JP3100697B2

JP3100697B2 - 飲食品の製造法

Info

Publication number: JP3100697B2
Application number: JP25951891A
Authority: JP
Inventors: 和郎福田; 行蔵浅野; 渡辺　　誠; 綾子室町
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1991-10-08
Publication date: 2000-10-16
Anticipated expiration: 2015-10-16
Also published as: JPH06189694A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サッカロマイセス属に
属する酵母に同属由来の耐性遺伝子を導入した酵母を用
いることを特徴とする飲食品たとえばアルコール飲料、
発酵調味料（醸造調味料ともいう）などの製造法および
該製造法により製造される飲食品に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルコール飲料、発酵調味料などの飲食
品における香気は、これらの商品にとって重要な性質で
ある。その香気を決定する重要な成分は、エステル類お
よびアルコール類である。とくにβ−フェネチルアルコ
ールおよび酢酸β−フェネチルは、酵母が生成する高沸
点香気成分の一つで、それぞれ、バラの花およびヒヤシ
ンスの花に類似の芳香を呈する。これらの香気物質は、
様々な醸造製品に含有されその製品を特徴づけているが
特に吟醸酒および焼酎類に多量に存在し〔醸造協会誌、
74巻 173、1979年〕、酒類の香味に重要な役割を持つと
報告されている〔農芸化学会誌、35巻、 829、1962年;
醸造協会誌、66巻、 176、1971年〕。なかでも清酒にお
いては味のまろやかさや含み香に寄与していると考えら
れる。これらの香気物質を酵母が大量に生産することが
できれば、味のまろやかさや含み香の増した清酒、さら
には、バラの花の香りのする醸造飲料や食品を製造する
ことができるものと期待される。

【０００３】β−フェネチルアルコールは、サッカロマ
イセス属酵母により、フェニルアラニンの前駆物質であ
るフェニルピルビン酸が脱炭酸されて生成される〔ジャ
ーナル・オブ・ザ・インスティテュート・オブ・ブリュ
ーイング(Journal of the Institute of Brewing) 71
巻、 341、1965年; 醸造協会誌、61巻、 481、1966年;
同誌、76巻、629 、1981年〕。また、酢酸β−フェネチ
ルは、アセチルCoA とβ−フェネチルアルコールから、
アルコールアセチルトランスフェラーゼにより生成され
ることが知られている〔醸造協会誌、82巻、 369、1987
年〕。

【０００４】従来、飲食品中の高級アルコールの量を増
加させる方法としては、酒類の製造過程においてロイシ
ンあるいはバリンなどを添加する方法〔ジャーナル・オ
ブ・ザ・インスティテュート・オブ・ブリューイング，
59巻, 421-429 、1981年〕が知られている。

【０００５】また本発明者らは、既にサッカロマイセス
・セレビジェを用いて飲食品中のイソブチルアルコール
あるいはイソアミールアルコールなどの分岐鎖アルコー
ルおよびβ−フェネチルアルコールなどの芳香族アルコ
ールを増加させる方法を報告している。たとえばアザロ
イシン耐性株（特開平1-257423号公報) 、グリホサート
耐性株、チエニールアラニン耐性株、チアゾールアラニ
ン耐性株、クロロアラニン耐性株、プロパギルグリシン
耐性株 (特開平3-7579号公報) およびアミノエチルシス
テイン耐性株 (特願平1-192234号) 、フルオロフェニー
ルアラニン耐性株〔（特開平2-92265 号、アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ(Agricul
tural and Biological Chemistry) 54巻、269-271 、19
90年) 、同誌54巻、3151-3156 、1990年〕、アゼチジン
カルボキシレート耐性株 (特願平2-206010号) などの変
異酵母を用いる方法をあげることができる。

【０００６】サッカロマイセス属に属し、フルオロフェ
ニールアラニン耐性の発現に係わる遺伝子を導入して得
られる形質転換酵母を飲食品の製造に用いることは知ら
れていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、飲食
品の香気成分として重要な高級アルコール類などの香気
成分とくにβ−フェネチルアルコールおよび酢酸β−フ
ェネチルをより多量に生成することができる形質転換酵
母を用い、香り高い飲食品を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】醸造用酵母を育種する上
で、変異処理を行うことは目的以外の遺伝子にも変異が
生じて醸造特性が変化する恐れがあることから、目的と
する遺伝子だけを導入する方法が望まれる。本発明によ
れば、サッカロマイセス属に属し、フルオロフェニール
アラニン耐性の発現に係わる遺伝子を導入して得られる
形質転換酵母を用いることを特徴とする香り高いアルコ
ール飲料、発酵調味料などの飲食品を製造する方法およ
び該方法によって製造された飲食品を提供することがで
きる。

【０００９】本発明で用いられる形質転換酵母は、サッ
カロマイセス属に属し、ｐ−フルオロフェニールアラニ
ン（ＰＦＰ）もしくはｏ−フルオロフェニールアラニン
（ＯＦＰ）などのフルオロフェニールアラニン耐性の発
現に係わる遺伝子が導入された酵母であれば、いずれで
も用いることができる。ＰＦＰ耐性の発現に係わる遺伝
子の例としては、ｐｆｐ１遺伝子があげられる。ＯＦＰ
耐性の発現に係わる遺伝子としては、配列番号１９で表
わされる遺伝子をあげることができる。配列番号１９で
表わされる遺伝子を含んでいれば、該遺伝子の前後に発
現に必要な遺伝子を含んでいてもよい。たとえば、ＯＦ
Ｐ１遺伝子（配列番号１８）があげられる。このような
形質転換酵母は、例えば市販の酵母（例えば、ビール酵
母、ワイン酵母、清酒酵母、ウイスキー酵母、焼酎酵
母、パン酵母等）あるいは自然界から分離された酵母等
に公知の形質転換法、例えば、プロトプラスト法、電気
融合法あるいは、リチウム等のアルカリ金属の存在下で
の形質転換法などを適宜適用して得ることができる。

