JP3217112B2 - 硫酸化糖の選択的脱硫酸化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、硫酸化糖の選択的脱硫
化方法に関し、更に詳しくは硫酸化糖の硫酸エステルの
うち、第１級水酸基（構成糖単位が５炭糖又は６炭糖類
からなる場合は、それぞれ５位又は６位の水酸基を表
す）に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化する方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】生物活性を有する硫酸化糖を提供するた
めに、様々な硫酸化糖の脱硫酸方法が研究されている。
硫酸化糖の脱硫酸方法としては、塩化水素メタノ−ル中
で酸触媒により脱硫酸する方法が知られている（Kantor
T.G. and Schubert M., J. Amer. Chem. Soc. 79, 152
(1957) ）。しかし、この方法では特定の硫酸基のみを
脱硫酸することはできず、またグリコシド結合のメタノ
リシスによる糖鎖の切断が起こるため低分子化し、もと
の鎖長を有する反応生成物の収量は低下する。

【０００３】収量よく脱硫酸を行う方法として、ジメチ
ルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はピ
リジン等の非プロトン性溶媒中（Usov A. I., Adamyant
s K.S., Miroshnikova L. I., Shaposhnikova A.A. and
Kochetkov N.K.,Carbohydr. Res. 18,336 (1971)）又
は少量の水又はメタノ−ルを含むジメチルスルホキシド
中（Nagasawa K., Inoue Y. and Kamata T., Carbohyd
r. Res., 58, 47 (1977) , Nagasawa K., Inoue Y. and
Tokuyasu T , J. Biochem., 86, 1323 (1979)）で行う
ソルボリシスがある。ソルボリシスの反応機構は、非プ
ロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を用い
て行う硫酸化反応の逆反応であることが知られている。
この反応は、反応条件をコントロ−ルすることによりＮ
−硫酸基の選択的脱硫酸方法として用いることができ
る。しかし、Ｏ−硫酸基の場合には、第１級又は第２級
水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱離させること
はできなかった。また、現在までのところ位置特異性を
持った脱硫酸化酵素も知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】第１級水酸基に結合し
ている硫酸基の特異的脱離法の開発は、ヒトに対し好ま
しい生物活性を有する医薬品の創造を目的とした硫酸化
糖を提供するために非常に重要である。例えば、硫酸化
多糖であるデキストラン硫酸、キシラン硫酸、コンドロ
イチン硫酸、ヘパリン類は、脂質代謝改善剤、抗血栓剤
として使用されているが、人工的に硫酸基を導入したも
のは、導入した硫酸基の位置が特定できず、多量に硫酸
基を導入するに従い組織からの出血傾向が強まる副作用
が生ずることも知られている。また、天然由来の硫酸化
糖は、起源の違いにより硫酸基の位置、量がそれぞれ異
なり、各硫酸化糖の生理活性も微妙に異なる。本発明者
は、硫酸化糖の特定位置の硫酸エステルを脱硫酸化する
ことにより、出血作用が少なく、かつ元の硫酸化糖に対
して異なる生物活性を発現させるための位置選択的硫酸
エステルの脱硫酸を目的として鋭意検討し、本発明に到
達した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の方法は、硫酸化
糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）
アセトアミド類と反応させることにより、硫酸化糖の第
１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸する
ことを特徴とする脱硫酸化糖の製造方法である。

【０００６】本発明の方法によれば、硫酸化糖の第１級
水酸基（構成糖単位が５炭糖又は６炭糖類からなる場合
は、それぞれ５位又は６位の水酸基を表す）に結合して
いる全部の硫酸基の脱硫酸化、又は部分的脱硫酸化を選
択的に行うことができる。

【０００７】本発明の方法が適用される硫酸化糖は、単
糖、オリゴ糖、多糖、複合多糖の類を問わず、該糖の硫
酸エステルである。本方法に用いられる硫酸化糖の有機
塩基塩としては、ピリジン等の芳香族アミン；トリメチ
ルアミン、トリエチルアミン等の脂肪族３級アミン；Ｎ
−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチ
ルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル
複素環アミン等の有機塩基との塩が挙げられる。

