JP2714068B2

JP2714068B2 - 遺伝子操作による百日ぜきトキシンの無毒化

Info

Publication number: JP2714068B2
Application number: JP63297152A
Authority: JP
Inventors: ヘンリイクレインマイケル; アンヌボーヒーター; アンソニーコックルステファン; メイルースモアシーナ; ローズジーレイギャビン
Original assignee: コノートラボラトリイズリミテツド
Priority date: 1987-11-24
Filing date: 1988-11-24
Publication date: 1998-02-16
Anticipated expiration: 2013-02-16
Also published as: EP0322115B1; DE3855072D1; JPH022383A; ATE135043T1; EP0322115A3; GR3019238T3; EP0322115A2; ES2088778T3; GB8727489D0; CA1341591C; DE3855072T2; DE3855072T3; EP0688868A1; EP0322115B2; US5085862A; ES2088778T5

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明は、百日ぜきトキシンの生物学的な毒性に不
可欠な一種以上のアミノ酸残基をコードするDNAの遺伝
子操作を利用した百日ぜきトキシンの無毒化のための新
規な方法に関する。更に、本発明は無毒化された百日ぜ
きトキシンを生産する生物学的に変異させられた百日ぜ
き菌（ボルデテラ・ペルツシス：Bordetella pertussi
s）を得るための手順にも関する。

［従来の技術］百日ぜき（Whooping coughまたはpertussis）は、病
原体である百日ぜき菌の感染による幼児や若年児童に発
生する激しく、高度に伝染性の呼吸器系の病気である。

この病原体にかかわる病毒性は多くの因子に起因して
おり、この病気の発病機構はまだ充分に解明されていな
い。

しかしながら、主要な全身的症状は百日ぜきトキシン
（PT）に原因していると一般に認識されている。

この物質はリンパ球増多因子、ヒスタミン感作因子、
および小島（アイリット）活性化蛋白質などの別名で呼
ばれており、広範囲の生物学的な活性を示す。

これらの作用の多くは、PTのアデノシンジホスフェー
ト（ADP）−リボシルトランスフェラーゼとしての生物
学的作用に関連している。

ある手段の受容体、例えばグアノシン・トリホスフェ
ート結合蛋白質のADPリボシル化は、サイクリックAMP
（環状アデノシン・モノホスフェート）や、ホスホリパ
ーゼＣにより媒介される種々の代謝経路上のコントロー
ルの喪失を招く。

蛋白質受容体の不在下では、百日ぜきトキシン（PT）
はニコチン酸アミドアデニン・ジヌクレオチドの加水分
解にも触媒作用（NADグリコハイドロラーゼ活性）を及
ぼす。

従来の殺菌全細胞（Killed whole−cell）百日ぜきワ
クチンは多種の抗原群の混合物であり、特異的な防御抗
原を含む限定された無栽培ワクチン（acellular raccin
e）の開発に対し大きな役割を果たした。

そのなかでPTは最も重要な防御抗原である。考慮下の
他の抗原は凝集原類と糸状赤血球凝集素（FHA）であ
る。

［発明が解決しようとする課題］通常、上述のPTと他の抗原は、ホルムアルデヒド、グ
ルタールアルデヒド、過酸化水素などのような薬品を使
用して化学的に不活性化あるいは変性毒性化される。

この方法においては、化学的修飾が過多であったり、
過小であったりしないような微少なバランスの探索が必
要であるという重大な不利益を有している。

処理が不充分であれば、RT等において病毒性因子とな
る小部分が未変化のまま残存し、それを含むワクチンは
残留毒性を保持し得る。

処理が過剰であれば、その本来の免疫原決定基はマス
クを掛けられるか、破壊され、その結果それを含むワク
チンは効能を喪失する。

PTの場合には、触媒作用を有するサブユニットがアル
デヒド類により不活性化されることが比較的に困難であ
るから、この問題は特に重大である。

百日ぜきワクチンにおいて残留毒性の可能性、あるい
は変性毒素化された全細胞百日ぜきワクチンの反転（変
性前への復帰）は多年問題視されてきたし、稀少ケース
においては、このようなワクチンが神経学的損傷の原因
となり得るのではないかと示唆されている。

現在、使用されているか、試用段階にある全ての百日
ぜき用ワクチンは、以上述べた問題を起こす化学的手段
による抗原の不活性化に依存している。

もし、科学的変性毒素化法を用いずに免疫原的・防御
的エピトープの本来の構造を保存した不活性化ワクチン
が設計されるならば、安全性と効力が更に増加されるこ
とは明らかである。

これらの理由により、発明者らはPtTOXをコードする
遺伝子の組換えを行ない、毒性のないPTのアナログとし
てのPT変異体を分泌する百日ぜき菌株を構築した。

構造的に、PTはADP−リボシルトランスフェラーゼ作
用を有する細菌性トキシンに属し、これにはジフテリア
トキシン、シュードモナス・アエノギノサ（Pseuclomon
as aeruginosa）のエクソトキシンＡ、コレラトキシ
ン、および大腸菌の非耐熱性トキシンが含まれている。

従って、PTは二つの機能的な部分、すなわちその一つ
としての酵素的活性を有するＡ部分と、他の部分として
のホスト細胞に結合してその活動位置へのＡ部分の転移
を導くＢ部分とを有する。

PT中において、Ａ部分は独立したサブユニットであ
り、通常S1と表示される。

Ｂ部分は二つのダイマーとしてアレンジされた五つの
ポリペプタイドの電子対非共有オリゴマーであり、一つ
のダイマーはサブユニットS2＋S4を有し、他のダイマー
はサブユニットS3＋S4を有し、これらのダイマーは結合
サブユニットS5に支持されている。

S1サブユニットのアミノ酸配列は興味深い多くの特長
を表わしている。

S1中には一つの連鎖内ジスルフィド結合を形成し得る
システイン残基が二つしか存在しない。

しかしながら、これら残基の重要性が示され、酵素活
性のためにその毒素は減少させられるべきであることが
知られている［モス（Moss）ら、J.Biol.Chem.258,1187
2,（1983）］。

S1の中に二つのトリプトファンがあり、ジフテリアト
キシンとＰ．aeruginosa エクソトキシンＡのNAD結合
位置にトリプトファン残基が近接していることが示唆さ
れた。

S1中にも保持された二つの部分が、コレラトキシンと
大腸菌非耐熱性トキシンのアミノ酸配列中にも発見され
た［ロホト（Locht）とカイス（keith）、Science,232,
1258（1986）］。

更に加えて、ジフテリアトキシンとＰ．aeruginosaエ
クソトキシンＡのNAD活性部位は、グルタミン酸残基を
含むことが示された（キャロル（Carrol）とコリエール
（Collier）、Proc.Nat.Acad.Sic.,U.S.A.,81,3307,（1
984）;J.Biol.Chem.,262,8707,（1987）］。

上述したように、PTのＢ部分は、PTの受容細胞への結
合を媒介し、二つのダイマーを含む。

これらのダイマーの各々が結合部位を有しているか否
かは論争上にある。

しかしながら、S2とS3サブユニットは、アミノ酸配列
において類似であり、この結合に関する研究は、特にS3
のリジンおよび／もしくはチロシン残基がトキシンとそ
のリセプターとの相互作用に関与していることを示して
いる［ノギモリら、Biochem.,25,1355（1986）；アーム
ストロング（Armstrong）とペップラー（Peppler）、In
fect.Immun.,55,1294,（1987）］。

NADとの相互作用に係るグルタミン酸残基におけるジ
フテリアトキシンとＰ．aeruginosaエクソトキシンＡの
部位特定突然変異は、ADP−リボシルトラスファーゼ活
性の大きな減少を導びいた。［テーテン（Tweten）ら,
J.Biol.Chem.,260,10392,（1984），ダグラス（Dougla
s）、コリアー（Collier）,J.Bacteriol.,169,4967,（1
987）］。

S1およびS2の端部領域を完全に欠く形のものが大腸菌
で発現されている［ロッホ（Locht）ら,Infect.Immun.,
55,2546（1987）］。トランスポゾンの挿入、遺伝子の
端部領域の切断またはリンカー挿入により得たTOXのオ
ペロンの突然変異体は、対立遺伝子の交換により、百日
ぜき菌の染色体に導入された［ブラック（Black）ら、A
nn.Sclavo,175d,（1986）；ブラック（Black）とファル
コウ（Falkow）,Infect.Immun.,55,2465,（1987）］。
しかしながら、活性アミノ酸残基の部位特定突然変異誘
発により特異的に無毒化された十分に組立てられた組換
えホロトキシンの生物学的及び免疫防御的な特性は、報
告されていない。安全で有効な百日ぜき用ワクチンの成
分として有用なPTのアナログとしてのPT変異体の産生が
この発明の主題である。

防御ワクチンへの利用のための各種物質の有効性と毒
性に対する試験として、有用な多くのinvivoおよびin v
itroでの試験がある。効力の標準試験はマウスプロテク
ションテスト（mouseprotection test）であり、生きた
百日ぜき菌による大脳内チャレンジテストを含んでい
る。最近では防御抗体の生成を測定することでワクチン
をテストしている。通常の毒性試験はCHO（チャイニー
ズハムスターの卵巣）細胞のクラスタリングアッセイ
（Clustering assay）によるものであり、これはADP−
リボシルトランスファーゼ活性とトキシンの結合能力の
両方を反映する［バーン（Burn）ら、Infect.Immun.,5
5,24（1987）］。PTの酵素活性を直接試験する方法は、
ウシトランスデューシン（trasducin）のADP−リボシル
化反応を利用するものである［ウォルキンス（Walkin
s）ら、J.Biol.Chem.,260,13478,（1985）］。

［課題を解決するための手段］本発明によれば、PTの無毒化のための新規な方法が提
供される。更に、本発明により従来技術の化学的方法の
欠点を悩むことなく、好ましくない副作用を有すること
なしにその免疫特性を保持した無毒化されたPTが提供さ
れる。本発明に係る知見において、トキシン中の機能し
得るトキシン活性に大きく関与するアミノ酸残基が、確
定された。更に、分離された百日ぜきトキシン遺伝子の
部位特定突然変異誘発によりこれら残基は除去あるいは
交換される。このような操作から得られる突然変異した
百日ぜきトキシンオペロンは次に生体内の本来の天然遺
伝子と置換され、普通の生育条件下でこのトキシンの無
毒化された類似体（PT変異体）をそれにより生ずる。本
発明の方法において、PTのアナログとしてのPT変異体の
PTに対する三次元構造及び免疫原性の変化は最小限にお
さえられている。好適なトキシンの変異形態は、変異部
分以外の構成要素に殺菌の感染自体に対する耐性を得る
ために必要な特性が更に要求されるかもしれないが、そ
れ自体百日ぜきのきびしい症状に対して十分な防御性を
与え得る。