【００１０】本発明で用いられる形質転換酵母の具体例
としては、サッカロマイセス・セレビジェ( Saccharomy
ces cerevisiae ) K-9H14-U7/pKF101 株 (以下、K-9H
14-U7/pKF101株と称す) およびサッカロマイセス・セレ
ビジェ( Saccharomyces cerevisiae ) FD-8/pKF201株
(以下、FD-8/pKF201 株と称す) をあげることができ
る。K-9H14-U7/pKF101株およびFD-8/pKF201 株は、ブダ
ペスト条約に基づいて平成３年３月22日付で工業技術院
微生物工業技術研究所に、各々微工研条寄第3330号(FER
M BP-3330)および微工研条寄第3329号(FERM BP-3329)と
して寄託されている。

【００１１】これらの形質転換酵母を用いてアルコール
飲料および発酵調味料を製造する。アルコール飲料およ
び発酵調味料を製造する方法は各々従来知られている方
法によりおこなうことができる。以下にアルコール飲料
（焼酎、ウイスキーなどの蒸留酒、ワイン、清酒など）
および発酵調味料の製造について説明する。いずれの製
造法においても酵母によるアルコール発酵を伴う。

【００１２】〔原料〕いかなる糖質およびデンプン質を
用いることもできるが、目的とするアルコール飲料の種
類によって酒税法および酒税法施行令に定められた原料
を用いる。たとえば、ブドウなどの果実、糖蜜、グルコ
ース、イモ類、そば、米、麦、あわ、とうもろこし、こ
うりゃん、きび、ひえおよび米や麦の麹を用いることが
できる。ブドウなどの果実、糖蜜、グルコースなどの糖
質は直接酵母によりそのまま発酵させる方法（単発
酵）、いも類、麦類、そば、トウモロコシなどの穀類の
澱粉質をまず糖化酵素により発酵性糖類に分解し、つい
で酵母でのアルコール発酵をおこなう方法（並行複発
酵）などが知られている。一般に、糖化酵素は、麦芽に
含まれるもの、たとえば、糸状菌アスペルギルス・オリ
ザエ（ Aspergillus oryzae) などの麹菌の生産するも
のあるいはα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテ
アーゼなどの酵素製剤が用いられる。

【００１３】〔酒母〕発酵に用いる酵母は、寒天傾斜培
地などの保存状態から適当な液体培地を経由し酵母菌数
を増加させる。たとえば、清酒酒母の最後の段階では、
モロミの約７％に当たる米と米麹を用い酵母の育成が図
られる。

【００１４】〔モロミ〕炭素源とする原料、水さらに無
機塩類を温度管理のできるタンクに仕込み酒母の添加に
よって発酵を開始する。清酒、焼酎製造においては、発
酵の初発では炭素原料の一部を仕込み、発酵にともない
残りを追加する段仕込が一般におこなわれている。清酒
では、追加の段階ごとに１段目（添え）、２段目
（仲）、３段目（留め）と呼ばれている。発酵過程にお
いては、ｐＨ3.５〜5.０、温度６〜２０℃で攪拌しなが
らおこなわれ微生物などに注意を払って管理される。モ
ロミ品温は、清酒では１０℃から１８℃、好ましくは１
５℃で管理される。モロミ期間は、１６日から２５日程
度で発酵を終了させる。焼酎製造においては、モロミ品
温は清酒よりやや高く、かつモロミ期間も短縮される。
モロミは発酵が順調に進むように適宜攪拌される。

【００１５】〔上槽もしくは蒸留〕酵母の発酵によって
生成されたモロミ中のエタノールをアルコール飲料の形
態にする工程は目的とする飲料によって種々の方法がと
られる。清酒では、モロミ発酵終了後、圧搾濾過などに
よって酒糟と分離し原酒を得る。蒸留酒では、モロミを
単式蒸留機などを用いて蒸留液を得る。焼酎では、モロ
ミを蒸留しエタノールの濃縮された焼酎原酒を得る。発
酵調味料においては、発酵終了前にモロミに食塩、酢酸
等を添加する処置（酒税法で定められた不可飲処置）を
おこなった後濾過する。

【００１６】以下に本発明の実施例および参考例を示
す。

【００１７】

【実施例】

実施例１．清酒の醸造 K-9H14-U7/pKF101株、K-9H14-U7 株、FD-8/pKF201 株、
FD-8株およびF44 株 (特開平2-92265)を用いて清酒を醸
造した。モロミの仕込みは第１表のごとくおこなった。

【００１８】

【表１】

【００１９】モロミの品温管理：添え仕込、踊り、およ
び仲仕込までは１６℃、仲仕込から留め仕込までは１４
℃、さらに留め仕込以降は、１３℃でおこない、以降１
日ごとに１℃品温を上昇させ、落ち泡開始以降は、反対
に１日１℃ずつ１０℃まで低下させた。醸造した清酒の
成分を第２表に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】発酵終了モロミ中の形質転換酵母K-9H14-U
7/pKF101株（１００株）についてウラシル要求性とＯＦ
Ｐ耐性を調べたところ、９０％以上の高い頻度でプラス
ミドが保持されていた。

【００２２】実施例２．大麦焼酎の製造 K-9H14-U7/pKF101株、K-9H14-U7 株、FD-8/pKF201 株お
よびFD-8株を用いて、焼酎を醸造した。モロミの仕込
は、第３表のごとくおこない、１次仕込には米麹を用
い、２次仕込では精白度７５％の大麦を用いた。

【００２３】

【表３】

【００２４】モロミ管理：モロミの品温は、始終２０℃
とした。１次仕込から５日後に２次仕込、更に１０日後
に蒸留をおこなった。醸造した熟成モロミの成分を第４
表に、更に蒸留して得られた焼酎の香気成分を第５表に
示した。

【００２５】

【表４】

【００２６】

【表５】

【００２７】実施例３．醸造調味料の製造酵母として、K-9H14-U7/pKF101株およびK-9H14-U7 株を
用い、発酵調味料を製造した。モロミの仕込は第６表の
ごとくおこなった。

