JP3144639B2

JP3144639B2 - 新規ポリペプチドの製造法

Info

Publication number: JP3144639B2
Application number: JP04435290A
Authority: JP
Inventors: 治夫音田; 康明伊藤; 恭三林
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-02-28
Filing date: 1990-02-27
Publication date: 2001-03-12
Anticipated expiration: 2016-03-12
Also published as: JPH03123487A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明のある種の癌細胞から産生されるポリペプチド
をコードするcDNAをクローニングし、それを使用して、
本来の癌細胞が産生するポリペプチドを遺伝子工学的手
法を用いて産生する方法に関する。

従来の技術ある種の細胞が分泌する蛋白、ポリペプチドの単離精
製は、その生理活性を指標にして種々の方法、例えば、
ゲルろ過法、吸着クロマトグラフィー、電気泳動、等電
点分画法により行われるが、存在する生理活性物質の量
が少ない場合は、その単離には困難が伴う。この点を解
決するため、当ポリペプチドを遺伝子工学的手法により
大量に産生させる事を試み、本来の細胞が産生するポリ
ペプチドと免疫学的測定法において同等に反応する本ポ
リペプチドを産生させる事が可能になっている。

一方、癌細胞が増殖因子等、種々のポリペプチドを分
泌する事は知られており、これらのポリペプチドと癌と
の関連について関心がもたれている。

例えばヒト乳癌細胞のMCF7は、TGF（transforming gr
owth factor）α，β，γ〔ディクソン（Dickson）等、
キャンサーリサーチ（Cancer Res.）46,1707−1713,（1
986）〕、インスリン様増殖因子〔ハフ（Haff）等、キ
ャンサーリサーチ（Cancer Res.）46,4613−4619,（1
986）〕また血小板由来増殖因子〔ブラウゼルト（Brouz
ert）等、プロシージングオブナショナルアカデ
ミーオブサイエンスユーエスエー（Pro.Natl.Aca
d.Sci.USA）84,5763−5767（1987）〕等を分泌すること
が知られている。

一方、本発明者等の一人は、このように種々の増殖因
子を分泌するMCF7細胞と増殖因子の１種であるEGF（Epi
dermal growth factor）との関係を調べるため、ヒトEG
Fを測定できるEIA（Enzyme Immuno Assay）を確立し、M
CF7やヒト胃癌細胞のMKN−45、KATO−IIIの培養液につ
いて測定を試みた結果、EGFと異なる新規の物質が産生
されていることを見出した。これは上記のヒトEGF測定
系中に、EGFに対する抗体の他に別の抗体が混じってい
た為に検出されたものと考えられる。そして、この新規
ポリペプチドと癌との関連を知る目的で、このポリペプ
チドの精製を行い、その構造を明らかにすると共に〔バ
イオケミカルバイオフィジカルリサーチコミュニ
ケーション（Biochem.Biophys.Res.Comm.）155 366（19
88）〕、これに基いて特許出願を行なっている（特願平
１−35111号）。このポリペプチドは、Ｎ末端がEAQであ
り、アミノ酸が60個からなるものであり、このポリペプ
チドはヒト乳癌細胞であるMCF7、あるいはヒト胃癌細胞
であるMKN−45もしくはKATO−IIIの産生する新規ポリペ
プチドであり、またこのポリペプチドは等電点が4.3、
分子量は6,661ダルトンであり、そのアミノ酸配列はである。

更に、ヒト乳癌細胞において、エストロゲンによって
誘発されるmRNAについては、シャンボン（Chambon）等
がその完全な塩基配列を解明しており、この塩基配列か
ら84個のアミノ酸配列からなるポリペプチド（9140ダル
トン）の存在が予測されている。そしてこの84個のアミ
ノ酸配列におけるシグナルペプチド配列を予測し、実際
に分泌されるポリペプチドが、58個のアミノ酸配列から
なるもの（6450ダルトン）あるいは63個のアミノ酸配列
からなるもの（6970ダルトン）ではないかと予測してい
る〔シャンボン等、ヌクレイックアシッズリサーチ
（Nucleic Acids Research）12,No.6（1984）2861−287
8、及びシャンボン等、ディーエヌエー（DNA）
（４）11〜21（1985）〕。しかしながら、これはあくま
でも予測にすぎず、実際にこのような分泌ポリペプチド
をアミノ酸配列が確定できるまで、単離精製はしていな
かったのである。

