JP3330372B2 - ポリヌクレオチド組成物および方法 - Google Patents

ポリヌクレオチド組成物および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の概要〕 特異的なポリヌクレオチド組成物およびその生産方法
を開示する。生産されたポリヌクレオチドは非相補的な
ヌクレオチド配列を全く含有しない。この特異的なポリ
ヌクレオチドは、治療剤としてラベルされ診断に応用す
るプローブを生産するのに使用でき、または薬剤の配送
にまたは治療剤として使用できる。
〔産業上の利用分野〕
本発明は、特異的なポリヌクレオチド組成物およびそ
の生産方法に関する。
〔従来の技術〕
ポリヌクレオチド調製物は、一般に特異的に意図する
ヌクレオチド配列および意図しない、実際は意図するポ
リヌクレオチドの使用を防害し得る他のポリヌクレオチ
ドからなる。これらの調製物は従来次のようにして得ら
れた。所望のポリヌクレオチドのコピーを細菌プラスミ
ドのようなベクタに挿入し、結果的に組換えベクタを得
る。その後組換えベクタを細菌のような宿主に導入し、
結果的にこれが複製する形質転換宿主を得る。組換えベ
クタのプラスミド複製を許容する生育期間の後、多コピ
ーを単離し、必要に応じて所望のポリヌクレオチドを切
除する。これらのポリヌクレオチド調製物は、特に治療
および診断応用に用途を有する。
この従来の方法では、所望のポリヌクレオチドを含有
する調製物は意図しない他のポリヌクレオチドをも一般
に含有する。これらのポリヌクレオチドは２つの起源、
pBR322のようなクローン化に使用する従来のベクタおよ
び宿主染色体から生起する。所望のポリヌクレオチドを
含有する単離物がラベルされている場合、これらの他の
ポリヌクレオチドもラベルされている。これらの他のポ
リヌクレオチドの多くは、生物サンプルにしばしば認め
られる共生細菌のポリヌクレオチドに相補的である。よ
って、これらの他のラベルされたポリヌクレオチドは診
断応用で偽陽性を与えるサンプルで共生細菌と反応し得
る。これらの欠点は、アール・エフ・アムビンダら「臨
床例の診断的核酸ハイブリダイゼーションにおけるベク
タ相同問題」、J.Clin.Microb.,24,16−20（1986）で考
察されている。
挿入物がヒトパピローマウィルス（HPV）に対して特
異的であり、かつpUC9ベクタにクローン化されているも
のが一例である。ベクタはイー・コリ細胞に導入されイ
ー・コリは複製を許容される。HPV挿入物を含有するベ
クタポリヌクレオチドは、当業界で公知の幾つかの方法
のいずれかによりイー・コリ細菌から単離される。HPV
挿入物は制限酵素で開裂され、精裂され、例えば螢光分
子でニックトランスレーションによりラベルされる。１
つはHPVを含有し１つは含有しない２つの異なる膣汚染
に対しこのHPVプローブを試験するに際し、イー・コリ
細菌はしばしば女性尿管に棲息するため両方の試験が陽
性と表れ得る。HPV陰性膣汚染で得られる偽陽性は、HPV
特異的ポリヌクレオチドをラベルする途中にラベルされ
プラスミドまたはイー・コリの染色体に見出されるポリ
ヌクレオチド配列に相補的なHPVプローブの中にまたは
共に存在する非特異的ポリヌクレオチドの結果である。
HPV陰性サンプルの尿管内におけるイー・コリ細胞の豊
富な存在は、プローブに存在する低レベルのラベルされ
たイー・コリポリヌクレオチドを補償して余りある。
イー・コリポリヌクレオチドに相補的でない所望のポ
リヌクレオチドを生産する１つの方法は、例えば遺伝子
合成装置によりポリヌクレオチドを合成的に生産するこ
とである。現在利用可能な装置は約50ヌクレオチド（0.
50kb）のポリヌクレオチドを生産することができる。し
かしながら、この方法で調製したポリヌクレオチドはよ
り長い（１〜2kb）配列をラベルし得る程にはラベルし
得ない。長いプローブは一般に標的ポリヌクレオチドに
ハイブリダイズするに際し短いプローブより大きなシグ
ナルを与える。
さらに、長く伸長したポリヌクレオチドの間で形成さ
れたハイブリッドは、短く伸長したポリヌクレオチドの
間で形成されたハイブリッドより顕著に熱力学的に安定
である。これによりハイブリッドが高温および高緊縛条
件下でインタクトなまま留まるのが許容され、無作為に
形成されたハイブリッドの変性が単純化される。
よって、特にハイブリダイゼーション検定において、
均一なヌクレオチド調製物、特に現在遺伝子合成装置か
ら得ることのできるものより長い配列を提供するものを
創製する方法の必要性が存する。
〔発明が解決しようとする課題〕
この必要性に応えるべく、本発明は、意図するもの以
外の非特異的オリゴまたはポリヌクレオチドを含有しな
い意図する特異的なオリゴまたはポリヌクレオチドから
なる組成物を提供する。このオリゴまたはポリヌクレオ
チドは、遺伝子合成装置により達成され得るより何倍も
長い配列となり得、他の試験管内または生体内技術から
従来利用可能であったものより均一である。この種の均
一なオリゴまたはポリヌクレオチドは、特にハイブリダ
イゼーション検定試薬調製に使用するのに有利である。
〔課題を解決するための手段〕
よって本発明によれば、（ａ）本質的に、 （ｉ）ベクタがT7ファージから誘導された核酸ベクタ、 （ii）前記標的の核酸と十分に相同的であり、実質的に
標的配列のみとハイブリダイズし、混入物として試料中
に存在し得る他の配列とはハイブリダイズしない核酸断