本発明により、百日ぜきトキシンの遺伝子的に無毒化
された免疫的防御のための変異体が提供される。ここで
用いられている「遺伝子的に無毒化された変異体」とい
う言葉は、本来の毒性の約１％またはそれ未満、好まし
くは約0.5％未満の残存毒性をもつ百日ぜきトキシン変
異体（PT変異体）を意味する。残存毒性はCHO細胞のク
ラスタリングアッセイおよびADP−リボシルトランス
ファーゼの活性の測定により検出される。

更に、本発明により免疫的防御性を有する百日ぜきト
キシン変異体またはそのイキソイドと生理学的に許容さ
れるキャリアとの免疫学的有効量を含み、百日ぜき菌に
対して有用なワクチンが提供される。この遺伝子的に無
毒化された百日ぜきトキシン変異体自体もまた、毒性に
無関係な抗原決定基に対するコンジュゲートワクチンを
作るためのヘプタン、多糖類またはペプチドのキャリア
蛋白として使うことができる。

また、本発明により、該百日ぜきトキシン変異体の生
成方法が提供されている。この方法は、百日ぜきトキシ
ンの毒性を関与する少なくとも１つのアミノ酸残基を確
認する過程、該アミノ酸残基を除去または他のアミノ酸
残基と置換するため、および変異したトキシンオペロン
を生成するためにトキシン遺伝子に部位特定突然変異を
誘発する過程、百日ぜき菌菌体中の本来の遺伝子に変異
した百日ぜきトキシンオペロンを置換する過程、および
免疫的防御性を有し、遺伝子的に無毒化された百日ぜき
トキシンを生成するために変異百日ぜきオペロンを有す
る変異株を生育させる過程を含んでいる。

以下の詳述から明らかとなるように、本発明は更に、
ここで与えられたような変異遺伝子により本来の百日ぜ
きトキシンオペロンが置換され、百日ぜき菌の新規な菌
株、あるいは本来の百日ぜきトキシンオペロンが除去さ
れた新規な百日ぜき菌株が提供される。

百日ぜき菌の種々の株における百日ぜきトキシンオペ
ロン（TOXオペロン）は、配列においてほぼ同一である
ことが知られている［ニコシア（Nocosia）ら,Proc.Na
t.Acad.Sci.,U.S.A.,83,4631,（1986）］；ロッホ（Loc
ht）及びケイト（Keith）,science,2321258,（198
6）］。

百日ぜきトキシン遺伝子座［TOX・ローカス（Locus）
は、５′−フランキングシークエンス（flanking seque
nce）、プロモーター領域、PTの全てのPTサブユニット
に対応する構造遺伝子および３′−フランキングシーク
エンスを有するEcoR I切断部位から始まるDNA断片とし
て、ここで定義される。発明者らが用いた百日ぜき菌10
536株からTOX遺伝子がクローン化され、その配列が分析
された。その結果、そのDNA配列は、他の公知の配列と
塩基No.1として定義されるEcoR I切断部位の１番目のＧ
の下流部にあるつのユニークな塩基の相異以外において
高い相同性を示すことが発見された。全ヌクレオチド配
列と構造遺伝子に対応するアミノ酸配列を第５図に示し
た。

4.6kb EocR I−BamH IフラグメントとしてpUC8:2の中
にクローンされた百日ぜき菌10536株からの百日ぜきト
キシン遺伝子（TOX遺伝子）を含むクローンＪ−169−１
プラスミドDNAは、1988年11月23日にATCC40518として、
ロヒビル、メリーランド、アメリカ（Rochville,Maryla
nd,U.S.A）のアメリカンタイプカルチャーコレクション
（ATCC）に寄託された。

第５図に示したDNA配列における315番目のＴは、この
10536株において特有なものであり、また710番目、1200
番目および1202番目のS1をコードする遺伝子の中には他
の公知の配列と３つの違いが有り、それぞれ成熟S1のア
ミノ酸配列の34番および198番に、グルタミン酸および
バリンの２つのユニークなアミノ酸の存在を規定してい
る。

ボルデテラパラペルツシス（Ｂ．parapertussis）
及びボルデテラプロンチセプチカ（Ｂ．bronchisepti
ca）のトキシン遺伝子のプロモーター領域の中の様々な
部分を変異させることによって、これらのトキシン遺伝
子は発現されなくなる［アリコ（Arico）多びラポーリ
（Rappuoli）,J.Bactericl.,169.2349,（1987）］。こ
のようなトキシン遺伝子の発現のないＢ．parapertussi
sは、スクリーニングにおける変異TOX遺伝子発現用の宿
主として利用できる。

本発明者らは、S1内、特にNADハイドロリシス活性部
位内にある第129番のアミノ酸の置換が、PTのADP−リボ
シルトランスフェラーゼ活性を消失させる事を見い出し
た。しかし、完全な安全性を保証するために、PT全体に
わたって異なる種々の部位における置換を行なう事は望
ましいであろう。したがって、本発明の方法には、毒性
を低減化するための、PTのＡ部分およびＢ部分の両方又
は各々の中の単一部位または複数の部位に対応する遺伝
子の部分を変異させる過程、及び百日ぜき菌のTOX−（T
OX欠失変異）菌株の染色体中にこれらの変異TOX遺伝子
を再導入する過程が含まれる。

その生物学上の活性と非常に関連し、遺伝子操作し得
る部位を含む毒性に関与する部分を決めるための種々の
検討方法が本発明者らにより使用された。

PTは、百日ぜき菌10536株培養上清から得られること
ができる。未精製の上清は、ウルトラフィルトレーショ
ンによって濃縮され、フェツイン−アガロース・アフィ
ニティ・カラム（fetuin−agarose affinity column）
に通され、そこにPTが吸着された。PTは、洗浄されたカ
ラムからチオシアン酸カリウムを用いて溶出され、リン
酸塩−食塩溶液で透析された。この段階において、ナト
リウム・ドデシル硫酸塩−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）分析により測定したPTの純度は90〜9
5％であった。主な汚染物はFHAであった。更なる精製
は、ヒドロキシアパタイトのカラムによるクロマトグラ
フィーにより達成され、99％を越える純度のPTが得られ
た。

S1サブユニットのNADと相互作用する部分を、ニコチ
ンアミドカルボニル基またはアデニン部のどちらか一方
がラベルされた［¹⁴C］NADを用い、単離精製されたS1と
NADとを光架橋させることにより決定した。放射性の標
識は、ニコチンアミド部から、たんぱく質の中へ、効果
的に転移された。そのたんぱく質は、トリプシンにより
消化され、その消化物をHPLCカラムを用いたクロマトグ
ラフィーを用いて分析すると、２つの主要な放射性ペプ
チドが得られた。精製の後、これらトリプシン消化によ
り得られた２つのペプチドのアミノ酸配列を分析する
と、それらの最初の15個のアミノ酸からなる配列は、成
熟S1のアミノ酸配列の118番〜132番に相当することが示
された。両方のペプチドにおいて、放射性は、成熟S1の
129番のアミノ酸に対応する未同定のアミノ酸に結合し
ており、他のどのポジションにおいても検出されなかっ
た。これはGLU¹²⁹がNADとの光架橋の部位であり、それ
故にこのアミノ酸がニコチンアミドとの相互作用部位の
重要な構成要素であろうということが立証された。重要
なことに、ジフテリアトキシンおよびP. aeruginosaエク
ソトキシンＡにおける結合部位もまたグルタミン酸残基
であり、このS1のGLU¹²⁹から始まる３つのアミノ酸から
なる配列は、他の種々のバクテリアトキシンにおいて類
似である配列に似ている。

百日ぜき菌10536株から得られた染色体のDNAは、制限
酵素EcoR Iにより消化され、数百ベースから数千ベース
の範囲の種々のフラグメントが得られた。得られたDNA
フラグメントは、EcoRIで消化処理された且つ脱リン酸
残基処理されたλgtll DNAと連結された。こうして得ら
れた各DNAは、ファージ粒子中にパッケージングされ、
λgtll百日ぜき遺伝子ライブラリーとして、大腸菌y109
0株内に保存された。これとは別に、百日ぜき菌染色体D
NAを制限酵素Sau 3A Iで消化し、非常に大きなDNA断片
を得た後、これらをBamH Iで消化処理したλ charon 35
DNAと連結した。そうして得られたDNAは、ファージ粒
子中にパッケージングされ、λ ch 35百日ぜき遺伝子ラ
イブラリーとして大腸菌LE392株内に保存された。これ
らの遺伝子ライブラリーを含む菌株をプレート培養し、
得られたファージプラークをニトロセルロースフィルタ
ーに移した。得られた各フィルターは、PT S4サブユニ
ットに特異的なオリゴヌクレオチドからなるプロープを
用いてDNAハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グされた。陽性を示すプラークについて、プレート培養
によるプラーク形成およびハイブリダイゼーションから
なる工程が２回繰り返され、更に精製された。陽性を示
すプラークからファージDNAが調製され、制限酵素によ
る消化処理と、サザンブロット（Southern blot）分析
にかけられた。異なる５′−又は３′−フランキング領
域（Flanking region）と、4.6kb EooR I断面からなるT
OXオペロンの全体若しくはその一部を含むクローンが特
定された。クローン化されたTOx遺伝子（百日ぜきトキ
シン遺伝子）は、その塩基配列の分析および遺伝子操作
のために、サブクローンニングされた。塩基配列の分析
はジデオキシ法により行なわれ、公知の配列と比べら
れ、４つの新しい塩基が10536TOX遺伝子の中に見い出さ
れた。

