JP2968997B2 - 改良された生物学的昆虫制御物質および使用方法 - Google Patents

改良された生物学的昆虫制御物質および使用方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、国立衛生研究所の研究費（交付番号AI−23
719）および米国農務省のHatch Act研究費（交付番号GE
000918）の援助を受けてなされた。アメリカ合衆国政府
は、本発明において所定の権利を有する。
技術分野 本発明は、害虫の改良された生物学的制御の方法およ
び組成物に関する。特に、本発明は、昆虫の成長および
発育の制御に効果があるバキュロウィルス遺伝子および
その遺伝子生産物の使用と操作に関する。本発明はま
た、感染した害虫に対して悪影響を与える、遺伝子学的
に改変されたバキュロウィルスならびに他の昆虫制御物
質に関する。
発明の背景 害虫の生物学的制御に関する興味は、従来の化学的殺
虫剤の不都合さの結果から生じたものである。化学的殺
虫剤は、一般に、無益な種はもちろんのこと有益な種に
も作用する。害虫は、このような化学物質に対する抵抗
力を獲得する傾向があり、これらの殺虫剤に対して抵抗
性をもつ新しい害虫個体群が急速に増大し得る。さら
に、化学残渣は、環境の害にもなるし健康をも脅かす。
生物学的制御は、害虫の制御において、化学的殺虫剤へ
の依存を減らすことができる代替手段である。
生物学的制御の主要な戦略は、昆虫に対して病原性で
ある天然界に存在する生物（昆虫の病原体）の使用およ
び害虫に抵抗性のある作物の開発を含んでいる。研究方
法には、昆虫遺伝子、あるいは昆虫制御物質にとって適
切な標的物となり得る遺伝子生産物を同定し特徴づける
こと、以前には使われていなかった微生物の同定ならび
に開発（天然に存在する非病原性微生物を昆虫に対し病
原性を与えるように改変することを含む）、現在使用さ
れている昆虫病原体の改変および改良、ならびに遺伝子
工学による害虫に対してより強い抵抗性を示す作物の開
発が含まれる。
天然における昆虫個体群の中で、流行性の病気の原因
となるウイルスが、生物学的殺虫剤として開発されてき
た昆虫病原体に属する。バキュロウイルスは、節足動物
のみに感染するウイルスの大きな群である。（Miller,
L.K.（1981），Genetic Engineering in the Plant Sci
ences,N.Panopoulpus編,Praeger Publ.,New York,pp.20
3−224;Carstens,（1980）Trends,Biochemical Science
52:107−110;HarrapandおよびPayne（1979），Advance
s in Virus Research,Vol.25,Lawferら編,Academic Pre
ss,New York,pp.273−355）。多くのバキュロウイルス
は、商業上重要な農林業の作物の害虫である昆虫に感染
する。このようなバキュロウイルスは、生物学的制御物
質として潜在的な価値を有している。４種の異なるバキ
ュロウイルスが、米国環境保護局（U.S.Enviromental P
rotection Agency）に殺虫剤としての使用のために登録
されている。生物学的殺虫剤としてのバキュロウィルス
の利点の中には、宿主特異性がある。生物学的殺虫剤と
してのバキュロウイルスは、群として節足動物にだけ感
染するのではなく、バキュロウイルス個々の株は、普通
１種ないし数種の昆虫に感染する。それ故に、これらは
人類および環境に害をもたらさないし、有益な種の昆虫
に不利な影響もあたえずに使用され得る。
バキュロウイルスのサブグループには、核多角体病ウ
イルス（NPV）、顆粒病ウイルス（GV）および非閉塞性
バキュロウイルスが含まれる。バキュロウイルスの閉塞
型では、ビリオン（エンベロープに包まれたヌクレオカ
プシド）が、結晶性タンパク質マトリックス中に埋めこ
まれている。封入体あるいは閉塞体と呼ばれるこの構造
は、天然では生物体外で見出される形態であり、生物間
での感染の拡大に関与している。NPVウイルスの特徴的
な形は、多くのビリオンが各々の閉塞体中に埋め込まれ
ていることである。それらのNPV閉塞体は、比較的大き
い（最高５μｍ）。GVウィルスの閉塞体はより小さく、
各々１個のビリオンを有している。両者の閉塞体の結晶
性タンパク質マトリックスは、主として25000から33000
ダルトンのポリペプチドからなっていて、ポリヘドリン
あるいはグラヌリンと呼ばれている。非閉塞性サブグル
ープのバキュロウイルスは、ポリヘドリンやグラヌリン
のタンパク質を生産しないし、閉塞体も形成しない。
実際には、感染は、昆虫がバキュロウイルス粒子、と
くに閉塞体型のバキュロウイルス粒子で汚染された餌を
食べたときに起こる。その閉塞体は、昆虫中腸の中で、
アルカリ状態下で分解し、各々ウイルス粒子を放出し、
腸壁の上皮細胞を犯す。宿主細胞中で、バキュロウイル
スは核に移動し、そこで複製がおこる。最初は、ある特
定のウイルスタンパク質は、感染細胞の中で、いわゆる
転写と“初期遺伝子（early genes）”の翻訳によって
生産される。他の機能の中で、これらのタンパク質は、
ウイルスが細胞に侵入後、４時間から６時間後に始まる
ウイルスDNAの複写を可能とするために必要とされる。
広範囲のウイルス性DNAの複写は、宿主感染後（pi）約1
2時間にわたって進行する。約８時間から10時間piの間
に、感染した細胞は、“後期ウイルス性遺伝子生産物”
を多量に生産する。これらには、後代ウイルス粒子の形
成において、ウイルスDNAを含むヌクレオカプシドの構
成要素が含まれる。後代ウイルス粒子の生産は、12時間
piの付近で始まる。最初に、後代ウイルスは細胞膜に移
り、そこで細胞表面から出芽するときに包皮を必要とす
る。この非閉塞のウイルスは、次に、昆虫の中の他の細
胞に感染し得る。ポリヘドリン合成は、感染後12時間か
ら18時間に始まり、24時間piまでにかなり高いレベルに
まで増加する。その時、出芽状ウイルスは閉塞体に埋め
込まれる。閉塞体形成は、細胞が死滅するかあるいは溶
菌するまで続く。ある種のバキュロウイルスは、事実上
宿主昆虫のどの組織にも感染して、感染過程の終着時点
で昆虫は全部液化され、他の昆虫に感染を広め得る閉塞
体を数多く放出する（The Biology of Baculoviruses,V
ol.IおよびII,GrandosおよびFederici編,CRC Press,Boc
a Raton,Florida, 1986,の総説）。
殺虫剤としてバキュロウイルスを使用する上での一つ
の重大な欠点は、ウイルスの摂取と昆虫の死亡との間の
時間の長さにある。この時間の間に、害虫は餌を食べて
作物に害を与える。栽培者は、昆虫の出没が明らかにな
るまで殺虫剤を使用しそうにもないので、餌を与える時
間を最小限にすることが重要である。
必要とされるのは、昆虫が死亡するまでに食べる量を
減少させる生物学的殺虫剤である。生物学的殺虫剤は、
化学的殺虫剤より環境に及ぼす害が少ないので好まし
い。さらに早期の昆虫の死亡が望ましい。昆虫の発育を
制御するタンパク質をコードする遺伝子の開発、および
それを種々の生物に導入することは、害虫の改良された
生物学的制御を可能とするであろう。
発明の要旨 本発明において、昆虫の発育、成長、あるいは行動に
影響を及ぼすバキュロウイルス遺伝子、およびその遺伝
子生産物が同定されている。本発明は、昆虫制御戦略に
おいて、この遺伝子あるいは遺伝子生産物を不活性化す
る方法、およびこの遺伝子および遺伝子生産物を使用す
る方法も提供する。好ましい実施態様としては、egt遺
伝子は、AcMNPVのエクジステロイドUDPグリコシルトラ
ンスフェラーゼ（EGT）をコードする。バキュロウイル
スegt遺伝子の発現は、昆虫の脱皮ホルモンを不活性化
するEGTの生産をもたらし、昆虫の幼虫が脱皮あるいは
さなぎになるのを阻害する。バキュロウイルスegt遺伝
子の不活性化により、感染幼虫の脱皮あるいはさなぎ化
が進む。
本発明は、egt遺伝子およびそれらの遺伝子生産物を
用いる昆虫制御物質の広い範囲を包含している。本発明
の昆虫制御物質物質により、EGTタンパク質の不適切な
合成が引き起こされ、あるいは害虫中でのEGTタンパク
質の正常な機能化または発現が阻害される。その結果、
害虫の正常な発育が中断される。
好ましくは、egt遺伝子を有する生物は、害虫に対し
て特異的なウイルスであり、ここでこのウイルスのegt
遺伝子は不活性化されているので、このウイルスにより
感染している宿主昆虫の継続的な発育を可能とする。そ
の宿主昆虫の発育は摂餌の減退のような行動の変化を引
き起こし、ウイルス性殺虫剤により感染した時には、成
長の減退およびさらにより迅速な死に及ぶ。本発明はま
た、改良されたウイルス性殺虫剤の生産の方法を包含し
ている。さらに、本発明は、害虫にこの改良されたウイ
ルス性の殺虫剤を与えて害虫を制御する方法を包含す
る。
本発明が意図するところの遺伝的に変化が加えられた
ウイルスは、従来技術のウイルスよりもさらに効果的な
殺虫剤である。バキュロウイルス、たとえばAutographa
californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）ならびにO
rgyia pseudotsugata核多角体病ウィルス（OpMNPV）
は、自然状態においてegt遺伝子を発現し、その遺伝子
発現により、感染幼虫がそのウイルス感染のために死ぬ
までに摂餌に費やされる時間が延びる。本発明は、例え
ば（しかし限定されるわけではないが）、バキュロウイ
ルスのようなウイルスのゲノム中のegt遺伝子を不活性
化することを包含する。そのegt遺伝子は、β−ガラク
トシダーゼに対する遺伝子のような非ウイルス性のマー
カー遺伝子でその位置を置換するか、あるいはその中に
挿入することで不活性化され得る。egt遺伝子の発現を
阻害するものであれば、egt遺伝子を阻害するためには
どのようなDNA配列でも使用され得ると理解されるべき
である。あるいは、egt遺伝子の全て、あるいは一部
は、適切なDNAコード断片を欠失させることによってゲ
ノムからとり除かれ得るか、もしくは、egt遺伝子の発
現を制御するゲノム調節部分が、変化させられるかとり
除かれ得る。egt遺伝子を不活性化する欠失のあるバキ
ュロウイルスは、昆虫細胞培養中において、一連のウイ
ルスの継代によっても生産され得る。得られた欠失ウイ
ルスは、外来のDNAを含んでいなくて、機能性のget遺伝
子を欠いている点において野生型とは異なっているとい
う利点を有している。このような改変されたバキュロウ
イルスは、現在使用されているウイルスよりも害虫制御
物質としてすぐれた機能をする。単純な欠失変異体に関
していえば、これらは異種のDNAを含んでいないので、
遺伝子工学でつくられた殺虫剤として、規制期間（例え
ば、アメリカ合衆国EPA）に受け入れられるべきであ
る。機能性はegt遺伝子の発現をおこさないバキュロウ
イルスは、昆虫の発育を阻害するegt以外の遺伝子を挿
入することにより改変され得る。従って、このようなウ
イルスの昆虫制御物質としての有効性が改良される。
本発明は、完全なegt遺伝子が欠失しているか、ある
いは機能的にEGT生産物の発現が不可能である変異型の
ウイルスの幼虫を感染させることにより、害虫を制御す
る方法をも包含している。変異型のウイルスに感染した