【０００８】有機塩基を溶媒として硫酸化糖を溶解し、
該有機塩基との塩を形成させる。続いて無水の有機塩基
の存在下、トリメチルシリル化試薬であるＮ，Ｏ−ビス
（トリメチルシリル）アセトアミド（以下ＢＴＳＡと略
記）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフロロア
セトアミド（ＢＴＳＦＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチル
シリル）ジフロロアセトアミド、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメ
チルシリル）モノフロロアセトアミドを加え、反応温度
を室温〜１００℃で反応させることにより、本発明の選
択的脱硫酸化を達成することができる。

【０００９】第１級水酸基に結合している硫酸基の全部
を脱硫酸化する場合は、硫酸化糖中の遊離水酸基及び硫
酸エステル化水酸基を含む全水酸基のモル量に対し１６
倍モル量以上、第１級水酸基に結合している硫酸基を部
分的に脱硫酸化し、該硫酸基量の一部を残存させる場合
には、３倍〜１６倍モル量のトリメチエルシリル化試薬
を用いればよい。

【００１０】具体的には、例えば、第１級水酸基に結合
している硫酸基の全部を脱硫酸化する場合、前記の条件
を満足するトリメチルシリル化剤量の存在下、好ましく
は４０℃〜８０℃で３時間以内反応させることにより、
目的の全部を脱硫酸化することができる。また、第１級
水酸基に結合している硫酸基を部分的に脱硫酸化する場
合、所定のトリメチルシリル化剤量の存在下、好ましく
は３０℃〜８０℃で２時間以上、適宜条件を組み合わせ
て反応させることにより目的を達成できる。

【００１１】続いて反応液中に水を加え、余分のトリメ
チルシリル化剤を加水非反応性とすることにより反応を
停止させ、次いで溶媒及び非反応性のトリメチルシリル
化剤を透析により可能な限り除去する。次に、透析内液
を１００℃で３０分〜１時間沸騰させ、透析内液中に残
存するＯ−トリメチルシリル化糖誘導体のＯ−トリメチ
ルシリル基を加水分解除去する。

【００１２】用いた硫酸化糖に、第１級水酸基との硫酸
エステルに加えて第２級水酸基との硫酸エステルが存在
する場合、又は、第１級水酸基に結合している硫酸基の
全部を脱硫酸化しない反応条件を選択した場合には、こ
れら残存する硫酸基をＮａ塩とするために、水酸化ナト
リウムを加えてpH９前後に調整し、透析した後、凍結乾
燥して硫酸化糖のナトリウム塩を得ることができる。

【００１３】

【実施例】以下、実施例及び試験例により本発明を更に
詳細に説明するが、硫酸化糖の同定は以下の試験例に基
づき行った。実施例は本発明の範囲をなんら制限するも
のではない。

【００１４】試験例 １）硫酸イオンの定量 硫酸化糖及び脱硫酸化糖の硫酸基の定量は、新生化学実
験講座３，糖質II，p37,p 81 （東京化学同人刊）に記
載の方法に従い、酸加水分解により硫酸基を遊離硫酸イ
オンとし、次いで該イオンをイオン交換樹脂に吸着させ
た後、溶媒を用いて溶出し、その遊離硫酸イオンを電気
電導度計を用いて検出、定量した。

【００１５】すなわち、３００μｇの硫酸化糖に３Ｎ−
塩酸1 mlを加え、１００℃で１８時間加水分解した。そ
の溶液を乾燥した後、１ｍｌの水に溶解した。ミリポア
限外ろ過膜（0.45 μm ）でろ過した後、硫酸イオン含
量をＨＰＬＣ（Waters ILC-1）によるイオン交換クロマ
ロトグラフィーで分析した。カラムに IC Pak Anion（W
aters, 4.6 mm × 5 cm ）を用い、1.3 mM四ホウ酸ナ
トリウム、 1.5 mM グルコン酸ナトリウム、 6 mM ホウ
酸、0.25％グリセリン及び 12 ％アセトニトリルの組成
の移動相を使用して、0.8 ml／分の流速で展開した。硫
酸イオンの検出には電気電導度計（Waters 430）を用い
た。

【００１６】２）¹³Ｃ−ＮＭＲ 硫酸化糖の水酸基の性質を判定する目的で、骨格炭素の
核磁気共鳴スペクトルを測定した。１０％糖の重水溶液
でのスペクトルは、80℃、 75.4 MHz(GeneralElectoric
Company, QE-300 ）で測定した。