M13ファージでのS1又はS3遺伝子のサブクローンに対
して、in vitroでのホスホロチオエート（phosphoroth
ioate）法を用いた部位特定突然変異誘発が行なわれ
た。これらのクローンからの一本鎖DNAは、１又はそれ
以上のアミノ酸の置換または欠失のために特にデザイン
されたオリゴヌクレオチドとアニーリングされた。その
突然変異誘発は、市販のキット（kit）を使用して行な
われた。部分的な変位は一本鎖DNAの配列分析により確
認された。変異したサブユニット遺伝子はオペロンの残
部と再結合されて変位ホロトキシン遺伝子が構築され、
更に該遺伝子は宿主選択性の広いプラスミドpRK404に組
込まれ後、大腸菌3M109株に保存された。

この変異ホロトキシン遺伝子に対応するホロトキシン
アナログ（PT全体に対するアナログ）を特徴付ける為
に、ヘルパープラスミドとしてpRK2013を用いた固体表
面の上での接合を利用して、それらのプラスミドを天然
のストレプトマイシンに対する耐性を有する百日ぜき菌
に導入した。これらプラスミドが導入された菌はストレ
プトマイシン及びテトラサイクリンを含むホルデー・ジ
ャングー血液プレートと培地（Bor−det−Gengou blood
plate）でスクリーニングされた。

一方変異遺伝子を、自殺プラスミド（suicideplasmi
d）の接合伝達（conjugative trasfar）によって、百日
ぜき菌の染色体に導入することもできた。染色体中での
結合状態は、ランダムであったり、TOXオペロンのフラ
ンキング領域を利用した相同組換えによる方向性を有し
ていたりした。第７図は、ランダムな組換えのための変
異を含む自殺プラスミドの構成を示す。

液体培養は浸盪フラスコ（10mlから２容量）又はフ
ァーメンター（20から50容量）でメチル−β−シク
ロデキストリンを含む変法ステーナーショルテ（Staine
r−Scholte）培地を用いて行なわれた。培養上清中のホ
ロトキシンアナログの発現レベルはELISA法によって測
定され、種々の変異形態のホロトキシンアナログが見出
された。これらアナログの残留毒性がCHO細胞クラステ
リングアッセイ（clustering assay）によって測定され
た。

天然のPTについて行なわれている方法に従って、組換
え百日ぜき菌の２〜50容量での培養から多数のPTの
アナログとしての変異体を精製した。これらの変異体の
ADP−リボシルトランスフェラーゼ活性（ADPR活性）を
［³²P］標準NADから牛トランスドゥシン（bovine trans
ducin）への放射能の取込量として測定した、後に示される表1aは生じたPT変異体を示し、表1bはそ
れらの残留毒性と酵素活性を表示している。

精製変異体を選択し、標準マウスを用いた脳内チャレ
ンジテストによって、急性毒性、ヒスタミン感作活性及
び効能についてテストした。これらの結果を表２に示す
が、表２はPTアナログとしての異性体の急性毒性及びヒ
スタミン感作活性が顕著に減少し、マウスでの効能テス
ト（Potency test）ではこれらが免疫防御性を有するこ
とを示している。

PTのアナログとしての変異体の免疫学的性質を、エピ
トープ地図の作成及びマウスにおける抗体応答の分析に
よって更に検討した。PTの個々のサブユニットやダイマ
ーに特異的な幾つかのモノクローナル抗体（MAbs）をつ
り、これらの抗体によって特定されたエピトープが変異
によって影響されたかどうかをELISAによって測定する
のに使用した。

MAb PS21によって認識されたS1のエピトープは、マウ
スでは免疫優性であって、この抗体はマウス大脳内チャ
レンジテストで受動的防御を与えるので特に重要である
（モノクローナル抗体PS21を分泌するこのハイブリドー
マは、寄託番号HB10299で、ATCCに1989年11月30日付け
で寄託されている）。PTアナログとしての変異体の中で
のこのエピトープの保存について表1bに示す。

三つの精製PT変異体の免疫原性の研究をマウスで行な
った。PTにより誘導されるCHO細胞クラスタリングを阻
害する能力（第３参照）、抗−PT、抗−S1部分及び抗−
Ｂ部分オリゴマー抗体力価について、間接的なELISA
（表４）によって免疫血清をテストした。

ワクチン製造に適する突然変異TOX遺伝子を発現する
ための百日ぜき菌株を生成するために、TOXローカスの
５′−および３′−フランキング領域を含有する線状の
百日ぜき菌DNAのエレトロポレーション（Ele ctroporat
ion）を使用して、内因性のTOXオペロン（operon）を相
同組換えによって欠失させた。次いで、選ばれた変異遺
伝子を百日ぜき菌染色体のTOXローカスのなかへ再結合
した。変異化TOX遺伝子を含むクローンを培養し、培養
上清について、前述したようにPTアナログとしてのPT変
異体の発現レベルとその残留毒性について分析した。こ
れらの結果を表５に示す。

TOX遺伝子が完全に欠失されるか、又はクローンによ
って置換されている百日ぜき菌株が、次のように1988年
11月23日にブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され
た。

TOX^-株は百日ぜき菌の本来のトキシンオペロンが欠失
し、かつ異種（外来）のDNAが存在しない新規な菌株で
あり、抗生物質の不存在下で生育して百日ぜきトキシン
毒性のない百日ぜき菌抗原を生成することが可能であ
る。

形質転換された株の各々は、百日ぜき菌の一種属であ
り、百日ぜきトキシン毒性に対して関与する少なくとも
一つの特定アミノ酸残基の部位特定突然変異によって形
成される変異PTをコードする遺伝子によってそのトキシ
ンオペロンが置換されている。

ここに示すデータは、発明者らによりCHO細胞のクラ
スター形成値および酵素活性（野生型における活性の0.
1〜１％）値が充分減少した一連の百日ぜきトキシンの
アナログとしての変異体が製造されたことを現わしてい
る。多くのこれらのアナログは、また、防御モノクロナ
ール抗体によって認められた免疫優性S1エピトープをも
っている。さらにある種のこれら変異体は、最低の毒性
を示す投与量で、猛毒性の百日ぜき菌を用いたテストに
対してマウスを防御するものであることが認められた。
これらの結果の大部分はＢ．parapertussisによって分
泌されたPT変異体を使用した場合においても共通であ
り、対応する製品がＢ．parapertussisそれ自体の遺伝
操作によって得られることは明らかである。

従って本発明は、新規な百日ぜきワクチンの成分の候
補者としての多数の無毒化免疫原、および百日ぜき菌で
のそれらの製造方法を提供するものである。

［実施例］なお本発明において十分に記載されていない分子遺伝
学的方法、蛋白生化学的方法および醗酵学的方法やバイ
ブリドーマ形成技術の方法ならびに実施例は、科学文献
に充分に報告されたものであり、当業者が容易に行なえ
る範囲にあるものである。

実施例１本実施例はPTの調整と精製を示す。

百日ぜき菌10536株の培養上澄をミリポアペリコンカ
セットシステム（Millipore Pellicon casette syste
m）を用いて10,000または20,000の分子量をカットする
膜で限外ろ過し20−50倍に濃縮した。トキシン（PT）は
粗濃縮物から、IMのリン酸カリウム及び10mMのNaCl（pH
7.5）で平衡化したフェツイン−アガロ−スアフィニテ
ィカラムを通すことによって該カラムに吸収された。典
型的な吸着物の容積はトキシン1mg当り1mlであった。ト
キシンが吸着したカラムは100mMのリン酸カリウム（1M
のNaCl）含有（pH7.5）で洗浄され、ついで3Mのチオシ
アン酸カリウムを更に含む同じバッファーが通され、ト
キシンが脱着して溶出された。プールされた画分はチオ
シアン酸塩を除くために、50mMのトリス−塩酸［Tris−
HCl、10容量％のグリセロール及び200mMのNaClを含む
（pH8.0）］で透析し、ついで50mMのトリス−塩酸［50
容量％のグリセロールを含む200mMのNaCl（pH8.0）］で
透析し、更に−200℃で透析処理された試料を貯蔵し
た。エリザ（ELISA）によって決定された収率は90〜95
％であった。SDA−PAGEで決定された純度は90〜95％で
あり、不純物の主なものはFHAであった。さらに精製す
るために、貯蔵されたトキシンは水で５倍に稀釈され、
これを10mMのリン酸カリウム（pH8.0）で平衡化したト
キシン1mg当り1mlの容積にヒドロキシアパタイトのカラ
ムにかけた。そのカラムはpH8.0の30mMのリン酸カリウ
ムで洗浄され、更にトキシンを脱着するための100また
は200mMのリン酸カリウムで処理されたトキシンが溶出
された。プールされた画分はpH8.0で50容量％のグリセ
ロールを含む100mMのリン酸カリウムで透析され、最終
製品は−200℃で保存された。代表的な収率は90〜95％
であり、SDS−PAGEにより示される純度は99％以上であ
った。

実施例２本実施例はPTのサブユニットS1の調製を示す。

PTを実施例１に記載のようにフェツイン−アガロース
に吸着させ、ついでこれをCHAPSバッファー（500mMの尿
素,50mMのリン酸カリウム,100mMのNaClと１容量％のCHA
PS（３−［（３−コルアミドプロピル）−ジメチルアモ
ニオ］−１−プロパンスルホネート）,ph7.5）で洗浄し
た。このカラムを500μＭのアデノシントリホスフェイ
ト（ATP）を含むCHAPSバッファーで処理し、S1サブユニ
ットを溶出させた。S1サブユニットはそのカラム容積で
シャープなピークとして出現した。プールされた分画
を、次に残存するＢ部分オリゴマーを除くために、CHAP
S/ATP緩衝液で平衡化されたきれいなフェツイン−アガ
ロ−スカラムを通過させ、ついで−200℃で貯蔵するた
めにpH8.0で50容量％のグリセロール含む100mMリン酸カ
リウムで透析した。S1はバイダック（vydac）C4カラム
での逆相HPLCによって、PT基準のそれと積分されたピー
ク面積を比較することによて定量された。代表的な収率
は僅か20〜25％であったが、SDS−PAGEおよび逆相HPLC
の何れからも明らかなように他のサブユニットを含まな
かった。

