JP3192128B2 - ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症の遺伝子診断法 - Google Patents
ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症の遺伝子診断法Info
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- JP3192128B2 JP3192128B2 JP08437399A JP8437399A JP3192128B2 JP 3192128 B2 JP3192128 B2 JP 3192128B2 JP 08437399 A JP08437399 A JP 08437399A JP 8437399 A JP8437399 A JP 8437399A JP 3192128 B2 JP3192128 B2 JP 3192128B2
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- Japan
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- claudin
- bovine
- gene
- deficiency
- seq
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウシのClaudin-16
欠損症の遺伝子診断法（又は検出方法）に関する。
欠損症の遺伝子診断法（又は検出方法）に関する。
【０００２】
【発明に関わる語句の定義】本明細書において、「Clau
din-16」はClaudin-16遺伝子が転写され翻訳されて生成
したタンパク質を意味し、「Claudin-16遺伝子」はClau
din-16をコードしている翻訳領域のエクソン部分、隣接
している非翻訳領域のエクソン部分、それらのイントロ
ン部分、該遺伝子の発現の制御に関わる領域に加え、本
疾患に関連する変異部分が含まれるDNAの領域を意味す
る。
din-16」はClaudin-16遺伝子が転写され翻訳されて生成
したタンパク質を意味し、「Claudin-16遺伝子」はClau
din-16をコードしている翻訳領域のエクソン部分、隣接
している非翻訳領域のエクソン部分、それらのイントロ
ン部分、該遺伝子の発現の制御に関わる領域に加え、本
疾患に関連する変異部分が含まれるDNAの領域を意味す
る。
【０００３】
【従来の技術】Claudin-16欠損症は、先天性腎尿細管形
成不全を主徴とする常染色体性劣性遺伝病であり、臨床
的には発育不良、背湾姿勢、過長蹄などを呈し、生化学
的特徴として血液中のBUN（尿素態窒素）値及びクレア
チニン値の高い疾患である。本疾患は、和牛においては
1991年以降発生が認められているが、ヒトにおいて同様
な疾患の報告は無い。Claudin-16欠損症を発症したウシ
は、血液中のBUN値及びクレアチニン値の異常な高さを
伴う発育不良として発見することができる。しかし、一
方の染色体上にのみ異常に関連した遺伝子を有するヘテ
ロ接合体であるウシ、すなわち遺伝的にClaudin-16欠損
症のキャリアーであるウシについてはその異常を知るこ
とが難しい。したがって見かけ上は異常の認められない
ウシ同士を交配させた場合でも生まれてくる子牛に異常
が現れることがあり、本疾患の発生を未然に防ぐ上では
問題を有している。
成不全を主徴とする常染色体性劣性遺伝病であり、臨床
的には発育不良、背湾姿勢、過長蹄などを呈し、生化学
的特徴として血液中のBUN（尿素態窒素）値及びクレア
チニン値の高い疾患である。本疾患は、和牛においては
1991年以降発生が認められているが、ヒトにおいて同様
な疾患の報告は無い。Claudin-16欠損症を発症したウシ
は、血液中のBUN値及びクレアチニン値の異常な高さを
伴う発育不良として発見することができる。しかし、一
方の染色体上にのみ異常に関連した遺伝子を有するヘテ
ロ接合体であるウシ、すなわち遺伝的にClaudin-16欠損
症のキャリアーであるウシについてはその異常を知るこ
とが難しい。したがって見かけ上は異常の認められない
ウシ同士を交配させた場合でも生まれてくる子牛に異常
が現れることがあり、本疾患の発生を未然に防ぐ上では
問題を有している。
【０００４】
【発明が解決しようとしている課題】ウシのClaudin-16
欠損症を予防する手段の1つとして、ヘテロ接合体同士
の交配を避けるという方法が考えられる。そのためには
ウシのClaudin-16欠損症の診断を遺伝子レベルで行い、
疾患遺伝子のキャリアーを早急に見つけだす必要があ
る。異常を持つウシの疾患遺伝子が正常なものに比べて
どのように変異しているかを明らかにし、様々な遺伝子
工学的手法により変異遺伝子を迅速に検出できる手段を
得ることができれば、このような遺伝子診断法を確立す
ることができる。したがって、本発明の目的はウシのCl
audin-16欠損症の遺伝子診断法（遺伝子検出法）を提供
することである。これにより、Claudin-16欠損症のキャ
リアーをスクリーニングすることによって今後の本疾患
の発生を未然に防ぐことができる。
欠損症を予防する手段の1つとして、ヘテロ接合体同士
の交配を避けるという方法が考えられる。そのためには
ウシのClaudin-16欠損症の診断を遺伝子レベルで行い、
疾患遺伝子のキャリアーを早急に見つけだす必要があ
る。異常を持つウシの疾患遺伝子が正常なものに比べて
どのように変異しているかを明らかにし、様々な遺伝子
工学的手法により変異遺伝子を迅速に検出できる手段を
得ることができれば、このような遺伝子診断法を確立す
ることができる。したがって、本発明の目的はウシのCl
audin-16欠損症の遺伝子診断法（遺伝子検出法）を提供
することである。これにより、Claudin-16欠損症のキャ
リアーをスクリーニングすることによって今後の本疾患
の発生を未然に防ぐことができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために研究を重ねた結果、本疾患と密接に関
連する約30 kbに及ぶDNAの欠損を見出し、この領域に存
在する新規の遺伝子を同定することに成功した。この遺
伝子の構造は、最近、マウスで報告されているClaudin
遺伝子ファミリー（M. Furuse et al., J. Cell Biol.,
141, 1539-1550(1998); K. Morita et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 96, 511-516 (1999)）と類似して
いたため、Claudin-16と命名した。さらに、本発明者ら
は、DNAの欠損という変異によりClaudin-16遺伝子が発
現していないことが本疾患の原因であることを見出し、
該遺伝子上に設定した特定のオリゴヌクレオチドプライ
マーを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR
（ポリメラーゼ連鎖反応）法により、かかる変異が検出
されることを見出し、本発明を完成するに至った。
を達成するために研究を重ねた結果、本疾患と密接に関
連する約30 kbに及ぶDNAの欠損を見出し、この領域に存
在する新規の遺伝子を同定することに成功した。この遺
伝子の構造は、最近、マウスで報告されているClaudin
遺伝子ファミリー（M. Furuse et al., J. Cell Biol.,
141, 1539-1550(1998); K. Morita et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 96, 511-516 (1999)）と類似して
いたため、Claudin-16と命名した。さらに、本発明者ら
は、DNAの欠損という変異によりClaudin-16遺伝子が発
現していないことが本疾患の原因であることを見出し、
該遺伝子上に設定した特定のオリゴヌクレオチドプライ
マーを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR
（ポリメラーゼ連鎖反応）法により、かかる変異が検出
されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明の要旨は、 （１）工程（a）：ウシの核酸試料を得る工程、 工程（b）：工程（a）にて得られた核酸試料を遺伝子増
幅反応に付して、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる
変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、
及び 工程（c）：工程（b）の核酸断片について変異の存在を
調べる工程、を含むウシのClaudin-16欠損症の遺伝子診
断法であって、変異部位を含む領域がウシClaudin-16遺
伝子の塩基配列中、配列表の配列番号：1に示される塩
基配列の1〜629位を含む領域である、ウシのClaudin-16
欠損症の遺伝子診断法。 （２）遺伝子増幅反応が、PCR法によって行われるもの
である、前記（１）に記載の遺伝子診断法。（３）変異の存在をPCR増幅により調べることを特徴と
する前記（１）〜（２）のいずれかに記載の遺伝子診断
法。 （４）核酸試料がゲノミックDNA、cDNA、又はmRNAを含
む試料である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺
伝子診断法。
幅反応に付して、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる
変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、
及び 工程（c）：工程（b）の核酸断片について変異の存在を
調べる工程、を含むウシのClaudin-16欠損症の遺伝子診
断法であって、変異部位を含む領域がウシClaudin-16遺
