JP3148854B2 - 新規創傷治癒剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規ペプチドを有効
成分として含む創傷治癒剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】創傷は、外科的切開、消化管潰瘍、火
傷、裂傷または皮膚潰瘍（褥瘡など）などの表面組織の
損傷である。創傷の治療法としては、受傷部を応急処置
したのち、生体の自然の回復力によって受傷部が治癒す
るのを待つのが常法である。しかしながら、回復までに
長期間を要し、痛みをはじめとした患者の苦痛は並大抵
のものではない。そこで、自然治癒に頼ることなく、積
極的かつ直接的に治癒を促進させることが望まれてい
る。創傷の治癒は一般に細胞増殖による新しい結合組織
および上皮組織の形成に依存し、創傷の治癒に関与する
細胞の分化、増殖過程を刺激あるいは促進する薬剤が有
効であると考えられている。

【０００３】従来、創傷治癒の促進作用を示すものとし
ては、幼牛血液抽出物（ソルコセリル）（応用薬理、２
２巻、５６５〜５７９頁、１９８１年）、塩化リゾチー
ムなどが報告されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述の創傷
（表面組織の損傷）は、概して難治性であり、既存薬で
は充分な臨床効果が認められないことが多い。

【０００５】本発明の目的は、この点に鑑み、有用性の
高い新規創傷治癒物質を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、

【化３】 で示される新規ペプチド（以下、本発明ペプチドとい
う）からなる創傷治癒物質（以下、本発明創傷治癒物質
という）、および本発明ペプチドを有効成分として含む
創傷治癒剤を提供することによって、上記目的を達成す
るものである。

【０００７】本発明創傷治癒物質は、ストレプトマイセ
ス属に属する本発明創傷治癒物質生産菌株、例えば、放
線菌ストレプトマイセス・ノビリス（Streptomyces nob
ilis、以下「Ｓ．ノビリス」と略記する）を培養し、得
られた培養液または同液の乾固物もしくは培養菌体から
有機溶剤によって抽出された抽出物を、各種カラムクロ
マトグラフィーに付し、目的物を含むカラムクロマトグ
ラフィー画分を再結晶処理することにより得られる。

【０００８】本発明創傷治癒物質を生産する放線菌Ｓ．
ノビリスは、公的保存機関から入手可能であり、たとえ
ば理化学研究所の保存菌（ＪＣＭ４２７４）（これは米
国においてＡＴＣＣ１９２５２およびオランダにおいて
ＣＢＳ１９８．６５としても保存）などの菌が使用でき
る。

【０００９】放線菌Ｓ．ノビリスの培養は、然るべき栄
養物を含んだ培地を用いて行う。液体培養の場合、その
培地の成分としてはブドウ糖などの糖類、ペプトンや麦
芽エキスなどのタンパク質類、ビタミン類、核酸類、ア
ミノ酸類、複合糖質類の一種または数種を含んだ水溶液
が好適に用いられる。代表的な培地例としては、澱粉・
アンモニウム系の液体培地（可溶性澱粉、Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ 、ＮＨ₄ Ｃｌを含む）が挙げられる。液体培地のｐ
Ｈは２〜９が好ましく、培養温度は１５〜４２℃が好ま
しい。また液体培養の好ましい培養時間は１〜１４日で
ある。こうして得たＳ．ノビリスの培養液またはその乾
固物もしくは菌体自体から溶剤を用いて本発明ペプチド
を抽出する。

【００１０】Ｓ．ノビリスの培養液またはその乾固物も
しくは菌体自体の抽出液を硫酸アンモニウム（硫安）処
理し、得られた沈殿物を溶媒抽出してもよい。硫安処理
に際しては、培養液またはその乾固物もしくは菌体自体
の抽出液に添加する硫安は、固体のままの状態でもよい
し、溶液状態のものでもよい。硫安の添加量は好ましく
は飽和濃度の３０〜９０重量％の範囲である。処理時間
は特に限定されないが、好ましくは３０分〜５時間の範
囲である。沈殿物を得るための遠心分離に際しては、遠
心力が３，０００Ｇ〜２０，０００Ｇであることが好ま
しく、遠心時間は２〜６０分であることが好ましい。

