JP3141084B2 - 単子葉植物の超迅速形質転換法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、単子葉植物のアグ
ロバクテリウム媒介性の形質転換方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物を改良するための手段の１つとして
「形質転換法」が挙げられ、形質を改変するための所望
の組換え遺伝子が植物に導入される。効率の良い、迅速
な形質転換法は、有用な植物、特に、主食として重要な
食糧である穀物を、分子育種するにおいて極めて重要で
ある。

【０００３】穀物の多く（例えば、イネ、コムギ、オオ
ムギ、およびトウモロコシ）は、単子葉植物に分類され
る。単子葉植物を形質転換するために、これまでに種々
の形質転換法が開発されている。形質転換法は、直接的
な形質転換法と間接的な形質転換法とに大きく分けられ
る。

【０００４】直接的な形質転換法としては、例えば、エ
レクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ．
ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６、１９８
９；およびＲｈｏｄｅｓ Ｃ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２４０：２０４−２０７、１９８９を参照）、パー
ティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ．ら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２、１９９１
を参照）ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法
（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、８：７３６−７４０、１９９０を参照）が挙げら
れる。エレクトロポレーション法およびパーティクルガ
ン法は、遺伝子を比較的効率良く導入し得る方法とし
て、単子葉植物を形質転換するために一般に使用されて
きた。

【０００５】間接的な形質転換法としては、アグロバク
テリウム媒介性の形質転換法（以下、アグロバクテリウ
ム形質転換法と呼ぶことがある）が挙げられる。アグロ
バクテリウムは、植物病原細菌の一種である。アグロバ
クテリウムは、植物に感染すると、自らが有するプラス
ミド（例えば、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド）
上に存在するＴ−ＤＮＡ領域を、植物に組込む性質を有
する。アグロバクテリウム形質転換法では、植物に遺伝
子を導入するための手段として、このＴ−ＤＮＡ領域の
植物への組込みを利用する。簡潔には、植物は、所望の
組換え遺伝子含むアグロバクテリウムで感染される。感
染後、所望の組換え遺伝子は、アグロバクテリウムから
植物細胞内に移入され、そして植物ゲノムに組込まれ
る。

【０００６】アグロバクテリウム形質転換法は、双子葉
植物については、十分に確立されており、現在までに、
所望の組換え遺伝子を発現する安定な形質転換植物が数
多く作出されている。

【０００７】対照的に、アグロバクテリウム形質転換法
を単子葉植物に適用することは、従来、一般に困難であ
るとされてきた。例えば、Ｐｏｒｔｒｙｋｕｓら（ＢＩ
Ｏ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ５３５−５４２，１９９
０）は、アグロバクテリウムは、単子葉植物に感染しな
いと報告している。しかし、他方で、アグロバクテリウ
ムを使用して単子葉植物を形質転換する試みは数多く行
われ、その結果、アグロバクテリウム形質転換法を単子
葉植物に適用できる可能性が見出されてきた。

【０００８】例えば、Ｒａｉｎｅｒｉらは、イネの胚盤
部分を取り出し、傷をつけて、脱分化を誘導する培地に
置床し、数日後に、その胚盤部分をアグロバクテリウム
で感染した。その結果、正常な再分化個体を得るまでに
は至らなかったものの、外来遺伝子が導入されたカルス
を誘導することに成功した（Ｒａｉｎｅｒｉ， Ｄ．
Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３３−３
８、１９９０を参照）。

【０００９】国際公開ＷＯ９４／００９７７号パンフレ
ットは、イネおよびトウモロコシについての、アグロバ
クテリウム形質転換法を開示する。この方法では、アグ
ロバクテリウムで形質転換するための植物試料として、
脱分化過程にあるかまたは脱分化した培養組織（例え
ば、カルス）を使用することを必要とする。このため、
アグロバクテリウムでの感染の前に、形質転換しようと
する植物試料（例えば、葉切片）から脱分化された培養
組織を作製するために、通常、３〜４週間の脱分化誘導
期間を必要とする。

【００１０】国際公開ＷＯ９５／０６７２２号パンフレ
ットは、イネおよびトウモロコシの未熟胚をアグロバク
テリウムで感染する方法を開示する。しかし、未熟胚を
取り出すための作業は多大な労力を要する。