片、および （iii）検出し得るシグナルの産生に必要でありかつ
（ｉ）または（ii）の少なくとも１つと共有結合する少
なくとも１つのラベル系 よりなる核酸、および （ｂ）前記ラベル系成分自身が検出し得ない場合に前記
ラベル系の成分（iii）に結合し、前記ラベル成分が検
出し得るようにする前記ラベル系の少なくとも１種の付
加成分； からなることを特徴とする組成物が提供される。１つの
観点では、この細胞または無細胞系は宿主細菌細胞であ
り、かつオリゴまたはポリヌクレオチドを選択的不活性
化または消化によりアニールし得なく処理する。ベクタ
は致死的ファージとすることができ、オリゴまたはポリ
ヌクレオチドをこれにより不活性化する。例えばこの致
死的ファージは、Ｔ偶数系ファージ、ファージT7、また
はファージベクタT7−T102,T7−T014,T7−T105並びにT7
−T106のような溶菌性ファージとすることができる。致
死的ファージは、温度依存性または宿主選択性のものの
ような溶菌性欠損ファージとすることもできる。ベクタ
が溶菌性欠損ファージである場合は、この方法は、宿主
複製系の全ゆる細胞膜を破壊する付加工程を含む。
他の観点では、ベクタは致死的ファージである必要は
ない。この観点では、この方法は、ベクタが蛋白質コー
トを有するファージである場合は、ベクタ含有細胞また
は無細胞系に裸のオリゴまたはポリヌクレオチドを不活
性化するが蛋白質を不活性化しない物質を導入する付加
工程を含む。例として、この種の不活性化または消化特
性を有する物質は、デオキシボヌクレアーゼまたはリボ
ヌクレアーゼまたはこれらの組合せのようなヌクレアー
ゼである。
本発明は、さらに前記した方法により調製する組成物
を提供する。この組成物は、意図する特異的なオリゴま
たはポリヌクレオチドからなり非特異的なオリゴまたは
ポリヌクレオチドを含有しない。この組成物は、ハイブ
リダイゼーションまたは他の特異的な結合系について公
知の全ゆるラベル系でラベルを行うのに特に適切であ
り、かつハイブリダイゼーション検定、薬剤配送並びに
遺伝子制御を含む用途について例外的な特異性の試薬を
提供する。
前記した態様の他の観点では、本発明は、意図する標
的配列に特異的に相補的なオリゴまたはポリヌクレオチ
ド配列を有する致死的ファージからなる組換えベクタを
提供する。前記したように、致死的ファージは溶菌性ま
たは溶菌性欠損とすることができる。典型的な溶菌性フ
ァージは、ファージT7、Ｔ偶数系ファージ、T7−T102,T
7−T104,T7−T105並びにT7−T106である。典型的な溶菌
性欠損ファージは温度依存性または宿主選択性のもので
ある。
全ゆるファージの観点および態様で、組換えベクタは
さらに少なくとも１つのラベル系の成分を組込み得る。
このラベル系成分は、オリゴまたはヌクレオチド配列の
またはファージのまたは両方の少なくとも１つのヌクレ
オチドで組込まれ得る。典型的なラベル系成分はビオチ
ンおよびそのアナログ、酵素、螢光物質、ラジオラベル
並びにその類似物を含む。
前記したように、本発明は組成物および特異的なポリ
ヌクレオチド調製物、すなわち非特異的なポリヌクレオ
チドにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含有
しない調製物を生産する方法を開示する。
意図するポリヌクレオチドは通常は少なくとも50のヌ
クレオチドからなり、この配列は標的配列に対し独特で
あり、特異的な生物または特異的な群の生物に対し独特
または特徴的である。この種の挿入物から得られるポリ
ヌクレオチド断片は、これらが生物の標的配列と独特に
ハイブリダイズするのに十分な配列のヌクレオチドを含
めば特異的なポリヌクレオチドと考えられる。標的は狭
くも広くもなり得、属の単一の種から幾つかの属の多数
の種にまで及ぶ。この種の特異的なポリヌクレオチド
は、よって標的生物または組織の存在を検出するプロー
ブとして使用し得、治療実体としてまたは薬剤配送系の
一部として使用し得る。
溶菌性ファージの選択および使用 １つの態様では、本発明は致死的ファージを使用する
ことを企図するが、これは、感染に際し宿主細菌の生存
能力を破壊する溶菌性または溶菌性欠損ファージであ
る。致死的ファージから誘導されたベクタは宿主染色体
の全ゆるポリヌクレオチドに対し全く相同性を有しない
だろう。ファージは一般に複製して宿主細胞当り約50〜
500のファージ粒子を生産し、同時に宿主ポリヌクレオ
チドを崩壊させる。よって、唯一残る無傷のオリゴまた
はポリヌクレオチドはベクタおよび意図する挿入物のも
のである。
本発明によれば、ベクタとして使用すべく選択するフ
ァージのポリヌクレオチドを単離し、予備決定した制限
エンドヌクレアーゼにより切断して挿入部位を与えた
後、意図する特異的なポリヌクレオチドを導入して組換
えポリヌクレオチドを生産する。
組換えポリヌクレオチドをパッケージし、適切な宿主
細胞を使用する標準的方法でファージのストックを作成
する。ファージが複製するのを許容する適切な宿主を選
択する。イー・コリは好適な宿主細胞である。
所望のファージの組換えポリヌクレオチドをフェノー
ル処理によりこれらのカプシドから除去する。その後組
換えポリヌクレオチドは、従来のベクタを用いるのと異
なり直接ラベルして使用し得る。その他、挿入物をシグ
ナル生成系の１つの成分として後に働き得るベクタ配列
の一部と共に回収することができる。或いは所望に応じ
て、これを酵素的に処理して特異的なポリヌクレオチド