発明が解決しようとする問題点このようにヒト乳癌細胞のMCF7等が分泌しているポリ
ペプチドを単離、精製し、このポリペプチドと癌等との
関連の究明のために供することが、この分野で望まれて
いたのであるが、少量のポリペプチドを単離、精製する
のは困難であり、又このポリペプチドは天然のものから
大量に安定に抽出することは難かしいこともあって、こ
のポリペプチドを大量に産生する方法の提供が望まれて
いたのである。

問題点を解決するための手段本発明者等はこのポリペプチドを大量に製造する方法
として、ヒト乳癌細胞のMCF7等から得られるmRNAから相
補DNA（cDNA）を合成し、それを基にして本ペプチドを
コードする塩基配列を有するDNAを含有する発現型ベク
ターを製造、これを大腸菌、酵母または動物細胞等に組
み込んだ、いわゆる遺伝子組み換えにより本ペプチドを
大量に製造する方法を提供するものである。

本発明は（ｉ）Ｎ末端がEAQであり、アミノ酸が60個
からなるポリペプチドをコードするDNAを含有するDNA、
（ii）該DNAを大腸菌、酵母、動物細胞の発現用ベクタ
ーに、Ｎ末端がEAQであり、アミノ酸が60個からなるポ
リペプチドを発現させるように構築した組み換えDNA、
（iii）該組み換えDNAを保持する形質転換体、（iv）該
形質転換体を培養し、培養物中にＮ末端がEAQであり、
アミノ酸が60個からなるポリペプチドを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする、該ポリペプチド
の製造法に関するものである。

本発明方法におけるポリペプチドをコードする塩基配
列を有するDNAを含有する発現型ベクターは、例えば、
（ｉ）種々の本ペプチド産生細胞、例えばMCF7細胞など
からメッセンジャーRNA（mRNA）を分離し、（ii）該mRN
Aから単鎖の相補DNA（cDNA）を、次いで二重鎖DNAを合
成し、（iii）該相補DNAをファージまたはプラスミドに
組み込み、（iv）得られた組み換えファージまたはプラ
スミドで宿主を形質転換し、（ｖ）得られた形質転換体
を培養後、形質転換体から適当な方法、例えば本ペプチ
ドの一部をコードするDNAプローブとのハイブリダイゼ
ーションにより、あるいは抗体ペプチド抗体を用いたイ
ムノアッセイ法により目的とするDNAを含有するファー
ジあるいはプラスミドを単離し、（vi）その組み換えDN
Aから目的とするクローン化DNAを切り出し、（vii）該
クローン化DNAまたはその一部を発現ベクター中のプロ
モーターの下流に連結する、ことにより製造することが
できる。

本ペプチドをコードするmRNAは、種々の本ペプチド産
生細胞、例えばヒト乳癌細胞であるMCF7、あるいはヒト
胃癌細胞であるMKN−45もしくはKATO−IIIなどから得る
ことができる。

これら本ペプチド産生細胞からRNAを調製する方法と
しては、グアニジンチオシアネート法〔（ジェー・エム
・チルグウィン（J.M..Chirgwin）ら、バイオケミスト
リー（Bio−chemistry），18,5294（1979）〕などが挙
げられる。

このようにして得られたmRNAを鋳型とし、逆転写酵素
を用いて、例えば岡山（H.Okayama）らの方法〔モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular
and Cellular Biology）2,161（1982）および同誌3,280
（1983）〕に従いcDNAを合成し、得られたcDNAをプラス
ミドに組み込む。

