JP2977894B2

JP2977894B2 - 自己免疫疾患用剤

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Publication number: JP2977894B2
Application number: JP2507957A
Authority: JP
Inventors: モードレル，マヌエル; ムンダー，ゲルハルト
Original assignee: MATSUKUSU PURANKU G TSUA FUERUDERUNKU DERU UITSUSENSHAFUTEN EE FUAU
Current assignee: MATSUKUSU PURANKU G TSUA FUERUDERUNKU DERU UITSUSENSHAFUTEN EE FUAU
Priority date: 1989-06-02
Filing date: 1990-05-31
Publication date: 1999-11-15
Anticipated expiration: 2014-11-15
Also published as: IE64039B1; IE901987L; AU5670690A; ES2060173T3; GR900100406A; US5266564A; CS276439B6; ZA904196B; GR1001195B; CA2056421A1; ATE94757T1; CA2056421C; EP0474712A1; DE3918082A1; EP0474712B1; DK0474712T3; CS268990A3; DE59002863D1; JPH04507096A; DE3918082C2

Description

【発明の詳細な説明】本発明はリゾレシチン誘導体を含有する免疫疾患の治
療用薬剤に関する。

西独特許公開第2009342号公報及び同第2009343号公報
から、合成リゾレシチン化合物を免疫学的アジユバント
として及び抵抗性の上昇のために使用することができる
ということはすでに公知である。更に、この種のアルキ
ルリゾ燐脂質が抗腫瘍剤として有効であるということは
西独特許公開第2619686号公報から公知である。更に、
リゾホスファチドの投与後、不所望な影響に対する身体
の抵抗性を高くするであろう活性化細胞が形成されると
いうことも公知である。更に西独特許公開第3530767号
公報中には多発性硬化症の治療のために合成リゾレシチ
ン化合物を使用することが記載されている。

有機体のすべての免疫学的反応においてＴ−リンパ球
は大きな役割をはたしている。その際、このＴ−リンパ
球の任務及びその作用方法は２つの主要な作用機構に分
けることができる、すなわち１バクテリア、ビールス、寄生物及び抗原を有する他
の物質のような異物の直接の防御、この際Ｔ−リンパ球
は直接エフェクター機構により関与している、および２免疫応答の調節、これにより免疫応答の過剰はな
い。

どちらの場合にも、Ｔ−リンパが高い特異性を有する
ということ、すなわちこれらの細胞が唯一の全く特定の
抗原を認識するという特性を有しているということが、
Ｔ−リンパ球の作用法に関して特徴的である。しかしな
がら、Ｔ−細胞がこの特性を示す前に、このＴ−細胞が
まず静止状態から活性化されることが必要である、この
ことは増殖及び分化を前提とする。

Ｔ−リンパ球は蛋白質により形成される異なる膜構造
により２種の大きな亜群、すなわちCD⁴⁺及びCD⁸⁺T−細
胞に分類される。CD⁴⁺はヘルパーもしくはインデューサ
ーＴ−細胞とも呼ばれ、特に外来蛋白質の認識及び抗原
に対する防御反応の惹起に関与する。サプレッサーもし
くは細胞毒Ｔ細胞とも呼ばれるCD⁸⁺−細胞は特にウィル
スに感染した細胞の認識及び破壊に関与する。

特に、動物界の高度に進化した種において自己反応特
性を示すＴ−細胞が生じるということが今や示された。
このことは、このようなＴ−リンパ球が有機体の身体自
体構造に対して向けられており、こうして身体自体の物
質及び細胞を攻撃するように予めプログラムされてい
る。通常、この自己反応性Ｔ−細胞は他の細胞又はファ
クターの調節性の影響により不活性であり、こうして有
機体の保護のために平衡が生じる。しかしながら、この
平衡が妨害されると、これにより自己免疫疾患が誘発さ
れる。このことは自己攻撃細胞又は自己抗体の形成に導
びき、これは最後に自己免疫疾患を惹起する。しかしな
がら、従来どの抗原が人におけるこの症候に関与してい
るのか知られていない。

