JP2936111B2 - 核酸の単離装置 - Google Patents
核酸の単離装置Info
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- JP2936111B2 JP2936111B2 JP8078898A JP7889896A JP2936111B2 JP 2936111 B2 JP2936111 B2 JP 2936111B2 JP 8078898 A JP8078898 A JP 8078898A JP 7889896 A JP7889896 A JP 7889896A JP 2936111 B2 JP2936111 B2 JP 2936111B2
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- outlet opening
- nucleic acids
- rim
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-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
Landscapes
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Centrifugal Separators (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸を単離する装
置、該装置の製造方法および該装置を用いて核酸を単離
する方法に関する。
置、該装置の製造方法および該装置を用いて核酸を単離
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】最
近、核酸により疾病をきわめて特異的に診断することが
可能であるので、核酸は化学的な検出方法における分析
物として受け入れられるようになってきている。たとえ
ば、核酸配列の分析により、ウイルスもしくは細菌感染
の高度に特殊化された検出、あるいは遺伝的病的素因の
決定が可能になる。これはとりわけ核酸に対する増幅方
法の導入によって可能になっている。それにもかかわら
ず、利用できるサンプル中の酸の量はサンプル液のほか
の成分に比べてひじょうに少ない。これらの成分の多く
は核酸の測定を妨げる可能性がある。このため、実際の
検出方法を実施する前に、サンプルに含まれる大多数の
成分から核酸を単離することが好都合であることが立証
されている。
近、核酸により疾病をきわめて特異的に診断することが
可能であるので、核酸は化学的な検出方法における分析
物として受け入れられるようになってきている。たとえ
ば、核酸配列の分析により、ウイルスもしくは細菌感染
の高度に特殊化された検出、あるいは遺伝的病的素因の
決定が可能になる。これはとりわけ核酸に対する増幅方
法の導入によって可能になっている。それにもかかわら
ず、利用できるサンプル中の酸の量はサンプル液のほか
の成分に比べてひじょうに少ない。これらの成分の多く
は核酸の測定を妨げる可能性がある。このため、実際の
検出方法を実施する前に、サンプルに含まれる大多数の
成分から核酸を単離することが好都合であることが立証
されている。
【０００３】この目的のために、初期の段階における核
酸の固体相への吸着がすでに提案されている。たとえ
ば、カオトロピック塩の存在下でガラス表面に結合する
核酸の特性が、プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエ
イ、第７６巻、６１５〜６１９頁（１９７９年）（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６、６１
５−６１９（１９７９））に記載されている。このばあ
い、アガロースマトリックスを溶解するためのＮａＩの
飽和溶液と共同して、アガロースゲルから核酸フラグメ
ントを単離するために研磨フリントガラスが使用され
た。この方法では、核酸の９５％以上が２５℃で２時間
後に結合され、それによって約１μｇのＤＮＡ／ｍｇガ
ラス粒子が結合された。引き続いてガラス粒子は数回洗
浄され、そののち核酸が溶離された。この一連の工程の
ために必要な時間は少なくとも３時間であった。
酸の固体相への吸着がすでに提案されている。たとえ
ば、カオトロピック塩の存在下でガラス表面に結合する
核酸の特性が、プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエ
イ、第７６巻、６１５〜６１９頁（１９７９年）（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６、６１
５−６１９（１９７９））に記載されている。このばあ
い、アガロースマトリックスを溶解するためのＮａＩの
飽和溶液と共同して、アガロースゲルから核酸フラグメ
ントを単離するために研磨フリントガラスが使用され
た。この方法では、核酸の９５％以上が２５℃で２時間
後に結合され、それによって約１μｇのＤＮＡ／ｍｇガ
ラス粒子が結合された。引き続いてガラス粒子は数回洗
浄され、そののち核酸が溶離された。この一連の工程の
ために必要な時間は少なくとも３時間であった。
【０００４】ガラス表面の核酸を精製する別の方法が開
発され、処理が改良され、必要な時間が短縮された。国
際公開第９１／０７６４８号公報には、底にプラスチッ
ク膜を含む円筒形のプラスチック容器が記載されてお
り、その容器もガラス繊維を含むことができる。やはり
このばあいも数回の洗浄と溶離ステップが必要である。
同様の方法がドイツ特許出願公開第４１２７２７６号明
細書に記載されており、核酸を含有する溶液が短期間の
うちにガラス繊維とのみ接触する。前記特許出願人から
該当する生成物を入手できる。前者のばあい、１００〜
２３，０００ｂｐの長さの分布で、５０ｎｇ〜３０μｇ
が結合容量として記載されている。収率は６０〜８５％
と記載されている。最大の効率を達成するために、製造
業者はサンプルを少なくとも２度通過させることを推奨
している。そうでなければ収率が少なくとも２５％低下
するからである。２３，０００ｂｐ以上の長さを有する
フラグメントに対する収率はせいぜい４０％である。
発され、処理が改良され、必要な時間が短縮された。国
際公開第９１／０７６４８号公報には、底にプラスチッ
ク膜を含む円筒形のプラスチック容器が記載されてお
り、その容器もガラス繊維を含むことができる。やはり
このばあいも数回の洗浄と溶離ステップが必要である。
同様の方法がドイツ特許出願公開第４１２７２７６号明
細書に記載されており、核酸を含有する溶液が短期間の
うちにガラス繊維とのみ接触する。前記特許出願人から
該当する生成物を入手できる。前者のばあい、１００〜
２３，０００ｂｐの長さの分布で、５０ｎｇ〜３０μｇ
が結合容量として記載されている。収率は６０〜８５％
と記載されている。最大の効率を達成するために、製造
業者はサンプルを少なくとも２度通過させることを推奨
している。そうでなければ収率が少なくとも２５％低下
するからである。２３，０００ｂｐ以上の長さを有する
フラグメントに対する収率はせいぜい４０％である。
【０００５】それぞれに具備される遠心分離管は、底が
鋭い円錐形をした容器において必要とされる結合容量に
応じて、数層のガラス繊維フリース（ｆｌｅｅｃｅ）を
