JP3174355B2 - Ｄｔａ遺伝子の塩基配列及びその利用法 - Google Patents
Ｄｔａ遺伝子の塩基配列及びその利用法Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、配列表の配列番号１に
示したアミノ酸配列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラー
ゼ（以下、ＤＴＡと略す）活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ、そのＤＮＡとベクターＤＮＡとより
なる組換え体ＤＮＡ、その組換え体ＤＮＡで形質転換せ
しめられた形質転換体、及び該形質転換体を利用したＤ
ＴＡの製造法並びにＤ−スレオニン等のＤ−β−ヒドロ
キシアミノ酸の製造法に関する。特に本発明は、ＤＴＡ
のコード領域に対応するＤＮＡを遺伝子組換え操作する
ことにより、安定で且つ発現性に優れた組換え体ＤＮＡ
を与えると共に、ＤＴＡ生産性の優れた形質転換体を提
供する。また、こうして得られた形質転換体を利用する
ことにより、バイオインダストリーの分野のみでなく、
広範な応用の可能なＤＴＡを大量に製造することがで
き、さらには特に、医薬、農薬等の合成原料として有用
なＤ−スレオニンをはじめとしたＤ−β−ヒドロキシア
ミノ酸を効率よく製造することにも関する。
示したアミノ酸配列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラー
ゼ（以下、ＤＴＡと略す）活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ、そのＤＮＡとベクターＤＮＡとより
なる組換え体ＤＮＡ、その組換え体ＤＮＡで形質転換せ
しめられた形質転換体、及び該形質転換体を利用したＤ
ＴＡの製造法並びにＤ−スレオニン等のＤ−β−ヒドロ
キシアミノ酸の製造法に関する。特に本発明は、ＤＴＡ
のコード領域に対応するＤＮＡを遺伝子組換え操作する
ことにより、安定で且つ発現性に優れた組換え体ＤＮＡ
を与えると共に、ＤＴＡ生産性の優れた形質転換体を提
供する。また、こうして得られた形質転換体を利用する
ことにより、バイオインダストリーの分野のみでなく、
広範な応用の可能なＤＴＡを大量に製造することがで
き、さらには特に、医薬、農薬等の合成原料として有用
なＤ−スレオニンをはじめとしたＤ−β−ヒドロキシア
ミノ酸を効率よく製造することにも関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】Ｄ−ア
ミノ酸の研究が進むに従って、Ｄ−アミノ酸は抗生物
質、酵素阻害剤、除草剤等の各種医薬、農薬、その他の
各種の生理活性物質の合成原料として有用であることが
明らかにされ、その大量製造法が求められてきた。従来
Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸それぞれの製造は、ＤＬ
−アミノ酸から繁雑な方法でもってラセミ体を光学分割
して製造することが一般的であった。
ミノ酸の研究が進むに従って、Ｄ−アミノ酸は抗生物
質、酵素阻害剤、除草剤等の各種医薬、農薬、その他の
各種の生理活性物質の合成原料として有用であることが
明らかにされ、その大量製造法が求められてきた。従来
Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸それぞれの製造は、ＤＬ
−アミノ酸から繁雑な方法でもってラセミ体を光学分割
して製造することが一般的であった。
【０００３】しかし、そのような方法は、不必要な他方
のアミノ酸をも製造するものであると共にそれを光学分
割しなければならないという著しい不利な点を有してい
た。このような点を解決するものとして、本発明者ら
は、自然界を広く検索した結果Ｄ−スレオニンアルドラ
ーゼ（ＤＴＡ）を見出すと共に（特公昭６４−１１２７
９号）、その酵素を使用すればグリシンとアセトアルデ
ヒドなどのアルデヒド化合物から選択的にＤ−スレオニ
ンなどのＤ体のβ−オキシアミノ酸を製造することが出
来ることを見出した（特開昭５８−１１６６９０号）。
のアミノ酸をも製造するものであると共にそれを光学分
割しなければならないという著しい不利な点を有してい
た。このような点を解決するものとして、本発明者ら
は、自然界を広く検索した結果Ｄ−スレオニンアルドラ
ーゼ（ＤＴＡ）を見出すと共に（特公昭６４−１１２７
９号）、その酵素を使用すればグリシンとアセトアルデ
ヒドなどのアルデヒド化合物から選択的にＤ−スレオニ
ンなどのＤ体のβ−オキシアミノ酸を製造することが出
来ることを見出した（特開昭５８−１１６６９０号）。
【０００４】このようなＤＴＡを使用してＤ−β−オキ
シアミノ酸を効率よく製造するためには、大量のＤＴＡ
を安価に取得することが必要であった。従来この酵素を
大量に効率よく得るために、高生産菌株を土壌などから
得る試みが広範囲になされたり、あるいは既存の生産株
の人工突然変異によって育種改良することがなされてき
たが、満足のいく結果は得られていなかった。
シアミノ酸を効率よく製造するためには、大量のＤＴＡ
を安価に取得することが必要であった。従来この酵素を
大量に効率よく得るために、高生産菌株を土壌などから
得る試みが広範囲になされたり、あるいは既存の生産株
の人工突然変異によって育種改良することがなされてき
たが、満足のいく結果は得られていなかった。
【０００５】このような状況のもとで、本発明者らは、
鋭意研究を行ない、その結果微生物よりＤＴＡ産生に関
与する遺伝子を遺伝子組換えの手法で大量に得ることを
可能にすると共に、その遺伝子を用いた組換えＤＮＡで
もって形質転換せしめたＤＴＡ高生産性の組換え微生物
を取得した。本発明者らは更に研究を進め、前記組換え
手法で得られたＤＴＡ産生に関与する遺伝子の塩基配列
の決定を試み、それに成功すると共に、ＤＴＡ産生に直
接関与する遺伝子部分を特定化した。そして更にこうし
て特定化されたＤＴＡ産生に直接関与する遺伝子部分
は、前記の組換えＤＮＡのほんの一部であること、そし
てこのように小断片化された遺伝子はそれ自体でＤＴＡ
をコードするものであることを知見するに至った。本発
明者らは更に研究を進めた結果このように小断片化され
たＤＴＡコードＤＮＡは、それを多コピー化することが
容易なこと、遺伝子発現制御配列との組み合わせが比較
的簡単になし得ること、その発現の制御が容易化しうる
こと、さらには高ＤＴＡ産生形質転換体の育種に使用で
きるなどの優れた利点を有すると共に、そのうちの塩基
配列を公知の手法で置換あるいは欠失あるいは付加する
ことが容易になるなどのことを見出して本発明を完成し
た。
鋭意研究を行ない、その結果微生物よりＤＴＡ産生に関
与する遺伝子を遺伝子組換えの手法で大量に得ることを
可能にすると共に、その遺伝子を用いた組換えＤＮＡで
もって形質転換せしめたＤＴＡ高生産性の組換え微生物
を取得した。本発明者らは更に研究を進め、前記組換え
手法で得られたＤＴＡ産生に関与する遺伝子の塩基配列
の決定を試み、それに成功すると共に、ＤＴＡ産生に直
接関与する遺伝子部分を特定化した。そして更にこうし
て特定化されたＤＴＡ産生に直接関与する遺伝子部分
は、前記の組換えＤＮＡのほんの一部であること、そし
てこのように小断片化された遺伝子はそれ自体でＤＴＡ
をコードするものであることを知見するに至った。本発
明者らは更に研究を進めた結果このように小断片化され
たＤＴＡコードＤＮＡは、それを多コピー化することが
容易なこと、遺伝子発現制御配列との組み合わせが比較
的簡単になし得ること、その発現の制御が容易化しうる
こと、さらには高ＤＴＡ産生形質転換体の育種に使用で
きるなどの優れた利点を有すると共に、そのうちの塩基
配列を公知の手法で置換あるいは欠失あるいは付加する
ことが容易になるなどのことを見出して本発明を完成し
た。
【０００６】即ち、本発明は、（１） 配列表の配列番
号１に示したアミノ酸配列を有し、Ｄ−スレオニンアル
ドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、（２） 上記（１）のＤＮＡをベクターに組み込ん
でなる組換え体ＤＮＡ、（３） 上記（２）の組換え体
ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体、（４） 上
記（３）の形質転換体を培養し、次に得られたＤＴＡを
採取することを特徴とするＤ−スレオニンアルドラーゼ
の製造法、及び（５） 上記（３）の形質転換体あるい
はその処理物を、グリシン及びアルデヒド化合物と反応
せしめ、生成したＤ−β−ヒドロキシアミノ酸を採取す
ることを特徴とするＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造
法に関する。
号１に示したアミノ酸配列を有し、Ｄ−スレオニンアル
ドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、（２） 上記（１）のＤＮＡをベクターに組み込ん
でなる組換え体ＤＮＡ、（３） 上記（２）の組換え体
ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体、（４） 上
記（３）の形質転換体を培養し、次に得られたＤＴＡを
採取することを特徴とするＤ−スレオニンアルドラーゼ
の製造法、及び（５） 上記（３）の形質転換体あるい
はその処理物を、グリシン及びアルデヒド化合物と反応
せしめ、生成したＤ−β−ヒドロキシアミノ酸を採取す
ることを特徴とするＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造
法に関する。
【０００７】本発明は、また、上記（１）のＤＮＡを用
いた高発現性の組換え体ＤＮＡ並びにその製造法、及び
上記（１）のＤＮＡを用いたＤＴＡ高産生形質転換体の
育種法をも提供する。
いた高発現性の組換え体ＤＮＡ並びにその製造法、及び
上記（１）のＤＮＡを用いたＤＴＡ高産生形質転換体の
育種法をも提供する。
【０００８】以下、本発明を更に詳細に説明する。 （１）ＤＴＡ合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡの単
離 本発明の配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有
し、ＤＴＡ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ（以下、単にＤＴＡ遺伝子ともいう。）は、Ｄ−スレ
オニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡから製造することができる。
離 本発明の配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有