【００２８】

【表６】

【００２９】発酵管理：発酵温度は、始終２５℃でおこ
なった。１次仕込後３日目に２次仕込をおこない、さら
に５日後に６５ｇの食塩を添加する不可飲処理をおこな
った。さらに２日後、圧搾濾過によって不溶性成分を除
去し、発酵調味料を得た。製造した発酵調味料の成分を
第７表に示す。

【００３０】

【表７】

【００３１】実施例４． K-9H14-U7/pKF101株の取得及
びＯＦＰ１遺伝子の塩基配列の決定（１）耐性遺伝子のクローニングＯＦＰ耐性遺伝子（ＯＦＰ１）は、３−デオキシ−Ｄ−
アラビノ−ヘプツロリン酸−７−リン酸シンターゼ（Ｄ
ＡＨＰシンターゼ）をコードする遺伝子ＡＲＯ４のアレ
ルである。既に報告されているサッカロマイセス・セレ
ビジェのＡＲＯ４の全塩基配列〔スイス工科大学、パラ
ビシニ(Paravicini)学位論文、1989年〕内にはＢａｍＨ
ＩおよびＳａｌＩ切断部位が存在しないことから、Ｓａ
ｌＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を有する配列番号１およ
び２で表わされる２９マーのオリゴヌクレオチドを、そ
れぞれＤＮＡシンセサイザーを使用して、合成した。配
列番号１で表わされるオリゴヌクレオチドはＳａｌＩ部
位を有する上流プライマーであり、配列番号２で表わさ
れるオリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩ部位を有する下流
プライマーである。合成して得られた２つのプライマー
が挟む領域は、ＡＲＯ４のプロモーター、オープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）およびターミネーターを含
む約1.９kbの領域である。

【００３２】別に、サッカロマイセス・セレビジェＸ２
１８０−１Ｂ株(ATCC26787) にＯＦＰ耐性を次のように
付与した。ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２
％、ぶどう糖２％、ｐＨ6.０）で、３０℃、１６時間培
養したＸ２１８０−１Ｂ株を0.２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ8.０）に菌体濃度１０⁸細胞／mlになるように懸濁し
た。

【００３３】ついで該懸濁液に、エチルメタンスルフォ
ネートを最終濃度30μl ／mlとなる様に添加し、３０℃
で６０分間放置した後、遠心分離で菌体を集めた。該菌
体を５％のチオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、さ
らに、リン酸緩衝液（ｐＨ6.０）で洗浄した。該菌体を
ＯＦＰ0.７mg／mlを含有する平板培地（ディフコ社製バ
クト・イースト・ナイトロジェン・ベース0.６７％、グ
ルコース２％、寒天1.５％）で３０℃、７日間培養し
た。寒天平板上に出現したコロニーからＯＦＰ耐性を有
する変異株サッカロマイセス・セレビジェＸ２１８０Ａ
株を選択した。

【００３４】得られた上流プライマー、下流プライマー
およびＯＦＰ耐性を有する変異株の全染色体ＤＮＡを用
い、Polymerase Chain Reaction （ＰＣＲ）法〔サイエ
ンス(Science) 、239 巻、487 、1988年〕に基づいて目
的とする1.９kbのＤＮＡ、すなわちＯＦＰ１遺伝子を増
幅した。

【００３５】この増幅したＤＮＡをアガロース電気泳動
にかけて1.９kbのバンドを分離し、ＤＮＡを抽出した。
次に、得られたＤＮＡをＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理し
た後、フェノール処理、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡ
を回収し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理したｐＵＣ１９
プラスミドに連結し、大腸菌〔E. coli HB101株、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal o
f Molecular Biology)41巻、459 、1969年〕を宿主とし
てサブクローニングを行った〔モレキュラー・クローニ
ング、実験書、第二版、コールドスプリングハーバー・
ラボラトリープレス(Molecular Cloning, A Laboratory
manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
9);以下、モレキュラー・クローニングという。〕。

【００３６】得られたプラスミドを電気泳動にかけ、ｐ
ＵＣ１９プラスミドよりＯＦＰ１遺伝子に相当する塩基
鎖（約1.９kb) 分長くなったプラスミドを回収し、その
プラスミドをｐＫＦ１００と命名した。ｐＫＦ１００の
挿入クローンについて制限酵素切断部位を調べたとこ
ろ、既知のＡＲＯ４と同じ部位に制限酵素切断部位が存
在することが確認された（第１図）。

【００３７】（２）ＯＦＰ１遺伝子の清酒酵母への導入
とβ−フェネチルアルコールの生成：取得したｐＫＦ１
００をＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した酵母ベクターＹ
Ｃｐ50（ura3 CEN4 ; Amp^R Tet^R) 〔ジーン（Gene)
60巻、237 、1987年〕につなぎ替え、先と同様にＯＦＰ
１遺伝子に相当する塩基鎖（約1.９kb）分長くなったプ
ラスミドを電気泳動ゲルから回収し、そのプラスミドを
ｐＫＦ１０１とした。次に、0.５μｇのｐＫＦ１０１を
リチウム法により、醸造協会９号酵母由来の１倍体株サ
ッカロマイセス・セレビジェK-9H14-U7( MATα ura3)
株に形質転換（モレキュラー・クローニング）後、ウラ
シルを含まないＣＭＭ寒天培地〔0.６７％ディフコイ
ーストナイトロジェンベース（アミノ酸フリー）に
２％のグルコース、２４μｇ／mlのウラシル、トリプト
ファン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、３６μ
ｇ／mlのチロシン、ロイシン、イソロイシン、リジン、
１００μｇ／mlのアスパラギン、１５０μｇ／mlのバリ
ン、２００μｇ／mlのスレオニン、６０μｇ／mlのフェ
ニルアラニンを添加したもの〕に塗布し、室温で培養
し、生育してくる形質転換株を取得し、K-9H14-U7/pKF1
01と命名した。