【００１１】従って、より迅速で、効率の良い、単子葉
植物のアグロバクテリウム形質転換法が利用できれば、
イネなどの穀物を含む、有用な単子葉植物の分子育種に
大いに貢献できる。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題の
解決を意図するものである。本発明の目的は、単子葉植
物のアグロバクテリウム形質転換法における改良を提供
することにある。本発明の方法によれば、従来のアグロ
バクテリウム形質転換法よりも効率良く、はるかに迅速
に、形質転換植物を作出することが可能である。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、単子葉植物の
形質転換方法に関し、所望の組換え遺伝子を含むアグロ
バクテリウムで、無傷の種子を感染する工程を包含す
る。本発明の方法において、種子は、無傷の状態で感染
され、形質転換しようとする植物試料を脱分化するなど
の処理は必要とされない。

【００１４】アグロバクテリウムでの感染に供される種
子は、播種後４〜５日目の種子であり得る。また、感染
の時点で、種子は、発芽した状態であり得る。

【００１５】形質転換される単子葉植物は、好ましくは
イネ科植物であり、より好ましくはイネ（Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ｌ．）である。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳しく説明する。

【００１７】本発明の方法が適用される「植物」は、単
子葉植物である。好ましい単子葉植物としては、イネ科
植物（例えば、イネおよびトウモロコシ）が挙げられ
る。本発明の方法が適用される最も好ましい植物は、イ
ネであり、特に、ジャポニカイネである。また「植物」
は、特に他で示さない限り、植物体、および植物体から
得られる種子を意味する。

【００１８】（植物発現用ベクターの作製）単子葉植物
に所望の組換え遺伝子を導入するために、所望の組換え
遺伝子を含む適切な植物発現用ベクターが構築される。
このような植物発現用ベクターは、当業者に周知の遺伝
子組換え技術を用いて作製され得る。アグロバクテリウ
ム形質転換法において使用するための植物発現用ベクタ
ーの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターが好適に用
いられるが、これらに限定されない。

【００１９】「所望の組換え遺伝子」は、植物に導入さ
れることが所望される任意のポリヌクレオチドをいう。
本発明における所望の組換え遺伝子は、天然から単離さ
れたものに限定されず、合成ポリヌクレオチドも含み得
る。合成ポリヌクレオチドは、例えば、配列が公知の遺
伝子を、当業者に周知の手法によって合成または改変す
ることにより入手し得る。本発明における所望の組換え
遺伝子としては、例えば、形質転換される植物において
発現が所望される、その植物に対して内因性または外因
性である任意のポリヌクレオチド、および植物において
ある内因性遺伝子の発現制御が所望される場合の、その
標的となる遺伝子のアンチセンス配列を含むポリヌクレ
オチドが挙げられる。

【００２０】植物において発現が意図される場合、所望
の組換え遺伝子は、自己のプロモーター（すなわち、天
然において該遺伝子が作動可能に連結しているプロモー
ター）を作動可能な様式で含むか、または自己のプロモ
ーターを含まない場合もしくは自己のプロモーター以外
のプロモーターをさらに含むことが所望される場合、任
意の適切なプロモーターと作動可能に連結される。使用
され得るプロモーターとしては、構成的プロモーター、
および植物体の一部において選択的に発現するプロモー
ター、ならびに誘導性のプロモーターが挙げられる。

【００２１】植物発現用ベクターにおいて、さらに種々
の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態
で連結され得る。調節エレメントは、好適には、選抜マ
ーカー遺伝子、植物プロモーター、ターミネーター、お
よびエンハンサーを含み得る。使用される植物発現用ベ
クターのタイプおよび調節エレメントの種類が、形質転
換の目的に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事
項である。

【００２２】「選抜マーカー遺伝子」は、形質転換植物
の選抜を容易にするために使用され得る。ハイグロマイ
シン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォ
トランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子、およびカナマイ
シン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトラ
ンスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子のような薬剤
耐性遺伝子が好適に用いられ得るが、これらに限定され
ない。

