JP3302017B2 - 組み換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成 - Google Patents
組み換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 多くの外因性遺伝子の発現は様々な組み換え宿主−ベ
クターシステムにおいて容易に行うことができるが、タ
ンパク質が通常多くの翻訳後プロセシングを必要とする
場合、発現は難しくなる。これが、翻訳後酵素によるプ
ロセシングを必要とする主要な繊維コラーゲンについ
て、完全な組み換えシステムにおける発現が今のところ
報告されていない理由のようである。Prockop及びKivir
ikko,N.Engl.J.Med.1984,311,376−386参照。プロリル
４−ヒドロキシラーゼは、Gly−Ｘ−Ｙ繰り返し配列の
Ｙ部位にあるプロリン残基を４−ヒドロキシプロリンに
ヒドロキシル化するのに必要な酵素であるため、おそら
く細胞によるプロコラーゲン及びコラーゲンの合成に必
要な、重要な翻訳後酵素（post−translational enzym
e）の一つである。Prockop及びKivirikko,N.Engl.J.Me
d.1984,311,376−386。適切な数のＹ部位にあるプロリ
ン残基がプロリル４−ヒドロキシラーゼによって４−ヒ
ドロキシプロリンにヒドロキシル化されない限り、新た
に合成されたペプチド鎖は37℃において３重ヘリックス
構造に折りたたまれない。ヒドロキシル化が起こらない
場合、ポリペプチドはヘリックス構造をとらず、細胞か
ら殆ど分泌されず、コラーゲン繊維へと自己重合できな
い。最近、プロリル４−ヒドロキシラーゼがバキュロウ
イルスによって発現された。Vuorio,K.et al.,Proceed
ings of the National Academy of Science,U.S.
A.,1992,89,7467−7470。
クターシステムにおいて容易に行うことができるが、タ
ンパク質が通常多くの翻訳後プロセシングを必要とする
場合、発現は難しくなる。これが、翻訳後酵素によるプ
ロセシングを必要とする主要な繊維コラーゲンについ
て、完全な組み換えシステムにおける発現が今のところ
報告されていない理由のようである。Prockop及びKivir
ikko,N.Engl.J.Med.1984,311,376−386参照。プロリル
４−ヒドロキシラーゼは、Gly−Ｘ−Ｙ繰り返し配列の
Ｙ部位にあるプロリン残基を４−ヒドロキシプロリンに
ヒドロキシル化するのに必要な酵素であるため、おそら
く細胞によるプロコラーゲン及びコラーゲンの合成に必
要な、重要な翻訳後酵素（post−translational enzym
e）の一つである。Prockop及びKivirikko,N.Engl.J.Me
d.1984,311,376−386。適切な数のＹ部位にあるプロリ
ン残基がプロリル４−ヒドロキシラーゼによって４−ヒ
ドロキシプロリンにヒドロキシル化されない限り、新た
に合成されたペプチド鎖は37℃において３重ヘリックス
構造に折りたたまれない。ヒドロキシル化が起こらない
場合、ポリペプチドはヘリックス構造をとらず、細胞か
ら殆ど分泌されず、コラーゲン繊維へと自己重合できな
い。最近、プロリル４−ヒドロキシラーゼがバキュロウ
イルスによって発現された。Vuorio,K.et al.,Proceed
ings of the National Academy of Science,U.S.
A.,1992,89,7467−7470。
Schnieke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1987,
84,8869−8873及びLee et al.,J.Biol.Chem.1989,26
4,20683−20687に、Ｉ型コラーゲンの２つの鎖のうち１
つだけを合成する、２つの異なるシステムにおけるレス
キュー実験が記載されている。Schniekeらはヒト繊維コ
ラーゲンproα１（Ｉ）鎖の遺伝子すなわちCOL1A1遺伝
子はマウス繊維芽細胞において発現でき、鎖がＩ型コラ
ーゲンの前駆体であるＩ型プロコラーゲン分子の重合に
用いられると報告した。しかし、このシステムにおいて
は、同分子中のproα２（Ｉ）鎖はマウス由来である。L
eeらのシステムにおいてはproα１（Ｉ）鎖はラット由
来である。従って、３つの鎖すべてが外因性遺伝子由来
であるプロコラーゲン分子の合成はSchniekeらによって
もLeeらによっても行われていない。
84,8869−8873及びLee et al.,J.Biol.Chem.1989,26
4,20683−20687に、Ｉ型コラーゲンの２つの鎖のうち１
つだけを合成する、２つの異なるシステムにおけるレス
キュー実験が記載されている。Schniekeらはヒト繊維コ
ラーゲンproα１（Ｉ）鎖の遺伝子すなわちCOL1A1遺伝
子はマウス繊維芽細胞において発現でき、鎖がＩ型コラ
ーゲンの前駆体であるＩ型プロコラーゲン分子の重合に
用いられると報告した。しかし、このシステムにおいて
は、同分子中のproα２（Ｉ）鎖はマウス由来である。L
eeらのシステムにおいてはproα１（Ｉ）鎖はラット由
来である。従って、３つの鎖すべてが外因性遺伝子由来
であるプロコラーゲン分子の合成はSchniekeらによって
もLeeらによっても行われていない。
完全な組み換えシステムにおける繊維コラーゲン遺伝
子の発現を行えないことがタンパク質の通常の構造−機
能関係の研究及び突然変異の影響の研究を妨げていた。
Anderson et al.,Am.J.Hum.Genet.1990,46,896−901;
Tiller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990、8
7、3889−3893;Vissing et al.,J.Biol.Chem.1990,26
4,18265−18267;Lee et al.,Science 1989,244,978
−980;Francomano et al.,Genomics 1987,1,293−29
6;Knowlton et al.,Am.J.Hum.Genet.1989,45,681−68
8;Ahmad et al.,Am.J.Hum.Genet.1990,47,A206;Palot
ie et al.,The Lancet 1989,I,924−927;Knowlton
et al.,N.Engl.J.Med.1990,322,526−530;Ala−Kokk
o et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990、87、6565
−6568に記載されているように特に、II型プロコラーゲ
ン遺伝子の突然変異は最近、いくつかのヒトの病気と関
連付けられたが、Elima and Vuorio,FEBS Lett.198
9,258,195−198;Aulthouse et al.,In Vitro Dev.B
iol.1989,25,659−668に記載されているように、十分な
数のヒト軟骨細胞を得るのは難しく、かつヒト軟骨細胞
は培養すると直ちに表現型を失うため、タンパク質の生
物学的機能と遺伝子の突然変異の間の因果関係は確認し
にくい。
子の発現を行えないことがタンパク質の通常の構造−機
能関係の研究及び突然変異の影響の研究を妨げていた。
Anderson et al.,Am.J.Hum.Genet.1990,46,896−901;
Tiller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990、8
7、3889−3893;Vissing et al.,J.Biol.Chem.1990,26
4,18265−18267;Lee et al.,Science 1989,244,978
−980;Francomano et al.,Genomics 1987,1,293−29
6;Knowlton et al.,Am.J.Hum.Genet.1989,45,681−68
8;Ahmad et al.,Am.J.Hum.Genet.1990,47,A206;Palot
ie et al.,The Lancet 1989,I,924−927;Knowlton
et al.,N.Engl.J.Med.1990,322,526−530;Ala−Kokk
o et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990、87、6565
−6568に記載されているように特に、II型プロコラーゲ
ン遺伝子の突然変異は最近、いくつかのヒトの病気と関
連付けられたが、Elima and Vuorio,FEBS Lett.198
9,258,195−198;Aulthouse et al.,In Vitro Dev.B
iol.1989,25,659−668に記載されているように、十分な
数のヒト軟骨細胞を得るのは難しく、かつヒト軟骨細胞
は培養すると直ちに表現型を失うため、タンパク質の生
物学的機能と遺伝子の突然変異の間の因果関係は確認し
にくい。
また、ヒト繊維コラーゲン遺伝子の発現が行えないこ
とにより、人間の種々の治療に使用でき、かつ、動物由
来のコラーゲンの使用によって引き起こされてしまう望
ましくない免疫反応を引き起こさないヒト繊維プロコラ
ーゲン及びコラーゲンの調製は不可能だった。
とにより、人間の種々の治療に使用でき、かつ、動物由
来のコラーゲンの使用によって引き起こされてしまう望
ましくない免疫反応を引き起こさないヒト繊維プロコラ
ーゲン及びコラーゲンの調製は不可能だった。
しかし最近、出願人らはヒトＩ型プロコラーゲン遺伝
子のプロモーターを用いたマウス3T3細胞におけるヒトI
I型プロコラーゲンの発現を記載した。Ala−Kokko et
al.,J.Biol.Chem.1991,266,14175;Ala−Kokko et a
l.,Matrix 1990,10,234. 発明の概要 本発明はヒト及び他の動物由来のコラーゲン遺伝子を
含む遺伝子コンストラクトの調製を含む。遺伝子コンス
トラクトの１つはＩ型プロコラーゲン（COL1A1）のヒト
遺伝子及びII型プロコラーゲン（COL2A1）のヒト遺伝子
のハイブリッドである。コンストラクトの5'端はプロモ
ーター、エクソン１及びCOL2A1遺伝子のイントロン１に
融合したCOL1A1遺伝子のイントロン１を含む。コンスト
ラクトはCOL1A1の第１イントロン中のプロモーター及び
推定されるエンハンサーがCOL1A2遺伝子の発現を促進
し、そしてヒトII型プロコラーゲンの生産を引き起こす
ようにデザインされる。COL2A1遺伝子は合計およそ26,0
00塩基対の、２つのSph I/Sph I遺伝子断片からなる。
このコンストラクトはシグナルペプチドのいくつかのコ
ドンを除くエクソン１のすべてのコーディング配列及び
エクソン１に続く、オルタナティブスプライシングされ
たエクソンを含む。コンストラクトのある型はmRNAのポ
リアデニル化の補正に必要な、遺伝子の3'端由来の3,50
0塩基対のSph I/Sph I断片も含む。
子のプロモーターを用いたマウス3T3細胞におけるヒトI
I型プロコラーゲンの発現を記載した。Ala−Kokko et
al.,J.Biol.Chem.1991,266,14175;Ala−Kokko et a
l.,Matrix 1990,10,234. 発明の概要 本発明はヒト及び他の動物由来のコラーゲン遺伝子を
含む遺伝子コンストラクトの調製を含む。遺伝子コンス
トラクトの１つはＩ型プロコラーゲン（COL1A1）のヒト
遺伝子及びII型プロコラーゲン（COL2A1）のヒト遺伝子
のハイブリッドである。コンストラクトの5'端はプロモ
ーター、エクソン１及びCOL2A1遺伝子のイントロン１に
融合したCOL1A1遺伝子のイントロン１を含む。コンスト
ラクトはCOL1A1の第１イントロン中のプロモーター及び
推定されるエンハンサーがCOL1A2遺伝子の発現を促進
し、そしてヒトII型プロコラーゲンの生産を引き起こす
ようにデザインされる。COL2A1遺伝子は合計およそ26,0
00塩基対の、２つのSph I/Sph I遺伝子断片からなる。
このコンストラクトはシグナルペプチドのいくつかのコ
ドンを除くエクソン１のすべてのコーディング配列及び
エクソン１に続く、オルタナティブスプライシングされ
たエクソンを含む。コンストラクトのある型はmRNAのポ