挿入物を開裂し得る。この場合、標準的方法を使用して
挿入物を単離し、特異的なポリヌクレオチド単独をラベ
ルする。このラベルを達成する方法は当業者にとって公
知である。
本発明によって組換えポリヌクレオチドから作成する
プローブは、細菌宿主染色体ポリヌクレオチドに相補的
な如何なるポリヌクレオチドをも含有しないだろう。致
死的ファージは増殖期間の後にその細菌宿主の生存能力
を破壊する機構を有するため、宿主染色体はもはや複製
し得ない。さらに、ファージは一般に宿主ポリヌクレオ
チドを崩壊させるため、ファージポリヌクレオチドと宿
主染色体との間でどのような組込みが自然に起ったとし
ても、結果する組込み生成物は破壊される。それにも拘
らず、絶対的な純粋性を確実にすべく、塩化セシウムグ
ラジエントにより、および／またはデオキシリボヌクレ
アーゼ、リボヌクレアーゼまたは両方を使用するヌクレ
アーゼ処理を混合物に施すことにより混合物中の全ゆる
宿主ポリヌクチオチド残渣からファージを分離し得る。
ヌクレアーゼは裸のポリヌクレオチドを崩壊させるのみ
でファージを崩壊させない。
プローブは細菌宿主染色体にまたはこの種の宿主が有
するプラスミドに見出されるポリヌクレオチドに相補的
な如何なるポリヌクレオチドも含有し得ないため、生物
サンプル中でプローブが非特異的なポリヌクレオチドと
ハイブリダイズすることはあり得ない。
この態様の１つの例として、Ｔファージのようなある
種の好適な溶菌性ファージの使用を構成する。Ｔファー
ジおよび他の溶菌性ファージのいずれをも使用し得るの
であるが、好適例はT7 2本鎖DNAバクテリオファージで
あり、これは長きに渡り著述されている。デュンとスツ
ジル、「バクテリオファージT7DNAの全ヌクレオチド配
列およびT7遺伝素子の位置」、J.Mol.Biol.,166,477〜5
35（1983）を参照するとよい。
T7の全ゲノムの配列および遺伝的機能は公知であるた
め、これをベクタとして使用すれば有利である。この利
点は、多数の必須でない遺伝子が存在し、これらを除去
しても適切な宿主でのファージの生存能力に影響を与え
ないという事由による。例えば、宿主の制限酵素活性を
除去し、そうでなければT7ファージを破壊する蛋白質を
コードする遺伝子が存在する。もしこの種の制限酵素を
含有しない宿主細菌を使用すれば（制限マイナス）、こ
れらの蛋白質をコードするT7ファージの遺伝子領域は必
要でない。ファージDNAは感染粒子にパッケージされる
所定の大きさでなければならない。一般に、結果的に得
られる粒子中のDNAの大きさは約10％を越えて延長し得
ず、20％を越えて低減し得ない。よってこれにより挿入
物の大きさの限界が置かれる。しかしながら、ファージ
から必須でない遺伝子が欠失されれば、その後より大き
い挿入物を組込み得る。
例えば、生成物はもとのT7DNAおよび挿入物として特
異的なヌクレオチド配列を含み得る（組換えポリヌクレ
オチド）。このDNA分子は蛋白質コートでパッケージさ
れる必要があり、この結果イー・コリ細胞に感染し得
る。パッケージ蛋白質を調製する適切な方法はクエムメ
ルレとマスカ、Virol.23,509（1977）により著述されて
いる。この方法は、適切なサプレッション・ネガティブ
のイー・コリ宿主におけるT7の変異株の使用を含み、パ
ッケージ蛋白質を与える。
T7DNAと挿入物DNAとのライゲーション混合物を全ての
付加的に必要な成分と共に抽出物と一緒にインキュベー
トするが、これは当業者には公知である。パッケージン
グが起るのに十分な時間が経過した後、混合物を宿主細
胞の培養物に添加し、溶けた寒天とスラリとをブロス寒
天平板に注入する。プラークが形成されるまで平板を37
℃でインキュベートする。特異的なポリヌクレオチドす
なわちプローブファージを含有するプラークをその後決
定する。いずれかのプラークにおける特異的なポリヌク
レオチドの存在を検出する１つの方法は、プラークリフ
トを作成しそれぞれのプラークからのT7ポリヌクレオチ
ドを特異的なポリヌクレオチドからなるプローブを用い
てインキュベートすることによる。例えば、マニアテス
ら、Molecular Cloning,コールド・スプリング・ハーバ
研究所（1982）を参照するとよい。特異的なポリヌクレ
オチドの存在は、（１）多数のプラークからのファージ
ストックを増殖させ、（２）フェノール処理／エタノー
ル沈澱によりプラークからポリヌクレオチドを単離し、
（３）適切な制限酵素を使用してファージ中の特異的な
ポリヌクレオチドの存在を同定することによっても決定
し得る。
所望のファージプラークを同定した後は、精製したフ
ァージストックを一連の希釈によってこれより得る。フ
ァージを回収して培養し、プラークを単離し、これより
ファージストックを調製する。その後これらのファージ
ストックを用いて、この一部を宿主細胞の液体培養に添
加して溶菌が起るまでインキュベートすることにより大
スケール量のファージを調製する。塩化セシウム遠心分
離および／またはヌクレアーゼ処理により残余する可能
性のある宿主染色体ポリヌクレオチドからファージを精
製する。
非溶菌性ファージの選択および使用 溶菌性欠損ファージは宿主細胞の生存能力を破壊して
それ自身のポリヌクレオチドを複製することができる
が、ある種の状況下では宿主細胞を溶菌しない。例え
ば、これらは温度感受性、または宿主範囲変異株とする
ことができ、この場合、これらは宿主細胞を特定の温度
または宿主を使用したときのみ溶菌することとなろう。