このような自己免疫疾患は従来免疫抑制物質、例えば
コルチコステロイド、シクロホスファミド、シクロスポ
リンＡ等で処置されている。しかしながら、これらの物
質が全免疫システムを抑制するだけでなく、更に著しい
副作用、例えば骨髄の抑制、発ガン性、並びに高い毒性
を有するということが示された。

本発明の課題は前記欠点を示さない、他の自己免疫疾
患治療剤を製造することである。

アンドレーセン（R.Aadreesen）及びムンダー（P.Mun
der）（New Trends Lipid Mediators Res.Basel,Ka
rger,1988、第１巻、第16〜29頁及びImmunbiol.（197
9）156、498〜508）はアルキルリゾ燐脂質がリンパ球の
非特異的増殖を抑制する立場にあるということをすでに
証明することができた。

意外なことに、自己免疫反応に関与する特異的な自己
反応性Ｔ−細胞の増殖がまさに全く特定のアルキルリゾ
ホスホリピドにより抑制され得ることが今や見い出され
た。

こうして、本発明の課題は一般式Ｉ［式中、R₁は炭素原子数12〜18のアルキル基を表わし、
R₂は炭素原子数１〜８のアルキル基を表わし、かつR₃は
Ｈ又は炭素原子数１〜３のアルキル基を表わす］の化合
物を含有することを特徴とする医薬調剤である。

アルキル基R₁、R₂及び／又はR₃は分枝していてよい
が、有利には直鎖である。一般式Ｉの化合物において、
R₁が炭素原子数１〜３のアルキル基であるのは有利であ
り、特にメチル基であり、かつ／又はR₃は有利にＨであ
る。有利な化合物は特にR₁＝ｎ−ヘキサデシル、及びR₂
＝メチル及びR₃＝Ｈの式Ｉの化合物（化合物II）、及び
まず第１にR₁＝ｎ−オクタデシル、及びR₂＝メチル及び
R₃＝Ｈの式Ｉの化合物（化合物III）である。

式Ｉの化合物の製造は公知であり、文献に記載された
方法で行なうことができる（例えばD.Arnold等著、Lieb
igs.Ann.Chem.709、234〜239（1967）;H.U.Weltzien及
びO.Westphal、Liebigs Ann.Chem.709、240〜243（196
7）参照）。

本発明により製造した医薬調剤がリウマチ様関節炎又
は強直性脊椎炎の治療に特に良好に適しているというこ
とが示された。

この非常にしばしば発現する疾患は一般的疾患である
進行性慢性多発関節炎であり、この疾患は慢性的に、又
は一気に進行する。この疾患は多くの場合、30才〜50才
で発現し、男性よりも女性が約３倍罹病する。この疾患
は最も思い奇形に導びくことがある。

本発明により製造した調剤はハシモド甲状腺炎、前身
性紅斑性狼瘡のためにも、グッドパスチュア症候群、天
疱瘡において、バセドー病及び重症筋無力症において並
びにインシュリン抵抗に対して、更に自己免疫性溶血性
貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、進行性全身系硬
化症、混合結合組織疾患、悪性貧血、特発性アジソン
病、抗精子抗体により誘発される不育症の場合、糸球体
腎炎、水疱性エンフィドイド（bulloeses Emphidoi
d）、ショーグレーン症候群において、細胞が媒介免疫
性及び島細胞に対する抗体により惹起される真性糖尿病
の場合、アドレナーゲン（adrenergen）薬剤抵抗、慢性
活性肝炎において、並びに組織特異性抗体により惹起さ
れる内分泌腺の脱落において治療のために好適である。
自己免疫疾患の発現のためには遺伝学的素因が存在しな
くてはならないということは公知であるが、免疫学的現
象を開始する独特な過程は知られていない。しかしなが
ら、ウィルス又はバクテリア感染がこの際重要であると
いうことは想像される。

