JP3355202B2 - ヘルペスプロテアーゼの製造と使用のための方法と組成 - Google Patents

ヘルペスプロテアーゼの製造と使用のための方法と組成

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】国立ガン研究所（ＣＡ４７４５
１）及び米国合衆国公共保健サービス、国立アレルギー
及び感染病研究所（ＡＩ１２４００９及びＡＩ１５８８
−１１）による認可にもとづく本発明に関し、政府は特
定の権利を保有するものとする。本発明は、ヘルペスプ
ロテアーゼの同定と精製及びこのようなプロテアーゼを
コードする核酸セグメントに関係している。本発明はま
たこれらのプロテアーゼの機能を阻害できる候補の物質
を選択する方法及びウイルス感染を検出し処置するこの
ような阻害剤の利用法に関するものである。
【０００２】ウイルス感染は重大な健康上の問題を起す ウイルス感染への処置と予防は、医学の重要な目標であ
る。ウイルス感染への処置と予防の開発方法に関する技
術水準を理解するために、感染ウイルスの構造と機能を
理解することが重要である。ウイルスは、一本鎖または
二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含む小さな遺伝要素で、２
つの異なった状態：細胞内と細胞外の間を交替すること
ができる。ウイルスは、それ自身では再生することが出
来ない真正細胞内寄生生物である。実際に、ウイルス
は、宿主細胞の生合成機能を引き継ぎ、ウイルスの合成
にそれを利用している。ウイルスＤＮＡのいくつかの蛋
白質産生物は、宿主細胞の代謝を停止する特殊な酵素ま
たは疎害因子であるが、大部分のウイルス−エンコード
蛋白質は新らしいウイルス粒子の構成に用いられる。蛋
白質の合成は、その複製とパッケージング；例えばキャ
プシド、のために必要な成分を生産するようにウイルス
によって方向づけられる。これらの成分はウイルスによ
って決められた順序に組立てられねばならず、若し彼等
が他の細胞を感染することになれば、新粒子は細胞から
脱出しなければならない。細胞内ウイルスの複製（溶菌
サイクル）の一般的な段階は次の通りである。
【０００３】 １． ウイルスの宿主細胞への付着（吸収）； ２． ウイルスまたはその核酸の宿主細胞への滲透； ３． ウイルス核酸の複製； ４． ウイルス蛋白質及びその他必要成分の産生； ５． ウイルス核酸及び蛋白質成分の組み立て；そして ６． 宿主細胞から成熟ビリオン粒子の放出 ウイルスは宿主の生命力を専有してしまうので、溶菌循
環の総合結果は、新らしいウイルス粒子と死んだ宿主細
胞である。ヘルペスによって生ずるある感染の型には、
宿主細胞にウイルスが生息する潜伏期間がある場合もあ
る。ウイルスの遺伝方式を明らかにすることがウイルス
感染と複製の機構を調査するための手がかりになり、単
にアカデミックな興味ではなくウイルスに起因する病気
の検出、予防そして処置へつなげられる。ウイルス感染
に対する宿主の抵抗は、ウイルスの宿主細胞への付着を
さまたげるためのウイルス受容部位の不在；彼等が宿主
細胞に侵入後のウイルス核酸の破壊、例えば宿主酵素に
よるウイルス核酸の切断により；本質的なウイルス蛋白
質合成阻害；あるいは宿主細胞中での彼等の蛋白質形成
後の破壊などによって起こすことが出来るだろう。自然
の抵抗力を補強する抗ウイルス薬品の発達は、人間に対
する多くのウイルス感染による破壊的影響を妨げる重要
な商業上の目的である。不幸にして、今日まで、利用で
きる処置はほとんどのウイルスの型に対して適切ではな
い。例えば、インターフェロンは細胞の抗ウイルス性の
低分子量の蛋白質で、ウイルスの増殖を阻止する。しか
しながら、インターフェロンは宿主特異性であり、ウイ
ルス特異性ではない傾向があり、すでに感染した宿主細
胞には効果がない。また、高濃度では毒性がある。
【０００４】抗ウイルス性薬品の目標は、ウイルスによ
り特に特異性のある酵素であろう。例えば、エイズの原
因であるＨＩＶ感染に関する攻撃の主目標は逆転写酵素
である。この酵素の阻害は、ウイルスの複製を妨害する
効果がある。不幸にして、これらの薬品、例えばＡＺ
Ｔ、に対する抵抗性の発達が、これらの処置を著るしく
制限している。現在、市場の抗−単純ヘルペスウイルス
薬品は、ウイルスＤＮＡを合成する酵素（例えばアシク
ロウイルス）に対抗する方向にある。これらの薬品に対
する抵抗性の出現のため、新らしい標的に対し、かなり
の関心が向けられている。ウイルス蛋白質の産生はウイ
ルスが攻撃される時期として特に興味がある。細胞外で
あるいは感染の状態で、ウイルスの基本構造は、蛋白質
によって包まれた核酸コアから出来ている（ヌクレオキ
ャプシド）。いくつかのウイルスはまた、ヌクレオキャ
プシドの外側に脂肪と蛋白質を含んだ外膜を備えてい
る。蛋白質の外被はキャプシドと呼ばれる。多くの異な
った蛋白質が、ウイルスによってきめられたキャプシド
を構成するだろう。あるウイルスは３〜１０蛋白質を、
また他のウイルスは２００以上もエンコードしている。
ウイルス粒子はビリオンと呼ばれる；彼等の役割りは、
複製された細胞から新しい宿主細胞に移動するウイルス
核酸を守ることにある。宿主細胞に移動後、ウイルスの
細胞内の状態が始まり、ウイルスの複製が可能になる。
多くの非ヘルペスウイルスが、医療介入の可能性がある
標的になるような切断座位特異性のプロテアーゼを発現
するように見える。しかしながら、これまで、処置や予
防法が極めて不適切な特に広範囲の感染剤であるヘルペ
スウイルスについて、このようなプロテアーゼは確認さ
れてこなかった。
【０００５】ヘルペス科 ヘルペスウイルス科には、多くの病気を引き起すために
臨床的に大きな興味のある動物ウイルスが含まれてい
る。エプスタイン−バールウイルスは、ガンの開始に関
係してきた；サイトメガロウイルスは、エイズ患者の最
大の伝染病の脅威である；そして水痘帯状庖疹ヘルペス
ウイルスは、水痘と帯状庖疹が健康上の重大な問題にな
っている世界のある地域では大きな関心事である。性的
に伝染する単純ヘルペス（ＨＳＶ）感染の世界的規模で
の発生の増加が、新生児ヘルペスの増加と共に過去１０
年間に生じた。活溌な潰瘍性病巣または無症候性分泌患
者との接触が感染剤の伝染を引き起こす結果になる。粘
膜の表面及びすりむけた皮膚でウイルスにさらされるこ
とによりウイルスが内部に浸入し、表皮及び真皮の細胞
内でウイルスの複製が始められるのが伝染である。臨床
的に明らかな病変に加えて、潜伏感染が、特に神経細胞
内で持続される場合がある。色々な刺戟がＨＳＶ感染の
復活の原因になるだろう。結果的に、これは根絶するの
が難かしい感染である。この病気は、処置方法が不適切
なため大部分調査されずにきてしまった。
【０００６】単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ） 単純ヘルペスウイルス亜型１及び２（ＨＳＶ−１、ＨＳ
Ｖ−２）は、人間が遭遇する最も普通の感染源である
（Ｃｏｒｅｙ及びＳｐｅａｒ，１９８６；Ｗｈｉｔｌｅ
ｙ，１９９０）。これらのウイルスは、比較的軽いもの
また回帰性単純口唇匐行疹のような不快な感染から、年
長の子供や大人の単純ヘルペス脳炎のような重大な生涯
脅威となる疾病あるいは新生児の播種性感染まで広範囲
な疾病の原因になっている。ヘルペス感染の臨床結果
は、早期の診断と抗ウイルス治療の迅速な開始に左右さ
れる。しかしながら、いくつかの治療の成功にも拘ら
ず、皮膚及び表皮の病変の再発や新生児のＨＳＶ感染ま
た脳の感染は、高い羅病率と死亡率に結びついている。
現在の可能な範囲よりもっと早期の診断が治療の成功度
を高めるだろう。それに加えて、改良された処置法が何
よりも必要である。外部からの補助手段が、特に化学物
質の形で感染細胞に与えられてきた。例えばヘルペスウ
イルス複製の化学的阻害剤が、５−フルオロデオキシウ
リジン（ＦＵＤＲ）、５−ヨードデオキシウリジン、チ
ミンアラビノシドその他のような各種のヌクレオシド類
似物によってもたらされてきた。実験動物モデルに対
し、多種特異性または単一特異性抗−ＨＳＶ抗体、ＨＳ
Ｖ感作リンパ球、また特異性ウイルス抗原に対するクロ
ーンＴ細胞により、いくつかの防禦手段が講じられてき
た（Ｃｏｒｅｙ及びＳｐｅａｒ，１９８６）。しかしな
がら、満足すべき処置法は見出されなかった。プロテア
ーゼは、ヘルペスウイルス内には確認されなかったが、
しかしヘルペスウイルス科に関するいくつかの生物学的
な知見がある。ヘルペスウイルスは、宿主細胞核内で複
製する二本鎖ＤＮＡウイルスである。ヘルペスビリオン
は、宿主細胞内で組み立てられる３０以上の異なった蛋
白質で構成される。約６−８はキャプシドに用いられ
る。ヘルペスウイルスにとって好ましい宿主細胞は脊椎
動物細胞である。
【０００７】単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ゲノ
ムは、豊富なキャプシド蛋白質複合体を指定し、それら
は成分蛋白質の分子量が異なるために変性ゲル中に多数
バンドを形成する。これらの蛋白質の予備的な同定が報
告されてきた。単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）
キャプシド蛋白質の１セットはＧｉｂｓｏｎ及びＲｏｉ
ｚｍａｎ（１９７２，１９７４）により報告された。遺
伝学的にまた免疫学的に関係のあるウイルス科キャプシ
ド蛋白質は、変性ゲル中の細胞移動バンドによって同定
され、感染細胞蛋白質３５（ＩＣＰ３５）と名付けられ
た（Ｂｒａｕｎｅｔ ａｌ．，１９８３，１９８４）。
少なくとも４つの主要なバンドと多くの微少なバンドが
１次元変性ポリアクリルアミドゲル中に、また多くのス
ポットが２次元ゲル中に報告された。Ｂｒａｕｎら（１
９８４）は、Ｈ７４５により例示されたモノクローナル
抗体のパネルを用いて、ＩＣＰ３５蛋白質が翻訳後、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル中の電気泳動移動度を異に
するすくなくとも６種類（ＩＣＰ３５ａ，ｂ，ｃ，ｄ，
ｅ，ｆ）にプロセスされることを報告した。異なった分
子量によって特徴づけられるけれども、ウイルスポリペ
プチドのこのグループは、同じモノクローナル抗体によ
って検出され、ＨＳＶ−１ゲノム中の領域によってコー
ドされる。からのキャプシドはこれらのポリペプチドを
含まない。ＩＣＰ３５に潜在的に類似した蛋白質のセッ
トはＰｒｅｓｔｏｎらにより報告された（１９８３）。
ヌクレオチドの配列化がＨＳＶ−１ゲノムについて行わ
れ、一般的には成功しないが、色々なキャプシド蛋白質
をゲノムの配列に相互に関連づける試みがなされた。例
えば、ＩＣＰ３５蛋白質は、ＵＬ２６を指定した読み取
り枠によりエンコードされることが提案された（ＭｃＧ
ｅｏｃｈ等，１９８８）。本発明において、この予報は
誤っており、あるいは少なくとも不完全であることが示
されている。ＩＣＰ３５をエンコードする領域の概略の
地図作製が、ＨＳＶ−１×ＨＳＶ−２の種類間の組換え
体の分析を基にしてＢｒａｕｎらにより企画された（１
９８４）。これらの研究者は、ＩＣＰ３５がチミジンキ
ナーゼ（ＵＬ２３）及びグリコプロテインＢ（ＵＬ２
７）を特定化する遺伝子間に位置する領域によりエンコ
ードされることを提案した。これは、現在、４つの遺伝
子を含むことが知られている領域をカバーしているた
め、特異的な予報ではない。
【０００８】本発明は、治療用の新らしいウイルス標的
の探索に成功した結果によるものである。調査は、基質
としてＨＳＶ−１ ＩＣＰ３５蛋白質科を選ぶことによ
って開始された。特にヘルペスウイルス感染に適用され
るように、抗ウイルス化学療法のための標的プロテアー
ゼは、この方式で同定された。プロテアーゼの製造及び
検出方法、プロテアーゼの阻害剤選択の方法は、プロテ
アーゼの阻害を基にした処置計画の探査と同様にまた本
発明の一局面である。ＨＳＶ−１のヘルペスプロテアー
ゼの遺伝子と人間のサイトメガロウイルスのそれとの間
の類似性の発見は、本発明が、ＨＳＶ，ＣＭＶ，ＥＢＶ
及びＶＺＶを含めてすべてのヘルペスウイルスに対し広
く応用され得ることを示すものである。
【０００９】本発明は、ウイルス感染への処置と予防上
の方法と組成の開発のため、ウイルスプロテアーゼの同
定、精製及び操作に関係している。本発明のプロテアー
ゼは、このプロテアーゼの範疇の期待される特性を備え
たセリンプロテアーゼにさらに範囲が限定されるだろ
う。セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解に
触媒として作用する酵素であり、また、活性部位に典型
的なセリン残基をもっている（Ｗｈｉｔｅ，Ｈａｎｄｌ
ｅｒ及びＳｍｉｔｈ，１９７３）。セリンプロテアーゼ
はまた一般に、触媒三つ組残基の配列を含み、アミノ酸
の直線配列内でお互いにいくらか離れているが、適切に
折りたためられたプロテアーゼ内で“蛋白質分解裂”と