よって、ファージが細胞を溶菌する条件下でこれらは宿
主細胞中で複製し得る。しかしながら、一旦所望のファ
ージを得れば、溶菌が起らない条件下でこれらは宿主細
胞中で複製し得る。一旦ファージが宿主のポリヌクレオ
チドを崩壊させそれ自身のゲノムを複製すれば、ファー
ジ粒子をなお担持する宿主細胞は少量の容積で集められ
る。その後、宿主細胞の膜を例えば界面活性剤溶菌によ
り破裂させ、ヌクレアーゼにより宿主ポリヌクレオチド
を崩壊させ、ファージ粒子を集める。その後例えば塩化
セシウムのグラジエントにより溶菌中に形成された残渣
からファージ粒子を精製する。
宿主細胞のポリヌクレオチドを別個に不活性化して全
ての宿主細胞ポリヌクレオチドを精製の過程で意図する
ポリヌクレオチドから分離しなければならない。よって
従来の技術では、これらの宿主ポリヌクレオチドが意図
するポリヌクレオチドの調製物に混入する。
宿主細胞ポリヌクレオチドを不活性化する１つの方法
は前記したようにヌクレアーゼ処理によるものである。
他の方法はこれらを不可逆的に架橋結合するものであ
る。この方法は宿主細胞のポリヌクレオチドが主として
２本鎖形態であることを必要とする。２本鎖ポリヌクレ
オチドを架橋する多数の試薬が利用可能である。しかし
ながら、試薬は、ファージ蛋白質コートに浸透してファ
ージのポリヌクレオチドをも不活性化し得るものであっ
てはならない。
この方法の変法は、内位添加剤（intercalating agen
t）を付着させるもので、これは２本鎖ポリヌクレオチ
ドをビーズに架橋する能力を有する。ビーズは例えばセ
ファロース、アガロース、またはシリカのようないずれ
のポリマとすることもできる。内位添加剤は、内位添加
剤がビーズと反応しなお内位添加剤上に架橋に必要な機
能を無傷のまま残し得るようこれを誘導することにより
ビーズに付着される。この種の試薬の例はプソラレン
（psoralen）、内位添加かつ架橋剤である。プソラレン
は、例えばアガロースと反応し得るイソチオシアナート
基を含有するよう誘導し得る。
プソラレンのビーズへの付着に続いて、ビーズをパッ
ケージされたファージ粒子と宿主細胞の裸のポリヌクレ
オチドからなる細胞抽出物と混合する。混合物をあらか
じめ決定した時間の間撹拌する。プソラレンは、裸の２
本鎖ポリヌクレオチドのみに内位添加し得、ファージの
封止されたポリヌクレオチドに内位添加し得ない。
その後混合物をプソラレンを活性化し得る波長の光に
露呈する。活性化されたプソラレンは内位添加したポリ
ヌクレオチドを架橋結合する。遠心分離を用いて低速で
ビーズを回転沈降させ、ファージ粒子を上浄に懸濁状態
で残す。その後高速でファージ粒子を回転沈降させ、溶
かして特異的なポリヌクレオチドからなるものを含むそ
のポリヌクレオチドを放出させる。
異種起源の宿主細胞系 本発明の他の態様は、特異的なポリペプチドを標的ヌ
クレオチドの起源に見出される如何なるポリヌクレオチ
ドをも含まないベクタおよび宿主細胞で増殖させる場合
に適用できる。よって、たとえベクタまたは宿主細胞の
ポリヌクレオチドによる特異的なポリヌクレオチドの汚
染があったとしても、これらのポリヌクレオチドは生物
サンプルに存在しないため全く結果となり得ない。
この種の宿主細胞の例は植物細胞およびそこに見出さ
れるプラスミドであり、ここでは、ヒト細胞または細菌
に見出されるものに相補的なポリヌクレオチドは植物中
には全く存在しない。標的サンプルはヒトのど培養物と
し得る。
〔実施例〕
以下の実施例を説明するが、本発明を限定するもので
はない。
実施例 １ この実施例に記載する実験により、pBR322またはM13
のような普通に使用するクローン化ベクタはイー・コリ
DNAと交叉反応するのに対し、T7のような致死的ファー
ジはイー・コリDNAと交叉反応しないことを説明する。
これにより、ハイブリダイゼーションプローブとして使
用するのに適切な特異的なDNA配列組成物を調製するベ
クタの適切な選択を説明する。
T7、pBR322並びにM13DNAのイー・コリのものとの交叉
反応性を測定すべく、P32ラベルしたDNAプローブをイー
・コリの臨床単離物（ten）からの標的DNAとハイブリダ
イズさせた。ラベルしたプローブの起源は野生型T7バク
テリオファージおよび２つの普通に使用されるクローン
化ベクタ、pBR322およびM13である。この実験で使用し
たイー・コリを種々の臨床標品から単離し典型的な臨床
単離物の例とした。少なくとも４つの種が抗生物質耐性
を与えるプラスミドを含有する。
12のDNA（前記した10のイー・コリ臨床単離物並びに
実験室イー・コリ種JM103およびウシ胸線DNA）をマニア
ティスら、前記した文献により記載された方法によって
調製する。TE緩衝液（10mM Tris HCl,pH8.0,1mM EDTA）
をそれぞれのDNAサンプル（終濃度125μ当り20μｇ）
に添加することによりポール（Pall）ナイロン膜（ポー
ル・バイオジン（Pall Biodyne））上にDNAをドットす
る。10分の１容量（12.5μ）の2MNaOHを変性DNA（室
温で10分）に添加する。その後、7M酢酸アンモニウム
（150μ,pH8.0）を添加し、続いて1M酢酸アンモニウ
ム（712.5μ）を添加する。それぞれのサンプルから
のDNA（すなわち１μg/50μ）を真空（10インチHg）
を用いドットブロット・マニホールドを用いてポールナ
イロン膜上にドットする。その後２×SSC（0.3MNaCl,0.