リアデニル化の補正に必要な、遺伝子の3'端由来の3,50
0塩基対のSph I/Sph I断片も含む。
第２のコンストラクトはプロモーター、第１エクソ
ン、イントロン、及びコンストラクトの5'断片としてヒ
トCOL1A1遺伝子の第１エクソンのおよそ半分を有する。
5'断片は唯一のKpn I制限酵素部位を介して、遺伝子の
最初の１と半分（one and one−half）のエクソンに
含まれる配列を除くすべてのコーディング配列を含むcD
NAに結合される。更に、cDNAの3'端はEcoR I部位を介し
てCOL1A1遺伝子の3'端由来のおよそ0.5KbのEcoR I/EcoR
I断片に結合される。一連の付加コンストラクトはヒト
COL1A1遺伝子の全長cDNAの発現を促進するため、サイト
メガロウイルスの強力なプロモーターを用いる。すべて
のコンストラクトは5'及び3'端に特異的な制限酵素部位
をもつように設計されており、従って、ベクター配列か
ら切り出すことができる。
ン、イントロン、及びコンストラクトの5'断片としてヒ
トCOL1A1遺伝子の第１エクソンのおよそ半分を有する。
5'断片は唯一のKpn I制限酵素部位を介して、遺伝子の
最初の１と半分（one and one−half）のエクソンに
含まれる配列を除くすべてのコーディング配列を含むcD
NAに結合される。更に、cDNAの3'端はEcoR I部位を介し
てCOL1A1遺伝子の3'端由来のおよそ0.5KbのEcoR I/EcoR
I断片に結合される。一連の付加コンストラクトはヒト
COL1A1遺伝子の全長cDNAの発現を促進するため、サイト
メガロウイルスの強力なプロモーターを用いる。すべて
のコンストラクトは5'及び3'端に特異的な制限酵素部位
をもつように設計されており、従って、ベクター配列か
ら切り出すことができる。
本発明はコラーゲン遺伝子コンストラクトの、選択さ
れた細胞へトランスフェクト及び発現を含む。本発明の
好ましい態様として、選択された細胞はプロコラーゲン
及びコラーゲンの生合成に重要な翻訳後酵素を１つ若し
くはそれ以上発現する。例えば、プロリル４−ヒドロキ
シラーゼはプロコラーゲン及びコラーゲンの生合成に重
要な翻訳後酵素である。プロコラーゲンまたはコラーゲ
ンを、このタンパク質を合成する生物の体温において安
定な３重ヘリックス構造に折り畳むために、この酵素は
プロコラーゲンまたはコラーゲン中の−Gly−Ｘ−Ｙ繰
り返しトリペプチド構造のＹに位置するおよそ100のプ
ロリン残基を４−ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化
しなければならない。このように、本発明の好ましい態
様として、プロリル４−ヒドロキシラーゼを発現する細
胞が好ましい。このような細胞は天然に翻訳後酵素を発
現するものであっても、プロリル４−ヒドロキシラーゼ
のような翻訳後酵素をコードする遺伝子をトランスフェ
クトされていてもよい。ホニュウ類細胞、昆虫細胞、ま
たは酵母細胞が望ましい。少なくとも１組のプロリル４
−ヒドロキシラーゼのような翻訳後酵素をコードする遺
伝子で形質転換されたホニュウ類細胞、昆虫細胞、およ
び酵母細胞は、本発明の別の好ましい態様において構築
されたコラーゲン遺伝子で形質転換されてもよい。本発
明はまた、培養可能で、必要な翻訳後酵素及び分泌機構
を含む、チャイニーズハムスターの卵巣細胞のようなそ
の他の細胞を利用することもできる。
れた細胞へトランスフェクト及び発現を含む。本発明の
好ましい態様として、選択された細胞はプロコラーゲン
及びコラーゲンの生合成に重要な翻訳後酵素を１つ若し
くはそれ以上発現する。例えば、プロリル４−ヒドロキ
シラーゼはプロコラーゲン及びコラーゲンの生合成に重
要な翻訳後酵素である。プロコラーゲンまたはコラーゲ
ンを、このタンパク質を合成する生物の体温において安
定な３重ヘリックス構造に折り畳むために、この酵素は
プロコラーゲンまたはコラーゲン中の−Gly−Ｘ−Ｙ繰
り返しトリペプチド構造のＹに位置するおよそ100のプ
ロリン残基を４−ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化
しなければならない。このように、本発明の好ましい態
様として、プロリル４−ヒドロキシラーゼを発現する細
胞が好ましい。このような細胞は天然に翻訳後酵素を発
現するものであっても、プロリル４−ヒドロキシラーゼ
のような翻訳後酵素をコードする遺伝子をトランスフェ
クトされていてもよい。ホニュウ類細胞、昆虫細胞、ま
たは酵母細胞が望ましい。少なくとも１組のプロリル４
−ヒドロキシラーゼのような翻訳後酵素をコードする遺
伝子で形質転換されたホニュウ類細胞、昆虫細胞、およ
び酵母細胞は、本発明の別の好ましい態様において構築
されたコラーゲン遺伝子で形質転換されてもよい。本発
明はまた、培養可能で、必要な翻訳後酵素及び分泌機構
を含む、チャイニーズハムスターの卵巣細胞のようなそ
の他の細胞を利用することもできる。
図面の簡単な説明 図１は最初の２つのエクソンを除くCOL2A1をすべて含
む30Kbの断片に結合したヒトCOL1A1遺伝子のプロモータ
ー、最初のエクソン及び最初のイントロンの大部分を含
む遺伝子コンストラクトをトランスフェクトされたHT−
1080細胞から培養液中に分泌されたタンパク質のSDSポ
リアクリルアミド電気泳動による解析を示す写真であ
る。培養液タンパク質をオートラジオグラフィー（stor
age phosphor film analyzer）で解析出来るよう
に、細胞を［14C］プロリンとともにインキュベートし
た。レーン１は未精製培養液タンパク質が３つの主要ポ
リペプチド鎖から成ることを示す。上側の２つはコンス
トラクトをトランスフェクトされていない細胞によって
合成されるIV型コラーゲンのproα１（IV）及びproα２
（IV）鎖である（示されていない）。３番目のバンドは
コンストラクトから合成されたヒトII型プロコラーゲン
のproα１（II）鎖である。レーン２及び３は培養液を
イオン交換カラム（DE−52,Whatman,レーン２はpH7.4レ
ーンはpH7.0）によるクロマトグラフィーにかけた後の
同じ培養液タンパク質である。II型プロコラーゲンはイ
オン交換カラムの排出体積（void volume）中に現れ
る。
む30Kbの断片に結合したヒトCOL1A1遺伝子のプロモータ
ー、最初のエクソン及び最初のイントロンの大部分を含
む遺伝子コンストラクトをトランスフェクトされたHT−
1080細胞から培養液中に分泌されたタンパク質のSDSポ
リアクリルアミド電気泳動による解析を示す写真であ
る。培養液タンパク質をオートラジオグラフィー（stor
age phosphor film analyzer）で解析出来るよう
に、細胞を［14C］プロリンとともにインキュベートし
た。レーン１は未精製培養液タンパク質が３つの主要ポ
リペプチド鎖から成ることを示す。上側の２つはコンス
トラクトをトランスフェクトされていない細胞によって
合成されるIV型コラーゲンのproα１（IV）及びproα２
（IV）鎖である（示されていない）。３番目のバンドは
コンストラクトから合成されたヒトII型プロコラーゲン
のproα１（II）鎖である。レーン２及び３は培養液を
イオン交換カラム（DE−52,Whatman,レーン２はpH7.4レ
ーンはpH7.0）によるクロマトグラフィーにかけた後の
同じ培養液タンパク質である。II型プロコラーゲンはイ
オン交換カラムの排出体積（void volume）中に現れ
る。
図２は図１に示される細胞から培養液中に分泌された
II型プロコラーゲンが正しい本来の構造に折り畳まれた
ことを示す写真である。正しく折り畳まれた３重ヘリッ
クスプロコラーゲンまたはコラーゲンは切断耐性を示す
が、折り畳まれていない、若しくは不正確に折り畳まれ
たプロコラーゲンまたはコラーゲンは小さな断片に切断
されてしまう条件下で、培養液タンパク質を高濃度のト
リプシン及びキモトリプリンにより、示した温度におい
て切断した（Bruckner及びProckop,Anal.Biochemistry
1981,110,360）。次に切断産物をSDSポリアクリルア
ミド電気泳動及びフルオログラフィーによって解析し
た。結果は、通常、II型プロコラーゲンが折り畳まれな
い温度である43℃までは、II型プロコラーゲンは切断耐
性であることを示した。従って、II型プロコラーゲンは
正しく折り畳まれており、コラーゲン繊維の合成に使用
できる。
II型プロコラーゲンが正しい本来の構造に折り畳まれた
ことを示す写真である。正しく折り畳まれた３重ヘリッ
クスプロコラーゲンまたはコラーゲンは切断耐性を示す
が、折り畳まれていない、若しくは不正確に折り畳まれ
たプロコラーゲンまたはコラーゲンは小さな断片に切断
されてしまう条件下で、培養液タンパク質を高濃度のト
リプシン及びキモトリプリンにより、示した温度におい
て切断した（Bruckner及びProckop,Anal.Biochemistry
1981,110,360）。次に切断産物をSDSポリアクリルア
ミド電気泳動及びフルオログラフィーによって解析し
た。結果は、通常、II型プロコラーゲンが折り畳まれな
い温度である43℃までは、II型プロコラーゲンは切断耐
性であることを示した。従って、II型プロコラーゲンは
正しく折り畳まれており、コラーゲン繊維の合成に使用
できる。
図３はCOL1A1遺伝子及びCOL1A2遺伝子を共トランスフ
ェクトしたHT−1080細胞の培養液の解析を示す写真であ
る。COL1A2は活性ネオマイシン耐性遺伝子に結合させた
が、COL1A1は結合させなかった。ネオマイシンのアナロ
グであるG418を用いてCOL1A2−ネオマイシン耐性遺伝子
コンストラクトの発現細胞をスクリーニングした。ヒト
proα１（Ｉ）鎖特異的ポリクローナル抗体を用いたウ
エスタンブロッティングにより培養液中のCOL1A1発現を
解析した。レーン１は培養液タンパク質がproα（Ｉ）
鎖を含むことを示す。レーン２はproα１（Ｉ）鎖及び
部分的にプロセシングされたpCα１（Ｉ）鎖を含むＩ型
プロコラーゲンの信頼できる標準である。結果は、細胞
が合成したproα１（Ｉ）を含むヒトＩ型プロコラーゲ
ンはおそらく、２つのproα（Ｉ）鎖及び１つのproα２
（Ｉ）鎖から成る、通常のヘテロ３量体型になっている
ことを示す。
ェクトしたHT−1080細胞の培養液の解析を示す写真であ
る。COL1A2は活性ネオマイシン耐性遺伝子に結合させた
が、COL1A1は結合させなかった。ネオマイシンのアナロ
グであるG418を用いてCOL1A2−ネオマイシン耐性遺伝子
コンストラクトの発現細胞をスクリーニングした。ヒト
proα１（Ｉ）鎖特異的ポリクローナル抗体を用いたウ
エスタンブロッティングにより培養液中のCOL1A1発現を
解析した。レーン１は培養液タンパク質がproα（Ｉ）
鎖を含むことを示す。レーン２はproα１（Ｉ）鎖及び
部分的にプロセシングされたpCα１（Ｉ）鎖を含むＩ型
プロコラーゲンの信頼できる標準である。結果は、細胞
が合成したproα１（Ｉ）を含むヒトＩ型プロコラーゲ
ンはおそらく、２つのproα（Ｉ）鎖及び１つのproα２
（Ｉ）鎖から成る、通常のヘテロ３量体型になっている
ことを示す。
図４は特異的な制限酵素によって切断される人工的部
位を含むように修飾したヒトＩ型プロコラーゲンのpro
α１（Ｉ）鎖のcDNAの構成図を示す。
位を含むように修飾したヒトＩ型プロコラーゲンのpro
α１（Ｉ）鎖のcDNAの構成図を示す。
図５は精製したニワトリプロリル４−ヒドロキシラー
ゼ（レーン１及び４）及びヒトプロリル４−ヒドロキシ
ラーゼのα−サブユニット及びβ−サブユニット遺伝子
を発現し、かつα58/βウイルス（レーン２及び５）ま
たはα59/βウイルス（レーン３及び６）に感染したSf9
細胞から培養液中に分泌されたタンパク質の未変性7.5
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（レーン１−３）及
び10％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（レーン４
−６）による解析を示す写真である。α58/β及びα59/
βは64塩基対長さが異なる。レーン１−３は未変性条件
下で分離したタンパク質であり、２種のサブユニットの
４量体を示す。レーン４−６は変性条件下の同じタンパ
ク質であり、２つのサブユニットが分離したバンドとし
てあらわれている。