して束ねられている。プロテアーゼからプロテアーゼへ
のこの触媒三つ組残基には、色々な相違点が観察され
た。例えば、トリプシンとズブチリシンセリンプロテア
ーゼは共に、Ａｓｐ，Ｈｉｓ，及びＳｅｒが触媒三つ組
のアミノ酸である。しかしながら、トリプシン様セリン
プロテアーゼでは、それらはＨｉｓ，Ａｓｐ，Ｓｅｒに
配列されるのに対し、ズブチリシン様プロテアーゼは、
Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒに配列される。これらのかぎ残
基の相対的な面間隔もまた異なっている。それに加え
て、これらのプロテアーゼには、それらをセリンプロテ
アーゼとして同定されるようにして結果的には分類され
る別の進化的に保護された特徴がみられる。触媒的に重
要なＡｓｐ，Ｈｉｓ及びＳｅｒ残基の存在は、しかしな
がら、セリンプロテアーゼ内の一員であることと分類の
ためには、決定的な試験である。本発明のプロテアーゼ
は、ウイルスのキャプシドの成長上必須であるように見
える。従って、プロテアーゼ作用の阻害は、ウイルスの
溶菌循環を崩壊に導くだろう。明らかに、このようなプ
ロテアーゼは、抗ウイルス治療のための最適の標的であ
る。特に、この標的は、これまで如何なるプロテアーゼ
も報告されなかったヘルペスウイルスに対する攻撃のた
めに有用である。本発明は、さらに特に、ヘルペスセリ
ンプロテアーゼの同定、精製及び操作そしてヘルペス感
染を検出し処置するためのプロテアーゼ阻害剤の使用に
関するものである。
【００１０】具体例で明らかにされているように、プロ
テアーゼは、単純ヘルペスウイルスの亜型、ＨＳＶ−１
から精製された。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドＰＡＧＥ
ゲル電気泳動法で測定されたこのプロテアーゼの見かけ
の分子量はおよそ７５−８５ｋｄ、一般的には約８０ｋ
ｄである。ヘルペスプロテアーゼはさらに、およそ４５
０−６３５アミノ酸のアミノ酸配列をもつものとして特
徴づけられる。しかしながら、これらの範囲は流動的で
ある。例えば、６３５アミノ酸配列は、そのカルボキシ
ル末端から離れてまだセリンプロテアーゼの活性を保持
する少なくとも３２９アミノ酸を持つだろう。６３５ア
ミノ酸の具体例で、プロテアーゼ切断部位は、カルボキ
シル末端から約１８−２５アミノ酸、好ましくはカルボ
キシル末端から約２０アミノ酸の位置に設けられてい
る。プロテアーゼは、ＨＳＶ−１及び２を注射した細胞
から、またプロテアーゼをエンコードするＤＮＡ配列に
よりトランスフェクトされた細胞から、あるいは例えば
ウサギの網状赤血球溶解質を用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏま
たは細胞フリー系で合成されることにより精製された形
で得られる。蛋白質の合成後、蛋白質は変性ゲル上に単
一バンドとして移動し、３５Ｓ標識メチオニンで容易に
検出される。蛋白質合成の約５時間後、２つのバンドが
生ずるだろう。次項で示されるように、第２のバンド
は、第１バンドの自己切断産物である。
【００１１】このプロテアーゼの特質は次のものを含む
ことである：（ｉ）それは４つの領域をもち、それらの
いくつかは触媒的活性を必要としないそして（ｉｉ）そ
の活性部位はプロテアーゼのアミノ末端の近くである。
アミノ酸置換、欠失、停止コドンまたは２０アミノ酸範
囲のプロテアーゼ中ヘの挿入を含む突然変異により、遺
伝子のアミノ及びカルボキシルドメインにおける非必須
ドメインＮｏ．Ｉ及びＮｏ．ＩＶの輪郭が画かれた。Ｎ
ｏ．ＩＩＩの必須のカルボキシル−近接ドメインは、Ｎ
ｏ．ＩＩの必須のアミノ近接ドメインから少なくとも２
０アミノ酸は隔てられており、プロテアーゼは機能を果
すだろう。アミノ近接ドメインは、水痘帯状庖疹ヘルペ
スウイルス及びＵＬ２６のヒトサイトメガロウイルス相
同体の中で最も保護されたドメインである。このドメイ
ンで検査された、保護アスパラギン酸、ヒスチジン、あ
るいはセリンアミノ酸コドンの中で、ヒスチジン残基６
１と１４８のみがプロテアーゼの蛋白質分解活性の損傷
なしに取り替えることが出来なかった。３次元結晶構造
分析により、活性部位の構造についてさらに洞察が加え
られるだろう（Ｓｋａｌｋａ，１９８９）。
【００１２】本発明はまた、ここに述べるヘルペスプロ
テアーゼをコードする能力がある核酸セグメントに関す
るものである。具体的な実施例の中で、ＨＳＶ−１ゲノ
ム内での広範囲な核酸配列の操作からウイルスの機構の
秘密が解かれ有用な核酸セグメントの分離と、精製及び
それらの発現産生物が可能になった。このような操作の
例には、遺伝領域の作用と相互作用、それらの発現産生
物及び発現の制御機構を調べるために、適当なプロモー
ター及びトレーサーを用いて、選択した核酸配列セグメ
ントをプラスミド内に結合させる操作が含まれる。これ
らの特別に指定したプラスミドは、本発明の一局面であ
る。本発明の別の局面は、ＩＣＰ３５と名づけられた単
純ヘルペスウイルス１キャプシド蛋白質科の核酸セグメ
ント内のコーディングドメインである。この新らしく限
定されたコーディング領域は、ＵＬ２６．５と名づけら
れた。ＩＣＰ３５蛋白質に関するコーディング配列の具
体的な実例で、セグメントは、制限エンドヌクレアーゼ
切断部位Ｈｐａ−１及びＰｓｔ−１により境界が定めら
れた。これら２つの切断部位は地図上の位置＋８３２及
び＋２７６１に位置している。これらの地図位置は、Ｈ
ＳＶ−１ゲノム中でＵＬ２６読み取り枠の転写開始部位
からの距離によって定められる。この位置は、＋１と名
づけられた。ＩＣＰ３５蛋白質をコードする遺伝子はま
た、地図位置が＋２１０４であるＫｐｎＩ部位から下流
で、位置＋２１３８にあるポリＡ部位まで、ずっと続く
これらの配列から成っている。
【００１３】本発明の核酸セグメントは、さらにプロテ
アーゼとＩＣＰ３５蛋白質のための重複した読み取り枠
をもつものとして限定される（図２）。これらの重複し
たセグメントは“３′−共末端”である。２つの中長い
方の、第１セグメントは、第１蛋白質をコードする。こ
の第１蛋白質は、およそ７５−８５ｋｄの分子量をもっ
ている。第２の読み取り枠、２つの重複している読み取
り枠の小さい方の配列は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による測定でみかけ上およそ４０−５５ｋ
ｄ、むしろ４５ｋｄの分子量をもつ第２蛋白質をエンコ
ードする。第１蛋白質は、セリンプロテアーゼの作用に
従ってアミノ酸配列を切断する能力をもつ蛋白質分解モ
ジュールをエンコードするよう定められている。切断さ
れる可能性のある基質は、ＵＬ２６遺伝子によりエンコ
ードされるプロテアーゼ配列それ自身かあるいは１次元
及び２次元ゲル中における移動に基づいて以前にＩＣＤ
３５ｃ，ｄと名づけられたＩＣＰ３５前駆体蛋白質であ
ろう。２０アミノ酸エピトープの挿入は切断を妨げな
い。第２蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの核酸
セグメントは、ＨＳＶ−１具体例でおよそ９９０の塩基
対を含んでいる。ある適用では、エンコードされるセグ
メントは、切断によりＩＣＰ３５ｅ及びｆを生ずる配列
だけを含む必要がある。他の適用では、例えば後に述べ
る候補の阻止剤の分析では、Ｓｅ当りの切断部位だけが
エンコードされることが望まれるだろう。具体的な例で
は、核酸セグメントは、本質的には、本明細書の図１，
ライン５に説明されるようなセグメント、あるいはその
機能が同等なものを含んでいる。
【００１４】ここで用いられたように、機能的同等性
は、ある構造的な変化がなされたが、それにも拘らず、
ＩＣＰ３５を切断する能力のある触媒的な活性プロテア
ーゼであるか、またはプロテアーゼをエンコードする、
酵素とそれらのエンコードする核酸配列に関することを
意味している。蛋白質の構造に修正や変化が行われ、そ
れにもかかわらず同様の、あるいはそれ以外の望ましい
特徴をもった分子が得られることは、技術上一般的に知
られている。かくして、あるアミノ酸は、例えば基質分
子または特異的な抗体との相互に作用する結合能力をそ
れ程ロスすることなく蛋白質構造内で他のアミノ酸に置
換される場合がある。蛋白質の生物学的機能活性を定め
るのは蛋白質の相互作用の能力と性質であるため、ある
アミノ酸配列の置換は蛋白質配列（あるいは勿論その基
本のＤＮＡコーディング配列）の中でなされることがで
き、それにも拘らず同様の特性を備えた蛋白質を得るこ
とができる。これらのことから、ヘルペスプロテアーゼ
ＤＮＡあるいは蛋白質配列の中で、それらの生物学的な
効用や活性をそれ程そこなうことなく様々な変化を生ぜ
しめる可能性が考えられる。このような変化を作る上
で、アミノ酸の水治療法の指数が考慮されよう。水治療
アミノ酸の指数、すなわち蛋白質における相互に作用す
る生物学的機能を論ずる場合の疎水性と電荷特性の重要
性は、技術分野では一般に理解されている（Ｋｙｔｅ
ｅｔ ａｌ．，１９８２）。例えばあるアミノ酸は、同
等の水治療法の指数または点数、例えば通常＋／−１、
をもつ他のアミノ酸と置換でき、なお同様の生物学的活
性を保つことが知られている。アミノ酸の相対的な水治
療法の性質は、結果的に生じる蛋白質の二次構造を決定
し、それが今度は、基質分子をもつ蛋白質の相互作用を
規定するものと思われる。そこで例えば、水治療法の指
数＋４．５のイソロイシンは、バリン（＋４．２）ある
いはロイシン（＋３．８）と置換することができ、なお
同様の生物学的活性が得られることが提案される。一
方、スケールの反対側で、リシン（−３．９）はアルギ
ニン（−４．５）と置換しうることなどが提案される。
【００１５】アミノ酸置換は、そのため一般的には、側
鎖置換基の相対的な類似性、例えば、大きさ、求電子性
の性質、電荷その他に基づいている。上記の色々な特性
値を考慮に入れた典型的な置換は、熟練技術者にはよく
知られており、例えば：アラニン、グリシン及びセリ
ン；アルギニンとリジン；グルタメートとアスパルテー
ト；セリンとスレオニン；及びバリン、ロイシン及びイ
ソロイシンが含まれる。本発明の核酸配列はまた、同様
に数多くの適用性をもつハイブリッド形成プローブとし
て有用である。ハイブリッド形成プローブは、例えば、
蛋白質のエンコード能力に適用する（あるいは加える）
ようなハイブリッド形成を含む多くの応用の中の２、３
の例をあげると、アンチセンス分子（例えば安定したア
ンチセンスＲＮＡ分子）の製造で、ライブラリーから変
異体遺伝子クローンを選択するためにＰＣＲプライマー
及びプローブとして用いられるだろう。勿論、有用なハ
イブリッド形成プローブとして、意図された適用とハイ
ブリッド形成の條件次第で、実際にどのような長さでも
作られるだろう。例えば、長さで１０から１４ヌクレオ
チド程小さなプローブも、それにも拘らず、ハイブリッ
ド形成の条件がプローブと鋳型の間の配列相同の程度に
関して適当でありさえすれば、鋳型分子によって安定し
たハイブリッドを形成することが期待される。同様に、
遺伝子をエンコードするのに十分なまでの長さの範囲の
分子あるいは同義遺伝子であっても、ハイブリッド形成
プローブとして用いられるだろう。いずれにせよ、好ま
しい具体例として、ハイブリッド形成プローブまたはプ
ライマーとして有用な核酸分子は、意図された適用とハ
イブリッド形成の條件次第で、大きさは例えば１０−１
４から２０、３０、４０または５０またはその程度のヌ
クレオチド、長さで１００、２００、５００または１０
００または２０００ヌクレオチドまでも及ぶだろう。
【００１６】かくして、発明に従って核酸セグメントは
図１に示されたものよりも、より小さなまたは大きな配
列を含むだろう。例えば、緊縮條件下で、図１の核酸セ
グメントにハイブリッド形成する能力があるのはおよそ
１４ヌクレオチド塩基対の長さの領域に相当するだろ
う。このような小さなセグメントは、プロテアーゼコー
ディング領域の存在を検出するためのプローブとして用
いられるだろう。核酸セグメントはまた、プロテアーゼ
またはＩＣＰ３５蛋白質のためのｍＲＮＡ配列になるだ
ろう。後者のためのｍＲＮＡは、およそヌクレオチドの
位置＋１０００（＋１と称されるヘルペスＵＬ２６転写
開始部位からの距離の呼称）から位置＋２１３８で転写
される。ｍＲＮＡは、＋１０９９に位置するメチオニン
開始コドンから翻訳される。もっと小さなまたは大きな
セグメントはまたセグメントが用いられる使用法に従っ
て考慮される。これらのｍＲＮＡセグメントは、ＩＣＰ
３５切断部位を合成するために有用である。ヘルペスゲ
ノム内の色々な核酸セグメントが分離され、クローンさ
れた。ヘルペスプロテアーゼをコードする核酸セグメン
トは、ＵＬ２６ヘルペス読み取り枠の地図位置に相当す
る領域からのヘルペスゲノムから得られるだろう。プロ
テアーゼのコーディングセグメント内に含まれるもっと
小さなセグメントは、チミジンキナーゼ遺伝子とグリコ