すでに前記のようにET−18−OCH₃は特にリウマチ様関
節炎及び強直性脊椎炎に好適である。ET−18−OCH₃の作
用をバルブ/c（Balb/c）−マウスのプロテオグリカン−
誘発進行性多発関節炎において調べた。この動物モデル
は、例えば臨床検査、例えば放射線分析及びシンチグラ
フィー骨検査により及び関節結合及び脊柱の組織病理学
的調査により証明されたように、人におけるリウマチ様
関節炎及び強直性脊椎炎に強い一致を示した（Glant等
著、Arthritis rheum.30（1987）、201〜212;Mikecz等
著、Arthritis rheum.30（1987）、306〜318）。この
関節炎は両側の小さい末梢関節における多関節滑膜炎と
して始まり、脊椎炎をも包含し、これは関節の中の軟骨
及び骨の強い破壊を伴なって進行する。関節炎症のはじ
めの外見的症状（はれ及び赤変）は関節炎を惹起するプ
ロテオグリカンの第３または第４回目の腹腔内注射の後
に発現する。

バルブ/c−マウスにおける関節炎の発現は宿主マウス
の軟骨プロテオグリカンに対する細胞における並びに体
液における免疫応答の出現に依存する。しかしながら、
循環する自己抗体は超免疫関節炎動物においてのみ、軟
骨崩壊が多かれ少なかれ現れるとき、発現する。この自
己抗体は完全な（崩壊していない）、かつコンドロイチ
ナーゼABCで処理したマウスの軟骨−プロテオグリカン
と反応し、かつ免疫化するプロテオグリカンと交差反応
を示す（Mikecz等著、Arthritis rheum.30（1987）、3
06〜318）。

ET−18−OH₃での前処置は動物を疾患から保護する
か、又は関節炎を惹起するプロテオグリカンでの免疫化
の間に処置を開始するかぎり、関節炎の進行を著しく遅
くする。更に処置した群において関節炎が発生する場
合、その臨床的症状、例えば赤くはれることは、あまり
強くない。更に、処置していない動物においてより、よ
り少ない末梢関節が罹病した。ET−18−OCH₃での処置の
開始は全実験期間の間循環−（自己）−抗体の水準を低
下させ、特異的抗体の生産を抑制した。予めET−18−OC
H₃で処置した動物からのＴ−リンパ球は免疫のために使
用した抗原の存在において増殖しない。コンカバリンＡ
での非特異的Ｔ−細胞−刺激が同様に明らかに抑制され
る。

本発明により使用すべきアルキルリゾ燐脂質を用いて
自己反応性Ｔ−細胞は抑制され、かつこの際Ｔ−細胞が
CD⁴⁺−又はCD⁸⁺−細胞であるかはどちらでもよく、この
際この抑制は細胞のホスファチジルコリン物質代謝の妨
害により惹起されるということも見い出された。この妨
害が活性化Ｔ−細胞に関してのみ特異的であり、かつこ
の際活性化されていないＴ−細胞はその合成能において
影響されないということは特に注目に値する。自己反応
性Ｔ−細胞の増殖はこれが自己攻撃性に作用するための
不可欠の前提であるので、アルキルリゾ燐脂質誘発抑制
により免疫サプレッションが実施される。

次に図面と組み合わせて実施例につき本発明をより詳
細に説明する。図面においては次のものを示す：第１図種々の作用物質による自己反応性CD⁴⁺−細胞
の増殖抑制の、その量に関連するグラフ図；第２図第１図と同様であるが、実験時間に関連する
グラフ図；第３図第１図と同様であるが、CTLL1−細胞の増殖
抑制に関するグラフ図；第４図 ET−18−OCH₃の存在におけるＴ−リンパ球の
新規合成能（コリン組込み）の細胞の活性化状態に関連
するグラフ図；第５図 ET−18−OCH₃の存在におけるAR17T−細胞に
よるホスファチジルコリンの分解のグラフ図；第６図第５図と同様であるが、活性化していないＴ
−細胞に関する図；第７図第２〜５群の免疫Balb/c−マウスのリンパ球
刺激テストのグラフ図；第８図牛関節軟骨のプロテオグリカン（BAC−PG）
で免疫した第４群の動物中の抗体水準のグラフ図；第９図牛関節軟骨のプロテオグリカン（BAC−PG）
で免疫された第５群のBalb/cマウスの血清中の抗体水準
に対するET−18−OCH₃の作用の図；第10図人骨増殖体−軟骨（HYAC−PG）のプロテオグ
リカンで免疫された第７群の動物の血清中の抗体水準の
グラフ図；第11図第６群〜第９群のマウスの第７図と同様の
図；第12図 HYAC−PGで免疫化された第８群のBalb/c−マ
ウスの血清中の抗体水準に関するET−18−OCH₃の作用の
グラフ図；第13図 ET−18−OCH₃で前処置し、かつ引き続きHYAC
−PGで免疫したバルブ/cマウスの血清中の抗体水準のグ
ラフ図。