ゼ（レーン１及び４）及びヒトプロリル４−ヒドロキシ
ラーゼのα−サブユニット及びβ−サブユニット遺伝子
を発現し、かつα58/βウイルス（レーン２及び５）ま
たはα59/βウイルス（レーン３及び６）に感染したSf9
細胞から培養液中に分泌されたタンパク質の未変性7.5
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（レーン１−３）及
び10％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（レーン４
−６）による解析を示す写真である。α58/β及びα59/
βは64塩基対長さが異なる。レーン１−３は未変性条件
下で分離したタンパク質であり、２種のサブユニットの
４量体を示す。レーン４−６は変性条件下の同じタンパ
ク質であり、２つのサブユニットが分離したバンドとし
てあらわれている。
発明の詳細な説明 骨形成不全症（osteogenesis imperfecta）（OI）の
ほとんどの型は２つのＩ型プロコラーゲン遺伝子のうち
の１つに起こった優性突然変異により引き起こされるこ
とが確立されてきている。また、少なくともいくつかの
閉経後骨粗鬆症（post−menopausal osteoporosis）も
２つのＩ型プロコラーゲン遺伝子の、同様な突然変異に
より引き起こされる。II型プロコラーゲン遺伝子の突然
変異が軟骨異形成症（chondrodysplasia）及び一群の主
要な一般的骨関節炎（osteoarthritis）のようなヒトの
病気を引き起こすことが、更に報告されている。III型
プロコラーゲン遺伝子（COL3A1）の突然変異が致死的な
エーラース・ダンロス症候群（Ehlers−Danlos sydrom
e）（IV型）及び家族性動脈瘤のようなヒトの病気を引
き起こすことが更に報告されている。更に、アルポート
症候群として知られている腎臓病がIV型コラーゲン遺伝
子のうちの１つ（COL4A5）の突然変異によって引き起こ
されることが示されている。更に、コラーゲン繊維の懸
濁液の注入が括約筋（sphincters）のような組織の物理
的弱さに加え、美容的欠陥の治療に効果的であることが
示されている。
ほとんどの型は２つのＩ型プロコラーゲン遺伝子のうち
の１つに起こった優性突然変異により引き起こされるこ
とが確立されてきている。また、少なくともいくつかの
閉経後骨粗鬆症（post−menopausal osteoporosis）も
２つのＩ型プロコラーゲン遺伝子の、同様な突然変異に
より引き起こされる。II型プロコラーゲン遺伝子の突然
変異が軟骨異形成症（chondrodysplasia）及び一群の主
要な一般的骨関節炎（osteoarthritis）のようなヒトの
病気を引き起こすことが、更に報告されている。III型
プロコラーゲン遺伝子（COL3A1）の突然変異が致死的な
エーラース・ダンロス症候群（Ehlers−Danlos sydrom
e）（IV型）及び家族性動脈瘤のようなヒトの病気を引
き起こすことが更に報告されている。更に、アルポート
症候群として知られている腎臓病がIV型コラーゲン遺伝
子のうちの１つ（COL4A5）の突然変異によって引き起こ
されることが示されている。更に、コラーゲン繊維の懸
濁液の注入が括約筋（sphincters）のような組織の物理
的弱さに加え、美容的欠陥の治療に効果的であることが
示されている。
本発明はこれらの繊維性プロコラーゲンのうちの１つ
がmRNAとしても、タンパク質としても発現している細胞
に関する。加えて、本発明はホニュウ類細胞系、昆虫細
胞系、または酵母細胞系で発現しているＩ、II及びIII
型プロコラーゲン及び、これらのプロコラーゲン遺伝子
を含むトランスフェクト細胞系の確立に関する。
がmRNAとしても、タンパク質としても発現している細胞
に関する。加えて、本発明はホニュウ類細胞系、昆虫細
胞系、または酵母細胞系で発現しているＩ、II及びIII
型プロコラーゲン及び、これらのプロコラーゲン遺伝子
を含むトランスフェクト細胞系の確立に関する。
本発明は更に遺伝子コンストラクトがHT−1080ヒト腫
瘍細胞系におけるヒト繊維性プロコラーゲンの合成に用
い得ることを提供する。このヒト細胞系は基底膜の主要
なコラーゲンであるIV型コラーゲンの容易な供給源であ
る。IV型コラーゲンは繊維形成プロコラーゲンまたはコ
ラーゲンではないので、簡単なクロマトグラフの技法に
よりすべての繊維性プロコラーゲンから容易に分離でき
る。従って、本発明は内因性のコラーゲン遺伝子産物か
ら繊維性プロコラーゲンを簡単に分離する方法を提供す
る。更に、培養中HT−1080細胞は非常に速く増殖し、そ
して長期間維持することができる。
瘍細胞系におけるヒト繊維性プロコラーゲンの合成に用
い得ることを提供する。このヒト細胞系は基底膜の主要
なコラーゲンであるIV型コラーゲンの容易な供給源であ
る。IV型コラーゲンは繊維形成プロコラーゲンまたはコ
ラーゲンではないので、簡単なクロマトグラフの技法に
よりすべての繊維性プロコラーゲンから容易に分離でき
る。従って、本発明は内因性のコラーゲン遺伝子産物か
ら繊維性プロコラーゲンを簡単に分離する方法を提供す
る。更に、培養中HT−1080細胞は非常に速く増殖し、そ
して長期間維持することができる。
加えて、本発明は細胞中に発現される１つのプロコラ
ーゲンまたはコラーゲン遺伝子、または多くのプロコラ
ーゲンまたはコラーゲン遺伝子を提供する。更に、１つ
のプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子、または多く
のプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子を、１つ若し
くはそれ以上のコピー数、細胞にトランスフェクトし、
発現させることができることが考えられる。本発明はこ
れらの細胞がヒトプロコラーゲン遺伝子の少なくとも一
つ、限定されるわけではないが、特にヒトＩ型プロコラ
ーゲンのproα１（Ｉ）プロコラーゲン鎖をコードするC
OL1A1遺伝子を発現するようトランスフェクトされ得る
ことを提供する。本発明はさらに、proα２（Ｉ）及びp
roα１（Ｉ）鎖が同時に合成され、Ｉ型プロコラーゲン
の通常のヘテロ３量体分子に重合するように、COL1A1及
びCOL2A1遺伝子の両方を細胞にトランスフェクトし、発
現させ得ることを提供する。さらに、本発明はヒトII型
プロコラーゲンのproα１（II）鎖をコードするCOL2A1
遺伝子を細胞にトランスフェクトし、発現させ得ること
を提供する。さらに、ヒトIII型プロコラーゲンのproα
１（III）鎖をコードするCOL3A1遺伝子を細胞にトラン
スフェクトし、発現させ得ることを提供する。本発明の
細胞中にトランスフェクトされ、発現されたプロコラー
ゲンまたはコラーゲン遺伝子はすべて、突然変異、変
異、ハイブリッド、または組み替え遺伝子からなっても
よい。このような突然変異、変異、ハイブリッド、また
は組み替え遺伝子はハイブリッド遺伝子を切断するため
の独自の制限酵素認識部位を提供する変異を含んでいて
もよい。本発明の好ましい態様では、１つ若しくはそれ
以上の独自の制限酵素認識部位を提供する変異は遺伝子
にコードされているアミノ酸配列を変化させることな
く、単に、遺伝子の取り扱いに有用な独自の制限酵素認
識部位を提供する。このように、修飾遺伝子は独自の制
限酵素認識部位に並んで存在する、多くの分離された領
域またはＤ−領域から構成される。遺伝子の、このよう
な、遺伝子の分離された領域は本明細書中において、カ
セットと言及される。例えば、図４に示したように、カ
セットはD1からD4.4として表される。遺伝子カセットの
複数コピーは本発明に含まれる本遺伝子の別の変種であ
る。コラーゲナーゼのような内因性酵素に対する耐性の
ような所望の特性を提供する、組み替えまたは突然変異
遺伝子、またはカセットもまた、本発明に含まれる。更
に本発明は、実質上全て細胞が、別のプロコラーゲンま
たはコラーゲン遺伝子（限定はされないが、好ましくは
Ｉ、II、III型プロコラーゲン遺伝子またはIV型コラー
ゲン遺伝子である）を含む、トランスフェクト細胞を提
供する。本発明はトランスフェクト細胞はヒト腫瘍細胞
のようなホニュウ類細胞、限定はされないが、特にHT−
1080細胞でもよいことを意図する。本発明の別の態様と
してトランスフェクト細胞はバキュロウイルスSf9細胞
のような昆虫細胞でもよい。本発明のさらに別の態様と
して、形質導入細胞は出芽酵母（Saccharomyces cerev
isiae）またはPichia pastoris細胞のような酵母細胞
である。本発明の好ましい態様では、ホニュウ類細胞、
昆虫細胞、及び酵母細胞のような、天然には十分量の翻
訳後酵素を生産しないような細胞は、少なくとも１組
の、プロリル４−ヒドロキシラーゼのような翻訳後酵素
をコードする遺伝子をトランスフェクトされる。
ーゲンまたはコラーゲン遺伝子、または多くのプロコラ
ーゲンまたはコラーゲン遺伝子を提供する。更に、１つ
のプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子、または多く
のプロコラーゲンまたはコラーゲン遺伝子を、１つ若し
くはそれ以上のコピー数、細胞にトランスフェクトし、
発現させることができることが考えられる。本発明はこ
れらの細胞がヒトプロコラーゲン遺伝子の少なくとも一
つ、限定されるわけではないが、特にヒトＩ型プロコラ
ーゲンのproα１（Ｉ）プロコラーゲン鎖をコードするC
OL1A1遺伝子を発現するようトランスフェクトされ得る
ことを提供する。本発明はさらに、proα２（Ｉ）及びp
roα１（Ｉ）鎖が同時に合成され、Ｉ型プロコラーゲン
の通常のヘテロ３量体分子に重合するように、COL1A1及
びCOL2A1遺伝子の両方を細胞にトランスフェクトし、発
現させ得ることを提供する。さらに、本発明はヒトII型
プロコラーゲンのproα１（II）鎖をコードするCOL2A1
遺伝子を細胞にトランスフェクトし、発現させ得ること
を提供する。さらに、ヒトIII型プロコラーゲンのproα
１（III）鎖をコードするCOL3A1遺伝子を細胞にトラン
スフェクトし、発現させ得ることを提供する。本発明の
細胞中にトランスフェクトされ、発現されたプロコラー
ゲンまたはコラーゲン遺伝子はすべて、突然変異、変
異、ハイブリッド、または組み替え遺伝子からなっても
よい。このような突然変異、変異、ハイブリッド、また
は組み替え遺伝子はハイブリッド遺伝子を切断するため
の独自の制限酵素認識部位を提供する変異を含んでいて
もよい。本発明の好ましい態様では、１つ若しくはそれ
以上の独自の制限酵素認識部位を提供する変異は遺伝子
にコードされているアミノ酸配列を変化させることな
く、単に、遺伝子の取り扱いに有用な独自の制限酵素認
識部位を提供する。このように、修飾遺伝子は独自の制
限酵素認識部位に並んで存在する、多くの分離された領
域またはＤ−領域から構成される。遺伝子の、このよう
な、遺伝子の分離された領域は本明細書中において、カ
セットと言及される。例えば、図４に示したように、カ
セットはD1からD4.4として表される。遺伝子カセットの
複数コピーは本発明に含まれる本遺伝子の別の変種であ
る。コラーゲナーゼのような内因性酵素に対する耐性の
ような所望の特性を提供する、組み替えまたは突然変異
遺伝子、またはカセットもまた、本発明に含まれる。更
に本発明は、実質上全て細胞が、別のプロコラーゲンま
たはコラーゲン遺伝子（限定はされないが、好ましくは
Ｉ、II、III型プロコラーゲン遺伝子またはIV型コラー
ゲン遺伝子である）を含む、トランスフェクト細胞を提
供する。本発明はトランスフェクト細胞はヒト腫瘍細胞
のようなホニュウ類細胞、限定はされないが、特にHT−
1080細胞でもよいことを意図する。本発明の別の態様と
してトランスフェクト細胞はバキュロウイルスSf9細胞
のような昆虫細胞でもよい。本発明のさらに別の態様と
して、形質導入細胞は出芽酵母（Saccharomyces cerev
isiae）またはPichia pastoris細胞のような酵母細胞
である。本発明の好ましい態様では、ホニュウ類細胞、
昆虫細胞、及び酵母細胞のような、天然には十分量の翻
訳後酵素を生産しないような細胞は、少なくとも１組
の、プロリル４−ヒドロキシラーゼのような翻訳後酵素
をコードする遺伝子をトランスフェクトされる。
本発明は更に、実質上すべての細胞が、少なくとも１
つのトランスフェトされたコラーゲンまたはプロコラー