プロテインｇＢ遺伝子の間に位置し、位置＋８３２から
＋２１３８までのＤＮＡ配列を含んでいる。このコーデ
ィング配列は、ＩＣＰ３５ヘルペスキャプシド科蛋白質
として発現されるのみならずＩＣＰ３５コーディング配
列を調節するためのプロモーター配列を含んでいる。
【００１７】ＩＣＰ３５プロモーターが分離され、非常
に活溌なプロモーターであることが示された。これは、
より長いＵＬ２６読み取り枠からのプロテアーゼの産生
に比較して、ＩＣＰ３５がエンコードする単位によって
増加した多くの基質のコピーが生産された観察から立証
される。ＵＬ２６の第１の読み取り枠には、１３５と１
６８塩基対と位置＋８３２と＋１０００の間の地図が含
まれる。このプロモーター領域は、ＩＣＰ３５蛋白質の
発現を開始する能力がある。それはまた、他の核酸配
列、例えば単純ヘルペス遺伝子ＵＳ５及びＵＬ１０の増
加した割合での発現を促進するのに有効である。ＩＣＰ
３５蛋白質のためのコーディング配列の分離と操作は、
これらの蛋白質がヘルペスウイルスキャプシドの組み立
てに用いられることから、本発明の重要な業績であっ
た。キャプシドの機能的構成要素になるため、ＩＣＰ３
５蛋白質前駆体のＩＣＰ３５ｃ，ｄは、ｅ及びｆを産生
するよう、ＵＬ２６コーディング配列によって作られる
ヘルペスプロテアーゼで切断されなければならない。こ
のプロテアーゼは、プロテアーゼと前駆体をエンコード
する両方の遺伝子がトランスの位置にあってさえ、前駆
体蛋白質の切断に影響を及ぼす能力がある。コーディン
グ配列を持つ本発明の核酸セグメントは、エンコードさ
れたウイルスセリンプロテアーゼを発現する能力のある
組換え発現ベクターに運ばれるだろう。このような核酸
セグメントの例は、ヘルペスウイルス、ＨＳＶ−１につ
いて、本明細書の図１Ａに、Ａ−Ｚ、ＡＡ−ＮＮとして
示されている。これらの核酸セグメントまたはそれらの
機能的な同等物は、任意に、終止部位、ポリ−Ａ付加部
位のような他要素、また適切なその他の要素（例えば、
プラスミドＡ−Ｚ、ＡＡ−ＮＮ参照）に加えて、選択さ
れたプロモーター及び／または調整要素に実用的に結び
つけられるだろう。これらの成分には、ヘルペスα４、
ＩＣＰ３５遺伝子を調整する能力をもつようなプロモー
ター、あるいは事実上、選択した宿主細胞内に発現を促
進する能力をもったどのプロモーターも含まれる。組換
え発現ベクターは、真核または原核プロモーターのどち
らかをプロモーターとして含むだろう。そして、カルボ
キシル末端アミノ酸の３′位置にポリアデニレーション
シグナルを含むだろう。プロモーターは、エンコードさ
れた蛋白質の転写単位内にあるだろう。ベクターはま
た、ここに紹介される分析に用いられたマーカーを含む
だろう。宿主細胞の例は、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ、Ｅ．
ｃｏｌｉまたは、本発明に従って、移動したベクターに
発現させ得る、熟練技術者にはよく知られている他の真
核または原核細胞である。
【００１８】本発明はさらに、ヘルペスプロテアーゼを
製造する方法に関係している。このような方法の具体例
には次のステップが含まれる。 （１） ヘルペスプロテアーゼをエンコードする核酸セ
グメントを製造すること；そして （２） 蛋白質を作るためにセグメントに発現させるこ
と。具体的な実例の中で、プロテアーゼを作る方法には
核酸セグメントを内部に移動する宿主細胞の利用が含ま
れる。宿主細胞は発現に適当な條件の下で培養され、蛋
白質はそれによって発現される。方法にはまた、熟練技
術者には良く知られているような方法で、蛋白質が分離
され、精製される工程が含まれる。要求される精製の程
度は、計画されている蛋白質の利用如何によっている。
一方、核酸セグメントは例えばウサギの網状赤血球溶解
質のような細胞フリーのシステムで発現され、あるい
は、ここの文献にあるような自動蛋白質合成器で合成さ
れるだろう。ヘルペスプロテアーゼまたはＩＣＰ３５蛋
白質をコードする核酸セグメントは、ヘルペスに感染す
る細胞からウイルスゲノムＤＮＡを得、興味のある核酸
の中で、核酸配列領域を含む蛋白質分解部位を増幅し、
このように増幅された核酸配列を含む組換えクローンを
作ることによって求められるだろう。クローンは、すく
なくともプロテアーゼの蛋白質分解ドメインをコードす
る領域あるいはこのようなクローンをスクリーンするＩ
ＣＰ３５蛋白質の切断部位を指向するモノクローナル抗
体を用いることによって、望みの増幅核酸セグメントを
含むクローンが選択されるだろう。この技術の熟練者に
はよく知られている、その他のクローニング及びクロー
ンスクリーニング技術もまた有効である（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。本発明はまた、切断
に効果的な條件の下でプロテアーゼによって分子を処理
するステップを含めたヘルペス分子の切断の方法に関係
するものである。このような條件は、セリンプロテアー
ゼが一般的に機能するような條件である。
【００１９】具体的な例示で、組織試料の中のヘルペス
プロテアーゼを検出する方法は、プロテアーゼに対抗す
る抗体を作り、これらの抗体を標識し、標識した抗体を
組織試料に接触させ、熟練技術者にはよく知られている
標準方法で異種結合した標識抗体蛋白質を検出すること
からなる。これらの標識は、蛍光標識かまたは放射能標
識である。生物学的試料中の核酸セグメントを検出する
方法の１つは、実際的には、図１のライン５または６に
示されるように、あるいはヘルペスプロテアーゼまたは
ＩＣＰ３５蛋白質のコーディングで、この明細書の他の
場所で明らかにしているように、核酸セグメントにハイ
ブリッド形成する能力があるヌクレオチドプローブを作
ることである。ヌクレオチドプローブは標識されるだろ
う。次にプローブは、特定のハイブリッドの形成に適当
な選ばれた條件の下で、試験される生物学的試料と共に
培養される。プローブと生物学的試料の核酸との間に形
成された特定のハイブリッドは次に、熟練技術者には公
知の色々な方法、例えばプローブの放射活性標識の検出
のような方法で検出される。このようなハイブリッドの
形成は、当初に求められた核酸セグメントの存在を暗示
するものである。ウイルス感染の処置方法は、ウイルス
生活環に不可欠の、ここに開示する標的プロテアーゼを
利用する。このような方法の例は、プロテアーゼの阻害
剤の有効量を作ることからなる。量は処置の方式に依存
するだろう。方式は、局所クリーム、軟膏あるいは直接
皮膚に施用するスプレー、あるいは全身感染に対する静
脈注射であってもよい。阻害剤は、適用方式によって、
人に用いるのに適した薬物学的に許容できる担体と併用
するようにもくろまれる。最終的に；阻害剤の治療用の
量は、ヘルペスウイルスそれ自体は再生産が阻害される
が、宿主細胞は破壊されないように決められる。ここに
開示する処置方法は、特に単純ヘルペスウイルス亜型１
または２に適用できるがしかし、一般的には、広範囲な
ＤＮＡ相同関係をもつことが知られているヘルペス科メ
ンバーに適用できるだろう。他の有機体、例えばサイト
メガロウイルス（ＵＬ８０），水痘帯状疱診ヘルペスウ
イルス（ＯＲＦ３０），エプスタイン・バールウイル
ス、におけるＨＳＶ−１ ＵＬ２６への広範な配列相同
の理由で、これらの処置戦略は広く、すべてのヘルスウ
イルスへ適用が可能でありそうである。
【００２０】この阻害は、転写、翻訳または蛋白質作用
のレベルのどれであってもよい。転写による妨害は、Ｄ
ＮＡ鋳型におけるｍＲＮＡ形成による妨害を必要とする
だろう。翻訳による妨害は、ｍＲＮＡ鋳型における蛋白
質の合成による妨害を必要とするだろう。一方、プロテ
アーゼそれ自体の作用は、プロテアーゼの構造、特にそ
の基質の切断部位を変えて、その蛋白質分解ドメインを
破壊するか、あるいはプロテアーゼを不活性化する偽基
質の供与によって崩壊されるだろう。阻害の別の形態と
しては、ヘルペスプロテアーゼのコーディング配列によ
るハイブリッド形成の能力はあるが、プロテアーゼが翻
訳されるべきｍＲＮＡ転写を阻害するハイブリッドを形
成するような核酸セグメントから成る。本発明の目的に
適当であるように思われるいくつかの阻害剤がある。Ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏの分析で、キモスタチンとイソプロピル
フルオロ燐酸塩がプロテアーゼに１００％の阻害を与え
ることが発見された。フエニルメタンスルホニルフルオ
ライドは、すくなくとも５０％阻害を与え、この減少
は、阻害剤の経時的な不安定性によるものである。色々
なプロテアーゼ阻害剤による試験の結果、ＵＬ２６プロ
テアーゼは、セリンプロテアーゼ阻害剤によって阻害さ
れたがしかし、システィン、アスパラギン酸あるいはメ
タロプロテアーゼ阻害剤によっては阻害されないことが
示された。これら以外に考えられた阻害剤には、アンチ
ペイン、アプロチニン、ロイペプチン、（４−アミノ−
フエニル）−メタンスルホニルフルオライド、そしてこ
こに開示する候補スクリーニング分析において陽性度を
検査するセリンプロテアーゼ阻害剤のすべてが含まれ
る。特別な具体例で、ここに開示された阻害剤の非毒性
の誘導体が考察されている。
【００２１】さらにその他の阻害剤を決めるため、ウイ
ルスプロテアーゼを作り、候補の阻害物質とプロテアー
ゼを結合させ、さらに、プロテアーゼによって切断され
る可能性のある基質を選ぶことにより、興味のある候補
物質がスクリーンされる。分析は、基質と、プロテアー
ゼ候補物質結合物を接触させ、候補物質が基質に対する
プロテアーゼの作用を妨害したかどうかを決定する方法
で行われている。具体的な例証の中で、候補物質のため
の検査の用いられるウイルスプロテアーゼは、本明細書
に開示される方法によれば、ウサギの網状赤血球溶解質
でｉｎｖｉｔｒｏで合成され、精製されたヘルペスプロ
テアーゼである。プロテアーゼは、実験室内のｉｎ ｖ
ｉｔｒｏの分析か、または試験組織内で、候補阻害物質
と結合される。プロテアーゼにより切断される可能性の
ある選ばれた基質は、プロテアーゼそれ自体か、また少
なくとも、ＩＣＰ３５蛋白質前駆体ｃ，ｄの切断部位で
あろう。基質を、プロテアーゼ及び候補阻害物質と接触
させた後、基質が切断されたかどうかを測定することに
より、その物質が基質に対するプロテアーゼの作用を阻
害したか否かを決めることができる。１つの具体例とし
て、ＩＣＰ３５ｃ，ｄ蛋白質が、プロテアーゼによる
ｃ，ｄの切断によってのみ形成されるＩＣＰ３５サブユ
ニットのｅ及びｆが産生したかどうかをＳＰＳゲル電気
泳法によって調べることにより決められるだろう。若し
も蛋白質が切断されなかったならば、候補物質は、本当
にウイルスプロテアーゼを阻害すると推論される。この
阻害剤は、そこで医療試験に用いられるだろう。候補阻
害物質分析に用いられるウイルスプロテアーゼは、例え
ば、発現ベクターが少なくともプロテアーゼの蛋白質分
解のモジュールを含む、遺伝子組換え技術の適用によっ
て作ることができるだろう。発現ベクターは次に、コー
ディング配列を発現させる條件の下で、適当な宿主細胞
に移動される。配列が、プロテアーゼまたはプロテアー
ゼセグメントの形で発現された後、細胞からプロテアー
ゼが集められるだろうし、若し必要ならば、熟練者には
公知の方法でさらに精製される。
【００２２】ヘルペスプロテアーゼを作る別の方法は、
プロテアーゼを含む試料、例えば、ヘルペス感染組織セ
グメントまたは滲出液を得ることである。試料は、それ
から均一にして、分別されてプロテアーゼ留分を得る。
プロテアーゼ留分は、それからさらに、特殊な用途に応
じて、熟練技術者による公知の方法で分離、精製され
る。本発明はまた、異なったヘルペス種属、その他の非
ヘルペスウイルス、あるいは、実際にはどんな有機体で
も、ここに開示されたものと同等の機能をもったセリン
プロテアーゼを選択する方法に関係している。プロテア
アーゼ選択のため、少なくとも本明細書に開示されたプ
ロテアーゼの切断部位を含むアミノ酸配列が作成され
る。それから、候補のウイルスプロテアーゼは、ウイル
スセリンプロテアーゼにより切断されやすいアミノ酸配
列を含む切断部位と接触させられる。最終的に、ＩＣＰ
３５基質を用い、ＩＣＰ３５ｃ，ｄがｅ及びｆに変った
かどうかを測定することによって、切断が生じたかどう
かの決定がなされる。こられの方法によって、ＨＳＶ−
２プロテアーゼが、ＩＣＰ３５ｃ，ｄをｅ及びｆに切断
する能力のあることが示された。
【００２３】本発明の方法と組成物は、他の種属の中の
必要なセリンプロテアーゼを同定することを可能にし
た。本発明の方法は、ソースのゲノムが変化する場合に
のみ、一般的には利用できる。これらのセリンプロテア
ーゼは、保護セグメントによってエンコードされ、広く
行き渡ることが期待される。ヘルペスウイルスとして、
６つのウイルスＤＮＡ配列の中の４つの（ＨＳＶ−１，
ＥＳＶ，ＶＺＶ，ＣＭＶ）が報告され、熟練技術者に利