【００２３】「植物プロモーター」は、選抜マーカー遺
伝子に作動可能に連結される、植物で発現するプロモー
ターを意味する。このようなプロモーターの例として
は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５
Ｓプロモーター、およびノパリン合成酵素のプロモータ
ーが挙げられるが、これらに限定されない。

【００２４】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡ
に転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加
に関与する配列である。ターミネーターの例としては、
ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵
素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられる
が、これらに限定されない。

【００２５】「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効
率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとして
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含
むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１
つの植物発現用ベクターあたり複数個用いられ得る。

【００２６】（植物の形質転換）単子葉植物の形質転換
に用いられるアグロバクテリウムは、任意のアグロバク
テリウム属細菌であり得、好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである。アグロバ
クテリウムは、所望の組換え遺伝子を含む植物発現用ベ
クターで（例えば、エレクトロポレーションによって）
形質転換される。形質転換されたアグロバクテリウムで
種子を感染することにより、所望の組換え遺伝子を植物
に導入し得る。導入された組換え遺伝子は、植物中のゲ
ノムに組み込まれて存在する。なお、植物中のゲノムと
は、核染色体のみならず、植物細胞中の各種オルガネラ
（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるゲ
ノムを含んでいう。

【００２７】形質転換が意図される植物の種子は、籾殻
を除去した後、無傷の状態で前培養される。種子に関し
て「無傷」とは、種子が、胚珠を除去すること、および
胚盤を傷つけることなどの人為的な操作を受けていない
状態であることをいう。

【００２８】前培養において、種子は、適切な濃度のオ
ーキシン（例えば、２，４−Ｄ）を含む培地（例えば、
Ｎ６Ｄ培地）に播種されて、代表的には４日〜５日間、
好ましくは５日間、保温され得る。前培養は、種子の組
織が脱分化過程に入る前に完了される。このときの温度
は、代表的には２５〜３５℃、好ましくは２７〜３２℃
である。前培養の完了後、種子は殺菌され、次いで水で
十分に洗浄される。次いで、種子は、無菌操作下で、形
質転換されたアグロバクテリウムで感染され得る。

【００２９】アグロバクテリウムでの感染（共存培養）
の間、種子は、暗黒下で、代表的には２日間〜５日間、
好ましくは３日間、保温される。このときの温度は、代
表的には２６〜２８℃、好ましくは２８℃である。次い
で、種子は、培地中のアグロバクテリウムを除菌するた
めに、適切な除菌剤（例えば、カルベニシリン）による
処理に供される。形質転換された種子が、選抜マーカー
（例えば、ハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性）を基
準として選抜される。

【００３０】適切な除菌条件および選抜条件下での培養
後、選抜された形質転換種子は、適切な植物調節物質を
含む再分化培地（例えば、ＭＳ培地）に移され、適切な
期間、保温され得る。植物体を再生するためには、再分
化した形質転換体は、発根培地（例えば、植物調節物質
を含まないＭＳ培地）に移される。根の発育が確認され
た後、形質転換体は、鉢上げされ得る。

【００３１】植物に導入された所望の組換え遺伝子は、
植物において意図される目的（例えば、目的とされる新
たな形質の発現、またはある内因性の遺伝子の発現の制
御）のために作用し得る。

【００３２】所望の組換え遺伝子が植物に導入されたか
否かは、当業者に周知の手法を用いて、確認され得る。
この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行
い得る。具体的には、再生した植物の葉から全ＲＮＡを
抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメン
ブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の
一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダ
イズさせることにより、目的の遺伝子のｍＲＮＡを検出
し得る。あるいは、所望の組換え遺伝子の導入によっ
て、植物における内因性遺伝子の発現制御が所望される
場合、標的となる内因性遺伝子の発現を、例えば、上記
のノーザンブロット解析を用いて、試験し得る。標的と
なる内因性遺伝子の発現が、非形質転換のコントロール
植物におけるその発現に比べて有意に抑制されている場
合、所望の組換え遺伝子は植物に導入され、そして発現
の制御に作用したことが確認される。

【００３３】従来の方法は、アグロバクテリウムでの感
染の前に、通常、３〜４週間の脱分化誘導期間を必要と
する。対照的に、本発明の方法は、脱分化を誘導する工
程を必要としないので、形質転換単子葉植物を作出する
ために必要な日数を短縮することが可能である。さら
に、本発明の方法によれば、従来法における選抜に要す
る期間を短縮することも可能となり、培養変異の影響を
低減することが可能となる。