例１ここで使用される自己反応性CD4⁺T−リンパ球細胞
は、ラットにおいて実験的自己免疫−関節炎（アジュバ
ンド関節炎とも称される）を発生させる原因となる。こ
のようなリンパ球細胞はJ.Holoshitz等（Science,Vol,2
19（1983）,56〜58頁）の方法により単離されている。
その増殖は抗原PPD（Ｐurified Ｐrotein Ｄerivativ
e、結核菌からの精製分画）で誘発された。

抗原の存在における特異的残留刺戟の間にアルキルリ
ゾ燐脂質によってCD4⁺−細胞の増殖を阻止する：Ｔ−リンパ球細胞（AR17）１×10³個を、RPMI1640＋1
0％ウシ胎児血清＋抗原１μｇ中で48時間培養する。抗
原提供細胞として照射した（30Gy）胸腺細胞１×10⁶個
を一緒に培養する。前記時間後に培養物ごとに³H−チミ
ジン0.5μCiを加え、引続き６時間の培養後にリンパ球
細胞のDNA中へのチミジンの組込み量を測定する。

結果はFig.1に示してある。このグラフから、このよ
うにして惹起されたAR17−細胞の増殖が物質１−オクタ
デシル−２−メチル−グリセロ−３−ホスホコリン（以
下ET−18−OCH₃と称する）によって阻止される。

例２例１で記載したようにして単離されたAR17−細胞を、
培地中で増殖するために成長因子（IL−２）を加えて刺
戟する。この際アリキルリゾ燐脂質によるこの増殖の阻
止を試験する。実験は次のように行った：Ｔ−リンパ球細胞（AR17）１×10³個を、RPMI1640＋1
0％ウシ胎児血清＋ConA刺戟脾臓細胞（IL2）の10％培養
上澄み中で24時間及び48時間培養する。この時間後に培
養物あたり³H−チミジン0.5μCiを加え、さらに６時間
の培養後にリンパ球細胞のDNAへのチミジンの組込み量
を測定する。

結果をFig.2で示してある。このグラフから、この場
合にも物質ET−18−OCH₃が増殖に対する抜群の阻止効果
を示すことがわかる。

例３細胞毒性Ｔ−リンパ球細胞（CTLL1）［M.M.Simon等に
よってEur.J.Immunol.（1986），16,1269〜1276で記
載］を単離し、この細胞系のアルキルリゾ燐脂質による
増殖阻止を試験した。ここで使用した細胞系は、自己反
応性CCD8⁺T−細胞である。実験を実施するために、Ｔ−
リンパ球細胞（CTLL−１）１×10³をRPMI1640＋10％ウ
シ胎児血清＋ConA刺戟脾臓細胞（IL2）の10％培養上澄
み中で48時間増殖した。この時間後に培養物ごとに³H−
チミジン0.5μCiを加え、さらに６時間の培養後にＴ−
細胞のDNAへのチミジンの組込み量を測定する。結果はF
ig.3で対照測定値に対する百分率で示してある。このグ
ラフからわかるように、ET−18−OH及びET−18−OCH₃は
抜群の増殖阻止を示す。

例４ホスファチジルコリン中への放射性標識コリンの導入
を検べ、このようにして細胞の新規合成能力を測定し
た。この場合にはＴ−リンパ球細胞１×10⁶個を、コリ
ンを含まないDMEM（Ｄulbecco's Ｍodifikation von
Ｅagle's Medium）＋10％ウシ胎児血清＋ConA刺戟脾
臓細胞（IL2）の10％培養上澄み＋¹⁴C−コリン0.51Ci中
で所定の時間の間培養する。細胞燐脂質を抽出し、薄層
クロマトグラフィーで分離し、ホスファチジルコリンの
バンドの放射能をDC−スキヤナで測定する。