用されるコンピューターデータベースに組み込まれた。
アミノ酸配列と機能の相同関係は、セリンプロテアーゼ
の保護的性質と、以前に例えばヘルペス科のような関連
した種属の中に相同関係が検出されたことに基づいて期
待される（Ｄａｖｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；
ＭｃＧｅｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。かくし
て、ＨＳＶ−１のＵＬ２６，ＥＢＶのＢＶＲＦ２，ＣＭ
ＶのＵＬ８０、ＶＺＶの遺伝子３３は、キャプシドの成
熟に同じまたは類似の役割を果し、プロテアーゼをエン
コードすることが予言できる。これらの推定に基づくプ
ロテアーゼとＨＳＶ−１ ＵＬ２６の間に広範な相同関
係が見出されたので、これらのプロテアーゼの作用また
は切断の機構は、ＨＳＶ−１ ＵＬ２６と同じであると
信じられる。かくして、開示した阻害剤を含む本発明が
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２）に
対抗するものをもち、他のヘルペスウイルス（ＥＢＶ，
ＶＺＶ，ＣＭＶ及びヒトヘルペスウイルス６）の処置に
利用することができるのは驚くべきことではない。
【００２４】本発明のセリンプロテアーゼが、ヘルペス
科に限定されるものではないだろうということを示唆す
るものとして、他の病源菌内にキャプシドのアッセンブ
リの報告がある。バクテリオファージＴ４及びラムダ
は、キャプシドアッセンブリとして最も普通に研究され
ている。これらのファージの中で、最初、予備形成キャ
プシドが、外部のコート蛋白質と内部の骨核蛋白質の相
互作用によって、寄せあつめられる。それから、骨核蛋
白質は、ファージ−エンコードプロテアーゼによて切断
されてキャプシドから取り除かれる。同時に、ファージ
ＤＮＡはキャプシド内にパッケージされ、キャプシドを
成熟させるようになる。骨核蛋白質の切断は、成熟した
キャプシドを産生するために不可欠である。最近、ＨＳ
Ｖとラムダファージの間のキャプシド構造の類似性が、
低温電子顕微鏡によって明らかにされた。ヒトＣＭＶ株
ＡＤ１６９の配列が決定され、また、ＨＳＶ ＵＬ２６
と類似した遺伝子が同定された。ＩＣＰ３５は、ＨＳＶ
キャプシド成熟の過程で、骨核またはアッセンブリ蛋白
質として機能することが提案された。本発明のプロテア
ーゼによるＩＣＰ３５の切断は、キャプシド成熟のため
に必要であり、ウイルスの複製のために不可欠である。
ここに開示するプロテアーゼは、ＤＮＡパッケージング
を開始するためにＩＣＰ３５蛋白質を切断するこれらの
ファージに対応する部分としての機能を果たすものであ
る。それ故、ここに開示した候補プロテアーゼ阻害剤分
析と処置の方法は、単にヘルペス科のみに対するより
も、もっと広い応用性をもっている。ドメインは、ポリ
ペプチドまた蛋白質内のアミノ酸配列として定められる
蛋白質の一部または領域に関係しており、本ケースにお
けるドメインは、蛋白質の機能または置換の配列におけ
るアミノ酸の欠失または置換の影響によって機能的に限
定される。ダウンストリームは、核酸分子に沿って、関
連の、与えられた点から３′方向に見出される核酸配列
のことを云う。エピトープは、抗原決定基であるアミノ
酸配列である。
【００２５】読み取り枠（ＯＲＦ）は、終止コドンのな
いアミノ酸として、一連の３塩基連鎖コードを含む。こ
の型の配列は、潜在的に、蛋白質に翻訳が可能である。
ＤＮＡに関する事実上の精製は、それらが有機体のゲノ
ム内に存在するような本来の状態から分離されたフリー
のＤＮＡセグメントのことを云い、それらが遺伝子工
学、例えば、組換えベクター内に挿入された状態で存在
するようなセグメントも含むとされている。転写単位
は、ＲＮＡポリメラーゼによる開始と終止の部位間の距
離である。アプストリームは、核酸分子に沿って、関連
の、与えられた点から５′の方向に見出される核酸配列
を云う。ウイルスプロテアーゼは、特定の部位で、ウイ
ルス前駆体蛋白質を切断する能力のある酵素である。 ＨＳＶ 単純ヘルペスウイルス ＣＭＶ サイトメガロウイルス ＯＲＦ 読み取り枠 ＩＣＰ 感染した細胞ポリペプチド ＤＦＰ ジイソプロピルフルオロ燐酸塩 ＴＰＣＫ Ｌ−１−トシルアミド−２−フエニルエチル
クロロメチルケトン ＴＬＣＫ Ｎ−α−Ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチ
ルケトン ＰＭＳＦ フエニルメチルスルホニルフルオライド ＥＧＴＡ エチレングリコール−ビス（β−アミノエチ
ルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′テトラアセティックア
シド
【００２６】図１Ａ． ＨＳＶ−１ゲノムの配列図、Ｕ
Ｌ２６及びＵＬ２６．５読み取り枠の位置及びそれらの
転写、また本発明における使用のため、構成された検査
プラスミドの構造、図１Ｂ． ＵＬ２６読み取り枠の核
酸及びアミノ酸配列。＋１部位は、ＵＬ２６読み取り枠
の翻訳開始部位に相当する。図２． ＨＳＶ−１ゲノム
のＤＮＡ，ＵＬ２６及びＵＬ２６．５読み取り枠（ＯＲ
Ｆ）の間の関係の模式図及びこの遺伝系の翻訳及び翻訳
後の産生物。図３． モック−感染及び１２時間感染ベ
ロ細胞から全細胞質ＲＮＡへハイブリッド形成され、Ｓ
１ヌクレアーゼで消化されたＤＮＡプローブ１（Ａ）及
びプローブ２（Ｂ）のオートラジオグラフの画像。図
４． プラスミド構成物によってトランスフェクトさ
せ、ウイルスにより重複感染させ、ポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動的に分離され、ニトロセルローズシー
トに電気的に移動後、ＨＳＶ−１ ＩＣＰ３５に対抗す
るゴートモノクローナル抗体Ｈ７２５（ＨＳＶ Ａｂ）
と反応させた細胞の溶解質からのポリペプチドの写真。
図５． プラスミド構成物によってトランス−フェクト
させ、ウイルスにより重複感染させ、ポリアクリルアミ
ドゲル中で電気泳動により分離され、電気的にニトロセ
ルローズシートに移動後、さらにモノクローナル抗体Ｈ
７２５（ＨＳＶＡｂ）またはＣＨ２８−２（ＣＭＶ Ａ
ｂ）と反応させた、脂肪の溶解質からのポリペプチドの
写真。図６． プラスミド構成物によってトランスフェ
クトさせ、ＨＳＶ−１により重複感染させ、ポリアクリ
ロアミドゲル中で電気泳動的に分離され、電気的にニト
ロセルローズシートに移動させ、次にモノクローナル抗
体Ｈ７２５（ＨＳＶＡｂ）またはＣＨ２８−２（ＣＭＶ
Ａｂ）と反応させた、細胞の溶解質からのポリペプチ
ドの写真。図７． プラスミド構成物によってトランス
フェクトさせ、ウイルスにより重複感染させ、ポリアク
リルアミドゲル中で電気泳動的に分離し、電気的にニト
ロセルローズシートに移動させた後、モノクロナール抗
体Ｈ７２５（ＨＳＶ Ａｂ）またはＣＨ２８−２（ＣＭ
Ｖ Ａｂ）と反応させた、細胞の溶解質からのポリペピ
チドのオートラジオグラフ画像と写真。図８． ヌクレ
アーゼ−処理のウサギ網状赤血球溶解質中で翻訳され、
次いで９．５％変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳
動的に分離させた３５Ｓ−メチオニン標識ポリペプチド
のオートラジオグラフの画像。図９． プラスミド構成
物でトランスフェクトさせ、３４℃（３４°）または３
９℃（３９°）でＨＳＶ−１（Ｆ）で重複感染させ、ポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動的に分離し、電気的
にニトロセルローズシートに移動させた後、ＨＳＶ−１
ＩＣＰ３５（ＨＳＶ Ａｂ）に対するモノクローナル
抗体Ｈ７２５と反応させ、パーオキシダーゼに結合した
ゴート抗−マウスＩｇＧ抗体で染色させた細胞から電気
泳動的に分離したポリペプチドの写真。図１０． プラ
スミドによってトランスフェクトさせ、ＨＳＶ−１
（Ｆ）（ＨＳＶ−１）により３４℃と３９℃で、あるい
は３７℃で、モック−感染または重複感染させ、ポリア
クリルアミドゲル中で電気泳動的に分離し、電気的にニ
トロセルローズシートに移動後、モノクロナール抗体Ｈ
７２５（ＨＳＶ−Ａｂ）またはＣＨ２８−２（ＣＭＶ
Ａｂ）と反応させ、さらにパーオキシダーゼと結合した
ゴート抗−マウスＩｇＧ抗体により染色させた細胞か
ら、電気泳動的に分離されたポリペプチドの写真。
【００２７】図１１． プラスミドでトランスフェクト
させ、ＨＳＶ−１（Ｆ）（ＨＳＶ−１）またＨＳＶ−２
（Ｇ）（ＨＳＶ−２）で、３４℃、３９℃または３７℃
で、モック−感染または重複感染させ、変性ポリアクリ
ルアミドゲル中で電気泳動的に分離し、電気的にニトロ
セルローズシートに移動後、モノクローナル抗体Ｈ７２
５（ＨＳＶ−Ａｂ）またはＣＨ２８−２（ＣＭＶ Ａ
ｂ）と反応させ、そしてパーオキシダーゼと結合したコ
ード抗−マウスＩｇＧ抗体で染色させた、細胞からのポ
リペプチドの写真。図１２ ＵＬ２６読み取り枠でエ
ンコードされ、変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳
動的に分離された３５Ｓ−メチオニン標識ポリペプチド
のオートラジオグラフの画像。図１３． プラスミドＵ
またはＹ中にエンコードされ、あるいは、プラスミドＸ
またはＺでトランスフェクトさせた細胞の溶解質中に含
まれて、ＨＳＶ−１（Ｆ）またはＨＳＶ−１（Ｇ）で重
複感染させた配列からｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたポ
リペプチドのオートラジオグラフの画像と写真。図１
４． ＵＬ２６読み取り枠でエンコードされ、プロテア
ーゼ阻害剤としてＰＭＳＦの作用を示すように、変性ゲ
ル中で電気泳動的に分離された３５Ｓ−メチオニン標識
ポリペプチドのオートラジオグラフの画像。図１５．
プラスミド構成物でトランスフェクトさせ、ＨＳＶ−１
（Ｆ）で、３４℃（３４°）または３９℃（３９°）で
重複感染させ、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動的
に分離し、電気的にニトロセルローズシートに移動させ
た後、最初に、ＨＳＶ−１ ＩＣＰ３５（ＨＳＶ Ａ
ｂ）に対するモノクローナル抗体Ｈ７２５または、ＣＭ
Ｖエピトープ（ＣＭＶ Ａｂ）に対するＣＨ２８−２と
反応させ、パーオキシダーゼと結合したゴート抗−マウ
スＩｇＧ抗体によって染色させた細胞の溶解質から電気
泳動的に分離させたポリペプチドの写真。図１６． プ
ラスミド構成物Ｙ中にクローン化されたＵＬ２６ＯＲＦ
からｉｎｖｉｔｒｏで翻訳された合成ＲＮＡからのヌク
レアーゼ−処理ウサギ網状赤血球溶解質中でｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで翻訳されて、電気泳動的に分離されたポリペプ
チドのオートラジオグラフの画像。図１７． 突然変異
誘発試験の結果の図式表示。
【００２８】本発明は、このようなプロテアーゼをエン
コードするヘルペスプロアーゼと核酸セグメントに関係
している。プロテアーゼエンコーディングセグメントは
また、ウィルス複製の間、キャプシド産生に用いられる
蛋白質のため少なくとも１つのコーディングドメインを
含んでいる。プロテアーゼの基質はそれ自身のアミノ産
配列とウィルスキャプシド蛋白質の前駆体を含んでいる
（図２）。プロテアーゼの阻害剤は、ウイルスの生活環
を抑止し、それによって治療的介入の方法が提供され
る。本発明の方法と組成物の具体的な例では、プロテア
ーゼ源としてＨＳＶ−１を用いている。新らしいヘルペ
スプロテアーゼが、ＨＳＶ−１で同定され、精製され
て、“Ｐｒ”として省略された。ウイルス産生物を直接
攻撃するために作られた対抗手段は、Ｐｒプロテアーゼ
の作用を阻害することによって与えられる。プロテアー
ゼは、ＤＮＡをウイルスキャプシド内にパッケージする
のに不可欠なことから、プロテアーゼの阻害剤は、ウイ
ルスの複製サイクルを崩壊させる。プロテアーゼの阻害
剤による処置は、臨床結果を緩和し、伝染のリスクを減
少させる。ヘルペスプロテアーゼは、ＨＳＶゲノム、Ｕ
Ｌ２６読み取り枠の領域の産生物である。プロテアーゼ
は、それ自体の切断をもたらすに足りるだけのウイルス
蛋白質と、本発明の一面として、同定され精製されたＵ
Ｌ２６．５読み取り枠（ＯＲＦ）領域の産生物のそれと
の両方における必需品である。ＵＬ２６ＯＲＦの産生
物、Ｐｒａと名づけられた蛋白質は、これまで明らかに
されていないヘルペスプロテアーゼで、ヘルペスウイル
スから精製された最初のプロテアーゼである。細胞フリ
ー系で、Ｐｒａは、それ自身Ｐｒｂに切断され、翻訳産
生物Ｐｒａがプロテアーゼとして機能することができる
ことが立証されている（図１）。Ｐｒａの自動触媒的切
断の産生物に指定された名称Ｐｒｂは、および２０アミ
ノ酸で、Ｐｒａより小さい。
【００２９】本発明のプロテアーゼの特徴は、それ自身