幼虫は脱皮し蛹化しようと試み、結果として野生型ある
いは従来技術のウイルスに感染した幼虫よりも、えさを
食べる時間が短くなる。変異型ウイルスに感染した幼虫
は、野生型あるいは従来技術のウイルスに感染した幼虫
よりも死ぬのも早い。
本発明の目的は、野生型、あるいは従来技術のウイル
スよりもより効果的な殺虫剤である組換え型ウイルスを
提供することである。本発明は、vEGTZと称される組換
え型AcMNPVによって例証される。そのvEGTZにおいて
は、egt遺伝子の一部が欠失し、β−ガラクトシダーゼ
をコードする細菌性遺伝子であるlacＺによって置換さ
れている。これは当業者にとっては理解されていること
であるが、egt遺伝子を不活性化するあらゆるDNA配列が
置換され得る。本発明は、egt遺伝子の一部が欠失して
いるvEGTDELと称される組換え型バキュロウイルスによ
って更に例証される。もうひとつの実施態様として、eg
t遺伝子を除去したバキュロウイルス殺虫剤がある。自
然に生じる変異（欠失を包含する）がegt遺伝子の不活
性化をもたらすバキュロウイルスもこれらに含まれる。
従って、本発明の目的は害虫の制御に有用であるegt
遺伝子およびその遺伝子生産物を提供することである。
さらに、本発明の範囲には、実質上精製されたエクダイ
ステロイド・UDP−グルコシルトランスフェラーゼおよ
びそれに特異的な抗体が含まれる。egt遺伝子は、表１
のegt遺伝子のヌクレオチド配列に対する配列相同性に
より、あるいはEGT酵素活性の決定とそれに引き続くDNA
の分析の後に同定され得る。エクダイステロイド・UDP
グルコシルトランスフェラーゼをコードするなどのDNA
配列も、ここでegt遺伝子であると定義される。egtタン
パクは当該分野では既知の技術によって精製され得、そ
のアッセイ工程は実施例４に示される。実質的に純粋な
egtタンパクの精製は少なくとも約70％（W/W）のエクダ
イステロイド・UDP−グルコシルトランスフェラーゼを
含有することである。組換え型egtタンパクとは、該タ
ンパクをコードする遺伝子が天然に存在する以外の他の
生物で作られるタンパクである。その組換え型タンパク
は、遺伝子工学的あるいはDNAの組換えの技術の結果と
して発現する。
本発明のもうひとつの目的は、効果的な殺虫剤であっ
て、さらに環境に対しても無害な、遺伝子工学によって
つくられるウイルスを提供することである。
本発明のもうひとつの目的は、機能性egt遺伝子が欠
損しており、昆虫の発育を妨害する第２の遺伝子を発現
する組み換え型殺虫剤を提供することであり、ここで第
２の遺伝子は生物中に自然には存在しない。この第２の
遺伝子は、脱皮に影響を及ぼす遺伝子生産物をコードす
る。この様な遺伝子生産物は昆虫の発育に影響を及ぼす
昆虫ホルモンか、又は脱皮を調節する昆虫ホルモンを、
不活性化する酵素となり得る。特定の例には、前胸腺刺
激ホルモン、羽化ホルモンおよび幼若ホルモンエステラ
ーゼが包含される。これらのタンパクをコードする遺伝
子が、昆虫制御物質を生産するために昆虫ウイルス中に
とり込まれたときには、そのウイルスはegt遺伝子を含
まないか、egt遺伝子が不活性化されているものでなけ
ればならない。
本発明のもうひとつの目的は、昆虫制御物質としての
使用のために、遺伝子的に改変された生物を提供するこ
とであり、この生物は、egt遺伝子を自然状態において
発現しないが、遺伝指的に挿入されたegt遺伝子を発現
する。この様にEGTを発現する遺伝子的に改変された生
物は、害虫にとって有害であり、結果として植物への害
を軽減する。
更に本発明の目的は、農業への応用に適した殺虫組成
物を提供することである。このような組成物は当該分野
で理解され得る農業的に適した担体と、バキュロウイル
スのような、前記ウイルスのegtが不活性化される様に
遺伝子的に改変された昆虫ウイルスを包含する。このよ
うなEgt-バキュロウイルスはさらに遺伝的に改変され
て、脱皮に影響する昆虫ホルモンまたは脱皮に影響する
昆虫ホルモンを不活性化する酵素をコードする異種遺伝
子を発現する。遺伝子生産物が脱皮に影響を与える異種
遺伝子には、前胸腺刺激ホルモン、羽化ホルモン、およ
び幼若ホルモンエステラーゼが含まれるが、これらに限
定されない。好ましくは、遺伝子的に改変されたバキュ
ロウイルスを包含する殺虫組成物は、スプレー塗布用に
処方される。
更に殺虫組成物として意図されたものは農業用に適し
た担体と、遺伝子的に改変された昆虫寄生体を有するも
のである。昆虫寄生体は、幼虫と密接にかかわりながら
生活し、複製する生物であり、幼虫にとっては有害とな
る。昆虫寄生体は、細菌であり、真菌であり、ウイルス
であり、もしくは他の昆虫であり得る。このようなegt
遺伝子を含有する遺伝子的に改変された昆虫寄生体は、
egt遺伝子の不活性化によって昆虫制御物質として改良
される。
上述の殺虫組成物のいずれもが、昆虫がえさを食べる
のを刺激する成分をさらに含有している。本発明の殺虫
組成物は、植物に付与した後に害虫に食べられて、殺虫
組成物中の昆虫抑制物質の影響を受け易い害虫はえさを
食べる量が減少して死滅する。
本発明のもうひとつの目的は、egtの発現により、あ
るいはその遺伝子生産物の機能により阻害する、改変さ
れた生物学的殺虫剤を提供することである。
図面の簡単な説明 第１図は、egt遺伝子の位置を示すAcMNPVゲノムの概
略図である。AcMNPVゲノムは地図単位中に、EcoR Iおよ
びHind IIIの制限酵素切断地図として提供されている。
第２図は、egt遺伝子を配列決定し、その配列分析し
た結果の略要約図である。パネルＡはその領域の制限酵
素切断地図を表す。パネルＢに、オープンリーディング
フレームについての配列のコンピューターによる分析結
果を示す。縦線は停止コドンを示す。この配列は、各々
のDNA鎖（1,2,3,1′,2′,3′）について、すべての３つ
の可能なオープンリーディン グフレームに“翻訳”さ
れている。egtに相当するオープンリーディングフレー
ム（２）はEGTとラベルされている。
第３図は、以下の（Ａ）（Ｂ）および（Ｃ）の各構造
の概略図であり、（Ａ）はAcMNPVのegt遺伝子領域、
（Ｂ）は組み換え型ウイルスvEGTZ、そして（Ｃ）はEGT
DELである。斜線部はlacＺ遺伝子を表す。
第４図は、バキュロウイルスOpMNPVにおけるegt遺伝
子の同定のためのアガロースゲル電気泳動、およびサザ
ンブロット分析の概略図である。
第５図は、OpMNPVゲノムの制限酵素切断地図の略図で
ある。
第６図は、コントロールの非感染幼虫あるいは第４齢
でwt AcMNPVまたはvEGTZに、感染した幼虫の体重増加の
グラフである。
第７図は、第４齢でwt AcMNPVまたはvEGTZに、感染し
た幼虫の死亡率を示すグラフである。
第８図は、第５齢でwt AcMNPVまたはvEGTZに、感染し
た幼虫の体重増加を示すグラフである。
第９図は、第５齢でwt AcMNPVまたはvEGTZに、感染し
た幼虫の死亡率を示すグラフである。
第10図は、第１齢での、4.8×106多面封入体濃度（PI
B/ml）でwt AcMNPVまたはvEGTZにに感染した幼虫の死亡
率を示すグラフである。
第11図は、第１齢での、2.4×106（PIB/ml）でwt AcM
NPVまたはvEGTZに感染した幼虫の死亡率を示すグラフで
ある。
開示された実施様態の詳細な説明 鱗翅類の昆虫は、卵から成虫までの発育の間に固有の
一連の出来事を経験する（Comprehensive Insect Physi
ology,biochemistry and Pharmacology，第７、８巻、K
erkutおよびGilbert編、Pergamon Press,Oxford,1984の
詳細な総説を参照。）ふ化後、幼虫は多量のえさを食べ
る時期に入り、その期間中にさらに成長を続けるため数
回脱皮する。この脱皮の間の段階を齢期とよんでいる。
幼虫の成長期の最後には、幼虫を蛹化し最終的に成虫と
なる。脱皮と蛹化の過程（これをまとめて脱皮（ecdysi
s）という言葉で表す）は、いくつかの異なった種類の
ホルモンの相互作用によって調節されている。最初の刺
激は、ある種の脳細胞からの前胸腺刺激ホルモン（PTT
H）の放出である。この刺激によって前胸腺を刺激し、
エクダイステロイドを生産し分泌するが、これはしばし
ば昆虫脱皮ホルモンと呼ばれている。幼若ホルモンの存
在下に脱皮が起こり、幼若ホルモンの非存在下に蛹化が
起こる。羽化ホルモンもまた脱皮に関連したいくつかの
行動変化をもたらすのに重要である。
バキュロウイルスAcMNPVは、多くのバキュロウイルス
研究のモデル系として使用されており、以前には予測も
できない方法で、前に議論された昆虫の発育の過程を妨
害する。AcMNPVに感染した幼虫は、もはや脱皮も蛹化も
できなくなる。これはAcMNPVが、エクダイステロイドUD
P−グルコシルトランスフェラーゼ（EGT）として知られ
る酵素の合成を誘導し、それが昆虫エクダイステロイド
を特異的に不活性化させるためである。
EGTをコードする遺伝子は本発明者よって同定され
た。それはAcMNPVのゲノム上の8.4から9.6の地図単位で
延びている（第１図および第２図）。第１図のパネルＣ
に示すようにegt遺伝子をとり囲むウイルスDNA断片は、
プラスミドpUC19と、ブルースクリプト（Bluescript）M
13＋と、ブルースクリプトM13−との中にクローン化さ
れている。第２図は、ゲノムのegt領域の制限酵素切断
地図とコンピューターによるegt領域のオープンリーデ
ィングフレーム分析を示す。リーディングフレーム２の
みが相対的に長いオープンリーディングフレームをも
ち、それはegt遺伝子をコードする領域として同定され
た。egt遺伝子のヌクレオチド配列と、推測される506個
のアミノ酸配列は表１に示される。egtのコード配列
は、ヌクレオチド149付近からヌクレオチド1670付近ま
で延びている。
本発明の好ましい実施態様において、バキュロウイル
スAcMNPVの遺伝子は、egt遺伝子の一部を、β−ガラク
トシダーゼをコードする細菌の配列で置換することによ
って不活性化されている。この組み換え型バキュロウイ
ルスをvEGTZと命名する。第２の好ましい実施態様で
は、第３図に示す様に、AcMNPVのegt遺伝子の部分が置
換されることなく欠失していることである。wt AcMNPV
の、感染中に合成されたタンパク、およびvEGTZの感染
中に合成されたタンパクを比較することにより、EGTタ
ンパクは、感染細胞から分泌される60KDaのタンパクで
あることが明らかとなった。昆虫ウイルスegt遺伝子の
不活性化のもうひとつの機構は、脱皮に影響する昆虫ホ
ルモンあるいは脱皮に影響する昆虫ホルモンを不活性化
させる酵素をコードする遺伝子の挿入であり、その遺伝
子は前記の昆虫ウイルスで感染した細胞で発現しうる。
ジーンバンク（Genbank）データベースの検索によ
り、egtといくつかのほ乳類のUDP−グルクロノシルトラ
ンスフェラーゼの間に21から22％の配列の相同性がみら
れた。これらの酵素の確定したアミノ酸配列をもったeg
tアミノ酸配列が表２に示されている。
表２は、他の種由来のUDP−グルクロノシルトランス
フェラーゼとUDP−グルコシルトランスフェラーゼとを
選んで、egtアミノ酸配列を並べて示したものである。e
gtの推定されたアミノ酸配列は、次のものと比較されて
いる。ヒト（HUMUDPGAT）（Jacksonら（1987）Biovem.