含んでいる。小さな出口開口が底に配置される。遠心分
離管はまずガラス繊維フリースを上から容器内に導入
し、該フリースを底に押し付けることによって製造され
る。引き続いて、リングが同じ開口を通して容器内に挿
入され、その開口を通したのちに核酸溶液が加えられ、
それが容器の内壁と接触することによってガラス繊維フ
リースをしっかりと底の上に押し付け、こうして核酸含
有サンプルとインキュベートするあいだにフリースが浮
上するのを防止する。このタイプの遠心分離管の構成
は、今では確立されているように、多くの干渉サンプル
成分がそのなかに保持されるので、それらを完全に除去
するために数回の洗浄工程が必要であるという欠点を有
している。このことがつぎに核酸の収率減少を招いた
り、あるいは引き続く酵素反応の妨害を招く。市販され
ている製品のために、１００ｂｐの長さのフラグメント
に対して、９０％の収率で５μｇの結合容量が記載され
ている。ほかの製品では、２０μｇの結合容量で７５〜
９０％の収率が達成される。
鋭い円錐形をした容器において必要とされる結合容量に
応じて、数層のガラス繊維フリース（ｆｌｅｅｃｅ）を
含んでいる。小さな出口開口が底に配置される。遠心分
離管はまずガラス繊維フリースを上から容器内に導入
し、該フリースを底に押し付けることによって製造され
る。引き続いて、リングが同じ開口を通して容器内に挿
入され、その開口を通したのちに核酸溶液が加えられ、
それが容器の内壁と接触することによってガラス繊維フ
リースをしっかりと底の上に押し付け、こうして核酸含
有サンプルとインキュベートするあいだにフリースが浮
上するのを防止する。このタイプの遠心分離管の構成
は、今では確立されているように、多くの干渉サンプル
成分がそのなかに保持されるので、それらを完全に除去
するために数回の洗浄工程が必要であるという欠点を有
している。このことがつぎに核酸の収率減少を招いた
り、あるいは引き続く酵素反応の妨害を招く。市販され
ている製品のために、１００ｂｐの長さのフラグメント
に対して、９０％の収率で５μｇの結合容量が記載され
ている。ほかの製品では、２０μｇの結合容量で７５〜
９０％の収率が達成される。
【０００６】前述した先行技術では、核酸全体もしくは
ＲＮＡの単離ではなく、ＤＮＡの単離のみが記載されて
いる。
ＲＮＡの単離ではなく、ＤＮＡの単離のみが記載されて
いる。
【０００７】したがって、本発明の目的は核酸の単離用
の製品およびその製造方法を改善することである。
の製品およびその製造方法を改善することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この目的は、入口と出口
の開口およびこれらの開口のあいだに置かれる核酸を結
合するためのマテリアルを備えた、液体サンプルから核
酸を単離する装置によって達成され、出口開口はマテリ
アルを挿入したのち狭められる。本発明による容器は所
望の外形であってよいが、本質的に円筒形もしくは少な
くとも部分的に円錐形であることが好ましい。この容器
のとくに好ましい態様は、たとえば従来の遠心分離管の
管の形状をしている。かかる遠心分離管は約２５ｍｍの
長さと約８．５ｍｍの直径を有している。この管は好ま
しくは核酸含有サンプルを受け入れるように形成された
入口開口と面する構成部材を有している。とくに、この
空間の体積はサンプルを完全に保持するのに充分な大き
さである。付加的な構造要素を入口開口に設けることが
でき、それは入口開口をキャップで閉じることを可能に
する。かかる構成はエッペンドルフ・キャップ（Ｅｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ ｃａｐ）として知られている。
の開口およびこれらの開口のあいだに置かれる核酸を結
合するためのマテリアルを備えた、液体サンプルから核
酸を単離する装置によって達成され、出口開口はマテリ
アルを挿入したのち狭められる。本発明による容器は所
望の外形であってよいが、本質的に円筒形もしくは少な
くとも部分的に円錐形であることが好ましい。この容器
のとくに好ましい態様は、たとえば従来の遠心分離管の
管の形状をしている。かかる遠心分離管は約２５ｍｍの
長さと約８．５ｍｍの直径を有している。この管は好ま
しくは核酸含有サンプルを受け入れるように形成された
入口開口と面する構成部材を有している。とくに、この
空間の体積はサンプルを完全に保持するのに充分な大き
さである。付加的な構造要素を入口開口に設けることが
でき、それは入口開口をキャップで閉じることを可能に
する。かかる構成はエッペンドルフ・キャップ（Ｅｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ ｃａｐ）として知られている。
【０００９】核酸を結合するためのマテリアルは出口開
口の近くにある装置領域に置かれることが好ましい。こ
のことは、液体小滴を保持する危険性を減少させ、それ
によって汚染の危険性をも減少させるために、マテリア
ルと出口開口とのあいだに置かれる管内の空間を好まし
くは小さく保持すべきであることを意味している。核酸
を結合するためのマテリアルは装置に固定される。この
目的のために、装置を破壊せずには除去できない保持デ
バイスが入口開口の方向に設けられる。この保持デバイ
スも容器と同じ材料で作られることが好ましい。この態
様では、保持デバイスを具備する本発明による容器を射
出成形で製造できるので、この装置はとくに好都合であ
る。保持デバイスは容器の内壁から内部空間へと突出
し、入口開口の方向に傾斜することが好ましい。これら
の要件は、たとえば内部空間内の円周リムもしくは突起
によって達成されうる。入口開口に向かって傾斜するこ
とで、鈍角のみが内部空間に生じることが保証される。
公知の容器の主な欠点は液体サンプル等の液体が直角も
しくはより鋭角に保持されること、またリングが容器の
内壁に対して完全に配置されていないばあい、洗浄工程
の効率を低下させることであることが立証されている。
さらに、比較的に重大な工程、主としてリングの挿入が
この容器の製造段階で省かれる。さらに、容器の製造中
に保持デバイスを設けられることは、保持デバイスを幅
広く選択できるようにし、したがって、構造部材が鋭角
でぶつかることを避けることができる。
口の近くにある装置領域に置かれることが好ましい。こ
のことは、液体小滴を保持する危険性を減少させ、それ
によって汚染の危険性をも減少させるために、マテリア
ルと出口開口とのあいだに置かれる管内の空間を好まし
くは小さく保持すべきであることを意味している。核酸
を結合するためのマテリアルは装置に固定される。この
目的のために、装置を破壊せずには除去できない保持デ
バイスが入口開口の方向に設けられる。この保持デバイ
スも容器と同じ材料で作られることが好ましい。この態
様では、保持デバイスを具備する本発明による容器を射
出成形で製造できるので、この装置はとくに好都合であ
る。保持デバイスは容器の内壁から内部空間へと突出
し、入口開口の方向に傾斜することが好ましい。これら
の要件は、たとえば内部空間内の円周リムもしくは突起
によって達成されうる。入口開口に向かって傾斜するこ
とで、鈍角のみが内部空間に生じることが保証される。
公知の容器の主な欠点は液体サンプル等の液体が直角も