03Mクエン酸Na,pH8.0）を用いて膜を短時間リンスし、
風乾し、使用する前に80℃で２時間真空下で加熱する。
試験した３つのDNAプローブ（T7,pBR322並びにM13）
をP32を用いニックトランスレーション（マニアティス
ら、前記した文献p109を参照するとよい）によりラベル
して５×107cpm/μgDNAの比活性を有するプローブを作
成する。
使用する予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリ
ダイゼーションの方法はマニアティスら、前記した文献
に記載されたようなものである。65℃での48時間のハイ
ブリダイゼーションの後、２×SSC,0.1％SDSを用いて３
回、0.2×SSC,0.1％SDSを用いて３回、65℃で膜を洗浄
する（それぞれの洗浄について20分）。フィルタをＸ線
フィルム（コダック）に露呈し、現像後、ドットの領域
を切除してシンチレーションカウントにより定量化す
る。この研究の結果を第１表にまとめる。
これらのデータから、普通に使用されるプラスミドpB
R322はイー・コリDNAと高度に交叉反応性であり、M13も
イー・コリDNAと高度に交叉反応性であるが、例えばT7
のような致死的ファージは試験したイー・コリとは交叉
反応性でないことが分かる。よって、これは、致死的フ
ァージがクローン化ベクタとして使用して交叉反応性、
非特異的配列を含有しないオリゴまたはポリヌクレオチ
ド調製物を生産するのに極めて望ましいことを示唆す
る。これは特にハイブリダイゼーションプローブに使用
するのに極めて望ましい。
実施例 ２ この実施例に記載する実験は幾種かの組換え致死的フ
ァージベクタの作成に関する。これらのベクタをその後
これらの中に種特異的DNA配列を挿入し増殖させること
により使用する。広範な種類の意図するDNA配列がこれ
らのベクタへの挿入に適切である。
pENZ−４の作成 背景情報は、ヤングら、米国出願番号823,921、1986
年１月30日に出願され即時の承継人に譲渡されたものに
与えられているが、これを参考文献としてここに取り入
れる。これは、受託番号53411および53409としてアメリ
カン・タイプ・カルチャ・コレクションに寄託された組
換え細菌種を記載する。これらは、それぞれGC155およ
びGC1657として言及されるナイセリア・ゴノルホエア
（Neisseria gonorrhoeae）由来のDNA配列挿入物を含有
するバクテリオファージベクタmp8（バクテリオファー
ジM13から誘導される）を含有する。ここではこれらをp
ENZ−１（mp8::GC155）およびpENZ−２（mp8::GC1657）
として後記する。ベクタmp8に関するさらなる背景につ
いては、メシング、ジェー、Methods in Enzymology,10
1,20〜78（1983）を参照するとよい。
次に第１図を参照して、EcoR1およびSal I消化により
pENZ−１から除去されるGC155配列をバクテリオファー
ジベクタmp19に導入し、同じくEcoR1およびSal Iを用い
て消化してプラスミドpENZ−３（mp19::GC155）を生産
する。mp19に関するさらなる背景については、ヤニシュ
ーペロンら、Gene,33,103〜119（1958）を参照するとよ
い。その後pENZ−３プラスミドを使用してイー・コリ株
JM109細胞を形質転換する。形質転換したJM109細胞を培
養して雑種ファージストックを与え、これよりスーパー
コイルDNAを単離する。その後制限酵素分析によりファ
ージストックにおいてpENZ−３を同定する。pENZ−３プ
ラスミドは、ポリリンカアニーリングにより逆方向に挿
入されたGC155断片が結果的に与えられる点においての
みもとのpENZ−１と異なる。
pENZ−２およびpENZ−３プラスミドをSal IおよびBal
IIを用いて消化し、その後一緒に連結して両方の挿入
物（GC155およびGC1657）を含有するプラスミドを生産
する。これをここではプラスミドpENZ−４と後記し、GC
155およびGC1657の両方を含有する断片をGC2B（ハッチ
（hatched）蛋白質）として記載する。
pENZ−５の作成 続けて第１図を参照して、ベクタmp19およびベクタtg
130（キーニイら、Gene,26,91（1983）を参照するとよ
い）をEcoR1およびBgl IIを用いて消化し、その後一緒
に連結してプラスミドpENZ−５を形成する。このように
生産したプラスミドを使用してJM109細胞を形質転換
し、前記したようにファージストックから制限酵素分析
によりpENZ−５を同定する。プラスミドpENZ−５はBamH
I部位に隣接するEcoR1部位を有する。同様に、これら
の２つのBamH1部位の間には、さらに制限部位Kpn I,Sma
I,Sac I,Sph I,Xba I並びにHind IIIが存在する。第２
図にこれをさらに詳細に示す。
pENZ−６の作成 調製を前記したpENZ−４については、GC155に加えGC1
657（GC2B）挿入物のそれぞれの末端にBamH1部位を有す
るのが望ましい。
従来これは挿入物の両方の末端に市販のリンカを導入
することにより達成されたが、利用可能な付加的な制限
部位を有するベクタを創製するのがより好適である。そ
れぞれの意図した挿入物についての他の酵素と和合する
リンカを付加するのに従来必要とされた付加操作を回避
してこれらの目的を達成するのが最も望ましい。この組
合せの利点は、前記したpENZ−４およびpENZ−５を組合
せてプラスミドpENZ−６を形成することにより可能とな
る。
よって、なお第１図を参照して、pENZ−４およびpENZ
−５をEcoR1を用いて消化し、その後一緒に連結してプ
ラスミドpENZ−６を形成する。このように生産したpENZ
−６を使用してJM109細胞を形質転換し、前記したよう
にファージストックからの制限酵素分析によって同定す
る。その結果得られN.gonorrhoeae挿入物GC2Bおよびそ
の制限地図の関連部分を含むpENZ−６をより詳細に第３
