JP3036708B2

JP3036708B2 - Ｄ−グルコース−６−リン酸の高感度定量法および定量用組成物

Info

Publication number: JP3036708B2
Application number: JP3138324A
Authority: JP
Inventors: 成植田; 守高橋; 英生美崎; 茂行今村
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1991-05-14
Filing date: 1991-05-14
Publication date: 2000-04-24
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: EP0639646A4; DE69129375D1; WO1992020817A1; JPH04335898A; EP0639646A1; EP0639646B1; DE69129375T2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床生化学検査、食品
検査等におけるグルコース−６−リン酸の酵素サイクリ
ング反応を用いた新規な高感度定量法および定量用組成
物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、臨床検査分野において、成分分析
には化学法に代わり、より特異性の高い酵素法が普及し
つつある。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１．１．１．４９）は、酵素的分析に広く用い
られている酵素のひとつであり、下記の反応を触媒す
る。Ｄ−グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）⁺＝Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸＋ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ＋Ｈ⁺

【０００３】本酵素は、ＡＴＰ、グルコースなどの定量
や、クレアチンキナーゼなどの酵素活性測定時の共役酵
素として他の酵素と組み合わせて用いられている。例え
ば、グルコースを定量する際には、ヘキソキナーゼ（Ｅ
Ｃ２．７．１．１）の作用でＡＴＰの存在下にＤ−グ
ルコース−６−リン酸に変換し、グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ反応に導いて測定を行っている。こ
の場合、反応によって生成した還元型ＮＡＤ（Ｐ）の量
を、一般的には３４０ｎｍにおける吸収を分光学的に測
定するのであるが、他に、ジアホラーゼ、ニトロブルー
テトラゾリウムを用いてホルマザン色素として測定する
方法もある。しかし、この色素は不溶性であり、自動分
析器には適さない。更に、ＮＡＤＰの代わりにチオＮＡ
ＤＰを用いる方法も報告されており（臨床検査（臨時増
刊）、Ｖｏl ．２２、ｐ１２３２、１９７８）、これに
より感度が約２倍になっている。

【０００４】上記以外にも、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼは、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．
１．１）、ホスホグルコムターゼ、ホスホヘキソースイ
ソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）の活性測定や、Ｄ
−ソルビトール、Ｄ−フルクトースの定量等に用いられ
ており、臨床検査分野においては、応用範囲の広い酵素
である。

【０００５】このうち、無機リンは、シュークロースホ
スホリラーゼとホスホグルコムターゼの酵素反応系によ
ってＤ−グルコース−６−リン酸に転換され測定されて
いる（臨床検査機器試薬、Ｖｏl ．１３、ｐ１１３
７−１１４３、１９９０）。また、Ｄ−フルクトースの
測定は、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコースイソメラー
ゼを用いてＤ−グルコース−６−リン酸に変換したのち
測定されているが、ヘキソキナーゼはＤ−グルコースに
も作用するため、Ｄ−フルクトースに特異的なフルクト
キナーゼを用いた測定法についての報告もある（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４、２０５、１９７３）。血
清中のＤ−フルクトースは、正常値が約４０μｍｏl ／
１と少量であり、糖尿病で上昇するとの報告もあり（日
本臨床、４７、ｐ４６８、１９８９、増刊号）、高感度
化が望まれている。

【０００６】一般に、酵素を用いて分析を行う場合、測
定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸化
水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に変換することが行われ、
この場合、検出可能な物質の量は化学量論的に測定対象
物と等しくなる。現在、この検出可能な物質を測定する
方法としては、分光分析機器を用いる方法が最も普及し
ているが、これも感度上に限界があり、測定対象物の含
量が少ない場合適さないという欠点があった。

【０００７】そこで、測定対象物の含量が少ない場合
や、測定対象物を含む被検体が少量の場合等は、分光分
析よりも感度の優れた蛍光分析、発光分析等が行われて
いる。しかしながら、これらの方法も臨床検査等の汎用
検査においては、機器の普及という点からあまり適した
ものではなかった。また、微量の物質を測定するその他
の方法としては、該物質が等量の補酵素等に変換できる
場合、２種類の酵素を用いて補酵素等を増幅する、いわ
ゆる酵素サイクリング法が知られている。例えば、ＮＡ
Ｄサイクリング、ＣｏＡサイクリング、ＡＴＰサイクリ
ングなどがあるが、これらの方法は、臨床検査等のルー
チン分析においては、操作が煩雑なため、殆ど用いられ
ていないのが現状であった。