結果はFig.4に図示してある。ここで断線は、未刺戟
Ｔ−細胞におけるコリン組込み量を示し、実線は刺戟CD
4⁺T−細胞（AR17）におけるコリン組込み量を示す。個
々の結果は対照値に対する百分率で示してある。さら
に、意外にもET−18−OCH₃は活性化自己反応性AR17 Ｔ
−細胞の合成のみを阻止するが、自己免疫反応に関与し
ない未活性化Ｔ−リンパ球細胞は、その合成能力に関し
て前記物質の作用を受けていないことがわかる。

例５ホスファチジルコリンの脂肪酸構造は、脱アシル化酵
素としてホスホリパーゼＡ及び再アシル化酵素としての
アシルトランスフェラーゼの作用によって不断に更新さ
れる。この物質代謝を検出するために、Ｔ−細胞を予め
¹⁴C−油酸と一緒にインキュベートする。すると、ホス
ファチジルコリンがこの脂肪酸の組込みによって放射性
標識された。

さて、AR17 Ｔ−細胞におけるホスファチジルコリン
の分解を、種々のアルキルリゾ燐脂質を加えた後測定し
た。この場合DMEM＋１％ウシ胎児血清＋¹⁴C−油酸0.1μ
Ci中でＴ−リンパ球細胞１×10⁶を４時間培養した。次
にこの標識細胞をDMEM＋10％ウシ胎児血清＋ConA刺戟脾
臓細胞（IL2）の10％培養上澄み中で種々のアルキルリ
ゾ燐脂質と一緒に24時間及び48時間さらに培養した。Ｔ
−細胞の燐脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーで分
離し、ホスファチジルコリンのバンドの放射能をDC−ス
キャナを用いて測定する。

結果は対照値に対する百分率としてFig.5に示してあ
る。このグラフから、ET−18−OCH₃と一緒にインキュベ
ートされた細胞が高い放射能損失（これはホスファチジ
ルコリンの損失を意味する）を有することがわかる。こ
れに対して未活性化Ｔ−細胞は、Fig.6からもわかるよ
うに、前記物質とのインュベーションに対する効果を示
さない。

例６プロテオグリカン誘導関節炎の形成に対するET−18−OC
H₃の作用一次関節炎の誘導： Balb/cマウス（Charles River Colony,Montreal,Qu
ebec）の５〜６週令雌を免疫するために、コンドロイチ
ナーゼABCで分解された、ヒト軟骨増殖体のプロチオグ
リカン［未成熟のヒト関節炎軟骨（HYAC）からのプロチ
オグリカンに相当する］を、既述のように使用した（Gl
ant等:Arthritis rheum.30（1987）,201〜212;Mikecz
等:Arthritis rheum.30（1987）,306〜318）。燐酸塩
緩衝塩溶液（PBS（pH7.2）100μｌ中のコンドロイチナ
ーゼABC分解HYACのプロチオグリカン−タンパク質100μ
ｇを、PBSを含む1:1乳濁液中のフロイント完全アジュバ
ントと一緒に腹腔内注射した。９日、35日及び65日目
に、前記タンパク質を再び３回フロイント不完全アジュ
バント中の抗原と一緒に注射した。Balb/c−対照マウス
（雌）を、関節炎発生性（ウシの関節）プロチオグリカ
ン（BAC−TG）又は燐酸塩緩衝塩溶液（PBS）及びプロト
テオグリカン抗原を含まないアジュバントで免疫した。

この実験のグループ（群）を表Ｉに記載してある。グ
ループ９では初めに10頭の動物をET−18−OCH₃で前処置
し、次にヒト軟骨増殖体起源の関節炎発生性プロチオグ
リカンを用いて処置した。同プロチオグリカンはグルー
プ６（免疫、未処理）、グループ７（免疫、未処理、但
し毎日牛乳で飼養）及びグループ８（免疫、牛乳中に溶
解したET−18−OCH₃を用いて処置）でも使用した。