【００３４】本発明の方法の好ましい１つの実施態様に
おいて、形質転換単子葉植物を作出するために必要とさ
れる日数は約５０日であり、従来のアグロバクテリウム
形質転換方法（例えば、下記実施例２を参照）において
必要とされる日数（約９０日）の約３分の２以下であ
る。また、本発明の方法によれば、日本晴の種子の場合
で、１０〜１５％の形質転換効率が得られる。どんとこ
い、キタアケなどの他のイネ品種でも同程度に高い形質
転換効率が達成可能である。従って、本発明の方法を使
用することによって、従来の形質転換法よりも効率良
く、および迅速に、形質転換植物を作出することが可能
である。

【００３５】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説
明する。この実施例は、本発明を限定するものではな
い。実施例で使用した、材料、試薬などは、他に特定の
ない限り、商業的な供給源から入手可能である。

【００３６】（実施例１：本発明の方法によるイネ植物
の形質転換）イネの代表的品種である日本晴の種子を、
籾殻の除去後、無傷の状態で、２．５％次亜塩素酸ナト
リウム（ＮａＣｌＯ）溶液中で殺菌した。水での十分な
洗浄の後、イネを以下の無菌操作に供した。

【００３７】（前培養）種子を、２，４−Ｄを含むＮ６
Ｄ培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ
酸、２．８ｇ／ｌプロリン、２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、
４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．８）に播種し、５日間、
２７℃〜３２℃で保温した。この間に種子は発芽した
（図１）。

【００３８】（植物発現用ベクター）アグロバクテリウ
ムを形質転換するための植物発現用ベクターとして、ヒ
マのカタラーゼ遺伝子の第１イントロンを含むＧＵＳ遺
伝子と、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子とが連結された
プラスミドである、ｐＩＧ１２１Ｈｍを用いた（中村
ら、植物バイオテクノロジーＩＩ、現代化学増刊、ｐ
ｐ．１２３−１３２（１９９１））。ｐＩＧ１２１Ｈｍ
で、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１を形質転換した
（Ｈｏｏｄら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６
８：１２９１−１３０１（１９８６））。ＥＨＡ１０１
は、ヘルパープラスミドのｖｉｒ領域が強病原性アグロ
バクテリウムＡ２８１由来の菌である。

【００３９】（アグロバクテリウム感染）形質転換され
たアグロバクテリウムの懸濁液に、前培養した上記種子
を浸漬した後、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／ｌスクロー
ス、１０ｇ／ｌグルコース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、
２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、１０ｍｇ／ｌ アセトシリン
ゴン、４ｇ／ｌゲルライト、ｐＨ５．２）に移植した。
暗黒下で３日間、２８℃で保温して共存培養した。

【００４０】（除菌および選抜）共存培養の完了後、５
００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用
いて、種子から、アグロバクテリウムを洗い流した。次
いで、形質転換された種子の選抜を、以下の条件で行っ
た。第１回目の選抜 ：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）お
よびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、２
ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子を置
き、７日間、２７℃〜３２℃で保温した。第２回目の選抜 ：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）お
よびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、２
〜４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上に、種子
を置き、さらに７日間、２７℃〜３２℃で保温した。

【００４１】（再分化）選抜された形質転換種子を、以
下の条件で再分化させた。第１回目の再分化 ：再分化培地（カルベニシリン（５０
０ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）
を補充したＭＳ培地（３０ｇ／ｌスクロース、３０ｇ／
ｌソルビトール、２ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌカイ
ネチン、０．００２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、４ｇ／ｌゲルラ
イト、ｐＨ５．８）上に、選抜した種子を置き、２週
間、２７℃〜３２℃で保温した。第２回目の再分化 ：第１回目の再分化において使用した
のと同じ再分化培地を使用して、さらに２週間、２７℃
〜３２℃で保温した。

【００４２】（鉢上げ）再分化した形質転換体を、発根
培地（ハイグロマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した、
ホルモンを含まないＭＳ培地）上に移して、根の発育を
確認した後に、鉢上げした（図２）。