【００１１】抽出に用いる溶剤としては有機溶剤が好ま
しく、その代表例としては、酢酸エチルなどのエステル
類、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアル
コール類、エチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル
類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類のほ
かジクロロメタン、クロロホルムなどが挙げられるが、
使用可能な溶剤はこれらに限定されない。また、上記溶
剤の混合物を用いることもできる。特に好適な溶剤は酢
酸エチル、ジクロロメタン、アセトンなどである。抽出
時間は溶剤の種類や抽出温度などによっても異なるが、
好ましくは３〜１２０分の範囲である。また抽出中は液
を静置してもまたは攪拌してもよい。好ましくは、同一
試料に対して抽出操作を複数回繰り返す。抽出温度は特
に制限されない。

【００１２】次に、溶剤抽出物に対するカラムクロマト
グラフィーについて述べる。

【００１３】カラムクロマトグラフィーの充填剤として
は、ＯＤＳ（オクタデシルジメチルクロロシランのよう
なオクタデシルシラン類）が好ましい。充填量は特に限
定されないが、チャージする溶剤抽出物に対する重量比
１０〜５００倍量を充填することが好ましい。溶剤抽出
物をカラムにチャージする際はまずＯＤＳに吸着させる
ことが好ましい。このときＯＤＳの量は特に限定されな
いが、好ましくは吸着させる溶剤抽出物に対する重量比
０．５〜２０倍量のＯＤＳを用いてこれに抽出物を吸着
させた後、この抽出物吸着ＯＤＳを少量の溶剤に懸濁し
てからカラムにチャージする。溶出溶媒は特に限定され
ないが、好ましくは極性がメタノール：アセトニトリル
＝１：１混合溶剤を８０％（ｖ／ｖ）含む水溶液からメ
タノールの間にある溶剤を用いる。

【００１４】次に、本発明ペプチドの再結晶による精製
について述べる。

【００１５】再結晶に用いる溶剤は、本発明ペプチドを
溶かす溶剤であれば特に限定されないが、好ましくはメ
タノール、エタノールなどである。再結晶の方法として
は、当該物質を含有するカラム溶出画分を加熱下で少量
の溶剤に溶かし、得られた溶液を徐々に冷やしてこの物
質を再結晶させてもよいし、当該物質を含有するカラム
溶出画分を当該物質の溶解性の高い溶剤に溶かし、そこ
に当該物質の溶解性の低い液（例えば水）を徐々に加え
てこの物質を再結晶させてもよい。

【００１６】本発明創傷治癒物質を製剤化するには、通
常はこれを製剤用担体とともに製剤組成物の形態とす
る。担体としては剤形に応じた薬剤を調製するのに通常
使用される充填剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、着色剤、
矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、懸濁化剤、緩衝
剤、安定化剤、保存剤、付質剤、界面活性剤、滑沢剤、
賦形剤、抗酸化剤、分散剤、噴射剤、溶解剤、溶解補助
剤が例示される。また適当な溶剤を選定することによ
り、得られた本発明ペプチドをそのままの形態で液剤と
して使用することもできる。

【００１７】本発明創傷治癒物質を用いて製剤化される
創傷治癒剤の投与単位形態としては、上記のごとき液剤
のほか、錠剤、丸剤、飲用液剤、リモナーゼ剤、注入
剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、
シロップ剤、浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ
剤、リニメント剤、ローション剤、エリキシル剤、眼軟
膏剤、硬膏剤、カプセル剤、坐剤、浣腸剤、注射剤（液
剤、懸濁剤など）、貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、パスタ
剤、吸入剤、クリーム剤、スプレー剤、点鼻剤、エアゾ
ール剤などが例示される。

【００１８】創傷治癒剤中に含有すべき本発明創傷治癒
物質の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択される
が、好ましくは創傷治癒剤中に１０^-7〜１０重量％の範
囲である。

【００１９】本発明創傷治癒物質より得られた創傷治癒
剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与され
る。たとえば外用剤の場合には、これを皮膚ないしは粘
膜などの所要部位に直接噴霧、貼付または塗布し、錠
剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプ
セル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈
内、筋肉内、皮内、皮下、関節腔内もしくは腹腔内投与
され、坐剤の場合には直腸内投与される。

【００２０】本発明創傷治癒物質より得られた創傷治癒
剤の投与量は、使用目的、症状などにより適宜選択され
るが、通常は１日当り本発明創傷治癒物質として１０ｐ
ｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。また上記
製剤組成物を１〜４回／日に分けて投与することももち
ろん差し支えない。