cDNAを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来のpBR322〔ジーン（gene），2,95（1977）〕,pBR32
5〔ジーン，4,121（1978）〕,pUC12〔ジーン，19,,259
（1982）〕,pUC13〔ジーン，19,259（1982）〕、枯草菌
由来のpUB110〔バイオケミカル・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション（Biochemical and Biophy
sical Research Communication），112,678（1983）〕
などが挙げられるが、その他のものであっても、宿主内
で複製増殖されるものであれば、いずれをも用いること
ができる。またcDNAを組み込むファージベクターとして
は、たとえばλgt11〔ヤング及びデーヴィス（Young,
R.,and Davis,R.,）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・
ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.），8
0,1194（1983）〕などが挙げられるが、その他のもので
あっても宿主内で増殖できるものであれば用いることが
できる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、ティ
ー・マニアティス（T.Maniatis）ら，モルキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor La
−boratory），第211−268頁（1982）に記載の方法など
が挙げられる。またファージベクターにcDNAを組み込む
方法としては、たとえばヒューン（Hyunh,T.V.）らの方
法〔ディー・エヌ・エークローニングアプラクテ
ィカルアプローチ（DNA Cloning,A Practical Approa
ch）１,49（1985）〕などが挙げられる。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主た
とえばエシェリキア（Escherichia）属菌，バチルス（B
acillus）属菌などに導入する。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・
コリ（Escherichia coli）K12DH1〔プロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）60,160（1968）〕,M103
〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acid
s Research），9,309（1981）〕,JA221〔ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molec
ular Biology）〕，120,517（1978）〕,HB101〔ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー41,459（196
9）〕,C600〔ジェネティックス（Genetics），39,440
（1954）〕などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチ
リス（Bacillus subtilis）MI114（ジーン，24,255（1
983）〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Journal of Biochemistry）95,87（1984）〕など
が挙げられる。

プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たと
えばティー・マニアティス（T.Maniatis）ら，モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning），コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory），第249頁（1982）に記載のカルシ
ウムクロライド法あるいはカルシウムクロライド／ルビ
ジウムクロライド法などが挙げられる。

またファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば
増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用い
て導入することができる。

本ペプチドcDNAを含有する本ペプチドcDNAライブラリ
ーは上記の方法などで得ることが出来るが、MCF7cDNAラ
イブラリーから本ペプチドcDNAをクローニングする方法
としては、本ペプチドのアミノ酸配列に基づいて化学合
成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたコロ
ニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダ
イゼーション法〔ティー・マニアティス（T.Maniatis）
ら，モレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（C
old Spring Harbor Laboratory），（1982）〕などが挙
げられる。

このようにしてクローン化された本ペプチドcDNAは必
要があればプラスミド、例えばpBR322,pUC12,pUC13,pUC
18,pUC19,pUC118,pUC119などにサブクローニングしてポ
リペプチドcDNAを得ることができる。

このようにして得られたDNAの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Maxam−Gilbert）法〔Maxam,A.
M.and Gilbert,w.,プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・
ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.），7
4,560（1977）〕あるいはジデオキシ法〔Messing,J.
ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acid
s Research）9,309（1981）〕によって決定し、既知の
アミノ酸配列から本ペプチドをコードするcDNA（式Ｉ）
が得られる。

上記のようにしてクローン化された本ペプチドをコー
ドするDNAは目的によりそのまま、または所望により制
限酵素で消化して使用することが出来る。

クローン化されたDNAから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができ
る。

該DNAはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのATGを
有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのTAA,TG
AまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コド
ンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用
いて付加することもできる。さらに該DNAを発現させる
にはその上流にプロモーターを接続する。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド
（例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13），酵母由来プラス
ミド（例、YIp,YEp,YRp,YCp），あるいはλファージな
どのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシ
ニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の
発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれ
ばいかなるものでもよい。

形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合
は、trpプロモーター,lacプロモーター,recAプロモータ
ー，λPLプロモーター,lppプロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター,SPO2プ
ロモーター,penPプロモーターなど、宿主が酵母である
場合は、PHO5プロモーター,PGKプロモーター,GAPプロモ
ーター,ADHプロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主
がエシェリキア属菌でプロモーターがtrpプロモーター
またはλPLプロモーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモー
ター、レトロウィルスのプロモーター、メタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。

なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。

このようにして構築された本ペプチドの成熟ペプチド
をコードするDNAを含有するベクターを用いて、形質転
換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス
属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例として
は、前記したものと同様のものが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビ
シエ（Saccaromyces cerevisiae）AH22,AH22R^-,NA87−1
1A,DKD−5Dなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞COS−7,Vero,チ
ャイニーズハムスター細胞CHO,マウスＬ細胞，ヒトFL細
胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえば
プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），69,211
0（1972）やジーン，17,107（1982）などに記載の方法
に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecu
lar ＆ General Genetics），168,111（1979）などに記
載の方法に従って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），75,1929（1978）に記載
の方法に従って行なわれる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー
（Virology）52,456（1973）に記載の方法に従って行な
われる。