【００３８】（３）ＯＦＰ１遺伝子の塩基配列およびア
ミノ酸配列の決定ＤＮＡ合成装置で種々のプライマーを作成し、ダイデオ
キシ法〔Messing J. :メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー（Methods in Enzymology ） 101巻、20-78 、1983
年〕により伸張させたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し
た。

【００３９】プライマーは、Paraviciniが報告している
ＡＲＯ４の塩基配列を参考にして、３００から４００塩
基ごとに２０から２１塩基のプライマーを翻訳される側
について７種（配列番号５から１１）をＤＮＡ合成装置
を用いて合成した。さらに、本遺伝子の非翻訳側のＤＮ
Ａ鎖（アンチセンス）についても３００から４００塩基
ごとに２０から２１塩基のプライマーを６種作成した
（配列番号１２から１７）。非翻訳鎖でのプライマー
は、翻訳側のプライマーと重複を避けるようにその位置
を選択し、合成したプライマー領域に変異があっても見
逃すことのないように配慮した。

【００４０】シークエンスキット(Taq DyeDeoxyTM Term
inator Cycle Sequencing Kit 、アプライドバイオシ
ステム社) の処方に従い、これらのプライマーとＯＦＰ
１遺伝子のＤＮＡ断片を反応させ、それぞれ約４００塩
基までの長さのＤＮＡ断片を増幅した。これらの蛍光標
識されたＤＮＡ断片をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩモ
デル３７３ＡＤＮＡシークエンスシステム、アプライド
バイオシステム社）を用いて塩基配列を決定した。そ
れぞれの塩基配列を十分な重複をもたせてつなぎ合わせ
てＯＦＰ１遺伝子の全塩基配列を決定した（配列番号１
８）。また、同一のプライマーを用いてＡＲＯ４遺伝子
を鋳型として、ＰＣＲ法でＤＮＡ断片を増幅し、シーク
エンサーで塩基配列を決定した。両者は、いずれも非翻
訳ＤＮＡ鎖を鋳型とした同様の実験によって塩基配列を
決定した結果と矛盾がなかった。

【００４１】上記の結果、ＡＲＯ４遺伝子とＯＦＰ１遺
伝子の相違は、１塩基のみであった。即ち、ＯＦＰ１遺
伝子では、翻訳開始点より４９６番目の塩基（配列番号
１８では１０５８番目）のシトシン（Ｃ）が、アデニン
（Ａ）に置換されていた。この置換は、タンパク上で
は、１６６番目のアミノ酸のグルタミン（Ｇｌｎ）が、
リジン（Ｌｙｓ）に置換されたことに相当する。

【００４２】参考例１．形質転換株K-9H14-U7/pKF101
株の性質 K-9H14-U7 株、K-9H14-U7/pKF101株およびプラスミドYC
p50 のみを組み込んだK-9H14-U7/YCp50 株を、フルオロ
フェニールアラニンを水に溶解後、その濃度が２mg／ml
になるようにバクト・イースト・ナイトロジェン・ベー
ス（ディフコ社製）に混和して調製した寒天平板培地に
接種した後、２８℃で４日後の生育を観測した。その結
果を第８表に示す。

【００４３】さらに、K-9H14-U7 株、K-9H14-U7/pKF101
株およびK-9H14-U7/YCp50 株をYPD中３０℃、４８時間
振盪培養後、培養液中に生成されるβ−フェネチルアル
コールを測定した結果も第８表に示す。

【００４４】

【表８】

【００４５】プラスミドの安定性：形質転換株は、栄養
培地で植え継ぎを行ってもプラスミドの脱落は、認めら
れなかった。

【００４６】参考例２．ＡＲＯ４遺伝子とＯＦＰ１遺
伝子の比較ＡＲＯ４遺伝子に相当する1.9kb のＤＮＡ断片をＸ２１
８０−１Ｂ株から、取得し、ｐＵＣ１９に連結し、さら
にＹＣｐ５０につなぎ変え、プラスミドｐＫＦ４０１と
した。サッカロマイセス・セレビジェＫ−９Ｈ１４−Ｕ
７株のかわりにサッカロマイセス・セレビジェＰＵ−２
（MAT3, aro3, aro4, ura3）株を、ｐＫＦ１０１のかわ
りにｐＫＦ４０１を用いて実施例４（２）の方法と同様
におこない、形質転換株PU-2/pKF401 株を取得した。

【００４７】また、K-9H14-U7 株のかわりにPU-2株を用
いて実施例４（２）に記載の方法と同様におこない、形
質転換株PU-2/pKF101 株を取得した。PU-2株, ＰU-2/pK
F101株およびPU-2/pKF401 株を、フルオロフェニールア
ラニンを水に溶解後、その濃度が２mg／mlになるように
バクト・イースト・ナイトロジェン・ベース（ディフコ
社製）に混和して調製した寒天平板培地に接種した後、
２８℃で４日後の生育を観測した。その結果を第９表に
示す。

【００４８】さらに、PU-2株、PU-2/YCp50株、PU-2/pKF
101 株およびPU-2/pKF401 株をYPD中３０℃、４８時間
振盪培養後、培養液中に生成されるβ−フェネチルアル
コールを測定した結果も第９表に示す。

【００４９】

【表９】

【００５０】参考例３．ＯＦＰ１遺伝子の優性ポジテ
ィブマーカーとしての利用実用酵母の育種上、１コピーで形質の発現する優性耐性
マーカーが必要とされている。ＯＦＰ１遺伝子が１コピ
ーで優性のＯＦＰ耐性を示すことから、形質転換におけ
る優性ポジティブマーカーとしての可能性を検討した。
0.５μｇのｐＫＦ１０１および0.５μｇのＹＣｐ５０を
リチウム法によりK-9H14-U7 株およびアルコール発酵用
酵母由来SK-16-U5（ MATα ura3) 株に形質転換後、ウ
ラシルを補填した２mg／mlのＯＦＰ含有ＭＭ２プレート
上に塗布し、生育株についてウラシル要求性を調べた。
その結果、ｐＫＦ１０１を用いて形質転換したK-9H14-U
7株およびSK-16-U5株はすべてウラシル要求性が相補さ
れていた（第１０表）。さらに、プラスミドの脱落試験
を行った結果、pKF101プラスミドの消失とともに、プラ
スミド脱落菌はウラシル非存在下では生育せず、かつＯ
ＦＰ耐性およびチロシン存在下でのＰＦＰ耐性も失われ
ており、これらの形質が連鎖していることがわかった。

