JP3207596B2 - プラスミドｄｎａの調製方法 - Google Patents
プラスミドｄｎａの調製方法Info
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Landscapes
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定の分離膜、及びそ
の１用途として好適な、遺伝子工学の分野で多用される
プラスミドＤＮＡの簡便なる調製方法に関する。
の１用途として好適な、遺伝子工学の分野で多用される
プラスミドＤＮＡの簡便なる調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】プラスミドＤＮＡは細胞内で、宿主染色
体とは別個に独立して自律的に複製され、安定保持伝達
される遺伝子因子であり、遺伝子組換えＤＮＡ実験で
は、制限酵素などで切断した目的ＤＮＡをつないで増殖
させるベクターとして用いられている。ベクター用のプ
ラスミドＤＮＡとしては小型で自律的増殖能があるＤＮ
Ａ分子で、分子内に効率よく導入でき、目的のＤＮＡの
導入を形質の変化として認識するマーカー遺伝子や、目
的のＤＮＡ挿入のために適当な制限酵素切断点を持って
いるなどの機能が必要であり、多くの組換え用プラスミ
ドが開発されている。遺伝子組換え実験においてはクロ
ーニング、シークエンシング等の目的でプラスミドＤＮ
Ａを分離、調製する操作が頻繁に行われている。プラス
ミドＤＮＡを調製する方法としてはアルカリ−ＳＤＳ法
があり、例えばプラスミドを含有する微生物の培養液よ
り、微生物を遠心分離によって集菌し、次に菌体を溶液
Ｉ〔５０ｍＭ グルコース、２５ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ〕に懸濁、かくは
んした後、室温放置、次に氷冷下で溶液II（０．２Ｎ
ＮａＯＨ、１％ ＳＤＳ）を溶菌処理のために添加、か
くはんし、続いて溶液III （３Ｍ 酢酸カリウム（ｐＨ
４．８）〕を添加し、かくはんし、溶液の中和処理を行
う。次に遠心分離により、溶菌残渣とプラスミドＤＮＡ
を含有する遠心上清に分離、上清を分別後、該上清に冷
エタノールを添加し、−２０℃、３０分間冷却後プラス
ミドＤＮＡを沈殿させた後、遠心分離により沈殿を得、
沈殿をＲＮａｓｅＡを含有するＴＥバッファー〔１０ｍ
Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ〕に
溶解、ＲＮａｓｅ処理後、７．５Ｍ酢酸アンモニウム、
冷エタノールを添加、再度プラスミドＤＮＡを沈殿さ
せ、遠心分離により、目的のプラスミドＤＮＡを調製し
ている。
体とは別個に独立して自律的に複製され、安定保持伝達
される遺伝子因子であり、遺伝子組換えＤＮＡ実験で
は、制限酵素などで切断した目的ＤＮＡをつないで増殖
させるベクターとして用いられている。ベクター用のプ
ラスミドＤＮＡとしては小型で自律的増殖能があるＤＮ
Ａ分子で、分子内に効率よく導入でき、目的のＤＮＡの
導入を形質の変化として認識するマーカー遺伝子や、目
的のＤＮＡ挿入のために適当な制限酵素切断点を持って
いるなどの機能が必要であり、多くの組換え用プラスミ
ドが開発されている。遺伝子組換え実験においてはクロ
ーニング、シークエンシング等の目的でプラスミドＤＮ
Ａを分離、調製する操作が頻繁に行われている。プラス
ミドＤＮＡを調製する方法としてはアルカリ−ＳＤＳ法
があり、例えばプラスミドを含有する微生物の培養液よ
り、微生物を遠心分離によって集菌し、次に菌体を溶液
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くはんし、続いて溶液III （３Ｍ 酢酸カリウム（ｐＨ
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う。次に遠心分離により、溶菌残渣とプラスミドＤＮＡ
を含有する遠心上清に分離、上清を分別後、該上清に冷
エタノールを添加し、−２０℃、３０分間冷却後プラス
ミドＤＮＡを沈殿させた後、遠心分離により沈殿を得、
沈殿をＲＮａｓｅＡを含有するＴＥバッファー〔１０ｍ
Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ〕に
溶解、ＲＮａｓｅ処理後、７．５Ｍ酢酸アンモニウム、
冷エタノールを添加、再度プラスミドＤＮＡを沈殿さ
せ、遠心分離により、目的のプラスミドＤＮＡを調製し
ている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記アルカリ−ＳＤＳ
法によるプラスミドＤＮＡ調製は多工程を要し、遠心工
程時に染色体ＤＮＡ等の不純物が混入する場合もあり、
個人差、試料差が比較的大きく、調製プラスミドＤＮＡ
をシークエンシングに用いる場合、不純物のため非特異
的なバンドが現れたり、ＤＮＡポリメラーゼ反応が阻害
される場合もあり、操作に熟練を要し、一般には調製Ｄ
ＮＡを更に精製する必要があった。本発明の目的は簡便
に高純度プラスミドＤＮＡを調製する方法及び該方法に
使用するプラスミドＤＮＡ調製用基材を提供することに
ある。
法によるプラスミドＤＮＡ調製は多工程を要し、遠心工
程時に染色体ＤＮＡ等の不純物が混入する場合もあり、
個人差、試料差が比較的大きく、調製プラスミドＤＮＡ
をシークエンシングに用いる場合、不純物のため非特異
的なバンドが現れたり、ＤＮＡポリメラーゼ反応が阻害
される場合もあり、操作に熟練を要し、一般には調製Ｄ
ＮＡを更に精製する必要があった。本発明の目的は簡便
に高純度プラスミドＤＮＡを調製する方法及び該方法に
使用するプラスミドＤＮＡ調製用基材を提供することに
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、プラスミドＤＮＡの調製方法に関
し、プラスミドＤＮＡの調製方法において、該プラスミ
ドＤＮＡを保持する微生物又は細胞を破壊して得られる
プラスミドＤＮＡを含有する微生物又は細胞内成分を、
下部に孔径０．２〜０．８μmの孔を有するセルロース
アセテート膜が位置し、該膜の上部に保留粒子径０．５
〜１．０μmの孔を有するボロシリケートガラス繊維膜
が位置する二重膜で分離し、染色体ＤＮＡが分離された