J.242:581）、マウス（MUSUDPGAT）（KimuraとOwens（1
987）Eur.J.Biochem.168:515）、およびラット（RATUDP
GAT）（Mackenzie（1987）J.Biol.Chem.262:9744）。UD
P−グルクロノシルトランスフェラーゼ、およびとうも
ろこしのUDP−グルコシルトランスフェラーゼ（ZMAYUDP
GT）（Ralstonら（1988）Genetics 119:185）、これら
はInternational Biotechnologies Inc.によって実行さ
れたFApTPアルゴリズム（algorithm）（LipmanとPearon
（1985）Sciense 227:1435）を用いている。大文字は正
確に一致するが小文字は関連するタンパク間でしばしば
起こる置換を示している。（Dayhoff,（1978）Atlas of
Protein Sequence andStructure,National Biomedical
Research Foundation,Vol.5,Supplement 3,Silver Spr
ing MD）；点は、めったに起こらない置換を示し、ハイ
フンは配列間の間隙を示し、脱字記号はアミノ酸が配列
から欠失していることをしるしている。矢印の間のアミ
ノ酸はvEGTZとvEGTDELに於いてegt遺伝子から欠失して
いる。AcMNPV遺伝子が既知のUDP−グルコースおよびUDP
−グルクロノシルトランスフェラーゼと相同性を有する
ことにより、このAcMNPV配列が、egtをコードする配列
と同一であることが支持される。
ほ乳類に於いて、UDP−グルクロノシルトランスフェ
ラーゼはグルクロン酸の多種多様な外因性および内因性
親脂質性基質への転移を触媒する（Glucuronidation of
Drugs and Other Compounds,Dutton（ed.）,CRC Pres
s,Boca Raton,Florida,1986年に論じられている）。こ
の結合反応は、何らかの薬や発がん性物質の解毒と安全
な消失にとって重要である。さらに、ビリルビンおよび
ステロイドホルモンのような種々の内因性化合物の正常
な代謝と除去とは、グルクロン酸との結合を経て進行す
る。昆虫の系において入手し得る証拠により、このタイ
プの糖との結合反応は、グルクロン酸よりもむしろグル
コースの転移を経て起こるということが示される（Smit
h（1977）in Drug Metabolism−Form Microbe to Man,
Parke and Smith（eds.）,Taylor and Francis Ltd.,Lo
ndon pp219−232）。ほ乳類と同様、多くの種類の外因
性および内因性化合物が昆虫の中で結合される。
本発明者らはAcMNPV EGTタンパクが、グルコースをエ
クダイソン、20−ヒドロキシエクダイソン、およびマキ
ステロンＡのようなエクダイステロイドと特異的に結合
させるUDP−グルコシルトランスフェラーゼであること
を示した（表３参照）。溶解産物も、非感染のあるいは
VEGTZに感染した細胞の細胞外媒体もエクダイソンを改
変しない。AcMNPV感染細胞で発現したエクダイステロイ
ドグルコシルトランスフェラーゼ活性のほとんどは、細
胞外媒体に分泌される。比較的低レベルの活性のみがAc
MNPV感染細胞溶解産物に観察される。
AcMNPVegt遺伝子をプローブとして用いて、egt遺伝子
が他のバキュロウイルスであるOrgyia pseudotsugata
核多角体病ウイルス（OpMNPV）中で同定された。これは
第４図に示すとおりである。あらゆるバキュロウイル
ス、昆虫ウイルス、あるいは昆虫のegt遺伝子が本発明
で例示されたのと同様の方法で位置づけされ、特徴づけ
られ、そして単離され得ることは、この明細書の開示に
よって当業者に認められるであろう。表１に示した配列
と少なくとも70％のヌクレオチド配列の相同性をもつeg
t遺伝子は、表１中の配列と同等であると考えられる。
但しこれはそれら相同性をもつ遺伝子がエクダイステロ
イドUDP−グルコシルトランスフェラーゼである酵素を
コードする場合である。
egt遺伝子の機能等価物とは、グルコース部分をUDPグ
ルコースからエクダイソテロイドへと転移させることに
よって、エクダイソンの様なエクダイステロイドの不活
性化をも触媒するものである。そのようなegtの機能等
価物は本発明に記述した評価方法を用いて同定され得
る。
egt遺伝子を位置づけし、同定し、単離すれば、当業
者は、より効果的な昆虫制御物質を生産するための、本
発明で開示された方法と既知の技術を用いてその遺伝子
を不活性化できる。
vEGTZの性質と野生型（wt）のAcMNPVの性質を比較し
て、本発明者らはegtの発現は昆虫が脱皮し蛹化するの
を妨げることを示した。wt AcMNPVに感染した昆虫は脱
皮せず蛹化しないが、vEGTZに感染した昆虫は脱皮し、
蛹化しようとする（実施例IIの表４参照）。
脱皮と蛹化を阻害することにより、wt AcMNPVの感染
は、実際に幼虫がえさを食べる時間を延長する。第５齢
期間（最後の齢期）の初めでwtウイルスに感染した幼虫
は、感染後５、６日後の死までえさを食べ続ける。しか
し、非感染の幼虫は第５齢期に入った後、蛹化を準備し
て２、３日後にえさを食べるのをやめる（第８図参
照）。同様の効果がより早い齢期の幼虫にも観察され
る。非感染の幼虫は脱皮せず、その結果えさを食べるこ
とをやめない（第６図参照）。
機能性egt遺伝子が欠損した組み換え型バキュロウイ
ルスは、幼虫がえさを食べる時間を延長しない。このよ
うに、第５齢期初期でvEGTZに感染した幼虫は蛹化の準
備のため感染後２日間はえさを食べるのをやめる（第８
図参照）。しかしながらそれらは第９図に示すように蛹
化せず、代わりにwtウイルスに感染した幼虫よりももっ
と早くウイルスの感染に屈服する。同様に、第４齢期の
初期にvEGTZに感染した幼虫は脱皮のため、感染後２日
間はえさを食べるのをやめ、そしてwt感染した幼虫より
も死ぬのが早い（第６図および第７図参照）。第10図お
よび第11図に示すように、ふ化したばかりの第１齢期の
幼虫がwt AcMNPVに感染したとき、およびvEGTZに感染し
たときには、機能性egt遺伝子を欠損したバキュロウイ
ルスによって、より迅速な死亡が劇的に観察される。vE
GTZに感染した幼虫はwt AcMNPVに感染した幼虫よりも３
〜４日間早く死ぬ。それ故に、機能性egt遺伝子を欠く
組み換え型のバキュロウイルスは、昆虫制御物質として
野生型のバキュロウイルスよりかなり効果的である。eg
t遺伝子を、当該分野に既知の方法によって、どのバキ
ュロウイルスあるいは昆虫においても非機能性にするこ
とは、当業者にとってはこの明細書の開示によって明ら
かとなる。
上述の効果および次の実施例は、当分野においてより
劇的である。vEGTZに感染した幼虫は脱皮が困難である
が、注意深く制御された実験室の条件では脱皮する。温
度と光が厳密に制御されなければ、多くの昆虫は完全に
脱皮しない。そしてこれらは再びえさを食べ初め、その
後まもなく死に致る。
後代のウイルスが、機能性egt遺伝子を欠損したバキ
ュロウイルスに感染した幼虫の中に集まることができる
時間の長さはいく分切り詰められ、そして感染した昆虫
の成長が遅れるが、そこには後代のウイルスが実質的に
生産されている。おそい齢期の幼虫のvEGTZ感染の結
果、各幼虫あたり得られるウイルスの量は、wtウイルス
の感染で得られる量の約半分である。当分野では、ウイ
ルスを伝染させコスト的に有効な多量のウイルスの微粒
子を調製するにはこれで充分である。
本発明のもうひとつの実施態様は、機能性egt遺伝子
を欠く昆虫ウイルスが、遺伝子工学技術によって改変さ
れることであり、その結果、生物的制御因子としての効
果が、その生産物が昆虫の発育に影響する第２の遺伝子
を取り込むことによって、更に増強される。
PTTH（ペプチドホルモン）をコードする遺伝子は、eg
t遺伝子が欠失したウイルスのゲノムの中へ挿入され得
るし、かつPTTHは脱皮に影響するのに十分に高いレベル
で発現され得る。このようなウイルスに感染した幼虫
は、発育ホルモンの制御において、極端な混乱を経験す
る。このような昆虫は急激に病気になり、成長と発育が
危うくなり、えさを食べる量が減り早期に死滅する。
羽化ホルモンもまた小さなペプチドホルモンであり、
その遺伝子は従来の技術を用いて非機能性egt遺伝子を
もつウイルスの中へ挿入され得る。羽化ホルモンは、脱
皮に関連した多くの行動の変化を支配するので、十分に
高いレベルにこのホルモンを算出するEgt-ウイルスに感
染した昆虫は、えさをたべる量が少なくなるなどの行動
上のおよび／または発育上の異常を示すことになる。
昆虫における幼若ホルモンの濃度（titers）の主要な
調節物は幼若ホルモンエステラーゼであり、これは幼若
ホルモンを不活性化する。機能性egtが欠損し、十分に
高いレベルの幼若ホルモンエステラーゼを発現する組み
換え型ウイルスは昆虫の行動または／あるいは発育にと
って有害となる。
上記の遺伝子のすべては野生型のウイルスゲノムに付
加されることが可能である一方、それらは、野生型ウイ
ルスに感染した昆虫の行動に有意な影響を及ぼすことは
期待できないと認識することが重要である。なぜなら、
他のホルモンの生産を無視しても、野生型ウイルスによ
るegt遺伝子の発現により、エクダイステロイド脱皮ホ
ルモンが不活性化し、脱皮が妨げられるからである。こ
のような、昆虫の脱皮を妨害するように意図されたウイ
ルスの生産に関する成功した戦略は、本発明に記載のよ
うに、egt遺伝子の優先的な不活性化によるものであ
る。
完全なegt遺伝子が欠損しているか機能性egt生産物を
発現できない変異生物、および酵素を改変する他のホル
モンあるいはペプチドホルモンを発現するように、さら
に遺伝子的に改変された変異生物が本発明では昆虫制御
物質として含められることは、当業者に理解されるとこ
ろである。
egt遺伝子生産物が、強力でかつ特異的な方法で昆虫
の発育を妨害することが示された。エクダイステロイド
は、実質的にあらゆる種類の昆虫の発育に於いて重大な
役割を演じている（Comprehensive Insect Physiology
Biochemisty and Pharmacology,KerkuおよびGilbert
編、Pergamon Press,Oxford,1984に記載）。このよう
に、egtそのものは、幅広い昆虫制御戦略に於ける使用
にとってかなりの可能性をもつものである。たとえば、
本発明の第４の好適な実施態様において、農作物は、遺
伝子工学によって、既知の技術で、EGTタンパクを本質
的に生産するようになされ得る。そのような作物を食べ
ている昆虫は完全に成虫に発育できず、それ故に効果的
な長期間の作物保護が提供される。同様に植物あるいは
昆虫に正常に存在する細菌は、遺伝子工学によって既知
の方法でEGT酵素を生産することが可能となる。この様
な細菌はさらに効果的な生物制御因子として作用する。
同様に、非植物病原性で植物に集落化する（plant−c
olonizing）細菌は遺伝子的に改変されてEGT遺伝子を発
現する。これらの遺伝子的に改変された細菌が集落化し
た植物は、発現したタンパクの影響を受け易い害虫から
保護される。非植物病原性で植物に集落化する細菌は、
例えば、米国特許No.4,798,723に記載されている。ある
植物集落化細菌の遺伝子的改変は米国特許No.4,771,131
とヨーロッパ特許出願公開No.0185005に記載されてい
る。植物に集落化する他の細菌は当該技術分野で既知で
ある。既知の技術によるどの方法も、上述の昆虫制御物
質を生産する、発現可能な遺伝子を導入するのに使用可
能である。
このように遺伝子的に改変された植物物質、あるいは
このように遺伝子的に改変された、植物集落化細菌が集
落化した植物物質を、感受性のある昆虫が摂取すると、
その昆虫の正常な発育を破壊することになる。ある種の
昆虫（たとえばアブラムシ（aphids））は、特に浸透性
のある腸細胞をもつことが当該分野で既知となってい