しくはより鋭角に保持されること、またリングが容器の
内壁に対して完全に配置されていないばあい、洗浄工程
の効率を低下させることであることが立証されている。
さらに、比較的に重大な工程、主としてリングの挿入が
この容器の製造段階で省かれる。さらに、容器の製造中
に保持デバイスを設けられることは、保持デバイスを幅
広く選択できるようにし、したがって、構造部材が鋭角
でぶつかることを避けることができる。
【００１０】しかしながら、保持デバイスは円周上にな
い構造部材、たとえば比較できるレベルで規則的もしく
は不規則に配置される突起であってもよい。核酸を結合
するためのマテリアルは公知である。ガラス製の表面を
具備するマテリアルがとくに好ましい。このマテリアル
は、核酸を単離するために使用されるあいだに外形に主
要な変更を生じさせることなく、本発明による装置の内
壁の形状にフリースを容易に嵌合させることができるの
で、フリースの形態でとくに好ましく使用される。加え
て、フリースは液体を透過しやすい。４０〜１００ｍｇ
／ｃｃｍ（ｇ／ｃｄｍ）の厚さのフリースがとくに好ま
しいことが立証されている。
い構造部材、たとえば比較できるレベルで規則的もしく
は不規則に配置される突起であってもよい。核酸を結合
するためのマテリアルは公知である。ガラス製の表面を
具備するマテリアルがとくに好ましい。このマテリアル
は、核酸を単離するために使用されるあいだに外形に主
要な変更を生じさせることなく、本発明による装置の内
壁の形状にフリースを容易に嵌合させることができるの
で、フリースの形態でとくに好ましく使用される。加え
て、フリースは液体を透過しやすい。４０〜１００ｍｇ
／ｃｃｍ（ｇ／ｃｄｍ）の厚さのフリースがとくに好ま
しいことが立証されている。
【００１１】好ましい態様では、核酸を結合するための
マテリアルは液体透過性の多孔性マトリックス（以下、
支持フリースという）によって出口開口に向かってその
全領域にわたって支持される。かかる液体透過性マトリ
ックスは、たとえば液体成分に対して比較的不活性であ
り、可及的にそれら成分と結合しないマテリアル、ある
いは核酸を結合するマテリアルで作られるフリースであ
る。このばあい、ポリエステルまたはポリプロピレンが
とくに好ましいことがわかっている。このマトリックス
は出口開口から好ましくはほぼ完全に（つまり、９０％
以上）核酸を結合するためのマテリアルを単離するの
で、いかなる液体も核酸を結合するためのマテリアルか
ら直接出口開口に流れることはない。このマトリックス
は２つの機能を有している。まず、しっかりと固定され
ない核酸を結合するためのマテリアルの繊維を保持する
働きをし（収率の改善）、つぎに、このマトリックスは
容器の出口開口を、核酸を結合するためのマテリアルが
該開口を通って容器内へと挿入されうる程度に充分広く
保持できるようにし、引き続いて出口開口が狭められる
ようにする。核酸を結合するためのマテリアルが粒子状
マトリックスでできているばあい、このマテリアルのサ
ンプル保持空間への巻き込みを避けるために、このマテ
リアルは入口開口の側でも液体透過性の多孔性マトリッ
クスによって支持される。
マテリアルは液体透過性の多孔性マトリックス（以下、
支持フリースという）によって出口開口に向かってその
全領域にわたって支持される。かかる液体透過性マトリ
ックスは、たとえば液体成分に対して比較的不活性であ
り、可及的にそれら成分と結合しないマテリアル、ある
いは核酸を結合するマテリアルで作られるフリースであ
る。このばあい、ポリエステルまたはポリプロピレンが
とくに好ましいことがわかっている。このマトリックス
は出口開口から好ましくはほぼ完全に（つまり、９０％
以上）核酸を結合するためのマテリアルを単離するの
で、いかなる液体も核酸を結合するためのマテリアルか
ら直接出口開口に流れることはない。このマトリックス
は２つの機能を有している。まず、しっかりと固定され
ない核酸を結合するためのマテリアルの繊維を保持する
働きをし（収率の改善）、つぎに、このマトリックスは
容器の出口開口を、核酸を結合するためのマテリアルが
該開口を通って容器内へと挿入されうる程度に充分広く
保持できるようにし、引き続いて出口開口が狭められる
ようにする。核酸を結合するためのマテリアルが粒子状
マトリックスでできているばあい、このマテリアルのサ
ンプル保持空間への巻き込みを避けるために、このマテ
リアルは入口開口の側でも液体透過性の多孔性マトリッ
クスによって支持される。
【００１２】本発明による装置の特徴は、核酸を結合す
るためのマテリアルを導入したのち出口開口が狭められ
ることである。出口開口は好ましくは核酸を結合するた
めのマテリアルと支持マトリックスが出口開口から漏れ
ない程度に狭められる。マテリアルもしくはマトリック
スが硬質であればあるほど、それほど著しくくびれる必
要がなくなる。好ましくは、くびれは管壁の周囲まわり
を内向きに延びるリムであり、たとえば管の直径が８ｍ
ｍのばあい、リムはそれぞれの側から少なくとも０．５
ｍｍ、好ましくは０．７５ｍｍから１．５ｍｍの間で管
内部へと突出する。突起の下限はマテリアルとマトリッ
クスの保持力によって制限される一方、上限は出口開口
を通るフリースの吸引によって可及的に完全に制限され
る。
るためのマテリアルを導入したのち出口開口が狭められ
ることである。出口開口は好ましくは核酸を結合するた
めのマテリアルと支持マトリックスが出口開口から漏れ
ない程度に狭められる。マテリアルもしくはマトリック
スが硬質であればあるほど、それほど著しくくびれる必
要がなくなる。好ましくは、くびれは管壁の周囲まわり
を内向きに延びるリムであり、たとえば管の直径が８ｍ
ｍのばあい、リムはそれぞれの側から少なくとも０．５
ｍｍ、好ましくは０．７５ｍｍから１．５ｍｍの間で管
内部へと突出する。突起の下限はマテリアルとマトリッ
クスの保持力によって制限される一方、上限は出口開口
を通るフリースの吸引によって可及的に完全に制限され
る。
【００１３】さらに、本発明は入口と出口の開口を備え
た、液体サンプルから核酸を単離する容器およびこれら
の開口のあいだに置かれる核酸を結合するマテリアルの
製造方法に関し、該方法は出口開口を通り入口開口に向
かって容器に装着された保持デバイスまでマテリアルを
挿入し、出口開口を狭めることにより、マテリアルを保
持デバイスとくびれ部分のあいだで保持する。くびれ
は、たとえば、熱的にフランジを作ることによって、あ
るいは熱的に固定することによって達成される。この製
造方法はマテリアルの固定に関してとくに簡単で、とく
に信頼できるものである。
た、液体サンプルから核酸を単離する容器およびこれら
の開口のあいだに置かれる核酸を結合するマテリアルの
製造方法に関し、該方法は出口開口を通り入口開口に向
かって容器に装着された保持デバイスまでマテリアルを
挿入し、出口開口を狭めることにより、マテリアルを保
持デバイスとくびれ部分のあいだで保持する。くびれ
は、たとえば、熱的にフランジを作ることによって、あ
るいは熱的に固定することによって達成される。この製
造方法はマテリアルの固定に関してとくに簡単で、とく
に信頼できるものである。
【００１４】本発明による容器は好ましくは射出成形が
可能な材料で作られ、たとえば、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリカーボネート、もしくはポリウレタン、