液を採取する工程を包含することを特徴とする。また本
発明の第２の発明は、染色体ＤＮＡが分離されたプラス
ミドＤＮＡを調製するための分離膜に関し、下部に孔径
０．２〜０．８μmの孔を有するセルロースアセテート
膜、該膜の上部に保留粒子径０．５〜１．０μmの孔を
有するボロシリケートガラス繊維膜が位置することを特
徴とする。
発明の第１の発明は、プラスミドＤＮＡの調製方法に関
し、プラスミドＤＮＡの調製方法において、該プラスミ
ドＤＮＡを保持する微生物又は細胞を破壊して得られる
プラスミドＤＮＡを含有する微生物又は細胞内成分を、
下部に孔径０．２〜０．８μmの孔を有するセルロース
アセテート膜が位置し、該膜の上部に保留粒子径０．５
〜１．０μmの孔を有するボロシリケートガラス繊維膜
が位置する二重膜で分離し、染色体ＤＮＡが分離された
液を採取する工程を包含することを特徴とする。また本
発明の第２の発明は、染色体ＤＮＡが分離されたプラス
ミドＤＮＡを調製するための分離膜に関し、下部に孔径
０．２〜０．８μmの孔を有するセルロースアセテート
膜、該膜の上部に保留粒子径０．５〜１．０μmの孔を
有するボロシリケートガラス繊維膜が位置することを特
徴とする。
【０００５】本発明者らは、微生物又は細胞破壊液中の
プラスミドＤＮＡの選択的分離にセルロースアセテート
膜が有効であり、該膜とボロシリケートガラス繊維膜を
組合せ使用することにより高純度プラスミドＤＮＡの調
製が簡便かつ迅速に行えることを見出し、本発明を完成
させた。
プラスミドＤＮＡの選択的分離にセルロースアセテート
膜が有効であり、該膜とボロシリケートガラス繊維膜を
組合せ使用することにより高純度プラスミドＤＮＡの調
製が簡便かつ迅速に行えることを見出し、本発明を完成
させた。
【０００６】本発明で使用するプラスミドＤＮＡを保持
する微生物又は細胞とは、例えば細菌、放線菌、カビ、
酵母、動物細胞、植物細胞等であり、これら微生物又は
細胞を破壊する方法は、それぞれの微生物又は細胞で通
常使用されている方法でよく、物理的、化学的、あるい
は酵素学的方法等より選択使用することができる。
する微生物又は細胞とは、例えば細菌、放線菌、カビ、
酵母、動物細胞、植物細胞等であり、これら微生物又は
細胞を破壊する方法は、それぞれの微生物又は細胞で通
常使用されている方法でよく、物理的、化学的、あるい
は酵素学的方法等より選択使用することができる。
【０００７】本発明で分離に使用する二重膜は、上部は
プラスミドＤＮＡを保持する微生物又は細胞や、該微生
物又は細胞の破壊物が適当に分散した状態で保持できる
膜が良く、また該膜上で微生物又は細胞の分離や、分離
した微生物又は細胞の破壊等が行えるものが望ましく、
例えば保留粒子径０．３〜１．０μｍの孔を有するボロ
シリケートガラス繊維膜が使用できるが、二重膜形成時
の微生物又は細胞の保持能力、プラスミドＤＮＡを含有
する微生物又は細胞内成分の分離時間等より保留粒子径
０．５〜１．０μｍの孔径の膜が好ましく、この範囲の
保留粒子径を有する膜より、試料に合せ選択すれば良
い。なお、保留粒子径は均一であっても良いし、０．５
〜１．０μｍの範囲で分布していても良い。また膜面
積、膜厚等は試料の性状、処理量、好ましい処理時間等
に合せ選択すれば良い。次に下部は、細胞破片や変性染
色体ＤＮＡ等は通過させず、プラスミドＤＮＡの吸着が
無く、プラスミドＤＮＡを含有する溶液を効率よく通過
させるものが望ましく、例えば孔径０．２〜０．８μｍ
の孔を有するセルロースアセテート膜が使用できる。な
お、孔径は均一であっても良いし、０．２〜０．８μｍ
の範囲で分布していても良い。また膜面積、膜厚等は試
料の性状、処理量等に応じて選択すれば良い。
プラスミドＤＮＡを保持する微生物又は細胞や、該微生
物又は細胞の破壊物が適当に分散した状態で保持できる
膜が良く、また該膜上で微生物又は細胞の分離や、分離
した微生物又は細胞の破壊等が行えるものが望ましく、
例えば保留粒子径０．３〜１．０μｍの孔を有するボロ
シリケートガラス繊維膜が使用できるが、二重膜形成時
の微生物又は細胞の保持能力、プラスミドＤＮＡを含有
する微生物又は細胞内成分の分離時間等より保留粒子径
０．５〜１．０μｍの孔径の膜が好ましく、この範囲の
保留粒子径を有する膜より、試料に合せ選択すれば良
い。なお、保留粒子径は均一であっても良いし、０．５
〜１．０μｍの範囲で分布していても良い。また膜面
積、膜厚等は試料の性状、処理量、好ましい処理時間等
に合せ選択すれば良い。次に下部は、細胞破片や変性染
色体ＤＮＡ等は通過させず、プラスミドＤＮＡの吸着が
無く、プラスミドＤＮＡを含有する溶液を効率よく通過
させるものが望ましく、例えば孔径０．２〜０．８μｍ
の孔を有するセルロースアセテート膜が使用できる。な
お、孔径は均一であっても良いし、０．２〜０．８μｍ
の範囲で分布していても良い。また膜面積、膜厚等は試
料の性状、処理量等に応じて選択すれば良い。
【０００８】本発明で分離に使用する二重膜は通常密着
した状態で、円筒状の容器に保持されていれば良く、保
持容器の材質、形状は通常の分離方法、例えば減圧ろ
過、加圧ろ過、遠心ろ過等に使用できる材質、形状であ
れば良く、その形状は例えば通常のフィルターの形状で
あれば良く、フィルターの容器と二重膜は組立式でも良
いし、一体成形式でも良く、該フィルターを使用し、プ
ラスミドＤＮＡを含有する微生物又は細胞内成分と微生
物又は細胞破片、変性染色体ＤＮＡ等の分離を減圧法、
加圧法等により短時間に行うことができる。また、従来
のアルカリ−ＳＤＳ法で問題となる遠心分離後のプラス
ミドＤＮＡを含有する微生物又は細胞内成分（上清）と
変性染色体ＤＮＡを含有する微生物又は細胞の破片（沈
殿）を分画する際に生ずるプラスミドＤＮＡ画分への変
性染色体ＤＮＡの画分の混入も無く、純度良くプラスミ
ドＤＮＡ画分を調製することができる。
した状態で、円筒状の容器に保持されていれば良く、保
持容器の材質、形状は通常の分離方法、例えば減圧ろ
過、加圧ろ過、遠心ろ過等に使用できる材質、形状であ
れば良く、その形状は例えば通常のフィルターの形状で
あれば良く、フィルターの容器と二重膜は組立式でも良
いし、一体成形式でも良く、該フィルターを使用し、プ
ラスミドＤＮＡを含有する微生物又は細胞内成分と微生
物又は細胞破片、変性染色体ＤＮＡ等の分離を減圧法、