る。当業者はその様な植物発現性の遺伝子を構築するの
に必要な工程、およびその様な遺伝子を植物のゲノムに
取り込むのに必要な工程を理解している。
昆虫自身がそのライフサイクル中の特定の段階でegt
遺伝子を発現し、このことが発育を規制する機構の重要
な構成要素であることが見うけられる。この様に昆虫の
egt遺伝子が新既な昆虫制御の戦略に適した目標になり
得る可能性がある。本発明の開示はそのような戦略を組
み立てる手段を提供するものである。
更に本発明の実施態様によれば、EGT酵素に結合して
いるが、該酵素からは開裂も遊離もされないエクダイス
テロイド類縁体がデザインされ得る。その様な“自己不
活化基質”（suicide substrate）はEGT酵素と競争的に
結合し、EGT酵素の活動を阻害するか遮断する。あるい
は、組み換え型の生物は、本発明で提供した方法を採用
し当該分野で理解されるように、昆虫egt遺伝子の発現
が、例えばアンチセンスRNAの生産によって妨げられる
ように、遺伝子工学によって作られる。
ここで使用される昆虫制御物御質とは、組成物、ある
いは害虫に有害な組成物の活性成分である。昆虫がえさ
を食べるのは、昆虫制御物質に応じて減じられ、正常な
昆虫の脱皮は妨害され、引き続き死に致る。本発明の昆
虫制御物質は、エクダイステロイド改変酵素をコードす
る遺伝子を不活性化するように遺伝子工学的につくられ
た昆虫ウイルスであり、あるいは昆虫の発育に影響する
タンパクをコードする異種遺伝子を発現するためにより
手を加えられたウイルスでありうる。あるいはそれは植
物であり、昆虫寄生生物であり、または非植物病原性細
菌であり、それらのいずれもが脱皮に影響するタンパク
をコードする異種遺伝子を発現するように遺伝子工学に
よってつくられたものである。
害虫を制御するための植物への付与に適した殺虫組成
物は、農業に適した担体と昆虫制御物質とを含有する。
本発明の殺虫組成物の付与により、えさを食べるのを減
らし、感受性のある昆虫を殺すことによって、害虫から
植物を保護することが可能となる。
当業者は、たとえば昆虫ウイルスなどの特別な害虫の
制御に適した昆虫制御物質の選択方法を知っている。
昆虫制御物質の接種、吸入、直接の接触などを含む従
来の方法によって、本発明の昆虫制御物質に害虫をさら
すことは、当業者にとって理解されることである。
その他に昆虫制御物質として考え出されたものは、昆
虫の発育に影響を与える少なくとも一種のタンパクを発
現するように遺伝子的に改変された植物と昆虫病原性の
微生物である。その様なタンパクの例は、前胸腺刺激ホ
ルモンと、羽化ホルモンと、幼若ホルモンエステラーゼ
と、エクジポン（ecdipone）グルコシルトランスフェラ
ーゼとを包含するが、これらに限定される。
細菌ウィルスと真菌と他の昆虫を包含する昆虫寄生生
物もまた遺伝子的に改変されてegtを発現する。そのよ
うな昆虫寄生生物による寄生は改変されていない寄生生
物に正常に関連した症候に加え、正常な発育の破綻をも
たらす。感染した昆虫に於ける発育の破綻は、昆虫の病
気の段階を激化させる。害虫による接触と害虫の感染は
えさを食べるのを減少させ死を早めることになる。
本発明で開示され、生物に特有のプロモーターの適切
な制御のもとに発現した昆虫の発育に影響を及ぼすEGT
タンパクをコードするDNA配列は、生物を遺伝子的に改
変し昆虫制御物質を生産するように使用され得る。遺伝
子的改変のための目標の生物は昆虫寄生生物と植物と非
植物病原性植物集落化細菌を包含する。
egt遺伝子と遺伝子生産物と遺伝子生産物に対するよ
うに導入された抗体と、そして上記に由来しあるいは関
連する他のすべての試薬は本発明の範囲内に属する。EG
Tタンパクは本発明に記載の評価法と既知の技術を用い
て実質上精製され得る。
本発明の遺伝子工学的につくられたバキュロウィルス
の主要な用途は植物に適用して害虫を生物学的に制御す
るための農業組成物の成分としてである。昆虫制御のた
めのそのような農業的に適した生産物を調製する多種多
様の方法が当該分野で知られている。
植物保護のために殺虫剤として効果的な農業組成物を
生産する必要性のある昆虫制御物質の濃度は使用される
生物および変異体のタイプと成分の剤型に依存する。組
成物内で殺虫剤として効果的な殺虫制御物質の濃度は経
験的にすみやかに決定されるがこれは当業者には理解で
きることである。例えばウィルスの殺虫剤として効果的
な濃度は実施例VIからXIに記載の種々の方法を用いてす
みやかに決定される。
農業組成物は農場での農業的使用と分散に適していな
ければならない。一般に組成物は植物に対して毒性がな
く完全な閉塞ウィルスに対して無害でなければならな
い。葉への適用は植物の葉に損傷をあたえてはならな
い。適当な固体のあるいはより好ましくは液体の単体に
加えて、農業組成物はくっつき易く粘着性のある因子
や、乳化し易く湿った因子を包含するが、昆虫の摂食や
ウィルスの作用を鈍くする様な成分を包含しない。UV不
活性から昆虫制御物質を保護する成分を加えることもま
た望ましい。害虫の制御のための農業組成物は昆虫の摂
食を刺激する因子をも包含する。
生物的昆虫制御物質の適用と農業的適用の方法を記述
した論文が入手可能である。以下に例を掲げる。Couch
とIgnoffo（1981）Microbial Control of Pests and Pl
ant Disease 1970−1980,Burges（ed.），第34章 pp.6
21−634;CorkeとRishbeth,同書，第39章 pp.717−732;
Brockwell（1980）Methods of Evaluating Nitrogen Fi
xation,Bergersen（ed.）pp.417−488;Burton（1982）B
iological Nitrogen Fixation Technology for Tropica
l Agriculture,GrahamとHarris（eds.）pp.105−144;そ
して、Roughley（1982）同書,PP.115−127;The Biology
of Baculoviruses，第２巻、前出。
本発明は以下の例によって説明されるがそれらの範囲
に制限を加えるようには解釈されるものではない。様々
の実施態様や改変や等価物が手段として用いられ、本発
明中の記述を読んだ後に、それらが本発明の精神および
／あるいは添付の請求の範囲から離れることなく当業者
に対する提案となり得ることは理解されるところであ
る。
実施例Ｉ AcMNPVゲノム上のegt遺伝子の位置を図１に例示す
る。地図単位中のスケールはAcMNPVゲノムの地図の上に
示されている。この遺伝子のヌクレオチド配列と、隣接
する領域を決定し、その後に続く遺伝子の操作を許容す
るために、まず始めにプラスミドベクターの内へこの領
域を取り囲んでいるいくつかのDNA断片をクローン化す
ることが必要である（次の文献参照。Maniatisら（198
2）Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spri
ng Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY, 標準
クローニングのための手続き）。パネルＡは制限エンド
ヌクレアーゼEcoR IとHind IIIで開裂後のAcMNPVゲノム
の線形地図を示す。パネルＢはegt遺伝子の位置を示す
7.6から11.1地図単位までのゲノムの拡大図を示す。使
用されるものとのAcMNNPVの菌株はLI菌株である（Leeと
Miller（1978）J.Virol.27:754）。クローン化したDNA
断片とその結果生じるプラスミドの名前が図１のパネル
Ｃに示されている。断片１は7.6muのPst I部位から11.1
muのBamH I部位まで広がっているが、この断片は、プラ
スミドベクターpUC19へクローン化される。断片２と３
（それぞれPst I（7.6mu）からEcoR I（8.65mu）までと
EcoR I（8.65mu）からSalＩ（10.5mu）まで）は共にベ
クターブルースクリプト（Blue script）M13＋とブルー
スクリプトM13−ヘクローン化される。（Stratagene,Sa
n Diego,California）。断片４（BstE II（8.35mu）か
らBstE II（8.7mu）まで）はブルースクリプトM13＋ヘ
クーロン化される。
多くのBCpsEとBCESプラスミドのサブクローン（subcl
ones）がつくり出される。（Henikoff（1984）Gene 28:
351）。これらのサブクローンはウィルス挿入の非常に
大きな欠失をもっているので50より少ないベースペアか
ら完全なウィルスの断片の範囲まで異なった量のウィル
スDNAを含有する。これらのサブクローンの多くとプラ
スミドBCBは完全なegt遺伝子が同じ方向に配列するよう
に配列している（Sangerら（1977）Proc.Natl.Acad,Sc
i.USA 74:5463）。得られたヌクレオチドの配列はタン
パクをコードするオープンリーディングフレームの存在
のために以下の文献に記載されたプログラムを使用して
コンピューターによって分析された。文献:PustellとKe
fatos（1984）Nucl.Acids Res.12:643−655とDevereaux
ら，（1984）Nucl.Acids Res.12:387−396。この分析に
よりegt遺伝子は506個のアミノ酸から成るタンパクをコ
ードしていることがわかった。egt遺伝子のヌクレオチ
ド配列とegt遺伝子産物の予想されたアミノ酸配列を表
１に示す。
実施例II 機能的egt遺伝子を発現できない組換え型遺伝子を構
築するために実施例Ｉに記述したプラスミドクローンを
更に操作する必要がある。プラスミドpUCPsBは制限エン
ドヌクレアーゼEcoR IとXba Iで開裂され（図３参照、e
gt遺伝子内部に位置する）、小断片は廃棄される。Esch
erichia coli lacＺ遺伝子ははpSKS104（Casadabanら
（1983）Methods Enzymol.100:293−303）からEcoR Iと
Aha IIIによって切断されたものであるが、Xba Iの張り
出した両端がT4 DNAポリメラーゼを使用して埋められた
後にEcoR IとXba Iの間に挿入される。その結果生じる
プラスミドはpEGTZと命名される。このプラスミド内で
は、挿入されたlacＺ遺伝子は、フレームにおいて配列
をコードするegtの前にある。またプラスミドpEGTDELは
EcoR IとXba I部位とを簡単に連結することにより（両
端を平滑化した後で）、その間に何の配列も挿入せずに
構築される。
すべてのウィルスは本来AcMNPV L−１に由来し（Lee
とMiller（1978）同上）、プラーク精製（plaque−puri
fied）され、Spodoptera frugiperdg IPLB−SF−21の
細胞系（SF細胞）で繁殖されるが（Vaughnら（1977）In
Vitro13:213−217）、これらを行うには前述の方法を
用いる（（LeeとMiller（186）Genetic Engineering,Pr
inciples and Methods,Vol.8（eds.J.Setlow and A.Hol
laender）,Plenum Press,N.Y.,pp.277−298,1986）。
プラスミドpEGTZは前述のMillerら（1986）の方法に
従いSF細胞中にwt AcMNPV DNAとコトランスフェクトさ
れる。この工程はウィルスDNAとプラスミドDNAの配列間
で起こる相同の組換えを許容し、結果として、ウィルス
egt遺伝子とプラスミド由来の融合したegt−lacＺ遺伝
子との置換が起こる。残ったegtコード配列は、lacＺ配
列と共にフレーム内にあるので、このような組換え型ウ
ィルスはβ−ガラクトシダーゼに結合したegtの最初の8
4個のアミノ酸を包含する融合タンパクを生産する。vEG
TZと表示される組換え型ウィルスは同定可能である。な