【００１７】３）酵素消化による構造解析 新生化学実験講座３，糖質II p49〜62に記載の「２・８
グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組合せた構
造解析」を参照して次のようにして行った。

【００１８】ａ）コンドロイチナ−ゼＡＢＣによる消化 吉田らの方法（生化学，57,1189 (1985)）により、デル
マタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の水溶液（10 mg/m
l）２０μl に、0.4 M トリス−塩酸(pH 8.0)２０μl
、0.4 M 酢酸ナトリウム２０μl 、0.1 ％ウシ血清ア
ルブミン２０μl 及び水１２０μl を加え、コンドロイ
チナ−ゼＡＢＣ（5U/ml ）を２０μl 加えて、３７℃で
２時間反応させた。

【００１９】ｂ）ヘパリン分解酵素による消化 M,W,Mcleanの方法（M.W.Mclean, “ Proc. 9th Int. Sy
mp. Glycoconjugates”,p.B41(1987)）により、ヘパリ
ン０．１ mg を 2 mM 酢酸カルシウムを含む 20 mM 酢
酸ナトリウム (pH 7.0) ２２０μl に溶解して、20 mU
のヘパリナ−ゼ、20 mU のヘパリチナ−ゼＩ及びIIを加
えて、３７℃で２時間反応させた。

【００２０】ｃ）ＨＰＬＣによる分析 コンドロイチナ−ゼＡＢＣ又はヘパリン分解酵素消化を
行った後の溶液５０μl を、ＨＰＬＣ（医理化、モデル
852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（島津 P
NH₂ カラム,4.0 mm × 250 mm ）を使用し、232 nmでの
吸光度を測定した。流速１ml／分で、16mMリン酸水素ナ
トリウムを６０分間に０％から５０％まで上昇させて溶
出した。

【００２１】４）ゲルろ過 硫酸化糖の３％溶液１０μl をＨＰＬＣによるゲルろ過
で分析した。カラムはＴＳＫgel-G4000PW_X1 （東ソ−、
7.8 mm × 30 cm）を用い、溶離液に 0.2 M硫酸カリウ
ムを使用して、1.0 ml／分の流速で展開した。硫酸化糖
の検出には示差屈折計（島津,AID-2A ）を用いた。

【００２１】実施例１ メチル−α−ガラクトピラノシド−６硫酸アンモニウム
塩約２mg／３mlの水溶液に、アンバ−ライトＩＲ−１２
０Ｈ型樹脂５mlを加えて、遊離の硫酸エステル型に変換
させた。樹脂を除去した後、ピリジン２mlを加え、ピリ
ジニウム塩を形成させた。残余のピリジンを減圧下で留
去し、残渣を凍結乾燥することにより、乾燥メチル−α
−ガラクトピラノシド−６硫酸ピリジニウム塩を調製し
た。この試料を各０．２ mg づつ小分けし、乾燥ピリジ
ン約０．０５mlを加えて、メチル−α−ガラクトピラノ
シド−６硫酸ピリジニウム塩の全水酸基モル量（[-OH]
＋[-O-SO₃ ^-]）に対するＢＴＳＡのモル量が０〜２０倍
量までの異なる反応系を用意した。各系にＢＴＳＡを加
えた後、８０℃で約１時間加熱反応させた。各系の反応
混合物中のトリメチルシリル化メチルガラクトピラノシ
ドを直接ガスクロマトグラフィ−で測定することによ
り、脱硫酸量を算出して図１に示した。

【００２２】実施例２ 実施例１のＢＴＳＡモル量を１６倍量及び８倍量に設定
し、反応温度を４０℃、６０℃、８０℃に変えて、経時
的に脱硫酸化率を検討した。その結果を図２に示した。

【００２３】実施例１及び２から明らかなように、ＢＴ
ＳＡが硫酸化糖の遊離水酸基及び硫酸化水酸基を含む全
水酸基のモル量に対して１６倍モル量以上で、反応温度
４０℃〜８０℃、３時間以内反応させることにより第１
級水酸基に結合している硫酸基の全部を脱硫酸化するこ
とができる。また第１級水酸基に結合している硫酸基を
部分的に脱硫酸化する場合には、ＢＴＳＡを３〜１６倍
迄のモル量で、反応温度を３０℃〜８０℃、反応時間を
適宜選択することにより目的を達成することができる。