【０００８】高感度測定法がもたらす利点としては、測
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合は、その測
定系に及ぼす共存物質の影響を小さくすることができ
る。また、ある限られた被検体量で検査できる項目数を
増やすことも可能である。更に、検体が人血液である場
合などは、採血量を減らすことができるため、被採血者
への心理的な負担を軽減することもできるし、廃棄物の
減少により環境汚染を軽減することに貢献することにも
なる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】前述のごとくグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて種々の物質、
酵素活性が測定されているが、これらは何れも高感度測
定法とはいいがたく、特に含量の少ない物質や酵素活性
の測定については簡便で高い感度な方法が望まれてい
る。また、ヘキソキナーゼと組み合わせてＤ−グルコー
スを高感度に測定できれば、酵素免疫法における標識用
酵素として頻用されているβ−ガラクトシダーゼの活性
測定への応用も考えられる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点につき鋭意検討した結果、グルコース−６−リン酸
の定量において、チオニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下、チオＮＡＤ類という）およびチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以
下、チオＮＡＤＰ類という）からなる群より選ばれた一
つと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以
下、ＮＡＤ類という）およびニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフエート類（以下、ＮＡＤＰ類とい
う）からなる群より選ばれた一つの補酵素に作用するグ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびチオＮＡ
Ｄ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）類との２種の補酵素を用いる
ことにより、サイリング反応を形成せしめることを見出
し、かつその反応における吸光度の測定に際し、ＮＡＤ
（Ｐ）類のアナログであるチオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ
（Ｐ）類の還元型吸収波長がそれぞれ４００ｎｍ付近、
３４０ｎｍ付近と異なつていることを利用し、他物質の
吸収波長の混雑が回避できる酵素サイクリング反応が実
施でき、高感度な測定が可能であることを確認し、本発
明を完成するに至った。

【００１１】すなわち、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を実施するに
当り、上記二種類の補酵素の一つにチオＮＡＤ（Ｐ）類
を使用して、どちらか一方の補酵素の変化量のみを分別
定量するもので、その結果、Ｄ−グルコース−６−リン
酸を高感度に測定できるものである。

【００１２】本発明は、上記のような知見に基づいて完
成されたものであって、Ｄ−グルコース−６−リン酸を
含有する被検液に、（１）チオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフエート類（以下チオＮＡＤＰ類と
いう）及びチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
類（以下チオＮＡＤ類という）からなる群より選ばれた
一つと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
エート類（以下ＮＡＤＰ類という）及びニコチンアミド
アデニンジヌクレオチオド類（以下ＮＡＤ類という）か
らなる群より選ばれる一つとを補酵素とし、少なくとも
Ｄ−グルコース−６−リン酸を基質としてＤ−グルコノ
−δ−ラクトン−６−リン酸を生成する可逆反応をなす
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ
１、（３）Ｂ１、を含有する試薬を作用せしめて、次の
反応式

【００１３】

【化２】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
量を測定することを特徴とするＤ−グルコース−６−リ
ン酸の高感度定量法、並びに上記（１）、（２）及び
（３）を含有することを特徴とするＤ−グルコース−６
−リン酸定量用組成物を提供するものである。

【００１４】本発明において用いられる、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９）
とは、少なくともＤ−グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ
（Ｐ）⁺＝Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸＋
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ⁺なる反応を触媒するものであっ
て、チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群
より選ばれた一つを補酵素とするものなら特に限定され
ない。

【００１５】本酵素の具体例としては、動植物に広く分
布し、乳腺組織、赤血球、肝、植物、微生物などから精
製されている。また、酵母等に見られるように一般にＮ
ＡＤＰに特異的であるが、ロイコノストツクメセンテ
ロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）、アゾトバクターヴイネランデイ（Ａｚ
ｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シュー
ドモナスフルオロエツセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）などの酵素は、ＮＡＤに
も作用する（酵素ハンドブツク、ｐ２０〜２１、朝倉書
店（１９８３））。

【００１６】また、バチルスステアロサーモフイラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）由来の酵素も同様にＮＡＤ、ＮＡＤＰ共に作用
する（生化学、Ｖｏl ．５２、ｐ８１９、１９８０）。
このうち、酵母、ロイコノストツクメセンテロイデス
（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅａｓｅｎｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ）由来の酵素は例えば、オリエンタル酵母工業、ベ
ーリンガーマンハイム社、シグマ社等より市販されてお
り、例えば、シグマ社より市販されているパン酵母由来
の酵素の補酵素に対する相対活性は４０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７．１）ではＮＡＤＰを用いた時を１００とする
と、チオＮＡＤＰで６７％程度であり、ＮＡＤには全く
作用しなかった。

【００１７】また、（株）東洋紡より市販されているロ
イコノストツクメセンテロイデス由来のものについて
は、同様にＮＡＤＰを用いた時を１００とすると、チオ
ＮＡＤＰで２７％、ＮＡＤで１７６％、またチオＮＡＤ
では４９％であった。さらに、東洋醸造（株）より市販
されているバチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｐ．）由来の酵素については、４０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）では、ＮＡＤＰを用いた時を１００％と
して、チオＮＡＤＰが４０％、ＮＡＤで７％、チオＮＡ
Ｄでは３４％であった。他の起源の酵素についても適宜
の系に使用可能であり、使用する酵素の補酵素ＮＡＤ
（Ｐ）類、チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する特異性は、基質
であるＤ−グルコース−６−リン酸に対して反応性を有
するものであればよく、そのような酵素の性質はこれら
補酵素と基質を用い確認できるものである。

【００１８】又、Ａ１およびＢ２で示される補酵素は、
チオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類
を示すが、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類として
は、例えばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフエート（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒ
ポキサンチンジヌクレオチドホスフエート、チオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）および
チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙
げられる。

【００１９】又、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類としては、
例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチドホスフエート（アセチルＮＡＤＰ）、アセチルピ
リジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエート、ニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエー
ト（デアミノＮＡＤＰ）；及びニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニン
ジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジン
ヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙げられ
る。

【００２０】本発明のＡ１およびＢ１において例えばＡ
１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類であることが必要であり、Ａ１およびＢ１の
関係において一つのチオ型補酵素を使用するものであ
る。又、定量に用いるグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合
は、上述のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いる
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）Ｎ
ＡＤＰ類のみを補酵素とする場合は、上述のチオＮＡＤ
Ｐ類及びＮＡＤＰ類より、また用いるグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類及び（チ
オ）ＮＡＤＰ類を共に補酵素にする場合は、上述のチオ
ＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類および
ＮＡＤＰ類より適宜選択して用いればよい。

【００２１】本発明の高感度定量法を用いれば、被検液
中にもともと含有されているＤ−グルコース−６−リン
酸を測定することができるが、又、これらの物質を遊
離、生成する酵素系における基質や、その酵素活性を測
定することもできる。更に、本発明の高感度定量法を用
いれば、上記のようなＤ−グルコース−６−リン酸を遊
離、または生成する酵素系と連結し得る、単一の、もし
くは複数の工程からなる酵素系における基質や、その酵
素活性をも測定することができる。これらの酵素系は、
特に限定されるものではないが、例えば以下に示す種々
の酵素の反応系が挙げられる。

【００２２】（１）ＡＴＰ、Ｄ−グルコースとヘキソキ
ナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）の酵素反応系によって
遊離、生成するＤ−グルコース−６−リン酸を定量する
ためのもので、ＡＴＰまたはＤ−グルコースの定量、ま
たはヘキソキナーゼの活性測定のための反応系。Ｄグルコース＋ＡＴＰ→Ｄ−グルコース−６−リン酸＋
ＡＤＰ

【００２３】（２）Ｄ−フルクトース−６−リン酸とホ
スホグルコースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）の
酵素反応系によって遊離、生成するＤ−グルコース−６
−リン酸を定量するためのもの。Ｄ−フルクトース−６−リン酸→Ｄ−グルコース−６−
リン酸

【００２４】（３）Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−
グルコース−１，６−ジリン酸とホスホグルコムターゼ
（ＥＣ２．７．５．１）の酵素反応系によって遊離、
生成するＤ−グルコース−６−リン酸を定量するための
もの。Ｄ−グルコース−１−リン酸＋Ｄ−グルコース−１，６
−ジリン酸→Ｄ−グルコース−６−リン酸＋Ｄ−グルコ
ース−１，６−ジリン酸