ぜならば、β−ガラクトシダーゼの発現が、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Ｘ−gal）のような指示薬の存在下青いウィル
スのプラークを引き起こすためである。vEGTZのegt遺伝
子の図が図３のパネルＢに示される。
組換え型ウィルスvEGTDELは、プラスミドpEGTDELとウ
ィルスvEGTZ由来のDNAとをSF細胞中にコトランスフェク
トすることにより得られる。相同の組換えはvEGTZのegt
−lacＺ融合遺伝子とpEGTDEL由来の欠失したegt遺伝子
との置換を起こす。組換え型ウィルスvEGTDELはＸ−gal
の存在下青いプラークを形成しないことによって同定さ
れる。vEGTDELのegt遺伝子の構造は図３のパネルＣに示
される。
実施例III egt遺伝子の生産物はwt AMNPV（EGTをつくる）によっ
て合成されたタンパクのvEGTZあるいはvEGTDEL（EGTを
つくらない）によって生産されたタンパクと比較するこ
とによって同定される。SF細胞はO'ReillyとMillerが記
述するように（（1990）J.Virol.64:1321−1328）20の
感染多重度（MOI）でwt AcMNPVまたはvEGTZに感染す
る。非感染細胞もまた分析されている。感染後６時間の
うち、細胞を放射性元素でラベルした〔35S〕−メチオ
ニンの存在した全タンパクが放射性元素でラベルされる
まで１時間培養した。その後細胞をアルカリ性にしタン
パクをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PA
GE）（Laemmliら（1970）Nature 227:680−685）によっ
て分離した。細分から分泌されたどのタンパクも取出
し、分析した。SDS−PAGEの処理後放射性元素でラベル
されたタンパクはオートラジオグラフィーにて検出され
た。60KDaのタンパクがwt AcMNPVに感染した細胞から分
泌されるが、vEGTZに感染した細胞あるいは非感染細胞
からは分泌されない。この60KDaのタンパクはwt−AcMNP
Vに感染した細胞の溶解産物中には検出されないが、こ
のことはタンパクが細胞から分泌されていることを示し
ている。これらのデータはegt遺伝子の生産物は60KDaの
分泌されたタンパクでありヌクレオチドとアミノ酸配列
のデータとよく一致した特徴を示している。
実施例IV EGTタンパクの酵素活性はwt AcMNPVとvEGTZに感染し
たSF細胞を比較することによって同定される。wt AcMNP
VとvEGTZに感染したSF細胞は列IIIに記載してある。感
染後12時間で細胞と細胞外媒体は集められ別々に分離さ
れる。非感染細胞も平行して処理される。細胞の溶解産
物あるいは細胞外媒体は1mM UDP−グルコースと0.25μC
i〔3H〕エクダイソンの存在下、O'ReillyとMillerが記
載した方法（（1989）Science245:1110−1112）によっ
て培養される。細胞の溶解産物あるいは媒体におけるエ
クダイステロイドUDP−グルコシルトランスフェラーゼ
の活性はエクダイソン−グルコースの結合を形成するた
めUDP−グルコースからエクダイソンへグルコースの転
移を触媒するものである。エクダイソンとエクダイソン
−グルコースは結合はシリカゲルを用いた薄層クロマト
グラフィーによってそれぞれ分離され（BansalとGessne
r（1988）Anal.Biochem.109:321）、オートラジオグラ
フィーによって視覚化される。エクダイソン−グルコー
ス結合（Ｇ）はwt AcMNPVに感染した細胞溶解産物ある
いは細胞外媒体が分析された時にだけ形成される。非感
染のあるいはvEGTZ感染の細胞溶解産物かまたは媒体が
使用される時には結合が観察されないが、これは活性は
egtの発現に依存していることを示している。ほとんど
の活性は細胞外媒体中にかたよっており、このことは実
施例IIIで議論したデータと一致している。そのグルコ
ースがエクダイソンと結合していることの証拠は、UDP
−グルコースが放射性元素でラベルしたUDP−〔Ｕ−
14C〕グルコースと置換することを除く上述の方法に従
いwtに感染した溶解産物を分析することによって得るこ
とができる。ラベルされていないUDP−ブルコースある
いはレベルしたUDP−〔Ｕ−14C〕グルコースで実効され
た反応は、共に〔3H〕エクダイソンが存在するが、これ
らの反応と結合のシンチレーションの計数はエクダイソ
ン由来の3Hとグルコース由来の14Cが共に検知されるこ
とを示している。これらのデータでegt遺伝子産物は、U
DP−グルコースからエクダイソンへのグルコースの転移
を触媒するUDP−グルコシルトランスフェラーゼである
ことがわかる。
EGTの基質特異性をより完全に調べるための実験を行
った。これらの実験では、著しいegt活性を有するwt−A
cMNPVに感染した細胞由来の細胞外媒体の中へ種々の基
質（1mM）を入れて培養した。どの観察される結合もegt
に依存していることを確実にするためのコントロールと
して、EGTを産出しない非感染細胞由来の媒体およびvEG
TZに感染した細胞由来の媒体で、各々基質を培養した。
0.05μmCiのUDP−〔Ｕ−14C〕グルコースがそれぞれの
反応に加えられた。EGTのための基質として作用するど
の化合物もグルコースと結合する。グルコースは放射性
元素によってラベルれているので検出され得る。
更なるコントロールはUDP−〔Ｕ−14C〕グルクロン酸
を、wt感染細胞由来の媒体との反応の別の組に加えるこ
とであり、そのことによりグルクロン酸が本反応が転移
しないということが示される。得られたデータを表３に
示す。同定された基質はエクダイソンと20−ヒドロキシ
エクダイソンとマキステロンＡだけでありこれらすべて
エクダイステロイドである。結合はにせのあるいはvEGT
Z感染の細胞由来の媒体を使用して観察されず、このこ
とにより観察される活性はegtの発現に依存しているこ
とが確かめらた。UDP−〔U14C〕グルクロン酸が使用さ
れると結合が観察されないが、これはEGTはグルクロン
酸を転移しないことを実証している。
実施例Ｖ 他のバキュロウィルスもまたAcMNPV egt遺伝子と実
質的に相同性をもつ遺伝子を含有することを実証するた
めに、OpMNPVのDNAが単離され制限エンドヌレアーゼEco
R IとBamH IとHind IIIによってばらばらに分解さた。
これらの酵素はウィルスDNAを開裂し、OpMNPVゲノム上
における位置がすでに知られている異なった大きさのい
くつかの断片に分解する（Leisyら（1984）J.Virol.52:
699）。サザンハイブリダイゼーション法がT.Maniatis
らの文献（（1982）同上）の記述に従い行われた。AcMN
PV egt遺伝子の内部断片が酵素EcoR IとXba Iによって
プラスミドBCESから切除された（図１参照）。この断片
を放射性元素32PでラベルしOpMNPVゲノム内のあらゆる
関連する配列を同定するプローブとして使用する。適当
な条件のもとに、当該分野では理解されているが、DNA
断片は類似のあるいは同様の配列を含有するDNAの他の
断片に結合する。このようにAcMNNPV egtプローブは関
連するDNA配列を有するナイロン膜上でどのOpMNPV DNA
断片とも結合する。結合したプローブの位置は膜をＸ線
フィルムにさらすことにより視覚化される。egtプロー
ブではまず最初におだやかな条件のもと（1M塩化ナトリ
ウム,0.3Mクエン酸ナトリウム、５％デキストランサル
フェート、5X Denhardt溶媒および0.25％SDS 37℃）で
ナイロン膜とハイブリダイズする。これはプローブを比
較的離れた関係の配列にハイブリダイズさせる。ハイブ
リダイゼーションの温度を上げたり、あるいはハイブリ
ダイゼーション溶液の中へホルムアミドを添加すること
によって特異的なハイブリダイゼーションバンドが観察
されるまでハイブリダイゼーションの厳格さは増大す
る。図４のハイブリダイゼーションの条件は1M塩化ナト
リウム、0.3Mクエン酸ナトリウム、５％デキストランサ
ルフェート、5X Denhardt溶媒と0.25％SDS,68℃で15時
間である。図４はAcMNNPV egtプローブがOpMNPV DNAの
特異な断片、いわゆるEcoR I断片ＢとBamH I断片ＡとHi
nd III断片ＮおよびHind III断片Ｓとに結合することを
示している。OpMNPVegt遺伝子がAcMNPV遺伝子とゲノム
中相対的に同じ位置にあることに注目されたい。同様の
実験記録が他の昆虫病原体中のegt相同性遺伝子の同定
に応用され得る。非常に相同性の低い（highly diverge
nt）配列にとって実施例IVに示される分析方法を使用し
てEGTの活性を確かめることが必要となる。その後、ゲ
ノムの分子遺伝学的分析は既知の方法論を用いてEGT酵
素をコードする遺伝子を単離することが必要となる。
また、実施例IVに示したエクダイステロイドUDP−グ
ルコシルトランスフェラーゼ活性測定用の特異な分析方
法を用いて他の生物中にEGT遺伝子を見出すことも可能
である。この分析方法は従来の生物学的技術で精製する
間に酸素を同定するのに使用される。一旦精製されると
EGTタンパクの部分的アミノ酸配列は決定される。この
情報はゲノム中にEGT遺伝子を位置づけるのに使用され
るオリゴヌクレオチドプローブを作り出すのに使われ
る。
実施例VI エクダイステロイドの血液リンパ滴定量は幼虫−幼虫
および幼虫−蛹の脱皮を規制すべく環状に変動してい
く。そしてグルコースの結合はエクダイステロイドを不
活性化する恐れがあるので（Warrenら（1986）J.Liq.Ch
romatogr.９:1759;Thompsonら（1987）Arch.Insect Bio
chem.Physiol.４:1;Thompsonら（1988）Arch.Insect Bi
ochem.Physiol.７:157）、おそらくegtの発現はAcMNPV
の感染中に感染した昆虫の正常な発育の過程を破壊す
る。そのような破壊を実証するために、新たに脱皮した
第４齢のＳ．frugiperda幼虫をwt AcMNPVあるいはvEGTZ
を注入して感染させ、それらの発育にどのような妨害が
あってもわかるように毎日モニターした。幼虫のひとつ
の同齢集団にネガティブコントロールとして細胞培養液
を注入した。この実験結果を次の表４に示す。細胞培養
液を注入したすべての幼虫は（偽感染）予想どおり第５
齢期に脱皮する。wtウィルスで感染した16匹の幼虫の内
１匹だけがこの変化をする。対称的に、変異型のvEGTZ
に感染したすべての幼虫は第４から第５齢期への脱皮を
受ける。このようにwt AcMNPVによるegtの発現は明らか
にかつ特異的に宿主の脱皮を阻害する。感染した幼虫の
両方の集団はその結果ウィルスの感染に屈し、egtの破
壊はvEGTZにその宿主を殺すことを妨げない。
表４ AcMNPV感染による脱皮の阻害 ウィルス 脱皮数 死亡数 偽 16 0 野生型 1 16 vEGTZ 16 16 第４齢期のS. frugiperda幼虫には１×105pfuのwt A
cMNPVまたはvEGTZ（５μ中）を注入する。偽感染の幼
虫には５μの細胞培養液を注入する。各々の同齢集団
は人工的な食事と（R.L.Burton（1969）ARS publicatio
n,pp.33p134）28℃で14:10の明：暗の時間比で飼育した
16匹の幼虫を含む。脱皮は毎日モニターされ死亡数は７
日目に記録される。
同様の結果が第５齢期初期に注入した幼虫でも得られ
ている。新しく脱皮した第５齢期幼虫を使用すると、wt
感染した幼虫は蛹化の徴候を示さなかった。他方、vEGT
Z感染した幼虫の大多数はいくつかの行動上の変化を示
した（えさを食べるのをやめたり、ふらふらしたり、回
転したりなど）が、これはまさに幼虫−蛹への脱皮の特
徴である。しかし、すべてのウィルス感染した幼虫は蛹
化前に死亡した。これらのデータはAcMNPVの感染が幼虫
が脱皮し蛹化するのを妨げていることを示している。さ
らにデータは昆虫の発育の妨害はegtの発現によるもの
であることを示している。