【００５１】

【表１０】

【００５２】サッカロマイセス・セレビジェ由来のポジ
ティブマーカーの使用により、実用酵母での分子育種が
容易になる。

【００５３】参考例４． FD-8/pKF201 株の取得（１）耐性遺伝子のクローニングＰＦＰ耐性遺伝子（ｐｆｐ１）は、プリフェン酸デヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子ｔｙｒ１のアレルであ
る。既に報告されているサッカロマイセス・セレビジェ
のＴＹＲ１の全塩基配列〔ジーン(Gene)、85巻、303 、
1989年〕内にはＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ切断部位が存
在しないことから、ＳａｌＩ部位およびＢａｍＨＩ部位
を有する配列番号３および４で表わされる２６マーのオ
リゴヌクレオチドを、それぞれＤＮＡシンセサイザーを
使用して、合成した。配合番号３で表わされるオリゴヌ
クレオチドはＳａｌＩ部位を有する上流プライマーであ
り、配列番号４で表わされるオリゴヌクレオチドは、Ｂ
ａｍＨＩ部位を有する下流プライマーである。合成して
得られた２つのプライマーが挟む領域は、ＴＹＲ１のプ
ロモーターとオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
およびターミネーターを含む約2.４kbの領域である。

【００５４】別に、サッカロマイセス・セレビジェＸ２
１８０−１Ｂ株にＰＦＰ耐性をつぎのように付与した。
ＹＰＤ培地で、３０℃、１６時間培養したＸ２１８０−
１Ｂ株を0.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ8.０）に菌体濃度
１０⁸細胞／mlになるように懸濁した。

【００５５】ついで該懸濁液に、エチルメタンスルフォ
ネートを最終濃度３０μｌ／mlとなる様に添加し、３０
℃で６０分間放置した後、遠心分離で菌体を集めた。該
菌体を５％のチオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、
さらに、リン酸緩衝液（ｐＨ6.０）で洗浄した。該菌体
をＰＦＰ 0.７mg／mlを含有する平板培地（ディフコ社
製バクト・イースト・ナイトロジェン・ベース0.６７
％、グルコース２％、寒天1.５％）で３０℃、７日間培
養した。寒天平板上に出現したコロニーからＰＦＰ耐性
を有する変異株を選択した。

【００５６】得られた上流プライマー、下流プライマー
およびＰＦＰ耐性を有する変異株の全染色体ＤＮＡを用
い、ＰＣＲ法に基づいて目的とする2.４kbのＤＮＡ、す
なわちｐｆｐ１遺伝子を増幅した。この増幅したＤＮＡ
をアガロース電気泳動にかけて2.４kbのバンドを分離
し、ＤＮＡを抽出した。次に、得られたＤＮＡをＢａｍ
ＨＩとＳａｌＩで処理した後、フェノールで処理、エタ
ノール沈澱でＤＮＡを回収し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで
処理したｐＵＣ１９プラスミドに連結し、大腸菌（ E.
coli HB101株）を宿主としてサブクローニングをおこな
った（モレキュラ・クローニング）。

【００５７】得られたプラスミドを電気泳動にかけ、ｐ
ＵＣ19プラスミドより、ｐｆｐ１遺伝子に相当する塩基
鎖（約2.４kb）分長くなったプラスミドを回収し、その
プラスミドをｐＫＦ２００と命名した。ｐＫＦ２００の
挿入クローンについて制限酵素切断部位を調べたとこ
ろ、既知のＴＹＲ１と同じ部位に制限酵素切断部位が存
在することが確認された（第２図）。

【００５８】（２）ｐｆｐ１遺伝子の清酒酵母への導入
とβ−フェネチルアルコールの生成：取得したｐＫＦ２
００をＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した酵母ベクターＹ
Ｃｐ50につなぎ替え、先と同様にｐｆｐ１遺伝子に相当
する塩基鎖（約2.４kb）分長くなったプラスミドを電気
泳動ゲルから回収し、そのプラスミドをｐＫＦ２０１と
した。次に、0.５μｇのｐＫＦ２０１をリチウム法によ
り、サッカロマイセス・セレビジェATCC 44337株由来の
サッカロマイセス・セレビジェFD-8株( MATa ura3 ty
r1 his3 lys2) に形質転換（モレキュラ・クローニン
グ）後、ウラシルを含まない CMM寒天培地に塗布し、室
温で培養し、生育してくる形質転換株を取得し、FD-8/p
KF201 と命名した。

【００５９】参考例５．形質転換株FD-8/pKF201 株の
性質ＦＤ−８株、ＦＤ−８／ｐＫＦ２０１株およびプラスミ
ドＹＣｐ５０のみを組み込んだＦＤ−８／ＹＣｐ５０株
を、フルオロフェニ−ルアラニンを水に溶解後、その濃
度が１mg／mlになるようにウラシルを含まないＣＭＭ寒
天培地に混和して調製した寒天平板培地に接種した後、
２８℃で４日後の生育を観察した結果を第１１表に示
す。

【００６０】さらに、ＦＤ−８株、ＦＤ−８／ｐＫＦ２
０１株およびＦＤ−８／ＹＣｐ５０株をＹＰＤ中３０
℃、４８時間振盪培養後、培養液中に生成されるβ−フ
ェネチルアルコールを測定した結果も第１１表に示す。

【００６１】

【表１１】

【００６２】プラスミドの安定性：形質転換株は、栄養
培地で植え継ぎを行ってもプラスミドの脱落は、認めら
れなかった。

【００６３】

【発明の効果】本発明で得られる酵母を用いることによ
り、香りの高い、従来とは異なった香気特性を有する飲
食品を製造することができる。

【００６４】

【配列表】

【００６５】配列番号：１配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：Primer領域の上流存在位置：−５５６．．−５３６特徴を決定した方法：Ｅ