実施例３本実施例はNADのS1サブユニットとの光架橋反応性を
示す。

50μg/mlのS1、10mMのジチオスレイトール（dithioth
reitol）および50μＭのNADをCHAPSバッファーに含む混
合物（100μ）を、氷で冷した96−ウエルマイクロ滴
定プレートセットのウエル中におき、30分間ブレインキ
ュベートした後、9Wの水銀灯を5cmの距離におき３時間
まで254nmで照射した。次に各ウエル中に試料の残存NAD
グリコハイドロラーゼ活性が検定された。その結果、S1
の酵素活性は２時間の照射後に全くなくなり、これに反
して照射による不活性の程度は同じ条件でNADのない場
合は、僅か40％にすぎなかった。この結果は、NADに左
右される光化学的反応がおきたことを示す。NAD分子の
どの部分がその蛋白質と作用し合ったかおよび架橋反応
性の程度を見出すためにS1を同上条件下で［カルボニル
−¹⁴C］NADまたは［アデニン−¹⁴C］NADと共に照射し
た。３時間間隔で反応混合物の一部をとり出し、それら
三塩化酢酸（TCA）を10％（重量／容量）になるよう加
えて処理した。沈澱した蛋白を濾過して集め、新しい10
％（重量／容量）のTCAで洗浄し、シンチレーションカ
ウンターでカウントした。その結果、放射ラベルはアデ
ニン残基からよりもむしろニコチンアミド残基により導
入され、その取り込みの程度は蛋白１モル当り0.75モル
標識物であることが示された。

実施例４本実施例はS1サブユニット上での光架橋に関与する部
位を確認するものである。

100μg/mlのS1、10mMのジチオスレイトールおよび50
μＭの［カルボニル−¹⁴C］NADをCHAPSバッファーに含
む混合物（3ml）を氷上のペトリ皿に入れ、1mmの層と
し、静かにマグネチックスタラーで撹拌しながら２時間
254nmの波長の光をこれに照射した。チオール基の酸化
の防止のために、溶液は窒素で脱気された状態でジチオ
スレイトールで還元され、更に４−ビニルピリジンでｓ
−アルキル化処理された。反応混合物を10mMの酢酸でざ
っと透析し、20％（重量／容量）TCAで処理し、沈澱し
た放射標識された蛋白が集められた。

沈澱した蛋白（1ml）を2Mの尿素、200mMの重炭酸アン
モニウム中に再溶解してその濃度を500μg/mlとし、37
℃で20時間50μg/mlのトリプシンで消化処理した。消化
物の混合物は酸性化され、１×25cmのVydac C₁₈逆相HPL
Cカラムで、10mMのトリフルオロ酢酸（TFA）中に０−50
％のアセトニトリルの直線濃度勾配を用いて分画され
た。分画の放射性レベルはシンチレーションカウンター
でチェックされ、その結果２つの主な放射性ペプチド
（ペプチドＡ及びＢ）があり、これらの放射性レベルは
溶出された放射性物質のレベル全体の50％に及ぶことが
わかった。

集められたペプチド画分は凍結乾燥され、10mMのTF
A、6Mのグアニジニウムクロライド中に再溶解され、10m
MのFTA中の20−30％のアセトニトリル濃度勾配により、
Vydac CI8カラムで分離された。

それぞれのペプチドは更に均質化するためにpH6.5の2
0mM醋酸アンモニウム液中でのアセトニトリル濃度勾配
によって同一カラムで精製され、精製画分（溶液）を蒸
発乾固した。これらは、分子中に１つの放射性標識部位
が存在することで一致した。

２つのペプチドの配列分布を、自動化されたエドマン
（Edman）分解を利用して行なった。連続する流出液の
一部は放射能の探知のために利用された。得られた結果
を第１図に示した。ペプチドＡとＢでサイクル15迄、シ
ークエンスは同一であり、これらの配列は成熟S1の118
〜132の間のアミノ酸配列とほぼ一致することが認めら
れた。両ペプタイドにおける放射能はともにサイクル12
で放出された成熟S1中の129の位置に対応する未同定ア
イノ酸が有していた。更に、サイクル15より後では放射
能は認められなかった。かくしてGLU¹²⁹は架橋のサイト
であることが確認され、そこでこれがニコチンアミドと
の相互作用の重要な成分であるらしいことが確認され
た。

実施例５この実施例は百日ぜき菌の染色体DNAの調製方法を紹
介する。

百日ぜき菌10536株を変法ステイナー−ショルテ（Sta
iner−Scholte）培地（合計２）中で培養した。この
培地はＬ−プロリン5g/、食塩2.5g/、KH₂PO₄0.5g/
、KCl 0.2g/L、MgCl₂・6H₂O 0.1g/、トリス（Tri
s）1.5g/、カザミノ酸10g/、メチル−β−シクロデ
キストリン2g/、CaCl₂・2H₂O 0.02g/、グルタミン
酸−モノナトリウム10g/、Ｌ−システイン0.004％、F
eSO₄・7H₂O 0.001％、ニアシン0.004％、グルタチオン
0.015％およびアスコルビン酸0.04％からなり、pH7.6で
ある。この培地の125mlを500mlフラスコ（計16個）に分
注し、それぞれのフラスコに定常期の前培養液（4ml）
を接種し、35〜36℃、150rpm、16.5時間の条件で振とう
培養し、対数増殖期まで増殖させた。増殖菌体を含む培
養液を集めその500mlづつ４℃で１時間5000×ｇで遠心
分離処理した。各分離菌体25mlをTE緩衝液（10mM Tris
−HCl、1mM EDTA、pH7.5）で洗浄し、それから20ml TE
中に再懸濁し、−70℃で凍結した。菌体の適用量（ペレ
ット１つ分）を90ml TE中に際懸濁し、これにプロナー
ゼを500μg/mlになるように加えた。更にSDSを１％にな
るように加え、試料は37℃で21.5時間、清澄な分解液が
生成するまで放置された。生成した分解液に対して、こ
の分解液と同量のフエノールを飽和したTris−HCl、pH
7.5、を用いた室温で２時間のゆるやかな撹拌による抽
出処理を行なった。2800×ｇで15分間20℃で遠心分離法
で層分離させ、水層を、この水層と同量のフェノール：
クロロホルム混液（混合比1:1）で同様に抽出した。更
に2100×ｇ、10分間、20℃で遠心分離法で層分離させ、
水層を更にクロロホルムで２時間上記と同様にして抽出
した。抽出後、1600×ｇ、５分間、20℃で遠心分離法で
層分離させ、水層を４℃で1M NaCl溶液（２）に対し
透析した。透析は24時間行なわれ、NaCl溶液は１回交換
された。この透析後、更に水層は２のTE緩衝液に対し
て透析された。この透析は48時間行なわれTE緩衝液は１
回交換された。

実施例６この実施例は百日ぜき菌遺伝子のライブラリーの作製
について紹介する：１） λgt ll EcoR Ｉライブラリー百日ぜき菌のDNA（10μｇ）を100mM Tris−HCl、pH7.
5中で、50μM NaCl、5mM MgCl₂、100μg/mlBSA、１μg/
ml RNAse Aの存在下に、種々の部分で切断されたDNAフ
ラグメントのセットを発生させるために、EcoR I（10ユ
ニット）で反応時間を異ならせて消化した。0.25、0.
5、１、２、４および８時間のそれぞれの時間の各試料
を０℃で保管した。反応はEDTA20mMの添加により停止さ
せた。各試料を集め、それをTNE（20mM Tris−HCl、pH
8.0、5mM EDEA、1M NaCl）中で、85,000×ｇ、20時間
後、20℃で10〜40％の濃度勾配を利用したショ糖濃度勾
配遠沈法で分画した。低濃度側からの24画分（0.5ml）
を分別し、各分画に1mlのエタノールをDNAを沈澱させる
ために添加した。エタノールが添加された各分画はドラ
イアイス上に30分間放置され、それから12,000×ｇ、５
分間、４℃で遠心分離処理した。沈澱物のペレットを70
％エタノールの750μで洗浄し、更にドライアイス上
で５分間保ち、12,000×ｇ、５分間遠心分離したのち乾
燥させた。それぞれのペレットを殺菌水の25μ中に再
懸濁し、先の各分画に対応する各懸濁液から１つおきに
その５μをサンプリングし、それを先の消化処理によ
って得られたDNA断片の大きさを求めるためにアガロー
スゲル電気泳動にかけた。その結果から、約0.5kbから9
kbの大きさの範囲のDNAを含む画分が集められた。集め
られた百日ぜき菌DNAのEcoR I断片混合物（0.4μｇ）は
EooR Iでの消化処理後、脱リン酸基化したλgtll DNA
（0.5μｇ）と結合され、市販のキットを使用してファ
ージ粒子中にパッケージングされた。こうして得られた
ファージライブラリーは大腸菌Y1090株の菌体で増殖さ
れ、λgtll DNA 1μｇあたり約10¹⁰プラクー形成単位
（pfu）が得られた。次にこのファージライブラリーを
クローンをスクリーニングするために４×10 pfu/mlに
増幅させた。

増幅は、0.2％マルトースを含む培地で１夜培養して
得た定常期の菌体に、培地0.6ml当りライブラリーの10
¹⁴〜10⁵pfuを添加し、ファージを菌体に吸着させるため
に37℃で15分間放置し、それをプレートにまくことによ
り行なった。その際、ファージと菌体の混合液は軟質ア
ガーと混合され、プレート化され、37℃で１晩培養され
た。培養後、プレートを4mlのSMG緩衝液（0.4M NaCl、1
0mM MgSO₄、50mM Tris−HCl、pH7.5、0.01％ゲラチン）
で洗浄し、そこから菌体とファージを含むアガー層をか
き取った。洗浄液とファージを含むアガーを一緒にし、
それに100μのクロロホルムを添加し、混合物を15分
間ゆるやかに撹拌しながらインキュベートした。反応混
合物の清澄な上清液を得るために、この混合物を4000×
ｇ、４℃で10分間、２回遠心分離処理した。得られた上
清にクロロホルムを最終濃度0.3％となるように加え、
ファージライブラリーとして４℃で貯蔵した。

２） λシャローン（Charon）35Sau 3A Iライブラリー百日ぜき菌DNA（３×166μｇ）を10mM Tris−HCl、pH
7.5、100mM NaCl、10mMMgCl₂、100μg/ml BSAの中でSau
3AI（３×220ユニット）で消化した。反応時間は、DNA
の非常に大きなフラグメントを発生させるために、１分
間、２分間または３分間とした。