図に示す。
T7−T101::GC2Bの作成 背景として、この実験で使用するバクテリオファージ
T7−T101は、デュンら、前記した文献に記載されたバク
テリオファージT7の改変である。これは最初にダブリュ
・スツディル、ブルックハーベン国立研究所により調製
された。
主としてこれは、２つの断片が欠失したT7ファージで
ある。デュンら、前記した文献に記載された全T7DNA配
列の番号を参照して、欠失した２つの断片は塩基対836
〜3142（△1306）および11,293〜11,570（△28）であ
る。同様に、T7−T101は△1306欠失の端に挿入された小
さなリンカ配列を有する。このリンカ配列は２つのBamH
1部位に隣接するBgl II部位からなる。よって、T7−T10
1は、併せせてT7DNA配列の2,586 bpを失い、通常は宿
主制限系を克服するのに使用し得る遺伝子を欠損する。
このように、このファージは、イー・コリＢの制限マイ
ナス、修飾マイナス（r-m-）誘導体であるイー・コリ株
BL21中で生育される。
次に第４図を参照して、前記したように調製したpENZ
−６プラスミドおよびT7−T101バクテリオファージをEc
oR1を用いて消化し、これにより一緒に連結する。連結
の結果得られる生成物をクエムメルレら、バクテリオフ
ァージT7由来のUV 照射損傷DNAのインビトロパッケー
ジング、J.Virol.23,509〜516（1977）により記載され
た手順に従ってパッケージする。パッケージ反応の完遂
後、その結果得られる調製物を使用してイー・コリBL21
細胞を形質転換し、細胞を培養してプラークを単離す
る。個々のプラークからファージストックを作成し、DN
Aを単離し、制限酵素分析を行ってpENZ−６およびT101
配列のパッケージされた組合せであるT7−T101::GC2Bを
同定する。
なお第４図を参照して、pENZ−６由来のGC2B挿入物を
BamH1,EcoR1,Kpn I,Sac IまたはXba Iのいずれかを用い
る消化により切除し得る。前記したプロセスによりEcoR
1末端を有する挿入物をBamH I部位に置くことが可能と
なるが、T7−T101::GC2Bは、たとえ親T7−T101ベクタよ
りも有用な制限部位を有する。
したがって、GC2B挿入物を首尾よく使用してこれらの
付加的な制限部位をT7−T101に導入した。その結果得ら
れたT7−T101::GC2Bをその後使用して以下にさらに詳細
に説明するようにGC2Bにより導入されたポリリンカを有
するがGC155またはGC1657配列を有しない一般的に適用
可能なベクタを生産する。
ベクタT7−T102の作成 続けて第４図を参照して、GC2B挿入物をEcoR1消化に
よりT7−T101::GC2Bから除去する。その後GC2B挿入物を
除去したT7−T101::GC2BをDNAリガーゼで処理してなお
ポリリンカを保持しつつGC2B挿入物を有しないT7−T10
1::GC2Bの左および右部分を一緒に再連結する。連結の
結果得られる生成物をパッケージしてイー・コリBL21細
胞を形質転換するのに使用する。これらの形質転換細胞
を培養し、プラークを単離し、個々のプラークからファ
ージストックを作成する。DNAを単離し、制限酵素分析
を行ってGC2B挿入物を除去したT7−T101::GC2Bを同定す
る。以後これをベクタT7−T102とするが、これは、広範
囲の標的特異的DNA配列を挿入するのに有用である。ベ
クタT102の作成によりT7ゲノムに新しい制限酵素部位、
特にSac I,Sma I,EcoR1,BamH1,EcoR V,Pst I,Sph I並び
にHind IIIについての部位が導入されることに注意すべ
きである。
再吟味として、T7ゲノムの必ずしも全部のコード能力
が適切な状況下では生存能力に必要というわけではな
い。T7−T101およびT7−T102は、双方とも836〜3,142
（△1306）および11,293〜11,570（△28）の領域に及ぶ
T7ゲノムから除去された総計2,583bpの欠失を有するT7
ベクタである。したがって、約2.6Kbの外来DNAをこれら
のベクタに挿入し得るが、なお野生型T7ゲノムより全然
大きなものではない。同様の技術またはリンカを使用し
てT7または他の致死的ファージ内のBamH I部位または他
の都合の良い部位に他の部位を導入する。
T7誘導ベクタの能力の一層の増強 前記したものに加えて、以下に説明するT7−LG4のよ
うなある種の自然変異株において欠失が見出されたT7ゲ
ノムの他の領域が存在する。これらの欠失をT101または
T102と組合せて以下のようになお大きな能力を有するベ
クタを作成する。
最初の手順では、イー・コリBL21細胞をT7−T101::GC
2B、および2,034bpの全欠失についてT7マップ上で5845
〜7879bpの断片で欠失するT7の変異株であるT7−LG4に
共感染させて、３つの欠失すべてを有するベクタを結果
的に作成する。よってこれは野生型T7ゲノムから欠失す
る4,617bpを有する。驚くべきことに、これはその後結
果的に得られるベクタを首尾よくパッケージすることが
でき、これを以後T7−T104とする。注記したように、△
1306およびT7−LG4欠失は共に野生型T7ゲノムから4,3Kb
の欠失を結果的に与える。しかしながら、GC2B挿入物
（約1.7Kb）の存在は、結果的に野生型T7より約2,6Kbだ
け小さいT7−T104を与える。
次に、GC2B挿入物の存在がファージの生存能力に必要
かどうかの評価を行う。よって、T7−T101::GC2Bからの
T7−T102の作成で前記したものと同様の方法で、T7−T1
04DNAをEcoR1を用いて消化し、ポリリンカを維持しつつ
GC2B挿入物を除去する。続いて行う連結、パッケージン
グ並びに制限分析により、△1306およびLG4の欠失を特
徴としGC2B挿入物をも欠失する１つのベクタを同定す
る。そこでこれをT7−T105と呼ぶ。これにより、挿入配