し、ＤＴＡ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ（以下、単にＤＴＡ遺伝子ともいう。）は、Ｄ−スレ
オニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡから製造することができる。
【０００９】このＤ−スレオニンアルドラーゼの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡとしては、例えばキサン
トモナス属細菌から得られたものが挙げられる。このキ
サントモナス属細菌としてはＤＴＡ産生キサントモナス
属細菌株であれば特に限定されないが、特に好ましいも
のとしてはキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７を
あげることができる。
関与する遺伝情報を担うＤＮＡとしては、例えばキサン
トモナス属細菌から得られたものが挙げられる。このキ
サントモナス属細菌としてはＤＴＡ産生キサントモナス
属細菌株であれば特に限定されないが、特に好ましいも
のとしてはキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７を
あげることができる。
【００１０】また、このＤＮＡは、それが一旦単離取得
されたならば、慣用方法に従ってそのＤＮＡ中の塩基配
列の大部分あるいは一部分を利用して、それをプローブ
として用いて、他の生物を検索して、その生物の保有す
る遺伝子のうちに、ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を
担うものを見つけ出し、次にそのようにして同定された
遺伝子を遺伝子組換え技術の手法を応用して切り出し
て、それを大量に得、それをこのキサントモナス属細菌
に由来するものと同様に用いることは、当業者であれば
容易に理解し得るところのものである。
されたならば、慣用方法に従ってそのＤＮＡ中の塩基配
列の大部分あるいは一部分を利用して、それをプローブ
として用いて、他の生物を検索して、その生物の保有す
る遺伝子のうちに、ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を
担うものを見つけ出し、次にそのようにして同定された
遺伝子を遺伝子組換え技術の手法を応用して切り出し
て、それを大量に得、それをこのキサントモナス属細菌
に由来するものと同様に用いることは、当業者であれば
容易に理解し得るところのものである。
【００１１】従って、本発明のＤ−スレオニンアルドラ
ーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ源として
は、キサントモナス属細菌のみでなく、上記したような
手法の適用できるグラム陰性あるいはグラム陽性細菌で
あってＤＴＡをコードする遺伝子を有するものがあげら
れる。この他にも、ＤＴＡ遺伝子を有するものであれ
ば、動物、植物、下等生物、高等生物の区別なく利用す
ることが可能である。ＤＴＡ遺伝子源として好ましい微
生物としてはキサントモナス属、アリスロバクター属、
シュードモナス属あるいは、アルカリゲネス属に属する
ものがあげられる。このようなものの代表的な例として
はキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７、アルカリ
ゲネス・ハエカリスＩＦＯ１２６６９、シュードモナス
ＤＫ−１９（微工研菌寄第６２００号）及びアリスロバ
クターＤＫ−１９（微工研菌寄第６２０１号）をあげる
ことができる。
ーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ源として
は、キサントモナス属細菌のみでなく、上記したような
手法の適用できるグラム陰性あるいはグラム陽性細菌で
あってＤＴＡをコードする遺伝子を有するものがあげら
れる。この他にも、ＤＴＡ遺伝子を有するものであれ
ば、動物、植物、下等生物、高等生物の区別なく利用す
ることが可能である。ＤＴＡ遺伝子源として好ましい微
生物としてはキサントモナス属、アリスロバクター属、
シュードモナス属あるいは、アルカリゲネス属に属する
ものがあげられる。このようなものの代表的な例として
はキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７、アルカリ
ゲネス・ハエカリスＩＦＯ１２６６９、シュードモナス
ＤＫ−１９（微工研菌寄第６２００号）及びアリスロバ
クターＤＫ−１９（微工研菌寄第６２０１号）をあげる
ことができる。
【００１２】（２）ＤＴＡをコードするＤＮＡの塩基配
列の決定 次にキサントモナス属細菌由来のＤＴＡ産生に関与する
遺伝子を含むＤＮＡを例にあげて、ＤＴＡをコードする
ＤＮＡの単離及びその塩基配列の決定法について説明す
る。ここで使用しうるキサントモナス属細菌由来のＤＴ
Ａ産生に関与する遺伝子の供給株としては、具体的には
キサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７よりクローン
化されたＤＴＡ遺伝子を含む約３．５ＫｂのＳｍａＩ／
ＢｇｌII断片を組み込んだプラスミドＤＮＡをもつ形質
転換体大腸菌Ｃ６００（ｐＤＴ６４８）があげられる。
列の決定 次にキサントモナス属細菌由来のＤＴＡ産生に関与する
遺伝子を含むＤＮＡを例にあげて、ＤＴＡをコードする
ＤＮＡの単離及びその塩基配列の決定法について説明す
る。ここで使用しうるキサントモナス属細菌由来のＤＴ
Ａ産生に関与する遺伝子の供給株としては、具体的には
キサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７よりクローン
化されたＤＴＡ遺伝子を含む約３．５ＫｂのＳｍａＩ／
ＢｇｌII断片を組み込んだプラスミドＤＮＡをもつ形質
転換体大腸菌Ｃ６００（ｐＤＴ６４８）があげられる。
【００１３】この株は工業技術院微生物工業技術研究所
に、微工研菌寄第１１０４９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１０
４９）として寄託されている。上記形質転換体からの組
換え体ＤＮＡおよび目的のＤＴＡ遺伝子を持つＤＮＡ断
片の調製は通常の方法を用いて行うことができる。
に、微工研菌寄第１１０４９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１０
４９）として寄託されている。上記形質転換体からの組
換え体ＤＮＡおよび目的のＤＴＡ遺伝子を持つＤＮＡ断
片の調製は通常の方法を用いて行うことができる。
【００１４】例えば、培地中で増殖させた該形質転換体
を収穫し、細胞壁をリゾチーム処理等の細胞破壊法とし
て知られた方法により壊し、次に核酸画分を分離した
後、密度勾配遠心などの方法により所望の画分に分け
る。こうして得られたプラスミドを含有する画分は、次
に適当な制限酵素で処理することにより、適度な断片に
することができると共にまた選択的に配列表の配列番号
１に示したアミノ酸配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ断片とすることができ
る。
を収穫し、細胞壁をリゾチーム処理等の細胞破壊法とし
て知られた方法により壊し、次に核酸画分を分離した
後、密度勾配遠心などの方法により所望の画分に分け
る。こうして得られたプラスミドを含有する画分は、次
に適当な制限酵素で処理することにより、適度な断片に
することができると共にまた選択的に配列表の配列番号
１に示したアミノ酸配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ断片とすることができ
る。
【００１５】ＤＮＡの塩基配列を決定するのに適した程
度まで断片化されたＤＮＡは、次に当該分野でよく知ら
れた方法により処理されてその塩基配列を決定すること
ができる。ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法として
は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法、ジデオキシ・シー
クエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネーション
法等があげられる。このような方法の内には、適当な制
限酵素を作用させ、制限酵素地図を作製した上で、必要
な断片をサブクローン化する方法や、ショットガン・ク
ローニング法、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する方法、核
酸分解酵素によりディリーションする方法などの様々な
手法が含まれていることはもちろんである。
度まで断片化されたＤＮＡは、次に当該分野でよく知ら
れた方法により処理されてその塩基配列を決定すること
ができる。ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法として
は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法、ジデオキシ・シー
クエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネーション
法等があげられる。このような方法の内には、適当な制
限酵素を作用させ、制限酵素地図を作製した上で、必要
な断片をサブクローン化する方法や、ショットガン・ク
ローニング法、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する方法、核
酸分解酵素によりディリーションする方法などの様々な
手法が含まれていることはもちろんである。
【００１６】次に、こうしてＤＮＡ塩基配列の決定され
たＤＮＡのうちからＤＴＡ活性を有するポリペプチドを
コードしているＤＮＡ領域を決定する。このコード領域
決定のためには、先ず大量にＤＴＡ活性を有するポリペ
プチドを取得し、そのアミノ酸配列を決定し、そのアミ
ノ酸配列をコードしているＤＮＡ領域を探索決定する。
次にこうして決定されたＤＴＡ活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ領域を制限酵素で切り出し、再度
これを用いて発現ベクターを構築し、それを適当な宿主
中で発現させ、こうして得られた発現物の活性を検討し
て最終的に確認される。
たＤＮＡのうちからＤＴＡ活性を有するポリペプチドを
コードしているＤＮＡ領域を決定する。このコード領域
決定のためには、先ず大量にＤＴＡ活性を有するポリペ
プチドを取得し、そのアミノ酸配列を決定し、そのアミ
ノ酸配列をコードしているＤＮＡ領域を探索決定する。
次にこうして決定されたＤＴＡ活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ領域を制限酵素で切り出し、再度