加圧法等により短時間に行うことができる。また、従来
のアルカリ−ＳＤＳ法で問題となる遠心分離後のプラス
ミドＤＮＡを含有する微生物又は細胞内成分（上清）と
変性染色体ＤＮＡを含有する微生物又は細胞の破片（沈
殿）を分画する際に生ずるプラスミドＤＮＡ画分への変
性染色体ＤＮＡの画分の混入も無く、純度良くプラスミ
ドＤＮＡ画分を調製することができる。
【０００９】次にアルカリ−ＳＤＳ法に準じ、本発明を
更に説明する。プラスミドＤＮＡを含有する微生物、例
えばプラスミドｐＵＣ１９を含有する大腸菌ＪＭ１０９
株（ Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＣ１９）を培
養し、例えばＯＤ660nm 約３の培養液を調製した場合、
例えば保留粒子径０．５μｍの孔を有するボロシリケー
トガラス繊維膜（アドバンテック社製：ＧＣ−５０）、
０．４５μｍの孔径のセルロースアセテート膜（アドバ
ンテック社製：Ｃ０４５Ａ）の組合せで径１０ｍｍの二
重膜を作製し、該二重膜を保持するフィルターを使用す
れば減圧下で、約１．５ｍｌの培養液が約４０秒で迅速
にろ過でき、培養菌体が二重膜に保持される。例えば上
記培養液１．５ｍｌをろ過し、得られた菌体に溶液Ｉ′
（溶液Ｉに５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを添加）の必
要量、例えば１００μｌを添加し、室温で１分間放置す
る。次に溶液IIの必要量、例えば２００μｌを添加し、
室温で２分間放置する。続いて溶液III の必要量、例え
ば１５０μｌを添加し、室温で３分間放置する。次い
で、例えば真空ポンプで減圧し、プラスミドＤＮＡを含
有する分離液約４００μｌを約３分間で採取することが
できる。次に例えば２倍容の冷エタノールを添加し、−
２０℃、３０分間処理後遠心分離をすることによりプラ
スミドＤＮＡを含有するエタノール沈殿を得ることがで
きる。プラスミドＤＮＡの分離効率を高めるためには、
例えば各溶液の添加時にかくはん操作を行っても良い。
更に説明する。プラスミドＤＮＡを含有する微生物、例
えばプラスミドｐＵＣ１９を含有する大腸菌ＪＭ１０９
株（ Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＣ１９）を培
養し、例えばＯＤ660nm 約３の培養液を調製した場合、
例えば保留粒子径０．５μｍの孔を有するボロシリケー
トガラス繊維膜（アドバンテック社製：ＧＣ−５０）、
０．４５μｍの孔径のセルロースアセテート膜（アドバ
ンテック社製：Ｃ０４５Ａ）の組合せで径１０ｍｍの二
重膜を作製し、該二重膜を保持するフィルターを使用す
れば減圧下で、約１．５ｍｌの培養液が約４０秒で迅速
にろ過でき、培養菌体が二重膜に保持される。例えば上
記培養液１．５ｍｌをろ過し、得られた菌体に溶液Ｉ′
（溶液Ｉに５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを添加）の必
要量、例えば１００μｌを添加し、室温で１分間放置す
る。次に溶液IIの必要量、例えば２００μｌを添加し、
室温で２分間放置する。続いて溶液III の必要量、例え
ば１５０μｌを添加し、室温で３分間放置する。次い
で、例えば真空ポンプで減圧し、プラスミドＤＮＡを含
有する分離液約４００μｌを約３分間で採取することが
できる。次に例えば２倍容の冷エタノールを添加し、−
２０℃、３０分間処理後遠心分離をすることによりプラ
スミドＤＮＡを含有するエタノール沈殿を得ることがで
きる。プラスミドＤＮＡの分離効率を高めるためには、
例えば各溶液の添加時にかくはん操作を行っても良い。
【００１０】なお溶液ＩにＲＮａｓｅを添加することに
より操作時間が短縮され、リゾチームを添加することに
よりプラスミドＤＮＡの収率が向上する。例えば溶液Ｉ
に５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ及び４ｍｇ／ｍｌのリ
ゾチームを添加し用いれば良い。また、溶菌成分を減圧
法によりろ過する場合は、必要に応じて消泡剤を使用し
ても良く、消泡剤としては例えばアデカノール（旭電化
工業社製）、エイノール（バイオット社製）、ニッサン
ディスホームＣＢ４４２（日本油脂社製）等より選択
し、例えば、溶液III に０．０５％のエイノールを添加
すれば良い。また減圧度を調製することによってろ液の
発泡や飛散を防止することができ、例えばエイノール
０．０５％存在下真空度を−６５０ｍｍＨｇ付近に調整
することにより、発泡を完全に抑制することができる。
更にプラスミドＤＮＡ沈殿作製時にエタノールに換え、
イソプロピルアルコールを用いれば少量の溶媒量で、か
つ室温下で迅速に高純度プラスミドＤＮＡ沈殿を調製す
ることができる。
より操作時間が短縮され、リゾチームを添加することに
よりプラスミドＤＮＡの収率が向上する。例えば溶液Ｉ
に５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ及び４ｍｇ／ｍｌのリ
ゾチームを添加し用いれば良い。また、溶菌成分を減圧
法によりろ過する場合は、必要に応じて消泡剤を使用し
ても良く、消泡剤としては例えばアデカノール（旭電化
工業社製）、エイノール（バイオット社製）、ニッサン
ディスホームＣＢ４４２（日本油脂社製）等より選択
し、例えば、溶液III に０．０５％のエイノールを添加
すれば良い。また減圧度を調製することによってろ液の
発泡や飛散を防止することができ、例えばエイノール
０．０５％存在下真空度を−６５０ｍｍＨｇ付近に調整
することにより、発泡を完全に抑制することができる。
更にプラスミドＤＮＡ沈殿作製時にエタノールに換え、
イソプロピルアルコールを用いれば少量の溶媒量で、か
つ室温下で迅速に高純度プラスミドＤＮＡ沈殿を調製す
ることができる。
【００１１】プラスミドＤＮＡを含有する微生物又は細
胞の負荷量が多い場合は、例えば保留粒子径０．８μｍ
の孔を有するボロシリケートガラス繊維膜を使用すれば
良い。例えば保留粒子径０．８μｍの孔を有するボロシ
リケートガラス繊維膜（アドバンテック社製：ＧＡ−２
００）と前出の０．４５μｍのセルロースアセテート膜
を組合せ、径１０ｍｍの二重膜を作製、使用することに
より、前出 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＣ１９