ポリプロピレンがとくに好ましい。
可能な材料で作られ、たとえば、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリカーボネート、もしくはポリウレタン、
ポリプロピレンがとくに好ましい。
【００１５】さらに、本発明の主題は核酸を単離するた
めに、本発明によるマテリアルを使用することであり、
とくに、入口開口を通して発明の容器にサンプルを導入
することにより液体サンプルから核酸を単離する方法、
マテリアルを通るサンプルの通路、および核酸のマテリ
アルへの結合の廃止である。
めに、本発明によるマテリアルを使用することであり、
とくに、入口開口を通して発明の容器にサンプルを導入
することにより液体サンプルから核酸を単離する方法、
マテリアルを通るサンプルの通路、および核酸のマテリ
アルへの結合の廃止である。
【００１６】典型的な方法では、所望量の液体サンプル
が容器内にピペッティングにより導入される。そのの
ち、サンプルがマテリアルを通過する。これは、たとえ
ば、遠心単離機にかけることによって達成され、そのば
あい、液体がマテリアルと出口開口を通って容器から回
転しながら放出される。この方法では、核酸がマトリッ
クス上に固定化される一方、残りの液体サンプルは放出
される。引き続いてマトリックスを中（ｍｅｄｉｕｍ）
塩濃度洗浄緩衝液で１度洗浄することが好ましく、この
手段によって、単離されない残留液体サンプルおよび成
分がマテリアルから取り除かれる。
が容器内にピペッティングにより導入される。そのの
ち、サンプルがマテリアルを通過する。これは、たとえ
ば、遠心単離機にかけることによって達成され、そのば
あい、液体がマテリアルと出口開口を通って容器から回
転しながら放出される。この方法では、核酸がマトリッ
クス上に固定化される一方、残りの液体サンプルは放出
される。引き続いてマトリックスを中（ｍｅｄｉｕｍ）
塩濃度洗浄緩衝液で１度洗浄することが好ましく、この
手段によって、単離されない残留液体サンプルおよび成
分がマテリアルから取り除かれる。
【００１７】そののち、マトリックスに固定化された核
酸は低（ｌｏｗ）塩濃度緩衝液によって溶離される。か
かる緩衝液はドイツ特許出願第３７２４４４２号明細書
およびアナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１７５、１９６〜２
０１頁（１９８８）から知られている。２００ｍＭ以下
の塩化ナトリウムである低塩濃度緩衝液は、たとえば、
１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０またはＨ2Ｏが使用されることが好ましい。本発
明によるマトリックスで比較的高い収率が達成される。
酸は低（ｌｏｗ）塩濃度緩衝液によって溶離される。か
かる緩衝液はドイツ特許出願第３７２４４４２号明細書
およびアナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１７５、１９６〜２
０１頁（１９８８）から知られている。２００ｍＭ以下
の塩化ナトリウムである低塩濃度緩衝液は、たとえば、
１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０またはＨ2Ｏが使用されることが好ましい。本発
明によるマトリックスで比較的高い収率が達成される。
【００１８】
【発明の実施の形態】図１には本発明によるとくに好適
な容器の横断面が示されている。
な容器の横断面が示されている。
【００１９】図示されている本発明の容器は、一端にキ
ャップ３によって閉じることができる入口開口２を有す
る本質的に円筒状部材１で構成される。出口開口４に向
かって、保持デバイス５があり、その傾き６を明らかに
見ることができる。好ましい態様では、保持デバイスは
円筒形本体１と同じ材質で作られる円周リムである。核
酸を結合するためのマテリアル７は保持デバイスと接し
ている。マテリアルは支持フリース８によって出口開口
４と分離される。支持フリースはリム９によって容器内
に固定される。
ャップ３によって閉じることができる入口開口２を有す
る本質的に円筒状部材１で構成される。出口開口４に向
かって、保持デバイス５があり、その傾き６を明らかに
見ることができる。好ましい態様では、保持デバイスは
円筒形本体１と同じ材質で作られる円周リムである。核
酸を結合するためのマテリアル７は保持デバイスと接し
ている。マテリアルは支持フリース８によって出口開口
４と分離される。支持フリースはリム９によって容器内
に固定される。
【００２０】本発明は以下の実施例によって一層明確に
なるであろう。
なるであろう。
【００２１】実施例１ 本発明による遠心分離管の製造 約２５ｍｍの長さと約８．５ｍｍの直径を有する、図２
の縦断面で示した円筒状部材１たる遠心分離管の本体
は、ポリプロピレンＰＰＮ１０６０“ｎａｔｕｒ”から
射出成形によって製造される。核酸を結合するためのマ
テリアル７たる１つのガラス繊維フリース（ＷＦ２６４
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、面積重量６０ｇ／ｍ
2）と支持フリース８は射出成形器に挿入され、パンチ
で孔があけられる。所望の結合容量に応じて、いくつか
のガラスフリース７が、たとえば７個のガラスフリース
が使用される。パンチで孔があけられたフリースは図３
のＡおよび図３のＢに示すように、出口開口側から遠心
分離管に挿入される。そののち、出口開口４は、なお約
６０℃の温度の温プラスチック（ｗａｒｍ ｐｌａｓｔ
ｉｃ）をダイによって再成形することによって、両方の
フリースが図４に示されるようにしっかりと固定される
程度にまで狭められる。
の縦断面で示した円筒状部材１たる遠心分離管の本体
は、ポリプロピレンＰＰＮ１０６０“ｎａｔｕｒ”から
射出成形によって製造される。核酸を結合するためのマ
テリアル７たる１つのガラス繊維フリース（ＷＦ２６４
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、面積重量６０ｇ／ｍ
2）と支持フリース８は射出成形器に挿入され、パンチ
で孔があけられる。所望の結合容量に応じて、いくつか
のガラスフリース７が、たとえば７個のガラスフリース
が使用される。パンチで孔があけられたフリースは図３
のＡおよび図３のＢに示すように、出口開口側から遠心
分離管に挿入される。そののち、出口開口４は、なお約
６０℃の温度の温プラスチック（ｗａｒｍ ｐｌａｓｔ
ｉｃ）をダイによって再成形することによって、両方の
フリースが図４に示されるようにしっかりと固定される
程度にまで狭められる。
【００２２】実施例２ 大腸菌培養からのプラスミドＤＮＡの単離 大腸菌 ｘ ｐＵＣ１９の培養：２５ｍｌのＬＢ培地＋
アンピシリン（１５０μｇ／ｍｌ）に１つのコロニーを
播種し、振とうしながら３７℃で一晩インキュベートし
た。ＯＤ600測定で２．０（約２×１０9細胞／ｍｌに相
当する）の値を生じた。様々な大腸菌株を使用した。
アンピシリン（１５０μｇ／ｍｌ）に１つのコロニーを
播種し、振とうしながら３７℃で一晩インキュベートし
た。ＯＤ600測定で２．０（約２×１０9細胞／ｍｌに相
当する）の値を生じた。様々な大腸菌株を使用した。