【００２１】

【発明の実施の形態】

本発明ペプチドの製造例 実施例１ 理化学研究所から入手した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ
４２７４）を、酵母エキス０．２％（ｗ／ｖ）添加澱粉
・アンモニウム培地１００ｍｌ中で４０時間振盪培養
（前々培養）し、続いて同培地３リットルに前々培養菌
液６０ｍｌを接種し、２５時間振盪培養（種培養）し
た。さらに澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ
中に可溶性澱粉を１ｇ、リン酸水素二カリウムを０．０
５ｇ、塩化アンモニウムを０．０５ｇ含む）２８５リッ
トルに種培養した全量を接種し、約３０℃で８日間振盪
培養した。この培養液を遠心分離し、得られた上清液２
５０リットルに硫酸アンモニウムを上清１リットル当た
り６６２ｇ添加し、１時間攪拌した。続いて２０，００
０Ｇ（流速３６０−５００リットル／時間）で連続的に
遠心分離を行い、約１．２ｋｇの沈殿物を得た。

【００２２】上記により得られた沈殿物１．２ｋｇに水
３．６リットルを添加し、８０℃で３０分間攪拌した。
次に等量の酢酸エチルを添加し、１０分間振盪後、全体
を５，０００Ｇで１０分間遠心した。酢酸エチル相を分
離後、水相について本操作を数回繰り返し、溶剤抽出物
を得た。

【００２３】次に、上記により得られた溶剤抽出物を、
ＯＤＳ（オクタデシルジメチルクロロシラン）担体２５
ｇに吸着させた。ついで、ＯＤＳ担体２７５ｇを充填し
た径３．２ｃｍのカラム内の上記担体上に上記抽出物吸
着担体をチャージし、ＯＤＳカラムを作成した。このＯ
ＤＳカラムを用いて下記の条件で精製を行なった。溶出
溶剤としてａ）メタノール：アセトニトリル：水＝７：
７：６を１．５リットル、ｂ）メタノール：アセトニト
リル：水＝８：８：４を１．２リットル、ｃ）メタノー
ル：アセトニトリル：水＝９：９：２を１５０ｍｌ、
ｄ）メタノール：アセトニトリル：水＝１９：１９：２
を１リットル、ｅ）メタノールを１リットル、この順に
流速１０．５ｍｌ／分で流した。分画は、溶剤組成を変
更する毎に行い、特にメタノール：アセトニトリル：水
＝１９：１９：２の溶出画分は、適宜フラクションコレ
クターを用いて少量ずつ（２分間ずつ）分画した。各溶
出画分について、ＯＤＳ−８０ＴＭ、内径４．６ｍｍ×
長さ２５．０ｃｍの東ソー社製のカラムを用いたＨＰＬ
Ｃ（日立社製、ポンプＬ−６０００、Ｌ−６２００、検
出器Ｌ−３０００、カラムオープン６５５Ａ−５２）に
おいて、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、流速
１ｍｌ／分の条件で、溶離液として水：アセトニトリ
ル：メタノール＝６：７：７（０分）〜０：１：１（３
０分）を用いて分析を行った。上記画分のうちリテンシ
ョンタイムが１８〜２０分のピークを含むもののみを集
め、同一画分とし（１００ｍｇ）、メタノール−水を用
いて繰り返し再結晶を行い、針状結晶４５ｍｇを得た。

【００２４】この物質の構造は、種々の機器分析データ
より式［Ｉ］であると決定した。

【００２５】実施例２ 実施例１と同様にして培養を行い、得られた菌体２１５
ｇ（湿重量）にジクロロメタン２．１５リットルを加
え、３０分間超音波処理をした後、さらにジクロロメタ
ン８．６リットルを添加し、全体を室温で１時間攪拌し
た。菌体を濾別後、得られた濾液を濃縮乾固した。この
抽出物の乾固物を少量のヘキサンに溶解した後、ヘキサ
ン相をメタノールで３回抽出処理した。ヘキサン不溶物
とメタノール抽出物をメタノールに再溶解した。