このようにして、本ペプチド成熟ペプチドをコードす
るDNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転
換体が得られる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転
換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体
培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必
要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられ
る。炭素源としては、たとえばグリコース、デキストリ
ン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえ
ばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカ
ー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイシ
ョ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはた
とえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化
マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン
類、生長促進因子などを添加してもよい。

培地のpHは約５〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例え
ばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー（Mill
er），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティックス（Journal of Experimen
ts in Molecular Genetics）,431−433,Cold Spring Ha
rbor Laboratory,New York 1972〕が好ましい。ここに
必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、た
とえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加
えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約15〜43
℃で約３〜24時間行い、必要により、通気や攪拌を加え
ることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で
約６〜24時間行ない、必要により通気や攪拌を加えるこ
ともできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培
地〔Bostian,K.L.ら、「プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）77,4505（1980）〕が挙げられる。培地
のpHは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約
20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や攪
拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地
としては、たとえば約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM
培地〔サイエンス（Science）122,501（1952）〕,DMEM
培地〔ヴィロロジー（Virology），８,396（1959）〕,R
PMI1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Jounal of the Amer
ican Medical Association）199,519（1967）〕,199培
地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー
・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of th
e Society for the Biological Medicine）73,1（195
0）〕などが挙げられる。pHは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必
要に応じて通気や攪拌を加える。

上記培養物から本ペプチド成熟ペプチドを分離精製す
るには、例えば下記の方法により行なうことができる。

成熟ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに
際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集
め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム
および／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞
を破壊したのち、遠心分離やろ過により本ペプチドの前
駆体たんぱくや成熟ペプチドの粗抽出液を得る方法など
が適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンな
どのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−100などの界面活
性剤が含まれていてもよい。

培養液中に前駆体たんぱくや成熟ペプチドが分泌され
る場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あ
るいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このよう
にして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる
前駆体たんぱくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精
製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これら
の公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法など
の溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ
過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが挙げられる。

かくして生成する本ペプチドの前駆体たんぱくや成熟
ペプチドは特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ
などにより測定することができる。

作用・効果本発明のDNAでDNA感染または形質転換した菌体や細胞
では、大量の本ペプチド前駆体たんぱくや成熟たんぱく
を大量に生産、精製することができる。

本ポリペプチドはある種の癌細胞から生産、分泌され
るもので、癌との関連が予測され、癌の増殖機構の解
明、ひいては、癌の治療薬の提供に役立つものと考えら
れる。また、このポリペプチドは、既知の、すい臓から
分泌されるパンクレアティックスパスモリティック
エンザイム（Pancreatic Spasmolytic enzyme,PSP）
〔ジョージェンセン（Jorgensen）等、レギュレートリ
ーペプチド（Regulatory Peptide）、３,207−219（1
982）〕と相同性が高く、このものがもつ腸管ぜん動抑
制作用があることが推定され、また筋収縮弛緩作用が推
定される。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ−体を示すものとする。

DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA:メッセンジャーリボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム G :グリシン A :アラニン V :バリン L :ロイシン I :イソロイシン S :セリン T :スレオニン C :システイン M :メチオニン E :グルタミン酸 D :アスパラギン酸 K :リジン R :アルギニン H :ヒスチジン F :フェニールアラニン Y :チロシン W :トリプトファン P :プロリン N :アスパラギン Q :グルタミン実施例以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は
これに限定されることはない。

後述の実施例で得られた形質転換体サッカロマイセス
セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）AH22R^-/pGL
D906−10は平成１年２月21日に通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（FRI）にブダペスト条約に基き受
託番号FERM BP−2301として寄託され、また該微生物は
平成１年２月28日から財団法人発酵研究所（IFO）に受
託番号IFO 10465として寄託されている。

実施例１ MCF7細胞cDNAライブラリーの作製 MCF7細胞１を10％ウシ胎仔血清を含むイーグル最少培
地中にて単層培養し、10⁸個の細胞よりRNAをグアニジン
・熱フェノール法〔マニアティスティー（Maniatis,
T.）ら、モレキュラークローニングアラボラトリ
ーマニュアル（Molecular cloning−A laboratory ma
nual）,pp.194−195,1982〕を用いて抽出し、このRNAか
らポリ（Ａ）RNAをオリゴdTセルロースカラムクロマト
グラフィーにより精製した（同上、pp197−198）。この
ポリ（Ａ）RNAを鋳型とするcDNAを岡山らの方法で作製
し、cDNAライブラリーを作製した。