【００２３】プラスミドＤＮＡの単離：１．５ｍｌの細
菌培養をエッペンドルフ反応容器に移し、エッペンドル
フベンチ遠心分離機タイプ５４１５Ｃにおいて、最大速
度で約３０秒間遠心分離した。上清を除去し、沈澱物を
２５０μｌの緩衝液Ｉ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０
ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ、
ｐＨ８．０）に完全に再懸濁し、２５０μｌの緩衝液Ｉ
Ｉ（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）と注意深く混合した。細胞は完全に溶解し、澄んだ
溶液となる。こうしてえられた混合物を３５０μｌの緩
衝液ＩＩＩ（２．９Ｍ塩酸グアジニン、０．６５Ｍ酢酸
カリウム、ｐＨ４．１５）と混合し、約３分間氷上にイ
ンキュベートする。遠心分離によって白色の沈澱物が形
成され、フィルターチューブを受け入れ容器に挿入し、
上清をフィルターチューブに注ぐ。液体を遠心分離によ
ってガラスフリースを通して移動させる。溶離液を捨
て、５００μｌの洗浄用緩衝液Ｉ（５Ｍのグアニジニウ
ムＨＣｌ、２０ｍＭトリス、３７％エタノール、ｐＨ
６．６５）を加え、遠心分離に付す。洗浄用緩衝液Ｉの
使用は、とくにヌクレアーゼ・リッチの大腸菌株に対し
ては任意である。引き続いて、５００μｌの洗浄用緩衝
液ＩＩ（２０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭトリス、８０％エタ
ノール、ｐＨ７．５）をフィルターチューブに加え、前
述したように遠心分離に付す。つぎにフィルターチュー
ブをエッペンドルフ反応容器に移し、プラスミドＤＮＡ
を１００ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１
ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）内で溶離する。
菌培養をエッペンドルフ反応容器に移し、エッペンドル
フベンチ遠心分離機タイプ５４１５Ｃにおいて、最大速
度で約３０秒間遠心分離した。上清を除去し、沈澱物を
２５０μｌの緩衝液Ｉ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０
ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ、
ｐＨ８．０）に完全に再懸濁し、２５０μｌの緩衝液Ｉ
Ｉ（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）と注意深く混合した。細胞は完全に溶解し、澄んだ
溶液となる。こうしてえられた混合物を３５０μｌの緩
衝液ＩＩＩ（２．９Ｍ塩酸グアジニン、０．６５Ｍ酢酸
カリウム、ｐＨ４．１５）と混合し、約３分間氷上にイ
ンキュベートする。遠心分離によって白色の沈澱物が形
成され、フィルターチューブを受け入れ容器に挿入し、
上清をフィルターチューブに注ぐ。液体を遠心分離によ
ってガラスフリースを通して移動させる。溶離液を捨
て、５００μｌの洗浄用緩衝液Ｉ（５Ｍのグアニジニウ
ムＨＣｌ、２０ｍＭトリス、３７％エタノール、ｐＨ
６．６５）を加え、遠心分離に付す。洗浄用緩衝液Ｉの
使用は、とくにヌクレアーゼ・リッチの大腸菌株に対し
ては任意である。引き続いて、５００μｌの洗浄用緩衝
液ＩＩ（２０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭトリス、８０％エタ
ノール、ｐＨ７．５）をフィルターチューブに加え、前
述したように遠心分離に付す。つぎにフィルターチュー
ブをエッペンドルフ反応容器に移し、プラスミドＤＮＡ
を１００ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１
ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）内で溶離する。
【００２４】表１は単離されたプラスミドＤＮＡの収率
と純度を示す。
と純度を示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】実施例３ ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという）の反応生
成物の精製 フィルターチューブの分離特性：１００μｌのＴＥ中１
０μｇの分子量スタンダードＶＩＩＩ（ベーリンガー・
マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）社製、フラグメントの長さ（ｂｐ）：１１１４、９
００、６９２、５０１、４８９、４０４、３２０、２４
２、１９０、１４７、１２４、１１０、６７、３７、３
４、２６、１９）をウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ
という）（２０ｍｇ／ｍｌ）と混合する。５００μｌの
ＮＡ結合用緩衝液（３Ｍグアニジンチオシアネート、１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５％エタノール（ｖ／ｖ）、ｐ
Ｈ６．６、２５℃）をこの混合物に加え、注意深く混合
する。溶液をフィルターチューブに加え、エッペンドル
フベンチ遠心分離機タイプ５４１５Ｃにおいて約３０秒
間遠心分離に付す。濾液を集め、のちの分析のために保
管することができる。フリースを５００μｌの洗浄用緩
衝液ＩＩで洗浄し、引き続いて短い遠心分離によって乾
燥させる。結合された核酸を５０μｌのＴＥで溶離す
る。
成物の精製 フィルターチューブの分離特性：１００μｌのＴＥ中１
０μｇの分子量スタンダードＶＩＩＩ（ベーリンガー・
マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）社製、フラグメントの長さ（ｂｐ）：１１１４、９
００、６９２、５０１、４８９、４０４、３２０、２４
２、１９０、１４７、１２４、１１０、６７、３７、３
４、２６、１９）をウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ
という）（２０ｍｇ／ｍｌ）と混合する。５００μｌの
ＮＡ結合用緩衝液（３Ｍグアニジンチオシアネート、１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５％エタノール（ｖ／ｖ）、ｐ
Ｈ６．６、２５℃）をこの混合物に加え、注意深く混合
する。溶液をフィルターチューブに加え、エッペンドル
フベンチ遠心分離機タイプ５４１５Ｃにおいて約３０秒
間遠心分離に付す。濾液を集め、のちの分析のために保
管することができる。フリースを５００μｌの洗浄用緩
衝液ＩＩで洗浄し、引き続いて短い遠心分離によって乾
燥させる。結合された核酸を５０μｌのＴＥで溶離す
る。
【００２７】ゲル電気泳動および銀染色：ファスト（Ｐ
ｈａｓｔ）・システム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）社製）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、モデルタンパク質ＢＳＡと小さなＤＮＡフラグ