【００６６】配列番号：２配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：Terminator領域の下流存在位置：１３３１．．１３５０特徴を決定した方法：Ｅ

【００６７】配列番号：３配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：Primer領域の上流存在位置：−８０５．．−７８９特徴を決定した方法：Ｅ

【００６８】配列番号：４配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：Terminator領域の下流存在位置：１５４２．．１５５８特徴を決定した方法：Ｅ

【００６９】配列番号：５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：Primer 領域の上流存在位置：210..230 特徴を決定した方法：Ｅ配列 CCACCCGCTG CACCCTGTGC ２０

【００７０】配列番号：６配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：Primer 領域存在位置：430..451 特徴を決定した方法：Ｅ配列 CGTGTTAATT CCTCTTTCGT C ２１

【００７１】配列番号：７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：650..671 特徴を決定した方法：Ｅ配列 CATTAGCTTC TCCAGCTCTC C ２１

【００７２】配列番号：８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：896..917 特徴を決定した方法：Ｅ配列 AAGCCAAGAA CAACCGTCGG C ２１

【００７３】配列番号：９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：1133..1153 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GCCTCCGGTT TGTCTTTCCC ２０

【００７４】配列番号：１０配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：1369..1389 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GCCTGCCGGT TCCAACGGTC ２０

【００７５】配列番号：１１配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：1623..1642 特徴を決定した方法：Ｅ配列 TGAGGAAATT GGCTGCTGCT G ２１

【００７６】配列番号：１２配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：367..346 特徴を決定した方法：ＥアンチセンスＹｅｓ配列 TATGAAATTA AACATTGATT GG 22

【００７７】配列番号：１３配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：663..641 特徴を決定した方法：ＥアンチセンスＹｅｓ配列 GGAGAAGCTA ATGGGTCGTA ACC 23

【００７８】配列番号：１４配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：919..898 特徴を決定した方法：ＥアンチセンスＹｅｓ配列 CCAGCCGACG GTTGTTCTTG GC 22

【００７９】配列番号：１５配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：1154..1132 特徴を決定した方法：ＥアンチセンスＹｅｓ配列 CTGGGAAAGA CAAACCGGAG GCC 23

【００８０】配列番号：１６配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：1429..1408 特徴を決定した方法：ＥアンチセンスＹｅｓ配列 GAAATCCTTA TTGGAGTTAC CG 22

【００８１】配列番号：１７配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：翻訳領域存在位置：1721..1700 特徴を決定した方法：ＥアンチセンスＹｅｓ配列 GTGGTAGAGG AAAGAATGTA CG 22

