JP3144947B2 - タキサン型ジテルペンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等
の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型
ジテルペンの製造法に関する。

【０００２】

【従来技術】卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用
であるタキソール(Taxol)は、イチイ科イチイ属植物で
あるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT)より
単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と関
連する複雑なエステルグループを有している。タキソー
ルはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在
し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。
現在、タキソールの製造は天然のまたは栽培された植物
体中から採取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃ
ｍの高さに成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植
物であり、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから
容易に大量のタキソールを得ることは困難である。も
し、タキソールまたはタキソールの前駆物質であるバッ
カチンIII等のタキサン型ジテルペンの合成が組織培養
を利用して行なうことができれば、樹木を伐採する事な
く、大量のタキソールを容易に得ることができるので有
利である。

【０００３】これまでの植物の培養細胞を利用したタキ
ソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ（Taxu
s brevifolia NUTT）培養細胞によるタキソール生産方
法が特許〔US Patent:5019504〕されている。そして、
タキソール生産量は1〜3mg/lと記載されているが、工業
的生産には不十分である。

【０００４】一方、タキソール生産法の先行技術として
は、タキソール生合成前駆体であるバッカチンIII (bac
catin III)からの半合成法がHoltonらの特許〔US Paten
t:5015744〕として存在する。組織培養法は大量の植物
組織を必要としないことから、さらにタキソール生産に
有利である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、植物
組織培養により、タキサン型ジテルペンの簡便にかつ大
量に製造法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、タキサン型ジテルペン産生植物の培養細胞又は
培養組織の組織培養培地中にリチウムイオンを添加して
組織培養を行なうと、培養物中のタキサン型ジテルペン
生産性が向上することを見いだし、この発明を完成し
た。

【０００７】すなわち、本発明はタキサン型ジテルペン
を産生する植物の培養細胞又は培養組織をリチウムイオ
ンを含む組織培養培地中で組織培養し、組織培養物より
タキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキ
サン型ジテルペンの製造方法である。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、
タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はな
く、例えばタキソール、バッカチンIII、セファロマニ
ン、１０−デアセチルバッカチンが挙げられる。

【０００９】本発明の方法において組織培養に用いられ
るタキサン型ジテルペンを産生する植物としては、例え
ばセイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)、イチイ(T. cu
spidata SIEB.et ZUCC)、キャラボク(T. cuspidata SIE
B.et ZUCC var. nana REHDER)、タイヘイヨウイチイ(T.
brevifolia NUTT)、カナダイチイ(T. canadiensis MAR
SH)等のイチイ属植物を挙げることができる。

【００１０】前記植物の組織培養は、組織培養培地中に
リチウムイオンを存在させる以外は、従来から知られて
いる方法によって行なうことができる。

【００１１】リチウムイオンを組織培養培地中に存在さ
せる態様としては、塩化リチウム、酢酸リチウム、臭化
リチウム、しゅう化リチウム等を組織培養培地中に添加
すること等が挙げられる。リチウムイオンの濃度は、培
地における濃度が０.０１ｍＭ以上とすることが必要で
あり、この中でも特にリチウムイオンの濃度を０.０１
ｍＭ〜５０ｍＭの範囲に調整することが好ましい。

【００１２】従来、タキサン型ジテルペン産生植物の組
織培養において培地への添加物としてリチウムイオンを
使用した例は報告されておらず、かかるリチウムイオン
を使用により意外にもタキサン型ジテルペンの産生量が
増大することがわかった。

【００１３】本発明で使用される培地は、前記リチウム
イオンの他に、普通の培地成分を含有する。このような
成分として一般に無機成分及び炭素源が用いられ、これ
に植物ホルモン類、ビタミン類を添加し、さらに必要に
応じてアミノ酸類を添加することができる。炭素源とし
ては、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖
類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖
類、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を適当な
比率で混合したものを使用できる。

【００１４】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。

【００１５】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA)、ナフタレン酢酸(NAA)、２,４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸(2,4-D)等のオーキシン類、カイネチン、
ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用
いられる。

【００１６】ビタミン類としては、例えばビオチン、チ
アミン（ビタミンＢ1）、ピリドキシン（ビタミンＢ
6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用
いられる。

【００１７】アミノ酸類としては、例えばグリシン、フ
ェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等
を添加できる。一般に前記の各成分は、無機成分が約0.
1μMないし100mM、炭素源が約1〜約30g/l、植物ホルモ
ン類が約0.01〜約10μM、ビタミン類及びアミノ酸類が
それぞれ約0.1〜約100mg/lの濃度で用いられる。