【００２６】次に、上記により得られた溶剤抽出物を、
ＯＤＳ担体２８ｇに吸着させた。ついで、ＯＤＳ担体２
７５ｇを充填した径３．２ｃｍのカラム内の上記担体上
に上記抽出物吸着担体約３０ｇをチャージし、ＯＤＳカ
ラムを作成した。このＯＤＳカラムを用いて下記の条件
で精製を行なった。溶出溶剤としてａ）メタノール：ア
セトニトリル：水＝７：７：６を１．５リットル、ｂ）
メタノール：アセトニトリル：水＝８：８：４を１．２
リットル、ｃ）メタノール：アセトニトリル：水＝９：
９：２を２００ｍｌ、ｄ）メタノール：アセトニトリ
ル：水＝１９：１９：２を１リットル、ｅ）メタノール
を５００ｍｌ、この順に流速１０．５ｍｌ／分で流し
た。分画は、溶剤組成を変更する毎に行い、特にメタノ
ール：アセトニトリル：水＝１９：１９：２の溶出画分
は、適宜フラクションコレクターを用いて少量ずつ（２
分間ずつ）分画した。各溶出画分について、ＯＤＳ−８
０ＴＭ、内径４．６ｍｍ×長さ２５．０ｃｍの東ソー社
製のカラムを用いたＨＰＬＣ（日立社製、ポンプＬ−６
０００、Ｌ−６２００、検出器Ｌ−３０００、カラムオ
ープン６５５Ａ−５２）において、検出波長２１０ｎ
ｍ、カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分の条件で、溶離
液として水：アセトニトリル：メタノール＝６：７：７
（０分）〜０：１：１（３０分）を用いて分析を行っ
た。上記画分のうちリテンションタイムが１８〜２０分
のピークを含むもののみを集め、同一画分とし（８４０
ｍｇ）、メタノール−水を用いて繰り返し再結晶を行
い、針状結晶の本発明ペプチド３３０ｍｇを得た。

【００２７】この物質の構造は、実施例１と同様にして
種々の機器分析データより式［Ｉ］であると決定した。

【００２８】構造分析データ 実施例１および２で得られた物質の機器分析データを以
下に示す。

【００２９】１．ＭＳ ・ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝９１３．６（Ｍ＋Ｈ−Ｈ
₂ Ｏ）⁺ ，９３１．６（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，９５３．６（Ｍ＋
Ｎａ）⁺ ・ＨＲＦＡＢ−ＭＳ Found ： ｍ／ｚ＝９１３．５０７９（Ｍ＋Ｈ−Ｈ2
Ｏ）⁺ ，ｍ／ｚ＝９１３，９５３，９３１（９１３がメ
イン，９３１は非常に小さい） Calcd for ： Ｃ₄₅Ｈ₆₉Ｎ₈ Ｏ₁₂ ｍ／ｚ＝９１３．５０５３

【００３０】

【００３１】３．アミノ酸分析 加水分解物としてＤ−セリン、Ｌ−アラニンおよびＤ−
Ｎ−メチル−フェニルアラニンが認められた。

【００３２】４．組成式 質量分析と後述するＮＭＲのデータから新規ペプチドの
組成式はＣ₄₅Ｈ₇₀Ｎ₈Ｏ₁₃であることが分かった。

【００３３】５．ＮＭＲ ａ）部分構造Ａについて ＨＭＢＣスペクトル測定の結果、アラニン（Ａｌａ）の
カルボニル炭素（１７３．６ｐｐｍ）とＮ−ＣＨ3 −フ
ェニルアラニン（Ｐｈｅ）のＣＨ3 （３．０４ｐｐｍ）
とにロングレンジの相関が観測されたことにより、Ａの
部分構造が推定された。

【００３４】ｂ）部分構造Ｂ、Ｃについて¹ Ｈ− ¹Ｈ COSY,HOHAHA から同様のスピン系を持つ２
つの成分が推定された。

【００３５】 ｉ） ＮＨ(4.38ppm） ＣＨ₂ （46.1 , 2.89 , 3.15ppm ） ＣＨ₂ （21.3 , 1.45 , 1.63ppm ） ＣＨ₂ （24.2 , 1.93 , 2.25ppm ） ＣＨ（51.7 , 4.90ppm） ii） ＮＨ（3.93ppm ） ＣＨ₂ （47.9 , 2.56 , 3.30ppm ） ＣＨ₂ （21.5 , 1.55 , 1.66ppm ） ＣＨ₂ （24.4 , 1.67 , 2.58ppm ） ＣＨ（52.5 , 5.18ppm）

【００３６】両者の¹³Ｃシフトはよく一致しているので
同じ構造のもの（残基）と考えられる。さらに、ＣＨ₂
プロトンが非等価であることから環状構造と推定でき
る。

【００３７】このシフトはモナマイシン（Monamycin ）
に含まれれるPiperazic acid(Pip）のものに合うことか
ら、この成分はＰｉｐ（部分構造Ｂの左の部分と部分構
造Ｃ）と推定された。