【００２５】（４）上記（２）の酵素反応系におけるＤ
−フルクトース−６−リン酸が、Ｄ−フルクトース−
１，６−ジリン酸、無機リンと６−ホスホフルクトキナ
ーゼ（ＥＣ２．７．１．９０）の酵素反応系である場
合。Ｄ−フルクトース−１，６−ジリン酸＋無機リン→Ｄ−
フルクトース−６−リン酸＋ピロリン酸

【００２６】（５）上記（２）の酵素反応系におけるＤ
−フルクトース−６−リン酸が、Ｄ−フルクトースとフ
ルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４）またはヘキソ
キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）の酵素反応系由来で
ある場合。Ｄ−フルクトース＋ＡＴＰ→Ｄ−フルクトース−６−リ
ン酸＋ＡＤＰ

【００２７】（６）上記（３）のＤ−グルコース−１−
リン酸がグリコーゲン、無機リンとグリコーゲンホスホ
リラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）の酵素反応系由来で
ある場合。（グリコーゲン）ｎ＋無機リン→Ｄ−グルコース−１−
リン酸＋（グリコーゲン）ｎ−１

【００２８】（７）上記（３）のＤ−グルコース−１−
リン酸がシユークロース、無機リンとシユークロースホ
スホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．７）の酵素反応系由
来である場合。シユークロース＋無機リン→Ｄ−グルコース−１−リン
酸＋Ｄ−フルクトース

【００２９】（８）上記（１）の酵素反応系におけるＡ
ＴＰが、クレアチンリン酸、ＡＤＰとクレアチンキナー
ゼ（ＥＣ２．７．３．２）の酵素反応系由来である場
合。クレアチンリン酸＋ＡＤＰ→クレアチン＋ＡＴＰ

【００３０】（９）上記（１）の酵素反応系におけるＡ
ＴＰが、ホスホエノールピルビン酸、ＡＤＰとピルビン
酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）の酵素反応系由
来である場合。ホスホエノールピルビン酸＋ＡＤＰ→ピルビン酸＋ＡＴ
Ｐ

【００３１】（１０）上記（１）の酵素反応系における
ＡＴＰが、アセチルリン酸、ＡＤＰと酢酸キナーゼ（Ｅ
Ｃ２．７．２．１）の酵素反応系由来である場合。アセチルリン酸＋ＡＤＰ→酢酸＋ＡＴＰ

【００３２】（１１）上記（５）の酵素反応系における
Ｄ−フルクトースが、Ｄ−ソルビトール、ＮＡＤとソル
ビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１４）
の酵素反応系由来である場合。Ｄ−ソルビトール＋ＮＡＤ⁺→Ｄ−フルクトース＋ＮＡ
ＤＨ＋Ｈ⁺

【００３３】（１２）上記（１）の酵素反応系における
Ｄ−グルコースが、β−ラクトースと、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）の酵素反応系由
来である場合。 β−ラクトース＋Ｈ₂Ｏ→Ｄ−ガラクトース＋Ｄ−グル
コース

【００３４】Ａ１およびＢ１の量は被検体中のＤ−グル
コース−６−リン酸量に比較して過剰量であること、か
つグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＡ１及び
Ｂ１それぞれに対するＫｍ値に比較して過剰量であるこ
とが必要であり、特にＤ−グルコース−６−リン酸量の
２０〜１００００倍モルが好ましい。

【００３５】本発明のＤ−グルコース−６−リン酸定量
用組成物においては、Ａ１およびＢ１の濃度は０．０２
〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの量は１〜１０
００ｕ／ml、特に２〜４００ｕ／mlが好ましいが、その
量は被検体の種類等により適宜決定することができ、こ
れ以上の量を用いることもできる。

【００３６】また本発明にはその変形例として、以下の
方法も包含するものである。即ち、本発明定量法は、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡ
Ｄ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を補酵素とする場合にお
いて、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくは
ＮＡＤＰ類との組み合わせ、またはチオＮＡＤＰ類とＮ
ＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだとき
には、更に被検体に（４）成分のＤ−グルコース−６−
リン酸に作用せず、Ｂ２からＢ１への反応を形成する第
二のデヒドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの
基質を作用せしめることにより、後記反応式（II）のご
とく、Ｂ１とＢ２の間Ｂ１の再生のための反応系を付与
せしめることにより当該サイクリング反応を形成せしめ
得る。