ゲン遺伝子由来の鎖、及び、ヒトproα１（Ｉ）部位及
び非ヒトproα２（Ｉ）部位または非ヒトproα１（Ｉ）
部位及びヒトproα２（Ｉ）部位から成る［proα１
（Ｉ）］2proα２（Ｉ）コラーゲン分子以外の、内因性
のヒトまたはヒト以外のコラーゲンまたはプロコラーゲ
ン遺伝子、に由来する少なくとも１つの鎖を含む細胞を
意図する。
つのトランスフェトされたコラーゲンまたはプロコラー
ゲン遺伝子由来の鎖、及び、ヒトproα１（Ｉ）部位及
び非ヒトproα２（Ｉ）部位または非ヒトproα１（Ｉ）
部位及びヒトproα２（Ｉ）部位から成る［proα１
（Ｉ）］2proα２（Ｉ）コラーゲン分子以外の、内因性
のヒトまたはヒト以外のコラーゲンまたはプロコラーゲ
ン遺伝子、に由来する少なくとも１つの鎖を含む細胞を
意図する。
本発明の方法の新たな特性は、他の繊維性プロコラー
ゲンをつくらない組み換え細胞培養システムにおいて、
比較的多量のヒト繊維性プロコラーゲンを合成できるこ
とである。内因性の繊維性プロコラーゲンまたはコラー
ゲン遺伝子産物を組み換え遺伝子産物から精製するのは
非常に困難であるため、他の繊維性プロコラーゲンまた
はコラーゲンを合成するシステムは非実用的である。本
発明の方法を用いることにより、ヒトプロコラーゲンの
精製は非常に促進される。更に、本発明の方法により合
成されるタンパク質量は、当該技術分野の他のシステム
と比較して、多いことが示されている。
ゲンをつくらない組み換え細胞培養システムにおいて、
比較的多量のヒト繊維性プロコラーゲンを合成できるこ
とである。内因性の繊維性プロコラーゲンまたはコラー
ゲン遺伝子産物を組み換え遺伝子産物から精製するのは
非常に困難であるため、他の繊維性プロコラーゲンまた
はコラーゲンを合成するシステムは非実用的である。本
発明の方法を用いることにより、ヒトプロコラーゲンの
精製は非常に促進される。更に、本発明の方法により合
成されるタンパク質量は、当該技術分野の他のシステム
と比較して、多いことが示されている。
本発明の他の新たな特性は、合成されたプロコラーゲ
ンが正しく折り畳まれたタンパク質であり、プロコラー
ゲンまたはコラーゲンの特徴である通常の３重ヘリック
ス構造を示すことである。従って、プロコラーゲンはプ
ロテアーゼによって切断することにより、安定なコラー
ゲン原繊維（fibrils）及び繊維の合成に使用し得る。
ンが正しく折り畳まれたタンパク質であり、プロコラー
ゲンまたはコラーゲンの特徴である通常の３重ヘリック
ス構造を示すことである。従って、プロコラーゲンはプ
ロテアーゼによって切断することにより、安定なコラー
ゲン原繊維（fibrils）及び繊維の合成に使用し得る。
本発明はヒト繊維性プロコラーゲンproα１（Ｉ）鎖
の遺伝子、すなわちCOL1A1遺伝子はマウスの繊維芽細胞
中で発現でき、鎖がＩ型コラーゲンの前駆体である、Ｉ
型プロコラーゲン分子の重合に使用されることを報告し
たSchniekeらとは対照的である。しかし、Schniekeらの
システムではＩ型プロコラーゲン分子中にみられるpro
α２（Ｉ）鎖はマウス由来であった。従って、合成され
たＩ型プロコラーゲンは、ヒト及びマウス由来のハイブ
リッド分子であった。同様に、Leeらのシステムはproα
１（Ｉ）鎖がラット由来であるＩ型コラーゲンを合成す
るために、外因性proα２（Ｉ）遺伝子を発現した。本
発明は完全にトランスフェクトしたプロコラーゲン及び
コラーゲン遺伝子由来のプロコラーゲンまたはコラーゲ
ンを合成する方法を提供するが、これらの方法は完全に
トランスフェクトした遺伝子由来のプロコラーゲン及び
コラーゲンの合成に限定するものではない。
の遺伝子、すなわちCOL1A1遺伝子はマウスの繊維芽細胞
中で発現でき、鎖がＩ型コラーゲンの前駆体である、Ｉ
型プロコラーゲン分子の重合に使用されることを報告し
たSchniekeらとは対照的である。しかし、Schniekeらの
システムではＩ型プロコラーゲン分子中にみられるpro
α２（Ｉ）鎖はマウス由来であった。従って、合成され
たＩ型プロコラーゲンは、ヒト及びマウス由来のハイブ
リッド分子であった。同様に、Leeらのシステムはproα
１（Ｉ）鎖がラット由来であるＩ型コラーゲンを合成す
るために、外因性proα２（Ｉ）遺伝子を発現した。本
発明は完全にトランスフェクトしたプロコラーゲン及び
コラーゲン遺伝子由来のプロコラーゲンまたはコラーゲ
ンを合成する方法を提供するが、これらの方法は完全に
トランスフェクトした遺伝子由来のプロコラーゲン及び
コラーゲンの合成に限定するものではない。
本発明のヒトコラーゲンの利点はこれらのコラーゲン
が人体内でアレルギー反応を引き起こさないことであ
る。更に、培養細胞から調製された本発明のコラーゲン
は動物から得たコラーゲンより高品質であり、より大き
くより固い束の繊維を形成する。これらの高品質タンパ
ク質は現在利用可能な市販材料よりも長持ちする沈着物
を組織内に形成する。現在利用可能な方法を用いると、
美容整形の目的のためにはコラーゲンの注入は６カ月ご
とに繰り返さなければならないことが知られている。本
発明のヒトタンパク質はヒト組織内に注入後、より長持
ちする。
が人体内でアレルギー反応を引き起こさないことであ
る。更に、培養細胞から調製された本発明のコラーゲン
は動物から得たコラーゲンより高品質であり、より大き
くより固い束の繊維を形成する。これらの高品質タンパ
ク質は現在利用可能な市販材料よりも長持ちする沈着物
を組織内に形成する。現在利用可能な方法を用いると、
美容整形の目的のためにはコラーゲンの注入は６カ月ご
とに繰り返さなければならないことが知られている。本
発明のヒトタンパク質はヒト組織内に注入後、より長持
ちする。
本発明の方法は美容上の皺、及び他の美容上の欠陥を
取り除くために投与される、及び尿失禁症治療において
膀胱の括約筋等の組織の張力を回復させるために広く使
用される。動物コラーゲンに類似した、ヒトコラーゲン
の実用的な供給源を提供する。動物コラーゲンはまたセ
ラミック及びたの材料との混合物の形で、骨の欠陥を補
うため、及び骨の成長を促進するために利用される。動
物由来のＩ型コラーゲンが商業的に使用されている。し
かし、治療に用いるための簡便なヒトコラーゲン源はま
だ非常に必要とされている。
取り除くために投与される、及び尿失禁症治療において
膀胱の括約筋等の組織の張力を回復させるために広く使
用される。動物コラーゲンに類似した、ヒトコラーゲン
の実用的な供給源を提供する。動物コラーゲンはまたセ
ラミック及びたの材料との混合物の形で、骨の欠陥を補
うため、及び骨の成長を促進するために利用される。動
物由来のＩ型コラーゲンが商業的に使用されている。し
かし、治療に用いるための簡便なヒトコラーゲン源はま
だ非常に必要とされている。
更に、本発明は軟骨の主なコラーゲンの前駆体である
ヒトII型プロコラーゲンは軟骨の損傷の治療という特別
な用途を有することを意図する。更に、本発明の方法に
従って発現されたproα１（Ｉ）３量体から成るヒトＩ
型プロコラーゲンの修飾された型もまた意図する。ま
た、トランスフェクトしたヒト遺伝子由来の２つのpro
α１（Ｉ）及び１つのproα２（Ｉ）鎖から成るＩ型プ
ロコラーゲンも意図する。また、トランスフェクトした
ヒト遺伝子由来の３つのproα１（III）鎖から成るIII
型プロコラーゲンも意図される。加えて、これらのコラ
ーゲンの特別に設計された型も意図する。
ヒトII型プロコラーゲンは軟骨の損傷の治療という特別
な用途を有することを意図する。更に、本発明の方法に
従って発現されたproα１（Ｉ）３量体から成るヒトＩ
型プロコラーゲンの修飾された型もまた意図する。ま
た、トランスフェクトしたヒト遺伝子由来の２つのpro
α１（Ｉ）及び１つのproα２（Ｉ）鎖から成るＩ型プ
ロコラーゲンも意図する。また、トランスフェクトした
ヒト遺伝子由来の３つのproα１（III）鎖から成るIII
型プロコラーゲンも意図される。加えて、これらのコラ
ーゲンの特別に設計された型も意図する。
少なくとも１つのヒトプロコラーゲンまたはコラーゲ
ン遺伝子を細胞にトランスフェクトし、そしてプロコラ
ーゲンまたはプロコラーゲン遺伝子由来の、ヒトproα
１（Ｉ）部位及び非ヒトproα２（Ｉ）部位または非ヒ
トproα１（Ｉ）部位及びヒトproα２（Ｉ）部位から成
る［proα１（Ｉ）］2proα２（Ｉ）分子以外の分子を
含む細胞を選択することから成る、細胞内で繊維性コラ
ーゲンを合成するための方法が提供される。更に、少な
くとも１つのプロコラーゲン遺伝子が突然変異、変異、
ハイブリッド、または組み換え遺伝子にする方法も意図
する。加えて、本発明は、少なくとも１つのプロコラー
ゲン遺伝子をトランスフェクトされた実質上全ての細胞
が、III型及び他のプロコラーゲン遺伝子を含む方法を
提供する。更に、トランスフェクト細胞がヒト腫瘍細
胞、限定されないが、とくにHT−1080細胞である方法を
意図する。トランスフェクトされた各細胞が、実質上内
因性コラーゲン分子、内因性Ｉ型プロコラーゲン分子、
内因性II型プロコラーゲン分子、内因性III型プロコラ
ーゲン分子、または内因性IV型プロコラーゲン分子を含
まない方法も提供する。実質上すべてのトランスフェク
ト細胞が少なくとも１つのトランスフェクトしたコラー
ゲン遺伝子を含み、そして少なくとも１つのトランスフ
ェクトした遺伝子由来の鎖をもつ、ヒトproα１（Ｉ）
部位及び非ヒトproα２（Ｉ）部位または非ヒトproα１
（Ｉ）部位及びヒトproα２（Ｉ）部位から成る［proα
１（Ｉ）］2proα２（Ｉ）コラーゲン以外のプロコラー
ゲンまたはプロコラーゲン分子を発現する、別の方法を
提供する。実質上すべてのトランスフェクト細胞が少な
くとも１つのトランスフェクトしたヒトプロコラーゲン
遺伝子を含み、そしてトランスフェクシトしたコラーゲ
ン遺伝子由来の３つの鎖をもつプロコラーゲン分子を発
現する、別の好ましい方法を提供する。
ン遺伝子を細胞にトランスフェクトし、そしてプロコラ
ーゲンまたはプロコラーゲン遺伝子由来の、ヒトproα
１（Ｉ）部位及び非ヒトproα２（Ｉ）部位または非ヒ
トproα１（Ｉ）部位及びヒトproα２（Ｉ）部位から成
る［proα１（Ｉ）］2proα２（Ｉ）分子以外の分子を
含む細胞を選択することから成る、細胞内で繊維性コラ
ーゲンを合成するための方法が提供される。更に、少な
くとも１つのプロコラーゲン遺伝子が突然変異、変異、
ハイブリッド、または組み換え遺伝子にする方法も意図
する。加えて、本発明は、少なくとも１つのプロコラー
ゲン遺伝子をトランスフェクトされた実質上全ての細胞
が、III型及び他のプロコラーゲン遺伝子を含む方法を
提供する。更に、トランスフェクト細胞がヒト腫瘍細
胞、限定されないが、とくにHT−1080細胞である方法を
意図する。トランスフェクトされた各細胞が、実質上内
因性コラーゲン分子、内因性Ｉ型プロコラーゲン分子、
内因性II型プロコラーゲン分子、内因性III型プロコラ
ーゲン分子、または内因性IV型プロコラーゲン分子を含
まない方法も提供する。実質上すべてのトランスフェク
ト細胞が少なくとも１つのトランスフェクトしたコラー
ゲン遺伝子を含み、そして少なくとも１つのトランスフ
ェクトした遺伝子由来の鎖をもつ、ヒトproα１（Ｉ）
部位及び非ヒトproα２（Ｉ）部位または非ヒトproα１
（Ｉ）部位及びヒトproα２（Ｉ）部位から成る［proα
１（Ｉ）］2proα２（Ｉ）コラーゲン以外のプロコラー
ゲンまたはプロコラーゲン分子を発現する、別の方法を
提供する。実質上すべてのトランスフェクト細胞が少な
くとも１つのトランスフェクトしたヒトプロコラーゲン
遺伝子を含み、そしてトランスフェクシトしたコラーゲ
ン遺伝子由来の３つの鎖をもつプロコラーゲン分子を発
現する、別の好ましい方法を提供する。
本発明は下記の実施例によって更に詳細に記載される
が、これらに限定するものではない。
が、これらに限定するものではない。
実施例 実施例１ ヒトII型プロコラーゲンの合成 本発明に記載される組み換えCOL1A1遺伝子のコンスト
ラクトはプロモーターをもつCOL1A1の5'端断片、エクソ
ン１、及びCOL2A1遺伝子のエクソン３から54に融合した
イントロン１を含んだ。ハイブリッドコンストラクトを
HT−1080細胞にトランスフェクトした。これらの細胞に
ネオマイシン耐性遺伝子を共トランスフェクトし、ネオ
マイシンアナログであるG418の存在下で培養した。ハイ
ブリッドコンストラクトをトランスフェクト細胞作成に
使用した。