これを用いて発現ベクターを構築し、それを適当な宿主
中で発現させ、こうして得られた発現物の活性を検討し
て最終的に確認される。
【００１７】上記のようにして構造解析されたＤＮＡか
ら、ＤＴＡをコードするＤＮＡ以外の領域を除くには、
様々な方法でＤＴＡの合成に不必要な領域を欠失させる
ことによってなすことができる。このような方法として
は、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼIII
による欠失法、制限酵素切断サイトを利用した組換え法
などがあげられる。この際、本発明に従えば遺伝子の固
有のプロモーターを他のものに変更したり、部位特異的
変異を導入してプロモーターの強度を変化させること
が、現在の遺伝子操作技術を用いることにより、容易に
行いうる。従って、そのように一部を変更したＤＮＡ断
片であっても、ＤＴＡ活性を示すポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むＤＮＡ断片であれば、全て本発明に含
まれることは明白である。
ら、ＤＴＡをコードするＤＮＡ以外の領域を除くには、
様々な方法でＤＴＡの合成に不必要な領域を欠失させる
ことによってなすことができる。このような方法として
は、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼIII
による欠失法、制限酵素切断サイトを利用した組換え法
などがあげられる。この際、本発明に従えば遺伝子の固
有のプロモーターを他のものに変更したり、部位特異的
変異を導入してプロモーターの強度を変化させること
が、現在の遺伝子操作技術を用いることにより、容易に
行いうる。従って、そのように一部を変更したＤＮＡ断
片であっても、ＤＴＡ活性を示すポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むＤＮＡ断片であれば、全て本発明に含
まれることは明白である。
【００１８】また、本発明のＤＴＡ活性を示すポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片としては、Ｄ
ＴＡ活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡに加え
て、その遺伝子を生体内で発現させるのに重要な役割を
担う制御領域、例えば、遺伝子の転写プロモーター、リ
ボソーム結合部位、転写のターミネーターなどをコード
するＤＮＡをも含んだものがあげられる。
チドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片としては、Ｄ
ＴＡ活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡに加え
て、その遺伝子を生体内で発現させるのに重要な役割を
担う制御領域、例えば、遺伝子の転写プロモーター、リ
ボソーム結合部位、転写のターミネーターなどをコード
するＤＮＡをも含んだものがあげられる。
【００１９】本発明に従えば、一旦そのＤＴＡ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列が明ら
かにされることにより、その機能を損なわない範囲でそ
の塩基の置換あるいは欠失を当該分野においてよく知ら
れた方法を適用して容易に行なうことができる。例え
ば、相当するアミノ酸をコードする遺伝暗号の縮重を利
用したもの、生物の遺伝暗号の利用率を考慮した変換あ
るいはＤＴＡの機能に悪影響を及ぼさないようなアミノ
酸配列の変換のための塩基の置換、付加または欠失処理
などがあげられる。更にまた、このような改変のうちに
は、ＤＴＡの活性中心のみを保存し、その他の部分を大
幅に変化させるようにそのＤＮＡの配列及び長さをかえ
ることも含まれる。したがって、本発明のＤ−スレオニ
ンアルドラーゼをコードするＤＮＡとしては、以上のよ
うな改変を施したものすべてが含まれることは当業者で
あれば容易に理解し得るところのものである。
するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列が明ら
かにされることにより、その機能を損なわない範囲でそ
の塩基の置換あるいは欠失を当該分野においてよく知ら
れた方法を適用して容易に行なうことができる。例え
ば、相当するアミノ酸をコードする遺伝暗号の縮重を利
用したもの、生物の遺伝暗号の利用率を考慮した変換あ
るいはＤＴＡの機能に悪影響を及ぼさないようなアミノ
酸配列の変換のための塩基の置換、付加または欠失処理
などがあげられる。更にまた、このような改変のうちに
は、ＤＴＡの活性中心のみを保存し、その他の部分を大
幅に変化させるようにそのＤＮＡの配列及び長さをかえ
ることも含まれる。したがって、本発明のＤ−スレオニ
ンアルドラーゼをコードするＤＮＡとしては、以上のよ
うな改変を施したものすべてが含まれることは当業者で
あれば容易に理解し得るところのものである。
【００２０】以上のような事情に鑑み、本発明のＤ−ス
レオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡは、本発明の
思想を実質的に利用して得られ、本発明のＤＮＡと実質
的に同一の機能を有するものすべてを含有するものであ
る。
レオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡは、本発明の
思想を実質的に利用して得られ、本発明のＤＮＡと実質
的に同一の機能を有するものすべてを含有するものであ
る。
【００２１】（３）ＤＴＡ遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡ
の作製 ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを含む断
片から、適当な手段を施してＤＮＡ合成に不必要な領域
を欠失させたＤＮＡは、それを適当なベクターＤＮＡに
再び組み込むことにより、宿主細胞に再び導入すること
が出来る。本発明の上記ＤＴＡをコードするＤＮＡを宿
主細胞に導入し、そしてそれをその導入された宿主細胞
内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとして
は、適当な宿主細胞内で、ＤＴＡ遺伝子を発現できるも
のであれば特に制限なく使用し得る。
の作製 ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを含む断
片から、適当な手段を施してＤＮＡ合成に不必要な領域
を欠失させたＤＮＡは、それを適当なベクターＤＮＡに
再び組み込むことにより、宿主細胞に再び導入すること
が出来る。本発明の上記ＤＴＡをコードするＤＮＡを宿
主細胞に導入し、そしてそれをその導入された宿主細胞
内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとして
は、適当な宿主細胞内で、ＤＴＡ遺伝子を発現できるも
のであれば特に制限なく使用し得る。
【００２２】このようなベクターＤＮＡとしては、上記
ＤＴＡをコードするＤＮＡを組み込むことの出来るもの
であり、組換えたベクターＤＮＡで宿主細胞を形質転換
できるものであり、そして得られた形質転換体の細胞内
で導入されたＤＴＡをコードするＤＮＡの発現ができる
ものであれば特に限定されず、如何なるものも使用する
ことが出来る。このようなベクターＤＮＡとしては、宿
主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細胞
のみを選別できるような適当な選択マーカーなどが付与
されたものがあげられる。さらにまた、このようなベク
ターＤＮＡは公知のベクターＤＮＡ等から当業者が容易
に製造し得るようなものであってもよい。
ＤＴＡをコードするＤＮＡを組み込むことの出来るもの
であり、組換えたベクターＤＮＡで宿主細胞を形質転換
できるものであり、そして得られた形質転換体の細胞内
で導入されたＤＴＡをコードするＤＮＡの発現ができる
ものであれば特に限定されず、如何なるものも使用する
ことが出来る。このようなベクターＤＮＡとしては、宿
主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細胞
のみを選別できるような適当な選択マーカーなどが付与
されたものがあげられる。さらにまた、このようなベク
ターＤＮＡは公知のベクターＤＮＡ等から当業者が容易
に製造し得るようなものであってもよい。
【００２３】このようなベクターＤＮＡとしては、例え
ばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベ
クターから選ばれたものがあげられる。また、このよう
なベクターＤＮＡは他の宿主株との間で遺伝子交換が可
能なシャトルベクターであってもよいし、ランナウェイ
ベクターやスリーパーベクターなど遺伝子産物の発現効
率を向上せしめるために特別に工夫されたものであって
もよい。さらに、このようなベクターＤＮＡは、ｌａｃ
ＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロ
モーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモータ
ー、ｒｅｃＡプロモーター、ＰL プロモーター等の制御
因子を適宜付与されたものであってもよい。このような
形質発現などに係わる因子等を導入するためには、遺伝
子組換え技術の分野でよく知られた方法を適宜選択して
適用することにより行うことができる。
ばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベ
クターから選ばれたものがあげられる。また、このよう
なベクターＤＮＡは他の宿主株との間で遺伝子交換が可
能なシャトルベクターであってもよいし、ランナウェイ
ベクターやスリーパーベクターなど遺伝子産物の発現効
率を向上せしめるために特別に工夫されたものであって
もよい。さらに、このようなベクターＤＮＡは、ｌａｃ
ＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロ
モーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモータ
ー、ｒｅｃＡプロモーター、ＰL プロモーター等の制御
因子を適宜付与されたものであってもよい。このような
形質発現などに係わる因子等を導入するためには、遺伝
子組換え技術の分野でよく知られた方法を適宜選択して
適用することにより行うことができる。
【００２４】ここで使用することのできるベクターＤＮ
Ａの代表的なものは、宿主細胞によっても異なるが、ｐ