伝子の塩基配列中、配列表の配列番号：1に示される塩
基配列の1〜629位を含む領域である、ウシのClaudin-16
欠損症の遺伝子診断法。 （２）遺伝子増幅反応が、PCR法によって行われるもの
である、前記（１）に記載の遺伝子診断法。（３）変異の存在をPCR増幅により調べることを特徴と
する前記（１）〜（２）のいずれかに記載の遺伝子診断
法。 （４）核酸試料がゲノミックDNA、cDNA、又はmRNAを含
む試料である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺
伝子診断法。
【０００７】別の態様では、本発明は、 （５）ウシのClaudin-16欠損症を検出するためのキット
であって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部
位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用
されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、
しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、(ａ)配
列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５'末
端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド及び (ｂ)配列表の配列番号：１に示された塩基配列
のうちの３'末端の領域に対する相補塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものである
ことを特徴とする、ウシのClaudin-16欠損症を検出する
ためのキット。 （６）ウシのClaudin-16欠損症を検出するためのキット
であって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部
位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用
されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、
該オリゴヌクレオチドプライマーが、(1)配列表の配列
番号：１に示された塩基配列のうちの５'末端の領域に
相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び (2)
配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３'
末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドからなる群から選ばれたものであって、しかも該
オリゴヌクレオチドプライマーは、15〜35個のヌクレオ
チドからなるものであることを特徴とする、ウシのClau
din-16欠損症を検出するためのキット。 （７）ウシのClaudin-16欠損症を検出するためのキット
であって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部
位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用
されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、
しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表
の配列番号2〜7に示されたものからなる群から選ばれた
ものであることを特徴とする、ウシのClaudin-16欠損症
を検出するためのキット。
であって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部
位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用
されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、
しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、(ａ)配
列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５'末
端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド及び (ｂ)配列表の配列番号：１に示された塩基配列
のうちの３'末端の領域に対する相補塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものである
ことを特徴とする、ウシのClaudin-16欠損症を検出する
ためのキット。 （６）ウシのClaudin-16欠損症を検出するためのキット
であって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部
位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用
されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、
該オリゴヌクレオチドプライマーが、(1)配列表の配列
番号：１に示された塩基配列のうちの５'末端の領域に
相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び (2)
配列表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの３'
末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドからなる群から選ばれたものであって、しかも該
オリゴヌクレオチドプライマーは、15〜35個のヌクレオ
チドからなるものであることを特徴とする、ウシのClau
din-16欠損症を検出するためのキット。 （７）ウシのClaudin-16欠損症を検出するためのキット
であって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部
位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用
されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、
しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表
の配列番号2〜7に示されたものからなる群から選ばれた
ものであることを特徴とする、ウシのClaudin-16欠損症
を検出するためのキット。
【０００８】（８）ウシClaudin-16遺伝子及びウシClau
din-16欠損症の遺伝子に対応するヌクレオチド配列又は
その相補鎖の全体又はその一部であって、 (a)配列表の配列番号：1で示されたヌクレオチド配列又
はその相補鎖の全体又はその一部、 (b)前記配列(a)とハイブリッド形成し、PCRによりウシ
のClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を
遺伝子増幅するのに利用できる一切の配列、 (c)遺伝子コードの縮退のために前記配列(a)及び(b)か
ら派生した配列からなる群から選ばれたものであること
を特徴とする配列。 （９）配列表の配列番号：1で示されたヌクレオチド配
列又はその相補鎖の全体又はその一部を含むことを特徴
とするヌクレオチド配列。 （１０）ゲノミックDNA配列、cDNA配列、RNA配列、ハイ
ブリッド配列、合成配列、及び半合成配列からなる群か
ら選ばれたものであることを特徴とする上記（８）〜
（９）のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
din-16欠損症の遺伝子に対応するヌクレオチド配列又は
その相補鎖の全体又はその一部であって、 (a)配列表の配列番号：1で示されたヌクレオチド配列又
はその相補鎖の全体又はその一部、 (b)前記配列(a)とハイブリッド形成し、PCRによりウシ
のClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を
遺伝子増幅するのに利用できる一切の配列、 (c)遺伝子コードの縮退のために前記配列(a)及び(b)か
ら派生した配列からなる群から選ばれたものであること
を特徴とする配列。 （９）配列表の配列番号：1で示されたヌクレオチド配
列又はその相補鎖の全体又はその一部を含むことを特徴
とするヌクレオチド配列。 （１０）ゲノミックDNA配列、cDNA配列、RNA配列、ハイ
ブリッド配列、合成配列、及び半合成配列からなる群か
ら選ばれたものであることを特徴とする上記（８）〜
（９）のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【０００９】（１１）上記（８）〜（９）のいずれか一
記載の配列又は対応するmRNAとハイブリッド形成できる
ことを特徴とするヌクレオチドプローブ。 （１２）ウシClaudin-16欠損症を検出するため、ウシの
Claudin-16遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列を明
らかにしたり、及び／又は、単離するための用途の、上
記（１１）記載のヌクレオチドプローブ。 （１３）上記（１１）に記載のヌクレオチドプローブを
用いてウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部位を
含む配列を明らかにしたり、及び／又は、単離する工程
を有することを特徴とする、ウシClaudin-16欠損症の検
出方法。 （１４）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のオリゴ