ラクトはプロモーターをもつCOL1A1の5'端断片、エクソ
ン１、及びCOL2A1遺伝子のエクソン３から54に融合した
イントロン１を含んだ。ハイブリッドコンストラクトを
HT−1080細胞にトランスフェクトした。これらの細胞に
ネオマイシン耐性遺伝子を共トランスフェクトし、ネオ
マイシンアナログであるG418の存在下で培養した。ハイ
ブリッドコンストラクトをトランスフェクト細胞作成に
使用した。
ヒトII型プロコラーゲンのmRNAを合成する一群のクロ
ーンを得た。合成されるタンパク質を解析するため、細
胞を［14C］プロリンと共にインキュベートし、14Cラベ
ルされた培養液タンパク質をゲル電気泳動により解析し
た。図１参照。レーン１に示されるように培養液タンパ
ク質は通常細胞が合成するIV型コラーゲンのproα１（I
V）及びproαII（IV）鎖に加えて、期待されたproα１
（II）鎖からなるII型プロコラーゲンを含んだ。レーン
２及び３に示されるようにII型プロコラーゲンは１ステ
ップのイオン交換クロマトグラフィーにより、容易に精
製される。培養液中に分泌されたII型プロコラーゲンは
プロテアーゼ−温度安定性テストによると、正しく折り
畳まれていた。図２参照。
ーンを得た。合成されるタンパク質を解析するため、細
胞を［14C］プロリンと共にインキュベートし、14Cラベ
ルされた培養液タンパク質をゲル電気泳動により解析し
た。図１参照。レーン１に示されるように培養液タンパ
ク質は通常細胞が合成するIV型コラーゲンのproα１（I
V）及びproαII（IV）鎖に加えて、期待されたproα１
（II）鎖からなるII型プロコラーゲンを含んだ。レーン
２及び３に示されるようにII型プロコラーゲンは１ステ
ップのイオン交換クロマトグラフィーにより、容易に精
製される。培養液中に分泌されたII型プロコラーゲンは
プロテアーゼ−温度安定性テストによると、正しく折り
畳まれていた。図２参照。
実施例２ ヒトＩ型プロコラーゲンの合成 第二の実施例として、HT−1080細胞にCOL1A1遺伝子及
びCOL1A2遺伝子を共トランスフェクトした。両遺伝子は
全長cDNAに結合したサイトメガロウイルスプロモーター
から成る。COL1A2遺伝子コンストラクトはネオマイシン
耐性遺伝子を含むが、COL1A1遺伝子コンストラクトは含
まない。ネオマイシンアナログのG418存在下での増殖を
見ることにより、COL1A2−ネオマイシン耐性遺伝子コン
ストラクトを発現する細胞を選んだ。次にヒトproα１
（Ｉ）鎖に対する特異的ポリクローナル抗体により培養
液中のCOL1A1の発現を調べた。結果（図３参照）は、細
胞はおそらく２つのproα１（Ｉ）鎖及び１つのproα２
（Ｉ）鎖の通常のヘテロ３量体構造から成るヒトＩ型プ
ロコラーゲンを合成することを示した。
びCOL1A2遺伝子を共トランスフェクトした。両遺伝子は
全長cDNAに結合したサイトメガロウイルスプロモーター
から成る。COL1A2遺伝子コンストラクトはネオマイシン
耐性遺伝子を含むが、COL1A1遺伝子コンストラクトは含
まない。ネオマイシンアナログのG418存在下での増殖を
見ることにより、COL1A2−ネオマイシン耐性遺伝子コン
ストラクトを発現する細胞を選んだ。次にヒトproα１
（Ｉ）鎖に対する特異的ポリクローナル抗体により培養
液中のCOL1A1の発現を調べた。結果（図３参照）は、細
胞はおそらく２つのproα１（Ｉ）鎖及び１つのproα２
（Ｉ）鎖の通常のヘテロ３量体構造から成るヒトＩ型プ
ロコラーゲンを合成することを示した。
表１はヒトプロコラーゲン遺伝子を含むDNAコンスト
ラクトのまとめを示す。コンストラクトは適切なプロモ
ーター断片に加えて、遺伝子断片または遺伝子由来のcD
AN断片の分離された断片から構築した。
ラクトのまとめを示す。コンストラクトは適切なプロモ
ーター断片に加えて、遺伝子断片または遺伝子由来のcD
AN断片の分離された断片から構築した。
実施例３ 細胞トランスフェクション 細胞トランスフェクト実験のためにベクターからコン
ストラクトを切り出すため、遺伝子コンストラクトを含
むコスミドプラスミドクローンを制限酵素で切断した。
ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクター、La
w et al.,Molec.Cell Biol.1983,3,2110−2115、をB
amH Iで切断し、線状化した。２つの標本を遺伝子コン
ストラクト対ネオマイシン耐性遺伝子の比がおよを10:1
になるように混合し、そして混合物をリン酸カルシウム
共沈殿法、Sambrook et al.,Molecular Cloning.A
Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laborator
y Press,第２版（1989）、によるHT−1080細胞へのト
ランスフェクトに使用した。100mlプレートの集密前の
細胞当たり、およそ10μｇのミメラ遺伝子コンストラク
トとなるように、リン酸カルシウム溶液中のDNAを培養
細胞上に撒いた。細胞を10％新生ウシ血清を含むDMEM培
養液中で10時間インキュベートした。標本に３分間15％
グリセロール溶液を加えることによりグリセロールショ
ックを与えた。細胞を新生ウシ血清を含むDMEM培養液に
移し24時間培養し、次にG418を450μg/ml含む培養液に
移した。G418を含む培養液中でのインキュベートを３日
ごとに培養液を取り替え、およそ４週間続けた。G418耐
性細胞をプールし、またはフォーカスをプラスチックシ
リンダーを用いて単離し、副培養することにより得たク
ローンに分けた。
ストラクトを切り出すため、遺伝子コンストラクトを含
むコスミドプラスミドクローンを制限酵素で切断した。
ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクター、La
w et al.,Molec.Cell Biol.1983,3,2110−2115、をB
amH Iで切断し、線状化した。２つの標本を遺伝子コン
ストラクト対ネオマイシン耐性遺伝子の比がおよを10:1
になるように混合し、そして混合物をリン酸カルシウム
共沈殿法、Sambrook et al.,Molecular Cloning.A
Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laborator
y Press,第２版（1989）、によるHT−1080細胞へのト
ランスフェクトに使用した。100mlプレートの集密前の
細胞当たり、およそ10μｇのミメラ遺伝子コンストラク
トとなるように、リン酸カルシウム溶液中のDNAを培養
細胞上に撒いた。細胞を10％新生ウシ血清を含むDMEM培
養液中で10時間インキュベートした。標本に３分間15％
グリセロール溶液を加えることによりグリセロールショ
ックを与えた。細胞を新生ウシ血清を含むDMEM培養液に
移し24時間培養し、次にG418を450μg/ml含む培養液に
移した。G418を含む培養液中でのインキュベートを３日
ごとに培養液を取り替え、およそ４週間続けた。G418耐
性細胞をプールし、またはフォーカスをプラスチックシ
リンダーを用いて単離し、副培養することにより得たク
ローンに分けた。
実施例４ ウエスタンブロッティング COL2A1遺伝子の発現を解析するため、II型コラーゲン
のCOOH端のテロペプチドに存在するアミノ酸配列をもつ
23残基の合成ペプチドを用いて、ウサギ中でポリクロー
ナル抗体を調製した。Cheah et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.1985,82,2555−2559参照。抗体はウエスタン
ブロッティングにおいて、ヒトＩ型プロコラーゲンまた
はコラーゲン、ヒトII型プロコラーゲンまたはコラーゲ
ン、またはネズミ科のＩ型コラーゲンのα鎖とは反応し
なかった。COL1A1遺伝子の発現を解析するため、proα
１（Ｉ）鎖のCOOH端ポリペプチドと反応するポリクロー
ナル抗体を用いた。Olsen et al.,J.Biol.Chem.1991,
266,1117−1121参照。
のCOOH端のテロペプチドに存在するアミノ酸配列をもつ
23残基の合成ペプチドを用いて、ウサギ中でポリクロー
ナル抗体を調製した。Cheah et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.1985,82,2555−2559参照。抗体はウエスタン
ブロッティングにおいて、ヒトＩ型プロコラーゲンまた
はコラーゲン、ヒトII型プロコラーゲンまたはコラーゲ
ン、またはネズミ科のＩ型コラーゲンのα鎖とは反応し
なかった。COL1A1遺伝子の発現を解析するため、proα
１（Ｉ）鎖のCOOH端ポリペプチドと反応するポリクロー
ナル抗体を用いた。Olsen et al.,J.Biol.Chem.1991,
266,1117−1121参照。
プールしたクローンまたは個々のクローンから培養液
を除去し、30％飽和になるまで固体の硫酸アンモニウム
を加えることにより別々に沈殿させ、沈殿物を14,000×
ｇで遠心分離して集めた。そして次に0.15M NaCl、0.5
mM EDTA、0.5mM Ｎ−エチルマレイミド、0.1mM ｎ−
アミノベンズアミヂン及び50mM トリス塩酸（４℃でpH
7.4）を含む緩衝液に対して透析した。標本の一部を１
％SDS、50mM DTT及び10％（V/V）グリセロール中で、
５分間10℃に加熱し、ミニゲル装置（Holford SE250,H
olford Scientific）を用いた６％ポリアクリルアミド
ゲル上、125Vで90分間の電気泳動により分離した。分離
されたタンパク質をポリアクリルアミドゲルからニトロ
セルロース膜（Schleicher and Schuell）へ40Vで90
分間電気ブロットした。移したタンパク質を1:500（V/
V）希釈したポリクローナル抗体と30分間反応させた。
抗体と反応したタンパク質はアルカリホスファターゼに
結合した抗ウサギIgG二次抗体（Promega Biotech）に
より30分間で検出させた。製造業者の説明者に従い、ア
ルカリホスファターゼをNBT/BCIP（Promega Biotech）
により可視化した。
を除去し、30％飽和になるまで固体の硫酸アンモニウム
を加えることにより別々に沈殿させ、沈殿物を14,000×
ｇで遠心分離して集めた。そして次に0.15M NaCl、0.5
mM EDTA、0.5mM Ｎ−エチルマレイミド、0.1mM ｎ−
アミノベンズアミヂン及び50mM トリス塩酸（４℃でpH
7.4）を含む緩衝液に対して透析した。標本の一部を１
％SDS、50mM DTT及び10％（V/V）グリセロール中で、
５分間10℃に加熱し、ミニゲル装置（Holford SE250,H
olford Scientific）を用いた６％ポリアクリルアミド
ゲル上、125Vで90分間の電気泳動により分離した。分離
されたタンパク質をポリアクリルアミドゲルからニトロ
セルロース膜（Schleicher and Schuell）へ40Vで90
分間電気ブロットした。移したタンパク質を1:500（V/
V）希釈したポリクローナル抗体と30分間反応させた。
抗体と反応したタンパク質はアルカリホスファターゼに
結合した抗ウサギIgG二次抗体（Promega Biotech）に
より30分間で検出させた。製造業者の説明者に従い、ア
ルカリホスファターゼをNBT/BCIP（Promega Biotech）
により可視化した。
実施例５ 分泌プロコラーゲンの正しい折り畳みの証明 トランスフェクトした細胞により合成され、分泌され
たプロコラーゲンが正しく折り畳まれていることを証明
するために、培養液中のタンパク質を、正しく折り畳ま
れたプロコラーゲン及びコラーゲンのみが切断耐性とな
る条件下で高濃度のプロテアーゼにより切断した。トリ
プシン及びキモトリプシンの組み合わせで切断するため
に、25cmフラスコの細胞層を、10mM EDTA及び0.1％ N
onidet Ｐ−40（Sigma）を含む0.5mlの修飾クレブスII
培養液中にかき集めた。細胞をボルテックスミキサーに
１分間かけて激しく撹拌し、直ちに４℃に冷却した。上
清を新しいチューブに移した。標本を記載の温度で10分
間プレインキュベートし、同じ温度で２分間切断を行っ
た。切断のために、1mg/mlのトリプシン及び2.5mg/mlの
α−キモトリプシン（Boehringer Mannheim）を含む修