【００２４】実施例３〜９ α−Ｄ−ガラクトピラノシド−６硫酸（実施例３）、α
−Ｄ−ガラクトピラノシド−２硫酸（実施例４）、フノ
ラン（実施例５）、ポルフィラン（実施例６）、コンド
ロイチン硫酸（実施例７）、デルマタン硫酸（実施例
８）、ヘパリン（実施例９）の７種の硫酸化糖の脱硫酸
化を、それぞれＢＳＴＡにより以下のようにして行っ
た。

【００２５】各硫酸化糖のナトリウム塩２００mgをそれ
ぞれＩＲ−１２０（Ｈ⁺ 型）カラム（1 ×10 cm ）にか
け、溶出液に過剰のピリジンを加えてpH８に中和し、凍
結乾燥して各硫酸化糖のピリジン塩を調製した。各硫酸
化糖のピリジン塩をそれぞれ脱水したピリジン２０mlに
溶解して反応試料とした。各試料の糖骨格の全水酸基の
計算当量に対して２０倍モル量（約４ml）のＢＴＳＡを
加え、６０℃で２時間攪拌した。反応終了後、２０ｍｌ
の水を加えて未反応のＢＴＳＡを加水非反応性とするこ
とにより反応を停止させ、ミリポア限外ろ過膜を用いて
透析した。

【００２６】次にＯ−トリメチルシリル基を加水分解除
去するため、透析内液を１００℃で３０分から１時間
（溶液が透明になるまで）加熱沸騰させた。水酸化ナト
リウムを加えてpH９〜９．５に調整した後、透析した。
透析内液を凍結乾燥して、各硫酸化糖の脱硫酸化処理物
各１４０ mg 相当のナトリウム塩を得た。各糖の処理前
後の硫酸イオンの定量値を表１に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】実施例１０，比較例１〜３ 実施例３及び４に準じ、トリメチルシリル化剤としてＢ
ＴＳＦＡ、トリメチルシリルイミダゾ−ル（ＴＳＩ）、
ヨウ化トリメチルシラン（ＩＴＳ）、Ｎ，Ｏ−ビス（ト
リメチルシリル）カーバメ−ト（ＢＳＣ）を用いて反応
させた結果を表２に示す。

【００２９】

【表２】

【００３０】実施例３、４から判るように、本発明の方
法は、第１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱
硫酸化する方法であり、第２級水酸基の脱硫酸化は起こ
らないことが判る。

【００３１】実施例５のフノランは - 3 D Gal(6-SO₄)
β1-4(3,6-anhydro)L-Gal α1-の２糖が繰り返した構造
であり、ＢＴＳＡ処理により硫酸基が殆んど無くなっ
た。実施例６のポルフィランは -3 D Gal β1-4 LGal(6
-SO₄) α1- の２糖が繰り返した構造であり、ＢＴＳＡ
処理により硫酸基が殆んど無くなった。これら実施例５
及び６におけるＮＭＲの解析では、Ｃ−６位の¹³Ｃシグ
ナルの高磁場シフト並びにＣ−５位の低磁場シフトが確
認され、他の部位に変化がなく、Perlin A.S. and Casu
B. の報告（The Polysaccharides Vol.1,p133〜193 (
Academic Press )）と一致した。

【００３２】実施例８のコンドロイチン硫酸は鮫由来の
もので、コンドロイチナ−ゼ類を用いる組成２糖分析に
より、６硫酸：４硫酸の量比が９０：１０であった。実
施例８、９のコンドロイチン硫酸とヘパリンは、６硫酸
だけでなく４硫酸やジ硫酸エステル等を含んでおり、Ｂ
ＴＳＡ処理後の硫酸イオン含量はそれぞれ６．６％、２
４．９％の値を示した。実施例７のデルマタン硫酸は殆
んどが４硫酸であったため、ＢＴＳＡ処理前後での硫酸
イオン含量の変化は少なかった。

【００３３】デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリンについては、更に詳しい構造変化を調べるため
に、２糖単位に酵素消化してＨＰＬＣにより分析した。
実施例７、８、９の対応する硫酸化糖並びに脱硫酸化処
理後の糖に対し、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫
酸に対してはコンドロイチナ−ゼＡＢＣ、ヘパリンに対
してはヘパリン分解酵素を用い、新実験生化学講座３，
糖質II p54〜59（東京化学同人刊）の方法に従って処理
した。生じた不飽和２糖異性体のＨＰＬＣ分画クロマト
グラムを図３に示す。