【００３７】この場合、第二のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にＡ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、例えばＡ１を本質的に
補酵素として利用しない酵素を選択する組み合わせ、Ａ
１とＢ２の量的関係により第二のデヒドロゲナーゼが実
質的にＡ１に作用しない条件を選択する組み合わせが例
示される。定量の際には反応により生成したＡ２の量を
測定する。

【００３８】

【化３】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはＮＡＤＰ類
のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオ
ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示し、Ｂ２からＢ１への反応はＢ２を
補酵素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ１を生成す
る酵素反応を示す）。

【００３９】上記の成分（４）を用いるＤ−グルコース
−６−リン酸定量用組成物において、Ａ１の濃度は０．
０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好まし
く、Ｂ２または／及びＢ１の濃度は０．０５〜５０００
μＭ、特に５〜５００μＭが好ましい。グルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼの濃度は１〜１０００ｕ／m
l、特に２〜４００ｕ／mlが好ましく、第二のデヒドロ
ゲナーゼはＢ２に対するKm値（ｍＭ単位）の２０倍量
（ｕ／ml単位）以上になるように調製すればよく、例え
ば１〜１００ｕ／mlが好ましく、また第二のデヒドロゲ
ナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２０mMが好ま
しい。これらの量は被検体の種類等により適宜決定する
ことができ、これ以上の量を用いることもできる。

【００４０】第二のデヒドロゲナーゼはＢ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ１が高価
な場合は有効である。又、Ｂ１の代わりにＢ２あるいは
Ｂ１とＢ２の混合物を用いて反応を行つてもよい。この
場合、Ｂ１または／及びＢ２の使用量は特に限定される
ものではないが、一般的にはＡ１の１／１０モル以下が
好ましい。

【００４１】第二のデヒドロゲナーゼ及びその基質とし
ては、例えばＢ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．
１）とエタノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ１．１．１．６）（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）とグリセロ
ール、Ｌ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１．１．１．８）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グ
リセロール−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由
来）とＬ−リンゴ酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、
肝、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセロアルデヒ
ドリン酸とリン酸などが挙げられる。

【００４２】また、Ｂ２がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
Ｐ類のときは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．４２）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエ
ン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．
２．１．１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｘａｌａ
ｔｉｃｕｓ由来）とＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグ
ルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４４）
（ラツト肝、ビール酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）と６−ホ
スホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１３）（植物葉緑体
由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン
酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．
２．１．７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。

【００４３】さらに、本発明定量法は、グルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類及び（チ
オ）ＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合において、２つ
の補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類
との組み合わせ、または、チオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類も
しくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだときには、更
に被検体に（５）成分のＤ−グルコース−６−リン酸に
作用せず、Ａ２からＡ１への反応を形成する第三のデヒ
ドロゲナーゼ及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質を作
用せしめることにより、後記反応式（III ）のごとく、
Ａ１とＡ２の間にＡ１の再生のための反応系を付与せし
めることにより、当該サイクリング反応を形成せしめ得
る。

【００４４】この場合、第三のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にＢ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、例えばＢ１を本質的に
補酵素として利用しない酵素を選択する組み合わせ、Ｂ
１とＡ２の量的関係により第三のデヒドロゲナーゼが実
質的にＢ１に作用しない条件を選択する組み合わせ等が
例示される。定量の際にはＢ１の消費量を測定する。

【００４５】

【化４】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類の
ときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオ
ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ１への反応はＡ２を
補酵素として第三のデヒドロゲナーゼにてＡ１を生成す
る酵素反応を示す）

【００４６】すなわち、第三のデヒドロゲナーゼはＡ１
の再生のために補助的に添加するものであり、これによ
ってＡ１の使用量を少なくすることが可能となり、特に
Ａ１が高価な場合には有効である。また、Ａ１の代わり
にＡ２あるいはＡ１とＡ２の混合物を用いて反応を行っ
てもよい。この場合、Ａ１または／及びＡ２の使用量は
特に限定されるものではないが、一般的にはＢ１の１／
１０モル以下が好ましい。