飾クレブスII培養液を0.1体積加えた。5mg/mlのダイズ
トリプシンインヒビター（Sigma）を0.1体積加えて切断
反応を停止した。
たプロコラーゲンが正しく折り畳まれていることを証明
するために、培養液中のタンパク質を、正しく折り畳ま
れたプロコラーゲン及びコラーゲンのみが切断耐性とな
る条件下で高濃度のプロテアーゼにより切断した。トリ
プシン及びキモトリプシンの組み合わせで切断するため
に、25cmフラスコの細胞層を、10mM EDTA及び0.1％ N
onidet Ｐ−40（Sigma）を含む0.5mlの修飾クレブスII
培養液中にかき集めた。細胞をボルテックスミキサーに
１分間かけて激しく撹拌し、直ちに４℃に冷却した。上
清を新しいチューブに移した。標本を記載の温度で10分
間プレインキュベートし、同じ温度で２分間切断を行っ
た。切断のために、1mg/mlのトリプシン及び2.5mg/mlの
α−キモトリプシン（Boehringer Mannheim）を含む修
飾クレブスII培養液を0.1体積加えた。5mg/mlのダイズ
トリプシンインヒビター（Sigma）を0.1体積加えて切断
反応を停止した。
切断産物の解析のため、標本に10％SDS、50％グリセ
ロール及び0.012％ブロモフェノールブルーを含む0.625
M トリス塩酸緩衝液（pH6.8）から成る５×電気泳動標
本衝液を0.2体積加え、直ちに沸騰水中に２分間浸し
た。標本の２％の２−メルカプトエタノールを加え、沸
騰水中で３分間インキュベートすることによって還元し
た後、標本をSDSゲルにアプライした。Wet et al.,Jo
urnal of Biological Chemistry 1983,258,7721−7
728に記載の小さな修飾をしたLaemmli,Nature 1979,22
7,680−685の不連続システムを用いて、電気泳動を行っ
た。
ロール及び0.012％ブロモフェノールブルーを含む0.625
M トリス塩酸緩衝液（pH6.8）から成る５×電気泳動標
本衝液を0.2体積加え、直ちに沸騰水中に２分間浸し
た。標本の２％の２−メルカプトエタノールを加え、沸
騰水中で３分間インキュベートすることによって還元し
た後、標本をSDSゲルにアプライした。Wet et al.,Jo
urnal of Biological Chemistry 1983,258,7721−7
728に記載の小さな修飾をしたLaemmli,Nature 1979,22
7,680−685の不連続システムを用いて、電気泳動を行っ
た。
実施例６ 特異的に作成したプロコラーゲン及びコラー
ゲン 図４に示すように、ヒトＩ型プロコラーゲンのproα
１（Ｉ）鎖の、あるゲノムDNA及びあるcDNAから成るハ
イブリッド遺伝子を最初の材料とした。ハイブリッド遺
伝子のDNA配列を解析し、繰り返しＤ−領域間のつなぎ
めをつくるアミノ酸に対応するコドンを、コードするア
ミノ酸は変えずにハイブリッド遺伝子を切断するための
特異的な制限酵素認識部位をつくるように修飾した。
ゲン 図４に示すように、ヒトＩ型プロコラーゲンのproα
１（Ｉ）鎖の、あるゲノムDNA及びあるcDNAから成るハ
イブリッド遺伝子を最初の材料とした。ハイブリッド遺
伝子のDNA配列を解析し、繰り返しＤ−領域間のつなぎ
めをつくるアミノ酸に対応するコドンを、コードするア
ミノ酸は変えずにハイブリッド遺伝子を切断するための
特異的な制限酵素認識部位をつくるように修飾した。
A.組み換えプロコラーゲンまたはコラーゲン proα１（Ｉ）のD III領域をSrf I及びNae I制限酵素
で切断する。D3領域に存在するコラーゲナーゼ認識部位
にあるアミノ酸をコードする塩基を、他のアミノ酸配列
をコードするように修飾する。カセットを増幅し、遺伝
子に再挿入する。適切な宿主における遺伝子の発現の結
果、コラーゲナーゼによって切断されないＩ型コラーゲ
ンができる。
で切断する。D3領域に存在するコラーゲナーゼ認識部位
にあるアミノ酸をコードする塩基を、他のアミノ酸配列
をコードするように修飾する。カセットを増幅し、遺伝
子に再挿入する。適切な宿主における遺伝子の発現の結
果、コラーゲナーゼによって切断されないＩ型コラーゲ
ンができる。
B.プロコラーゲンまたはコラーゲンの欠損突然変異体 （proα１（Ｉ）鎖の）D2領域カセットを上記の遺伝
子からSma I切断によって切り出す。遺伝子を再重合さ
せ、D2領域のコドンの、フレームのあった欠損をもつ遺
伝子を作成した。
子からSma I切断によって切り出す。遺伝子を再重合さ
せ、D2領域のコドンの、フレームのあった欠損をもつ遺
伝子を作成した。
C.プロコラーゲンまたはコラーゲンの付加突然変異体 プロコラーゲンまたはコラーゲンの所望の領域を複数
コピー提供するため、１つ若しくはそれ以上のＤカセッ
トの複数コピーを、作成した部位に挿入してもよい。
コピー提供するため、１つ若しくはそれ以上のＤカセッ
トの複数コピーを、作成した部位に挿入してもよい。
実施例７ 組み換えDNAシステムにおけるヒトプロリル
４−ヒドロキシラーゼの発現 昆虫細胞においてプロリル４−ヒドロキシラーゼの２
つの遺伝子を発現させるため、下記の方法を実行した。
Sma I部位にヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのαサ
ブユニットの全長cDNAを含むpBluescript（Stratagen
e）ベクター、PA−58（Helaakoski,T.et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.1989,86,4392−4396）をSma I部位に
近接しているPst I及びBamH Iで切断することにより、
バキュロウイルス転移ベクターpVLα58を構築した。得
られた、61bpの5'非翻訳配列、全コーディング領域、及
び551bpの3'非翻訳配列を含むPst I−Pst I断片及びPst
I−BamH I断片、をバキュロウイルス翻訳ベクターpVL1
392（Luckow,V.A.and Summers,M.D.,Virology 1989,1
70,31−39）のPst I−BamH I部位にクローニングした。
バキュロウイルス転移ベクターpVLα59をpVL1392及びヒ
トプロリル４−ヒドロキシラーゼのαサブユニットをコ
ードする別のcDNAクローン、PA−59（Helaakoski,T.et
al.,supra）から、同様に構築した。cDNAクローン、P
A58とPA59は64bp長さが異なる。
４−ヒドロキシラーゼの発現 昆虫細胞においてプロリル４−ヒドロキシラーゼの２
つの遺伝子を発現させるため、下記の方法を実行した。
Sma I部位にヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのαサ
ブユニットの全長cDNAを含むpBluescript（Stratagen
e）ベクター、PA−58（Helaakoski,T.et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.1989,86,4392−4396）をSma I部位に
近接しているPst I及びBamH Iで切断することにより、
バキュロウイルス転移ベクターpVLα58を構築した。得
られた、61bpの5'非翻訳配列、全コーディング領域、及
び551bpの3'非翻訳配列を含むPst I−Pst I断片及びPst
I−BamH I断片、をバキュロウイルス翻訳ベクターpVL1
392（Luckow,V.A.and Summers,M.D.,Virology 1989,1
70,31−39）のPst I−BamH I部位にクローニングした。
バキュロウイルス転移ベクターpVLα59をpVL1392及びヒ
トプロリル４−ヒドロキシラーゼのαサブユニットをコ
ードする別のcDNAクローン、PA−59（Helaakoski,T.et
al.,supra）から、同様に構築した。cDNAクローン、P
A58とPA59は64bp長さが異なる。
pVLβベクターを44bpの5'非翻訳配列、全コーディン
グ領域、及び207bpの3'非翻訳配列を含むヒトプロリル
４−ヒドロキシラーゼβサブユニットの全長cDNAのEcoR
I−BamH I断片、Ｓ−138（Pihlajaniemi,et al.,EMBO
J.1987,6,643−649）をEcoR I/BamH Iで切断したpVL1
392と結合させて作成した。組み換えバキュロウイルス
転移ベクターを野生型Autographa californica nucle
ar polyhedrosis virus（AcNPV）DNAとリン酸カルシ
ウムトランスフェクト法により、Sf9細胞（Summers,M.
D.and Smith,G.E.,Tex.Agric.Exp.St.Bull.1987,1555,
1−56）に共トランスフェクトした。４日後、得られた
トランスフェクト細胞の上清中のウイルスプールを回収
し、プラーク解析に用いた。組換え交叉（occlusion）
陰性プラークを３回プラーク精製工程にかけ、野生型ウ
イルスの混入が全くない組み換えウイルスを作成した。
スクリーニング工程及び組み換えウイルスの精製はSumm
ers and Smith,supraの方法に従って行った。pVLα5
8、pVLα59及びpVLβから得られた組み換えウイルス
を、それぞれα58ウイルス、α59ウイルス及びβウイル
スとした。
グ領域、及び207bpの3'非翻訳配列を含むヒトプロリル
４−ヒドロキシラーゼβサブユニットの全長cDNAのEcoR
I−BamH I断片、Ｓ−138（Pihlajaniemi,et al.,EMBO
J.1987,6,643−649）をEcoR I/BamH Iで切断したpVL1
392と結合させて作成した。組み換えバキュロウイルス
転移ベクターを野生型Autographa californica nucle
ar polyhedrosis virus（AcNPV）DNAとリン酸カルシ
ウムトランスフェクト法により、Sf9細胞（Summers,M.
D.and Smith,G.E.,Tex.Agric.Exp.St.Bull.1987,1555,
1−56）に共トランスフェクトした。４日後、得られた
トランスフェクト細胞の上清中のウイルスプールを回収
し、プラーク解析に用いた。組換え交叉（occlusion）
陰性プラークを３回プラーク精製工程にかけ、野生型ウ
イルスの混入が全くない組み換えウイルスを作成した。
スクリーニング工程及び組み換えウイルスの精製はSumm
ers and Smith,supraの方法に従って行った。pVLα5
8、pVLα59及びpVLβから得られた組み換えウイルス
を、それぞれα58ウイルス、α59ウイルス及びβウイル
スとした。
Sf9細胞を10％ウシ胎児血清を含むTNM−FH培養液（Si
gma）中27℃で単層培養若しくはスピナーフラスコ（Tec
hne）中で浮遊培養した。組み換えタンパク質を合成す
るため、α58、α59またはβウイルスをそれぞれ単独に
使用する場合、1mlあたり106細胞の濃度で撒いたSf9細
胞に５−10倍の組み換えウイルスを注入した。プロリル
４−ヒドロキシラーゼ４量体を製造する場合、α及びβ
ウイルスを1:10−10:1の割合で感染に用いた。感染72時
間後細胞を回収し、0.10M トリスpH7.8/0.1M NaCl/0.
1M グリシン/10μＭ ジチオスレイトール/0.1％ Tri
ton Ｘ−100中でホモジェナイズし、遠心分離した。得
られた上清をSDS/10％PAGEまたは未変性7.5％PAGEによ
って解析し、酵素活性を解析した。細胞の沈殿物を１％
SDS中で更に可溶化し、SDS/10％PAGEによって解析し
た。感染後24−96時間後の細胞培養液もSDS/10％PAGEに
よって解析し、培養液中への合成タンパク質の分泌の有
無を分析した。これらの実験に用いた細胞は無血清TNM
−FH培養液中で培養した。
gma）中27℃で単層培養若しくはスピナーフラスコ（Tec
hne）中で浮遊培養した。組み換えタンパク質を合成す
るため、α58、α59またはβウイルスをそれぞれ単独に
使用する場合、1mlあたり106細胞の濃度で撒いたSf9細
胞に５−10倍の組み換えウイルスを注入した。プロリル
４−ヒドロキシラーゼ４量体を製造する場合、α及びβ
ウイルスを1:10−10:1の割合で感染に用いた。感染72時
間後細胞を回収し、0.10M トリスpH7.8/0.1M NaCl/0.