の切断に触媒的に作用するばかりでなく、驚くべきこと
に、それが作用する、より多量にある第２の基質は、プ
ロテアーゼをエンコードする遺伝子内に含まれる配列に
よって完全にエンコードされる。プロテアーゼと第２の
基質は、それらのカルボキシル末端で、アミノ酸配列を
分け合う。驚くべきそして予期しない発見は、第２基質
のコーディングセグメントが、ＩＣＰ３５と称するウイ
ルスキャプシド蛋白質をコードし、ＵＬ２６．５と名づ
けられる遺伝子が新たに確認されるということであっ
た。プロテアーゼの形の中にあるＵＬ２６遺伝子の発現
は、ウイルスの成熟のために不可欠である。この発言の
証拠は、Ｐｒｅｓｔｏｎらによって報告され（１９８
３）、ＵＬ２６読み取り枠での温度感受性突然変異は、
キャプシド成熟に致死効果をもたらした。従って、プロ
テアーゼの機能の崩壊は、ウイルス成熟を妨害し、治療
戦略が提供される。ヘルペスプロテアーゼを同定し、特
徴づけるため、３つの一般的な研究方法が発明者によっ
て用いられた。これらの方法は：１）検査プラスミドに
よって細胞をトランスフエクトし、次にそれらをヘルペ
スで感染する；２）２種類のプラスミドで細胞をトラン
スフエクトする；３）ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳する、を
含んでいる。これらの試験から、発明者は、２種類の遺
伝子（独立した転写単位）から成る、２種類の重複した
単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）核酸配列を確認
した。配列の大きい方は、ＵＬ２６と呼ばれ、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる測定で、およそ７５−８５Ｋｄの見かけ
上の分子量をもつ蛋白質をエンコードしている。この蛋
白質は、カルボキシル−末端蛋白質分解切断によって、
それ自身とＩＣＰ３５蛋白質前駆体をプロセシングする
能力がある。小さい方の配列は、ＵＬ２６．５と名づけ
られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、およそ３５−５
０Ｋｄの見かけ上の分子量をもつ蛋白質をエンコードし
ている。両遺伝子共にクローン化された。
【００３０】本発明のプロテアーゼがその分離、精製に
成功した理由の１つは、鍵検査基質、ＩＣＰ３５蛋白質
の選択によるものであった。ヘルペスゲノムをよりよく
理解するための別の生産的なステップは、ヘルペスの遺
伝経路の機構についての特殊な疑問に答えるようにデザ
インされた、特殊な構造計画をもつ数多くのプラスミド
の構造であった。いくつかのプラスミドの内部に、遺伝
作用の経路を追跡できるようなマーカー配列が挿入され
た。プラスミド構造物のシリーズの中のマーカーは、α
４プロモーターまたは、マウスモノクローナル抗体と反
応する能力のあるサイトメガロウイルスのエピトープを
エンコードする配列の欠失または挿入したものを含んで
いる。これらの構造物は、ヘルペスゲノムの領域の遺伝
作用の中で、ＵＬ２６ＯＲＦの構造と作用について、こ
れまでの試験から予言されていたこととは、劇的に驚く
程異なることが明らかにされた。これまでの研究で、Ｍ
ｃＧｅｏｃｈ等（１９８８）は、ＵＬ２６枠はＩＣＰ３
５をエンコードすると予言した。しかしなら、その読み
取り枠内のヌクレオチド配列から予言されたＵＬ２６の
産生物は、ＩＣＰ３５よりかなり大きいことが判明し
た。ヘルペスキャプシド蛋白質の産生に責任あるものに
ついて、階層的遺伝の複雑性が示された。本発明で明ら
かにされるのは、ＵＬ２６と名づけたドメインは、２つ
の重複した転写単位に解体され、アミノ酸配列の一部を
分け合う蛋白質を生ずるということである。これまでＩ
ＣＰ３５と名づけてきたものは、ＵＬ２６読み取り枠の
一部によってのみエンコードされることになる。本発明
の目的のため、その単位はＵＬ２６．５と名づけられ
た。本発明のプロテアーゼは一般的な適応性をもってい
る。前駆体を切断し、ＩＣＰ３５蛋白質を形成するＰｒ
ａプロテアーゼの基質の相同体が、他のヘルペスウイル
ス中に検出された。従って、本発明の方法は、他のウイ
ルス科のメンバーまた他の種属の中のプロテアーゼを見
せてくれそうである。１つの例として、ＩＣＰ３５蛋白
質のＣＭＶ相当物が、カルボキシル末端で切断されるこ
とが最近報告された（Ｇｉｂｓｏｎ 等、１９９０，Ｓ
ｃｈｅｎｋ等、１９９１）。ただし、ＣＭＶ蛋白質は、
その種属には未だ確認はされなかった。ヘルペス−切断
プロテアーゼは、それ故、他のヘルペスウイルスにおけ
る切断に影響するように思われる。ごく最近、サイトメ
ガロウイルス内のプロテイナーゼの報告がある。活性プ
ロテアーゼは、アミノ酸２４８における全長プロテアー
ゼの切断後に放出されると云われているが、しかし、本
発明から、このような切断の結果は不活性になるだろう
ということが示唆されている。水痘帯状疱診ヘルペスウ
イルス（ＶＺＶ）ゲノム中のＩＣＰ３５に相当する読み
取り枠の存在は（Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ，１９
８６；Ｄａｖｉｓｏｎ及び Ｍｃｇｅｏｃｈ，１９８
６）；ＩＣＰ３５同等物及び相当するプロテアーゼは、
色々なヘルペスウイルスの中に保護されることを示唆し
ている。ＩＣＰ３５のアミノ酸配列は、Ｐｒのカルボキ
シル末端に完全に含まれ、そしてＩＣＰ３５の蛋白質分
解活性は論証されないので、Ｐｒによって示される蛋白
質分解活性は、蛋白質のアミノ末端ドメインによって発
現されることが期待される。ＶＺＶゲノム（Ｄａｖｉｓ
ｏｎ及びＳｃｏｔｔ，１９８６）中で、ＵＬ２６に相当
する読み取り枠が、カルボキシル末端よりもむしろアミ
ノ末端におけるアミノ酸配列に大きな相同関係を示して
いることは興味深い点である。
【００３１】単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムの
操作 医療上の標的としてのウイルスプロテアーゼの重要性
は、ウイルス複製機構の考察から明らかである。例え
ば、単純ヘルペスウイルスは、７３の異なる遺伝子産物
をエンコードするに十分な程大きい、線状の、二本鎖Ｄ
ＮＡ分子（分子量およそ１００×１０６）からなるゲノ
ムをもっている。ゲノムの構造は、ＤＮＡウイルスの中
では普通ではなく、２つの独得なヌクレオチド配列が、
逆方向反復配列で隣り合っている。ウイルスゲノムは、
１６２のキャプソメアからなる正二十面体の蛋白質殻
（キャプシド）の内部にパッケージされている。ウイル
スの外部のおおいは、修飾細胞膜から生じた膜エンベロ
ープを含む脂肪である。細胞蛋白質は、ピリオンエンベ
ロープ中には検出されない。エンベロープの脂肪二重層
中のグリコプロテインは、ウイルスの宿主細胞、表面へ
の付着及びウイルスの細胞内への侵入とウイルスの成熟
及び出離を仲介する。キャプシドと脂肪二重層の間に
は、外皮がある。キャプシド内部には、ＤＮＡポリアミ
ン及びＤＮＡ−結合蛋白質がある。臨床的問題は、ウイ
ルスの複製と拡大によって細胞の感染が起った結果生ず
る。ウイルスゲノムが細胞の核に到達した後、ウイルス
ゲノムの発現は、高度に調節された形で起こる。ウイル
スの感染と複製から細胞死が結果的に生ずるかも知れな
い。プロテアーゼ阻害は、複製を遮断するだろう。ある
細胞、特に感覚性ニューロン、のｉｎ ｖｉｖｏの感染
では、必ずしもウイルスの複製と細胞死の結果にはなら
ない。潜伏期間が生ずるかも知れない。ＨＳＶ−１ゲノ
ムの配列の配置、ＵＬ２６及びＵＬ２６．５読み取り枠
の位置及びそれらの転写、そして本発明の局面で、組立
てられた検査プラスミドの構造が、図１に示されてい
る：ライン１−ＨＳＶ−１ゲノムの配列配置の図式表
示。ＵＬ及びＵＳは、末端逆方向反復で隣り合った長い
及び短いユニーク配列のことで長方形で示されている。
ライン２及び３−＋１に文字Ｉで示すＵＬ２６のおよそ
の転写開始部位に関係する、ゲノム地図の位置、ヌクレ
オチドの数、またＨＳＶ−１ ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ
ＤＮＡ断片の制限エンドヌクレアーゼ部位。ライン３は
また、翻訳終止コドン（Ｔ）及びＵＬ２６とＵＬ２６．
５ＲＮＡの両方に役立つシングルポリ（Ａ）シングナル
（Ａ）の位置を示す。ライン４及び５−黒長方形（太い
線）はＵＬ２６及びＵＬ２６．５読み取り枠のコーディ
ングドメインを表す。数字は、転写開始部位、翻訳開始
及び終止コドンそしてＵＬ２６のヌクレオチド＋１に関
係する両方の読み取り枠のためのポリ（Ａ）シグナルの
位置を示す。ライン６は、本報告に述べた試験に用いる
プラスミド構造物中に含まれるＨＳＶ−１配列の図式表
示であるラインＡからＺ及びＡＡからＺＺに関して、一
定のスケールで描かれた制限エンドヌクレアーゼ地図で
ある。ラインＡからＺ及びＡＡからＮＮまで、図式的に
示されるプラスミドの構造は、例１に説明されている。
プラスミドＢ，Ｄ，Ｈ，Ｊ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｗ，Ｘ，Ｚ，
ＡＡからＮＮに示されるα４プロモーター（白抜き長方
形）の起源は、適当な転写方向に挿入されたＢａｍＨＩ
Ｚ ＤＮＡ断片であった（Ｐｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，
１９８１）。ＣＭＶエピトープは、黒楕円形で示されて
いる。オリゴヌクレオチドＣは、その補体と共に、黒長
方形で示され、また新たに作られたＰｍｌＩ部位はＰ＊
でマークされている。制限エンドヌクレアーゼ部位は、
次のように略記された：Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｂａ，Ｂａｌ
１；Ｂｓ，ＢｓｔＥＩＩ；Ｅ，ＥｃｏＮＩ；Ｈ，Ｈｐａ
Ｉ；Ｋ，ＫｐｎＩ；Ｍｓ，ＭｓｔＩＩ；Ｐ，ＰｍｌＩ；
Ｐｓ，ＰｓｔＩ；Ｓ，ＳａｌＩ；Ｘ，ＸｍａＩ．Ｍｅ
は、ＵＬ２６．５読み取り枠のメチオニン翻訳開始コド
ンを表している。
【００３２】ＩＣＰ３５の非プロセシング種類ＵＬ２６
及びＵＬ２６．５読み取り枠のｉｎｖｉｔｒｏの翻訳を
同定するため、ＵＬ２６及びＵＬ２６．５読み取り枠の
両方をＰＧＥＭ３Ｚ−ｆ（＋）にクローン化し、それぞ
れプラスミドＴ及びＵが得られるようにした（図１）。
ＵＬ２６及びＵＬ２６．５のｍＲＮＡｓに相当するＲＮ
Ａｓは、Ｓｐ６ＲＮＡポリメラーゼによって転写され、
ヌクレアーゼ処理のウサギ網状赤血球溶解質に翻訳され
た。その結果は、ＵＬ２６及びＵＬ２６．５は、各々の
蛋白質を特定し、それぞれ、８０Ｋｄ（Ｐｒａ）及び４
５Ｋｄ（ＩＣＰ３５ｄ，ｃ）の見かけ上の分子量をもつ
二重バンドを形成することを示した。１ｎ ｖｉｔｒｏ
で合成されたＵＬ２６．５（ＩＣＰ３５）蛋白質の２つ
の種類は、ＨＳＶ−１（Ｆ）感染細胞内でｉｎ ｖｉｔ
ｒｏに合成されたＩＣＰ３５ｃ，ｄと共移動することが
見出された。さらに、ＩＣＰ３５ｃ，及びｄであるＵＬ
２６．５の非プロセシングの形はＩＣＰ３５ｅ及びｆに
プロセスされることが発見された。ＩＣＰ３５ｃ，ｄの
ＩＣＰ３５ｅ，ｆへのプロセシングに必要なウイルスゲ
ノム中のＤＮＡ配列を地図化（配置づける）し、精製す
ることは可能であった。ＢＨＫ細胞は、各々完全なＩＣ
Ｐ３５遺伝子を含む異なった長さのＨＳＶ−１ ＤＮＡ
配列をもつ一連のプラスミドによってトランスフェクト
され、３９℃でＨＳＶ−１（Ｆ）により重複感染され
た。無傷のＵＬ２６遺伝子（図１）を含むプラスミドＡ
によってトランスフェクトされたＢＨＫ細胞は、ＩＣＰ
３５ｃ，ｄに加えてＩＣＰ３５ｅ，ｆを発生したが、こ
れに反して、ＵＬ２６遺伝子のプロモーター領域が欠失
し、ＵＬ２６のコーディング配列のみが含まれる（図
１）プラスミドＣによりトランスフェクトされた細胞
は、単に非プロセシングのＩＣＰ３５ｃ，ｄのみを発生
した。これらの結果は、ＵＬ２６の遺伝子産物は、ＩＣ
Ｐ３５ｃ，ｄのｅ，ｆへのプロセシングに必要であるこ
とを示唆している。遺伝子ＵＬ２６の産生物は、トラン
ス位置にある時ＩＣＰ３５ｃ，ｄをｅ，ｆに切断する能
力があることが見出された。ＵＬ２６がトランスまたは
シスで作用するかどうかを決めるために、ＢＨＫ細胞
は、プロセシングのための基質としてプラスミドＮ及び
ＵＬ２６読み取り枠内の欠失を含む一連のプラスミドに
よってトランスフェクトさせ次いでＨＳＶ−１（Ｆ）で
感染させ、３９℃に維持された。その結果は次に示され
る。 （ｉ） プラスミドＮ及びＥ（図１）により、共トラン
スフェクトさせた細胞の溶解液は、ＣＭＶモノクローナ
ル抗体と反応するＩＣＰ３５の形ｅ及びｆを含まなかっ
たので、ＩＣＰ３５ｃ，ｄは、ＩＣＰ３５ｅ，ｆへの自
身のプロセシングに自動触媒作用を及ぼさなかった。 （ｉｉ） ＩＣＰ３５ｃ，ｄは、プラスミドＮ及びＣ、
またはＩにより、共トランスフェクトさせたＢＨＫ細胞
中でプロセスされなかった。プラスミドＣ及びＩは、そ