【００３４】実施例７で用いたデルマタン硫酸は殆んど
が４硫酸であり、６硫酸が少量混ざっているものであっ
が、ＢＴＳＡ処理により６硫酸のみに脱硫酸が起こり、
硫酸基が結合していない２糖残基になった以外は全く変
化が認められなかった。また、実施例８で用いたコンド
イチン硫酸は６硫酸、４硫酸、ジ硫酸エステル等の混合
物であったが、ＢＴＳＡ処理をすると、６硫酸のみが脱
離したために起きた変化しか見られなかった。次に実施
例９で用いたヘパリンについては、消化されて遊離した
２糖残基を比較すると６硫酸のみが脱離され、その他の
位置の硫酸基は一切変化を受けていなかった。

【００３５】更に、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫
酸、ヘパリンについて、ゲルろ過によりＢＴＳＡ処理前
後の分子量変化を調べた。図４に示したように分子量分
布の変化は殆んど認められなかった。

【００３６】以上のことから、ＢＴＳＡによる脱硫酸化
反応は、第１級水酸基に結合している硫酸基に特異的に
働き、他の位置の硫酸基及びグリコシド結合には影響を
与えないことが明らかである。

【００３７】実施例１、１０及び比較例１、２、３から
わかるように、本発明の方法で適用可能なシリル化剤と
しては、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミ
ド類のような有機カルボン酸アミドのＮ，Ｏ−ビス（ト
リメチルシリル）化合物に特定できる。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、糖骨格の水酸基に結合
している性質の異なる硫酸基を、第１級水酸基及び第２
級水酸基の違いを認識して脱硫酸化することにより、従
来知られていない位置特定硫酸エステルを有する硫酸化
糖を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＴＳＡ量変化に伴うメチル−α−ガラクトピ
ラノシド−６硫酸の脱硫酸化率を示したグラフである。

【図２】メチル−α−ガラクトピラノシド−６硫酸の各
温度における経時的脱硫酸化率を示したグラフである。
実線はＢＴＳＡ１６倍モル量、破線はＢＴＳＡ８倍モル
量での結果を示す。

【図３】ＢＴＳＡ処理による糖組成の変化を示した分画
クロマトグラムである。

【図４】ＢＴＳＡ処理による分子量分布の変化を示した
ＨＰＬＣ（ゲルろ過）のクロマトグラムである。実線は
ＢＴＳＡ処理前、破線はＢＴＳＡ処理後を示す。

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 硫酸化糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ−ビス
   （トリメチルシリル）アセトアミド類と反応させること
   により、硫酸化糖の第１級水酸基に結合している硫酸基
   を選択的に脱硫酸することを特徴とする脱硫酸化糖の製
   造方法。
2. 【請求項２】 フノラン、ポルフィラン、及びヘパリン
   からなる群より選択される第１級水酸基に硫酸基が結合
   している硫酸化多糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ−ビス（ト
   リメチルシリル）アセトアミド類と反応させることによ
   り得られる、第１級水酸基に結合している硫酸基が選択
   的に脱硫酸された硫酸化多糖。
3. 【請求項３】 硫酸イオン含量が２５％以下である、請
   求項３に記載の硫酸化多糖。
4. 【請求項４】 コンドロイチン硫酸の第１級水酸基に硫
   酸基が結合している硫酸化多糖の有機塩基塩を、Ｎ，Ｏ
   −ビス（トリメチルシリル）アセトアミド類と反応させ
   ることにより得られる第１級水酸基に結合している硫酸
   基が選択的に脱硫酸されたコンドロイチン硫酸であっ
   て、前記コンドロイチン硫酸は、グリコサミノグリカン
   分解酵素とＨＰＬＣとを組み合わせた構造解析におい
   て、ΔＤｉ−６Ｓ及びΔＤｉ−ｄｉＳ_Dで表される不飽
   和二糖異性体が実質的に検出されず、少なくともΔＤｉ
   −０Ｓ及びΔＤｉ−ＵＡ２Ｓで表される不飽和二糖異性
   体が検出されるものである、第１級水酸基に結合してい
   る硫酸基が選択的に脱硫酸されたコンドロイチン硫酸。