【００８２】配列番号：１８配列の長さ：１９２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：サッカロマイセスセレビジエ（Saccharomyce
s cerevisiae）株名：X2180A 配列の特徴特徴を表す記号：TATA signal 存在位置：369..373 特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：TATA signal 存在位置：413..416 特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：TATA signal 存在位置：421..427 特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：peptide 存在位置：563..1672 特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：Terminator 存在位置：1673..1675 特徴を決定した方法：Ｓ配列 GTCGACTGAA TCACGTGATC AACAGCAAAT TATGTACTCG TATATATGCA AGCGCATTCC 60 TTATATTGAC ACTCTTTCAT TGGGCATGAG GCTGTGTAAA CATAAGCTGT AACGGTCTCA 120 CGGAACACTG TGTAGTTGCA TTACTGTCAG GCAGTTATGT TGCTTAATAT AAAGGCAAAG 180 GCATGGCAGA ATCACTTTAA AACGTGGCCC CACCCGCTGC ACCCTGTGCA TTTTGTACGT 240 TACTGCGAAA TGACTCAACG ATGAAATGAA AAAATTTTGC TTGAAATTTT GAAAAAAAGA 300 TGTGCGGGAC GCATTGTTAG CTCATTGAAT ACATCGTGAT CGAATCCAAT CAATGTTTAA 360 TTTCATATTA ATACAGAAAC TTTTTCTCAT ACTTTCTTCT TCTTTTCATT GGTATATTAT 420 CTATATATCG TGTTAATTCC TCTTTCGTCA TTTTTAGCAT CGTTATAAGA GTAATTAAGA 480 ATAACTAGAA GAGTCTCTCT TTATATTCGT TTATTTTATA TATTTAACCG CTAAATTTAG 540 TAAACAAAAG AATCTATCAG AA 562 ATG AGT GAA TCT CCA ATG TTC GCT GCC AAC GGC ATG CCA AAG GTA AAT 610 Met Ser Glu Ser Pro Met Phe Ala Ala Asn Gly Met Pro Lys Val Asn 1 5 10 15 CAA GGT GCT GAA GAA GAT GTC AGA ATT TTA GGT TAC GAC CCA TTA GCT 658 Gln Gly Ala Glu Glu Asp Val Arg Ile Leu Gly Tyr Asp Pro Leu Ala 20 25 30 TCT CCA GCT CTC CTT CAA GTG CAA ATC CCA GCC ACA CCA ACT TCT TTG 706 Ser Pro Ala Leu Leu Gln Val Gln Ile Pro Ala Thr Pro Thr Ser Leu 35 40 45 GAA ACT GCC AAG AGA GGT AGA AGA GAA GCT ATA GAT ATT ATT ACC GGT 754 Glu Thr Ala Lys Arg Gly Arg Arg Glu Ala Ile Asp Ile Ile Thr Gly 50 55 60 AAA GAC GAC AGA GTT CTT GTC ATT GTC GGT CCT TGT TCC ATC CAT GAT 802 Lys Asp Asp Arg Val Leu Val Ile Val Gly Pro Cys Ser Ile His Asp 65 70 75 80 CTA GAA GCC GCT CAA GAA TAC GCT TTG AGA TTA AAG AAA TTG TCA GAT 850 Leu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Lys Lys Leu Ser Asp 85 90 95 GAA TTA AAA GGT GAT TTA TCC ATC ATT ATG AGA GCA TAC TTG GAG AAG 898 Glu Leu Lys Gly Asp Leu Ser Ile Ile Met Arg Ala Tyr Leu Glu Lys 100 105 110 CCA AGA ACA ACC GTC GGC TGG AAA GGT CTA ATT AAT GAC CCT GAT GTT 946 Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro Asp Val 115 120 125 AAC AAC ACT TTC AAC ATC AAC AAG GGT TTG CAA TCC GCT AGA CAA TTG 994 Asn Asn Thr Phe Asn Ile Asn Lys Gly Leu Gln Ser Ala Arg Gln Leu 130 135 140 TTT GTC AAC TTG ACA AAT ATC GGT TTG CCA ATT GGT TCT GAA ATG CTT 1042 Phe Val Asn Leu Thr Asn Ile Gly Leu Pro Ile Gly Ser Glu Met Leu 145 150 155 160 GAT ACC ATT TCT CCT AAA TAC TTG GCT GAT TTG GTC TCC TTC GGT GCC 1090 Asp Thr Ile Ser Pro Lys Tyr Leu Ala Asp Leu Val Ser Phe Gly Ala 165 170 175 ATT GGT GCC AGA ACC ACC GAA TCT CAA CTG CAC AGA GAA TTG GCC TCC 1138 Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Leu His Arg Glu Leu Ala Ser 180 185 190 GGT TTG TCT TTC CCA GTT GGT TTC AAG AAC GGT ACC GAT GGT ACC TTA 1186 Gly Leu Ser Phe Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr Leu 195 200 205 AAT GTT GCT GTG GAT GCT TGT CAA GCC GCT GCT CAT TCT CAC CAT TTC 1234 Asn Val Ala Val Asp Ala Cys Gln Ala Ala Ala His Ser His His Phe 210 215 220 ATG GGT GTT ACT AAG CAT GGT GTT GCT GCT ATC ACC ACT ACT AAG GGT 1282 Met Gly Val Thr Lys His Gly Val Ala Ala Ile Thr Thr Thr Lys Gly 225 230 235 240 AAC GAA CAC TGC TTC GTT ATT CTA AGA GGT GGT AAA AAG GGT ACC AAC 1330 Asn Glu His Cys Phe Val Ile Leu Arg Gly Gly Lys Lys Gly Thr Asn 245 250 255 TAC GAC GCT AAG TCC GTT GCA GAA GCT AAG GCT CAA TTG CCT GCC GGT 1378 Tyr Asp Ala Lys Ser Val Ala Glu Ala Lys Ala Gln Leu Pro Ala Gly 260 265 270 TCC AAC GGT CTA ATG ATT GAC TAC TCT CAC GGT AAC TCC AAT AAG GAT 1426 Ser Asn Gly Leu Met Ile Asp Tyr Ser His Gly Asn Ser Asn Lys Asp 275 280 285 TTC AGA AAC CAA CCA AAG GTC AAT GAC GTT GTT TGT GAG CAA ATC GCT 1474 Phe Arg Asn Gln Pro Lys Val Asn Asp Val Val Cys Glu Gln Ile Ala 290 295 300 305 AAC GGT GAA AAC GCC ATT ACC GGT GTC ATG ATT GAA TCA AAC ATC AAC 1522 Asn Gly Glu Asn Ala Ile Thr Gly Val Met Ile Glu Ser Asn Ile Asn 310 315 320 GAA GGT AAC CAA GGC ATC CCA GCC GAA GGT AAA GCC GGC TTG AAA TAT 1570 Glu Gly Asn Gln Gly Ile Pro Ala Glu Gly Lys Ala Gly Leu Lys Tyr 325 330 335 GGT GTT TCC ATC ACT GAT GCT TGT ATA GGT TGG GAA ACT ACT GAA GAC 1618 Gly Val Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Thr Thr Glu Asp 340 345 350 GTC TTG AGG AAA TTG GCT GCT GCT GTC AGA CAA AGA AGA GAA GTT AAC 1666 Val Leu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Val Arg Gln Arg Arg Glu Val Asn 355 360 365 AAG AAA 1672 Lys Lys 370 TAGATGTT 1680 TTTTTAATGA TATATGTAAC GTACATTCTT TCCTCTACCA CTGCCAATTC GGTATTATTT 1740 AATTGTGTTT AGCGCTATTT ACTAATTAAC TAGAAACTCA ATTTTTAAAG GCAAAGCTCG 1800 CTGACCTTTC ACTGATTTCG TGGATGTTAT ACTATCAGTT ACTCTTCTGC AAAAAAAAAT 1860 TGAGTCATAT CGTAGCTTTG GGATTATTTT TCTCTCTCTC CACGGCTAAT TAGGTGATCA 1920 TGGATCC 1927