のＯＤ660nm 約６の培養液１．５ｍｌが減圧下で約３分
でろ過でき、プラスミドＤＮＡを含有する分離液も約５
分で採取することができる。
胞の負荷量が多い場合は、例えば保留粒子径０．８μｍ
の孔を有するボロシリケートガラス繊維膜を使用すれば
良い。例えば保留粒子径０．８μｍの孔を有するボロシ
リケートガラス繊維膜（アドバンテック社製：ＧＡ−２
００）と前出の０．４５μｍのセルロースアセテート膜
を組合せ、径１０ｍｍの二重膜を作製、使用することに
より、前出 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＣ１９
のＯＤ660nm 約６の培養液１．５ｍｌが減圧下で約３分
でろ過でき、プラスミドＤＮＡを含有する分離液も約５
分で採取することができる。
【００１２】本発明のプラスミドＤＮＡの調製方法にお
いては、本発明の二重膜を有するフィルターと多数サン
プル処理用の吸引ろ過装置を組合せることによって、短
時間に、多数のサンプル処理を行うことができる。また
フィルターと遠心チューブと組合せ使用してもよい。
いては、本発明の二重膜を有するフィルターと多数サン
プル処理用の吸引ろ過装置を組合せることによって、短
時間に、多数のサンプル処理を行うことができる。また
フィルターと遠心チューブと組合せ使用してもよい。
【００１３】以上、詳細に説明した様に、本発明の方
法、二重膜を使用することにより、プラスミドＤＮＡを
含有する微生物又は細胞内成分を簡便に採取でき、高純
度プラスミドＤＮＡの調製を容易に、再現性よく行うこ
とができる。なお本発明においては、細胞の分取から、
プラスミドＤＮＡを含有する分離液の採取までを同一フ
ィルターで行えるので特に簡便であるが、細胞の破壊ま
でを別途行い、プラスミドＤＮＡを含有する分離液の採
取のみを本発明の方法で行ってもよい。
法、二重膜を使用することにより、プラスミドＤＮＡを
含有する微生物又は細胞内成分を簡便に採取でき、高純
度プラスミドＤＮＡの調製を容易に、再現性よく行うこ
とができる。なお本発明においては、細胞の分取から、
プラスミドＤＮＡを含有する分離液の採取までを同一フ
ィルターで行えるので特に簡便であるが、細胞の破壊ま
でを別途行い、プラスミドＤＮＡを含有する分離液の採
取のみを本発明の方法で行ってもよい。
【００１４】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これらの実施例に何ら限定されるものでは無い。
これらの実施例に何ら限定されるものでは無い。
【００１５】実施例１ （１）大腸菌ＪＭ１０９／ｐＵＣ１９の培養 プラスミドｐＵＣ１９で形質転換された大腸菌ＪＭ１０
９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地
（１０ｇ／リットル トリプトン、５ｇ／リットル 酵
母エキス、５ｇ／リットル 塩化ナトリウム）１００ｍ
ｌに植菌し、培養温度３７℃、振とう速度１２０ｒｐｍ
にて１６時間培養し、ＯＤ660nm 約３の培養液を調製し
た。
９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地
（１０ｇ／リットル トリプトン、５ｇ／リットル 酵
母エキス、５ｇ／リットル 塩化ナトリウム）１００ｍ
ｌに植菌し、培養温度３７℃、振とう速度１２０ｒｐｍ
にて１６時間培養し、ＯＤ660nm 約３の培養液を調製し
た。
【００１６】（２）プラスミドＤＮＡの調製 減圧用フィルターホルダーに保留粒子径０．５μｍの孔
を有するボロシリケートガラス繊維膜（ＧＣ−５０：ア
ドバンテック社製）を上部に、孔径０．４５μｍの孔を
有するセルロースアセテート膜（Ｃ０４５Ａ：アドバン
テック社製）を下部に配置して径１０ｍｍの二重膜を作
製し、該二重膜上に培養液１．５ｍｌを供し、吸引ビン
を通して真空ポンプ（ロータリーユニポンプＲＷ−１０
０：日本理化学器械社製）にて吸引し、膜面に菌体を集
菌した。ろ過時間は約４０秒であった。次に二重膜上に
５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（シグマ社製Ｉ型−Ａ
Ｓ）を含む溶液Ｉ〔５０ｍＭ グルコース、２５ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ：以下溶
液Ｉ′と称す〕１００μｌを加え１分間放置し、続いて
溶液II（０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ）２０
０μｌを加え２分間放置し、更に溶液III （３Ｍ酢酸カ
リウム）１５０μｌを加え中和し、３分放置後、真空ポ
ンプで吸引、ろ過し、プラスミドＤＮＡを含有する分離
液（以下、プラスミド分離液と略す）（約４００μｌ）
を採取した。ろ過時間は約２分４０秒であった。このプ
ラスミド分離液に冷エタノール８００μｌを加えかくは
ん後、ディープフリーザーにて−２０℃、３０分間冷却
処理した後、遠心分離により目的のプラスミドＤＮＡ画
分を得た。一方、培養液１．５ｍｌからアルカリ−ＳＤ
Ｓ法によりプラスミドＤＮＡ画分を調製した。二重膜を
使用した方法及び従来法のアルカリ−ＳＤＳ法により得
たプラスミドＤＮＡ画分を１００μｌのＴＥバッファー
に溶解し、その１０００分の１をアガロースゲル電気泳
動しエチジウムブロマイドを含むＴＢＥバッファー〔９
０ｍＭ トリス−ほう酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８）〕で染色し、その後ＴＢＥバッファー中で振とうし
て脱色して蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−１
００：宝酒造社製）にかけ実像化した。各バンドの蛍光
強度よりプラスミドＤＮＡの収量を比較すると、二重膜
法を使用する方法で得られるプラスミドＤＮＡ量は従来
法と比べ２０〜２９％と少ないが、プラスミドＤＮＡに
対する変性染色体ＤＮＡの混入は無く、二重膜を使用す
る方法により、変性染色体ＤＮＡの混入の無い、プラス
ミドＤＮＡ画分が調製されていた。任意に選出した７名
のパネラーによって行われた、従来法との比較を表１に
示す。なお表１において＋印の多いものほど、染色体Ｄ