各々の反応の後、EDTAを20mMになるように各反応混合
物に加え、その後2.5容積の無水エタノールを加え消化
処理されたDNAを沈澱させた。DNA混合物はTENは再懸濁
され、TNE中の10〜30％ショ糖濃度勾配で遠心分離され
た。得られた各DNAフラグメントのサイズはアガロース
ゲルの電気泳動により目視により測定された。λシャロ
ーン35DNA（２×50μｇ）を環状化した後、詰物DNAフラ
グメント（stuffer DNA fragment）を取り除くため150m
MMNaCl、6mM Tris−HCl pH7.9、6mMMgCl₂、100μg/ml B
SAの存在下BamH I（２×20units）でこれを消化処理し
た。BamH I消化物中からラムダアームを、８〜20％の酢
酸カリウムを用いた85,000×ｇの濃度勾配遠心で16時
間、32℃の処理でペレット化することにより単離した。
次に、先に得たSau3A I消化DNA混合物を、ラムダアーム
と、６℃、72時間の反応により結合させ、市販のキット
を用いてファージの中へパッケージングした。こうして
得られたファージライブラリーは大腸菌LE392株で増殖
され、１μｇのラムダアームあたり約１×10⁵pfuのファ
ージが得られた。このファージライブラリーは前述の方
法と同様にしてスリーニングするため１〜２×10¹⁰pfu/
mlに増幅された。

実施例７本実施例は百日ぜき菌遺伝子ライブラリーのスクリー
ニングを示すものである。

１） λgtllゲノミックライブラリー 30塩基からなるオリゴヌクレオチドプローブが、PT
のS4サブユニットをコードするヌクレオチド配列に従
い、合成された。プローブDNAは、UV・発色（imaging）
とワトマンセルロースDE52におけるアニオン交換クロマ
トグラフィーにより尿素／アクリルアミドから単離され
た。得られたプローブ用オリゴヌクレオチドの配列は、
成熟S4タンパクのアミノ酸配列の16〜25番の間の部分を
コードする５′GTAGCCATGAAGCCGTATGAAGTCACCCCG3′で
あった。このオリゴヌクレオチドの10μｇを、50mMTris
−HCl、pH9.5、10mM MgCl₂、5mM DTT、５％グリセロー
ルからなる溶液中で、37℃、15分間、25μCi［α−
³²P］ATPおよび４単位のポリヌクレオチドキナーゼと反
応させて、その５′末端を標識化した。更に、ATPが1.5
mMになるように加えられ、反応は1.75時間、37℃で続け
られた。次に、10μｇのtRNAがキャリアーとして加えら
れ、更に標識化DNAは、0.1Mトリエチルアンモニウム
バイカーボネートpN7.6を溶出液として利用したセファ
デックス（Sephadex）G50スーパーファインカラムにお
いてフリーのATPと分離された。ピークを構成する各画
分は一緒にされ、凍結乾燥された。得られたペレットは
無菌水で洗われ、再び凍結乾燥され、後約0.1μg/μ
の濃度で再懸濁された。

λgtll百日ぜき菌遺伝子ライブラリーを感染させた大
腸菌Y1090株を0.2％マルトースを含むNZCYMプレートで
培養し、プラークを形成した。プレート上のプラークの
ニトロセルロースフィルターに写し取り、それを変性用
溶液（1.5M NaCl,0.5MNaOH）と１分間反応させ、更に中
和用溶液（1.5M NaCl、0.5M Tris−HCl pH8.0）と５分
間反応させた後、ニトロセルロースフィルターにDNAを
固定するために２×SSDE（0.3M NaCl、20mlリン酸ナト
リウム、pH7.4、2mM EDTA）で短時間処理してから２時
間真空下80℃での焼付けを行った。更に、このニトロセ
ルロースフィルターを、５×SSC（0.7M NaCl、7.5mMク
エン酸ナトリウム、pH7.5）、５×Denhardt溶液（0.1％
Ficoll 400、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％BS
A）、0.1％ SDS、100μg/mlニシン精子DNAを含むプリハ
イブリディゼーション（prehybridization）用バッファ
ーと反応させた。プリハイブリディゼーション用バッフ
ァーを除去し、10⁷cpmの［³²P］−標識化オリゴヌクレ
オチドブローブを含む新しい放射性のバッファーが加え
られた。ハイブリディゼーションは45℃、16時間行なわ
れた。放射性のバッファーを除去し、結合していないプ
ローブを取り除くため５×SSC、0.1％SDSで室温で２回
短時間フィルターをすすいだ。フィルターはさらに、５
×SSC、0.1％SDSで一時間、５℃で２回洗われた後、空
気乾燥され、オートラジオグラフィにかけられた。

プラークが形成されているプレートはそれらのオート
ラジオグラムと比較され、陽性を示すプラークをプレー
トを用いた２回の純粋分離操作にかけた。単離クローン
の中から１つのクローン（λ gtll−15−４−１）が、
サザンブロット（Southernblot）分析による詳細な分析
のために選ばれた。

２） λ シャローン35遺伝子ライブラリーλ シャロ
ーン35百日ぜき菌遺伝子ライブラリーを感染させた大腸
菌LE392を0.2％マルトースを含むNZCYMプレートで培養
し、プラークを形成させた。プラークのフィルターへの
転写、ハイブリディゼーション及び洗浄等は上述のλｇ
＋11ライブラリーでの方法に従って行なわれた。陽性を
示すプラークをプレート上でさらに２回純粋分離操作に
かけ、その中のいくつかのクローン、すなわちλ ch 3
5,111,121,411,421及び431がサザンブロット分析により
分析された。

実施例８本実施例のゲノムクローンの分析を示すものである。

１）ファージDNAの生成ファージ培養物１リットル（２×500ml）を以下のよ
うにして用意した。大腸菌LE392株及び大腸菌Y1090株を
別々に0.2％マルトース含有培地で一夜培養した。培養
菌体（菌体数10¹⁰）は４℃で５分間4400×ｇで遠心分離
され、分離菌体を1mlSMGバッファー中に再懸濁させた。
ファージストック（1.2×10¹⁰pfu）をこれら懸濁液に加
え、ファージを菌体に吸着させるため37℃で15分間これ
らを接触させた。ファージ／菌体混合物は500mlの培地
で、37℃で激しい振とう下で溶禁が始まるまで（４〜4.
5時間）培養された。更にクロロホルム（10ml）を加え
溶菌を完了させるためにさらに15分間37℃で振とうを続
けた。反応混合物は室温にまで冷却され、これにDNase
を有しないRNaseA及びDNase I（各々１μg/ml）を室温
で30分間加えた。菌体残渣を20分間、3500×ｇの遠心処
理でペレット化し、上清と分散した。29.2g NaClと50g
ポリエチレングリコール（PEG6000）をこの上清500ml
に加えた後、これを徐々に固形分を溶かすため室温で振
とうし、更に０℃、１〜２時間放置しファージを沈澱さ
せた。ファージは、４℃20分間、4400×ｇで遠心分離に
より収穫され、8ml TMバッファー（50mMTris−HCl,pH7.
5,10mM MgSO₄）中に再懸濁された。この懸濁液から8ml
クロロホルムでの抽出によりPEGを取り除き、透明な上
清をえた。該上清をTMバッファー中での５％及び40％グ
リセロールの濃度勾配遠心（４℃、１時間、154,000×
ｇ）にかけた。その結果、ファージペレットが得られ、
上清と分離された。このペレットは0.5mlTMバッファー
に再線濁された。得られた懸濁液にDNase Iを５μg/ml
の濃度で、RNase Aを50μg/mlの濃度で加え、得られた
サンプルは37℃で30分間放置された。更に、このサンプ
ルにEDTAを20mM、プロナーゼは0.5mg/ml、SDSを0.5％の
濃度にそれぞれなるように加え、サンプルをさらに37℃
で１時間放置した。次に、サンプルを、フェノール、フ
ェノール：クロロフォルム混液（混合比1:1）及びクロ
ロフォルムでそれぞれ１度づつゆるやかに抽出した後、
ファージDNAをエタノールで沈澱させた。

２）結果 EcoR I gtllライブラリーより得られるクローン15−
４−１はサザンプロット分析により、全TOX遺伝子と小
さな５′及び３′−フランキング領域を有する4.6kb Ec
oR I断片を含むことがわかった。

λ charon35 クローンにおいてもほぼ同様の結果が
得られていることがわかった。いくつかのクローンは、
全TOXオペロンとフランキング領域を異なった方向性を
もって含んでおり、他のものは完全なTOX領域を含んで
いなかった。

クローン15−41、Ch111,Ch121/411,Ch431及びCh421の
マップは第２図に示されている。

実施例９本実施例は百日ぜきトキシンオペロン（TOXオペロ
ン）またはその一部を含有し、pUCを用いて形成された
プラスミドの構築を示すものである。

λ gtll クローン15−４−１からのファージDNAが前
記の方法に従って調製され、一般的方法により制限エン
ドヌクレアーゼEcoR Iで消化された。DNAは低融点アガ
ロースによるゲル電気泳動により単離された。エチジム
ウブロマイド染色ゲルのUV発色により4.6kbバンドが同
定され、分離された。DNAを0.3M酢酸ナトリウム（pH7.
0）を用いたフリーズソークテクニック（freeze−thaw
tech−nique）によりゲルから抽出し、エタノールで沈
澱させた。pLC8:2からのDNA、すなわちBgl II及びXba I
に対する２つの制限酵素切断部位がそのマルチクローニ
ングサイトにより追加されているpCU8の誘導体をEcoR I
で消化した。

EcoR Iでの切断で線状化されたDNAは子牛アルカリフ
ォスファターゼを用いて標準的な方法によって脱リン酸
基化され、フェノール抽出され、エタノールで沈澱させ
た。

pUC8:2ベクターDNAとクローン15−４−１からのTOXオ
ペロンDNAは標準的な反応で結合され、得られた結合体
の混合物は標準的な手順に従って適当な大腸菌JM109株
の形質転換に用いられた。この結果得られたコロニー
は、高速DNAスクリーニングテクニックにより分析さ
れ、２つのコロニーがプラスミドDNAの大規模な調製の
ために選ばれた。これらのクローン、Ｊ−169−１およ
びＪ−169−２は、挿入されたTOXオペロンの方向性にお
いてのみ相異していた。これらのクローンの構造を第３
図（ハッチング部やTOXオペロン）に示す。