メントの分離を調べる。
ｈａｓｔ）・システム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）社製）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、モデルタンパク質ＢＳＡと小さなＤＮＡフラグ
メントの分離を調べる。
【００２８】４μｌの溶離液を１μｌの５ｘサンプル用
緩衝液と混合する。１μｌの５ｘサンプル用緩衝液と混
合した４μｌの長さスタンダードＶＩＩＩとＴＥ緩衝液
中１：１００希釈のＢＳＡ溶液４μｌを対照として使用
する。
緩衝液と混合する。１μｌの５ｘサンプル用緩衝液と混
合した４μｌの長さスタンダードＶＩＩＩとＴＥ緩衝液
中１：１００希釈のＢＳＡ溶液４μｌを対照として使用
する。
【００２９】サンプルをエッペンドルフ遠心分離機で手
短に遠心分離し、サンプル３μｌを６／４ｃｏｍｂ（フ
ァルマシア社製）に加え、未変性（ｎａｔｉｖｅ）の緩
衝液ストリップ（ファルマシア社製）を用いるファスト
ゲル（勾配８〜２５％（ファルマシア社製））内で分離
する。
短に遠心分離し、サンプル３μｌを６／４ｃｏｍｂ（フ
ァルマシア社製）に加え、未変性（ｎａｔｉｖｅ）の緩
衝液ストリップ（ファルマシア社製）を用いるファスト
ゲル（勾配８〜２５％（ファルマシア社製））内で分離
する。
【００３０】引き続いて、サンプルをファスト・システ
ム・ディベロプメント・ユニット（Ｐｈａｓｔ ｓｙｓ
ｔｅｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｕｎｉｔ、ファルマ
シア社製）を用いて銀染色により検出する。
ム・ディベロプメント・ユニット（Ｐｈａｓｔ ｓｙｓ
ｔｅｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｕｎｉｔ、ファルマ
シア社製）を用いて銀染色により検出する。
【００３１】評価：溶離液から個々のＤＮＡフラグメン
トを対照の長さ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｅｎｇｔｈ ｓｔ
ａｎｄａｒｄ）スタンダードＶＩＩＩしたがって単離す
る溶離液中の１００ｂｐより小さいフラグメントをフィ
ルターチューブを用いて精製することにより単離する。
加えて、ＢＳＡ対照レーンに対応するタンパク質バンド
は見られない。 ファストゲル分離プログラム：
トを対照の長さ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｅｎｇｔｈ ｓｔ
ａｎｄａｒｄ）スタンダードＶＩＩＩしたがって単離す
る溶離液中の１００ｂｐより小さいフラグメントをフィ
ルターチューブを用いて精製することにより単離する。
加えて、ＢＳＡ対照レーンに対応するタンパク質バンド
は見られない。 ファストゲル分離プログラム：
【００３２】
【表２】
【００３３】分離ののち、ゲルを２５％トリクロロ酢酸
中で５分間インキュベートする。 ファストゲル展開プログラム：
中で５分間インキュベートする。 ファストゲル展開プログラム：
【００３４】
【表３】
【００３５】ＰＣＲ反応生成物の精製：５００ｂｐ、７
５０ｂｐ、１５００ｐ、３０００ｂｐの長さのＰＣＲ生
成物の製造用マトリックスとしてラムダファージのＤＮ
Ａを使用する。以下のＰＣＲ用調製物を一緒にピペット
で取り、混合し、パーキン・エルマー型９６００サーモ
サイクラーでインキュベートする。
５０ｂｐ、１５００ｐ、３０００ｂｐの長さのＰＣＲ生
成物の製造用マトリックスとしてラムダファージのＤＮ
Ａを使用する。以下のＰＣＲ用調製物を一緒にピペット
で取り、混合し、パーキン・エルマー型９６００サーモ
サイクラーでインキュベートする。
【００３６】
【表４】
【００３７】すべてのサンプルは、ベーリンガー・マン
ハイム社製 ＰＣＲコアキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（カタ
ログ番号１ ５７８ ５５３））を用いた。
ハイム社製 ＰＣＲコアキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（カタ
ログ番号１ ５７８ ５５３））を用いた。
【００３８】
【表５】
【００３９】ＰＣＲ生成物を前記のように精製し、ファ
ストゲル・システムで分析した。それと並行して、精製
する前にそれぞれのケースの反応生成物の１つのアリコ
ートを分析した。
ストゲル・システムで分析した。それと並行して、精製
する前にそれぞれのケースの反応生成物の１つのアリコ
ートを分析した。
【００４０】評価：精製前に比較されたすべてのＰＣＲ
生成物において過剰のプライマーを取り除いた。１．４
〜４μｇのＰＣＲ生成物の単離が可能であった。
生成物において過剰のプライマーを取り除いた。１．４
〜４μｇのＰＣＲ生成物の単離が可能であった。
【００４１】ＰＣＲ生成物のクローニング：ｐＵＣＩＱ
１７（３６３２ｂｐ、ベーリンガー・マンハイム社製）
を制限酵素ＤｒａＩＩで線状にし、以下のＰＣＲ混合物
で増幅した： ＰＣＲ混合物： ＰＣＲプログラム（ＰＥ ９６００） ｐＵＣＩＱ１７ １０ｎｇ １８サイクル： プライマー１ ２μＭ １０秒 ９４℃ プライマー２ ２μＭ ３０秒 ５７℃ １０ｘ緩衝液 ５０μｌ ４分 ７２℃ ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ Ｔａｑポリメラーゼ ２．５Ｕ Ｈ2Ｏ ５００μｌまで
１７（３６３２ｂｐ、ベーリンガー・マンハイム社製）
を制限酵素ＤｒａＩＩで線状にし、以下のＰＣＲ混合物
で増幅した： ＰＣＲ混合物： ＰＣＲプログラム（ＰＥ ９６００） ｐＵＣＩＱ１７ １０ｎｇ １８サイクル： プライマー１ ２μＭ １０秒 ９４℃ プライマー２ ２μＭ ３０秒 ５７℃ １０ｘ緩衝液 ５０μｌ ４分 ７２℃ ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ Ｔａｑポリメラーゼ ２．５Ｕ Ｈ2Ｏ ５００μｌまで
【００４２】すべての試薬はベーリンガー・マンハイム
社製 ＰＣＲコアキットからのものを用いた。
社製 ＰＣＲコアキットからのものを用いた。
【００４３】プライマーはヌクレオチド３５００および
３６３２で結合し、３４９３ｂｐのＰＣＲ生成物を生じ
る。それらは制限酵素ＣｌａＩ用の開裂部位を含み、こ
の開裂部位はプラスミドｐＵＫＩＱ１７には存在しな
い。 プライマー１：5′-AGCTTATCGATGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3′（配列番号１） プライマー２：5′-AGCTTATCGATAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGC-3′（配列番号２）
３６３２で結合し、３４９３ｂｐのＰＣＲ生成物を生じ
る。それらは制限酵素ＣｌａＩ用の開裂部位を含み、こ
の開裂部位はプラスミドｐＵＫＩＱ１７には存在しな
い。 プライマー１：5′-AGCTTATCGATGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3′（配列番号１） プライマー２：5′-AGCTTATCGATAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGC-3′（配列番号２）