実施例V II 野生型（wt）AcMNPVとvEGTZとの生体内での生物検定
は、egt遺伝子の発現が感染した幼虫のえさを食べる時
間を延長すること、およびegtの破壊が農薬としてのウ
ィルスの特徴を改善することを表している。本研究にお
いてはS. frugiperda幼虫に第４齢期初期にwt AcMNPV
またはvEGTZのいずれかを注入している。比較としてコ
ントロールの幼虫にはウィルスを含まない細胞培養媒体
を注入する。幼虫は毎日体重増加と脱皮あるいは蛹化の
徴候と死亡数をチェックされる。幼虫の異なった集団の
毎日の平均体重増加量と死亡率は図６と図７にそれぞれ
示している。コントロールの幼虫は最初の２日間でほど
ほどの成長を示している。第２日目の間にすべての第５
齢期に脱皮する。その後、蛹化の準備のためえさを食べ
るのをやめる前の更に２日間で劇的な成長をする。wt A
cMNPVに感染した16匹のうちのわずか１匹が脱皮し、か
わりに幼虫は引き続き感染したまま３日間成長を続け
る。この段階で病気にかかりはじめたが５日目まではど
れも死なない。wt AcMNPVに感染した幼虫は６日目まで
にすべて死ぬ。対称的にvEGTZに感染したすべての幼虫
は第４から第５齢期へ脱皮し、この期間にえさを食べる
のをやめる。このことが１日目から２日目への成長の停
止を意味している。脱皮後再びえさを食べ始めたが３日
目までに病気の徴候を示し始めた。感染後４日間たった
死に始め５日目までにすべて死んだ。機能的egtが欠落
したAcMNPV誘導体に感染した幼虫は野生型のAcMNPVに感
染したものよりもえさを食べるのが減少し、感染後より
早く死ぬ。
これらの現象は第５齢期の幼虫の感染により、より顕
著に表される（図８と９）。予想どおりコントロールの
幼虫は蛹化準備のためにえさを食べるのをやめる前の２
日間にかなり成長する。えさを食べなくなってから引き
続き劇的な体重の減少がある。wt AcMNPVに感染した幼
虫はそのようなえさを食べなくなる徴候をみせない。病
気になり始める前の２日間にえさを食べ続け体重を増や
す。死亡は感染後７日間までは完結しない。
要約するとvEGTZに感染した幼虫は、コントロールと
同様に、感染後最初の２日間だけえさを食べるというこ
とがわかる。この後蛹化の前に劇的な体重の減少がみら
れる。しかしながら、どの幼虫も蛹化せず、３日目まで
に病気の徴候がみられ、感染期６日ですべて死ぬ。また
もvEGTZはえさの摂食を減少させ死に至るのを早める。
実施例V III vEGTZとwt AcMNPVの感染効果を新たにふ化した第１齢
のS. frugiperda幼虫で比較する。新生のS. frugiper
da幼虫に様々な濃度のvEGTZあるいはwt AcMNPV多面体
（ポリヘドリン;polyhedrin）封入体を含んだえさを与
え、毎日の死亡率を観察した。２つの異なった投与に対
する得られた結果を図10および図11に示す。双方の投与
に対してvEGTZに感染した幼虫はwtウィルスに感染した
幼虫よりも実質的にかなり早い死亡率を示すことがわか
る。一般に組換え型ウィルスに感染した幼虫はwt型に感
染した幼虫よりも３、４日早く死亡した。この結果は不
活性化したegt遺伝子を包含するバキュロウィルスは完
全なegt遺伝子をもつバキュロウィルスよりも生物農薬
としてより優れたものであることを支持する。
実施例IX 前胸腺刺激ホルモン（PTTH）を発現する組換え型ウィ
ルスを構築するために、PTTH遺伝子がトランスプレスメ
ント（transplacement）プラスミドpEVmodXIVへクロー
ン化された。このプラスミドは1989年５月17日に出願さ
れた米国特許出願No.07/353,847に記載されている。こ
れについては本願明細書に記載されている。このプラス
ミドはAcMNPV多面体遺伝子の上流と下流の配列を包含し
ているが、この遺伝子は発現可能なPTTH遺伝子のEgt-ウ
ィルスへの相同的組換えを媒介する。マルチクローニン
グ部位は通常の多面体翻訳開始部位に位置し、LSXIV−
改変多面体プロモーターから下流へと向かっている（Ra
nkinら、Gene,70:39（1988））。Bombyx mori PTTH遺
伝子はプラスミドpBc22K−C19（KawakamiらScience, 24
7:1333（1990）から、制限酵素Hind IIIの分解によって
切除される。Hind IIIの相補末端はT4 DNAポリメラーゼ
によって満たされており、プラスミドはEcoR Iで開裂す
る。pEVmodXIVはKpn Iで開裂し、Kpn Iの張り出し末端
はT4 DNAポリメラーゼによって取り除かれプラスミドは
EcoR Iで開裂する。PTTH遺伝子をもつ断片はこれらの部
位を経由してトランスプレスメントプラスミドの中へク
ローン化される。この結果生じるプラスミドpEVPTTHの
中で、PTTH遺伝子はLSXIVに改変された多面体プロモー
ターからすぐに下流に位置する。
PTTHを発現する組換え型ウィルスはpEVPTTHをSF細胞
の内へvEGTDELあるいはwt AcMNPVとコトランスフェクト
することによって得られる。ウィルスDNA中で隣接する
多面体配列とpEVPTTH中でPTTH遺伝子に隣接する配列と
の間の組換えは多面体遺伝子とPTTHとの置換となる。こ
の組換えが起こったウィルスは閉塞陰性型の表現型によ
って同定される（MillerらGenetic Engineering Princi
ples and Methods,Vol.8,J.Setlow and A.Hollander,ed
s.Plenum Press N.Y.,1986,pp−277−298）。それぞれ
の組換え型ウィルスはvEGT−PTTHとvWTPTTHと命名され
た。
幼若ホルモンエステラーゼを発現する組換え型ウィル
スを生産する方法も類似している。まずHeliothis vire
scensの幼若ホルモンエステラーゼ遺伝子（Hanzlikら
（1989）J.Biol.Chem.264:12419）がプラスミドpJHE16B
（Hammockら（1990）Nature 344:458）からEcoR IとKp
n Iで分解することによって切り出される。トランスプ
レスメントプラスミドpEVmodXIVもまたEcoR IとKpn Iに
よって切り出され、断片を含む幼若ホルモンエステラー
ゼ遺伝子はこの部位に挿入される。pEVJHEはこのように
幼若ホルモンエステラーゼ遺伝子に隣接する多面体遺伝
子配列を含む。vEGT−JHEとvWTJHEとの組換え型ウィル
スはpEVJHEとvEGTZあるいはwt AcMNPV DNAとをそれぞれ
コトランスフェクトし、閉塞陰性型プラークをスクリー
ニングすることによって得られる。
羽化ホルモンを発現する組換え型ウィルスを構築する
ため、Manduca sexta羽化ホルモン遺伝子がプラスミドp
F5−３（horodiskyiら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.US
A，（86:8123））からEcoR IとHpa Iで分解して切り出
された。pEVmodXIVはKpn Iで開裂し、Kpn Iの張り出し
末端はT4 DNAポリメラーゼで取り除かれ、その後EcoR I
で開裂した。羽化ホルモン遺伝子含有断片のトランスプ
レスメントプラスミドへの挿入は組換えpEVEHを産出す
るが、そのpEVEHの中で羽化ホルモン遺伝子はLSXIV改変
多面体プロモーターから下流へと位置づけられる。この
プラスミドのvEGTZあるいはvDA26Z DNAとのコトランス
フェクトにより組換えウィルスvEGT−EHおよびvDA26ZEH
それぞれの単離が可能となる。vDA26ZはDA26遺伝子に挿
入されたE.coli lacＺをもつ組換え型ウィルスである
（O'Reillyら.,J.Gen Virol,In Press）。DA26遺伝子の
作用はわかっておらず、表現型的には脱皮に関して野生
型である。lacＺ遺伝子の存在のため、vDA26Z誘導体は
Ｘ−gal存在した青いプラークを引き起こす。
実施例Ｘ 生体内でのこれらの組換え型ウィルスの効果を評価す
るため、S.frugiperdaの幼虫を第３齢期の後期あるいは
第４齢期の早期に２×105pfuのvEGTDELあるいはvEGT−P
TTHあるいはvWTPTTHあるいはそれぞれ１×105pfuのvEGT
−PTTHとvEGT−JHEを合わせたもので感染させる。毎日
の死亡率の割合（％）を表５に示す。全EGT−ウィルス
に関し、感染した昆虫は第４齢期を通過し、そして頭が
いのずれを示す。これは３日目までに脱皮がまさに起こ
ろうとしているのを示すものである。vEGT−PTTH単独の
感染あるいはvEGT−PTTHとvEGT−JHE両方による感染
後、PTTEの発現は感染した昆虫を早く病気にさせ、４日
目までに高い死亡率がみられる。対称的にvEGTDELに感
染した昆虫は５日目までに高い死亡率を示さない。予想
どおり、vWTPTTHに感染した昆虫は脱皮して第５齢期に
入る徴候を示さない。頭がいのずれは観察されず、６日
目まで高い死亡率を示さない。EGTの非存在下PTTHの発
現はvEGTDELと比べて１日で感染を引き起こり、この様
に死の時期を早める。これらのデータは昆虫の脱皮に影
響する遺伝子を発現することによってバキュロウィルス
の農薬の特徴を改善することを実証し、そのような戦略
が効果的であるためにはegtが不活性でなければならな
いことを示している。
実施例XI 昆虫の発育に影響する異種のタンパクを発現する閉塞
陽性型ウィルスの生産は以下の方法で行われ得る。最初
に、β−ガラクトシダーゼを発現するEGT−閉塞陰性型
ウィルスが次の様に構築される。酵素β−ガラクトシダ
ーゼをコードするE.coli lacＺがトランスプレスメン
トベクターpSynVI−にクローン化される。このpSynVI-
は1989年５月17日に出願された米国特許出願No.07/353,
847に記述されている。pSynVI-はAcMNPV多面体遺伝子か
ら上流と下流の配列を含み、マルチクローニング部位は
合成改変多面体プロモーターからすぐ下流に位置してい
る。lacＺ遺伝子はPst Iで開裂することによりプラスミ
ドpSKS105（Casadabanら（1983）同上）より切除され
る。Pst Iの張り出し末端はムングビーン（mung bean）
ヌクレアーゼによって除去され、プラスミドはSst IIで
開裂する。pSynVI-はEcoR VとSst IIで開裂し、lacＺ遺
伝子はこれらの部位中にクローン化される。その結果生
じるプラスミドはpSynVI-galと呼ばれ、合成改変多面体
プロモーターのすぐ下流にlacＺ遺伝子を含有する。pSy
nVI-galはSF細胞中にvEGTDEL DNAとコトランスフェクト
され、β−ガラクトシダーゼを発現する閉塞陰性型のプ
ラークは単離され、ウィルスvEGT−SynVI-galを与え
る。
PTTHを発現する閉塞陰性型の組換えウィルスを構築す
るため、PTTH遺伝子はトランスプルスメントベクターpS
pXIVVI＋X3中にクローン化される。
pSpXIVVI＋X3を構築するために、中間体のプラスミド
pSpXIVVI＋が最初に構築される。pSptsXIVVI＋CAT（198
9年５月17日出願の米国特許出願No.07/353,847に記載）
はBgl IIで切断され両端はDNAポリメラーゼで埋められ
る。プラスミドpSynVI＋wtp（1989年５月17日出願の米
国特許出願No.07/353,847に記載）はEcoR VとSac Iで切
断されEcoR V−Sac Iの小断片は精製される。２つのプ
ラスミドの断片が連結されpSpXIVVI＋が選択される。Bg
1 II部位からSac I部位までのマルチクローニング部位
が、pSynVI＋wtpと同じであることを除いてはpSpXIVVI
＋プラスミドはpSPLSXIVVI＋CATと同じである。マルチ
クローニオング部位＃３（1989年５月17日出願の米国特
許出願No.07/353,847に記載）を構築するためにポリリ
ンカー（polylinker）がpSpXIVVI＋のEcoR I−Sac I部