ＮＡの混入割合が多いことを示し、−印は染色体ＤＮＡ
が検出されなかったことを示し、本発明の方法により、
染色体ＤＮＡの混入のない高品質プラスミドＤＮＡが、
個人差無く、調製されている。
を有するボロシリケートガラス繊維膜（ＧＣ−５０：ア
ドバンテック社製）を上部に、孔径０．４５μｍの孔を
有するセルロースアセテート膜（Ｃ０４５Ａ：アドバン
テック社製）を下部に配置して径１０ｍｍの二重膜を作
製し、該二重膜上に培養液１．５ｍｌを供し、吸引ビン
を通して真空ポンプ（ロータリーユニポンプＲＷ−１０
０：日本理化学器械社製）にて吸引し、膜面に菌体を集
菌した。ろ過時間は約４０秒であった。次に二重膜上に
５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（シグマ社製Ｉ型−Ａ
Ｓ）を含む溶液Ｉ〔５０ｍＭ グルコース、２５ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ：以下溶
液Ｉ′と称す〕１００μｌを加え１分間放置し、続いて
溶液II（０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１％ＳＤＳ）２０
０μｌを加え２分間放置し、更に溶液III （３Ｍ酢酸カ
リウム）１５０μｌを加え中和し、３分放置後、真空ポ
ンプで吸引、ろ過し、プラスミドＤＮＡを含有する分離
液（以下、プラスミド分離液と略す）（約４００μｌ）
を採取した。ろ過時間は約２分４０秒であった。このプ
ラスミド分離液に冷エタノール８００μｌを加えかくは
ん後、ディープフリーザーにて−２０℃、３０分間冷却
処理した後、遠心分離により目的のプラスミドＤＮＡ画
分を得た。一方、培養液１．５ｍｌからアルカリ−ＳＤ
Ｓ法によりプラスミドＤＮＡ画分を調製した。二重膜を
使用した方法及び従来法のアルカリ−ＳＤＳ法により得
たプラスミドＤＮＡ画分を１００μｌのＴＥバッファー
に溶解し、その１０００分の１をアガロースゲル電気泳
動しエチジウムブロマイドを含むＴＢＥバッファー〔９
０ｍＭ トリス−ほう酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８）〕で染色し、その後ＴＢＥバッファー中で振とうし
て脱色して蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−１
００：宝酒造社製）にかけ実像化した。各バンドの蛍光
強度よりプラスミドＤＮＡの収量を比較すると、二重膜
法を使用する方法で得られるプラスミドＤＮＡ量は従来
法と比べ２０〜２９％と少ないが、プラスミドＤＮＡに
対する変性染色体ＤＮＡの混入は無く、二重膜を使用す
る方法により、変性染色体ＤＮＡの混入の無い、プラス
ミドＤＮＡ画分が調製されていた。任意に選出した７名
のパネラーによって行われた、従来法との比較を表１に
示す。なお表１において＋印の多いものほど、染色体Ｄ
ＮＡの混入割合が多いことを示し、−印は染色体ＤＮＡ
が検出されなかったことを示し、本発明の方法により、
染色体ＤＮＡの混入のない高品質プラスミドＤＮＡが、
個人差無く、調製されている。
【００１７】
【表１】 表 １ ─────────────────────────────── パネラー 二重膜を用いた方法 アルカリ−ＳＤＳ法 ─────────────────────────────── Ａ − ＋＋＋ Ｂ − − Ｃ − − Ｄ − ＋＋ Ｅ − ＋＋ Ｆ − ＋ Ｇ − ＋ ───────────────────────────────
【００１８】（３）二重膜を使用する方法で調製したプ
ラスミドＤＮＡ画分約１５０ｎｇを制限酵素：ＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造社製）１０単位を含む反応液（１０ｍＭ 塩
化マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール）中で３
０℃、１時間処理し、アガロースゲル電気泳動により評
価した。プラスミドＤＮＡは完全に直鎖状ＤＮＡに切断
された。更に、該プラスミドＤＮＡをＲＩ標識ヌクレオ
チド又は蛍光プライマーを用いてジデオキシ法によりシ
ークエンスを行った。プラスミドｐＵＣ１９のマルチク
ローニングサイトの近傍に結合するプライマーＭ４（宝
酒造社製）１ｐｍｏｌと得られたプラスミド画分１μｇ
を混合し、宝酒造製ＢｃａＢＥＳＴ Ｄｉｄｅｏｘｙ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔで〔α32ｐ〕ｄＣＴＰを
用いて行った反応液を８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィー
によりラダー像を得た。また、プライマーＭ４の５′末
端をローダミンＸで標識したもの２ｐｍｏｌ及びプラス
ミド画分１μｇを用いた反応液では電気泳動後、前出の
蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯ−１００で走査す
ることによりラダー像を求めた。どちらの方法でも鮮明
なラダー像が得られた。ジデオキシシークエンシングに
用いるＤＮＡは特に純度が高いことが望ましく、不純物
のために非特異的なバンドが現れたり、ＤＮＡポリメラ
ーゼ反応が阻害される場合が多く、アルカリ−ＳＤＳ法
でプラスミドＤＮＡを調製した場合、個人差、試料差が
比較的大きく、一般に、更に精製が必要とされている
が、本発明の方法により得られたプラスミドＤＮＡ画分
はジデオキシシークエンシングに用いるＤＮＡ画分とし
て充分に高純度であり、また前述表１に示した様に個人
差も無く、安定してシークエンシングに用いることがで
きた。
ラスミドＤＮＡ画分約１５０ｎｇを制限酵素：ＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造社製）１０単位を含む反応液（１０ｍＭ 塩
化マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール）中で３
０℃、１時間処理し、アガロースゲル電気泳動により評
価した。プラスミドＤＮＡは完全に直鎖状ＤＮＡに切断
された。更に、該プラスミドＤＮＡをＲＩ標識ヌクレオ
チド又は蛍光プライマーを用いてジデオキシ法によりシ