ヌクレオチドプライマー。 （１５）上記（１４）記載のオリゴヌクレオチドプライ
マーを含有することを特徴とするウシのClaudin-16欠損
症用遺伝子診断試薬。
記載の配列又は対応するmRNAとハイブリッド形成できる
ことを特徴とするヌクレオチドプローブ。 （１２）ウシClaudin-16欠損症を検出するため、ウシの
Claudin-16遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列を明
らかにしたり、及び／又は、単離するための用途の、上
記（１１）記載のヌクレオチドプローブ。 （１３）上記（１１）に記載のヌクレオチドプローブを
用いてウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる変異部位を
含む配列を明らかにしたり、及び／又は、単離する工程
を有することを特徴とする、ウシClaudin-16欠損症の検
出方法。 （１４）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のオリゴ
ヌクレオチドプライマー。 （１５）上記（１４）記載のオリゴヌクレオチドプライ
マーを含有することを特徴とするウシのClaudin-16欠損
症用遺伝子診断試薬。
【００１０】本発明の目的、特徴、利点及びそのアイデ
アは、本明細書の記載により当業者には明らかであろ
う。以下の発明の実施の形態の項の記載及び具体的な実
施例などの記載は、本発明の好ましい態様を示すもので
あり、説明のためにのみここにおいて示されているもの
であることは理解されるべきであり、本明細書で開示さ
れている本発明の意図並びに範囲内で様々な改変並びに
修飾が、それらの記載に基づいて当業者に容易に明らか
になるであろう。
アは、本明細書の記載により当業者には明らかであろ
う。以下の発明の実施の形態の項の記載及び具体的な実
施例などの記載は、本発明の好ましい態様を示すもので
あり、説明のためにのみここにおいて示されているもの
であることは理解されるべきであり、本明細書で開示さ
れている本発明の意図並びに範囲内で様々な改変並びに
修飾が、それらの記載に基づいて当業者に容易に明らか
になるであろう。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
ウシClaudin-16欠損症の遺伝子診断法（検出方法）の確
立：後述のように、ウシClaudin-16欠損症の原因となる
遺伝子上の変異が解明され（図1）、この変異を利用し
て該疾患の検出を行うことができる。具体的なウシClau
din-16欠損症の遺伝子診断法（検出方法）としては、次
のような工程を含む様態が例示される。すなわち、 工程（a）：ウシの核酸試料を得る工程、 工程（b）：工程（a）にて得られた核酸試料を遺伝子増
幅反応に付して、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる
変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、
及び 工程（c）：行程（b）の核酸断片について変異の存在を
調べる工程、 である。
ウシClaudin-16欠損症の遺伝子診断法（検出方法）の確
立：後述のように、ウシClaudin-16欠損症の原因となる
遺伝子上の変異が解明され（図1）、この変異を利用し
て該疾患の検出を行うことができる。具体的なウシClau
din-16欠損症の遺伝子診断法（検出方法）としては、次
のような工程を含む様態が例示される。すなわち、 工程（a）：ウシの核酸試料を得る工程、 工程（b）：工程（a）にて得られた核酸試料を遺伝子増
幅反応に付して、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる
変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、
及び 工程（c）：行程（b）の核酸断片について変異の存在を
調べる工程、 である。
【００１２】第1に、工程（a）について述べる。本発明
に用いられるウシの核酸試料としては、Claudin-16をコ
ードするヌクレオチド配列を有するものであれば特に限
定されるものではなく、適当な細胞又は組織由来の核酸
（全ゲノムDNA及び細胞の全RNAから転写されたcDNAを包
含する）、例えば、ゲノミックDNA、cDNA、mRNA等があ
げられる。ウシの核酸試料の調整は、公知の方法、例え
ばMolecular cloning,a laboratory manual (2nd editi
on)（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (E
d.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
New York (1989)）に記載の方法により行うことができ
る。
に用いられるウシの核酸試料としては、Claudin-16をコ
ードするヌクレオチド配列を有するものであれば特に限
定されるものではなく、適当な細胞又は組織由来の核酸
（全ゲノムDNA及び細胞の全RNAから転写されたcDNAを包
含する）、例えば、ゲノミックDNA、cDNA、mRNA等があ
げられる。ウシの核酸試料の調整は、公知の方法、例え
ばMolecular cloning,a laboratory manual (2nd editi
on)（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (E
d.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
New York (1989)）に記載の方法により行うことができ
る。
【００１３】第2に、工程（b）について述べる。工程
（a）で得られた核酸試料及び適当なプライマーを用い
て、ウシClaudin-16遺伝子に存在しうる変位部位を含む
領域が増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。
本工程で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該
領域を増幅できる方法であれば特に限定されないが、PC
R法、RNAポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増
幅法のような核酸増幅法を利用することができる。なか
でもPCR法が好ましく用いられる。増幅の対象となる、
変異部位を含む領域としては、ウシClaudin-16遺伝子の
塩基配列のうち、ウシClaudin-16欠損症の原因となる変
異を含んでいる領域であれば特に限定されず、例えば、
配列表の配列番号：1に示される塩基配列の中の1〜629
位を含む領域が挙げられる。
（a）で得られた核酸試料及び適当なプライマーを用い
て、ウシClaudin-16遺伝子に存在しうる変位部位を含む
領域が増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。
本工程で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該
領域を増幅できる方法であれば特に限定されないが、PC
R法、RNAポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増
幅法のような核酸増幅法を利用することができる。なか
でもPCR法が好ましく用いられる。増幅の対象となる、
変異部位を含む領域としては、ウシClaudin-16遺伝子の
塩基配列のうち、ウシClaudin-16欠損症の原因となる変
異を含んでいる領域であれば特に限定されず、例えば、
配列表の配列番号：1に示される塩基配列の中の1〜629
位を含む領域が挙げられる。
【００１４】本明細書中、「ポリメラーゼ連鎖反応」又
は「PCR」とは、一般的に、米国特許第4683195号明細書
に記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレ
オチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法
を指している。一般に、PCR法は、鋳型核酸と優先的に
ハイブリダイズすることのできる2個のオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行う
ところのサイクルを繰り返し行うことを含むものであ
る。典型的には、PCR法で用いられるプライマーは、鋳
型内部の増殖されるべきヌクレオチド配列に対して相補
的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅
されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的
であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列
に隣接しているものを好ましく使用され得る。
は「PCR」とは、一般的に、米国特許第4683195号明細書
に記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレ
オチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法
を指している。一般に、PCR法は、鋳型核酸と優先的に
ハイブリダイズすることのできる2個のオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行う
ところのサイクルを繰り返し行うことを含むものであ
る。典型的には、PCR法で用いられるプライマーは、鋳
型内部の増殖されるべきヌクレオチド配列に対して相補
的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅
されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的
であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列
に隣接しているものを好ましく使用され得る。
【００１５】PCR法は、M. A. Innis, D. M. Gelfaud,
J. J. Snindky, & T. J. White (Ed.), PCR protocols:
a guide to methods and applications, Academic Pre
ss, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Qui
rke & G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approac
h, IRL Press, Oxford (1991); R. K. Saiki et al.,Sc
ience, 239, 487-491 (1988); M. A. Frohman et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)な
どに記載の方法あるいはそれを修飾したり、改変した方
法により行うことができる。また、PCR法は、それに適
した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造
業者あるいはキット販売業者により明らかにされている
プロトコールに従って実施することもできる。
J. J. Snindky, & T. J. White (Ed.), PCR protocols:
a guide to methods and applications, Academic Pre
ss, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Qui
rke & G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approac
h, IRL Press, Oxford (1991); R. K. Saiki et al.,Sc
ience, 239, 487-491 (1988); M. A. Frohman et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)な
どに記載の方法あるいはそれを修飾したり、改変した方
法により行うことができる。また、PCR法は、それに適
した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造
業者あるいはキット販売業者により明らかにされている
プロトコールに従って実施することもできる。
【００１６】本明細書中、「オリゴヌクレオチド」と
は、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド
で、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、
Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p. 716-734
(1989)に記載されているような既知の方法、例えば、ト
リエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、
ホスホネート法などの方法により化学合成されることが
できる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を
便利に行うことができることが知られており、例えば、
自動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置
は市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又は
それ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例え
ば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基ある
いはトリチル化された塩基などを含有していてよい。
は、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド
で、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、
Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p. 716-734
(1989)に記載されているような既知の方法、例えば、ト
リエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、
ホスホネート法などの方法により化学合成されることが
できる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を
便利に行うことができることが知られており、例えば、
自動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置
は市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又は
それ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例え
ば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基ある
いはトリチル化された塩基などを含有していてよい。
【００１７】PCR法で用いるプライマーとしては、上記
の変異部位を含むDNA断片を増幅できるものであれば、
特に限定されない。代表的には、プライマーは(a)配列
表の配列番号：1に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号：1に示された塩基配列のうちの任
意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを使用することができ、より好ましくは(1)配列表
の配列番号：1に示された塩基配列のうちの5'端側の任
意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド及び(2)配列表の配列番号：1に示された塩基配列のう
ちの3'端側の任意の領域に対する相補塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドを使用することができ、例えば、3
〜100個、好ましくは10〜50個、さらに好ましくは15〜3
5個のヌクレオチドを含有するものが挙げられる。ま
た、PCR条件も特に限定されず、通常行われる公知の条
件でよく、例えば、上記した文献の記載を参考に選択す
ることができる。PCRにおいては、DNA鎖の熱変性、プラ
イマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の
合成からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好
ましくは20〜35回、より好ましくは25〜30回繰り返して
行われる。
の変異部位を含むDNA断片を増幅できるものであれば、
特に限定されない。代表的には、プライマーは(a)配列
表の配列番号：1に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号：1に示された塩基配列のうちの任
意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを使用することができ、より好ましくは(1)配列表
の配列番号：1に示された塩基配列のうちの5'端側の任
意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド及び(2)配列表の配列番号：1に示された塩基配列のう
ちの3'端側の任意の領域に対する相補塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドを使用することができ、例えば、3
〜100個、好ましくは10〜50個、さらに好ましくは15〜3
5個のヌクレオチドを含有するものが挙げられる。ま
た、PCR条件も特に限定されず、通常行われる公知の条
件でよく、例えば、上記した文献の記載を参考に選択す
ることができる。PCRにおいては、DNA鎖の熱変性、プラ
イマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の
合成からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好
ましくは20〜35回、より好ましくは25〜30回繰り返して
行われる。
【００１８】第3に、工程（c）について述べる。本工程
において、工程（b）で得られる核酸断片について変異
の存在が調べられる。変異の存在の検出方法としては、
特に限定されないが、PCR法により得られたDNA断片長を
調べることにより検出される。DNA断片長を調べる方法
は特に限定されないが、ポリアクリルアミド又はアガロ
ースゲル上の電気泳動によりDNA断片を分離し、例え
ば、既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度に
対してのそれの移動度に基づいて、目的のDNA断片を同
定する方法が好まれる。
において、工程（b）で得られる核酸断片について変異
の存在が調べられる。変異の存在の検出方法としては、
特に限定されないが、PCR法により得られたDNA断片長を
調べることにより検出される。DNA断片長を調べる方法
は特に限定されないが、ポリアクリルアミド又はアガロ
ースゲル上の電気泳動によりDNA断片を分離し、例え
ば、既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度に