ＢＲ３２８（Ｍｕｒｏｏｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（７），４４０６（１９８
７））、ｐＲＫ２０１３などのヘルパープラスミドと共
に用いられるｐＲＫ２９０（Ｇ．Ｄｉｔｔａ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ ７７（１２）、７３４７−７３５１（１９８０））
などがあげられる。
Ａの代表的なものは、宿主細胞によっても異なるが、ｐ
ＢＲ３２８（Ｍｕｒｏｏｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（７），４４０６（１９８
７））、ｐＲＫ２０１３などのヘルパープラスミドと共
に用いられるｐＲＫ２９０（Ｇ．Ｄｉｔｔａ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ ７７（１２）、７３４７−７３５１（１９８０））
などがあげられる。
【００２５】上記ベクターＤＮＡに、上記ＤＴＡをコー
ドするＤＮＡを組み込むには、まず、上記ベクターＤＮ
Ａに適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターＤＮ
Ａ断片を、上記ＤＴＡをコードするＤＮＡ断片とを混合
し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによりなし
うる。この際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー
付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもでき
る。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適当
な宿主細胞の中に導入される。
ドするＤＮＡを組み込むには、まず、上記ベクターＤＮ
Ａに適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターＤＮ
Ａ断片を、上記ＤＴＡをコードするＤＮＡ断片とを混合
し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによりなし
うる。この際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー
付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもでき
る。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適当
な宿主細胞の中に導入される。
【００２６】（４）複数のＤＴＡ遺伝子を持つ組換え体
ＤＮＡの作製 同一のプラスミド上に複数のＤＴＡ遺伝子、すなわち上
記ＤＴＡをコードするＤＮＡを組み込めば、より良好な
結果が得られる。複数のＤＴＡ遺伝子を組み込む際のそ
の様式は、固有のプロモーターを持つＤＴＡ遺伝子が複
数個導入されていてもよいし、複数のＤＴＡ遺伝子がポ
リシストロニックに転写されるオペロンとして導入され
ていてもよいし、またこれらの組み合わせであってもよ
い。
ＤＮＡの作製 同一のプラスミド上に複数のＤＴＡ遺伝子、すなわち上
記ＤＴＡをコードするＤＮＡを組み込めば、より良好な
結果が得られる。複数のＤＴＡ遺伝子を組み込む際のそ
の様式は、固有のプロモーターを持つＤＴＡ遺伝子が複
数個導入されていてもよいし、複数のＤＴＡ遺伝子がポ
リシストロニックに転写されるオペロンとして導入され
ていてもよいし、またこれらの組み合わせであってもよ
い。
【００２７】固有のプロモーターを持つＤＴＡ遺伝子を
導入する方法では、導入可能な任意の位置にランダムに
導入してもよいし、一群のクラスターとして導入しても
よい。その際、遺伝子を導入する順序や遺伝子の方向性
は特に問題とはならない。また、ＤＴＡ遺伝子をオペロ
ンとして導入する方法では、プロモーターからの転写方
向に対してＤＴＡ遺伝子をタンデムに配置することが望
ましい。いずれの方法においてもＤＴＡ遺伝子を効率よ
く発現させるために重要な役割を担う制御領域、例えば
遺伝子の転写プロモーター、リボソーム結合部位、転写
のターミネーターなどをコードするＤＮＡが適当な位置
に配置されていることが必要であることは言うまでもな
い。
導入する方法では、導入可能な任意の位置にランダムに
導入してもよいし、一群のクラスターとして導入しても
よい。その際、遺伝子を導入する順序や遺伝子の方向性
は特に問題とはならない。また、ＤＴＡ遺伝子をオペロ
ンとして導入する方法では、プロモーターからの転写方
向に対してＤＴＡ遺伝子をタンデムに配置することが望
ましい。いずれの方法においてもＤＴＡ遺伝子を効率よ
く発現させるために重要な役割を担う制御領域、例えば
遺伝子の転写プロモーター、リボソーム結合部位、転写
のターミネーターなどをコードするＤＮＡが適当な位置
に配置されていることが必要であることは言うまでもな
い。
【００２８】導入する遺伝子の数に特に制限はなく、組
換え体ＤＮＡ及びそれを含む形質転換体の安定性を損な
わない範囲であればよい。組換え体ＤＮＡを作製する場
合、このための技術としては制限酵素による切断、リガ
ーゼによる連結、化学合成ＤＮＡの利用、ヌクレアーゼ
による欠失、部位特異的変異による塩基置換など、通常
の遺伝子操作で用いられる技術を適宜選択して適用する
ことにより行なうことができるが、この際に、プロモー
ターの変更やその他のＤＴＡ遺伝子を発現させるための
塩基配列の改変を行ってもよい。このようにして得られ
た組換え体ＤＮＡは次に適当な宿主細胞の中に導入され
る。
換え体ＤＮＡ及びそれを含む形質転換体の安定性を損な
わない範囲であればよい。組換え体ＤＮＡを作製する場
合、このための技術としては制限酵素による切断、リガ
ーゼによる連結、化学合成ＤＮＡの利用、ヌクレアーゼ
による欠失、部位特異的変異による塩基置換など、通常
の遺伝子操作で用いられる技術を適宜選択して適用する
ことにより行なうことができるが、この際に、プロモー
ターの変更やその他のＤＴＡ遺伝子を発現させるための
塩基配列の改変を行ってもよい。このようにして得られ
た組換え体ＤＮＡは次に適当な宿主細胞の中に導入され
る。
【００２９】（５）組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入 上記のようにして作製した組換え体ＤＮＡを導入するた
めの宿主細胞としては、上で得られた組換えベクターで
もって形質転換されて、ＤＴＡ遺伝子を発現させること
ができるようなものであれば、特に制限なく使用するこ
とが出来る。このような宿主細胞としては、本発明の目
的に沿ってＤＴＡ遺伝子の発現を達成し得る限り、グラ
ム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、
下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞で
あろうと植物由来細胞であろうと使用できる。
めの宿主細胞としては、上で得られた組換えベクターで
もって形質転換されて、ＤＴＡ遺伝子を発現させること
ができるようなものであれば、特に制限なく使用するこ
とが出来る。このような宿主細胞としては、本発明の目
的に沿ってＤＴＡ遺伝子の発現を達成し得る限り、グラ
ム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、
下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞で
あろうと植物由来細胞であろうと使用できる。
【００３０】ここで使用することのできる宿主細胞とし
ては、本発明のＤＴＡをコードするＤＮＡの発現が達成
され得るものがあげられ、このような宿主細胞として
は、大腸菌、キサントモナス属細菌、アセトバクター属
細菌、シュードモナス属細菌、グルコノバクター属細
菌、アゾトバクター属細菌、リゾビウム属細菌、アルカ
リゲネス属細菌、クレブシエラ属細菌、サルモネラ属細
菌及びセラチア属細菌から選ばれたものがあげられる。
ては、本発明のＤＴＡをコードするＤＮＡの発現が達成
され得るものがあげられ、このような宿主細胞として
は、大腸菌、キサントモナス属細菌、アセトバクター属
細菌、シュードモナス属細菌、グルコノバクター属細
菌、アゾトバクター属細菌、リゾビウム属細菌、アルカ
リゲネス属細菌、クレブシエラ属細菌、サルモネラ属細
菌及びセラチア属細菌から選ばれたものがあげられる。
【００３１】ここで使用することの好ましい宿主細胞と
しては、例えば大腸菌及びキサントモナス属細菌があげ
られる。上記組換え体ＤＮＡを用いて上記宿主細胞を形
質転換などをするにあたっては、ＤＮＡ組換技術におい
て広く知られた方法を適用して行うことができる。この
ような方法としては、宿主細胞をコンピテント（ｃｏｍ
ｐｅｔｅｎｔ）状態にして形質転換用緩衝液中で組換え
体ＤＮＡと混合するとか、ヘルパー・プラスミドを用い
て接合伝達により移入するなどの方法があげられる。
しては、例えば大腸菌及びキサントモナス属細菌があげ
られる。上記組換え体ＤＮＡを用いて上記宿主細胞を形
質転換などをするにあたっては、ＤＮＡ組換技術におい
て広く知られた方法を適用して行うことができる。この
ような方法としては、宿主細胞をコンピテント（ｃｏｍ
ｐｅｔｅｎｔ）状態にして形質転換用緩衝液中で組換え
体ＤＮＡと混合するとか、ヘルパー・プラスミドを用い
て接合伝達により移入するなどの方法があげられる。
【００３２】（６）形質転換体によるＤＴＡの製造 本発明により得られたＤＴＡ産生形質転換体は、それを
栄養培地中で培養せしめられ、次に得られた培養物をそ
のままＤＴＡ含有物として、あるいは培養物中からＤＴ
Ａを単離して、Ｄ−スレオニンあるいはその誘導体の合
成に用いることが出来る。ＤＴＡ産生形質転換体は、適
当な栄養培地中で培養することにより、それを大量に得
ることができる。培養に用いられる培地は微生物の生育
に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地
である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。培養
は、好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜６０℃の
任意の範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。
形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じてアンピ
シリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に
添加してもよい。
栄養培地中で培養せしめられ、次に得られた培養物をそ