列によって与えられた付加的量のDNAの存在はT7−T105
の生存能力に要求されないことが示される。
本発明によれば、前記したように調製したベクタを使
用して広範囲の配列を挿入し、複製させ、均一な形態で
回収することができる。この実施例によりGC2Bの使用を
示すが、使用することができかつ既に使用されもした他
のものには、Campylobacter jejuni由来の種特異的配列
が含まれる。
実施例 ３ 比較ハイブリダイゼーション検定 この実施例で説明する実験により、種を同定するDNA
プローブとして外来DNA断片を有する２つの組換えベク
タの使用を比較する。両方のベクタは、実施例２で記載
した挿入物GC2Bを含む。第１のベクタはpUC9である。第
２のベクタは、同様に実施例２に記載し同様にGC2B挿入
物を有するT7−△1306,△28である。
pUC9からG2CB挿入DNAを単離精製するのに使用する技
術は、マニアティスら、前記した文献に記載されたよう
なものであり、リゾチーム／フェノール抽出によりプラ
スミドDNAを単離し、CsClグラジエント浮遊密度遠心に
よりプラスミドDNAを精製し、２回目のCsCl遠心により
再精製し、EcoR1を用いる消化によりGC2B挿入物を除去
し、調製用アガロースゲル電気泳動によりpUC9ベクタか
らGC2B挿入物を分離精製し、続いて電気溶出によりアガ
ロースからCG2Bバンドを抽出することからなる。その後
この電気泳動精製工程を繰り返してラベルするGC2B挿入
DNAを与える。
GC2B挿入物はそのT7−△1306,△28ベクタから精製さ
れず、もとの場所に残留し、挿入物およびベクタDNA配
列の双方が一緒にラベルされる。
pUC9プラスミドベクタから誘導した精製GC2B挿入DN
A、T7−△1306,△28::GC2Bの両方をビオチンでラベルす
る。標的配列を伴うフィルタの調製並びに続くハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄工程の詳細は、実施例１に記
載されている。ビオチンラベルしたハイブリダイゼーシ
ョンの検出は、DETEK シグナル生成系（エンゾー・バ
イオケム社、ニューヨーク州、ニューヨーク）を用い添
付説明書に記載されているように行った。標的DNAをフ
ィルタ上にドットするDNAの量以外は実施例１に記載し
たのと同様の手順でドットした。この実験の結果を第２
表に示す。
これらのデータから、たとえ徹底的に精製したpUC9プ
ラスミド誘導GC2B挿入DNAを用いるとしてもイー・コリ
との広範な交叉反応性が存在するのに対し、T7−△130
6,△28::GC2Bベクタはイー・コリDNAと全く反応性を示
さないことを理解し得る。同時に、T7−△1306,△28::G
C2BベクタにおけるGC2B配列は、Neisseria gonorrhea D
NA（これよりGC2B配列が誘導された）をNeisseria meni
ngitidisから区別して認識し得るのになお完全に機能的
である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドベクタpENZ−3,pENZ−4,pENZ−５
並びにpENZ−６の調製について実施例２で説明する一連
の反応全体を示す。 第２図は、ベクタmp19およびtg130のポリリンカの融
合、その結果得られpENZ−５として同定されたプラスミ
ドベクタをさらに詳細に示す。 第３図は、pENZ−１からpENZ−５へのGC2B挿入物の転
移、その結果得られるプラスミドベクタpENZ−６をさら
に詳細に示す。 第４図は、pENZ−６およびT7−Δ1306,△28からのT7−
△1306,△28::GC2Bの作成並びにこれからGC2B断片を欠
失して形成するベクタT7−T102を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 上條 肇 (56)参考文献 国際公開87／2702（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 - 15/11 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中における標的核酸の存在を検出する
    試薬組成物であって、 （ａ）本質的に、 （ｉ）ベクタがT7ファージから誘導された核酸ベクタ、 （ii）前記標的の核酸と十分に相同的であり、実質的に
    標的配列のみとハイブリダイズし、混入物として試料中
    に存在し得る他の配列とはハイブリダイズしない核酸断
    片、および （iii）検出し得るシグナルの産生に必要でありかつ
    （ｉ）または（ii）の少なくとも１つと共有結合する少
    なくとも１つのラベル系 よりなる核酸、および （ｂ）前記ラベル系成分自身が検出し得ない場合に前記
    ラベル系の成分（iii）に結合し、前記ラベル成分が検
    出し得るようにする前記ラベル系の少なくとも１種の付
    加成分 からなることを特徴とする組成物。
  2. 【請求項２】前記核酸構築物が、 （ii）の核酸断片を（ｉ）のベクタ中に導入して前記核
    酸構築物を形成し、 複製され得る培地中にいて適する宿主中にて形成した構
    築物を複製させ、前記（ii）の核酸断片を導入したベク
    タの核酸と相補的なハイブリダイズし得るいずれかの核
    酸配列を除去し、 本質的に（ｉ）および（ii）よりなる核酸構築物を回収
    する工程 からなる方法により調製されることを特徴とする請求項
    １記載の組成物。
  3. 【請求項３】前記ベクタが病原性バクテリオファージで
    あり、方法が、ハイブリダイズし得なくなる程度まで核
    酸を分解するが、蛋白質を分解しない物質を溶菌後、し
    かしバクテリオファージの核酸をインタクトな状態とす
    るバクテリオファージコートからバクテリオファージの
    核酸が放出される前に導入する付加工程を更に含み、か
    つ前記バクテリオファージがインタクトな状態にするよ