対してのそれの移動度に基づいて、目的のDNA断片を同
定する方法が好まれる。
【００１９】上記以外の検出法としては、前記に例示さ
れた態様の工程（c）をその他の変異検出方法に変更し
た方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む
適当なDNA断片をプローブに用いるハイブリダイゼーシ
ョン法のような公知の変異検出方法が使用できる。さら
に、増幅されたDNAを適当なベクターにクローニングし
て塩基配列を決定する方法や、あるいは増幅断片そのも
のを鋳型としてその塩基配列を決定する方法によっても
変異の検出を行うことができる。
れた態様の工程（c）をその他の変異検出方法に変更し
た方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む
適当なDNA断片をプローブに用いるハイブリダイゼーシ
ョン法のような公知の変異検出方法が使用できる。さら
に、増幅されたDNAを適当なベクターにクローニングし
て塩基配列を決定する方法や、あるいは増幅断片そのも
のを鋳型としてその塩基配列を決定する方法によっても
変異の検出を行うことができる。
【００２０】オリゴヌクレオチドやプローブなどは、検
出を容易にするためのラベル成分により標識されている
ことができる。該ラベル成分は、分光学的手段、光学的
手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、
放射化学的手段などにより検出できるものであることが
できる。ラベル成分の例としては、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、３２Ｐなどの放
射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光
物質、発色物質などが挙げられる。
出を容易にするためのラベル成分により標識されている
ことができる。該ラベル成分は、分光学的手段、光学的
手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、
放射化学的手段などにより検出できるものであることが
できる。ラベル成分の例としては、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、３２Ｐなどの放
射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光
物質、発色物質などが挙げられる。
【００２１】本発明のウシClaudin-16欠損症の遺伝子診
断法（検出方法）により、Claudin-16欠損症を発病して
いるウシのみならず、Claudin-16欠損症のキャリアーの
ウシについても検出し、診断することができる。従っ
て、本発明でいうウシClaudin-16欠損症とは、遺伝子的
に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、また
キャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
断法（検出方法）により、Claudin-16欠損症を発病して
いるウシのみならず、Claudin-16欠損症のキャリアーの
ウシについても検出し、診断することができる。従っ
て、本発明でいうウシClaudin-16欠損症とは、遺伝子的
に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、また
キャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
【００２２】正常ウシ及びClaudin-16欠損症発症ウシの
Claudin-16遺伝子の解析：遺伝子上の変異と本疾患との
関連を調べるために、まず正常なウシのClaudin-16をコ
ードする遺伝子（cDNA）を単離し、その塩基配列を明ら
かにする。該遺伝子が単離された例はこれまで報告され
ていないが、本発明者らは、本疾患牛を含む家系のゲノ
ム連鎖解析を行い、ポジショナルクローニング法と云わ
れる手法を用いてウシClaudin-16遺伝子を単離した。
Claudin-16遺伝子の解析：遺伝子上の変異と本疾患との
関連を調べるために、まず正常なウシのClaudin-16をコ
ードする遺伝子（cDNA）を単離し、その塩基配列を明ら
かにする。該遺伝子が単離された例はこれまで報告され
ていないが、本発明者らは、本疾患牛を含む家系のゲノ
ム連鎖解析を行い、ポジショナルクローニング法と云わ
れる手法を用いてウシClaudin-16遺伝子を単離した。
【００２３】次に、得られた正常ウシのClaudin-16をコ
ードするcDNAの全塩基配列を配列表の配列番号：1に示
す。DNA断片の塩基配列の決定（シークエンシング）
は、化学分解法（Maxam & Gilbert法）、チェーンター
ミネーター法（Sangerジデオキシ法）などにより行うこ
とができる。
ードするcDNAの全塩基配列を配列表の配列番号：1に示
す。DNA断片の塩基配列の決定（シークエンシング）
は、化学分解法（Maxam & Gilbert法）、チェーンター
ミネーター法（Sangerジデオキシ法）などにより行うこ
とができる。
【００２４】Claudin-16欠損症の原因となる遺伝子上の
変異は、正常ウシ及び発症ウシのClaudin-16遺伝子の塩
基配列を比較することによって明らかにすることができ
る。すなわち、前記の正常ウシの場合と同様に発症ウシ
のClaudin-16遺伝子の塩基配列を調べ、これを正常ウシ
遺伝子と比較することにより、該疾患の原因である変異
を確認することができる。
変異は、正常ウシ及び発症ウシのClaudin-16遺伝子の塩
基配列を比較することによって明らかにすることができ
る。すなわち、前記の正常ウシの場合と同様に発症ウシ
のClaudin-16遺伝子の塩基配列を調べ、これを正常ウシ
遺伝子と比較することにより、該疾患の原因である変異
を確認することができる。
【００２５】本発明ではClaudin-16欠損症ウシのClaudi
n-16遺伝子上では配列表の配列番号：1に示される正常
ウシのClaudin-16遺伝子上のClaudin-16をコードする翻
訳領域の塩基配列のうち、1〜629位の部分が欠損する変
異を見出した（図1）。
n-16遺伝子上では配列表の配列番号：1に示される正常
ウシのClaudin-16遺伝子上のClaudin-16をコードする翻
訳領域の塩基配列のうち、1〜629位の部分が欠損する変
異を見出した（図1）。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例、実験例をもってさら
に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定され
るものでばない。以下の記載では、特に説明がない場合
には、D. M. Glover & B. D. Hames (Ed.), DNA Clonin
g 1, Core Techniques (2nd edition), A Practical Ap
proach, Oxford University Press, Oxford (1995); J.
Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Mole
cular cloning, a laboratory manual (2nd edition),
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New
York (1989); M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Sni
ndky & T. J.White (Ed.), PCR protocols: a guide to
methods and applications, Academic Press, Inc., N
ew York (1990); M. J. McPherson, P. Quirke & G. R.
Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Pres
s, Oxford (1991)に記載の方法あるいはそれを修飾した
り、改変した方法により行われている。また、市販の試
薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が
無い場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って
行ってある。
に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定され
るものでばない。以下の記載では、特に説明がない場合
には、D. M. Glover & B. D. Hames (Ed.), DNA Clonin
g 1, Core Techniques (2nd edition), A Practical Ap
proach, Oxford University Press, Oxford (1995); J.
Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Mole
cular cloning, a laboratory manual (2nd edition),
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New
York (1989); M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Sni
ndky & T. J.White (Ed.), PCR protocols: a guide to
methods and applications, Academic Press, Inc., N
ew York (1990); M. J. McPherson, P. Quirke & G. R.
Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Pres
s, Oxford (1991)に記載の方法あるいはそれを修飾した
り、改変した方法により行われている。また、市販の試
薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が
無い場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って
行ってある。
【００２７】［実験例１］ (1) 正常ウシClaudin-16遺伝子の塩基配列の決定 まず正常ウシ（和牛）より採取した新鮮な腎臓を材料と
し、RNA調製用試薬であるトリゾール（Gibco-BRL社製）
を使用して全RNAを調製した。得られた全RNAにオリゴ(d
T)nセルロース（社製）を加え、ポリAを含むRNA画分を
分離し、mRNA画分とした。このmRNA画分を鋳型に用い、
スーパースクリプトcDNA合成キット（Gibco-BRL社製）
を使用してcDNAを合成した。上記cDNAから、Uni-ZAPのc
DNAライブラリー合成キット（STRATAGENE社製）を用い
てcDNAライブラリーを合成した。
し、RNA調製用試薬であるトリゾール（Gibco-BRL社製）
を使用して全RNAを調製した。得られた全RNAにオリゴ(d
T)nセルロース（社製）を加え、ポリAを含むRNA画分を
分離し、mRNA画分とした。このmRNA画分を鋳型に用い、
スーパースクリプトcDNA合成キット（Gibco-BRL社製）
を使用してcDNAを合成した。上記cDNAから、Uni-ZAPのc
DNAライブラリー合成キット（STRATAGENE社製）を用い
てcDNAライブラリーを合成した。
【００２８】一方、Claudin-16欠損症の疾患牛（29頭）
及びそれらの両親牛からなる家系について、多型性DNA
マーカーを用いてClaudin-16欠損症と連鎖するウシ染色
体の領域を決定した。別に調製したウシの人工酵母染色
体(YAC)ライブラリー［文献H. Takeda et al., Animal
Genetics, 29, 216-219（1998年）］からこの領域に存
在するYACクローンを分離し、さらに該当するコスミド
クローンに含まれている遺伝子様構造部分を見い出し
た。この部位に相当するcDNAを上記のcDNAライブラリー
からクローニングし、BigDye Terminator Cycle Sequen
cing 試薬(PEバイオシステムズ社製)により、377蛍光DN
Aシークエンサー（PEバイオシステムズ社製）を用いて
その塩基配列を決定した。得られた塩基配列のうち翻訳
領域の配列を配列表の配列番号：1に示す。この部分の
塩基配列を他の既知の遺伝子と比較したところ、Claudi
n遺伝子ファミリーに属する新規の遺伝子であることが
判明し、Claudin-16と命名した。
及びそれらの両親牛からなる家系について、多型性DNA
マーカーを用いてClaudin-16欠損症と連鎖するウシ染色
体の領域を決定した。別に調製したウシの人工酵母染色
体(YAC)ライブラリー［文献H. Takeda et al., Animal
Genetics, 29, 216-219（1998年）］からこの領域に存
在するYACクローンを分離し、さらに該当するコスミド
クローンに含まれている遺伝子様構造部分を見い出し
た。この部位に相当するcDNAを上記のcDNAライブラリー
からクローニングし、BigDye Terminator Cycle Sequen
cing 試薬(PEバイオシステムズ社製)により、377蛍光DN
Aシークエンサー（PEバイオシステムズ社製）を用いて
その塩基配列を決定した。得られた塩基配列のうち翻訳
領域の配列を配列表の配列番号：1に示す。この部分の
塩基配列を他の既知の遺伝子と比較したところ、Claudi
n遺伝子ファミリーに属する新規の遺伝子であることが
判明し、Claudin-16と命名した。
【００２９】(2) Claudin-16遺伝子の発現 実験例1-(1)記載の方法にしたがって、mRNA画分を該疾
患牛の新鮮な腎臓から調製し、Claudin-16遺伝子の発現
について常法に従って調べた。mRNA画分をホルムアルデ
ヒドを含む1%アガロースゲルで電気泳動して、ナイロン
メンブレンにブロットし、Claudin-16遺伝子の断片をプ
ローブにしてClaudin-16遺伝子の発現を調べるノーザン
ブロットを行ったところ、腎臓に特異的に発現する遺伝
子で、正常ウシに比べ該疾患牛ではほとんど発現してい
ないことが明かとなった。
患牛の新鮮な腎臓から調製し、Claudin-16遺伝子の発現
について常法に従って調べた。mRNA画分をホルムアルデ
ヒドを含む1%アガロースゲルで電気泳動して、ナイロン
メンブレンにブロットし、Claudin-16遺伝子の断片をプ
ローブにしてClaudin-16遺伝子の発現を調べるノーザン
ブロットを行ったところ、腎臓に特異的に発現する遺伝
子で、正常ウシに比べ該疾患牛ではほとんど発現してい
ないことが明かとなった。
【００３０】(3) Claudin-16欠損症ウシClaudin-16遺伝
子の塩基配列の決定 実験例1-(2)に述べたようにClaudin-16欠損症ウシでのC
laudin-16遺伝子の発現が認められないことから、ゲノ
ミックDNA上のClaudin-16遺伝子の塩基配列を決定し
た。実験例1-(1)にて記載しているClaudin-16遺伝子を
含むコスミドクローン、及び、該疾患牛のゲノミックDN
Aから該当する領域のコスミドクローンを材料にショッ
トガン塩基配列決定法を行った。まず、ネブライザーで
物理的にコスミドクローンのDNAを約700 bpの大きさに
細断し、両端をDNAポリメラーゼで平滑にし、プラスミ
ドにクローニングした。これらのプラスミドクローンか
ら無作為に選び、それぞれ両端からDNAの塩基配列を読
んだ。配列表の配列番号：ｌの配列を参照しつつ塩基配
列をつないで、正常ウシとClaudin-16欠損症ウシにおけ
るClaudin-16遺伝子のDNA塩基配列を決定した。決定さ
れた塩基配列を前記の正常ウシについて決定されたもの
と比較した結果、Claudin-16欠損症ウシのClaudin-16遺
伝子では、配列表の配列番号：1に示された塩基配列
中、1〜629位を含む約30 kbの欠損が認められた。この
ため、該疾患牛ではClaudin-16遺伝子の発現が見られな
いと考えられる。
子の塩基配列の決定 実験例1-(2)に述べたようにClaudin-16欠損症ウシでのC
laudin-16遺伝子の発現が認められないことから、ゲノ
ミックDNA上のClaudin-16遺伝子の塩基配列を決定し
た。実験例1-(1)にて記載しているClaudin-16遺伝子を
含むコスミドクローン、及び、該疾患牛のゲノミックDN
Aから該当する領域のコスミドクローンを材料にショッ
トガン塩基配列決定法を行った。まず、ネブライザーで
物理的にコスミドクローンのDNAを約700 bpの大きさに
細断し、両端をDNAポリメラーゼで平滑にし、プラスミ
ドにクローニングした。これらのプラスミドクローンか
ら無作為に選び、それぞれ両端からDNAの塩基配列を読
んだ。配列表の配列番号：ｌの配列を参照しつつ塩基配
列をつないで、正常ウシとClaudin-16欠損症ウシにおけ
るClaudin-16遺伝子のDNA塩基配列を決定した。決定さ
れた塩基配列を前記の正常ウシについて決定されたもの
と比較した結果、Claudin-16欠損症ウシのClaudin-16遺
伝子では、配列表の配列番号：1に示された塩基配列
中、1〜629位を含む約30 kbの欠損が認められた。この
ため、該疾患牛ではClaudin-16遺伝子の発現が見られな
いと考えられる。
【００３１】［実験例２］ ウシのゲノミツクDNA上のClaudin-16遺伝子の変異が無
いことの確認：Claudin-16欠損症ウシに認められた欠損
部位を含むDNA断片を増幅するためのプライマーDN-F1、
DN-F2、DN-Rを合成した。配列表の配列番号：2、3、4に
ぞれぞれプライマーDN-F1、DN-F2、DN-Rの塩基配列を示
す。
いことの確認：Claudin-16欠損症ウシに認められた欠損
部位を含むDNA断片を増幅するためのプライマーDN-F1、
DN-F2、DN-Rを合成した。配列表の配列番号：2、3、4に
ぞれぞれプライマーDN-F1、DN-F2、DN-Rの塩基配列を示
す。
【００３２】 DN-F1: tatgctgttg atgtttatgt ag ［配列番号：2］ DN-F2: tatgtagaac gttcttctct g ［配列番号：3］ DN-R: cccccccccg cctttttc ［配列番号：4］