動物には塩溶液及びフロイントアジュバントの乳液を
注射するか又は動物をフロイントアジュバント中のプロ
テオグリカン抗原で免疫した。

略語： HYAG−PG−＝ヒトの軟骨増殖体（骨増殖体の関節）のプ
ロテオグリカン（Ｐrotoｇlycan） BAC−PG＝ウシの関節軟骨のプロテオグリカン塩溶液＝
燐酸塩緩衝塩溶液、pH7.4（NaCl0.14mol/中のPO₄0.01
mol/）溶媒＝牛乳（通常はET−18−OCH₃を溶解させるために使
用した）２グループ（No4及びNo5）からの動物を、BAC−PGで
免疫し、ET−18−OCH₃を用いて処置するか又は処置しな
かった。他方他の３グループでは15頭のマウスを負対照
として用いた（表Ｉ参照）。各グループには、実験当初
５〜６週令のBalb/c−マウス５〜10頭が存在した。これ
らのマウスを、牛乳（脂肪の少ない牛乳）中に溶かした
ET−18−OCH₃で、12週間（５〜６週間は25mg/kg、６週
間は20mg/kg）食道用ゾンデ（薬剤の経口投与）によっ
て処置した。ET−18−OCH₃の用量は、25mg/kgから20mg/
kgに減少させた、それというのも処置の第２週から処置
Balb/c−マウスの身体状態が悪化し、ET−18−OCH₃処置
の３〜４週でグループ９の４頭及びグループ８の２頭が
死んだからである。実験の５〜17週でマウス（グループ
９を除く、上記参照）をET−18−OCH₃で処置して殺し
た。

この報告で記載してある時間の数値（Fig.8〜10、Fi
g.12及び13参照）は初めの注射日から始まっている。

血清試料、抗体テスト：１日、９日、19日、27日、35日、44日、55日、65日、
77日、85日、97日及び112日に、眠窩後静脈叢から血清
試料を採取した。これらの試料を−20℃で122日の最終
出血死まで保管し、次に各動物の13種の血清試料中の抗
体力価を測定し、比較した。

血清中の抗体を溶液中の放射免疫テストによって測定
し、この際ヒトの新生児（コンドロイチナーゼABC処理
（＝追跡））及びマウス（無傷（（＝未変）及びコンド
ロイチナーゼABC処置）の¹²⁵I標識軟骨プロテオグリカ
ンを使用した。各血清を希釈度1:100、1:500及び1:2500
で、時には1:12500で、既述のように試験した（Mikecz
等:supra,Glant等:Biochem.J.234,31〜41）。このため
に希釈血清100μｌを、¹²⁵I標識プロテオグリカン（50
μｌ中10000I_pm）と一緒に室温で４時間インキュベート
した。このインキュベーション後にタンパク質を有する
黄色ブドウ球菌（Staphylococcusaureus）（５重量％／
容積）25μｌを加え、37℃で30分インキュベート、２回
洗浄した。残留物の放射能をバックマンガンマ計数器で
測定した。

リンパ球細胞の反応性のテスト：コンカバリン（Concavalin）Ａ（ConAはマウス−Ｔ−
細胞−マイトジェンとして）及び軟骨プロテオグリカン
抗原（BAC−PG及びHYAC−PG）に対する脾細胞の応答を
既述のように測定した（Mikecz等:supra）。リンパ球細
胞の刺戟は、抗原又はマイトジェン（Mitogen）刺戟培
養物のI_pm:未刺戟培養物のI_pmの比である指数として表
現した。

関節炎の評価：すべてのマウス（関節炎及び非関節炎、免疫及び未免
疫）の四肢の寸法を毎日検べて、既述のように記録され
た（Glant等:Arthritis Rheum.30（1987）,201〜212）
臨床的関節炎変化を立証した。関節炎発生の初期臨床的
徴候としての腫張及び発赤、膝、くるぶし、手首の厚さ
（直径）及び手の背掌側厚さを記録した。

臨床的及び組織学的試験：赤色及び白色血球（Erythrozyten及びLeukozyten）の
数及び白色血球の血液像を、実験前、実験11週（６週の
処置後）及び実験の最後（122日）に検べた。

四肢、尾部、腰椎棘及び器官を固定し、骨を脱灰し
て、組織学的研究のための解剖の準備をした。

結果：グループ1,2及び３（免疫せず、非関節炎対照動物）：これらのBalb/c−マウス（１グループに各５頭）を、
プロテオグリカン抗原で免疫しなかった、しかしグルー
プ２及び３の動物に生理的塩溶液及びフロイントアジュ
バントの乳濁液（表Ｉ）を注射した。これらの動物はプ
ロテオグリカン及びコラーゲンII型を含む、なんらかの
軟骨成分に対する抗体を生産せず、関節炎を発生しなか
った。