【００４７】この成分（５）を用いるＤ−グルコース−
６−リン酸定量用組成物において、Ｂ１の濃度は０．０
２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、
Ａ２または／及びＡ１の濃度は０．０５〜５０００μ
Ｍ、特に５〜５００μＭが好ましい。グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼの濃度は１〜１０００ｕ／ml、
特に２〜４００ｕ／mlが好ましく、第三のデヒドロゲナ
ーゼはＡ２に対するKm値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／
ml単位）以上になるように調製すればよく、例えば１〜
１００ｕ／mlが好ましく、また第三のデヒドロゲナーゼ
の基質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好まし
く、これらの量は被検体の種類等により適宜決定するこ
とができ、これ以上の量を用いることもできる。

【００４８】第三のデドロゲナーゼ及びその基質として
は、例えば、Ａ１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．
１）とアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とジ
ヒドロキシアセトン、Ｌ−グリセロール−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８）（ウサギ筋肉
由来）とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウ
シ心筋由来）とオキザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン
酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１２）（ウサ
ギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と１，３−ジ
ホスホ−Ｄ−グリセリン酸、Ａ１がＮＡＤＰ類またはチ
オＮＡＤＰ類のときは、グリセロアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１３）（植物葉緑体
由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げ
られる。

【００４９】反応液組成については、使用するグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼの各種補酵素間の相対
活性等を考慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後正
反応／逆反応の至適ｐＨ条件を酵素サイクリング反応が
効率よく進行するように設定すればよい。これら使用す
る酵素は単独でも、あるいは適宜２種以上を組み合わせ
て用いてもよい。

【００５０】斯くして、調製された本発明のＤ−グルコ
ース−６−リン酸定量用組成物によって、被検体中のＤ
−グルコース−６−リン酸を測定するには、上記成分
（１）〜（３）、（１）〜（４）、あるいは（１）〜
（３）及び（５）を含有する組成物に、被検体０．００
１〜０．５mlを加え、約３７℃の温度にて反応させ、反
応開始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例え
ば３分後と４分後の１分間、または３分後と８分後の５
分間における生成されたＡ２の量または消費されたＢ１
の量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化によ
つて測定すればよい。例えば、Ａ２がチオＮＡＤＨ、Ｂ
１がＮＡＤＨの場合、Ａ２の生成を４００ｎｍ付近の吸
光度の増加により測定するか、あるいはＢ１の消費を３
４０ｎｍ付近の吸光度の減少により測定し、既知濃度の
Ｄ−グルコース−６−リン酸を用いて測定したときの値
と比較すれば、被検液中のＤ−グルコース−６−リン酸
量をリアルタイムで求めることができる。

【００５１】また、本発明定量法は、被検体中のＤ−グ
ルコース−６−リン酸そのものを酵素サイクリング反応
に導くものであり、被検液中の共存物質の影響を受けに
くいため、被検液のブランク測定を省略することがで
き、レイトアツセイによる簡便な測定を成し得る。尚、
本発明においてはＡ２またはＢ１の測定に当り、吸光度
測定の代わりに他の公知の測定法を使用して定量を行う
ことができる。

【００５２】

【発明の効果】上述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、ま
た、酵素のサイクリング反応を組合せることによつて感
度を増大させることができるため、少量の検体で迅速か
つ正確に被検体中のＤ−グルコース−６−リン酸を定量
することができる。

【００５３】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１Ｄ−グルコース−６−リン酸の定量＜反応液＞５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）１ｍＭチオＮＡＤＰ（シグマ社製）０．５ｍＭ還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社
製）５ｍＭＥＤＴＡ３８ｕ／ml グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（シグマ社製：パン酵母由来）

【００５４】＜操作＞上記試薬１mlをキユベツトにとり、０、５、１０、１
５、２０、２５μＭのＤ−グルコース−６−リン酸溶液
をそれぞれ５０μl 添加し、３７℃にて反応を開始させ
た。反応開始後２分目と３分目の４００ｎｍにおける吸
光度を読み取り、その差を求めた。その結果を図１に示
した。図１から明らかなように、Ｄ−グルコース−６−
リン酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。

【００５５】実施例２Ｄ−グルコース−６−リン
酸の定量＜反応液＞５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）１ｍＭチオＮＡＤＰ（シグマ社製）２ｍＭ還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）２ｍＭＥＤＴＡ８４．４ｕ／ml グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（東洋紡社製：ロイコノストックメセンテロイデ
ス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ）由来）