【００３３】正常ウシ、Claudin-16欠損症ウシ、及びそ
の母牛の血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）
より、自動核酸分離装置NA-1000（クラボウ社製）を用
いてゲノミックDNAを調製した。これらのゲノミックDNA
を鋳型とし、ブライマーDN-F1とDN-R、及び／又はDN-F2
とDN-Rを用いたPCR (TAKARA Taqを使用、94 ℃で1分
間、57 ℃で1分間、72 ℃で1分間からなる工程を1サイ
クルとした40サイクル反応）を行い、反応液を1.5%ゲル
（0.5 x TBE）を用いた電気泳動に供し、泳勤後のゲル
をエチジムブロマイド染色して増幅DNA断片を確認し
た。正常ウシとClaudin-16欠損症ウシの母牛のゲノミッ
クDNAを鋳型とした場合、図2aに示すように、375 bp及
び／又は360 bpのDNA断片の増幅が見られた。しかし、C
laudin-16欠損症ウシのゲノミックDNAを鋳型にした場合
は増幅が認められなかった。
の母牛の血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）
より、自動核酸分離装置NA-1000（クラボウ社製）を用
いてゲノミックDNAを調製した。これらのゲノミックDNA
を鋳型とし、ブライマーDN-F1とDN-R、及び／又はDN-F2
とDN-Rを用いたPCR (TAKARA Taqを使用、94 ℃で1分
間、57 ℃で1分間、72 ℃で1分間からなる工程を1サイ
クルとした40サイクル反応）を行い、反応液を1.5%ゲル
（0.5 x TBE）を用いた電気泳動に供し、泳勤後のゲル
をエチジムブロマイド染色して増幅DNA断片を確認し
た。正常ウシとClaudin-16欠損症ウシの母牛のゲノミッ
クDNAを鋳型とした場合、図2aに示すように、375 bp及
び／又は360 bpのDNA断片の増幅が見られた。しかし、C
laudin-16欠損症ウシのゲノミックDNAを鋳型にした場合
は増幅が認められなかった。
【００３４】［実験例３］ ウシのゲノミツクDNA上のClaudin-16遺伝子の変異が有
ることの確認：Claudin-16欠損症ウシのゲノミックDNA
においてのみDNA断片を増幅するため、実験例1-(3)記載
の約30 kbの欠損部分の両端にプライマーDA-F1、DA-F
2、DA-Rを合成した。配列表の配列番号：5、6、7にぞれ
ぞれプライマーDA-F1、DA-F2、DA-Rの塩基配列を示す。
ることの確認：Claudin-16欠損症ウシのゲノミックDNA
においてのみDNA断片を増幅するため、実験例1-(3)記載
の約30 kbの欠損部分の両端にプライマーDA-F1、DA-F
2、DA-Rを合成した。配列表の配列番号：5、6、7にぞれ
ぞれプライマーDA-F1、DA-F2、DA-Rの塩基配列を示す。
【００３５】 DA-F1: attgtatttt taggagtgac tc ［配列番号：5］ DA-F2: tgattccata aaccatacag g ［配列番号：6］ DA-R: ccccccccca ctctatac ［配列番号：7］
【００３６】正常ウシ、Claudin-16欠損症ウシ、及びそ
の母牛のゲノミックDNAを鋳型とし、プライマーDA-F1と
DA-R、及び／又はDA-F2とDA-Rを用いたPCR (TAKARA Taq
を使用、94 ℃で１分間、57 ℃で1分間、72 ℃で1分間
からなる工程を1サイクルとした40サイクル反応）を行
い、反応液を1.5%ゲル（0.5 x TBE）を用いた電気泳動
に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増
幅DNA断片を確認した。Claudin-16欠損症ウシ、及びそ
の母牛のゲノミックDNAを鋳型とした場合、図2bに示す
ように、722 bp及び／又は753 bpのDNA断片の増幅が見
られたが、正常ウシでは認められなかった。
の母牛のゲノミックDNAを鋳型とし、プライマーDA-F1と
DA-R、及び／又はDA-F2とDA-Rを用いたPCR (TAKARA Taq
を使用、94 ℃で１分間、57 ℃で1分間、72 ℃で1分間
からなる工程を1サイクルとした40サイクル反応）を行
い、反応液を1.5%ゲル（0.5 x TBE）を用いた電気泳動
に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増
幅DNA断片を確認した。Claudin-16欠損症ウシ、及びそ
の母牛のゲノミックDNAを鋳型とした場合、図2bに示す
ように、722 bp及び／又は753 bpのDNA断片の増幅が見
られたが、正常ウシでは認められなかった。
【００３７】これらの結果より、Claudin-16 遺伝子の
翻訳領域の1〜629位を含む約30 kbの欠損について、発
症ウシの母牛はこの変異に関してへテロ接合体であり、
Claudin-16欠損症が染色体性劣性遺伝をする遺伝性疾患
であることが確認された。
翻訳領域の1〜629位を含む約30 kbの欠損について、発
症ウシの母牛はこの変異に関してへテロ接合体であり、
Claudin-16欠損症が染色体性劣性遺伝をする遺伝性疾患
であることが確認された。
【００３８】
【発明の効果】本発明によりウシのClaudin-16欠損症お
よぴそのキヤリアーを簡便かつ迅速に検出し、診断する
ことが可能となる。
よぴそのキヤリアーを簡便かつ迅速に検出し、診断する
ことが可能となる。
【００３９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Livestock Technology Association <120> Gene Diagnosis for Bovine Claudin-16 Deficiency <130> Co990106（整理番号） <140> <141> <160> 7 <170> PatentIn Ver.2.0 <210> 1 <211> 765 <212> DNA <213> Bovine <400> 1 ATGGGCCCAG GGCTGGCAGC TTCCCATGTG TCCTTTCCAG ACAGTCTGCT CGCTAAGATG 60 AGGGATCTTC TTCAGTATGT TGCCTGCTTC TTTGCTTTTT TCTCCGCTGG GTTCTTGGTT 120 GTGGCCACCT GGACAGACTG TTGGATGGTG AATGCAGATG ACTCCCTGGA GGTGAGCACA 180 AAATGCCGAG GCCTCTGGTG GGAGTGTGTC ACAAATGCTT TTGATGGAAT TCGCACCTGT 240 GATGAGTATG ATTCTATACT TGCTGAGCAC TCCTTGAAGC TGGTGGTAAC TCGGGCGCTG 300 ATGATTACTG CAGATATTCT AGCTGGATTT GGATTTATTA CTCTGCTCCT TGGACTTGAC 360 TGCGTGAAAT TCCTCCCTGA TGAGCCATAC ATCAAAGTCC GCATCAGCTT TGTTGCTGGA 420 ACCACGTTAC TAATAGCAGG TGCCCCAGGA ATAATTGGCT CTGTTTGGTA TGCTGTTGAT 480 GTTTATGTAG AACGTTCTTC TCTGGTTTTG CACAATATAT TTCTTGGCAT CCAATATAAA 540 TTTGGTTGGT CCTGTTGGCT TGGAATGGCT GGTTCTTTGG GTTGTTTTTT GGCTGGTGCT 600 ATCCTCACAT GCTGCTTATA CCTGTTCAAA GATGTTGGAC CTGAGAGGAG CTATCCTTAT 660 TCCACAAGGA AAGCCTATTC AACAACAGCT GTTTCCATGC CCCGGTCACA TGCGATCCCT 720 CGAACACAGA CTGCCAAAAT GTATGCTGTC GACACCAGGG TGTGA 765 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2 tatgctgttg atgtttatgt ag 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 3 tatgtagaac gttcttctct g 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 4 cccccccccg cctttttc 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 5 attgtatttt taggagtgac tc 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 6 tgattccata aaccatacag g 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 7 ccccccccca ctctatac 18