【００４４】ＰＣＲ反応に引き続いて、反応生成物を前
記の方法に従って精製する。比較において精製はポリエ
チレングリコール沈澱（ＰＥＧ）（バーンズ ダブリ
ュ．エム．（Ｂａｒｎｅｓ Ｗ．Ｍ．）（１９９２）ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）１１２、２９頁）を伴う沈澱によって
実施される。引き続く再結合反応を妨害する成分をこの
手段によって除去する。両サンプルを制限酵素ＣｌａＩ
で開裂し、アガロースゲルに単離する。ＤＮＡフラグメ
ントをアガロースゲルから溶離する。このために使用す
る方法は標準の方法であって、たとえば、サムブロッ
ク、ジェイ．フリッシュ、イー．エフ．およびマニティ
ス、ティー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｅ．Ｆ． ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）（１９８９）
モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）ア ラボラトリー マニュアル（Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版、ＣＳＨ ラ
ボラトリー プレス、コールド スプリング ハーバー
（ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州
（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているものである。
記の方法に従って精製する。比較において精製はポリエ
チレングリコール沈澱（ＰＥＧ）（バーンズ ダブリ
ュ．エム．（Ｂａｒｎｅｓ Ｗ．Ｍ．）（１９９２）ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）１１２、２９頁）を伴う沈澱によって
実施される。引き続く再結合反応を妨害する成分をこの
手段によって除去する。両サンプルを制限酵素ＣｌａＩ
で開裂し、アガロースゲルに単離する。ＤＮＡフラグメ
ントをアガロースゲルから溶離する。このために使用す
る方法は標準の方法であって、たとえば、サムブロッ
ク、ジェイ．フリッシュ、イー．エフ．およびマニティ
ス、ティー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｅ．Ｆ． ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）（１９８９）
モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）ア ラボラトリー マニュアル（Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版、ＣＳＨ ラ
ボラトリー プレス、コールド スプリング ハーバー
（ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州
（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているものである。
【００４５】ラピッド・ＤＮＡ・リゲーション・キット
（Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）
（ベーリンガー・マンハイム社 カタログ番号１ ６３
５ ３７９）を使用し、キットの指示に従ってサンプル
（最大３０ｎｇ）を再結合させ、コンピテントな大腸菌
ＤＨ５α細胞に変質転換させる。細胞をＴＮ Ａｐ １
００ Ｘ−Ｇａｌプレート上に縦状に付け、３７℃で一
晩インキュベートする。つぎの日にコロニーを数える。
その結果を表６に示す。
（Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）
（ベーリンガー・マンハイム社 カタログ番号１ ６３
５ ３７９）を使用し、キットの指示に従ってサンプル
（最大３０ｎｇ）を再結合させ、コンピテントな大腸菌
ＤＨ５α細胞に変質転換させる。細胞をＴＮ Ａｐ １
００ Ｘ−Ｇａｌプレート上に縦状に付け、３７℃で一
晩インキュベートする。つぎの日にコロニーを数える。
その結果を表６に示す。
【００４６】
【表６】
【００４７】フィルターチューブによって精製したばあ
いのコロニーの数はＰＥＧによって精製した時のものと
同じ桁の大きさである。このように、はるかに簡単なフ
ィルターチューブを用いる方法は、かなり多くの時間を
消費するＰＥＧ方法のものに対してかなりの純度の核酸
を生じさせる。
いのコロニーの数はＰＥＧによって精製した時のものと
同じ桁の大きさである。このように、はるかに簡単なフ
ィルターチューブを用いる方法は、かなり多くの時間を
消費するＰＥＧ方法のものに対してかなりの純度の核酸
を生じさせる。
【００４８】実施例４ スロット付きのフランジリムおよびより小さな出口開口
を具備する態様本発明による遠心分離管のさらなる態様
では、図５に示すように、出口開口はさらに制限され
る。この態様では、出口開口のフランジリムが（図６に
示すように）スリットを有している。この配置を用い
て、遠心分離ののち装置内に多量の残留液を残すことな
く、とくに粘度の高い溶液を遠心分離することが可能で
ある。
を具備する態様本発明による遠心分離管のさらなる態様
では、図５に示すように、出口開口はさらに制限され
る。この態様では、出口開口のフランジリムが（図６に
示すように）スリットを有している。この配置を用い
て、遠心分離ののち装置内に多量の残留液を残すことな
く、とくに粘度の高い溶液を遠心分離することが可能で
ある。
【００４９】実施例５ 実施例１および実施例４に示した発明による遠心分離装
置の選ばれた態様は、遠心分離ののち液体が装置のデッ
ドスペースに残留するのを防止する。不完全な遠心分離
は収率の低下を招き、単離される核酸の純度の低下を招
く。
置の選ばれた態様は、遠心分離ののち液体が装置のデッ
ドスペースに残留するのを防止する。不完全な遠心分離
は収率の低下を招き、単離される核酸の純度の低下を招
く。
【００５０】５００ｎｌの水を満たしたのちに、引き続
き６０００×ｇで２分間遠心分離に付したばあいに残留
する液体について調べる。結果を表７に示す。
き６０００×ｇで２分間遠心分離に付したばあいに残留
する液体について調べる。結果を表７に示す。
【００５１】
【表７】
【００５２】表７より本発明のチューブは残留する液体
がきわめて少ないことがわかる。これはとくに保持デバ
イスの傾斜をつけること（ｂｕｅｌｌｉｎｇ）に起因す
るものである。
がきわめて少ないことがわかる。これはとくに保持デバ
イスの傾斜をつけること（ｂｕｅｌｌｉｎｇ）に起因す
るものである。
【００５３】
【発明の効果】本発明の核酸の単離装置によれば、核酸
を結合するためのマテリアルが好適に保持されるため、
核酸の単離収率が顕著に改善される。
を結合するためのマテリアルが好適に保持されるため、
核酸の単離収率が顕著に改善される。
【００５４】