ークエンスを行った。プラスミドｐＵＣ１９のマルチク
ローニングサイトの近傍に結合するプライマーＭ４（宝
酒造社製）１ｐｍｏｌと得られたプラスミド画分１μｇ
を混合し、宝酒造製ＢｃａＢＥＳＴ Ｄｉｄｅｏｘｙ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔで〔α32ｐ〕ｄＣＴＰを
用いて行った反応液を８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィー
によりラダー像を得た。また、プライマーＭ４の５′末
端をローダミンＸで標識したもの２ｐｍｏｌ及びプラス
ミド画分１μｇを用いた反応液では電気泳動後、前出の
蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯ−１００で走査す
ることによりラダー像を求めた。どちらの方法でも鮮明
なラダー像が得られた。ジデオキシシークエンシングに
用いるＤＮＡは特に純度が高いことが望ましく、不純物
のために非特異的なバンドが現れたり、ＤＮＡポリメラ
ーゼ反応が阻害される場合が多く、アルカリ−ＳＤＳ法
でプラスミドＤＮＡを調製した場合、個人差、試料差が
比較的大きく、一般に、更に精製が必要とされている
が、本発明の方法により得られたプラスミドＤＮＡ画分
はジデオキシシークエンシングに用いるＤＮＡ画分とし
て充分に高純度であり、また前述表１に示した様に個人
差も無く、安定してシークエンシングに用いることがで
きた。
【００１９】またプラスミドＤＮＡの収量を改善するた
めに、溶液Ｉ′にリゾチームを最終濃度が４ｍｇ／ｍｌ
になるように加え、予め冷却しておいた上で添加した。
その結果、プラスミドＤＮＡの収量は従来法のアルカリ
−ＳＤＳ法に対して７０〜７７％に改善された。これら
ＲＮａｓｅＡ、リゾチームの添加が制限酵素処理及びシ
ークエンシングに悪影響を及ぼすことはなかった。
めに、溶液Ｉ′にリゾチームを最終濃度が４ｍｇ／ｍｌ
になるように加え、予め冷却しておいた上で添加した。
その結果、プラスミドＤＮＡの収量は従来法のアルカリ
−ＳＤＳ法に対して７０〜７７％に改善された。これら
ＲＮａｓｅＡ、リゾチームの添加が制限酵素処理及びシ
ークエンシングに悪影響を及ぼすことはなかった。
【００２０】プラスミド分離液からのＤＮＡの回収方法
についてエタノール沈殿法とイソプロピルアルコール沈
殿法を比較した。前述の様にエタノール沈殿法では、プ
ラスミド分離液に対して２倍量の冷エタノールを加えか
くはん後、−２０℃、３０分間冷却した後、遠心分離に
より、目的のプラスミドＤＮＡ画分を得たが、イソプロ
ピルアルコール沈殿法では、プラスミド分離液に対して
０．６倍量のイソプロピルアルコールを加えかくはん
後、遠心分離することにより、目的のプラスミドＤＮＡ
画分を得ることができた。エタノール沈殿法とイソプロ
ピルアルコール沈殿法で、プラスミドＤＮＡの収量に差
は認められなかったが、イソプロピルアルコール沈殿法
で得られるプラスミドＤＮＡ画分の方が混入する不純物
の量が大幅に減少していた。不純物の混入が少ないこ
と、冷却処理が不要なこと、ＤＮＡ回収に要する時間が
短い点等より、イソプロピルアルコール沈殿法はエタノ
ール沈殿法より簡便で良好な結果を得た。
についてエタノール沈殿法とイソプロピルアルコール沈
殿法を比較した。前述の様にエタノール沈殿法では、プ
ラスミド分離液に対して２倍量の冷エタノールを加えか
くはん後、−２０℃、３０分間冷却した後、遠心分離に
より、目的のプラスミドＤＮＡ画分を得たが、イソプロ
ピルアルコール沈殿法では、プラスミド分離液に対して
０．６倍量のイソプロピルアルコールを加えかくはん
後、遠心分離することにより、目的のプラスミドＤＮＡ
画分を得ることができた。エタノール沈殿法とイソプロ
ピルアルコール沈殿法で、プラスミドＤＮＡの収量に差
は認められなかったが、イソプロピルアルコール沈殿法
で得られるプラスミドＤＮＡ画分の方が混入する不純物
の量が大幅に減少していた。不純物の混入が少ないこ
と、冷却処理が不要なこと、ＤＮＡ回収に要する時間が
短い点等より、イソプロピルアルコール沈殿法はエタノ
ール沈殿法より簡便で良好な結果を得た。
【００２１】実施例２ 実施例１記載の保留粒子径０．５μｍの孔を有するボロ
シリケートガラス繊維膜、及び孔径０．４５μｍの孔を
有するセルロースアセテート膜より成る径１０ｍｍの二
重膜を作製し、実施例１記載のＯＤ660nm 約３の培養液
１．５ｍｌを供し、吸引ビンを通して真空ポンプにて吸
引し、膜上に菌体を集菌した。次に二重膜上に４ｍｇ／
ｍｌのリゾチームを含む溶液Ｉ′を１００μｌ加え１分
間放置し、続いて溶液IIを２００μｌ加え２分間放置
し、更に溶液III を１５０μｌ加え中和し、３分放置
後、真空ポンプで吸引、ろ過し、プラスミド分離液（約
４００μｌ）を採取した。ろ過時間は約２分４０秒であ
った。このプラスミド分離液に０．６倍量のイソプロピ
ルアルコールを加え、かくはん後遠心分離により目的の
プラスミドＤＮＡ画分を得た。得られた画分に変性染色
体ＤＮＡの混入も無く、高純度プラスミドＤＮＡを短時
間で調製することができた。
シリケートガラス繊維膜、及び孔径０．４５μｍの孔を
有するセルロースアセテート膜より成る径１０ｍｍの二
重膜を作製し、実施例１記載のＯＤ660nm 約３の培養液
１．５ｍｌを供し、吸引ビンを通して真空ポンプにて吸
引し、膜上に菌体を集菌した。次に二重膜上に４ｍｇ／
ｍｌのリゾチームを含む溶液Ｉ′を１００μｌ加え１分
間放置し、続いて溶液IIを２００μｌ加え２分間放置
し、更に溶液III を１５０μｌ加え中和し、３分放置
後、真空ポンプで吸引、ろ過し、プラスミド分離液（約
４００μｌ）を採取した。ろ過時間は約２分４０秒であ
った。このプラスミド分離液に０．６倍量のイソプロピ
ルアルコールを加え、かくはん後遠心分離により目的の
プラスミドＤＮＡ画分を得た。得られた画分に変性染色
体ＤＮＡの混入も無く、高純度プラスミドＤＮＡを短時
間で調製することができた。
【００２２】実施例３ 実施例１記載の方法に準じＯＤ660nm 約６の培養液を調
製した。ボロシリケートガラス繊維膜として、保留粒子
径０．５μｍの孔を有するボロシリケートガラス繊維膜
（ＧＣ−５０：膜厚０．２ｍｍ）、保留粒子径０．８μ
ｍの孔を有するボロシリケートガラス繊維膜（ＧＡ−２