なお、プラスミドＪ−169−1DNAは、1988年11月23日
付でアメリカンタイプカルチャーコレクションにブダペ
スト条約に基づいて寄託され、その受託番号はATCC 405
18である。

実施例 10 この例はTOXオペロンの配列分析について説明するも
のである。

１）使用したクローンクローンＪ−169−１が配列決定のための全てのクロ
ーンの形成の出発材料として使われた。TOXオペロンは
５個のほとんど同じ大きさのDNA断片に分けられ、M13mp
18、M13mp19またはpUC8:2にサブクローニングされた。
第４図a,b,c,dおよびｅにこれを示す。

２）サンプルの調製 M13クローンは大腸菌JM101中に保持され、その配列が
分析されるDNAは純粋培養プレートの１つの独立プラー
クから調製された。すなわち定常期の大腸菌JM101の培
養液は、新しい培地で稀釈（希釈率1:50）され、該プラ
ークからのファージをこれに感染させた。次に、この培
養液を37℃で６時間強く振とうして培養を行なた。菌体
は培養液から遠心分離によって除かれ、その上清が1/4
の体積の20％PEG6000、2.5M Naclで処理されてファージ
が沈澱させられた。この沈澱物を含む液は遠心分離処理
され、ファージペレットは再びTE中に懸濁させられ、フ
ェノール、フェノール：クロロフォルム（1:1）および
クロロホルムによってそれぞれ２回ずつ注意深く抽出さ
れた。更に、抽出液からファージDNAが酢酸ナトリウム
およびエタノールで沈澱させられ、70％エタノールで洗
浄ののち乾燥させられた。そのDNAは約１μg/mlとなる
ように無菌水に再び懸濁させられた。

配列決定用の約17から20の塩基のプライマーがホスホ
ロアミダイトケミストリーを用いたABI38A DNAシンセサ
イザーにより合成され、上記のように精製された。

３）配列決定サンガーのジデオキシ鎖のターミネーション法が全て
の配列分析のためのクルノー（klenow）ポリメラーゼま
たはシーケナーゼT7酵素を用いた反応に適用された。

４）結果上記のTOXオペロン全体のヌクレオチド配列（塩基配
列）が分析され、その結果がすでに公開されている他の
塩基配列と比較された。４つの塩基の違いの他は、ニコ
シアらによって報告された菌株BP165のTOXの配列との一
致がみられた。５′−フランキング領域における第315
番目の位置のＴは百日ぜき菌株10536にとって独自のも
のである。その他３つ置換（違い）はS1をコードする領
域の第710番目、第1200番目、第1202番目の位置にあ
り、その結果、２つの独特なアミノ酸すなわちGLU34（3
4番目のアミノ酸）およびVALI198（第198番目のアミノ
酸）が存在する。得られたヌクレオチド配列および対応
するアミノ酸配列を第５図に示す。

実施例 11 本例はTOX遺伝子の突然変異誘発についてについて説
明するものである。

１）使用したクローン S1遺伝子に変異を生じさせるために、クローンＳ−24
03（Ml13mp18/S1）が用いられ、S3遺伝子に変異を生じ
させるためにクローンＳ−1664−５−６（Ml13mp18/S3
（ｃ））が用いられた。これらのクローンは第４図に示
される。

２）突然変異誘発前記のように、純粋培養プレートの１つの単離プラー
クからとった保存ファージから一本鎖DNAを調製した。
適当な配列と長さを持つ突然変異誘発用プライマーが、
ABI380A DNAシンセサイザーで合成された。

エクスタイン（Eckstein）によって開発されたホスホ
ロチオエート法に基く化学キットがin vitro突然変異
誘発のために使用された。簡単に説明すると、突然変異
誘発用オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳金DNA（野生型；
変異が導入されるDNA）とアニーリングし、得られた一
部が二本鎖化したDNAの一本鎖部分を基質としてホスホ
ロチオエートdCTPアナログdATP、dGTPおよびdTTPを用い
て二本鎖化した。次に、こうして得た二本鎖DNAをNci I
で刻み、切れ目の入った鋳型（野生型）DNA鎖をエクソ
ヌクレアーゼIIIで処理して突然変異させる部位及びそ
の隣接部を消化し、その部分を一本鎖化した。消化部分
に対応する他方の鎖の相補DNAは、ホスホロチオエート
基の存在によってNciIによって刻まれることから保護さ
れた。そしてこの相補DNA鎖を鋳型として一本鎖化され
た部分を二本鎖化して、両方のDNA鎖に変異が導入され
た二本鎖DNAが得られた。このDNAは大腸菌中で増幅さ
れ、そのDNA塩基配列を分析することによって突然変異
の発生が確かめられた。

35個の一次変異体が得られ、これらの間に交雑を行な
ってさらに14個の変異体を得た。変異体形成効率の所望
とする変異の種類によって異っていた。１個〜６個の塩
基の変異および15個までの連続的な欠失を行った。その
際得られたアミノ酸の変化を表1aにまとめた。

実施例 12 本例はＢ．parapertussisにおける変異したTOX遺伝子
の発現のためのプラスミドの構築を示し、そのプラスミ
ドを用いて生成されたPTアナログの特徴を示すものであ
る。

１）プラスミドの複製 M13 クローンから調製した複製可能なDNAを、pRK404
中に所望の変異を有するTOXオペロンを再構築するため
に使用した。pRK404は、不適合グループＰ−１のpRK2フ
ァミリーに属する接合プラスミドであるpRK290の誘導体
である。そのサイズは10.6kbであり、テトラサイクリン
耐性（Tet^R）遺伝子をもち、pUC8からのマルチクローニ
ングサイトを有する。S1およびS3の一次変異体を結合さ
せたオペロンを得るための構築法を第６図に示し、得ら
れたクローンを表1aに示す。更に、S1での交雑変異形成
のために、インターナル制限酵素切断部位、特にユニー
クなSal I切断部位が利用された。S1での交雑による変
異のための一般的な方法もまた第６図に示し、得られた
クローンも表1aに示す。

２）スーサイドプラスミド（自殺プラスミド）複製を形成できない融合プラスミドを、TOX遺伝子ま
たは変異したTOX遺伝子をランダムにBordetella種の染
色体内に融合するために開発した。第７図にこれらのク
ローンの構造を示す。

上記（１）と（２）のタイプのプラスミドを、接合伝
達により百日ぜき菌に導入した。得られた菌株を振とう
フラスコまたはファーメンターの中で培養し、その培養
上清について、ELISAによってトキシンアナログの濃度
を下記のように分析した。マイクロタイタープレート
を、0.05M炭酸カリウム中、pH9.6、４℃、加湿環境中
で、フェツイン（２μg/ml）でコーティングした。この
プレートを、0.1％（重量／容量）のTween−20を含むDe
lbecco′s PBSにより２度洗浄し乾燥した。上記の培養
上清及び野生型PTのそれぞれの希釈濃度シリーズを形成
し、各濃度のサンプルをそれぞれ別々のウエルに加え
た。そしてプレートを室温で30分間放置したのち洗浄し
た。結合PTを、アフィニティ精製されペルオキシダーゼ
が結合された抗PTウサギ抗体を用いて検出した。

変異PTの残存毒性をCHO細胞クラスタリングアッセ
イにより測定し、それを天然（野生型）PTと比較して毒
性を決定した。PT変異体を、実施例１において天然のPT
について説明したのと同じように純化し、そのADP−リ
ボシルトランスファラーゼ活性を分析した。これらのデ
ータを表1bにまとめる。MAb PS21により認識されたS1エ
ピトープの発現が、培養上清の変法間接ELISAによって
評価された。フェツイン結合PTアナログが、第１抗体と
してのPS21と反応させられ、次にアフィニティ精製さ
れ、酵素が結合されたヤギ抗マウスIgGを第２抗体と反
応させられて視覚化された。MAb PS21認識されたS1エピ
トープの有無を調べ、表1bにそれを示した。

実施例 13 本発明は内因性の百日ぜき菌TOXオペロンの欠失およ
び置換のためのためのプラスミドの構築を例示してい
る。

１） TOXのフランキング領域ａ）５′−フンランキング領域 Ch421 DNAはまずBgl IIによって消化され、次いで11k
bフラグメントはアガローズゲル電気泳動によって精製
された。このBgl II切断断片はXma Iによって更に消化
され、、この消化物の電気泳動における5kbバンドから
のDNAを、あらかじめXma Iによって切断し、かつ脱リン
酸基化したpUC8:2中にサブクローン化した。大腸菌JM10
9株を前記Skb断片とpUC8:2との反応混合物によって形質
転換し、形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニ
ーは迅速（rapid）DNAスクリーニング法によって分析さ
れた。クローンＪ−183−９は約2.9kbの５′−フランキ
ング領域、TOXプロモーターならびにサブユニットS1お
よびS2のための遺伝子を含んでいることがわかった。第
8a図はクローンＪ−183−９の構築過程を示す。

ｂ）３′−フランキング領域 ch111 DNAはSal Iによって消化され、百日ぜき菌のDN
Aの約8kbのフラグメントはゲル精製された。このDNAは
フラグメントは、あらかじめSa1 Iによって消化され、
かつ脱リン酸基化されたpUC8:2中に挿入された。大腸菌
JM109形質転換体はスクリーニングされ、クローンＪ−2
19−111−３はS1遺伝子の一部分、その他のすべての構
造遺伝子全域、および約39kbの３′−フランキング領域
を含有することが同定された。第8b図はこのクローンの
構築過程を示す。

ｃ）５′−および３′−フランキング領域を有するTO
X遺伝子クローンＪ−183−９はXba Iによって消化され、その
消化物からpUC8:2、５′−フランキング領域およびS1遺
伝子のプロモーター領域を含む約7kbの断片がゲル精製
され、更に精製物からリン酸基が除去された。Ｊ−219
−111−3DNAはxba Iによって消化され、サブユニットS2
からS5までの構造遺伝子および３′−フランキング領域
を含む約8kbの断片がゲル精製された。これらのDNA断片
は結合され、結合体により形質転換された大腸菌JM109
がスクリーニングされてクローンＪ−229−17をもたら
した。このクローンは約2.9kbの５′−フランキング
（領域）、全TOXオペロン、および4kbの３′−フランキ
ング（領域）を含んでいた。その構築過程を第8c図に示
す。