グループ３の処置動物は体重を減少し、軽い貧血にな
った（表II）（おそらく頻繁な血液採取のため）が、他
の臨床的徴候又は実験室パラメーターは変化しなかっ
た。Ｔ細胞マイトジェン（ConA）によるリンパ球細胞の
刺戟のみは著しく減少された（Fig.7）。

グループ４及び５（非関節炎性プロテオグリカンで免疫
した動物）：グループ４及び５の動物は、ウシ関節軟骨（BAC）起
源のプロテオグリカンで免疫したが、グループ５のみは
ET−18−OCH₃で処置した（表Ｉ）。評価されているよう
に、グループ４及び５の動物は関節炎を発生しなかっ
た。

グループ４の動物は、免疫性ウシ関節プロテオグリカ
ンに対する“正常の”抗体産生及びヒト（HYAC）及びマ
ウスのプロテオグリカン上の交差反応性であるが、非関
節炎性エピトープに対する、連続的に増大する抗体力価
を示す（Fig.8）。マウスの軟骨プロテオグリカンに対
する抗体は見出されたけれども、これらの交差反応性抗
体は発症に関与していないと考えられる。刺戟指数とし
て表現されるリンパ球細胞の応答（Mikecz等,supra）
は、BAC及びHYAC−プロテオグリカン（PG）の存在で著
しく増大された（Fig.7）。

グループ５の動物（（表Ｉ））は、ウシ（結果は示し
てない）又はヒトのプロテオグリカンに対する低い抗体
水準を生じ、マウスの軟骨プロテオグリカンに対する自
己抗体は1:100の血清希釈度でさえも認められなかった
（Fig.9）。循環抗体の水準はET−18−OCH₃での２週間
の処置後に減少され、25mg/kg/日の用量でこの効果は20
mg/kg/日の用量の場合より特徴的であった。しかし抗体
生産は全処置期間の間連続的に増大した（Fig.9）。プ
ロテオグリカン抗原又はConAによるリンパ球細胞刺戟
は、ET−18−OCH₃の経口投与の終了後でさえも明らかに
減少された（Fig.7）。

グループ６及び７（HYACで免疫したが、ET−18−OCH₃で
処置しなかった動物）：この２グループの動物（表Ｉ）を免疫し、既述のよう
に試験した（Glant等,Arthritis Rheum.30（1987）,20
1〜212;Mikecz等,Arthritis Rheum.30（1987）,306〜3
18）。グループ６及び７の動物の間には相違は認められ
なかったが、グループ７は全処置期間の間ET−18−OCH₃
を含まない牛乳で毎日飼養した。これらの動物はHYAC−
プロテオグリカンに対する抗体及びマウス軟骨−プロテ
オグリカンに対する高水準の自己抗体を生産した。全動
物は、HYAC−プロテオグリカンの第３回の腹腔内注射後
又は第４回の腹腔内注射直後に関節炎を発生した（FIg.
10）。この関節炎は進行性であって、既述のように周辺
関節の変形及び強直を惹起した（Glant等,Arthritis r
heum.30（1987）,201−212）。これらの関節炎動物の脾
細胞の試験管内増殖はFig.11にまとめてある。このグラ
フはプロテオグリカン抗原及びConAの存在でリンパ球細
胞の特徴的な刺戟を示している。

グループ８（HYACで免疫しかつET−18−OCH₃で処置した
動物）：グループ８の６頭の動物をHYACのプロテオグリカンで
（グループ６及び７の動物と同様に）免疫したが、12週
間ET−18−OCH₃で処置した。動物は不良な身体状態にあ
り、２頭が第３及び第５処置週に死んだので、ET−18−
OCH₃の25mg/kg/日の用量を、第６週の処置から20mg/kg/
日の用量に減少させねばならなかった（Fig.12）。この
用量の減少は、前には不良な身体状態にあった動物が回
復した点では有利であった。このグループの３〜４頭は
関節炎を発症したが、関節炎の発生は著しくおそくな
り、すべての臨床的徴候（例えば発赤及び踝間直径とし
て表現される腫張）はより緩和し、罹患関節の数はグル
ープ６及び７の場合よりも少なくなった（表II）。