【００３８】 α β γ δ Ｐｉｐ¹⁾ 49.8 24.1 21.0 47.0 （ＣＤＣｌ₃ 溶液） 実測値 52-53 24-25 21 46-48 （ＣＤＣｌ₃ 溶液）

【００３９】また、セリン（Ｓｅｒ）の６．４０ｐｐｍ
のＮＨとＰｉｐの１６８．９ｐｐｍのカルボニルの間に
ロングレンジが観測されたことにより、部分構造Ｂが推
定された。

【００４０】1) C.H.Hassall, W.A.Thomas, M.C.Mosch
idis，J.Chem.Soc.,Perkin Trans.I, 1977, 2371(1977)

【００４１】ｃ）部分構造Ｄについて¹ Ｈ− ¹Ｈスピン結合から（ＣＨ₃ ）₂ −ＣＨ−ＣＨ−
ＣＨ−ＮＨ−なる部分構造が導かれ、ロングレンジの ¹
Ｈ−¹³Ｃ結合によりこの部分構造が確認され、また、１
７０．６ｐｐｍのカルボニルと４．８８ｐｐｍのＣＨと
のスピン結合から、β−ＯＨ−ロイシン（Ｌｅｕ）の構
造がわかり、５．４６ｐｐｍのＣＨからβ−ＯＨ−Ｌｅ
ｕがそのβ位でエステル結合していることが推定され
た。

【００４２】¹Ｈ− ¹Ｈスピン結合、ロングレンジの ¹
Ｈ−¹³Ｃ結合およびＮＯＥ(NuclearOverhauser Effect)
の測定結果より、部分構造Ｄの側鎖部（左）の部分構
造がわかった。

【００４３】ロングレンジの ¹Ｈ−¹³Ｃ結合から、β−
ＯＨ−Ｌｅｕの４．８８ｐｐｍのＣＨおよび８．３４ｐ
ｐｍのＮＨと側鎖部の１７７ｐｐｍのカルボニルとにロ
ングレンジの相関が観測されたことにより部分構造Ｄが
推定された。

【００４４】ｄ）新規ペプチドの化学構造について ロングレンジの ¹Ｈ−¹³Ｃ結合から、Ｓｅｒの１７０．
２ｐｐｍのカルボニルとβ−ＯＨ−Ｌｅｕの５．４６ｐ
ｐｍのＣＨとにロングレンジ相関が観測されたことによ
り、部分構造Ｂと部分構造ＤがＳｅｒとβ−ＯＨ−Ｌｅ
ｕの間でエステル結合していることがわかった。また、
β−ＯＨ−Ｌｅｕの５．４６ｐｐｍのＣＨとＰｉｐ（部
分構造Ｃ）の４．３８ｐｐｍのＮＨ、β−ＯＨ−Ｌｅｕ
の８．３４ｐｐｍのＮＨとＰｉｐ（部分構造Ｃ）の２．
８９ｐｐｍのＣＨ₂ ，４．９０ｐｐｍのＣＨとにＮＯＥ
が観測されたことから、部分構造Ｃがβ−ＯＨ−Ｌｅｕ
の１７０．６ｐｐｍのカルボニル基に結合していること
がわかった。残る部分構造Ａの結合方法は一通りであ
り、新規ペプチドの化学構造を決定した。

【００４５】また、Ｓｅｒの６．４０ｐｐｍとＮＨとＮ
−ＣＨ₃ −Ｐｈｅの３．０４ｐｐｍのＣＨ₃ の間にもＮ
ＯＥが観測されていることから、上記構造が正しいこと
が示唆されている。

【００４６】ｅ）ＮＭＲの測定結果は下記の通りであ
る。

【００４７】表１と表２は¹³Ｃシフトと炭素タイプ、お
よび直接結合する ¹Ｈを示し、表３〜表５は ¹Ｈシフ
ト、スピン結合する ¹Ｈ、¹³Ｃ、およびロングレンジ結
合する ¹³Ｃを示し、表６と表７はＮＯＥ測定結果を示
し、表８〜表１１は¹³Ｃおよび ¹Ｈの帰属を示す。