実施例２本ペプチドの一部をコードするDNAプローブ
の作製９番目のValから15残基目のGlnまでのアミノ酸配列
Val−Ala−Pro−Arg−Glu−Arg−GlnをコードするDNA配
列のうち、最も使用頻度の高いコドンをラーゼ（Lathe,
R.）の報告〔ジャーナルオブモレキュラーバイオ
ロジー（J.Mol.Biol.）183,1−12（1985）に従って選出
し、次のような配列を持つ、DNAプローブを合成した。

このDNAプローブの５′端をT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて³²P−りん酸化し、cDNAライブラリのスク
リーニングに用いた。

実施例３本ペプチドのcDNAの単離とその塩基配列の決
定大腸菌C600hflに前述のcDNAライブラリーを感染させ
てプレーティングし、コロニーを出現せしめた。コロニ
ーをナイロン膜にうつしとり、³²Pで標識した前項のDNA
プローブとハイブリダイゼーションを行なった。ハイブ
リダイゼーションは、42℃で行なった。ハイブリダイゼ
ーション陽性の数個のクローンをそれぞれ単離し、その
うちのひとつであるNo.52のcDNA部分の塩基配列を決定
した。このプラスミドに含まれるcDNA部分は1.8Kbpであ
った。このcDNA部分の塩基配列をサンガー（Sanger）の
方法「プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）7
4,5463−5467（1977）〕によって決定した。この塩基配
列およびそれより推定される前駆体蛋白質のアミノ酸配
列を式Ｉに示した。

で囲った領域が、本ペプチドである。

実施例４酵母を宿主とする本ポリペプチド発現ベクターの構築と
酵母への導入実施例３に記載のプラスミドNo.52（20μｇ）をそれ
ぞれ40ユニットの制限酵素Bal IとPvu II〔ともに宝酒
造（株）〕で消化した後、1.5％アガロースゲル電気泳
動を用いて、0.36Kb DNA断片を分離した。本DNA断片
（２μｇ）にXho Iリンカーｄ（CCTCGAGG）〔宝酒造
（株）〕を0.1μｇ加え、T4DNAリガーゼ〔宝酒造
（株）〕200ユニットを用いて50μの反応液（66mM T
ris−HCl,pH7.6/6.6mM MgCl₂/10mMジチオスレイトール
/0.1mM ATP）中で14℃、16時間反応させた。次に30ユ
ニットの制限酵素Xho I〔（株）ニッポンジーン〕を加
え、37℃、２時間反応を行い、DNA断片両端のトリミン
グを行った。本DNA断片0.5μｇと、酵母用発現ベクター
pGLDNA906−１（特開昭61−43991号）を制限酵素Sal I
で消化して得られた9.4Kb DNA断片0.1μｇを200ユニッ
トのT4DNAリガーゼを用いて上記の反応液（50μ）中
で連続し、E.coli DH I〔モレキュラークローニング
（Molecular cloning,Cold Spring Harbor Laboratory;
1982）の形質転換を行なった。得られたアンピシリン耐
性の形質転換体からプラスミドpGLD906−10を分離した
（第１図）。

プラスミドpGLD906−10 3μｇを用いて、プロトプラ
スト法〔ヒンネン（Hinnen）等、プロシージング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA）75,1927（1978）〕によりサッ
カロマイセスセレビシェ（Saccha romyoes cerevisia
e）AH22R^-〔宮の原ら、プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）80,1（1983）〕の形質転換を行った。そ
の結果ロイシンを含まない培地で生育できる形質転換体
AH22R^-/pGLD906−10を分離した。

実施例５酵母を宿主とする本ペプチドの発現ペプチド
の生産実施例４で得られた多くの形質転換体S.cere viciae
AH22R^-/pGLD906−10から数株を選び以下の方法によりこ
れらのペプチドの生産能を調べた。

Kitano〔バイオ／テクノロジー（BIO/TECNOLOGY），
５,281（1987）〕らの培地5mlを試験管に分注し、これ
に形質転換体を接種した後、30℃で３日間振盪培養し
た。その1mlを同一培地10mlを分注した試験管に移し、3
0℃で１日振盪培養した。次にその3mlを前と同一の培地
30mlを含む200mlフラスコに移し、30℃で２日間培養し
た。