【００４３】（実施例２：従来の方法によるイネ植物の
形質転換）実施例１に記載の方法との比較のために、日
本晴を形質転換の材料として使用して、従来の方法によ
るイネ植物の形質転換を、以下のように行った。

【００４４】（カルス誘導）日本晴の種子を、籾殻の除
去後、滅菌し、そしてカルス誘導培地（２ｍｇ／ｌの
２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地）に播種し、これを明所
下、３０℃で保温した。カルス誘導開始から約４週間
後、胚盤由来の増殖したカルスを、形質転換に使用し
た。

【００４５】（形質転換）実施例１に記載されるように
植物発現用ベクターｐＩＧ１２１Ｈｍで形質転換したア
グロバクテリウムＥＨＡ１０１で、得られたカルスを感
染し、２Ｎ６−ＡＳ培地上で、暗黒下で３日間、２８℃
で保温して共存培養した。

【００４６】（除菌および選抜）５００ｍｇ／ｌカルベ
ニシリンを含有するＮ６Ｄ培地を用いて、カルスから、
アグロバクテリウムを洗い流した。次いで、形質転換さ
れたカルスの選抜を、以下の条件で行った。第１回目の選抜 ：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）お
よびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充した２ｍ
ｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上にカルスを置
き、２週間、２７℃〜３２℃で保温した。第２回目の選抜 ：カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）お
よびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補充した２〜
４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上にカルスを
置き、さらに２週間、２７℃〜３２℃で保温した。

【００４７】（再分化、発根および鉢上げ）選抜された
形質転換種子を、実施例１と同様の条件で再分化させ、
鉢上げまでを行った。

【００４８】（結果）従来の方法による形質転換の例
と、本発明の方法による形質転換の例との比較を図３に
示す。播種後、形質転換体の鉢上げまでに必要な日数
は、従来法においては約９０日であったのに対して、本
発明の方法においては約５０日であった（図３
（ａ））。播種後約５０日目の時点で比較すると、本発
明の方法における形質転換体は鉢上げ可能な状態であっ
たのに対し、従来法における形質転換体は、未だ再分化
の過程にあった（図３（ｂ））。まとめると、本発明の
方法の実施により、形質転換に要する期間が、従来法の
約３分の２以下に短縮された。

【００４９】

【発明の効果】本発明によれば、改良された、アグロバ
クテリウム媒介性の単子葉植物の形質転換方法が提供さ
れる。本発明の方法においては、形質転換を意図される
植物の無傷の種子が、所望の組換え遺伝子を含むアグロ
バクテリウムで感染される。本発明の使用により、より
効率良く、そしてより迅速に、形質転換植物を作出する
ことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 アグロバクテリウムを感染する直前のイネ種
子の状態を示す、生物の形態を示す写真である。

【図２】 播種から約５０日目の、本発明の方法により
で得られたイネの再分化個体を示す、生物の形態を示す
写真である。

【図３】 （ａ）播種後約９０日目の従来法による形質
転換体と、播種後約５０日目の本発明の方法による形質
転換体とを比較した、生物の形態を示す写真である。
（ｂ）播種後約５０日目の従来法による形質転換体と、
播種後約５０日目の本発明の方法による形質転換体とを
比較した、生物の形態を示す写真である。

フロントページの続き (72)発明者 塩原 文緒 茨城県つくば市観音台２−１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 渋谷 直人 茨城県つくば市観音台２−１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 小野寺 治子 茨城県つくば市観音台２−１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 小野 和子 茨城県つくば市観音台２−１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 田切 明美 茨城県つくば市観音台２−１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 西澤 八重子 茨城県つくば市観音台２−１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (56)参考文献 特開 平10−117776（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単子葉植物の形質転換方法であって、所
   望の組換え遺伝子を含むアグロバクテリウムで、無傷の
   種子を感染する工程を包含し、ここで、該種子は発芽種
   子である、方法。
2. 【請求項２】 前記種子が、播種後４〜５日目の種子で
   ある、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記単子葉植物が、イネ科植物である、
   請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記イネ科植物が、イネである、請求項
   ３に記載の方法。