２） TOX−欠失プラスミドプラスミドＳ−2832−５はプラスミドpRK404からのTe
t^R遺伝子を含んでおり、その構築過程を第９図ａ）及び
ｂ）に示してある。Tet4^R遺伝子はプラスミドpNO1523中
にEcoR I/BamH I断片としてクローン化され、pGZ62を生
じた。プラスミドpGZ63は５′−および３′−フランキ
ング領域を、いかなる他のDNAも介在させることなしに
含んでいる。pGZ62由来のS12−Tet^R遺伝子サンドイッチ
はpGZ63のフランキング領域の間にクローン化されて、
プラスミドpGZ65を生じた。これらのプラスミドの構築
過程は第9c図中に要約してある。

３） TOX−再導入プラスミド百日ぜき菌TOX−株中での突然変異TOXを発現するため
に、第10図に示すタイプの接合自殺（conjugative suic
ide）プラスミドが組み立てられた。これらのプラスミ
ドはTOX遺伝子、付加された５′−および３′−フラン
キングシークエンスを含んでおり、TOX遺伝子領域の
下流部にクローン化された選択のためのTet ^Ｒ遺伝子を
持っている。

実施例 14 本例は、百日ぜき菌の染色体からのTOX遺伝子の欠失
およびTOX遺伝子欠失染色体へのin vitroでの変異TOX遺
伝子の導入を例示するものである。

１）百日ぜき菌の形質転換百日ぜき菌の種々の株がエレクトロポレーションによ
って形質転換された。菌株を変法ステイナー−ショル
テ（Stainer−Scholte）培地100ml中でミリリットル当
り約109個の菌体濃度になるまで培養し、培養菌体は、
クリニカル遠心分離機（4000×g,15分間,20℃）で回収
され、25ミリリットルのエレクトロポレーションバッフ
ァー（0.3Mショ糖、1mM塩化マグネシウム、7mMリン酸カ
リウム、pH7.2）中で洗浄され、同バッファー10ml中に
懸濁された。その菌体懸濁液500μにプラスミドDNAを
加え、混合物を氷上で10分間放置した。この菌体に、0.
8mmのギャップを有するキュベツト電極を用いて、BTXト
ランスフェクター（Transfector）100による25KV/cm,40
μｓのの指数減衰電圧単一パルスを与えた。培地３ミリ
リットルを更に加え、菌体を振とう下、37℃60分間培養
した。得られた培養菌体を12,000×ｇ、２分間の遠心分
離により収穫後、100μの媒体中に再懸濁させ、これ
を抗生物質によるスクリーニングのためにボーダ・ジャ
ンゴープレートに塗布接種し、これを２〜５日間、37℃
で培養した。

ａ） TOXオペロンの欠失および形質転換百日ぜき菌 str29は、百日ぜき菌 10536の自然発生rp
sLストレプトマイシン耐性変異株である。プラスミドpG
Z65は、TOXオペロンの５′−および３′−フランキング
領域間にクローニングされたpRK404 Tet^R遺伝子および
大腸菌S12遺伝子からなる遺伝子カートリッジを含んで
構成されている。このプラスミドはHind IIIにより線状
化され、百日ぜき菌 str289をTet^R、Strsに形質転換す
るのに使用され、その際相同組換えによりTOXオペロン
の欠失が生じた。このTOX欠失菌体を29−８とし、サザ
ンブロット分析によってTOX対立形質の削除およびそのT
cr、S12遺伝子カートリッジによる置換が示された。こ
の欠損株は、1989年11月30日付けでATCCに受託番号5397
3で寄託されている。S12−Tet^R遺伝子カートリッジを働
かすために、菌株29−８は、続いて線状pGZ63プラスミ
ドDNAで形質転換された。プラスミドpGT63はTOX５′−
および３′−フランキング領域を含むが、これらの領域
間に介在DNAを有さない。

このプラスミドを有する形質変換は、ストレプトマイ
シン耐性でTOXが欠失されているが、TOXローカスに外来
DNAが挿入されていない菌株である百日ぜき菌29−９を
生成させた。この菌株は、in vitro変異された遺伝子の
発現のためのホストとして使用された。第10図に示され
たタイプのプラスミドは変異されたTOX遺伝子およびTet
^R遺伝子からなる遺伝子カートリッジを有している。こ
の遺伝子カートリッジは、接合または形質転換による菌
株中へのプラスミドの導入に引き続いて、百日ぜき菌29
−９の染色体中に組み込まれた。TOX遺伝子の発現、PT
アナログの毒性およびMAB PS21により認識されるS1エピ
トープの保持は、前述したようにして決定された。組換
えにより構成された百日ぜき菌変異株および分泌された
PTアナログの物性を第５表に示した。

実施例 15 この実施例は、マウスに対するPT変異体（アナログ）
のin vivo試験について記載する。

組換え百日ぜき菌の培養上清から実施例１で示した方
法によりPT変異体を精製した。得られた変異体を３つの
異なった服用量でマウスに注射し、標準操作に従い次の
ような特性を試験した：急性毒性、ヒスタミン感作活性
およびマウスの大脳内チャレンジテストでの効果。

それらの免疫原性を評価するために、生後９〜11週の
メスのBALB/CマウスにPT変異体の2.0、0.5および0.125
μｇの量を注射した。これらマウスから０日目に前採血
された。また、23日目に再度採血（第１回採血）し、同
じ免疫原で追加免疫し、37日目に再度採血（第２回採
血）した。血液サンプル（0.4〜0.5ml/マウス）は眼窩
洞から出血させることより収集し、得られた血清を−20
℃で試験のために保存した。これら血清を用い、PTで誘
起されるCHO細胞クラスター形成の阻止能力（第３表）
および特定の抗原コートに対する抗体反応、開接ELISA
（第４表）について分析した。

第３表および第４表から明らかなように、PT変異体
は、抗原の無力換を誘起することができ、PT、S1および
Ｂ部分オリゴマーに対する免疫応答を生じさせ得る。

以上の本開示を総括すると、本発明は百日ぜきトキシ
ンの毒性を示す特定の部位を認知することによる百日ぜ
きトキシンを無毒化させる新規な方法、並びにトキシン
遺伝子の部位特定突然変異によって組換えハロトキシン
を製造する方法を提供する。

得られたトキシンアナログは、無毒化されたものであ
り、免疫優性S1エピトープを保持し、百日ぜき疾病に対
してその防御性を付与する。なお、本発明の範囲を越え
ない限りにおいて、各種の変形が可能である。

アミノ酸のナンバリングは天然種のサブユニット（na
tive subunits）中のポジションに対応する（第５
図）。全ての突然変異は、S3中と特定されていないなら
ば、サブユニットS1中である（S3）。

IIは択一的コドン（alternative codon）を示す。

△はアミノ酸残基の欠失を示す。

野生型（Wild type）とは、百日ぜき菌中の突然変異
されないTOXオペロンから発現されたPTを指す。

残留毒性は、CHOセルクラスタリングアッセイに
より決定された見掛けのPT濃度の、ELISAにより決定さ
れたPT変異体の実際の濃度に対する比をパーセンテージ
で表わしたものである。

ADPR活性は、等濃度の野生型PTにより触媒作用を及ぼ
されたウシトランスドウシンのADPリボシル化の程度を1
00とした場合の各PTアナログ（変異体）により触媒作用
を及ぼされたウシトランスドゥシンのADPリボシル化の
程度をパーセンテージで表わしたものである。