得られた培養液を3,000回転で10分間遠心分画し、上
清と菌体に分離した。菌体はRoseらの方法〔プロシーデ
ィングオブザナショナルアカデミーオブサ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），78,2460（198
1）〕により破砕し、抽出液を得た。すなわち、10mlの
培養液より集菌した菌体を一度SMバッファー（85mM Na
Cl,1mM MgSO₄,20mM Tris−HCl,pH7.4）で洗浄した後、
−80℃で菌体を凍結した。凍結菌体に1mlの破砕用バッ
ファー（100mM Tris−HCl,pH8.0,20％Glycerol,1mM PM
SF,1mM DTT）と2gのグラスビーズを加え、ボルテック
スミキサーによる強い攪拌で破砕した。これを遠心分離
し、上清を菌体抽出液とした。

本ペプチドの定量は、以下に示すEIAによって行っ
た。

プレート感作抗−hEGFを含むIgG分画（ウサギ血清より精製）200μ
g/mlを50mMのトリス−HCl（pH8.0）に加えたものを、10
0μ／ウェルずる96穴プレート（住友ベークライト
製）に分注した。37℃、３時間反応させた後、液を捨て
て、更にバッファーＡを加えブロッキングを行った。そ
して更に４℃で一晩静置した。バッファーＡの組成は次
のとおりである。

0.1M リン酸バッファー（pH7.0） 0.1％牛血清アルブミン（BSA） 0.3M NaCl 0.1％ NaN₃ 1mM MgCl₂ そしてこのアッセイ系を用いて、次のようにしてアッ
セイを行なった。

アッセイプレート使用直前にバッファーA200μ／ウェルで１
回洗浄した。バッファーA100μ／ウエルとサンプル10
0μを加えた。（duplicate）。このものを４℃で一晩
反応させた。次いで洗浄バッファー200μ／ウェルで
４回洗浄した。このものに、Fab'−/HRP conjugate（洗
浄バッファーで原液を1000倍希釈したもの）100μ／
ウエルを加え37℃で４時間反応させた。その後、洗浄バ
ッファー200μ/wellで４回洗浄し、0.1Mリン酸バッフ
ァー（pH7.0）中に溶解した0.6％HPPA〔３−（ｐ−ハイ
ドロキシフェニル）プロピオン酸〕を100μ／ウェル
及び0.015％H₂O₂を100μ／ウェル加え、37℃で１時間
以上反応させ、0.1Mグリシン−NaOH（pH10.3）50μ/w
ellで反応を停止させた。このものをダイナミック（白色・蛍光増強用）に移し、イムノリーダー（Immuno
reader）で蛍光を測定した（365nm励起、415nm蛍光測
定）。なお、対照として、次のものを用いた。

負（negative）:H₂O（０）正（positive）:0.1H硫酸中の1.0μg/mlキニン（10
0）その結果、形質転換体は、菌体内と菌体外に本ペプチ
ドを生産していることがわかった。

実施例６動物細胞での本ペプチドの発現動物細胞、例えばCOS7,CHO細胞での本ペプチドの発現
の目的で以下の図に示すようなプラスミドを構築した。

プラスミドNo.52を精製し、Pst Iで切断後、T4ポリメ
ラーゼで処理し、Bgl IIリンカーを結合した後、pTB551
のBgl IIサイトに組み込み、pTS6002を得た（第２
図）。

このプラスミドを動物細胞のCOS7に導入し、本ポリペ
プチドの産生をEIA検討した結果、細胞外の培養液中に
本ポリペプチドが分泌されていることを確認した。また
細胞内にもその存在を確認した。

細胞外（pg/ml）細胞内（pg/ml）検体１ 33.5 10.8 ２ 38.5 37.5 ３ 44.0 30.0 ４ 36.5 51.0 さらに第３図で示したようにして作製したプラスミド
pTS7003で形質転換したCHO細胞（Chinese hamster oval
ly cell）には、細胞外液中に1020,3750,1700,2150,107
0pg/mlの本ポリペプチドを産生する細胞株が得られた。