【００４８】

【表１】

【００４９】

【表２】

【００５０】

【表３】

【００５１】

【表４】

【００５２】

【表５】

【００５３】

【表６】

【００５４】

【表７】

【００５５】

【表８】

【００５６】

【表９】

【００５７】

【表１０】

【００５８】

【表１１】

【００５９】

【化４】

【００６０】

【化５】

【００６１】

【化６】

【００６２】

【化７】

【００６３】

【化８】

【００６４】

【化９】

【００６５】製剤の調製例 製剤例１（軟膏剤） 本発明ペプチド １ｍｇ プラスチベース（大正製薬社製） １ｇ 本発明ペプチド１ｍｇを乳鉢を用いて細かく粉砕した
後、プラスチベース１ｇを添加し、これらを乳鉢上でよ
く混合して、軟膏剤を調製した。

【００６６】製剤例２（軟膏剤） 本発明ペプチド ０．２ｍｇ メタノール １２．５μｌ プラスチベース（大正製薬社製） １ｇ 本発明ペプチド０．８ｍｇをメタノール５０μｌに溶解
した後、得られた本発明ペプチド含有メタノールのうち
１２．５μｌを乳鉢上でプラスチベース１ｇとよく混合
して軟膏剤を調製した。

【００６７】製剤例３（液剤） 本発明ペプチド ０．５ｍｇ ＤＭＳＯ ０．１ｍｌ ５重量％アラビアゴム水溶液 １．９ｍｌ 本発明ペプチド０．５ｍｇにＤＭＳＯ ０．１ｍｌを添
加して前者を溶解させた後、得られた本発明ペプチド含
有ＤＭＳＯ溶液０．１ｍｌを少量ずつ攪拌しながら５重
量％アラビアゴム溶液１．９ｍｌに添加し、均一に懸濁
した液剤を調製した。

【００６８】製剤例４（液剤） 本発明ペプチド ０．５ｍｇ 生理食塩水 ２ｍｌ 本発明ペプチド０．５ｍｇに少量の生理食塩水を添加
し、超音波を用いて均一な懸濁液にした後、生理食塩水
を添加して溶液量を２ｍｌとし、液剤を調製した。

【００６９】製剤例５（液剤） 本発明ペプチド ２５ｍｇ エタノール ２．５ｍｌ ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０ １ｇ 生理食塩水 ９６．５ｍｌ 本発明ペプチド２５ｍｇをエタノール２．５ｍｌに溶解
した後、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０を１ｇを
加えた。得られた溶液を少量ずつ攪拌しながら生理食塩
水９６．５ｍｌに添加し、液剤を調製した。

【００７０】製剤例６（液剤） 本発明ペプチド １０ｍｇ マクロゴール４００ ５０ｍｌ 生理食塩水 適量 本発明ペプチド１０ｍｇをマクロゴール５０ｍｌに溶解
した後、これに生理食塩水を加えて１００ｍｌにし、液
剤を調製した。

【００７１】薬理試験 試験例１ 肉芽増殖作用 本発明ペプチドを、最終濃度がそれぞれ５μｇ／ｍｌ、
５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌおよび５０００μｇ
／ｍｌになるようにメタノールに溶解した。各濃度のメ
タノール溶液の２０μｌ（本発明ペプチド０．１μｇ／
ディスク〜１００μｇ／ディスク）を直径８ｍｍのペー
パーディスク（アドバンテック社製の抗生物質検定用濾
紙）に２回に分けて染み込ませた後、風乾によりメタノ
ールを除去した。

【００７２】被験動物としては体重１２０〜２００ｇの
ウイスター雄性ラットを用いた。

【００７３】ラットをエーテル麻酔下で剃毛し、背部正
中線に沿ってメスで約３ｃｍの切創部を作成した。作成
した切創部より上記ペーパーディスクを皮下に埋め込ん
だ後、切創部を縫合した。１週間後、ラットをエーテル
麻酔下にて安楽死させ、皮下からペーパーディスクを取
り出し、形成された肉芽の湿重量を測定した。コントロ
ールとしては、本発明ペプチドを含まないメタノール２
０μｌをペーパーディスクに染み込ませついで風乾した
ものを用いた。

【００７４】また、対照薬としてソルコセリル注射液
（大鵬薬品社製）２５μｌ（ソリコセリル１ｍｇ／ディ
スク）をペーパーディスクに染み込ませたものを用い、
その他の点は、上記と同様に操作した。なお、コントロ
ールとしては、生理食塩液２５μｌをペーパーディスク
に染み込ませたものを用いた。