1M グリシン/10μＭ ジチオスレイトール/0.1％ Tri
ton Ｘ−100中でホモジェナイズし、遠心分離した。得
られた上清をSDS/10％PAGEまたは未変性7.5％PAGEによ
って解析し、酵素活性を解析した。細胞の沈殿物を１％
SDS中で更に可溶化し、SDS/10％PAGEによって解析し
た。感染後24−96時間後の細胞培養液もSDS/10％PAGEに
よって解析し、培養液中への合成タンパク質の分泌の有
無を分析した。これらの実験に用いた細胞は無血清TNM
−FH培養液中で培養した。
タンパク質発現のタイムコースを調べる際、組み換え
ウイルスに感染したSf9細胞を感染後24から50時間の間
の様々な２時間［35S］メチオニン（10μCi/μl;Amersh
am;1Ci＝37Cbq）でラベルし、そしてSDS/10％PAGEによ
って解析するために集めた。組み換えタンパク質の最大
蓄積を決定するために感染後24から96時間後の様々な時
点で細胞を回収し、SDS/10％PAGEによって解析した。細
胞の0.1％ Triton−Ｘ可溶画分及び１％ SDS可溶画分
を解析した。プロリル４−ヒドロキシラーゼ活性を２−
オキソ［１−14C］グルタール酸の脱炭酸化（Kivirikk
o,K.I.,and Myllyla,R.,Methods Enzymol.1982,82,24
5−304）に基づく方法により分析した。他の基質濃度を
一定に保ったとき、一定濃度の第２の基質存在下での第
１の基質濃度を変化させることによりKm値を決定した。
（Myllyla、R.,Tuderman,L.,and Kivirikko,K.I.,Eur.
J.Biochem.1977,80,349−357）。βサブユニットのタン
パク質ジスルフィドイソメラーゼ活性をグルタチオン：
インスリン トランスヒドロゲナーゼ分析によって測定
した（Carmichael et al.,J.Biol.Chem.1977,252,716
3−7167）。ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのβサ
ブユニットに対するモノクローナル抗体5B5（Hoyhtya,
M.et al.,Eur.J.Biochem.1984,141,477−482）を用い
てウエスタンンブロット解析を行った。ポリ（Ｌ−プロ
リン）親和性クロマトグラフィー、DEAE−セルロースク
ロマトグラフィー及びゲル濾過から成る工程（Kivirikk
o K.I.,and Myllyla,R.,Methods Enzymol.1987,144,
96−114）に従ってプロリル４−ヒドロキシラーゼを精
製した。
ウイルスに感染したSf9細胞を感染後24から50時間の間
の様々な２時間［35S］メチオニン（10μCi/μl;Amersh
am;1Ci＝37Cbq）でラベルし、そしてSDS/10％PAGEによ
って解析するために集めた。組み換えタンパク質の最大
蓄積を決定するために感染後24から96時間後の様々な時
点で細胞を回収し、SDS/10％PAGEによって解析した。細
胞の0.1％ Triton−Ｘ可溶画分及び１％ SDS可溶画分
を解析した。プロリル４−ヒドロキシラーゼ活性を２−
オキソ［１−14C］グルタール酸の脱炭酸化（Kivirikk
o,K.I.,and Myllyla,R.,Methods Enzymol.1982,82,24
5−304）に基づく方法により分析した。他の基質濃度を
一定に保ったとき、一定濃度の第２の基質存在下での第
１の基質濃度を変化させることによりKm値を決定した。
（Myllyla、R.,Tuderman,L.,and Kivirikko,K.I.,Eur.
J.Biochem.1977,80,349−357）。βサブユニットのタン
パク質ジスルフィドイソメラーゼ活性をグルタチオン：
インスリン トランスヒドロゲナーゼ分析によって測定
した（Carmichael et al.,J.Biol.Chem.1977,252,716
3−7167）。ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼのβサ
ブユニットに対するモノクローナル抗体5B5（Hoyhtya,
M.et al.,Eur.J.Biochem.1984,141,477−482）を用い
てウエスタンンブロット解析を行った。ポリ（Ｌ−プロ
リン）親和性クロマトグラフィー、DEAE−セルロースク
ロマトグラフィー及びゲル濾過から成る工程（Kivirikk
o K.I.,and Myllyla,R.,Methods Enzymol.1987,144,
96−114）に従ってプロリル４−ヒドロキシラーゼを精
製した。
図５は親和性カラムクロマトグラフィーによるタンパ
ク質精製後の、昆虫細胞により合成されたプロリル４−
ヒドロキシラーゼの解析を示す。未変性ゲルを用いたポ
リアクリクアミドゲル電気泳動により分析したところ、
組み換え酵素はニワトリ胚から精製した通常の酵素の４
量体活性型と同じ移動度を示した。組み換え酵素を還元
後、α及びβサブユニットが検出された。表２に組み換
え酵素の酵素活性のデータを示した。他の基質濃度を一
定に保ったとき、一定濃度の第２の基質存在下での第１
の基質濃度を変化させることによりKm値を決定した。
ク質精製後の、昆虫細胞により合成されたプロリル４−
ヒドロキシラーゼの解析を示す。未変性ゲルを用いたポ
リアクリクアミドゲル電気泳動により分析したところ、
組み換え酵素はニワトリ胚から精製した通常の酵素の４
量体活性型と同じ移動度を示した。組み換え酵素を還元
後、α及びβサブユニットが検出された。表２に組み換
え酵素の酵素活性のデータを示した。他の基質濃度を一
定に保ったとき、一定濃度の第２の基質存在下での第１
の基質濃度を変化させることによりKm値を決定した。
記載されているように、組み換え酵素のミカエリス−
メンテン（Km）値はニワトリ胚由来の本物の通常酵素の
値と同じであった。
メンテン（Km）値はニワトリ胚由来の本物の通常酵素の
値と同じであった。
トランスフェクトした昆虫細胞は大量の活性型プロリ
ル４−ヒドロキシラーゼを合成するので、大量のプロコ
ラーゲン及びコラーゲンの合成を得るために、プロコラ
ーゲン及びコラーゲンをコードする本発明の遺伝子をト
ランスフェクトするのに適切な細胞である。本発明の遺
伝子の細胞へのトランスフェクトは実施例３に記載され
るように行う。
ル４−ヒドロキシラーゼを合成するので、大量のプロコ
ラーゲン及びコラーゲンの合成を得るために、プロコラ
ーゲン及びコラーゲンをコードする本発明の遺伝子をト
ランスフェクトするのに適切な細胞である。本発明の遺
伝子の細胞へのトランスフェクトは実施例３に記載され
るように行う。
実施例８ プロリル４−ヒドロキシラーゼ組み換え遺伝
子を発現するサッカロミセス セレビシア（Saccharomy
ces cerevisiae）酵母中での組み換えコラーゲン遺伝
子の発現 酵母サッカロミセス セレビシア（Saccharomyces c
erevisiae）はどの多量の発現ベクターとも利用でき
る。最も一般的に使用される発現ベクターのひとつは酵
母及び大腸菌（E.coli）の両方における増殖の為の配
列、酵母のプロモーター、及び外来遺伝子の効率的な伝
達の為のターミネーターを含む多コピー２μプラスミド
である。２μプラスミドに基づくそのようなベクターの
典型的な例は２μ ORI−STB因子、GAL1プロモーター、
及び２μ Ｄ遺伝子ターミネーターをもつpWYG4であ
る。このベクターのNco I部位はプロリル４−ヒドロキ
シラーゼのα若しくはβサブユニット遺伝子の挿入に使
用するATGを含む。別の例として、発現ベクターは天然
の２μ ORI、STB、REP1及びREP2、GAL7プロモーターを
もち、FLPターミネーターを使用するpWYG7Lを用いるこ
ともできる。このベクターではプロリル４−ヒドロキシ
ラーゼのα若しくはβサブユニットの遺伝子は、5'端の
BamH I若しくはNco I部位でポリリンカーに挿入され
る。プロリル４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むベクタ
ーを、細胞壁を除去し、カルシウム及びポリエチレング
リコール処理によりDNAを取り込むスフェロプラストに
した後、若しくは未処理の細胞をリチウムイオンで処理
した後、S.cerevisiaeに形質転換した。または、DNAを
エレクトロポーレーションによって導入することもでき
る。ロイシン、トリプトファン、ウラシルまたはヒスチ
ジン要求性の宿主酵母細胞を用い、LEU2、TRP1、URA3、
HIS3、またはLEU2−Ｄのような選択マーカー遺伝子を利
用して、形質転換体を選択できる。ガラクトースプロモ
ーターによるプロリル４−ヒドロキシラーゼ遺伝子の発
現はガラクトースの付加により素早い誘導がかかるよう
に非抑制、非誘導糖の存在下で培養増殖させ；グルコー
ス培養液中で培養増殖し、そして遠心分離によりグルコ
ースを除去し、そしてガラクトース培養液中に懸濁する
前に細胞を洗い；そしてグルコース及びガラクトースを
含む培養液中で培養増殖し、ガラクトース誘導がかかる
前にグルコースを優先的に代謝させることにより誘導で
きる。安定な３重ヘリックス構造に折り畳まれ、従って
通常の生物学的機能を有するのに必要な折り畳みを伴う
ように、プロリル４−ヒドロキシラーゼにより適切にヒ
ドロキシル化されたコラーゲンまたはプロコラーゲンの
発現を得るため、プロリル４−ヒドロキシラーゼの両サ
ブユニットの遺伝子及び所望のコラーゲンまたはプロコ
ラーゲン遺伝子を細胞に取り込ませるように、さらに形
質転換細胞の処置を上記のように行う。
子を発現するサッカロミセス セレビシア（Saccharomy
ces cerevisiae）酵母中での組み換えコラーゲン遺伝
子の発現 酵母サッカロミセス セレビシア（Saccharomyces c
erevisiae）はどの多量の発現ベクターとも利用でき
る。最も一般的に使用される発現ベクターのひとつは酵
母及び大腸菌（E.coli）の両方における増殖の為の配
列、酵母のプロモーター、及び外来遺伝子の効率的な伝
達の為のターミネーターを含む多コピー２μプラスミド
である。２μプラスミドに基づくそのようなベクターの
典型的な例は２μ ORI−STB因子、GAL1プロモーター、
及び２μ Ｄ遺伝子ターミネーターをもつpWYG4であ
る。このベクターのNco I部位はプロリル４−ヒドロキ
シラーゼのα若しくはβサブユニット遺伝子の挿入に使
用するATGを含む。別の例として、発現ベクターは天然
の２μ ORI、STB、REP1及びREP2、GAL7プロモーターを
もち、FLPターミネーターを使用するpWYG7Lを用いるこ
ともできる。このベクターではプロリル４−ヒドロキシ
ラーゼのα若しくはβサブユニットの遺伝子は、5'端の
BamH I若しくはNco I部位でポリリンカーに挿入され
る。プロリル４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むベクタ
ーを、細胞壁を除去し、カルシウム及びポリエチレング
リコール処理によりDNAを取り込むスフェロプラストに
した後、若しくは未処理の細胞をリチウムイオンで処理
した後、S.cerevisiaeに形質転換した。または、DNAを
エレクトロポーレーションによって導入することもでき
る。ロイシン、トリプトファン、ウラシルまたはヒスチ
ジン要求性の宿主酵母細胞を用い、LEU2、TRP1、URA3、
HIS3、またはLEU2−Ｄのような選択マーカー遺伝子を利
用して、形質転換体を選択できる。ガラクトースプロモ
ーターによるプロリル４−ヒドロキシラーゼ遺伝子の発
現はガラクトースの付加により素早い誘導がかかるよう
に非抑制、非誘導糖の存在下で培養増殖させ；グルコー
ス培養液中で培養増殖し、そして遠心分離によりグルコ
ースを除去し、そしてガラクトース培養液中に懸濁する
前に細胞を洗い；そしてグルコース及びガラクトースを
含む培養液中で培養増殖し、ガラクトース誘導がかかる
前にグルコースを優先的に代謝させることにより誘導で
きる。安定な３重ヘリックス構造に折り畳まれ、従って
通常の生物学的機能を有するのに必要な折り畳みを伴う
ように、プロリル４−ヒドロキシラーゼにより適切にヒ
ドロキシル化されたコラーゲンまたはプロコラーゲンの
発現を得るため、プロリル４−ヒドロキシラーゼの両サ
ブユニットの遺伝子及び所望のコラーゲンまたはプロコ
ラーゲン遺伝子を細胞に取り込ませるように、さらに形
質転換細胞の処置を上記のように行う。
実施例９ プロリル４−ヒドロキシラーゼ組み換え遺伝
子発現Pichia pastoris酵母における組み換えコラーゲ
ン遺伝子の発現 プロリル４−ヒドロキシラーゼ及びプロコラーゲンま
たはコラーゲン遺伝子の発現は、大規模工程において組
み換えタンパク質を多量に生産するという特別な利点を
もつと思われるPichia Pastorisのような非サッカロミ
セス酵母においても可能である。メチロトローフP.rast
orisにおける典型的な発現はアルコールオキシダーゼを
コードし、厳密に制御されるAOX1遺伝子由来のプロモー
ターによって得られ、培養液中にメタノールを加えるこ
とによりプロモーターに制御される組み換えタンパク質
の高発現を誘導できる。P.pastorisは本来プラスミドを
もたないのでこの酵母は染色体組み込み用に設計された
発現ベクターとともに扱い、HIS4などの遺伝子を選択に
用いる。同じ細胞を更に処理することにより、組み替え
タンパク質がプロリル４−ヒドロキシラーゼによって適
切にヒドロキシル化され、従って繊維型をとるタンパク
質の通常の生物学的機能に必要な、安定なヘリックスに
折り畳まれ得る条件下で、本明細書に記載のプロコラー
ゲン及びコラーゲン遺伝子の発現を行う。
子発現Pichia pastoris酵母における組み換えコラーゲ
ン遺伝子の発現 プロリル４−ヒドロキシラーゼ及びプロコラーゲンま
たはコラーゲン遺伝子の発現は、大規模工程において組
み換えタンパク質を多量に生産するという特別な利点を
もつと思われるPichia Pastorisのような非サッカロミ
セス酵母においても可能である。メチロトローフP.rast
orisにおける典型的な発現はアルコールオキシダーゼを
コードし、厳密に制御されるAOX1遺伝子由来のプロモー
ターによって得られ、培養液中にメタノールを加えるこ
とによりプロモーターに制御される組み換えタンパク質
の高発現を誘導できる。P.pastorisは本来プラスミドを
もたないのでこの酵母は染色体組み込み用に設計された
発現ベクターとともに扱い、HIS4などの遺伝子を選択に
用いる。同じ細胞を更に処理することにより、組み替え
タンパク質がプロリル４−ヒドロキシラーゼによって適
切にヒドロキシル化され、従って繊維型をとるタンパク
質の通常の生物学的機能に必要な、安定なヘリックスに
折り畳まれ得る条件下で、本明細書に記載のプロコラー
ゲン及びコラーゲン遺伝子の発現を行う。
フロントページの続き (72)発明者 フェルタラ，アンドルズィー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19107, フィラデルフィア，ウォールナット・ス トリート 100 (72)発明者 シエロン，アレクサンダー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19107, フィラデルフィア，サウス・サーティー ンス・ストリート 201，ナンバー 901 (72)発明者 キビリッコ，カリ・イ フィンランド国 エスエフ−90230 オ ウル 23，ラアムサンティエ 14 ベ１ (72)発明者 ゲッディス，エイミー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19107, フィラデルフィア，サウス・エイス・ス トリート 233，アパートメント ６ (56)参考文献 米国特許5045449（ＵＳ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．266［22 ］（1991，Ａｕｇ．）ｐ．14175−14178 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．10［４ ］（1990）ｐ．1452−1460 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/10 C12N 1/19 C12N 15/09 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (39)