れぞれ、プロモーター領域内に、また、ＵＬ２６読み取
り枠のポリアデニレーション部位に欠失を含んでいる
（図１）。 （ｉｉｉ） ＩＣＰ３５ｃ，ｄは、プラスミドＮ及びＡ
またはＢにより、共トランスフェクトさせたＢＨＫ細胞
中でｅ，ｆにプロセスされた。プラスミドＡ及びＢは、
それぞれ、無傷のＵＬ２６プロモーター及び読み取り枠
及びα４プロモーターによって得られたＵＬ２６コーデ
ィング配列を含んでいる。ＨＳＶ−１（Ｆ）内のα−形
質導入因子は、３９℃でα４プロモーターを高レベルへ
誘導する（Ｐｏｓｔ等，１９８１；Ｂａｔｔｅｒｓｏｎ
及びＲｏｉｚｍａｎ，１９８３）。ＵＬ２６の高レベル
の発現は、プラスミドＮ及びＢにより、共トランスフェ
クトさせた細胞の溶解液中にＩＣＰ３５のプロセシング
形成物（形態ｅ及びｆ）が存在することを明らかにして
いる。ＵＬ２６によりエンコードされるプロテアーゼの
重要性は、ＩＣＰ３５ｃ，ｄをｅ，ｆにプロセシングす
る能力のあることを表す結果によって示されている。Ｕ
Ｌ２６とＩＣＰ３５ｃ，ｄのｅ，ｆへのプロセシング
は、共にその領域（ＵＬ２６ ＯＲＦの５′末端）での
突然変異が致死を招くことが報告（Ｐｒｅｓｔｏｎ等、
１９８３）されているので、キャプシド生産に不可欠で
あることが示されている。
【００３３】ヘルペス感染に対する攻撃の標的としての
プロテアーゼの利用の見通しから、より刺戟的なこと
は、ＩＣＰ３５ｃ，ｄを、キャプシド生産に必要なｅ，
ｆ蛋白質にプロセシングするためにはプロテアーゼが唯
一必要な蛋白質であるように見えることである。これ
は、プロテアーゼがキャプシドの形成に不可欠であるこ
とを示すものである。ＵＬ２６がこのプロセシングに必
要な唯一のウイルス蛋白質であるか否かを決めるため
に、そして３９℃でＨＳＶ−１（Ｆ）ゲノムにより発現
されたウイルス遺伝子がＩＣＰ３５の触媒に寄与する可
能性を排除するため、ＢＨＫ細胞を、基質及びプロセシ
ング用酵素をエンコードする遺伝子としてのプラスミド
Ｌの一定量と、プラスミドＢの異なった量により、それ
ぞれ共トランスフェクトさせた。プラスミドＬ（図１）
では、ＵＬ２６．５読み取り枠は、α４プロモーターで
調節され、ＣＭＶエピトープはＭｓｔＩＩ制限エンドヌ
クレアーゼ部位に挿入されたが、これに対し、プラスミ
ドＢは、同じプロモーターによって動かされた無傷のＵ
Ｌ２６読み取り枠を含んでいた。α４は、トランスフェ
クトされた細胞に本質的に発現する強力な真核プロモー
ターであるので（Ｐｏｓｔ等、１９８１；Ｋｒｉｓｔｉ
ｅ及びＲｏｉｚｍａｎ，１９８４）、プラスミドＬ及び
Ｂにより共トランスフェクトされた細胞内でのＵＬ２
６．５及びＵＬ２６蛋白質の発現は、ＨＳＶ−１（Ｆ）
による重複感染を必要としなかった。その結果は次の通
りであった。 （ｉ）ウイルス感染がない場合、プラスミドＬによって
トランスフェクトさせた細胞内にはＩＣＰ３５ｃ及びｄ
の２つの種類のみが発現された。プラスミドＬにより発
現されたエピトープ的にマークされたＩＣＰ３５は、許
容温度でＨＳＶ−１（Ｆ）によって重複感染させた細胞
内で十分にプロセスされた。期待したように、プラスミ
ドＢは、抗ＣＭＶ抗体と反応する産生物を生産しなかっ
た。 （ｉｉ）ＵＬ２６を含むプラスミドＢの存在で、プラス
ミドＬによって発現されたエピトープ的にマークされた
ＩＣＰ３５ｃ，ｄは、ＩＣＰ３５ｅ，ｆにプロセスされ
た。低濃度のプラスミドＢでは、ＩＣＰ３５ｅ，ｆの蓄
積量は、ＢＨＫ細胞内にプラスミドＬによって共トラン
スフェクトされたＵＬ２６プラスミドＤＮＡの量に直接
的に比例した。最高量のプラスミドＢの存在下で観察さ
れたＩＣＰ３５ｅ，ｆの量の減少は、２つのプラスミド
の間の競合または高量のＤＮＡが用いられたことによる
毒性の結果としての収量の減少を反映しているかも知れ
ない。これらの試験の結果から、ＵＬ２６の生産物は、
ＩＣＰ３５ｃ，ｄをＩＣＰ３５ｅ，ｆにプロセスする能
力があり、量も十分な唯一のウイルス因子であると結論
された。プロテアーゼは、それ故に、キャプシド成長に
不可欠であり、それは逆に、ヘルペスウイルス複製生活
環にとって不可欠である。このようなメジカントの活性
剤は、プロテアーゼの阻害剤を含む。阻害剤は、これま
で有効なプロテアーゼの蛋白質分解作用を取り消すよう
に働くか、またはプロテアーゼ生産に責任のある核酸セ
グメントの翻訳または転写の開始を崩壊し、または妨げ
るように作用するだろう。阻害剤は、化学的組成物の形
になるだろうし、その場合、細胞融合に影響する組成物
と結合されねばならない。若しも阻害剤が核酸セグメン
トの形であれば、熟練技術者には公知の色々な方法で、
感染した細胞に組み込まれるだろう。これらの方法はこ
こに開示されており、組換えベクターのトランスフェク
ション、電気穿孔法、あるいは機械的に加速した核酸分
子を感染細胞に押し込む“遺伝子銃”の使用から成る。
【００３４】例 １プラスミドの構造とＨＳＶゲノムへに対するそれらの関
係 特異的なポリペプチドの生産を調整するＨＳＶゲノムの
核酸配列の切断部分を同定するように操作できる核酸配
列のセグメントを含み、これらのセグメントを分離し、
それらの産生物を精製できるようなプラスミドの１セッ
トが組み立てられた。これらの精巧な道具は、ウイルス
感染に含まれる核酸配列を同定し、また操作するために
造られた。あるプラスミドでは、マーカーは、切断産物
を追跡し、色々な感染過程で用いられるヌクレオチド配
列を限定するため、特定の位置に挿入された。ＣＭＶエ
ピトープは、図１で黒楕円で示されている。オリゴヌク
レオチドは、その補体と共に、黒長方形で示されてい
る。新たに造られたＰｍＩＩ部位はＰ＊のマークであ
る。制限エンドヌクレアーゼ部位は、次のように略記さ
れている：Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｂａ，ＢａｌＩ；Ｂｓ，Ｂ
ｓｔＥＩＩ；Ｅ，ＥｃｏＮＩ；Ｈ，ＨｐａＩ；Ｋ，Ｋｐ
ｎＩ；Ｍｓ，ＭｓｔＩＩ；Ｐ，ＰｍｌＩ；Ｐｓ，Ｐｓｔ
Ｉ；Ｓ，ＳａｌＩ；Ｘ，ＸｍａＩ．集団的に、プラスミ
ドＡからＺに、ＡＡからＺＺに運ばれるＨＳＶ−１配列
は、ＵＬ２６読み取り枠の完全なドメインを包みこむ欠
失を含んでいる。ある例、例えばプラスミドＢ及びＤ
で、α４遺伝子のプロモーターは、高レベルの転写を強
いるために、ＢａｍＨＩ Ｚ断面の形の中に並列され
た。図１で、ＪからＮまでの名づけられたプラスミド構
成物は、これらの断片のユニークＭｓｔＩＩ部位に挿入
されるＣＭＶエピトープをエンコードする配列を、ＨＳ
Ｖ ＤＮＡ’ｓに運んでいる。１つを除く他のすべての
プラスミド構成物の中にＢａｍＨＩ Ｚ断片を挿入し、
この断片に含まれるα４プロモーターにより、転写が増
加するようにした。例外はプラスミド構成物Ｎであっ
た。プラスミドＯ及びＰにおいては、ＣＭＶエピトープ
が、ユニークＨｐａＩ部位に挿入され、Ｐプラスミドの
みがＢａｍＨＩ Ｚ断片の形の中に、α４プロモーター
を含んでいる。次のプラスミドが組み立てられた：Ａ
（ｐＲＢ４０５７），Ｂ（ｐＲＢ４０６０），Ｃ（ｐＲ
Ｂ４０５８），Ｄ（ｐＲＢ４０８９），Ｅ（ｐＲＢ４０
９３），Ｆ（ｐＲＢ４０５６），Ｇ（ｐＲＢ４０８
７），Ｈ（ｐＲＢ４０８８），Ｉ（ｐＲＢ４０２６），
Ｊ（ｐＲＢ４０９２），Ｋ（ｐＲＢ４０９４），Ｌ（ｐ
ＲＢ４０９６），Ｍ（ｐＲＢ４０９５），Ｎ（ｐＲＢ４
１０２），Ｏ（ｐＲＢ４０７９），ａｎｄ Ｐ（ｐＲＢ
４０８０），Ｑ（ｐＲＢ４１４０），Ｒ（ｐＲＢ４１８
４），Ｓ（ｐＲＢ４１８５），Ｔ（ｐＲＢ４１０３），
Ｕ（ｐＲＢ４０９０），Ｖ（ｐＲＢ４１８６），Ｗ（ｐ
ＲＢ４１８８），Ｘ（ｐＲＢ４２１３），Ｙ（ｐＲＢ４
２１４），Ｚ（ｐＲＢ４２１５）．ｐＲＢ４０２６は、
ＨＳＶ−１断片をＰＵＣ１８のＫｐｎＩ部位に挿入する
ことによって組み立てられた。ｐＲＢ４０５７は、遺伝
子の翻訳開始部位に関し；３′をヌクレオチド−９００
から、そのポリアデニレーション部位から下流へおよそ
６５０ヌクレオチドまで伸ばすＵＬ２６読み取り枠の完
全なエンコード配列を含んでいる。ｐＲＢ４０６０は、
ＨＳＶ−１ ＤＮＡ ＢａｍＨＩ Ｚ断片により、ｐＲ
Ｂ４０５７におけるＵＬ２６読み取り枠の翻訳開始部位
から、２３塩基対上流へウイルスＤＮＡ配列を移すこと
によって組み立てられた。ＢａｍＨＩＺ断片は１方の末
端に、ヌクレオチド＋３３によりスタートするα４遺伝
子の５′転写非コーディング配列の１部及びこの遺伝子
の上流非転写ドメインを含んでいる。ＢａｍＨＩ Ｚ断
片は、ＵＬ２６読み取り枠の無傷な、また先端を切った
ドメインに対し適当な転写方向にあるα４プロモーター
に並列するような方向に挿入された。ＰＲＢ４０５６、
ＰＲＢ４０５８、ｐＲＢ４０８７及びｐＲＢ４０９３
は、ｐＲＢ４０５７から得られ、またＰＲＢ４０８８及
びｐＲＢ４０８９は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）
により述べられたサブクローニングの技術で、欠失を発
生させることによってｐＲＢ４０６０から得られた。オ
リゴヌクレオチドの２対、すなわち、オリゴヌクレオチ
ドＡ（５′−ＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＣ
ＴＧＣＴＡＧＡＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＣＡＣＣＧＣＡＡ
ＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＡＣ−３′）その補体と
共に、オリゴヌクレオチドＢ（５′−ＡＡＡＧＧＧＡＣ
ＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＣＴＧＣＴＡＧＡＣＣＧＡＣＴ
ＧＣＧＡＣＡＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡ
ＣＡＣＧＡ−３′）その補体と共に、そしてオリゴヌク
レオチドＣ（５′−ＴＣＧＡＣＧＴＴＧＡＣＡＣＧＧＣ
ＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧＴＣＴＣＴ
ＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＣＧＴＧＴ
ＧＡ−３′），が、応用バイオシステムＤＮＡシンセサ
イザー３８０Ａ（Ｊｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉ
ｆ．）により合成された。オリゴヌクレオチドＡ，Ｂ及
びそれらの補体は、ＣＨ２８−２モノクローナル抗体の
エピトープをエンコードし、そしてプラスミドへのオリ
ゴヌクレオチドの挿入のスクリーニングに好都合なよう
に、３′末端にＫｐｎＩを含んでいる。ｐＲＢ４０７９
とｐＲＢ４０８０は、オリゴヌクレオチドＡ配列を、そ
れぞれ、ｐＲＢ４０５７及びｐＲＢ４０６０のユニーク
ＨｐａＩ部位に挿入することによって得られた。ｐＲＢ
４０９２は、オリゴヌクレオチドＢ配列を、ｐＲＢ４０
６０のユニークＭｓｔＩＩ部位に挿入することによって
得られた。ｐＲＢ４０９４，ｐＲＢ４０９５，ｐＲＢ４
０９６，そしてｐＲＢ４１０２は、ｐＲＢ４０９２から
普通のサブクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１
９８９）の方法により欠失を発生させて得られた。これ
らのプラスミドのすべての挿入部位は、ＣＭＶエピトー
プがＵＬ２６読み取り枠と同じ枠に挿入されたことが確
かめられるように配置された。プラスミドＱ（ｐＲＢ４
１４０）は、オリゴヌクレオチドを、その補体と共に、
プラスミドＡのユニークＰｍｌＩ部位に挿入することに
よって得られた。配列は、ＰｍｌＩ部位から翻訳部位
へ、標準ＵＬ２６配列をエンコードするがしかし、適当
な方向にＵＬ２６読み取り枠の新らしいＰｍｌＩ部位を
加えることにより、カルボキシル末端アミノ酸とＵＬ２
６読み取り枠の停止コドンの間に新らしいＰｍｌＩ部位
が作られる結果になった。それに加えて、標準ＰｍｌＬ
部位の配列、ＧＴＧ′は、配列、ＧＴＣ′に変化した。
適当な方向からのＵＬ２６読み取りのユニークＰｍｌＬ
部位への配列Ｃの挿入によって、カルボキシル末端アミ
ノ酸とＵＬ２６の停止コドンの間に、新らしいＰｍｌＩ
部位が作られる結果になった。元の標準のＰｍｌＩ部位
は、コドン“ＧＴＧ”と“ＧＴＣ”が同じアミノ酸をエ
ンコードしているので、ＵＬ２６アミノ酸を変えること
なく破壊された。従って、オリゴヌクレオチドとその補
体の、ＵＬ２６への挿入の最終的な効果は、標準カルボ
キシル末端アミノ酸とその停止コドンの間に、新らしく
出きたＰｍｌＩ認識配列によりエンコードされた２つの
追加アミノ酸をＵＬ２６が持ったということである。プ
ラスミドＲ（ｐＲＢ４１８４）は、配列Ｃをプラスミド
Ｅ（ｐＲＢ４０９３）のＰｍｌＬ部位へ挿入することに
よって得られ、またＳ（ｐＲＢ４１８５）は、オリゴヌ
クレオチドＡをその補体と共に、プラスミドＲのＰｍｌ