【００７５】本試験はそれぞれ５匹のラットを用いて行
い、肉芽湿重量はこれらラットについて得られた値の平
均値を取った。

【００７６】この試験結果を図１に示す。

【００７７】図１から判るように、本発明ペプチド１μ
ｇ／ディスク以上を含有するディスクを埋め込んだ群で
は、コントロール群に比べて明らかに肉芽湿重量が増加
し、ソルコセリル投与群に比べても肉芽湿重量の著しい
増加が認められた。したがって、本発明ペプチドは細胞
増殖作用を有し、その作用は本発明ペプチド１μｇ／デ
ィスクでソルコセリル１ｍｇ／ディスクを上回るもので
あることが認められる。

【００７８】試験例２ ラット切創モデルに対する作用 本発明ペプチドを最終濃度が５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／
ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌになるように生理食塩液に懸
濁し、本発明ペプチドの供試液を調製した。

【００７９】被験動物としては体重２５０〜３００ｇの
ウイスター雄性ラットを用いた。

【００８０】ラットをエーテル麻酔下で剃毛し、背部正
中線に垂直な方向にメスで３ｃｍの切創部を作成した。
この切創部を等間隔で３ケ所で縫合し、３時間後に上記
供試液０．５ｍｌ（本発明ペプチド２．５μｇ／創、１
０μｇ／創および２５μｇ／創）を切創部周辺に皮下投
与した。切創翌日より３日間、用時調製した供試液０．
５ｍｌ（本発明ペプチド２．５μｇ／創、１０μｇ／創
および２５μｇ／創）を１日１回切創部皮下に投与し
た。切創４日後にラットをエーテル麻酔下にて安楽死さ
せ、抜糸後、切創中央部２ｃｍを含む短冊状の皮膚切片
を切り取った。皮膚切片の結合組織を除去した後、レオ
メーターを用いて切創部の耐創張力（ｇ／ｃｍ）を測定
した。

【００８１】コントロールとしては、生理食塩液を用い
た。

【００８２】また、対照薬としては、ソルコセリル注射
液０．５ｍｌ（ソルコセリル２０ｍｇ／創）（大鵬薬品
社製）を用いた。

【００８３】本試験はそれぞれ１５匹のラットを用いて
行い、耐創張力（ｇ／ｃｍ）はこれらラットについて得
られた値の平均値を取った。

【００８４】この試験結果を図２に示す。

【００８５】図２から判るように、本発明ペプチドを投
与した群では、コントロール群に比べ、明らかに耐創張
力が増加し、また、対照薬のソルコセリル注射液よりも
さらに耐創張力が増加した。すなわち、本発明ペプチド
は、ソルコセリル注射液よりも強力な創傷治癒促進効果
を示すことが認められた。

【００８６】試験例３ ラット皮膚欠損モデルに対する
作用 本発明ペプチドと軟膏基剤（大正製薬社製のプラスチベ
ース）を混合し、本発明ペプチドを０．０２％含む軟膏
を作成した。

【００８７】被験動物としては体重２５０〜３００ｇの
ウイスター雄性ラットを用いた。

【００８８】欠損作成２日前から３日間、デキサメサゾ
ン（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔投与したラットをエーテル麻
酔下で剃毛し、横臥させて引っ張り、ポンチ（内径１６
ｍｍ）を用いて背部の正中線に対照の部位に皮膚欠損部
を作成した。用時調製した軟膏５０ｍｇ（本発明ペプチ
ド１０μｇ含有）を塗布した滅菌濾紙（２５×２５ｍ
ｍ）を皮膚欠損部あたり１枚貼付し、上からテガダーム
（３Ｍ、ドレッシング材）で覆い、さらに粘着性伸縮包
帯で覆い固定した。軟膏の投与は、１日１回治癒するま
で毎日行った。創傷治癒効果は、ノギスを用いて欠損部
の短径、長径を測定し、欠損部を楕円とみなして欠損部
の面積（短径×長径×３．１４÷４）を求め、初期の
（０日目）欠損部面積に対する、測定日の欠損部面積の
割合（これを、面積率という）を求めることにより評価
した。

【００８９】コントロールとしては、軟膏基剤（大正製
薬社製のプラスチベース）を用い、その他の点は上記操
作と同様に行った。

【００９０】また、対照薬としては、オルセノン軟膏５
０ｍｇ（トコレチナート１２５μｇ／欠損創）（日本レ
ダリー社製）を用いた。

【００９１】本試験はそれぞれ７匹のラットを用いて行
い、欠損部面積はこれらラットについて得られた計１４
ケ所の欠損部の面積の平均値を取った。この試験の面積
率の経時変化および治癒日数を図３、図４および表１２
に示す。