このグループ（No8）の動物及びすべての処置グルー
プ（No3,5及び９）はET−18−OCH₃で処置しなかった他
のグループ（No2,4,6及び７）の動物よりも若干貧血し
ていた（表II）。これは、骨髄細胞に対するET−18−OC
H₃の直接的作用の結果又は、例えば表IIで体重によって
表わされている、一般に不良の身体状態の関節的作用で
あるかも知れない。しかしすべてのマウスでは軽い貧血
は頻繁な血液採取の結果と認められた。他の実験室パラ
メーター、例えばタンパク尿（確認されない）、白色細
胞の数及び割合は、処置動物と未処理動物との間で顕著
な相違を示さなかった。

HYAC及びマウス軟骨のプロテオグリカンに対する循環
抗体の水準は、第２週の処置から減少されたが、短期間
後にはET−18−OCH₃の高い用量（25mg/kg/日）で処置す
る間でさえ増大し始めた（Fig.12）。他方抗原刺戟され
た、非特異的な（ConAで誘導された）Ｔ−リンパ球細胞
の増殖は、すべての処置動物で同様に減少された（Fig.
11）。

免疫前のグループ９（関節炎性プロテオグリカンを用い
る、ET−18−OCH₃で前処置）：このグループの動物（当初10頭）に、抗原の第１回の
注射の２週間前にET−18−OCH₃を経口投与した。残念な
がらこの前処置グループの４頭が実験の初めの６週間以
内に死んだ、これはET−18−OCH₃の用量25mg/kg/日がお
そらくBalb/c−マウスにとって高すぎる用量であること
を示す。しかし比較理由からET−18−OCH₃の用量を、グ
ループ８の２頭の動物が死ぬまで減少させなかった（上
記参照）。

動物臨床的パラメーター及び身体状態は、これらの前
処置動物が関節炎の臨床的徴候を示さなかった点を別に
して、グループ８の場合と同じであった。ウシ又はヒト
軟骨のプロテオグリカン又はコンカバリンＡによるリン
パ球細胞の刺戟はグループ８の動物の場合と同様であっ
た（すなわち特異的及び非特異的Ｔ−リンパ球細胞の応
答は著しく減少した）。さらに軟骨プロテオグリカンに
対する抗体の産生は著しく遅延され、抗体は通常は第４
回の抗原注射後に初めて血清中に確認された。

結論： ET−18−OCH₃によりBalb/c−マウスの処置は急性炎症
を抑制することができ、プロテオグリカン誘導関節炎の
場合には慢性関節炎の進行を阻止する。さらにET−18−
OCH₃による動物の前処置はBalb/c−マウスを炎症の発現
から守ると思われる。これはおそらくＴ−細胞を媒介す
る免疫応答の抑制のためであろう。ヒト及びマウス軟骨
のプロテオグリカンに対する抗体力価として測定される
自己抗体の産生は、処置の間に著しく抑制された。この
抑制効果は、ET−18−OCH₃の経口投与後の抗体産生の３
〜４週は一定であり、次に未知のメカニズムによって再
び消失される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 31/685 C07F 9/10 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式Ｉ［式中、R₁は炭素原子数12〜18のアルキル基を表わし、
R₂は炭素原子数１〜８のアルキル基を表わし、かつR₃は
Ｈ又は炭素原子数１〜３のアルキル基を表わす］の化合物を含有することを特徴とする、多発性硬化症を
除いた自己免疫疾患用剤。
【請求項２】一般式（Ｉ）において、R₂が炭素原子数１
〜３のアルキル基を表わし、かつR₁及びR₃が請求項１記
載のものを表わす請求項１記載の薬剤。
【請求項３】構造の一般式（Ｉ）の化合物を含有する請求項１又は２記載
の薬剤。
【請求項４】構造の一般式（Ｉ）の化合物を含有する請求項１又は２記載
の薬剤。
【請求項５】自己免疫疾患がリウマチ様関節炎又は強直
性脊椎炎である請求項１から４までのいずれか１項記載
の薬剤。