のままＤＴＡ含有物として、あるいは培養物中からＤＴ
Ａを単離して、Ｄ−スレオニンあるいはその誘導体の合
成に用いることが出来る。ＤＴＡ産生形質転換体は、適
当な栄養培地中で培養することにより、それを大量に得
ることができる。培養に用いられる培地は微生物の生育
に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地
である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。培養
は、好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜６０℃の
任意の範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。
形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じてアンピ
シリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に
添加してもよい。
【００３３】大量に培養して得たＤＴＡ産生形質転換体
の細胞あるいはその培養液よりのＤＴＡの単離精製にあ
たっては、特公昭６４−１１２７９号に記載の方法と類
似の方法が使用できるほか、その産生量が非常に高いこ
とからより簡便な方法が利用できる。このような方法を
行うには、まず、生物体を機械的方法、酵素処理方法、
自己溶解法、超音波処理法などの方法によって破壊し、
粗抽出液を得、ついでこれを硫酸アンモニウム、リン酸
ナトリウムなどの塩析剤あるいはアセトン又はエタノー
ルなどの溶媒による蛋白質沈澱法、電気泳動法、ゲル濾
過法あるいは分子ふるいクロマトグラフィー法、限外濾
過法、逆相クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグ
ラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィ
ニティクロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフィー
法、などの方法を単独あるいは適宜組み合わせて用いて
適用することにより行うことが出来る。
の細胞あるいはその培養液よりのＤＴＡの単離精製にあ
たっては、特公昭６４−１１２７９号に記載の方法と類
似の方法が使用できるほか、その産生量が非常に高いこ
とからより簡便な方法が利用できる。このような方法を
行うには、まず、生物体を機械的方法、酵素処理方法、
自己溶解法、超音波処理法などの方法によって破壊し、
粗抽出液を得、ついでこれを硫酸アンモニウム、リン酸
ナトリウムなどの塩析剤あるいはアセトン又はエタノー
ルなどの溶媒による蛋白質沈澱法、電気泳動法、ゲル濾
過法あるいは分子ふるいクロマトグラフィー法、限外濾
過法、逆相クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグ
ラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィ
ニティクロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフィー
法、などの方法を単独あるいは適宜組み合わせて用いて
適用することにより行うことが出来る。
【００３４】（７）Ｄ−β−オキシアミノ酸の製造 こうして得られた組換えＤＴＡは特開昭５８−１１６６
９０号に記載されたようにしてグリシンとアセトアルデ
ヒドなどのアルデヒド化合物からＤ−スレオニンなどの
Ｄ体のβ−オキシアミノ酸を製造する際に、従来自然界
に見出されている非組換え微生物のＤＴＡと同様にして
用いることができるが、本発明によれば大量かつ高純度
でそのＤＴＡを製造しうるものであることから、こうし
て得られたＤＴＡを用いることにより目的Ｄ−スレオニ
ン類を製造する方法としては大変に優れている。
９０号に記載されたようにしてグリシンとアセトアルデ
ヒドなどのアルデヒド化合物からＤ−スレオニンなどの
Ｄ体のβ−オキシアミノ酸を製造する際に、従来自然界
に見出されている非組換え微生物のＤＴＡと同様にして
用いることができるが、本発明によれば大量かつ高純度
でそのＤＴＡを製造しうるものであることから、こうし
て得られたＤＴＡを用いることにより目的Ｄ−スレオニ
ン類を製造する方法としては大変に優れている。
【００３５】また、従来自然界に見出されているＤＴＡ
生産性微生物では、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼを
も同時に産生しているために、グリシンとアルデヒド類
からＤ−β−オキシアミノ酸類を製造しようとする場
合、Ｌ−アロ−β−オキシアミノ酸の副生を避けるため
にＬ−アロスレオニンアルドラーゼを分離するか、選択
的に不活性化させることが必要であった。本発明に従っ
て組換えにより得られた微生物では、ＤＴＡのみを大量
に製造することが出来るので、Ｄ−スレオニン類を製造
する際に、宿主の産生するＬ−アロスレオニンアルドラ
ーゼ活性を除去するという繁雑な操作を大巾に省くこと
が出来る。
生産性微生物では、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼを
も同時に産生しているために、グリシンとアルデヒド類
からＤ−β−オキシアミノ酸類を製造しようとする場
合、Ｌ−アロ−β−オキシアミノ酸の副生を避けるため
にＬ−アロスレオニンアルドラーゼを分離するか、選択
的に不活性化させることが必要であった。本発明に従っ
て組換えにより得られた微生物では、ＤＴＡのみを大量
に製造することが出来るので、Ｄ−スレオニン類を製造
する際に、宿主の産生するＬ−アロスレオニンアルドラ
ーゼ活性を除去するという繁雑な操作を大巾に省くこと
が出来る。
【００３６】この方法で用いられるアルデヒド化合物と
しては一般式Ｒ−ＣＨＯ（式中Ｒは水素原子、置換又は
非置換の脂肪族基、脂環式基、芳香族基、又複素環式基
を表わす）で示されるアルデヒド化合物があげられる。
本方法で使用される酵素は、酵素活性を発揮し得る形態
であればよく、必ずしも単離されたものに限定されな
い。また該酵素は、半精製品でもよく粗抽出液、さらに
は培養物、生物体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物
体、あるいはそれら生物体の磨砕物等であってもよい。
さらにそれは、酵素自体あるいは生物体のまま公知の手
段で固定化されて用いられてもよい。
しては一般式Ｒ−ＣＨＯ（式中Ｒは水素原子、置換又は
非置換の脂肪族基、脂環式基、芳香族基、又複素環式基
を表わす）で示されるアルデヒド化合物があげられる。
本方法で使用される酵素は、酵素活性を発揮し得る形態
であればよく、必ずしも単離されたものに限定されな
い。また該酵素は、半精製品でもよく粗抽出液、さらに
は培養物、生物体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物
体、あるいはそれら生物体の磨砕物等であってもよい。
さらにそれは、酵素自体あるいは生物体のまま公知の手
段で固定化されて用いられてもよい。
【００３７】また、反応温度は１０〜７０℃、好ましく
は２０〜５０℃である。反応時のｐＨは６〜９．５、好
ましくは７〜８に維持する。本反応はバッチ方式で行っ
てもよく、連続方式で行っもよい。更に、本反応は任意
の時間だけ反応を行わせることによってなしうるが、好
適には１〜５０時間、より好ましくは５〜３０時間反応
を行うのがよい。反応終了後は、適宜濃縮、遠心分離、
濾過などの処理を施して懸濁物等を除去してから、イオ
ン交換樹脂処理、晶析等で精製し、必要に応じ活性炭な
どで脱色処理することにより、目的Ｄ−β−ヒドロキシ
アミノ酸を得ることが出来る。
は２０〜５０℃である。反応時のｐＨは６〜９．５、好
ましくは７〜８に維持する。本反応はバッチ方式で行っ
てもよく、連続方式で行っもよい。更に、本反応は任意
の時間だけ反応を行わせることによってなしうるが、好
適には１〜５０時間、より好ましくは５〜３０時間反応
を行うのがよい。反応終了後は、適宜濃縮、遠心分離、
濾過などの処理を施して懸濁物等を除去してから、イオ
ン交換樹脂処理、晶析等で精製し、必要に応じ活性炭な
どで脱色処理することにより、目的Ｄ−β−ヒドロキシ
アミノ酸を得ることが出来る。
【００３８】本方法で使用される酵素は、天然のＤＴＡ
のペプチド配列と一致するもののみに限定されず、遺伝
子変換及び遺伝子組換えの手法で得られるＤＴＡ活性を
示すものすべてを言うものと解すべきである。従って、
本方法で使用できる組換えＤＴＡは、天然のＤＴＡのペ
プチド配列中のアミノ酸の欠失したもの、あるいはその
ペプチド配列中のアミノ酸が他のアミノ酸で置き換えら
れたものをも包含する。
のペプチド配列と一致するもののみに限定されず、遺伝
子変換及び遺伝子組換えの手法で得られるＤＴＡ活性を
示すものすべてを言うものと解すべきである。従って、
本方法で使用できる組換えＤＴＡは、天然のＤＴＡのペ
プチド配列中のアミノ酸の欠失したもの、あるいはその
ペプチド配列中のアミノ酸が他のアミノ酸で置き換えら
れたものをも包含する。
【００３９】本発明に従って、配列表の配列番号１に示
したアミノ酸配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを用いて、それをベクターに組
み込んで得られた組換え体ＤＮＡは、それを宿主に導入
して形質転換体を得ても、その形質転換体の生育が親の
宿主の生育に比べて劣ることが少ないばかりでなく、そ
の導入された組換え体ＤＮＡも安定に保持され、欠失あ
るいは脱落により活性を失なうというような欠点がな
い。さらにまた、配列表の配列番号１に示したアミノ酸
配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡは、それが小型のものであることから、その
取り扱いが容易なばかりでなく、ベクター中に複数個組
み込んだり、あるいは強力な発現活性を有する制御配列
と組み合わせることが可能となった。
したアミノ酸配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを用いて、それをベクターに組
み込んで得られた組換え体ＤＮＡは、それを宿主に導入
して形質転換体を得ても、その形質転換体の生育が親の
宿主の生育に比べて劣ることが少ないばかりでなく、そ
の導入された組換え体ＤＮＡも安定に保持され、欠失あ
るいは脱落により活性を失なうというような欠点がな
い。さらにまた、配列表の配列番号１に示したアミノ酸
配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡは、それが小型のものであることから、その