位に挿入される。融合したBgl II部位からSac Iまでのp
SPXIVVI＋X3に於けるマルチクローニング部位は次のと
おりである。
このプラスミドは野生型の多面体プロモーターの制御
のもと完全な多面体遺伝子を含有する合成による改変さ
れた多面体プロモーターは多面体遺伝子の上流でかつ反
対方向に位置する。マルチクローニング部位はこの合成
による改変された多面体プロモーターの制御のもと遺伝
子の挿入の発現を許容すべく位置している。PTTH遺伝子
はパラスミドpBc22K−C19（Kawakamiら（1990）同上）
からHind IIIによる分解で切除された。Hind IIIの張り
出し末端はT4 DNAポリメラーゼにおいて埋められ、そし
てそのプラスミドはEcoR Iで開裂した。pSpXIVVI+X3をE
coR IとSma Iで開裂し、PTTH遺伝子をこれらの部位にク
ローン化し、プラスミドpSpPTTHを産出した。このプラ
スミド内でPTTH遺伝子はこの合成により改変された多面
体プロモーターから下流にあり、野生型多面体プロモー
ターとコード配列の隣に位置し、かつ反対の方向を向い
ている。PTTHも多面体遺伝子もAcMNPV内で多面体遺伝子
の上流と下流の配列に対して隣接している。
pSpPTTHはSF細胞の中にvEGT−SynVI-gal DNAとコトラ
ンスフェクトしている。ウィルスDNAにおける多面体の
上流と下流の配列およびpSpPTTHにおけるPTTHと多面体
遺伝子に隣接する配列との組換えはvEGT-SynVI-galのla
cＺ遺伝子をpSpPTTH由来の多面体遺伝子と置換すること
になる。組換え型ウィルスvEGT−SpPTTHは閉塞陽性型で
β−ガラクトシダーゼ陰性の表現型によって同定され
る。
幼若ホルモンエステラーゼを発現する閉塞陽性型ウィ
ルスを構築するために、幼若ホルモンエステラーゼ遺伝
子がプラスミドpJHE16B（Hammockら（1990）同上）か
ら、Kpn Iで分解し、張り出し末端をT4 DNAポリメラー
ゼで除去し更にEcoR Iで分解することによって切除され
る。その後幼若ホルモンエステラーゼ遺伝子を、EcoR I
とSam Iですでに開裂したプラスミドpSpXIVVI+X3にクロ
ーン化する。その結果生じたプラスミドpSpJHEをvEGT−
SynVI-gal DNAとコトランスフェクトして組換え型ウィ
ルスvEGT−SpJHEを産出する。この閉塞陽性型ウィルス
は合成によって改変された多面体プロモーターの制御の
もと幼若ホルモンエステラーゼを発現する。
同様に羽化ホルモンをプラスミドpF5−３（Horodyski
ら（1990）同上）からEcoR IとHpa Iで分解することに
より切り出し、EcoR IとSma Iで開裂したpSpXIVVI+X3に
クローン化する。それによって得られたプラスミドpSpE
HをvEGT−SynVI-gal DNAとコトランスフェクトして組換
えウィルスvEGT−SpEHを産出する。
脱皮に影響するタンパク（昆虫ペプチドホルモンある
いは昆虫ホルモンを不活性化する酵素）を発現するよう
に更に遺伝的に改変された閉塞陽性型のEGT-ウィルス
は、wtバキュロウィルス、あるいはegt遺伝子だけを不
活性化するために変えられたバキュロウィルスよりも、
感染した昆虫がえさを食べるのを減少させ、より早く死
に致らしめる。
実施例XIの昆虫制御物質は閉塞しているので、これら
のウィルスを、感染した作物に適用可能で、殺虫剤とし
て効果的で、農業的に受容され得る組成物に取り込むこ
とができる。このような閉塞ウィルス粒子の摂取はそれ
らウィルスの農場での繁殖と昆虫制御物質の蔓延につな
がる。感染は昆虫を死に至らしめ、それ故害虫からの作
物の保護となる。
以上の事項は単に本発明の好ましい特定の実施態様に
のみ関連するということ、そして多くの改変や変更が添
付されたクレーム中に述べられている発明の精神と範囲
から離れることなくなされるということは理解されねば
ならない。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/34 C12N 7/01 C12N 15/54 A01N 63/00 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ ＷＰＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ＰＩＲ Ｇｅｒｅｓｅｇ

Claims (53)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然に存在するエクダイステロイド改変酵
    素をコードする遺伝子が不活性化されている、昆虫ウィ
    ルスを含有する昆虫制御物質であって、ここで該酵素
    が、以下のアミノ酸配列を有するか、または以下のアミ
    ノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸欠失、置換、およ
    び／もしくは付加を有するアミノ酸配列を有する、昆虫
    制御物質：
  2. 【請求項２】天然に存在するエクダイステロイド改変酵
    素をコードする遺伝子が不活性化されている、昆虫ウィ
    ルスを含有する昆虫制御物質であって、ここで該遺伝子
    が、以下の約149番目のヌクレオチドから約1670番目の
    ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含むか、または
    以下の約149番目のヌクレオチドから約1670番目のヌク
    レオチドまでのヌクレオチド配列の相補鎖にストリンジ
    ェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイ
    ズし得るヌクレオチド配列を含む、昆虫制御物質：
  3. 【請求項３】前記遺伝子がegt遺伝子である請求項１ま
    たは２に記載の昆虫制御物質。
  4. 【請求項４】前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスであ
    る請求項３に記載の昆虫制御物質。
  5. 【請求項５】前記バキュロウィルスが核多角体病ウィル
    スである請求項４に記載の昆虫制御物質。
  6. 【請求項６】前記の核多角体病ウィルスがAutographa c
    alifornica核多角体病ウィルスおよびOrgyia pseudotsu
    gata核多角体病ウィルスでなる群から選択される、請求
    項５に記載の昆虫制御物質。
  7. 【請求項７】エクダイステロイドUDP−グルコシルトラ
    ンスフェラーゼをコードする不活性化された遺伝子を有
    する昆虫ウィルスがvEGTZおよびvEGTDELのうちのひとつ
    である、請求項６に記載の昆虫制御物質。
  8. 【請求項８】前記昆虫ウィルスが少なくとも１種の異種
    遺伝子の挿入によって、さらに改変された請求項３に記
    載の昆虫制御物質であって、前記異種遺伝子が前記ウィ
    ルスに感染した昆虫細胞で発現可能であり、そして、前
    記遺伝子が脱皮に影響するタンパクをコードする、昆虫
    制御物質。
  9. 【請求項９】前記異種遺伝子が、前胸腺刺激ホルモン、
    羽化ホルモン、および幼若ホルモンエステラーゼでなる
    タンパクをコードする遺伝子の群から選択される、請求
    項８に記載の昆虫制御物質。
  10. 【請求項１０】前記異種遺伝子が前胸腺刺激ホルモンで
    ある、請求項９に記載の昆虫制御物質。
  11. 【請求項１１】前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスで
    ある請求項10に記載の昆虫制御物質。
  12. 【請求項１２】前記昆虫ウィルスが、Autographa calif
    ornica核多角体病ウィルスである、請求項11に記載の昆
    虫制御物質。
  13. 【請求項１３】前記異種遺伝子が羽化ホルモンである請
    求項９に記載の昆虫制御物質。
  14. 【請求項１４】前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスで
    ある請求項13に記載の昆虫制御物質。
  15. 【請求項１５】前記昆虫ウィルスがAutographa califor
    nica核多角体病ウィルスである、請求項14に記載の昆虫
    制御物質。
  16. 【請求項１６】前記異種遺伝子が幼若ホルモンエステラ
    ーゼである請求項９に記載の昆虫制御物質。
  17. 【請求項１７】前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスで
    ある請求項16に記載の昆虫制御物質。
  18. 【請求項１８】前記昆虫ウィルスがAutographa califor
    nica核多角体病ウィルスである、請求項17に記載の昆虫
    制御物質。
  19. 【請求項１９】次の（ａ）および（ｂ）の工程を包含す
    る、昆虫ウィルスを含有する改良された昆虫制御物質を
    製造する方法： （ａ）脱皮に影響するタンパクまたはその活性フラグメ
    ントをコードする遺伝子を単離する工程であって、ここ
    で該タンパク質は以下のアミノ酸配列を有するか、また
    は以下のアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸欠
    失、置換、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列
    を有する、工程： ；および （ｂ）該遺伝子を本来発現しない該昆虫ウィルス中に該
    遺伝子を挿入する工程。
  20. 【請求項２０】次の（ａ）および（ｂ）の工程を包含す
    る、昆虫ウィルスを含有する改良された昆虫制御物質を
    制御する方法： （ａ）以下の約149番目のヌクレオチドから約1670番目
    のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含む遺伝子
    か、または以下の約149番目のヌクレオチドから約1670
    番目のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列の相補鎖に
    ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハ
    イブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む遺伝子を単
    離する工程であって、ここで該遺伝子を発現することに
    よって産生されるタンパク質が脱皮に影響する、工程： ；および （ｂ）該遺伝子を本来発現しない該昆虫ウィルス中に該
    遺伝子を挿入する工程。
  21. 【請求項２１】前記遺伝子が、エクダイステロイドUDP
    −グルコシルトランスフェラーゼ、前胸腺刺激ホルモ
    ン、羽化ホルモン、および幼若ホルモンエステラーゼで
    なる脱皮に影響するタンパクの群から選択されるタンパ
    クをコードする、請求項19または20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記昆虫ウィルスがegt遺伝子を発現し
    ない請求項21に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記遺伝子がバキュロウィルス由来であ
    る請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記バキュロウィルスが核多角体病ウィ
    ルスである請求項23に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記核多角体病ウィルスが、Autographa
    californica核多角体病ウィルスおよびOrgyia pseudot