Ｌ部位へ挿入することによって得られた。プラスミド
Ｔ，Ｕ，Ｖ及びＷ（ｐＲＢ４１０３、ｐＲＮ４０９０，
ｐＲＢ４１８６及びｐＲＢ４１８８）は、プラスミドＢ
及びＳから、サブクローニングによって得られた。プラ
スミドＸ，Ｙ及びＺ（ｐＲＢ４２１３、ｐＲＢ４２１４
及びｐＲＢ４２１５）は、スタヒロコカル蛋白質ＡのＩ
ｇＧ結合ドメインの５つの同族体から成る２５６アミノ
酸をエンコードする配列か、または１２９アミノ酸をエ
ンコードし、２つのこのようなドメインから成る配列
を、ＣＭＶ配列の３′末端と停止コドンの間の部位で、
ＵＬ２６読み取り枠内にフレームで挿入することにより
組み立てられた。これらの配列は、それぞれ、蛋白質Ａ
遺伝子融合ベクターｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のＢｃｌＬ−ＨｉｎｃＩ
Ｉ断片及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片であつ
た。プラスミドＴ，Ｕ，Ｖ，及びＹのベクターは、ＰＧ
ＥＭ３Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）から得られ、これらのプラスミドは、Ｔ７または
Ｓｐ６ ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏの
転写のための鋳型として用いることができた。他のすべ
てのプラスミドのためのベクターは、ｐＵＣ１８（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）から得ら
れた。オリゴヌクレオチド配列ＡとＣ及びその補体のプ
ラスミド内へのすべての挿入部位は、ＣＭＶエピトープ
及び補体を含むオリゴヌクレオチドＣによってエンコー
ドされたアミノ酸配列が、ＵＬ２６読み取り枠により、
フレームで挿入されたことが確認できるように配置され
た。構成物ＡＡ，ＢＢ，ＣＣ，ＤＤ及びＭＭは、翻訳停
止コドンを、それぞれ、ＰｍｌＩ，ＭｓｔＩＩ，Ｂｓｓ
ＨＩＩ，ＨｐａＩ部位及びＩＣＰ３５の翻訳開始コドン
をエンコードする部位で、ｐＲＢ４０６０中に挿入する
ことによって作られた。構成物ＮＮは、ＩＣＰ３５翻訳
開始部位と停止コドンの間の配列の欠失によって組み立
てられた。ｐＲＢ４２４５としてｐＧＥＭ３ｚｆ（＋）
中にクローンされたＢａｍＨＩ Ｚに融合したＵＬ２６
ＯＲＦは、製造業者の勧告に従って、変異原−遺伝子
キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の助けにより、ＩＩ，ＪＪ，
ＫＫ，ＬＬ，ＨＨ及びＧＧが発生するように突然変異を
誘発した。この目的に用いられた４０ｍｅｒオリゴヌク
レオチドは、応用バイオシステムモデル３８０Ｂ ＤＮ
Ａシンセサイザーで合成された。プラスミドＥＥ及びＦ
Ｆは、ＸｂａＩによる切断と、ＵＬ２６の最初の１０及
び３３アミノ酸を欠失するために、それぞれ構成物ＧＧ
及びＨＨとの再連結により構成された。図１に使用した
シンボルは次の通りである：白抜き四角形：α４プロモ
ーターの起源として用いられ、ＵＬ２６及びＵＬ２６．
５読み取り枠のそれに比例する適当な転写方向に挿入さ
れたＢａｍＨＩ Ｚ断片；黒楕円形：ここに述べられた
２０アミノ酸ＣＭＶエピトープ；黒長方形：蛋白質Ａの
ＩｇＧ結合ドメインをエンコードするＤＮＡ配列；
Ｐ＊：蛋白質ＡのＩｇＧ結合ドメインの挿入により結合
して生じた新らしいＰｍｌＩ部位、ｉｎ ｖｉｔｒｏの
突然変異により生じた新らしい翻訳開始コドンは、“Ａ
ＴＧ”とマークされる。黒三角形は、挿入した停止コド
ンを表わす。制限エンドヌクレアーゼは、次のように略
記された：Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｂａ，ＢａｌＩ；Ｂｓ，Ｂ
ｓｔＥＩＩ；Ｅ，ＥｃｏＮＩ；Ｈ，ＨｐａＩ；Ｋ，Ｋｐ
ｎＩ；Ｍｓ，ＭｓｔＩＩ；Ｐ，ＰｍｌＩ；Ｐｓ，Ｐｓｔ
Ｉ；Ｓ，ＳａｌＩ；Ｘ，ＸｃｍＩ．Ｍｅは、ＵＬ２６．
５９読み取り枠のメチオニン翻訳開始コドンを表わす。
制限エンドヌクレアーゼ地図は、ここに述べる試験に用
いられたプラスミド構成物に含まれるＨＳＶ−１配列の
図式表示であるラインＡからＺに関する図１のライン９
に一定の割合で画かれている。
【００３５】例 ２ ウイルス組成物を分離し、精製するためのプラスミドの
利用 宿主細胞は、図１のプラスミド構成物によってトランス
フェクトされた。さらに、プラスミドによって、ウサギ
網状赤血球溶解質系から、プロテアーゼがｉｎｖｉｔｒ
ｏで合成された。プラスミド構成物によりトランスフェ
クトさせ、またウイルスにより重複感染させ、ポリアク
リルアミドゲル中で電気泳動法で分離し、ニトロセルロ
ーズシートに電気的に移動させた後、パーオキシダーゼ
と結合したゴート抗−マウス免疫グロブリン抗体と反応
させた細胞からのポリペプチドの写真は、感染の機構に
責任のある核酸配列を分析することに用いられた。ポリ
ペプチド精製の実験法の詳細は、材料と方法の項に述べ
られている。構成物ＭＭ及びＮＮは、プロテアーゼの中
のどのＩＣＰ３５コーディング配列がＩＣＰ３５の切断
に不可欠であるかどうかを決めるために用いられた。 例 ３ 転写単位の分析 ＵＬ２６のヌクレオチド配列は、驚くべきことに、また
予想もしなかったが２つの転写単位に含まれることが発
見された。ＵＬ２６の転写物を地図化するため２つのプ
ローブが作られた。ＲＮＡ中のＵＬ２６の５′末端を同
定するように設計されたプローブ１は、ＢａｍＨＩ部位
に、標識したＥｃｏＮＩ−ＢａｍＨ１断片から成り、一
方、プローブ２は、ＢｓｔＥＩＩ部位に、標識したＸｃ
ｍＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片で作られた。モック−感染及び
１２時間感染ベロ細胞から全細胞質ＲＮＡへハイブリッ
ド形成され、Ｓ１ヌクレアーゼにより消化されたＤＮＡ
プローブ１（Ａ）及びプローブ２（Ｂ）のオートラジオ
グラフの画像が図３に示されている。ＲＮＡは、この中
の材料と方法の欄に記述されている。図３のレーン１
（ＰＳ）、Ｓ１−消化プローブ１は、レーンモック及び
ＨＳＶ−１に示されるハイブリッド形成と消化の場合と
同じ條件下であるように見える。レーン２及び８（モッ
ク）は、モック感染の１２時間後の細胞から抽出された
ＲＮＡを示す。レーン３及び９（ＨＳＶ−１）は、ＨＳ
Ｖ−１（Ｆ）で感染後、１２時間維持された細胞から抽
出されたＲＮＡを示す。レーン４及び７（Ｐ）は、非消
化プローブ（プローブ１または２）の位置を示す。レー
ン５及び７（Ｍ）は、酵素ＭｓｐＩによるＰＧＥＭ３Ｚ
の消化から得られた５′末端−標識断片を示している。
図３の矢印は、ＵＬ２６（Ａ）及びＵＬ２６．５（Ｂ）
ＲＮＡの防御された５′末端を示す。ＴはＵＬ２６ Ｒ
ＮＡにより防御されたプローブ２におけるＨＳＶ−１配
列の位置である。図３に示されたＳ１分析の結果は、プ
ローブ１にハイブリッド形成された細胞質ＲＮＡは、お
よそ３００のヌクレオチド長（レーン３）の断片を防御
したことを示している。ＢａｍＨ１部位から上流のヌク
レオチド３００はＵＬ２６の＋１と呼ばれた。およその
転写開始部位後最初のメチオニンコドンは、位置＋１８
０である。プローブ２にハイブリッド形成された細胞質
ＲＮＡは、Ｓ１消化（レーン９）から防御された２セッ
トの断片を生じた。最初の断片はＨＳＶ−１ ＤＮＡ配
列（バンドＴ）のすべてを含んでいた。防御された断片
の第２のセットは、長さ３５−４０ヌクレオチドの範囲
のいくつかのバンドを形成した（レーン２、バンドＵＬ
２６．５）。そこで、この転写の転写開始部位は、ＵＬ
２６のヌクレオチド＋１の割合で、およそヌクレオチド
＋１０００の位置であった。このＲＮＡの転写開始部位
から下流の最初のメチオニンコドンは、位置＋１０９９
であった。長い方のＲＮＡはＵＬ２６と名づけられた。
【００３６】例 ４ ＩＣＰ３５遺伝子の位置と分離 遺伝子を特定するＩＣＰ３５のコーディングドメインの
位置を限定するため、読み取り枠ＵＬ２６における一連
の欠失について、ＩＣＰ３５の発現能力が試験された。
ＢＨＫ細胞を、プラスミド構成物Ｏ，Ｎ及びＰ（図１）
によってトランスフェクトさせ、次にＨＳＶ−２（図
４）により感染させた。図４に示されるゲルのトップと
交差する文字は、それによって細胞がトランスフェクト
されたプラスミド構成物を示している。文字のダッシュ
または文字がないのは、細胞が感染されたがしかしトラ
ンスフェクトはされないことを示す。垂直線は、移動の
遅いバンドを表わしている。ＨＳＶ−１ ＩＣＰ３５を
生じた最も短かい断片は、プラスミドＥ（レーン２）で
あった。このプラスミド構成物は、その内在プロモータ
ーから発現されたので、その結果は、ＨｐａＩ−Ｐｓｔ
Ｉ断片内に含まれる配列が、コーディング配列とＩＣＰ
３５をエンコードする遺伝子のプロモーターの両方を含
むことを示している。プラスミドＥは、ＵＬ２６．５Ｒ
ＮＡプラス１６８ヌクレオチドのすべての配列を含んで
いる。 例 ５ 読み取り枠の分離と特徴 図５で、プラスミド構成物でトランスフェクトさせまた
ウイルスで重複感染させた細胞から抽出されたポリペプ
チドの写真は、ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動
による分離、ニトロセルローズシートへの電気的移動、
そしてモノクローナル抗体Ｈ７２５（ＨＳＶ Ａｂ）ま
たはＣＨ２８−２（ＣＭＶ Ａｂ）との反応後に撮影さ
れた。ゲルのトップと交差する文字は、それによって細
胞がＤＮＡ感染されたプラスミド構成物を示している。
文字のダッシュまたは欠除は細胞が感染されたが、トラ
ンスフェクトされなかったことを示す。垂直線は、遅−
移動バンドを表わしている。図５は、構成物Ｊ，Ｋ，ま
たはＬによってトランスフェクトされたＢＨＫ細胞が、
抗−ＨＳＶ−１ ＩＣＰ３５（Ｈ７２５）及び抗−ＣＭ
Ｖ（ＣＨ２８−２）モノクローナル抗体の両方と反応し
た蛋白質の科を作ったことを示す。プラスミド構成物Ｌ
のトランスフェクション産生物による特徴的な４つのＩ
ＣＰ３５バンドの形成は、ＩＣＰ３５の開始メチオニン
コドンが１０９９の位置にあることを示している。これ
らの結果は、ＩＣＰ３５を特定するＵＬ２６．５のコー
ディング配列がＵＬ２６の一部を構成し、その枠内にあ
ることを示している。前の項で、ＩＣＰ３５は、Ｈｐａ
Ｉ−ＰｓｔＩ断片に含まれるＤＮＡ配列のトランス活性
化によって発現することが示された。プラスミド構成物
ＥはＨＳＶ−２によりトランス活性化されるので、ＵＬ
２６のコーディング配列はコーディング配列とＩＣＰ３
５特定化遺伝子のプロモータードメインの両方を含むこ
ともまた結論されるだろう。 例 ６ 抗−ＣＭＶ ｍＡｂの利用 プラスミド構成物でトランスフェクトさせ、ＨＳＶ−１
で重複感染させた細胞からのポリペプチドの写真は、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル中での電気泳動による分
離、ニトロセルローズシートへの電気的移動、そしてモ
ノクローナル抗体Ｈ７２５（ＨＳＶ Ａｂ）またはＣＨ
２８−２（ＣＭＶ Ａｂ）との反応後に撮影された。図
６に示されるゲルの頂部と交差する文字は、細胞がトラ
ンスフェクトされたプラスミド構成物を示したものであ
る。文字のダッシュまたは欠除は、細胞が感染されたが
トランスフェクトされなかったことを示す。垂直線は、
遅い移動バンドを表わしている。これらの結果は、抗−
ＣＭＶモノクローナル抗体の使用により、一異種ウイル
スによる細胞の重複感染の必要性が取り除かれることを
示している。
【００３７】例 ７ ＵＬ２６ ＯＲＦの産生物の同定、分離及び特徴 図７は、プラスミド構成物によりトランスフェクトさ
せ、次にウイルスにより重複感染させたＢＨＫ細胞をポ
リアクリルアミド中で電気泳動により分離し、ニトロセ
ルローズシートに電気的に移動し、さらにモノクローナ
ル抗体Ｈ７２５（ＨＳＶ Ａｂ）またはＣＨ２８−２
（ＣＭＶ Ａｂ）と反応させた後、その細胞からのポリ
ペプチドのオートラジオグラフの画像と写真を示してい
る。ゲルの頂部と交差する文字は、細胞がトランスフェ
クトされたプラスミド構成物を示している。垂直線と矢
印は、ＵＬ２６蛋白質の産生物を表わしている。図７に
おいて、レーン１，２，３は、材料と方法で述べるよう
に、〔３５Ｓ〕メチオニンで標識された蛋白質のオート
ラジオグラフの画像である。ＨＳＶ−２の感染細胞蛋白
質（ＩＣＰＳ）は、Ｍｏｒｓｅ等（１９７８）に従って
番号を付した。レーン８，９及び１０は、ＣＨ２８−２
モノクローナル抗体によるよりもむしろＨ７２５によっ
て染色されたレーン４，５及び６に示されたのと同じ細
胞の溶解質を示す。レーン７は、プラスミド構成物Ｊに
よってトランスフェクトされ、ＵＬ２６がα４プロモー
ターによって動かされ、ＨＳＶ−１（Ｆ）によって感染
され、３９℃に維持された細胞の溶解質を示す。これら