取り扱いが容易なばかりでなく、ベクター中に複数個組
み込んだり、あるいは強力な発現活性を有する制御配列
と組み合わせることが可能となった。
【００４０】本発明に従って得られた形質転換体は、優
れた生育性を示すと共に高いＤＴＡ生産性を示すことが
でき、更に安定にＤＴＡ生産性を保持するために有用で
ある。また、本発明に従えば、大量のＤＴＡ生産が可能
であり、またその生産されたＤＴＡの単離精製も容易と
なり、高純度のＤＴＡ製品が得られる。こうして得られ
たＤＴＡを利用することにより、優れたＤ−スレオニン
をはじめとするＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法が
提供される。
れた生育性を示すと共に高いＤＴＡ生産性を示すことが
でき、更に安定にＤＴＡ生産性を保持するために有用で
ある。また、本発明に従えば、大量のＤＴＡ生産が可能
であり、またその生産されたＤＴＡの単離精製も容易と
なり、高純度のＤＴＡ製品が得られる。こうして得られ
たＤＴＡを利用することにより、優れたＤ−スレオニン
をはじめとするＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法が
提供される。
【００４１】
実施例１ ＤＴＡ遺伝子の塩基配列の決定 組換え体ＤＮＡの調製は、以下説明するようにＢｉｒｎ
ｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙの方法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，９
０）に従って行った。ＤＴＡ遺伝子を保持する組換え体
プラスミドＤＮＡを持つ形質転換体ＤＫ−ＥＣ６００
（ｐＤＴ６４８）（微工研菌寄第１１０４９号）を１０
０μｇ／mlのアンピシリンを含む４００mlのＬＢ培地で
一晩培養した。培養液から菌体を集菌し、４mg／mlのリ
ゾチームを含む４mlのグルコース溶液（５０ｍＭグルコ
ース，５ｍＭトリス，１０ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）
に懸濁して室温で反応させた。８mlのアルカリＳＤＳ溶
液（０．２Ｎ ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ）および６mlの酢
酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸カリウム；ｐＨ４．８）を順
次添加して穏やかに混和してから氷水中に５分間置い
た。１５，０００rpm で２０分間遠心して沈澱を除去し
た後、１０．８mlのイソプロピルアルコールを添加して
氷中に１０分間静置し、次に１５，０００rpm で２０分
間遠心して上澄みを除去した。８０％エタノール水溶液
を添加して再度遠心した後、減圧下で乾燥した。
ｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙの方法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，９
０）に従って行った。ＤＴＡ遺伝子を保持する組換え体
プラスミドＤＮＡを持つ形質転換体ＤＫ−ＥＣ６００
（ｐＤＴ６４８）（微工研菌寄第１１０４９号）を１０
０μｇ／mlのアンピシリンを含む４００mlのＬＢ培地で
一晩培養した。培養液から菌体を集菌し、４mg／mlのリ
ゾチームを含む４mlのグルコース溶液（５０ｍＭグルコ
ース，５ｍＭトリス，１０ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）
に懸濁して室温で反応させた。８mlのアルカリＳＤＳ溶
液（０．２Ｎ ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ）および６mlの酢
酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸カリウム；ｐＨ４．８）を順
次添加して穏やかに混和してから氷水中に５分間置い
た。１５，０００rpm で２０分間遠心して沈澱を除去し
た後、１０．８mlのイソプロピルアルコールを添加して
氷中に１０分間静置し、次に１５，０００rpm で２０分
間遠心して上澄みを除去した。８０％エタノール水溶液
を添加して再度遠心した後、減圧下で乾燥した。
【００４２】ＴＥ緩衝液１０mlを加えて沈澱ペレットを
静かに溶解してから１０mg／mlエチジウム・ブロマイド
１mlを添加し、これに１０．５ｇの塩化セシウムを加え
て静かに溶解した。この溶液を１２，０００rpm で５分
間遠心して沈澱を除去した後、分離用超遠心機（ロータ
ーＲＰＶ４５Ｔ）を用いて４５，０００rpm で１６〜２
０時間遠心分離した。紫外線照射下で閉環状ＤＮＡを含
む画分１mlを注射器で抜取り、ＮａＣｌ飽和イソプロピ
ルアルコールで少なくとも５回処理してエチジウム・ブ
ロマイドを抽出除去した。
静かに溶解してから１０mg／mlエチジウム・ブロマイド
１mlを添加し、これに１０．５ｇの塩化セシウムを加え
て静かに溶解した。この溶液を１２，０００rpm で５分
間遠心して沈澱を除去した後、分離用超遠心機（ロータ
ーＲＰＶ４５Ｔ）を用いて４５，０００rpm で１６〜２
０時間遠心分離した。紫外線照射下で閉環状ＤＮＡを含
む画分１mlを注射器で抜取り、ＮａＣｌ飽和イソプロピ
ルアルコールで少なくとも５回処理してエチジウム・ブ
ロマイドを抽出除去した。
【００４３】ＴＥ緩衝液２ml、エタノール６mlを順次加
え、−２０℃で１０分間冷却後、１５，０００rpm で２
０分間遠心し、析出・沈澱させた。８０％エタノール水
溶液で洗浄後減圧下に乾燥して４００μリットルのＴＥ
緩衝液に溶解した。ｐＤＴ６４８からＤＴＡ遺伝子を含
む約３．５ＫｂのＳｍａＩ／ＢｇｌII断片を含むＤＮＡ
断片を調製し、エチジウム・ブロマイドを含む１％アガ
ロース・ゲル電気泳動で分離した。目的のＤＮＡ断片を
含むゲルを紫外線照射下で切り出し、常法に従い、ゲル
内部からＤＮＡ断片を抽出・回収した。
え、−２０℃で１０分間冷却後、１５，０００rpm で２
０分間遠心し、析出・沈澱させた。８０％エタノール水
溶液で洗浄後減圧下に乾燥して４００μリットルのＴＥ
緩衝液に溶解した。ｐＤＴ６４８からＤＴＡ遺伝子を含
む約３．５ＫｂのＳｍａＩ／ＢｇｌII断片を含むＤＮＡ
断片を調製し、エチジウム・ブロマイドを含む１％アガ
ロース・ゲル電気泳動で分離した。目的のＤＮＡ断片を
含むゲルを紫外線照射下で切り出し、常法に従い、ゲル
内部からＤＮＡ断片を抽出・回収した。
【００４４】３．５ＫｂのＳｍａＩ／ＢｇｌII断片の一
部を制限酵素で除去したＤＮＡ断片を用いて組換え体Ｄ
ＮＡを作製した。これを導入して得た形質転換体のＤＴ
Ａ活性を調べたところ、ＳｍａＩ／ＥｃｏＴ２２Ｉの約
２．５Ｋｂ上にＤＴＡ遺伝子が局在していることが見い
出された。そこで、代表的な４塩基認識の制限酵素を用
いて詳細な制限酵素切断地図を作製した。そのうちの代
表的な制限酵素切断地図を図１に示す。ＳｍａＩ／Ｅｃ
ｏＴ２２Ｉ ＤＮＡ断片を図１に示した制限酵素で切断
し、Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ法により塩基配
列を決定した。この配列を配列表の配列番号１に示す。
決定した塩基配列は２０５３塩基対からなり、下記する
ようにしてＤＴＡ遺伝子の全領域が含まれていることが
確認された。
部を制限酵素で除去したＤＮＡ断片を用いて組換え体Ｄ
ＮＡを作製した。これを導入して得た形質転換体のＤＴ
Ａ活性を調べたところ、ＳｍａＩ／ＥｃｏＴ２２Ｉの約
２．５Ｋｂ上にＤＴＡ遺伝子が局在していることが見い
出された。そこで、代表的な４塩基認識の制限酵素を用
いて詳細な制限酵素切断地図を作製した。そのうちの代
表的な制限酵素切断地図を図１に示す。ＳｍａＩ／Ｅｃ
ｏＴ２２Ｉ ＤＮＡ断片を図１に示した制限酵素で切断
し、Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ法により塩基配
列を決定した。この配列を配列表の配列番号１に示す。
決定した塩基配列は２０５３塩基対からなり、下記する
ようにしてＤＴＡ遺伝子の全領域が含まれていることが
確認された。
【００４５】塩基配列中には、７５５番目のＡＴＧから
はじまり、１８９２番目のＴＧＡで終わる１１３７塩基
対のＤＴＡに対応するオープンリーディングフレームが
存在する。ＤＴＡのＮ末端アミノ酸を決定するために、
精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を次のようにして決定し
た。ＤＴＡ遺伝子を含む形質転換体ＤＫ−ＸＣ３３１１
（ｐＤＴ６４８）（微工研菌寄第１０９７９号）の培養
菌体を超音波破砕後、１ｍＭ塩化マンガン、０．０１ｍ
ＭＰＬＰを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．
５）中５５℃で３０分間熱処理した。遠心後上澄をＤＥ
ＡＥイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル・パーミ
エーションクロマトグラフィーにより、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動で単一バンドを与えるまで精製し
た。ＤＴＡ活性画分を分取し、逆相カラムクロマトグラ
フィーで単一ピークを与えることを確認した後、プロテ
ィン・シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ４７７Ａ）によりＮ末端の１２個のアミノ酸残基
の配列を決定した。
はじまり、１８９２番目のＴＧＡで終わる１１３７塩基
対のＤＴＡに対応するオープンリーディングフレームが
存在する。ＤＴＡのＮ末端アミノ酸を決定するために、
精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を次のようにして決定し
た。ＤＴＡ遺伝子を含む形質転換体ＤＫ−ＸＣ３３１１
（ｐＤＴ６４８）（微工研菌寄第１０９７９号）の培養
菌体を超音波破砕後、１ｍＭ塩化マンガン、０．０１ｍ
ＭＰＬＰを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．
５）中５５℃で３０分間熱処理した。遠心後上澄をＤＥ
ＡＥイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル・パーミ
エーションクロマトグラフィーにより、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動で単一バンドを与えるまで精製し
た。ＤＴＡ活性画分を分取し、逆相カラムクロマトグラ
フィーで単一ピークを与えることを確認した後、プロテ