００：膜厚０．７５ｍｍ：アドバンテック社製）、保留
粒子径１．０μｍの孔を有するボロシリケートガラス繊
維膜（ＧＡ−１００：膜厚０．４５ｍｍ：アドバンテッ
ク社製）をそれぞれ用い、孔径０．４５μｍの孔を有す
るセルロースアセテート膜との径１０ｍｍの二重膜をそ
れぞれ作製した。次に作製した二重膜を使用し、実施例
１記載のＯＤ660nm 約３の培養液、又は上記ＯＤ660nm
約６の培養液より、プラスミドＤＮＡ画分を実施例２に
準じ調製した。各二重膜を使用した場合の培養液及びプ
ラスミド分離液のろ過時間と、収量比を表２に示す。な
お表中プラスミドＤＮＡの収量比は保留粒子径０．５μ
ｍの孔を有するボロシリケートガラス繊維膜を使用し、
ＯＤ660nm 約３の培養液を処理した際のプラスミド収量
を１００とした。
製した。ボロシリケートガラス繊維膜として、保留粒子
径０．５μｍの孔を有するボロシリケートガラス繊維膜
（ＧＣ−５０：膜厚０．２ｍｍ）、保留粒子径０．８μ
ｍの孔を有するボロシリケートガラス繊維膜（ＧＡ−２
００：膜厚０．７５ｍｍ：アドバンテック社製）、保留
粒子径１．０μｍの孔を有するボロシリケートガラス繊
維膜（ＧＡ−１００：膜厚０．４５ｍｍ：アドバンテッ
ク社製）をそれぞれ用い、孔径０．４５μｍの孔を有す
るセルロースアセテート膜との径１０ｍｍの二重膜をそ
れぞれ作製した。次に作製した二重膜を使用し、実施例
１記載のＯＤ660nm 約３の培養液、又は上記ＯＤ660nm
約６の培養液より、プラスミドＤＮＡ画分を実施例２に
準じ調製した。各二重膜を使用した場合の培養液及びプ
ラスミド分離液のろ過時間と、収量比を表２に示す。な
お表中プラスミドＤＮＡの収量比は保留粒子径０．５μ
ｍの孔を有するボロシリケートガラス繊維膜を使用し、
ＯＤ660nm 約３の培養液を処理した際のプラスミド収量
を１００とした。
【００２３】
【表２】 表 ２ ──────────────────────────────────── ガラス繊維膜保留粒子径 菌体負荷量 ろ過時間 収量比 （μｍ） ＯＤ660nm 培養液 プラスミド分離液 ──────────────────────────────────── ＧＣ−５０ ３ 38秒 2分38秒 100 ０．５ ６ 3分38秒 14分35秒 119 ──────────────────────────────────── ＧＡ−２００ ３ 40秒 2分18秒 54 ０．８ ６ 2分40秒 4分30秒 102 ──────────────────────────────────── ＧＡ−１００ ３ 1分 5秒 3分30秒 44 １．５ ６ 4分35秒 8分55秒 93 ────────────────────────────────────
【００２４】ＧＣ−５０の場合、菌体負荷量が多くなる
とろ過時間が長くなり二重膜の特徴の１つである迅速性
が失われてしまう。大腸菌の増殖量は培地組成、培養条
件、クローンの種類によって様々でありフィルター上に
供する菌体量を制限することは実験操作上実際的ではな
いために菌量の増加に対してもろ過時間の短いことが望
まれる。この問題は、ガラス繊維膜の種類をＧＡ−１０
０、ＧＡ−２００に変えることによって改善された。こ
れら２種の膜では同量の菌体から得られるプラスミドＤ
ＮＡの収率は低下するが、その収量は、その後の通常の
プラスミドの使用に必要な量以上であった。なお、各ボ
ロシリケートガラス繊維膜と孔径０．２μｍ又は０．８
μｍの孔を有するセルロースアセテート膜（Ｃ０２０
Ａ，Ｃ０８０Ａ：アドバンテック社製）をそれぞれ組合
せ使用した場合の各ろ過時間、プラスミドＤＮＡの収
率、純度は孔径０．４５μｍの孔を有するセルロースア
セテート膜を使用した場合と同様の結果を示した。
とろ過時間が長くなり二重膜の特徴の１つである迅速性
が失われてしまう。大腸菌の増殖量は培地組成、培養条
件、クローンの種類によって様々でありフィルター上に
供する菌体量を制限することは実験操作上実際的ではな
いために菌量の増加に対してもろ過時間の短いことが望
まれる。この問題は、ガラス繊維膜の種類をＧＡ−１０
０、ＧＡ−２００に変えることによって改善された。こ
れら２種の膜では同量の菌体から得られるプラスミドＤ
ＮＡの収率は低下するが、その収量は、その後の通常の
プラスミドの使用に必要な量以上であった。なお、各ボ
ロシリケートガラス繊維膜と孔径０．２μｍ又は０．８
μｍの孔を有するセルロースアセテート膜（Ｃ０２０
Ａ，Ｃ０８０Ａ：アドバンテック社製）をそれぞれ組合
せ使用した場合の各ろ過時間、プラスミドＤＮＡの収
率、純度は孔径０．４５μｍの孔を有するセルロースア
セテート膜を使用した場合と同様の結果を示した。
【００２５】実施例４ 実施例３記載の保留粒子径０．８μｍの孔を有するボロ
シリケートガラス繊維膜、及び孔径０．４５μｍの孔を
有するセルロースアセテート膜より成る径１０ｍｍの二
重膜を保持するフィルターを２４本作製し、次いで２４
本立の箱型の多数サンプル処理用吸引容器を用い、実施
例１記載の培養液１．５ｍｌ、及び溶液Ｉ′２００μ
ｌ、溶液II４００μｌ、溶液III ３００μｌを用い、実
施例２記載の方法に準じ２４サンプル一括処理を行っ
た。吸引容器内の真空度−７５０ｍｍＨｇにおいては激
しい発泡によりプラスミド分離液をかなり損失した。こ
の発泡を防ぐために多数サンプル処理用吸引容器と真空
ポンプの間にニードルバルブを設け容器内の真空度を調
節した。その結果、真空度を−６５０ｍｍＨｇ付近にコ
ントロールすることで発泡をほぼ抑制することができ
た。更に、最終濃度が０．０２％になるようにエイノー
ル（バイオット社製消泡剤）を加えることにより発泡は
完全に抑制された。そこで、溶液III にエイノールを
０．０５％添加し、吸引時の真空度を−６５０ｍｍＨｇ
付近に調整し、２４サンプル一括処理を行った。培養液
の添加から、プラスミド分離液の採取までの操作中に、
発泡等によるプラスミド分離液の損失は無く、簡便にプ
ラスミド分離液を採取することができた。また、このと
き得られたプラスミドＤＮＡは、制限酵素処理、シーク
エンシングに問題なく使用することができた。なお、実
施例３に記載の培養液を用いた場合も、２０分以内に２
４サンプルのプラスミド分離液の採取を終了することが
でき、イソプロピルアルコール処理後のプラスミドＤＮ