配列番号：１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 DESCRIPTION／desc＝オリゴデ
オキシリボヌクレオチド ハイポセティカル：ＮＯ 配 列 AGCTTATCGA TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCG 34 配列番号２： 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 DESCRIPTION／desc＝オリゴデ
オキシリボヌクレオチド ハイポセティカル：ＮＯ 配 列 AGCTTATCGA TAAGCGGATG CCGGGAGCAG ACAAGC 36
オキシリボヌクレオチド ハイポセティカル：ＮＯ 配 列 AGCTTATCGA TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCG 34 配列番号２： 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 DESCRIPTION／desc＝オリゴデ
オキシリボヌクレオチド ハイポセティカル：ＮＯ 配 列 AGCTTATCGA TAAGCGGATG CCGGGAGCAG ACAAGC 36
【図１】本発明による好適な容器の横断面図である。
【図２】核酸を結合するためのマテリアルを備えた管を
示す図である。
示す図である。
【図３】核酸を結合するためのマテリアルと支持フリー
スを備えた管の装着を示す図である。
スを備えた管の装着を示す図である。
【図４】本発明による最終的な管を示す図である。
【図５】フランジエッジがスリットを具備する管を示す
図である。
図である。
【図６】図５の管を下から見た図である。
【図７】リムにフランジを付ける前の状態の図３のＡに
類似した図５の管を示す図である。スリットは点線で示
されている。
類似した図５の管を示す図である。スリットは点線で示
されている。
１ 円筒状部材 ２ 入口開口 ３ キャップ ４ 出口開口 ５ 保持デバイス ６ 傾き ７ 核酸を結合するためのマテリアル
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミハエル フリッツ ドイツ連邦共和国、デー−68647 ビー ブリス、グロス−ロールハイマー−シュ トラーセ 19 (72)発明者 ヘルベルト ハルティヒ ドイツ連邦共和国、デー−67122 アル トリップ、フォイエルバッハシュトラー セ 11 (72)発明者 ハンス ランゲ ドイツ連邦共和国、デー−68623 ラン ペルトハイム、レーマーシュトラーセ 99 デー (72)発明者 ロルフ ラーヒ ドイツ連邦共和国、デー−68549 イル ベスハイム、カンツェルバッハシュトラ ーセ 22 (56)参考文献 特開 平４−58899（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−158144（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−255074（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−224474（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−319499（ＪＰ，Ａ) 特公 平３−47885（ＪＰ，Ｂ２) 実公 平３−37720（ＪＰ，Ｙ２) 実公 昭63−18443（ＪＰ，Ｙ２) 特表 平７−501222（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−500914（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−504911（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−501223（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−501727（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12M 1/00 B04B 5/02 B04B 7/18
Claims (7)
- 【請求項１】 入口開口（２）および出口開口（４）
と、当該入口開口（２）および出口開口（４）のあいだ
に設けられた核酸を結合するためのマテリアル（７）と
を有する、液体サンプルからの核酸の単離のための装置
であって、前記出口開口（４）が、前記マテリアル
（７）の導入ののちに狭められ、前記出口開口（４）が
スリットを有する円周リム（５）からなることを特徴と
する装置。 - 【請求項２】 入口開口（２）および出口開口（４）を
備えた円筒形本体（１）と、核酸を結合するためのマテ
リアル（７）とを有する、液体サンプルから核酸を単離
するための装置であって、 前記マテリアル（７）が入口開口（２）および出口開口
（４）とのあいだに設けられ、 前記出口開口（４）がマテリアル（７）の導入ののちに
狭められ、当該マテリアル（７）が円周リム（５）によ
って入口開口（２）の方向にしっかりと固定され、前記
円筒形本体（１）を別の形に作り変えることによって形
成されたリム（９）によって出口開口（４）の方向にし
っかりと固定されてなる装置。 - 【請求項３】 入口開口（２）および出口開口（４）
と、当該入口開口（２）および出口開口（４）のあいだ
に設けられた核酸を結合するためのマテリアル（７）と
を有する、液体サンプルからの核酸の単離のための容器
として機能する装置であって、 前記出口開口（４）が、前記マテリアル（７）の導入の
のちに狭められ、 前記マテリアル（７）が円周リム（５）によって入口開
口（２）の方向に保持され、 該円周リム（５）は当該装置を破壊しない限り取り除く
ことができず、 該円周リム（５）が容器の内壁から容器の内部に延び、
かつ入口開口（２）に向かって傾斜してなることを特徴
とする装置。 - 【請求項４】 前記円周リム（５）が前記装置と同じ材
料から一体的に製造されてなる請求項３記載の装置。 - 【請求項５】 前記マテリアル（７）が、全領域にわた
って液体透過性の多孔性マトリックスによって前記出口
開口（４）に支持されてなる請求項３記載の装置。 - 【請求項６】 入口開口（２）および出口開口（４）
と、核酸を結合するための、該入口開口（２）および出
口開口（４）のあいだにしっかしりと固定されたマテリ
アル（７）とを有し、液体サンプルから核酸を単離する
装置の製法であって、 前記マテリアル（７）を出口開口（４）から入口開口
（２）の方に向かって円周リム（５）まで挿入する工
程、および前記マテリアル（７）が円周リム（５）とく
びれ部の位置とのあいだに保持されるようにフランジま
たは熱的固定によって出口開口を狭くする工程からなる
製法。 - 【請求項７】 液体サンプルから核酸を単離する方法で
あって、 該サンプルを、入口開口（２）から請求項１、２または
３記載の装置に導入する工程、マテリアル（７）に該液
体サンプルを通過する工程、および核酸のマテリアル
（７）との結合を廃止する工程からなる方法。
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