実施例７酵母およびMCF7細胞で生産される本ポリペプ
チドの同定酵母形質転換AH22R^-/pGLD906−10を³⁵S−システイン
存在下に培養し、その上清に、本ポリペプチド測定用の
EIAに使用した抗体を加え、37℃、１時間、４℃で一晩
静置後、プロテインＡセファロースを添加し、抗原、抗
体複合体として回収した後、20％のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、乾燥後、オートラジオグラフをと
り、判定した結果、分子量が約8,000ダルトンの位置に
単一バンドとして同定された。MCF7細胞を同様に培養液
中に³⁵S−システインを添加して培養し、その上清を上
記の方法と同じくポリアクリルアミドゲル電気泳動で解
析した（第４図）。このようにして発現させた本ポリペ
プチドは、大量に精製でき、その生理活性の検討に供し
得る。

実施例８酵母で産生させた本ポリペプチドの精製とＮ
末端アミノ酸配列の決定上記の実施例７で得た酵母（AH22R^-/pGLD906−10）培
養上清１を１％酢酸で透析（Spectra/Por3,登録商
標）し、凍結乾燥した後0.05Mの酢酸アンモニウム（pH
5.5）25mlに溶解した。沈殿物は４℃における3000rpm,1
0分の遠心分離で除去した。次いでDEAE−セファデック
ス（Sephadex）Ａ−25のカラムクロマトグラフィー（第
５図）、セファデックス（Sephadex）Ｇ−50、スーパー
ファイン（Superfine）を使用したゲルろ過法（第６
図）、逆相の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を経
て（第７図）、EIA陽性分画のNo.7をアミノ酸配列の決
定に使用した。

DEAE−セファデックスＡ−25のカラムクロマトグラフ
ィーに当っては、カラムは直径1.6cm×43cm長、床容積1
00mlのものを用い、0.8ml/分の流速で0.05Mから2Mの酢
酸アンモニウム（pH5.5）直線勾配で溶出を行い、ファ
ルマシアFPLCシステムを用い、10ml/分画で分画した。
これらの分画のA280nmにおける吸光度、電導度、EIA
（酵素免疫活性）の測定を行い、第５図にその結果を示
した。分画数21〜30の本ペプチドに相当する部分につい
て凍結乾燥を行い、このものを１％酢酸10mlに溶解して
ゲルろ過工程に移った。

ゲルろ過に当っては、直径2.5cm×108cm長、床容積50
0mlのセファデックスＧ−50スーパーファインを用い、
0.2ml/分の流速で１％酢酸で溶出を行い、4ml/分画の割
合で分画した。A280nmにおける吸光度、電導度、EIAの
測定を行い、第６図にその結果を示している。分画数89
〜101の部分について凍結乾燥を行い、このものを10％T
FA100μに溶解して逆相HPLC工程に移った。

逆相HPLCに当っては、直径4.6mm×250mm長のカラム
（Wakopak wacosil 10C₁₈,登録商標）を用い、０〜50％
CH₃CN含有0.1％TFA直線勾配を1.0ml/分の割合で流し、
1.5ml/分画の割合で分画した後、EIA測定を行った。そ
の結果を第７図に示す。試料（分画数７）を凍結乾燥
し、20％のアセトニトリルに溶解した後、エドマン分解
を行い、定法通り分析した結果、Ｎ末端配列は各アミノ
酸を一文字表示で表わすと、EAQTETCTVAPであった。こ
の配列は本発明者の一部が発見したヒト乳癌細胞MCF−
７細胞の分泌する新規ポリペプチドの25〜35残基と一致
し、MCF−７細胞が分泌するペプチドと同じであること
が判明した（特願平１−35111号参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵母を宿主とする本ペプチド発現ベクターの構
築図であり、第２図及び第３図は動物細胞を宿主とする
本ペプチド発現ベクターの構築図である。第４図は酵母
およびMCF7細胞で生産される本ポリペプチドの同定に関
する電気泳動図である。第５図、第６図および第７図は本発明で得られた本ポリ
ペプチドの精製の過程を示す図であり、第５図がカラム
クロマトグラフィー、第６図がゲルろ過法、第７図が逆
相高速液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，（1984）Ｖｏｌ．12，Ｎｏ．６，ｐ．2861−2878 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/12 C12N 1/19 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列（II）で表わされるポリペプチドをコードするDNAが、酵母の
発現用ベクターに組み込まれた組み換えDNAを保持する
酵母形質転換体を培養し、アミノ酸配列（III）で表わされるポリペプチドを培養液中に分泌させ、分泌
されたアミノ酸配列（III）で表わされるポリペプチド
を採取することを特徴とする、アミノ酸配列（III）で
表わされるポリペプチドの製造法。