【００１８】本発明の組織培養に用いられる培地として
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962年) 〔Murashige
& Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965年)
〔Linsmaier Skoog〕の培地、ウッディー・プラント・
メディウム(1981年) 〔Woody Plant Medium〕の培地、
ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培
地等に前記の植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて
前記した炭素源、ビタミン類、アミノ酸等を添加して調
整される培地を例示できるが、この中でも特にウッディ
ー・プラント・メディウムの培地を用いて調整される培
地が好ましい。

【００１９】本発明には液体培地及び寒天やゲランガム
等を通常0.1〜1％含有する固形培地のいずれも使用でき
るが、通常は液体培地が好ましい。本発明の組織培養に
おいては、上記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花
粉、葯、がく等の組織片または細胞、あるいはこれらを
上記培地あるいは他の従来の培地によって組織培養して
得られる培養細胞または培養組織を使用することができ
る。上記培養組織は組織又はカルスから分化して得られ
るシュート(shoot)や不定根を含む。

【００２０】これらの組織または細胞を本発明によりリ
チウムイオンを添加した培地を用いて組織培養すると、
無添加と比較してタキサン型ジテルペンの高生産性培養
組織又は培養細胞が得られる。この培養組織又は培養細
胞から、メタノール等の有機溶媒による抽出によってタ
キサン型ジテルペンを分離することができる。

【００２１】本発明の組織培養の好ましい一例として
は、次の方法が挙げられる。先ずイチイ属に属する植物
の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採
取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッ
ディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床し、
10〜35℃で14〜60日程度経過させて組織片の一部をカル
ス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養
すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られ
る。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの
一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持
する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをい
う。なお、安定化したカルスを得るまでの培養では、細
胞の死滅を防止する観点から、培地にリチウムイオンを
存在させない方が好ましい。

【００２２】この安定化したカルスを増殖に適した液体
培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体
培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速
度が高められる。本発明では、この安定化したカルス又
は該カルスを構成する細胞は、リチウムイオンを含有す
る固体培地又は液体培地で培養される。

【００２３】本発明の組織培養における培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が増殖速度が
大きいので好適である。また、培養期間としては、１４
〜４２日間が好適である。

【００２４】本発明の製造方法において液体培地を用い
た場合には、培養終了後に培養組織または培養細胞をデ
カンテーションまたは濾過等の方法によって培地から分
離し、このものから目的とするタキサン型ジテルペンを
有機溶媒による抽出等の方法によって分離することがで
きる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を更に
具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によ
りその技術的範囲が限定されるものではない。 （実施例１）ナフタレン酢酸を10^-5Mの濃度になるよう
に添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培
地（ゲランガム0.25重量％）に、前もって2％アンチホ
ルミン溶液または70％エタノール溶液等で滅菌処理した
セイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)の茎の一部を置床
し、25℃で暗所にて静置培養してセイヨウイチイカルス
を得た。次にこのカルス0.1g（新鮮重）を、上記成分を
同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウム
の液体培地1ml入りのφ18mmウェルに移し、ロータリー
シェーカー上で旋回培養（振幅25mm、120rpm）し、２８
日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

【００２６】このようにして得られた培養細胞0.1g（新
鮮重）を、上記成分を同じ濃度で添加し、さらにリチウ
ムイオンの終濃度が０.０１ｍＭになるように塩化リチ
ウムを添加したウッディー・プラント・メディウムの液
体培地１ml入りのφ18mmウェルに移して25℃で２８日間
振盪培養した。

【００２７】培養終了後、セイヨウイチイ培養細胞を濾
過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定
し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求め
た。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキ
サン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、バッカ
チンIIIと比較定量することによってタキサン型ジテル
ペン収量を測定した。その結果を表１に示す。

【００２８】（比較例１）実施例１において、リチウム
イオンを添加しない培地を用いた以外は該実施例と同様
に操作した。その結果を表１に示す。 （実施例２）実施例１において、添加したリチウムイオ
ンの終濃度が０.１ｍＭである以外は該実施例と同様に
操作した。その結果を表１に示す。 （実施例３）実施例１において、添加したリチウムイオ
ンの終濃度が１ｍＭである以外は該実施例と同様に操作
した。その結果を表１に示す。 （実施例４）実施例１において、添加したリチウムイオ
ンの終濃度が１０ｍＭである以外は該実施例と同様に操
作した。その結果を表１に示す。 （実施例５）実施例１において、添加したリチウムイオ
ンの終濃度が５０ｍＭである以外は該実施例と同様に操
作した。その結果を表１に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、タキサン型ジテルペン
産生植物の組織培養によって、大量のタキソールを簡便
に得ることができた。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 タキサン型ジテルペンを産生するイチイ
   属植物の安定したカルスを０.０１〜５０ｍＭのリチウ
   ムイオンを含む組織培養培地中で組織培養し、得られた
   組織培養物よりタキサン型ジテルペンを回収することを
   特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。
2. 【請求項２】 イチイ属植物がセイヨウイチイである請
   求項１記載の製造方法。