量の上記で
得られた混練物に、精製大豆油20g及び精製卵黄レシチ
ン30gを約60℃で加温混合し、これに、0.24Mグリセリン
水溶液を100ml加えホモミキサーで撹拌し粗乳化液とす
る。粗乳化液を水酸化ナトリウムで中和後、マイクロフ
ルイダイザーにより高圧乳化し、きわめて微細なアムホ
テリシンＢを含有する乳剤を得た。また常法に従い凍結
乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例11 実施例10で得られた混練物4mgに、コレステリルオレ
ート0.5g及び精製卵黄レシチン0.5gを加え混合する。こ
れに0.24Mグリセリン水溶液8mlを加えホモジナイザーで
撹拌し粗乳化液とする。粗乳化液を水酸化ナトリウムで
中和後、0.24Mグリセリン水溶液を加えて10mlに定容し
た後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル18
5）で60分間乳化し極めて微細なアムホテリシンＢを含
有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥
品を得た。

実施例12 アムホテリシンＢの結晶3mgに精製大豆油20mgを加え
メノウ乳鉢で約10分間充分に混合練合し均質化する。こ
れに精製大豆油0.5g及び精製卵黄レシチン0.4g、ジミリ
ストイルホスファチジルグリセロール0.1gを加えさらに
混合練合する。これに、10％マルトース水溶液8mlを加
えホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。そして、10
％マルトース水溶液を加えて10mlに定容した後、超音波
ホモジナイザー（ブランソンモデル185）で60分間乳
化し極めて微細なアムホテリシンＢを含有する乳剤を得
た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例13 アムホテリシンB3mg、精製大豆油0.5g及び水素添加卵
黄レシチン0.4g、コレステロール0.1gを乳鉢にとり、約
20分間充分に混合練合した。粉末Ｘ線回折測定の結果、
得られた混練物中でアムホテリシンＢは完全に非晶質化
されていることが確認された。これに、９％ラクトース
水溶液8mlを加えホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とす
る。そして、９％ラクトース水溶液を加えて100mlに定
容した後、超音波ホモジナイザー（ブランソンモデル
185）で60分間乳化し極めて微細なアムホテリシンＢを
含有する乳剤を得た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾
燥品を得た。

実施例14 アムホテリシンＢの結晶300mgに精製大豆油20mgを加
え真空らいかい器で約10分間充分に混合練合し均質化す
る。これに精製大豆油50g及び精製卵黄レシチン40g、ジ
ミリストイルホスファチジルグリセロール1gを加えさら
に混合練合する。これに、10％マルトース水溶液800ml
を加えホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。そし
て、10％マルトース水溶液を加えて1000mlに定容した
後、圧力式ホモジナイザー（日本精機製）で60分間乳化
し極めて微細なアムホテリシンＢを含有する乳剤を得
た。また常法に従い凍結乾燥し凍結乾燥品を得た。

実施例15 アムホテリシンＢの結晶3mgにジミリストイルホスフ
ァチジルグリセロール0.1gを加え、これに2N塩酸0.1ml
を加えてメノウ乳鉢で混合練合し均質化する。これに精
製大豆油0.5g及び精製卵黄レシチン0.4gを加えさらに混
合練合する。これに、10％マルトース水溶液8mlを加え
ホモジナイザーで撹拌し粗乳化液とする。そして、2N水
酸化ナトリウムで中和した後、10％マルトース水溶液を
加えて10mlに定容し、超音波ホモジナイザー（ブランソ
ンモデル185）で60分間乳化して極めて微細なアムホ
テリシンＢを含有する乳剤を得た。また常法に従い凍結
乾燥し凍結乾燥品を得た。

試験例2:粒子径の測定実施例８〜15で得られたアムホテリシンＢを含有する
脂肪乳剤の乳剤粒子の粒子径について、レーザー光によ
る動的光散乱粒子径測定装置を用いその粒子径について
評価したところ、下記の結果を得た。また、いずれも１
μｍ以上の粒子を含まなかった。実施例番号平均粒子径実施例番号平均粒子径８ 45nm 12 48nm ９ 93nm 13 31nm 10 20nm 14 52nm 11 55nm 15 48nm

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き審査官田村聖子 (56)参考文献特開平３−169808（ＪＰ，Ａ) 特表平２−502460（ＪＰ，Ａ) 欧州公開391369（ＥＰ，Ａ１)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】単純脂質を必須の核成分とし、リン脂質を
必須の表層成分とする乳剤粒子から構成され、かつアム
ホテリシンＢを含有する非リポソーム性脂肪乳剤を製造
する過程において、アムホテリシンＢを非晶質化して脂
質に分散させるに際して、アムホテリシンＢの結晶の存
在が確認できなくなるまでアムホテリシンＢとリン脂質
又はアムホテリシンＢとリン脂質と単純脂質とを物理的
に練合することを特徴とするアムホテリシンＢ含有非リ
ポソーム性脂肪乳剤の製造方法。
【請求項２】物理的に練合するに際して酸を加え、練合
の後アルカリで中和することを特徴とする請求項１記載
のアムホテリシンＢ含有非リポソーム性脂肪乳剤の製造
方法。
【請求項３】単純脂質が中性脂質又はステロール誘導体
であり、リン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスフ
ァチジルイノシトール又はホスファチジルグリセロール
である請求項１又は２記載のアムホテリシンＢ含有非リ
ポソーム性脂肪乳剤の製造方法。
【請求項４】単純脂質が精製大豆油、綿実油、菜種油、
胡麻油、コーン油、落花生油、サフラワー油、トリオレ
イン、トリリノレイン、トリパルミチン、トリステアリ
ン、トリミリスチン、トリアラキドニン、コレステリル
オレート、コレステリルリノレート、コレステリルミリ
ステート、コレステリルパルミテート又はコレステリル
アラキデートであり、リン脂質が卵黄ホスファチジルコ
リン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホス
ファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリ
ン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイ
ルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジ
ルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセ
ロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール若
しくは精製卵黄レシチン又はこれらの水素添加物である
請求項１又は２記載のアムホテリシンＢ含有非リポソー
ム性脂肪乳剤の製造方法。
【請求項５】酸が塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、クエン酸、
乳酸又はマレイン酸であり、アルカリが水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、アンモニア又はトリエチルアミン
である請求項２乃至４記載のアムホテリシンＢ含有非リ
ポソーム性脂肪乳剤の製造方法。