S1エピトープとは、野生型PT（＋＋＋＋＋）と比較し
た、特異的なモノクロナール抗体PS21により認識された
免疫優性S1エピトープの発現を指す。

NDは決定されなかったことを示す。

HS活性なヒスタミン感作活性を表わす。

M.P.T.はマウス大脳内チャレンジテストを表わす。

LD⁵⁰は試験動物の50％が死ぬ投与量である。

ED⁵⁰は試験動物の50％が保護される投与量である。

天然種（netive）は百日ぜき菌10536からのPTであ
る。

マウスは０日に予め前採血されてから免疫処置され
た。23日目に採血（第１回採血）し、そこで追加免疫し
た。最終血清は37日目（第２回採血）に得られた。

血清によるCHO細胞クラスタリングの阻止効果は、CHO
細胞クラスタリングが抑制される最大稀釈率で表わされ
ている。

免疫処置および採血は第３におけると同様に行われ
た。

用いられた抗原はPTホロトキシ（holotoxin）、単離
されたS1サブユニットおよび単離されたＢオリゴマーで
あった。

単位は、ELISAにおいてバックグラウンドの２倍に等
しい光吸収を示す稀釈率を1000で割ったものである。

NRは、抗原と反応しないことを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、放射性の標識をしたサブユニットS1からのペ
プチドＡおよびＢの自動化された配列分析により得られ
たアミノ酸の配列を示しており、得られた配列と成熟S1
の配列（residure）が比較されている。第２図は、染色体ライブラリーから得られた種々のTOX
クローンの構造を示している。第３図は、ゲノムクローン（λgtll 15−４−１）から
のTOX遺伝子を含んでいるサブクローンの構築過程を示
しており、pUC8:2のBgl IIおよびXba I切断部位位置を
含むマルチクローニングサイトに挿入されているTOX遺
伝子を有する。第４図は、オペロンの配列決定に使われたTOX遺伝子の
サブクローンの構築過程を示している。（ａ）におい
て、TOX遺伝子の制限酵素地図と各蛋白質サブユニット
に対応する位置が示されており、pUC8:2/TOXクローンＪ
−169−１が分割され、分割断片がクローン化され、ま
た各サブユニットもM13mp18、M13mp19またはpUC8:2中へ
サブクローン化された。（ｂ）にpUC8:2の５′領域のク
ローン、M13mp18におけるS1クローンおよびM13mp19にお
けるS1クローンが示されている。（ｃ）に、M13mp18中
のS2クローンおよびM13mp19中のS2クローンが示されて
いる。（ｄ）にM13mp18およびM13mp19中のS4/S5クロー
ンが示されている。（ｅ）に、M13mp18およびpUC8:2中
のS3クローンおよび３′領域のクローンが示されてい
る。第５図は、百日ぜき菌10536株のTOX遺伝子のヌクレオチ
ド配列と及びそれに対応する遺伝子翻訳生成物を示す。第６図は、宿主選択性の広いpRK404中へのTOXまたはTOX
のアナログ遺伝子の組み込み過程を示す（Ditta et a
l.,Plasmid,13,149,［1985］）。（ａ）および（ｂ）に
は、突然変異遺伝子と天然型の遺伝子を利用してpRK404
中に一次TOXアナログ遺伝子を形成する過程が示され、
また（ｃ）には、二つのS1突然変異遺伝子の交雑により
生成された突然変異体の典形的構造が示されている。第７図は、自殺プラスミドの構築過程を示す。一つは非
相同組換えのためのものであり、pRK404およびpMK2004
（kahn et al,Methods in Enzymology68,278,［197
9］）に基く接合伝達の能力をもつが、自己複製の能力
はない。また、最終のプラスミドもまたカナマイシン耐
性遺伝子をTOXまたはTOXのアナログの３′側に含む。第８図はTOX遺伝子の５′−および３′−フランキング
領域のクローン化を示す。（ａ）は、λシャロン35クロ
ーンCh421からpUC8:2中へのTOXの５′部分の組換え過程
を示し、（ｂ）はλ Ch111からpUC8:2中へのTOXの３′
部分の組換え過程を示し、（ｃ）は５′−および３′−
フランキング領域をともなうTOXのpUC8:2クローンの構
築過程を示す。第９図ａ）〜ｃ）は相同組換えによる百日ぜき菌染色体
からのTOXオペロンの欠失に利用するプラスミドの構築
過程を示す。第10図は、相同組換えによる、百日ぜき菌ゲノム中への
変異TOX遺伝子の導入のためにプラスミドの構築過程を
示し、最終のプラスミドは、第７図に示した自殺プラス
ミドに基づいており、且つ変異TOX遺伝子の３′側にpRK
404からのテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者ステファンアンソニーコックルカナダ国エル４シイ５ピイ９オンタリオ州リツチモンドヒルステフアンストリート 159 (72)発明者シーナメイルースモアカナダ国エル４ジイ４アール４オンタリオ州オーロラクロフォードローズドライブ 70 (72)発明者ギャビンローズジーレイカナダ国エル４ケイ１ジイ８オンタリオ州コンコードベイヒルドライブ 49 (56)参考文献特開昭62−228286（ＪＰ，Ａ) 特開平１−165370（ＪＰ，Ａ) 特開平２−84183（ＪＰ，Ａ) 特表平４−501051（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．232（1986) Ｐ．1258−1264 ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．55，Ｎｏ．10 （1987．Ｏｃｔ）Ｐ．2465−2470 Ｐｖｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．85，Ｎｏ．19 （1988．Ｏｃｔ）Ｐ．7521−7525 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．242（1988. Ｏｃｔ）Ｐ．72−74 ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．56，Ｎｏ．８（1988．Ａｕｇ）Ｐ．2465−2470

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】百日ぜきホロトキシン変異体であって、該
ホロトキシンが、天然百日ぜきホロトキシン中の少なく
とも１つのアミノ酸をコードする少なくとも１つのコド
ンを部位指定突然変位により変異させた遺伝子によって
コードされたものであり、該部位指定突然変異が前記少
なくとも１つのアミノ酸の削除または置換を生じさせる
ものであり、かつ前記天然百日ぜきホロトキシンの免疫
的防御性を維持しつつ残存毒性を前記天然百日ぜきホロ
トキシンの１％以下に遺伝学的に解毒するものである百
日ぜきホロトキシン変異体であって、以下に示すアミノ酸の置換の少なくとも１つを含むこと
を特徴とする変異体。 a.前記少なくとも１つのアミノ酸がARG⁹であり、これが
LYS⁹またはHIS⁹に置換されたもの。 b.前記少なくとも１つのアミノ酸がARG⁵⁸であり、これ
がGLU⁵⁸で置換されたもの。 c.前記少なくとも１つのアミノ酸がGLU¹²⁹であり、これ
がGLY¹²⁹、GLN¹²⁹またはASN¹²⁹で置換されたもの。
【請求項２】１つのアミノ酸が削除または置換されたも
のである請求項１に記載の変異体。
【請求項３】複数のアミノ酸が削除または置換されたも
のである請求項１に記載の変異体。
【請求項４】天然百日ぜきホロトキシンの0.5％未満の
残存毒性を有する請求項１〜３のいずれかに記載の変異
体。
【請求項５】天然百日ぜきホロトキシンの１％未満のAD
P−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する請求項
１〜４のいずれかに記載の変異体。
【請求項６】減少したヒスタミン感作活性を有する請求
項１〜５のいずれかに記載の変異体。
【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載の免疫防御
性を有しつつ遺伝学的に解毒された百日ぜきハロトキシ
ンの変異体の有効量と、生理学的に許容される担体とを
含むことを特徴とする百日ぜき用ワクチン。
【請求項８】免疫応答を引き起すためのハプテン、多糖
類またはポリペプチドに結合させた請求項１〜６のいず
れかに記載の遺伝学的に解毒された百日ぜきハロトキシ
ンの変異体を含む活性コンジュゲートの有効量を含むこ
とを特徴とするコンジュゲートワクチン。
【請求項９】百日ぜきトキシンの毒性に関与する百日ぜ
きトキシン中の少なくとも１つの特定のアミノ酸をコー
ドする少なくとも１つのヌクレオチド配列の削除または
置換のための部位指定突然部位によって形成された変異
ハロトキシンオペロンを有し、かつ免疫防御性を有しつ
つ遺伝学的に解毒されて１％以下の残存毒性を有する変
異百日ぜきトキシンを野生型トキシンの不存在下で発現
する能力を有するボルデテラ（Bordetella）株であっ
て、以下に示すアミノ酸の置換の少なくとも１つを含むこと
を特徴とするボルデテラ株。 a.前記少なくとも１つのアミノ酸がARG⁹であり、これが
LYS⁹またはHIS⁹に置換されたもの。 b.前記少なくとも１つのアミノ酸がARG⁵⁸であり、これ
がGLU⁵⁸で置換されたもの。 c.前記少なくとも１つのアミノ酸がGLU¹²⁹でありこれが
GLY¹²⁹、GLN¹²⁹またはASN¹²⁹で置換されたもの。
【請求項１０】ATCC 53833、53834、53835、53836、53
837、53974、53975または53976である請求項９に記載の
ボルデテラ株。
【請求項１１】百日ぜきホロトキシン中の百日ぜきの毒
性に関与する複数のアミノ酸残基の削除または置換のた
めに複数のコドンが削除または置換されている請求項９
または10に記載のBordetella株。
【請求項１２】免疫防御性を有しつつ遺伝学的に解毒さ
れた百日ぜきホロトキシンの変異体を製造する方法にお
いて、ａ）前記ホロトキシンの毒性に関与する少なくとも１つ
のアミノ酸残基を特定する過程と、ｂ）ホロトキシンオペロン部位指定突然変異を起させて
前記少なくとも１つのアミノ酸残基をコードするヌクレ
オチド配列を削除または置換し、変異したホロトキシン
オペロンを製造する過程と、ｃ）該変異したホロトキシンオペロンを、百日ぜきトキ
シン生産性が欠失したボルデテラ（Bordetella）株に導
入し、形質転換されたボルデテラ株を得る過程と、ｄ）得られた形質転換体を増殖させて、免疫防御性を維
持しつつ１％以下の残存毒性を有する、免疫防御性を有
しつつ遺伝学的に解毒されたホロトキシンを野生型トキ
シンの不存在下で製造する過程とを有する百日ぜきホロトキシン変異体の製造方法であ
って、以下に示すアミノ酸の置換の少なくとも１つを含むこと
を特徴とする変異体の製造方法。 a.前記少なくとも１つのアミノ酸がARG⁹であり、これが
LYS⁹またはHIS⁹に置換されたもの。 b.前記少なくとも１つのアミノ酸がARG⁵⁸であり、これ
がGLU⁵⁸で置換されたもの。 c.前記少なくとも１つのアミノ酸がGLU¹²⁹であり、これ
がGLY¹²⁹、GLN¹²⁹またはASN¹²⁹で置換されたもの。
【請求項１３】少なくとも１つのアミノ酸残基が、前記
ハロトキシン中の複数のアミノ酸であり、前記変異がこ
れら複数のアミノ酸の各々をコードするコドンにおいて
引き起こされる請求項12に記載の方法。
【請求項１４】前記変異したホロトキシンオペロンのボ
ルデテラ株への導入が、コンジュゲーションまたはエレ
クトロポレーションにより行われる請求項12または13に
記載の方法。
【請求項１５】前記ボルデテラ株が、ボルデテラ・ペル
ツシス（Bordetella pertussis）またはボルデテラ・パ
ラペルツシス（Bordetella parapertussis）である請求
項12〜14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】約１％以下の残存毒性を有する免疫防御
用の遺伝学的に解毒された百日ぜきトキシンの変異体を
コードする変異百日ぜきトキシン（tox）オペロンであ
って、天然toxオペロン中の少なくとも１つのコドンの
削除または置換によって得られ、この少なくとも１つの
コドンが天然ホロトキシン毒性に関与する天然ホロトキ
シン中の少なくとも１つのアミノ酸をコードするもので
ある変異百日ぜきtoxオペロンであって、以下に示すアミノ酸の置換の少なくとも１つを含むこと
を特徴とする変異百日ぜきtoxオペロン。 a.前記少なくとも１つのアミノ酸がARG⁹であり、これが
LYS⁹またはHIS⁹に置換されたもの。 b.前記少なくとも１つのアミノ酸がARG⁵⁸であり、これ
がGLU⁵⁸で置換されたもの。 c.前記少なくとも１つのアミノ酸がGLU¹²⁹であり、これ
がGLY¹²⁹、GLN¹²⁹またはASN¹²⁹で置換されたもの。
【請求項１７】0.5％未満の残存毒性を有する免疫防御
用の遺伝学的に解毒された百日ぜきトキシン変異体をコ
ードする請求項16に記載の変異百日ぜきtoxオペロン。
【請求項１８】天然ホロトキシンの１％以下のADP−リ
ボシルトランスフェラーゼ活性を有する免疫防御用の
遺伝学的に解毒された百日ぜきトキシン変異体をコード
する請求項16または17に記載の変異百日ぜきtoxオペロ
ン。
【請求項１９】複数のコドンが削除または置換されてい
る請求項16〜18のいずれかに記載の変異百日ぜきtoxオ
ペロン。