ィン・シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ４７７Ａ）によりＮ末端の１２個のアミノ酸残基
の配列を決定した。
【００４６】このアミノ酸配列は、オープン・リーディ
ング・フレームから推定されたＤＴＡのアミノ酸配列中
のＮ末端付近に見い出され、塩基配列上７６７番目から
コードされる１２残基のアミノ酸配列と完全に一致し
た。これにより、ＤＴＡは塩基配列上７６７番目から１
８９１番目までにコードされ、Ｖａｌではじまる、３７
５個のアミノ酸残基からなる分子量３９，３００のタン
パク質であると推定されるが、その分子量はＳＤＳ Ｐ
ＡＧＥにより決定された分子量４２，０００と良好な一
致を示した。
ング・フレームから推定されたＤＴＡのアミノ酸配列中
のＮ末端付近に見い出され、塩基配列上７６７番目から
コードされる１２残基のアミノ酸配列と完全に一致し
た。これにより、ＤＴＡは塩基配列上７６７番目から１
８９１番目までにコードされ、Ｖａｌではじまる、３７
５個のアミノ酸残基からなる分子量３９，３００のタン
パク質であると推定されるが、その分子量はＳＤＳ Ｐ
ＡＧＥにより決定された分子量４２，０００と良好な一
致を示した。
【００４７】実施例２ 組換え体ＤＮＡの作製 塩基配列上６４０番目のＡｌｕＩサイトから１９１１番
目のＳａｌＩサイトまでの約１２７０残基のＤＮＡ断片
をファージベクターＭ１３ｍｐ１８のＳｍａＩサイトと
ＳａｌＩサイトの間に組み換えた。常法に従って調製し
た組換え体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断して平滑末
端化後ＢａｍＨＩリンカー存在下でＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇ
ａｓｅにより連結し、次にそれでもってＪＭ１０９を形
質転換した。常法にしたがって選抜した形質転換体から
調製した組換え体ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで切断して
平滑末端化後ＢｇｌIIリンカー存在下で閉環し、次にこ
うして得られたベクターでＪＭ１０９を再度形質転換し
た。この形質転換体から得られた組換え体ＤＮＡを制限
酵素ＢｇｍＨＩとＢｇｌIIで切断し、エチジウム・ブロ
マイドを含む１％アガロース・ゲル電気泳動で分離し、
約１．２Ｋｂの目的のＤＮＡ断片を含むゲルを紫外線照
射下で切り出した。常法に従い、ゲル内部からＤＮＡ断
片を抽出・回収した。
目のＳａｌＩサイトまでの約１２７０残基のＤＮＡ断片
をファージベクターＭ１３ｍｐ１８のＳｍａＩサイトと
ＳａｌＩサイトの間に組み換えた。常法に従って調製し
た組換え体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断して平滑末
端化後ＢａｍＨＩリンカー存在下でＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇ
ａｓｅにより連結し、次にそれでもってＪＭ１０９を形
質転換した。常法にしたがって選抜した形質転換体から
調製した組換え体ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで切断して
平滑末端化後ＢｇｌIIリンカー存在下で閉環し、次にこ
うして得られたベクターでＪＭ１０９を再度形質転換し
た。この形質転換体から得られた組換え体ＤＮＡを制限
酵素ＢｇｍＨＩとＢｇｌIIで切断し、エチジウム・ブロ
マイドを含む１％アガロース・ゲル電気泳動で分離し、
約１．２Ｋｂの目的のＤＮＡ断片を含むゲルを紫外線照
射下で切り出した。常法に従い、ゲル内部からＤＮＡ断
片を抽出・回収した。
【００４８】プラスミド・ベクターｐＢＲ３２８を制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し、ＣＩＰ（フォスファターゼ
（ベーリンガーマンハイム社製））による脱リン酸化
後、上で調製した１．２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断
片と混合してＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅで連結した。こ
うして得られたベクターで大腸菌Ｃ６００のコンピテン
トセルを形質転換し、この形質転換体から得られた組換
え体ＤＮＡの構造を制限酵素で切断後のＤＮＡの電気泳
動パターンにより確認した。このプラスミドをｐＤＴ６
５１と命名した。
酵素ＢａｍＨＩで切断し、ＣＩＰ（フォスファターゼ
（ベーリンガーマンハイム社製））による脱リン酸化
後、上で調製した１．２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断
片と混合してＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅで連結した。こ
うして得られたベクターで大腸菌Ｃ６００のコンピテン
トセルを形質転換し、この形質転換体から得られた組換
え体ＤＮＡの構造を制限酵素で切断後のＤＮＡの電気泳
動パターンにより確認した。このプラスミドをｐＤＴ６
５１と命名した。
【００４９】実施例３ 複数個の遺伝子を組み込んだ組換え体ＤＮＡ 上で得た形質転換体からプラスミドｐＤＴ６５１を調製
した。ｐＤＴ６５１をＢａｍＨＩで切断、ＣＩＰによる
脱リン酸化後、上で作製したＤＴＡ遺伝子を含む約１．
２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断片を混合後、Ｔ４ＤＮ
Ａ Ｌｉｇａｓｅで連結して大腸菌Ｃ６００のコンピテ
ントセルに形質転換した。
した。ｐＤＴ６５１をＢａｍＨＩで切断、ＣＩＰによる
脱リン酸化後、上で作製したＤＴＡ遺伝子を含む約１．
２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断片を混合後、Ｔ４ＤＮ
Ａ Ｌｉｇａｓｅで連結して大腸菌Ｃ６００のコンピテ
ントセルに形質転換した。
【００５０】得られた組換え体ＤＮＡの構造を、制限酵
素で切断後のＤＮＡの電気泳動パターンにより解析し、
２番目に導入されたＤＴＡ遺伝子が最初に導入されたＤ
ＴＡ遺伝子と同一方向にタンデムに挿入されたものを選
択し、ｐＤＴ６５２と命名した。以下、同様の組換え操
作を繰り返し、ＤＴＡ遺伝子が３個または４個同一方向
にタンデムに挿入された組換え体ＤＮＡを作製し、それ
ぞれｐＤＴ６５３、ｐＤＴ６５４と命名した。
素で切断後のＤＮＡの電気泳動パターンにより解析し、
２番目に導入されたＤＴＡ遺伝子が最初に導入されたＤ
ＴＡ遺伝子と同一方向にタンデムに挿入されたものを選
択し、ｐＤＴ６５２と命名した。以下、同様の組換え操
作を繰り返し、ＤＴＡ遺伝子が３個または４個同一方向
にタンデムに挿入された組換え体ＤＮＡを作製し、それ
ぞれｐＤＴ６５３、ｐＤＴ６５４と命名した。
【００５１】実施例４ ＤＴＡ生産菌の育種 以下、上で作製した組換え体ＤＮＡをキサントモナス属
細菌に移入してＤＴＡ産生株を育種した例を具体的に示
す。宿主菌、キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１
を５０mlのＬＢ培地に接種し、３７℃で２時間４５分培
養した。集菌後直ちに１０mlのコンピテント調製用緩衝
液（５０ｍＭ ＣａＣｌ2 、１０ｍＭ ＲｂＣｌ2 、
０．１Ｍ ＭＯＰＳ；ｐＨ６．５）に懸濁し、氷中３０
分間静置した。遠心によって上澄みを除去後２．５mlの
同一緩衝液に再懸濁し、氷中で３０分間以上静置した。
細菌に移入してＤＴＡ産生株を育種した例を具体的に示
す。宿主菌、キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１
を５０mlのＬＢ培地に接種し、３７℃で２時間４５分培
養した。集菌後直ちに１０mlのコンピテント調製用緩衝
液（５０ｍＭ ＣａＣｌ2 、１０ｍＭ ＲｂＣｌ2 、
０．１Ｍ ＭＯＰＳ；ｐＨ６．５）に懸濁し、氷中３０
分間静置した。遠心によって上澄みを除去後２．５mlの
同一緩衝液に再懸濁し、氷中で３０分間以上静置した。
【００５２】１０μｇのｐＤＴ６５１〜６５４をそれぞ
れ個別に含む微量遠心チューブに１００μリットルの形
質転換緩衝液（１０％ポリエチレングリコール（分子量
１０００）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭＯＰＳ；ｐ
Ｈ７．２）、２００μリットルのコンピテント・セルを
採取し、混合後氷中に３０分間静置した。３７℃の水浴
で２分間加温した後、０．８mlのＬＢ培地を添加し、３
７℃で１時間培養した。５０μｇ／mlのクロラムフェニ
コールを含むＬＢ寒天培地に０．１mlずつ培養液を塗布
し、一昼夜３７℃で培養した。こうしてｐＤＴ６５１，
ｐＤＴ６５２，ｐＤＴ６５３及びｐＤＴ６５４の各ベク
ターをそれぞれ保有する形質転換体を得た。
れ個別に含む微量遠心チューブに１００μリットルの形
質転換緩衝液（１０％ポリエチレングリコール（分子量
１０００）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭＯＰＳ；ｐ
Ｈ７．２）、２００μリットルのコンピテント・セルを
採取し、混合後氷中に３０分間静置した。３７℃の水浴
で２分間加温した後、０．８mlのＬＢ培地を添加し、３
７℃で１時間培養した。５０μｇ／mlのクロラムフェニ
コールを含むＬＢ寒天培地に０．１mlずつ培養液を塗布
し、一昼夜３７℃で培養した。こうしてｐＤＴ６５１，
ｐＤＴ６５２，ｐＤＴ６５３及びｐＤＴ６５４の各ベク
ターをそれぞれ保有する形質転換体を得た。
【００５３】得られたクロラムフェニコール耐性株が目
的のプラスミドを保持していることを確認し、このうち
それぞれ１株をＤＴＡ活性測定に供した。形質転換体を
５０μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１
００mlに接種し、３７℃で一晩培養した。集菌後、活性
測定用緩衝液（０．０１ｍＭ ＰＬＰ、５ｍＭ ＭｎＣ
ｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、０．０１Ｍ トリス；ｐＨ７．０）で
洗浄し凍結乾燥した。凍結乾燥菌体４０mgを同緩衝液１
mlに懸濁し、さらに０．００７８％になるまで希釈し
た。あらかじめ保温しておいた基質溶液（５０ｍＭＤ−
スレオニン、２ｍＭ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、０．０１
ｍＭ ＰＬＰ、０．２Ｍ トリス；ｐＨ７．０）０．２
mlを加えた。
的のプラスミドを保持していることを確認し、このうち
それぞれ１株をＤＴＡ活性測定に供した。形質転換体を
５０μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１