    sugata核多角体病ウィルスでなる核多角体病ウィルスの
    群から選択される、請求項24に記載の方法。
  26. 【請求項２６】昆虫ウィルスを含有する改良された昆虫
    制御物質を生産する方法であって、ここで該方法は、該
    昆虫ウィルス中のエクダイステロイド改変酵素をコード
    する遺伝子を不活性化する工程を包含し、該遺伝子が該
    昆虫ウィルスの本来のゲノムの一部であり、ここで該酵
    素は、以下のアミノ酸配列を有するか、または以下のア
    ミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸欠失、置換、お
    よび／もしくは付加を有するアミノ酸配列を有する、方
    法：
  27. 【請求項２７】昆虫ウィルスを含有する改良された昆虫
    制御物質を生産する方法であって、ここで該方法は、該
    昆虫ウィルス中のエクダイステロイド改変酵素をコード
    する遺伝子を不活性化する工程を包含し、該遺伝子が該
    昆虫ウィルスの本来のゲノムの一部であり、かつ以下の
    約149番目のヌクレオチドから約1670番目のヌクレオチ
    ドまでのヌクレオチド配列を含むか、または以下の約14
    9番目のヌクレオチドから約1670番目のヌクレオチドま
    でのヌクレオチド配列の相補鎖にストリンジェントなハ
    イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌ
    クレオチド配列を含む、方法：
  28. 【請求項２８】前記遺伝子がエクダイステロイドUDP−
    グルコシルトランスフェラーゼをコードする請求項26ま
    たは27に記載の方法。
  29. 【請求項２９】前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスで
    ある請求項28に記載の方法。
  30. 【請求項３０】前記バキュロウィルスが核多角体病ウィ
    ルスである請求項29に記載の方法。
  31. 【請求項３１】エクダイステロイドUDP−グルコシルト
    ランスフェラーゼをコードする遺伝子を不活性化する欠
    失をもったAutographa californica核多角体病ウィルス
    誘導体が、昆虫細胞中の該ウィルスの連続する移動の後
    に単離される請求項26または27に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記核多角体病ウィルスが、Autographa
    californica核多角体病ウィルスおよびOrgyia pseudot
    sugata核多角体病ウィルスでなる核多角体病ウィルスの
    群から選択される、請求項30に記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記核多角体病ウィルスがvEGTZおよびv
    EGTDELのうちのひとつである請求項32に記載の方法。
  34. 【請求項３４】昆虫細胞内で発現しうる異種遺伝子の挿
    入により、前記昆虫ウィルスを遺伝子的に変換する工程
    をさらに包含する請求項26または27に記載の方法であっ
    て、該遺伝子が脱皮に影響するタンパクをコードする、
    方法。
  35. 【請求項３５】前記第２の遺伝子が、前胸腺刺激ホルモ
    ンをコードする遺伝子、羽化ホルモンをコードする遺伝
    子、および幼若ホルモンエステラーゼをコードする遺伝
    子でなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
  36. 【請求項３６】昆虫を昆虫ウィルスを含有する昆虫制御
    物質にさらす工程を包含する昆虫を制御する方法であっ
    て、該昆虫ウィルスがエクダイステロイド改変酵素また
    はその活性フラグメントをコードする遺伝子を発現する
    ように遺伝子操作されており、該酵素は、以下のアミノ
    酸配列を有するか、または以下のアミノ酸配列に１つま
    たは数個のアミノ酸欠失、置換、および／もしくは付加
    を有するアミノ酸配列を有し、ここで該酵素が該昆虫に
    有害に作用する、方法：
  37. 【請求項３７】昆虫を昆虫ウィルスを含有する昆虫制御
    物質にさらす工程を包含する昆虫を制御する方法であっ
    て、該昆虫ウィルスがエクダイステロイド改変酵素をコ
    ードする遺伝子を発現するように遺伝子操作されてお
    り、該遺伝子が、以下の約149番目のヌクレオチドから
    約1670番目のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含
    むか、または以下の約149番目のヌクレオチドから約167
    0番目のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列の相補鎖
    にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
    ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、該酵素
    が該昆虫に有害に作用する、方法：
  38. 【請求項３８】エクダイステロイド改変酵素をコードす
    る遺伝子を含む昆虫ウィルスを含有する昆虫制御物質に
    昆虫をさらす工程を包含する昆虫制御のための方法であ
    って、ここで、該酵素は、以下のアミノ酸配列を有する
    か、または以下のアミノ酸配列に１つまたは数個のアミ
    ノ酸欠失、置換、および／もしくは付加を有するアミノ
    酸配列を有し、そして該遺伝子が不活性化されている、
    方法：
  39. 【請求項３９】エクダイステロイド改変酵素をコードす
    る遺伝子を含む昆虫ウィルスを含有する昆虫制御物質に
    昆虫をさらす工程を包含する昆虫制御のための方法であ
    って、ここで、該遺伝子は、以下の約149番目のヌクレ
    オチドから約1670番目のヌクレオチドまでのヌクレオチ
    ド配列を含むか、または以下の約149番目のヌクレオチ
    ドから約1670番目のヌクレオチドまでのヌクレオチド配
    列の相補鎖にストリンジェントなハイブリダイゼーショ
    ン条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含
    み、そして該遺伝子が不活性化されている、方法：
  40. 【請求項４０】前記遺伝子がエクダイステロイドUDP−
    グルコシルトランスフェラーゼをコードする請求項38ま
    たは39に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスで
    ある請求項40に記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記バキュロウィルスが、Autographa c
    alifornica核多角体病ウィルスおよびOrgyia pseudotsu
    gata核多角体病ウィルスでなる群から選択される、請求
    項41に記載の方法。
  43. 【請求項４３】前記遺伝子が、前記ウィルスに感染した
    昆虫細胞中で発現しうる異種遺伝子の挿入により不活性
    化された、請求項42に記載の方法であって、異種遺伝子
    が脱皮に影響するタンパクをコードする、方法。
  44. 【請求項４４】前記の第２の遺伝子が、前胸腺刺激ホル
    モンをコードする遺伝子、羽化ホルモンをコードする遺
    伝子、および幼若ホルモンエステラーゼをコードする遺
    伝子でなる群から選択される、請求項43の方法であっ
    て、該遺伝子が前記ウィルスに感染した昆虫細胞中で発
    現し得る、方法。
  45. 【請求項４５】昆虫制御物質と農業に適した担体とを含
    有する殺虫組成物であって、該昆虫制御物質がエクダス
    テロイドUDP−グルコシルトランスフェラーゼをコード
    し天然に存在する遺伝子を不活性化するように遺伝子的
    に改変された昆虫ウィルスを含み、ここで、該トランス
    フェラーゼが、以下のアミノ酸配列を有するか、または
    以下のアミノ酸配列に１つまたは数個のアミノ酸欠失、
    置換、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列を有
    する、組成物：
  46. 【請求項４６】昆虫制御物質と農業に適した担体とを含
    有する殺虫組成物であって、該昆虫制御物質がエクダス
    テロイドUDP−グルコシルトランスフェラーゼをコード
    し天然に存在する遺伝子を不活性化するように遺伝子的
    に改変された昆虫ウィルスを含み、ここで、該遺伝子
    は、以下の約149番目のヌクレオチドから約1670番目の
    ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含むか、または
    以下の約149番目のヌクレオチドから約1670番目のヌク
    レオチドまでのヌクレオチド配列の相補鎖にストリンジ
    ェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイ
    ズし得るヌクレオチド配列を含む、組成物：
  47. 【請求項４７】脱皮に影響するタンパクをコードする異
    種遺伝子を発現するように遺伝子的にさらに改変された
    昆虫ウィルスを含有する昆虫制御物質を含む、請求項45
    または46に記載の殺虫組成物。
  48. 【請求項４８】前記昆虫ウィルスがバキュロウィルスで
    ある請求項45〜47のいずれか１項に記載の昆虫制御物
    質。
  49. 【請求項４９】前記バキュロウィルスが核多角体病ウィ
    ルスである請求項48の昆虫制御物質。
  50. 【請求項５０】前記核多角体病ウィルスがAutographa c
    alifornicaおよびOrgyia pseudotsugataでなる群から選
    択される、請求項49に記載の核多角体病物質。
  51. 【請求項５１】請求項28に記載の方法で調製される昆虫
    ウィルス。
  52. 【請求項５２】次のａ）〜ｆ）までの工程を含有する、
    vEGTZを調製する方法： ａ）制限エンドヌクレアーゼEcoR IとXba IとでpUCBCPs
    Bを分解し、それによって生じる大きな断片を精製する
    こと； ｂ）制限エンドヌクレアーゼEcoR IとAha IIIとでpSKS1
    04からlacZ遺伝子を切り出すこと； ｃ）T4 DNAポリメラーゼでXba I末端を平滑化した後
    に、該lacZ遺伝子をpUCBCPsBのEcoR I−Xba Iの大きい
    方の断片と連結し、pEGTZを形成すること； ｄ）pEGTZとAcMNPVとをSF細胞中へコトランスフェクト
    すること； ｅ）β−ガラクトシダーゼの発現によりウィルス組換体
    を同定すること； ｆ）該組換体ウィルスvEGTZを精製すること。
  53. 【請求項５３】次のａ）〜ｆ）までの工程を包含する、
    vEGTDELの調製方法： ａ）制限エンドヌクレアーゼEcoR IとXba IとでpUCBCPs
    Bを分解し、その結果生じる大きな断片を精製するこ
    と； ｂ）工程（ａ）の大きなDNA断片の両端を平滑化するこ
    と； ｃ）工程（ｂ）の大きなDNA断片を連結してpEGTZDELを
    形成すること； ｄ）SF細胞中にpEGTZDELとvEGTZとをコトランスフェク
    トし、相同組換えを行うこと； ｅ）β−ガラクトシダーゼを発現しないことにより組換
    えvEGTDELを同定すること； ｆ）該組換えvEGTDELを精製すること。
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