    うにバクテリオファージの核酸を保護する蛋白質含有コ
    ートを有することを特徴とする請求項２記載の組成物。
  4. 【請求項４】前記ベクタが細菌細胞中で複製され、方法
    が前記細菌細胞の膜を破壊する付加工程を含むことを特
    徴とする請求項２記載の組成物。
  5. 【請求項５】ベクタが病原性バクテリオファージであ
    り、方法が、ハイブリダイズし得なくなる程度まで核酸
    を分解するが、蛋白質を分解しないヌクレアーゼを溶菌
    後、しかしバクテリオファージの核酸をインタクトな状
    態にするバクテリオファージコートからバクテリオファ
    ージの核酸が放出される前に導入する付加工程を含み、
    かつ前記バクテリオファージがインタクトな状態である
    ようにバクテリオファージの核酸を保護する蛋白質含有
    コートを有することを特徴とする請求項２記載の組成
    物。
  6. 【請求項６】前記保護コートが蛋白質、リポ蛋白質また
    はムコ蛋白質コートであることを特徴とする請求項５記
    載の組成物。
  7. 【請求項７】前記ヌクレアーゼがデオキシリボヌクレア
    ーゼまたはリボヌクレアーゼであることを特徴とする請
    求項５記載の組成物。
  8. 【請求項８】前記ヌクレアーゼがデオキシリボヌクレア
    ーゼおよびリボヌクレアーゼ双方を含む調製物であるこ
    とを特徴とする請求項７記載の組成物。
  9. 【請求項９】試料中における標的核酸の存在につき試料
    を分析する方法であって、方法が、 １） 前記試料を （ａ）本質的に、 （ｉ）ベクタがT7ファージから誘導された核酸ベクタ、 （ii）前記標的の核酸と十分に相同的であり、実質的に
    標的配列のみとハイブリダイズし、混入物として試料中
    に存在し得る他の配列とはハイブリダイズしない核酸断
    片、および （iii）検出し得るシグナルの産生に必要でありかつ
    （ｉ）または（ii）の少なくとも１つと共有結合する少
    なくとも１つのラベル系 よりなる核酸、および （ｂ）前記ラベル系成分自身が検出し得ない場合に前記
    ラベル系の成分（iii）に結合し、前記ラベル成分が検
    出し得るようにする前記ラベル系の少なくとも１種の付
    加成分 からなる試薬組成物とハイブリダイゼーションする条件
    下で接触させ、 ２）いずれかの検出し得る反応を観察する ことからなること特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】試薬組成物の核酸構築物が、 （ii）の核酸断片を（ｉ）のベクタ中に導入して前記核
    酸構築物を形成し、 複製され得る培地中において適する宿主中にて、形成し
    た構築物を複製させ、 前記（ii）の核酸断片を導入したベクタの核酸と相補的
    でハイブリダイズし 得るいずれかの核酸配列を除去し、 本質的に（ｉ）および（ii）よりなる核酸構築物を回収
    する工程 からなる方法により調製されることを特徴とする請求項
    ９記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記構築物が細菌細胞中で複製され、か
    つ方法が、前記細菌細胞の膜を溶菌後しかしファージDN
    Aをインタクトな状態にするファージコートからファー
    ジDNAが放出される前に破壊する付加工程を含むことを
    特徴とする請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】ハイブリダイズし得なくなる程度まで核
    酸を分解するが、蛋白質を分解しないヌクレアーゼを溶
    菌後、しかしバクテリオファージの核酸をインタクトで
    あるようにするバクテリオファージコートからバクテリ
    オファージの核酸が放出される前に導入する付加工程を
    含み、かつ前記核酸ベクタがインタクトな状態であるよ
    うにバクテリオファージの核酸を保護する蛋白質含有コ
    ートを有する病原性バクテリオファージであることを特
    徴とする請求項９記載の組成物。
  13. 【請求項１３】前記保護コートが蛋白質、リポ蛋白質ま
    たはムコ蛋白質コートであることを特徴とする請求項12
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記ヌクレアーゼがデオキシリボヌクレ
    アーゼまたはリボヌクレアーゼであることを特徴とする
    請求項12記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記ヌクレアーゼがデオキシリボヌクレ
    アーゼおよびリボヌクレアーゼ双方を含む調製物である
    ことを特徴とする請求項14記載の方法。
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US5217862A (en) * 1989-05-24 1993-06-08 Amoco Corporation Method for the detection of Neisseria gonorrhoeae

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8505027D0 (sv) * 1985-10-24 1985-10-24 Kabigen Ab A lytic virulent phage, a hostcell containing same and a process for protein production
US4900659A (en) * 1986-01-30 1990-02-13 Enzo Biochem, Inc. Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group

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