００mlに接種し、３７℃で一晩培養した。集菌後、活性
測定用緩衝液（０．０１ｍＭ ＰＬＰ、５ｍＭ ＭｎＣ
ｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、０．０１Ｍ トリス；ｐＨ７．０）で
洗浄し凍結乾燥した。凍結乾燥菌体４０mgを同緩衝液１
mlに懸濁し、さらに０．００７８％になるまで希釈し
た。あらかじめ保温しておいた基質溶液（５０ｍＭＤ−
スレオニン、２ｍＭ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、０．０１
ｍＭ ＰＬＰ、０．２Ｍ トリス；ｐＨ７．０）０．２
mlを加えた。
【００５４】３０℃で２時間反応させた後、０．４mlの
１Ｎ塩酸を加え反応を停止させた。遠心後上澄み液を
０．２２μのメンブランフィルターで濾過した。各プラ
スミドＤＮＡを持つキサントモナス・シトリーＩＦＯ３
３１１の形質転換体のＤＴＡ活性を、宿主及び遺伝子供
与体と比較して表１に示す。
１Ｎ塩酸を加え反応を停止させた。遠心後上澄み液を
０．２２μのメンブランフィルターで濾過した。各プラ
スミドＤＮＡを持つキサントモナス・シトリーＩＦＯ３
３１１の形質転換体のＤＴＡ活性を、宿主及び遺伝子供
与体と比較して表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】実施例５ ＤＴＡ高生産によるＤ−スレオニンの製造 上で育種したＤＴＡ高生産性の形質転換体を５０μｇ／
mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５００mlに接
種し、３７℃で一晩培養した。集菌後、０．９％食塩水
を加えて洗浄し凍結乾燥した。
mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５００mlに接
種し、３７℃で一晩培養した。集菌後、０．９％食塩水
を加えて洗浄し凍結乾燥した。
【００５７】アセトアルデヒド５０ｍＭ、グリシン５０
ｍＭ、０．１ｍＭ ＰＬＰおよび１０ｍＭメルトカプト
エタノールを含むｐＨ８．０の０．１Ｍトリス塩酸緩衝
液５００mlよりなる基質溶液に上記乾燥菌体１ｇを加え
３０℃で２０時間反応させた。反応終了後、ＤＮＡ供与
体であるキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７およ
び形質転換体ＤＫ−ＸＣ３３１１（ｐＤＴ６４８）と比
較して、溶液中のＤ−スレオニンを定量したところ表２
に示す結果を得た。
ｍＭ、０．１ｍＭ ＰＬＰおよび１０ｍＭメルトカプト
エタノールを含むｐＨ８．０の０．１Ｍトリス塩酸緩衝
液５００mlよりなる基質溶液に上記乾燥菌体１ｇを加え
３０℃で２０時間反応させた。反応終了後、ＤＮＡ供与
体であるキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７およ
び形質転換体ＤＫ−ＸＣ３３１１（ｐＤＴ６４８）と比
較して、溶液中のＤ−スレオニンを定量したところ表２
に示す結果を得た。
【００５８】
【表２】
【００５９】反応液をＨ+ 型のＤｏｗｅｘ５０Ｗ×８を
５００ml充填したカラムに通液し、水洗後０．２Ｎアン
モニアで溶離してスレオニン区分からグリシン区分を分
離した。スレオニン区分を濃縮後活性炭で脱色し、脱色
液にエタノールを添加して結晶を得た。この結晶につい
てＮＭＲ、赤外線吸収スペクトル、元素分析、及び比旋
光度を測定して、この結晶がＤ−スレオニンであること
を確認した。また、ストレプトコッカス・ハエカリスＩ
ＦＯ３１８１を用いたバイオ・アッセイ法により、反応
液中にはＬ−体がまったく含まれていないことを確認し
た。
５００ml充填したカラムに通液し、水洗後０．２Ｎアン
モニアで溶離してスレオニン区分からグリシン区分を分
離した。スレオニン区分を濃縮後活性炭で脱色し、脱色
液にエタノールを添加して結晶を得た。この結晶につい
てＮＭＲ、赤外線吸収スペクトル、元素分析、及び比旋
光度を測定して、この結晶がＤ−スレオニンであること
を確認した。また、ストレプトコッカス・ハエカリスＩ
ＦＯ３１８１を用いたバイオ・アッセイ法により、反応
液中にはＬ−体がまったく含まれていないことを確認し
た。
【００６０】
【発明の効果】微生物より単離したＤＴＡ産生遺伝子を
含むＤＮＡの塩基配列を解析することにより、ＤＴＡ産
生に必要で、ベクターに組み込むための遺伝子断片を大
幅に小型化するとともに、複数個の遺伝子のベクターへ
の導入を可能にした。これにより、形質転換体の生育及
び導入した組換え体ＤＮＡの安定性を向上せしめるとと
もにＤＴＡの生産性をも大幅に改善せしめることができ
た。
含むＤＮＡの塩基配列を解析することにより、ＤＴＡ産
生に必要で、ベクターに組み込むための遺伝子断片を大
幅に小型化するとともに、複数個の遺伝子のベクターへ
の導入を可能にした。これにより、形質転換体の生育及
び導入した組換え体ＤＮＡの安定性を向上せしめるとと
もにＤＴＡの生産性をも大幅に改善せしめることができ
た。
【配列表】
【図１】ＤＴＡ遺伝子を有するＳｍａｌ−ＥｃｏＴ２２
１断片の制限酵素地図の代表例を示す。
１断片の制限酵素地図の代表例を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:64） (72)発明者 三好 照三 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気 化学工業株式会社総合研究所内 (56)参考文献 特開 平３−139283（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (11)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に示した塩基配列か
らなる請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで
なる組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列表の配列番号１に示した塩基配列か
らなるＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換えＤＮＡ
である請求項３記載の組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡあるいは配列表の配列番
号１に示した塩基配列からなるＤＮＡを複数個ベクター
に組み込んでなる請求項３記載の組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで
なる組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換
体。 - 【請求項７】 請求項４または５のいずれかに記載の組
換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体である
請求項６記載の形質転換体。 - 【請求項８】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで
なる組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体
を培養し、次に得られたＤ−スレオニンアルドラーゼを
採取することを特徴とするＤ−スレオニンアルドラーゼ
の製造法。 - 【請求項９】 該形質転換体が請求項７記載のものであ
る請求項８記載の製造法。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸
配列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込ん
でなる組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換
体あるいはその形質転換体処理物を、グリシン及びアル
デヒド化合物と反応せしめ、生成したＤ−β−ヒドロキ
シアミノ酸を採取することを特徴とするＤ−β−ヒドロ
キシアミノ酸の製造法。 - 【請求項１１】 該形質転換体が請求項７記載のもので
ある請求項１０記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15620291A JP3174355B2 (ja) | 1991-05-31 | 1991-05-31 | Ｄｔａ遺伝子の塩基配列及びその利用法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15620291A JP3174355B2 (ja) | 1991-05-31 | 1991-05-31 | Ｄｔａ遺伝子の塩基配列及びその利用法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05168484A JPH05168484A (ja) | 1993-07-02 |
| JP3174355B2 true JP3174355B2 (ja) | 2001-06-11 |
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ID=15622603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15620291A Expired - Fee Related JP3174355B2 (ja) | 1991-05-31 | 1991-05-31 | Ｄｔａ遺伝子の塩基配列及びその利用法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3174355B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE05793824T1 (de) | 2004-10-13 | 2008-02-07 | Mitsui Chemicals, Inc. | Für ein neuartiges enzymmit d-serin-synthaseaktivität codierende dna, verfahren zur herstellung dessenzyms und verfahren zur herstellung von d-serin unter verwendung davon |
-
1991
- 1991-05-31 JP JP15620291A patent/JP3174355B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05168484A (ja) | 1993-07-02 |
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