【図１】（ａ）Claudin-16欠損症ウシ由来のウシClaudi
n-16遺伝子の欠損部分を示す図である。 （ｂ）欠損部分を検出するためのPCRプライマーの位
置。
n-16遺伝子の欠損部分を示す図である。 （ｂ）欠損部分を検出するためのPCRプライマーの位
置。
【図２】（ａ）Claudin-16遺伝子の変異の無いゲノミッ
クDNAを鋳型とすれば、PCRで増幅することを示す電気泳
動パターン図である。 （ｂ）Claudin-16遺伝子の変異の有るゲノミックDNAを
鋳型とすれば、PCRで増幅することを示す電気泳動パタ
ーン図である。
クDNAを鋳型とすれば、PCRで増幅することを示す電気泳
動パターン図である。 （ｂ）Claudin-16遺伝子の変異の有るゲノミックDNAを
鋳型とすれば、PCRで増幅することを示す電気泳動パタ
ーン図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 平野 貴 福島県西白河郡西郷村大字小田倉字小田 倉原１ 社団法人畜産技術協会附属動物 遺伝研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/10 - 15/28 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅｓｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 工程（a）：ウシの核酸試料を得る工
程、 工程（b）：工程（a）にて得られた核酸試料を遺伝子増
幅反応に付して、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しうる
変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、
及び 工程（c）：工程（b）の核酸断片について変異の存在を
調べる工程、 を含むウシのClaudin-16欠損症の遺伝子診断法であっ
て、変異部位を含む領域がウシClaudin-16遺伝子の塩基
配列中、配列表の配列番号：1に示される塩基配列の1〜
629位を含む領域である、ウシのClaudin-16欠損症の遺
伝子診断法。 - 【請求項２】 遺伝子増幅反応がPCR（ポリメラーゼ連
鎖反応）法によって行われる請求項１に記載の遺伝子診
断法。 - 【請求項３】 変異の存在をPCR増幅により調べること
を特徴とする請求項１〜２のいずれか一項に記載の遺伝
子診断法。 - 【請求項４】 核酸試料がゲノミックDNA、cDNA、又はm
RNAを含む試料である請求項１〜３のいずれか一項に記
載の遺伝子診断法。 - 【請求項５】 ウシのClaudin-16欠損症を検出するため
のキットであって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しう
る変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅する
のに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有し
ており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマー
が、(1)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のう
ちの５'末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド及び (2)配列表の配列番号：１に示された
塩基配列のうちの３'末端の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたも
のであることを特徴とする、ウシのClaudin-16欠損症を
検出するためのキット。 - 【請求項６】 ウシのClaudin-16欠損症を検出するため
のキットであって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しう
る変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅する
のに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有し
ており、該オリゴヌクレオチドプライマーが、(1)配列
表の配列番号：１に示された塩基配列のうちの５'末端
の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
及び (2)配列表の配列番号：１に示された塩基配列のう
ちの３'末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものであって、
しかも該オリゴヌクレオチドプライマーは、15〜35個の
ヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウ
シのClaudin-16欠損症を検出するためのキット。 - 【請求項７】 ウシのClaudin-16欠損症を検出するため
のキットであって、ウシのClaudin-16遺伝子に存在しう
る変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅する
のに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有し
ており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマー
が、配列表の配列番号2〜7に示されたものからなる群か
ら選ばれたものであることを特徴とする、ウシのClaudi
n-16欠損症を検出するためのキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08437399A JP3192128B2 (ja) | 1999-03-26 | 1999-03-26 | ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症の遺伝子診断法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08437399A JP3192128B2 (ja) | 1999-03-26 | 1999-03-26 | ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症の遺伝子診断法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000270880A JP2000270880A (ja) | 2000-10-03 |
| JP3192128B2 true JP3192128B2 (ja) | 2001-07-23 |
Family
ID=13828743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08437399A Expired - Lifetime JP3192128B2 (ja) | 1999-03-26 | 1999-03-26 | ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症の遺伝子診断法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3192128B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115851611B (zh) * | 2022-10-26 | 2025-08-12 | 苏州仁端生物医药科技有限公司 | 一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 |
-
1999
- 1999-03-26 JP JP08437399A patent/JP3192128B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000270880A (ja) | 2000-10-03 |
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