【００８３】配列番号：１９配列の長さ：１１１３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：サッカロマイセスセレビジエ（Saccharomyce
s cerevisiae）株名：X2180A 配列 ATG AGT GAA TCT CCA ATG TTC GCT GCC AAC GGC ATG CCA AAG GTA AAT 48 Met Ser Glu Ser Pro Met Phe Ala Ala Asn Gly Met Pro Lys Val Asn 1 5 10 15 CAA GGT GCT GAA GAA GAT GTC AGA ATT TTA GGT TAC GAC CCA TTA GCT 96 Gln Gly Ala Glu Glu Asp Val Arg Ile Leu Gly Tyr Asp Pro Leu Ala 20 25 30 TCT CCA GCT CTC CTT CAA GTG CAA ATC CCA GCC ACA CCA ACT TCT TTG 144 Ser Pro Ala Leu Leu Gln Val Gln Ile Pro Ala Thr Pro Thr Ser Leu 35 40 45 GAA ACT GCC AAG AGA GGT AGA AGA GAA GCT ATA GAT ATT ATT ACC GGT 192 Glu Thr Ala Lys Arg Gly Arg Arg Glu Ala Ile Asp Ile Ile Thr Gly 50 55 60 AAA GAC GAC AGA GTT CTT GTC ATT GTC GGT CCT TGT TCC ATC CAT GAT 240 Lys Asp Asp Arg Val Leu Val Ile Val Gly Pro Cys Ser Ile His Asp 65 70 75 80 CTA GAA GCC GCT CAA GAA TAC GCT TTG AGA TTA AAG AAA TTG TCA GAT 288 Leu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Lys Lys Leu Ser Asp 85 90 95 GAA TTA AAA GGT GAT TTA TCC ATC ATT ATG AGA GCA TAC TTG GAG AAG 336 Glu Leu Lys Gly Asp Leu Ser Ile Ile Met Arg Ala Tyr Leu Glu Lys 100 105 110 CCA AGA ACA ACC GTC GGC TGG AAA GGT CTA ATT AAT GAC CCT GAT GTT 384 Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro Asp Val 115 120 125 AAC AAC ACT TTC AAC ATC AAC AAG GGT TTG CAA TCC GCT AGA CAA TTG 432 Asn Asn Thr Phe Asn Ile Asn Lys Gly Leu Gln Ser Ala Arg Gln Leu 130 135 140 TTT GTC AAC TTG ACA AAT ATC GGT TTG CCA ATT GGT TCT GAA ATG CTT 480 Phe Val Asn Leu Thr Asn Ile Gly Leu Pro Ile Gly Ser Glu Met Leu 145 150 155 160 GAT ACC ATT TCT CCT AAA TAC TTG GCT GAT TTG GTC TCC TTC GGT GCC 528 Asp Thr Ile Ser Pro Lys Tyr Leu Ala Asp Leu Val Ser Phe Gly Ala 165 170 175 ATT GGT GCC AGA ACC ACC GAA TCT CAA CTG CAC AGA GAA TTG GCC TCC 576 Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Leu His Arg Glu Leu Ala Ser 180 185 190 GGT TTG TCT TTC CCA GTT GGT TTC AAG AAC GGT ACC GAT GGT ACC TTA 624 Gly Leu Ser Phe Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr Leu 195 200 205 AAT GTT GCT GTG GAT GCT TGT CAA GCC GCT GCT CAT TCT CAC CAT TTC 672 Asn Val Ala Val Asp Ala Cys Gln Ala Ala Ala His Ser His His Phe 210 215 220 ATG GGT GTT ACT AAG CAT GGT GTT GCT GCT ATC ACC ACT ACT AAG GGT 720 Met Gly Val Thr Lys His Gly Val Ala Ala Ile Thr Thr Thr Lys Gly 225 230 235 240 AAC GAA CAC TGC TTC GTT ATT CTA AGA GGT GGT AAA AAG GGT ACC AAC 768 Asn Glu His Cys Phe Val Ile Leu Arg Gly Gly Lys Lys Gly Thr Asn 245 250 255 TAC GAC GCT AAG TCC GTT GCA GAA GCT AAG GCT CAA TTG CCT GCC GGT 816 Tyr Asp Ala Lys Ser Val Ala Glu Ala Lys Ala Gln Leu Pro Ala Gly 260 265 270 TCC AAC GGT CTA ATG ATT GAC TAC TCT CAC GGT AAC TCC AAT AAG GAT 864 Ser Asn Gly Leu Met Ile Asp Tyr Ser His Gly Asn Ser Asn Lys Asp 275 280 285 TTC AGA AAC CAA CCA AAG GTC AAT GAC GTT GTT TGT GAG CAA ATC GCT 912 Phe Arg Asn Gln Pro Lys Val Asn Asp Val Val Cys Glu Gln Ile Ala 290 295 300 305 AAC GGT GAA AAC GCC ATT ACC GGT GTC ATG ATT GAA TCA AAC ATC AAC 960 Asn Gly Glu Asn Ala Ile Thr Gly Val Met Ile Glu Ser Asn Ile Asn 310 315 320 GAA GGT AAC CAA GGC ATC CCA GCC GAA GGT AAA GCC GGC TTG AAA TAT 1008 Glu Gly Asn Gln Gly Ile Pro Ala Glu Gly Lys Ala Gly Leu Lys Tyr 325 330 335 GGT GTT TCC ATC ACT GAT GCT TGT ATA GGT TGG GAA ACT ACT GAA GAC 1056 Gly Val Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Thr Thr Glu Asp 340 345 350 GTC TTG AGG AAA TTG GCT GCT GCT GTC AGA CAA AGA AGA GAA GTT AAC 1104 Val Leu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Val Arg Gln Arg Arg Glu Val Asn 355 360 365 AAG AAA TAG 1113 Lys Lys 370

【図面の簡単な説明】

【図１】既知のＡＲＯ４遺伝子の制限酵素地図とプラス
ミドｐＫＦ１００に導入したＯＦＰ１耐性遺伝子の制限
酵素地図である。図中、ＳはＳａｌＩ、ＳｐはＳｐｈ
Ｉ、ＸはＸｂａＩ、ＫはＫｐｎＩ、ＢはＢａｍＨＩを表
わす。

【図２】既知のＴＲＹ１遺伝子の制限酵素地図とプラス
ミドｐＫＦ２００に導入したｐｆｐ１耐性遺伝子の制限
酵素地図である。図中、ＳはＳａｌＩ、ＳｔはＳｔｕ
Ｉ、ＨはＨｉｎｄIII 、ＥはＥｃｏＲＩ、ＢはＢａｍＨ
Ｉを表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 1/19 // Ｃ１２Ｎ 1/19 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A23L 1/00 A23L 1/23 C12G 3/02 C12N 15/31 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物を用いて飲食品を製造する方法に
おいて、サッカロマイセス属に属し、配列番号１８また
は配列番号１９で表される遺伝子を導入した酵母を用い
ることを特徴とする飲食品の製造法。
【請求項２】飲食品がアルコール飲料または発酵調味
料である請求項１記載の製造法。
【請求項３】配列番号１８または配列番号１９で表さ
れる遺伝子。