- 【請求項１】（ａ）ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードする少なくとも一つのトランスフェクトされ
た配列、並びに （ｂ）プロリル ４−ヒドロキシラーゼ又はそのサブユ
ニットをコードする少なくとも一つのトランスフェクト
された配列 含む組換え宿主細胞。 - 【請求項２】前記組換え宿主細胞が実質的に、天然には
プロコラーゲンまたはコラーゲンを産生しない、請求項
１に記載の宿主細胞。 - 【請求項３】前記組換え宿主細胞が実質的に、天然には
ヒトのプロコラーゲンまたはコラーゲンを産生しない、
請求項１に記載の宿主細胞。 - 【請求項４】前記プロリル ４−ヒドロキシラーゼ又は
そのサブユニットをコードするトランスフェクトされた
配列が、プロリル ４−ヒドロキシラーゼのαサブユニ
ットをコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に
記載の宿主細胞。 - 【請求項５】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲン
をコードするトランスフェクトされた配列が、繊維性の
プロコラーゲン又はコラーゲンをコードする、請求項１
ないし４のいずれか１項に記載の宿主細胞。 - 【請求項６】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲン
をコードするトランスフェクトされた配列が、非−繊維
性のプロコラーゲン又はコラーゲンをコードする、請求
項１ないし４のいずれか１項に記載の宿主細胞。 - 【請求項７】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲン
をコードするトランスフェクトされた配列が、Ｉ型、II
型、III型及びIV型のプロコラーゲン又はコラーゲンか
らなる群から選択されるプロコラーゲン又はコラーゲン
をコードする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載
の宿主細胞。 - 【請求項８】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲン
をコードするトランスフェクトされた配列が、COL1A1、
COL1A2、COL2A1、COL3A1及びCOL4A5からなる群から選択
される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の宿主
細胞。 - 【請求項９】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲン
をコードする少なくとも一つのトランスフェクトされた
配列が、突然変異、変異又はハイブリッド遺伝子であ
る、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の宿主細
胞。 - 【請求項１０】前記宿主細胞が真核細胞である、請求項
１ないし９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。 - 【請求項１１】前記真核細胞が非ヒト哺乳動物細胞であ
る、請求項10に記載の組換え宿主細胞。 - 【請求項１２】前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項
10に記載の組換え宿主細胞。 - 【請求項１３】前記真核細胞が酵母細胞である、請求項
10に記載の組換え宿主細胞。 - 【請求項１４】組換えプロコラーゲンおよび／または組
換えコラーゲンの産生に有用な宿主細胞を作成する方法
であって、 （ａ）ヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンをコードす
る少なくとも一つの配列を前記宿主細胞にトランスフェ
クトし；そして （ｂ）プロリル ４−ヒドロキシラーゼ又はそのサブユ
ニットをコードする少なくとも一つの配列を前記宿主細
胞にトランスフェクトする、 ここにおいて、前記宿主細胞はプロコラーゲンまたはコ
ラーゲンを産生することが可能である ことを含む、前記方法。 - 【請求項１５】前記組換え宿主細胞が実質的に、天然に
はプロコラーゲンまたはコラーゲンを産生しない、請求
項14に記載の方法。 - 【請求項１６】前記組換え宿主細胞が実質的に、天然に
はヒトのプロコラーゲンまたはコラーゲンを産生しな
い、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１７】前記プロリル ４−ヒドロキシラーゼ又
はそのサブユニットをコードするトランスフェクトされ
た配列が、プロリル ４−ヒドロキシラーゼのαサブユ
ニットをコードする、請求項14ないし16のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項１８】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードするトランスフェクトされた配列が、繊維性
のプロコラーゲン又はコラーゲンをコードする、請求項
14ないし17のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１９】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードするトランスフェクトされた配列が、非−繊
維性のプロコラーゲン又はコラーゲンをコードする、請
求項14ないし17のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２０】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードするトランスフェクトされた配列が、Ｉ型、
II型、III型及びIV型のプロコラーゲン又はコラーゲン
からなる群から選択されるプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードする、請求項14ないし17のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項２１】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードするトランスフェクトされた配列が、COL1A
1、COL1A2、COL2A1、COL3A1及びCOL4A5からなる群から
選択される、請求項14ないし17のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項２２】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードする少なくとも一つのトランスフェクトされ
た配列が、突然変異、変異またはハイブリッド遺伝子で
ある、請求項14ないし17のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２３】前記宿主細胞が真核細胞である、請求項
14ないし22のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２４】前記真核細胞が非ヒト哺乳動物細胞であ
る、請求項14ないし23のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２５】前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項
14ないし23のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２６】前記真核細胞が酵母細胞である、請求項
14ないし23のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２７】宿主細胞においてプロコラーゲンまたは
コラーゲンを産生する方法であって、 ここにおいて、前記宿主細胞はヒトのプロコラーゲン又
はコラーゲンをコードする少なくとも一つの配列、及び
プロリル ４−ヒドロキシラーゼ又はそのサブユニット
をコードする少なくとも一つの配列によってトランスフ
ェクトされている、 （ａ）上記宿主細胞をプロコラーゲンおよび／またはコ
ラーゲンの発現を可能にする条件下で培養し；そして （ｂ）プロコラーゲンおよび／またはコラーゲンを単離
する ことを含む、前記方法。 - 【請求項２８】前記組換え宿主細胞が実質的に、天然に
はプロコラーゲンまたはコラーゲンを産生しない、請求
項27に記載の方法。 - 【請求項２９】前記組換え宿主細胞が実質的に、天然に
はヒトのプロコラーゲンまたはコラーゲンを産生しな
い、請求項27に記載の方法。 - 【請求項３０】前記プロリル ４−ヒドロキシラーゼ又
はそのサブユニットをコードするトランスフェクトされ
た配列が、プロリル ４−ヒドロキシラーゼのαサブユ
ニットをコードする、請求項27ないし29のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項３１】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードするトランスフェクトされた配列が、繊維性
のプロコラーゲン又はコラーゲンをコードする、請求項
27ないし30のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３２】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードするトランスフェクトされた配列が、非−繊
維性のプロコラーゲン又はコラーゲンをコードする、請
求項27ないし30のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３３】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードするトランスフェクトされた配列が、Ｉ型、
II型、III型及びIV型のプロコラーゲン又はコラーゲン
からなる群から選択されるプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードする、請求項27ないし30のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項３４】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードするトランスフェクトされた配列が、COL1A
1、COL1A2、COL2A1、COL3A1及びCOL4A5からなる群から
選択される、請求項27ないし30のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項３５】前記ヒトのプロコラーゲン又はコラーゲ
ンをコードする少なくとも一つのトランスフェクトされ
た配列が、突然変異、変異またはハイブリッド遺伝子で
ある、請求項27ないし30のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３６】前記宿主細胞が真核細胞である、請求項
27ないし35のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３７】前記真核細胞が非ヒト哺乳動物細胞であ
る、請求項36に記載の方法。 - 【請求項３８】前記真核細胞が昆虫細胞である、請求項
36に記載の方法。 - 【請求項３９】前記真核細胞が酵母細胞である、請求項
36に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78089991A | 1991-10-23 | 1991-10-23 | |
| US780,899 | 1991-10-23 | ||
| PCT/US1992/009061 WO1993007889A1 (en) | 1991-10-23 | 1992-10-22 | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant dna systems |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001379164A Division JP2002255999A (ja) | 1991-10-23 | 2001-12-12 | 組換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP50792293A Expired - Fee Related JP3302017B2 (ja) | 1991-10-23 | 1992-10-22 | 組み換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成 |
| JP2001379164A Pending JP2002255999A (ja) | 1991-10-23 | 2001-12-12 | 組換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成 |
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|---|---|---|---|
| JP2001379164A Pending JP2002255999A (ja) | 1991-10-23 | 2001-12-12 | 組換えｄｎａ合成システムにおけるヒトプロコラーゲン及びコラーゲンの合成 |
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| JP (2) | JP3302017B2 (ja) |
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| AU (2) | AU680606B2 (ja) |
| CA (1) | CA2121698C (ja) |
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| DK (1) | DK0625048T4 (ja) |
| ES (1) | ES2143478T5 (ja) |
| GR (1) | GR3033022T3 (ja) |
| WO (1) | WO1993007889A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9018354B2 (en) | 2005-03-31 | 2015-04-28 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Methods of producing proteins having triple-helix structure |
| KR102135976B1 (ko) * | 2019-10-24 | 2020-07-20 | 주식회사 에이바이오테크 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1995011920A1 (en) * | 1993-10-25 | 1995-05-04 | Teijin Limited | Purified human chondrocalcin, process for producing the same, and utilization thereof |
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| US6713662B1 (en) * | 1994-07-27 | 2004-03-30 | Pharming Intellectual Property B.V. | Production of collagen in the milk of transgenic mammals |
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