【００９２】

【表１２】

【００９３】図３、図４および表１２から判るように、
本発明ペプチドを投与した群では、コントロール群に比
べて有意な欠損部面積縮小効果および平均治癒日数短縮
が認められた。また、本発明ペプチドを投与した群で
は、対照薬のオルセノン軟膏に比べても顕著な欠損部面
積縮小効果および平均治癒日数の短縮が認められた。こ
のように、本発明ペプチドは、顕著な創傷治癒促進効果
を示すことが認められた。

【００９４】試験例４ 糖尿病マウス皮膚欠損モデルに
対する作用 本発明ペプチドを最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるよう
に生理食塩液に懸濁し、本発明ペプチドの供試液を調製
した。

【００９５】被験動物としては体重３０〜４５ｇの雌性
糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）を用いた。

【００９６】欠損作成３日前に剃毛したマウスをエーテ
ル麻酔下で背部正中線を中心に肩甲部にまたがる直径１
６ｍｍの欠損部を眼科用ハサミを用いて作成した。供試
液２０μｌ（本発明ペプチド１μｇ）を創面（２ｃ
ｍ² ）に滴下し、上からポリウレタンフィルム材（ジョ
ンソン社製、商品名 バイオクーシブ）で覆った。投与
は、欠損作成日を０日目として、０、２、４日目に１日
１回ずつ行った。創傷治癒効果は、ノギスを用いて欠損
部の短径、長径を測定し、欠損部を楕円とみなして欠損
部の面積（短径×長径×３．１４÷４）を求め、初期の
（０日目）欠損部面積に対する、測定日の欠損部面積の
割合（これを、面積率という）を求めることにより評価
した。

【００９７】コントロールとしては、生理食塩液のみを
用い、その他の点は上記操作と同様に行った。

【００９８】また、対照薬としては、塩基性線維芽細胞
増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）（Ｐｒｏｇｅｎ社製）を１０μ
ｇ／ｍｌになるように生理食塩液に溶解して用い、その
他の点は上記操作と同様に行った。

【００９９】本試験はそれぞれ５頭のマウスを用いて行
い、欠損部面積はこれらのマウスについて得られた欠損
部面積の平均値を取った。この試験の面積率の経時変化
を図５に、および欠損作成１４日目の面積率を表１３に
示す。

【０１００】

【表１３】

【０１０１】図５および表１３から判るように、本発明
ペプチドを投与した群では、コントロール群に比べて欠
損作成１４日目の面積率が約半分まで縮小した。また、
本発明ペプチドを投与した群では、対照薬のｂ−ＦＧＦ
とほぼ同等の欠損部面積縮小効果を示した。このよう
に、本発明ペプチドは、顕著な創傷治癒促進効果を示す
ことが認められた。

【０１０２】試験例５ 毒性試験 次の方法でラットに対する本発明ペプチドの毒性を調べ
た。まず、本発明ペプチドを、５重量％アラビアゴム水
溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加して成る
溶液に懸濁し、供試液とした。被験動物としては体重１
２０ｇ〜２００ｇのウイスター雄性ラットを用いた。

【０１０３】上記供試液をラットに皮下投与し、死亡状
況を確認した。その結果、２０ｍｇ／ｋｇ投与でも死亡
しなかった。

【０１０４】

【発明の効果】本発明によれば、顕著な創傷治癒効果を
示す新規創傷治癒物質およびこれを含む新規創傷治癒剤
を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明ペプチド、コントロールおよび対照薬の
濃度と肉芽湿重量との関係を示すグラフである。

【図２】本発明ペプチド、コントロールおよび対照薬の
濃度と耐創張力との関係を示すグラフである。

【図３】本発明ペプチド含有軟膏剤およびコントロール
軟膏についての欠損作成日からの日数と面積率との関係
を示すグラフである。

【図４】本発明ペプチド含有軟膏剤および対照薬軟膏に
ついての欠損作成日からの日数と面積率との関係を示す
グラフである。

【図５】本発明ペプチド含有剤およびコントロールにつ
いての欠損作成日からの日数と面積率との関係を示すグ
ラフである。

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Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 で示されるペプチドを有効成分として含む創傷治癒剤。