Ａの純度も充分であった。
シリケートガラス繊維膜、及び孔径０．４５μｍの孔を
有するセルロースアセテート膜より成る径１０ｍｍの二
重膜を保持するフィルターを２４本作製し、次いで２４
本立の箱型の多数サンプル処理用吸引容器を用い、実施
例１記載の培養液１．５ｍｌ、及び溶液Ｉ′２００μ
ｌ、溶液II４００μｌ、溶液III ３００μｌを用い、実
施例２記載の方法に準じ２４サンプル一括処理を行っ
た。吸引容器内の真空度−７５０ｍｍＨｇにおいては激
しい発泡によりプラスミド分離液をかなり損失した。こ
の発泡を防ぐために多数サンプル処理用吸引容器と真空
ポンプの間にニードルバルブを設け容器内の真空度を調
節した。その結果、真空度を−６５０ｍｍＨｇ付近にコ
ントロールすることで発泡をほぼ抑制することができ
た。更に、最終濃度が０．０２％になるようにエイノー
ル（バイオット社製消泡剤）を加えることにより発泡は
完全に抑制された。そこで、溶液III にエイノールを
０．０５％添加し、吸引時の真空度を−６５０ｍｍＨｇ
付近に調整し、２４サンプル一括処理を行った。培養液
の添加から、プラスミド分離液の採取までの操作中に、
発泡等によるプラスミド分離液の損失は無く、簡便にプ
ラスミド分離液を採取することができた。また、このと
き得られたプラスミドＤＮＡは、制限酵素処理、シーク
エンシングに問題なく使用することができた。なお、実
施例３に記載の培養液を用いた場合も、２０分以内に２
４サンプルのプラスミド分離液の採取を終了することが
でき、イソプロピルアルコール処理後のプラスミドＤＮ
Ａの純度も充分であった。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、簡便で迅速な高純度プラ
スミドＤＮＡの調製方法が提供され、また本発明の分離
膜を使用することにより、被分離物の多数サンプルの一
括処理を効率よく行うことができる。
スミドＤＮＡの調製方法が提供され、また本発明の分離
膜を使用することにより、被分離物の多数サンプルの一
括処理を効率よく行うことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中尾 雅幸 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 石野 良純 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 村上 勝志 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 平４−360686（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−349892（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 B01D 61/14 B01D 71/04 B01D 71/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 プラスミドＤＮＡの調製方法において、
該プラスミドＤＮＡを保持する微生物又は細胞を破壊し
て得られるプラスミドＤＮＡを含有する微生物又は細胞
内成分を、下部に孔径０．２〜０．８μmの孔を有する
セルロースアセテート膜が位置し、該膜の上部に保留粒
子径０．５〜１．０μmの孔を有するボロシリケートガ
ラス繊維膜が位置する二重膜で分離し、染色体ＤＮＡが
分離された液を採取する工程を包含することを特徴とす
るプラスミドＤＮＡの調製方法。 - 【請求項２】 染色体ＤＮＡが分離されたプラスミドＤ
ＮＡを調製するための分離膜であって、下部に孔径０．
２〜０．８μmの孔を有するセルロースアセテート膜が
位置し、該膜の上部に保留粒子径０．５〜１．０μmの
孔を有するボロシリケートガラス繊維膜が位置している
ことを特徴とする分離膜。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06914593A JP3207596B2 (ja) | 1993-03-05 | 1993-03-05 | プラスミドｄｎａの調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06914593A JP3207596B2 (ja) | 1993-03-05 | 1993-03-05 | プラスミドｄｎａの調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253842A JPH06253842A (ja) | 1994-09-13 |
| JP3207596B2 true JP3207596B2 (ja) | 2001-09-10 |
Family
ID=13394201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06914593A Expired - Fee Related JP3207596B2 (ja) | 1993-03-05 | 1993-03-05 | プラスミドｄｎａの調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3207596B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2965131B2 (ja) | 1995-07-07 | 1999-10-18 | 東洋紡績株式会社 | 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法 |
| US6146854A (en) * | 1995-08-31 | 2000-11-14 | Sequenom, Inc. | Filtration processes, kits and devices for isolating plasmids |
-
1993
- 1993-03-05 JP JP06914593A patent/JP3207596B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06253842A (ja) | 1994-09-13 |
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