【００５６】＜操作＞上記試薬１mlをキユベツトにと
り、０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０μＭ
のＤ−グルコース−６−リン酸溶液をそれぞれ２０μl
添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分
目と４分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、そ
の差を求めた。実施例１と同様、その結果を図２に示し
た。図２から明らかなように、Ｄ−グルコース−６−リ
ン酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。

【００５７】実施例３Ｄ−グルコース−６−リン
酸の定量＜反応液＞５０ｍＭＭＥＳ酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍＭチオＮＡＤＰ（シグマ社製）２ｍＭ還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）２ｍＭＥＤＴＡ２４．８ｕ／ml グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（東洋醸造社製：バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｐ．）由来）

【００５８】＜操作＞上記試薬１mlをキユベツトにと
り、０、１０、２０、３０、４０、５０μＭのＤ−グル
コース−６−リン酸溶液をそれぞれ２０μl 添加し、３
７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と４分目
の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図３に示した。図３から明らかなよう
に、Ｄ−グルコース−６−リン酸量に対する吸光度変化
量は良好な直線性を示した。

【００５９】実施例４Ｄ−フルクトースの定量＜反応液（Ｉ）＞５０ｍＭＭＥＳ酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＭチオＮＡＤＰ（シグマ社製）２ｍＭ塩化マグネシウム０．５ｍＭＡＴＰ１ｕ／ml ヘキソースキナーゼ（酵母由来、オリエン
タル酵母工業社製）３．６ｕ／ml ホスホグルコースイソメラーゼ（酵母
由来、ベーリンガーマンハイム社製）２４．８ｕ／ml グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（東洋醸造社製：バチルスエスピー（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｐ．）由来）

【００６０】＜反応液（ＩＩ）＞５０ｍＭＭＥＳ酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＭ還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母工業社
製）５０ｍＭＥＤＴＡ

【００６１】＜操作＞上記反応液（Ｉ）０．９mlをキユ
ベツトにとり、０、１０、２０、３０、４０、５０μＭ
のＤ−フルクトース溶液をそれぞれ２０μl 添加し、３
７℃にて反応を開始させた。反応開始後５分後に、反応
液（ＩＩ）を０．１ml加え、酵素サイクリング反応を開
始させた。反応液（ＩＩ）添加後２分目と４分目の４０
０ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求めた。そ
の結果を図４に示した。図４から明らかなように、Ｄ−
フルクトース量に対する吸光度変化量は良好な直線性を
示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｄ−グルコース−６−リン酸の定量曲線であ
る。

【図２】Ｄ−グルコース−６−リン酸の定量曲線であ
る。

【図３】Ｄ−グルコース−６−リン酸の定量曲線であ
る。

【図４】Ｄ−フルクトースの定量曲線である。

【化２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】被検体に、（１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート類（以下、チオＮＡＤＰ類という）およびチオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオ
ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる一つと、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以
下、ＮＡＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド類（以下、ＮＡＤ類という）からなる群
より選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＤ−グル
コース−６−リン酸を基質としてＤ−グルコノ−δ−ラ
クトン−６−リン酸を生成する可逆反応をなすグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式【化１】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
量を測定することを特徴とするＤ−グルコース−６−リ
ン酸の高感度定量法。
【請求項２】チオＮＡＤＰ類がチオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフエート（チオＮＡＤＰ）ま
たはチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
ホスフエートである請求項１記載の高感度定量法。
【請求項３】チオＮＡＤ類がチオニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチン
アミドヒポキサンチンジヌクレオチドである請求項１記
載の高感度定量法。
【請求項４】ＮＡＤＰ類がニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフエート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジ
ンアデニンジヌクレオチドホスフエート（アセチルＮＡ
ＤＰ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチ
ドホスフエートおよびニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドホスフエート（デアミノＮＡＤＰ）からな
る群より選ばれた補酵素である請求項１記載の高感度定
量法。
【請求項５】ＮＡＤ類がニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌ
クレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒポ
キサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群
より選ばれた補酵素である請求項１記載の高感度定量
法。
【請求項６】次の成分（１）〜（３）（１）チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
群より選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＤ−グ
ルコース−６−リン酸を基質としてＤ−グルコノ−δ−
ラクトン−６−リン酸を生成する可逆反応をなすグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１、
（３）Ｂ１、（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
す）を含有することを特徴とするＤ−グルコース−６−
リン酸の定量用組成物。