の條件下で、α及びいくらかのβ蛋白質が発現される
が、しかしＨＳＶ−１（Ｆ）のＩＣＰ３５は発現されな
い。ＨＳＶ−１（Ｆ）ウイルスゲノム中のＩＣＰ３５は
発現されない。プラスミド構成物によりエンコードされ
たＩＣＰ３５は、トランスフェクトした遺伝子がβ遺伝
子として調節されるので発現される。前項で、ＩＣＰ３
５をエンコードする配列は、ＵＬ２６ ＯＲＦと名づけ
た配列のほんの一部が重複することが示された。次項に
紹介した試験の目的は、ＵＬ２６読み取り枠の全長の産
生物を同定することであった。ＢＨＫ細胞を、プラスミ
ド構成物Ｏ，Ｎ，またはＰ（図１）によりトランスフェ
クトさせ、それからＨＳＶ−２によって感染させた。プ
ラスミドＯ，Ｎ及びＰによってトランスフェクトさせた
細胞から電気泳動によって分離された蛋白質を、ＨＳＶ
−１（Ｈ７２５）またはＣＭＶ（ＣＨ２８−２）（図７
レーン４から６及び８から１０）に対するモノクローナ
ル抗体と反応させ、それから、分子量マーカーを与える
ためにオートラジオグラフにした（レーン１から３）。
顕著な結果は次の通りであった。 （１）ＵＬ２６によるフレームで挿入されたＣＭＶエピ
トープを含むプラスミド構成物Ｏ及びＰは、電気泳動移
動度で、見かけ上の分子量７５０００から７８０００
（図７、レーン４及び６）をもつ蛋白質にほぼ相当する
２つのバンドを形成する蛋白質を特定した。ＣＭＶモノ
クローナル抗体は、プラスミドＯ及びＰ（レーン４及び
６）によって生じたＩＣＰ３５バンドとは反応しなかっ
た。ＣＭＶエピトープは、ＨｐａＩ制限エンドヌクレア
ーゼ部位（＋８３２）、すなわち、位置＋１０９９のＩ
ＣＰ３５の翻訳開始部位の前、に挿入された。 （２）すべてのプラスミド構成物は、ＨＳＶ−１ ＩＣ
Ｐ３５に対するＨ７２５モノクローナル抗体と反応する
ＩＣＰ３５を作った。プラスミド構成物Ｎ及びＰによっ
て作られたＩＣＰ３５蛋白質の電気泳動移動度の相違
は、追加２１アミノ酸をエンコードするオリゴヌクレオ
チドの、プラスミド構成物Ｎへの挿入を反映している。 （３）ＩＣＰ３５蛋白質のそれと比較して、完全なＵＬ
２６ ＯＲＦによって特定化された多量の蛋白質は、Ｍ
ｒ７５０００−７８０００Ｋｄの蛋白質とＩＣＰ３５の
両方共同じモノクローナル抗体、ＣＨ２８−２と反応す
るけれども、より大きな蛋白質の反応性または量は、Ｉ
ＣＰ３５について観察されたものよりもかなり低いとい
うことが、観察から推論されるだろう。２つの蛋白質が
アミノ酸配列を分け合うというまぎれもない証拠は、Ｕ
Ｌ２６蛋白質の過剰の條件下で、構成物Ｊは、より大き
な蛋白質とＩＣＰ３５の両方と共に移動し、またＣＨ２
８−２モノクローナル抗体（矢印、図７、レーン７）と
反応する蛋白質を産生したという観察に基づいている。
【００３８】例 ８ ＵＬ２６及びＵＬ２６．５蛋白質の特徴 ヌクレアーゼ−処理したウサギ網状赤血球溶解質中に翻
訳され、９．５％変性ポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動により分離された、３５Ｓ−メチオニン標識ポリペ
プチドのオートラジオグラフの画像が図８に示されてい
る。製造業者の示唆に従って転写したように、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗ１から入手したキットによ
って与えられた、プロメモザイクウイルス鋳型の翻訳産
物がレーン１に示されている。レーン２は、プラスミド
Ｕ内のＵＬ２６読み取り枠の翻訳産物を示す。レーン３
は、プラスミドＴ内のＵＬ２６．５読み取り枠の翻訳産
物を示す。これらの結果は、ＵＬ２６及びＵＬ２６．５
は、それぞれ、８０，０００Ｋｄ（Ｐｒａ）及び４５，
０００（ＩＣＰ３５ｄ，ｃ）の見かけ上の分子量をも
ち、二重バンドを形成する各々の蛋白質を特定すること
を示した。 例 ９ ＵＬ２６の遺伝子産物は、転位で、ＩＣＰ３５ｃ，ｄを
ｅ，ｆにプロセスすることが要求される。プラスミド構
成物によってトランスフェクトさせ、３４℃（３４°）
または３９℃（３９°）で、ＨＳＶ−１（Ｆ）により重
複感染させ、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動によ
って分離させ、電気的にニトロセルローズシートに移動
させ、ＨＳＶ−１ ＩＣＰ３５（ＨＳＶ Ａｂ）に対す
るモノクローナル抗体Ｈ７２５と反応させ、パーオキシ
ダーゼに結合したゴート抗−マウスＩｇＧ抗体によって
染色させたＢＨＫ細胞から電気泳動法で分離されたポリ
ペプチドの写真が図９に提供されている。実験の詳細は
ここの材料と製法欄に述べられている。ゲル頂部に交差
する文字は、細胞がトランスフェクトされた、そのプラ
スミド構成物を示している。ダッシュは、細胞が感染し
たが、トランスフェクトしなかったことを示す。側面の
文字は、Ｂｒａｕｎ等（１９８４）に従い、ＩＣＰの異
なる種属に割り当てられた。ＩＣＰ３５バンドｅ及びｆ
は、バンドｃ及びｄの蛋白質の切断産物である。バンド
ｃ′，ｄ′，ｅ′及びｆ′に移動する蛋白質は、ＣＭＶ
エピトープを含み、そしてそれ故、それぞれに、バンド
ｃ，ｄ，ｅ及びｆにおける標準の蛋白質よりもゆっくり
と移動する。初期の実験では、ＩＣＰ３５ｃ，ｄは、Ｉ
ＣＰ３５ｅ，ｆの前駆体であると示唆された（Ｂｒａｕ
ｎ等、１９８４；Ｐｒｅｓｔｏｎ等、１９８３）。この
仮定を審査するため、ＢＨＫ細胞を、ＵＬ２６．５遺伝
子（図１）を含むプラスミドＥによってトランスフェク
トさせ、また３９℃でＨＳＶ−１（Ｆ）により重複感染
させた。このウイルスは、温度感受性で、３９℃では、
それ自身のＵＬ２６及びＵＬ２６．５読み取り枠を発現
しない。結果（図１０）を次に示す： （１）ウイルスゲノム内に居住するＩＣＰ３５遺伝子
は、ＩＣＰ３５に対するＨ７２５モノクローナル抗体と
それぞれに反応を示すＩＣＰ３５バンドが存在するかし
ないかによって証拠づけられるように、３４℃（レーン
１）で発現され、３９℃（レーン２）では発現されなか
った。 （２）ＩＣＰ３５ｃ，ｄは、３９℃で（レーン４）プラ
スミドＥ中の１つの読み取り枠から発現されたＩＣＰ３
５蛋白質のただ２つの種類であったが、これに対し、３
４℃（レーン１）に維持された豊富な感染細胞の溶解質
中には、少なくともＩＣＰ３５ｃ，ｄ，ｅ及びｆを検出
することができた。これらの結果から次の結論が導かれ
る： （ａ）ＩＣＰ３５ｃ，ｄは、ＩＣＰ３５蛋白質の非プロ
セシング形成物である； （ｂ）それらはＩＣＰ３５ｅ，ｆにプロセスされ得る； （ｃ）ＨＳＶ−１（Ｆ）後期遺伝子発現がない場合プロ
セシングが生じなかったので、プロセシングはトランス
作用因子を必要とする。
【００３９】例１０ ＵＬ２６は、トランスで、ＩＣＰ３５ｃ及び−ｄをＩＣ
Ｐ３５ｅ及び−ｆにプロセスするように作用することが
でき、またＵＬ２６は、コンピテント細胞で、ＩＣＰ３
５ｃ及び−ｄのＩＣＰ３５ｅ及び−ｆへのプロセシング
に必要な唯一のウイルス蛋白質である。ＵＬ２６がトラ
ンスまたはシスで作用するかどうかをきめるため、ＢＨ
Ｋ細胞を、プロセシングのための基質としてのプラスミ
ドＮにより、またＵＬ２６読み取り枠に欠失を含む一連
のプラスミドにより、トランスフェクトさせ、ＨＳＶ−
１（Ｆ）により感染させて３９℃に維持した。結果（図
１０Ａ）は、次の通りであった。 （ｉ）ＩＣＰ３５ｃ及び−ｄは、プラスミドＮ及びＥ
（図１）により共トランスフェクトされた細胞の溶解質
が、ＣＭＶモノクローナル抗体（レーン８）と反応性を
示すＩＣＰ３５ｅ及び−ｆを含まないので、自動触媒的
に３５ｅ及び−ｆにプロセシングされない。 （ｉｉ） ＩＣＰ３５ｃ及び−ｄは、プラスミドＮ及び
Ｃまたは１（レーン７及び６）により共トランスフェク
トさせたＢＨＫ細胞内でプロセスされなかった。プラス
ミドＣ及びＩは、それぞれ、プロモーター領域内及びＵ
Ｌ２６読み取り枠のポリアデニレーション部位に欠失を
含んでいる（図１）。 （ｉｉｉ）ＩＣＰ３５ｃ及び−ｄは、プラスミドＮ及び
ＡまたはＢにより共トランスフェクトさせたＢＨＫ細胞
内で、ＩＣＰ３５ｅ及び−ｆにプロセシングされた。プ
ラスミドＡ及びＢは、それぞれ、無傷のＵＬ２６プロモ
ーター及び読み取り枠そしてα４プロモーターにより動
かされたＵＬ２６コーディング配列を含んでいる（レー
ン５及び４）。α−形質導入因子は、３９℃で高レベル
でα４プロモーターを誘発するＨＳＶ−１（Ｆ）であ
る。ＵＬ２６の高レベルの発現は、プラスミドＮ及びＢ
（ランド４）により共トランスフェクトされた細胞の溶
解質内に、ＩＣＰ３５のプロセスされた形（ｅ及びｆ
型）の存在を説明できるかも知れない。結果は、ＵＬ２
６が、ＩＣＰ３５ｃ及びｄのＩＣＰ３５ｅ及び−ｆへの
プロセシングに含まれる蛋白質をエンコードすることを
示している。ＨＳＶ−１（Ｆ）ゲノムにより、３９℃で
発現されるウイルス遺伝子が、ＩＣＰ３５の触媒作用に
寄与する可能性を排除し、ＵＬ２６がこのプロセシング
に必要な唯一のウイルス蛋白質であるか否かを決めるた
めに、ＢＨＫ細胞を、基質をエンコードする遺伝子とし
てまたプロセシングのための酵素として、一定量のプラ
スミドＬと異なった量のプラスミドＢにより、それぞれ
共トランスフェクトさせた。プラスミドＬ（図１）で
は、ＵＬ２６．５読み取り枠はα４プロモーターによっ
て調節され、ＣＭＶエピトープは、ＭｓｔＩＩ制限エン
ドヌクレアーゼ部位で挿入されたが、一方、プラスミド
Ｂは、同じプロモーターにより動かされた無傷のＵＬ２
６読み取り枠を含んでいた。α４プロモーターは、本質
的にはトランスフェクトされた細胞に発現される強い真
核プロモーターであるので（Ｋｒｉｓｔｉｅ及びＲｏｉ
ｚｍａｎ，１９９１；Ｐｏｓｔ等，１９８１）、プラス
ミドＬとＢによりトランスフェクトされた細胞内のＵＬ
２６．５とＵＬ２６蛋白質の発現は、ＨＳＶ−１（Ｆ）
による重複感染を必要としなかった。その結果（図１０
Ｂ）は、次の通りであった： （ｉ）ウイルス感染がない場合、プラスミドＬ（レーン
１７）によりトランスフェクトさせた細胞には、ＩＣＰ
３５ｃと−ｆの２種類のみが発現された。プラスミドＬ
によって発現されたエピトープ様にマークされたＩＣＰ
３５は、許容温度でＨＳＶ−１（Ｆ）により重複感染さ
せた細胞内で十分にプロセスされた（レーン１８）。期
待したように、プラスミドＢは、抗−ＣＭＶ抗体と反応
性を示す産生物を生じなかった（レーン１１）。 （ｉｉ）ＵＬ２６を含むプラスミドＢの存在する場合、
プラスミドＬによって発現されたエピトープ様にマーク
されたＩＣＰ３５ｃと−ｄは、ＩＣＰ３５ｅと−ｆにプ
ロセスされた。低濃度のプラスミドＢでは、ＩＣＰ３５
ｅと−ｆの蓄積量は、プラスミドＬによりＢＨＫ細胞内
に共トランスフェクトされたＵＬ２６プラスミドＤＮＡ
の量に直接的に比例した（レーン１２から１６）。プラ
スミドＢの量が最高に存在した場合にみられたＩＣＰ３
５ｅと−ｆの量の減少は、２つのプラスミド間の競合ま
たは、高量のＤＮＡによる毒性の結果としての収量の減
少を反映しているのかも知れない。これらの試験からの
結果は、ＵＬ２６の産生物は、ＩＣＰ３５ｃと−ｄをＩ
ＣＰ３５ｅと−ｆにプロセスする能力も量も十分にある
唯一のウイルス因子であるということである。
【００４０】例１１ カルボキシル末端切断へのプロテアーゼの影響 プラスミドによってトランスフェクトさせ、また３４℃
（３４°、レーン１と４）か３９℃（３９°、レーン２
と５）または３７℃（レーン３と６−１４）で、モック
感染、あるいは、ＨＳＶ−１（Ｆ）（ＨＳＶ−１）また
はＨＳＶ−２（Ｇ）（ＨＳＶ−２）によって重複感染さ
せ、変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動で分離
し、ニトロセルローズシートに電気移動し、モノクロー
ナル抗体Ｈ７２５（ＨＳＶ−Ａｂ）またはＣＨ２８−２
（ＣＭＶ Ａｂ）と反応させ、パーオキシダーゼと結合
したゴート抗−マウスＩｇＧ抗体によって染色した細胞
からの、ポリペプチドの写真が図１１に提示されてい
る。ゲルの頂部に交差する文字は、細胞がトランスフェ
クトされたそのプラスミド構成物を示している。ダッシ
ュは、細胞が感染したが、トランスフェクトしなかった
ことを示す。本発明の別の局面は、プロテアーゼによっ
て影響された切断の型である。ＩＣＰ３５ｃ，ｄのｅ，
ｆへのプロセシングは、カルボキシル末端蛋白質分解の
切断を含んでいる。プラスミドＮによって特定されたＩ
ＣＰ３５ｅ，ｆが、ＨＳＶ−１感染細胞に生じたＩＣＰ
３５ｃ，ｄと共に変性ゲル中で共移動するため、プロセ
シング中切断されたＩＣＰ３５の一部は、プラスミドＮ
中に挿入されたＣＭＶアミノ酸配列の大きさにほぼ等し
いと推論されるだろう。ＩＣＰ３５プロセシングがカル
ボキシル末端蛋白質分解切断を含むか否かを決めるた
め、ＢＨＫ細胞をプラスミドＪ，Ｒ，Ｓ及びＷでトラン
スフェクトさせ、ＨＳＶ−２で重複感染させた。プラス
ミドＲは、ＰｍｌＩ部位にＵＬ２６．５を挿入されたＣ
ＭＶエピトープ（配列Ａ）を含んでいたが、これに対
し、プラスミドＳとＷでは、挿入は、カルボキシル末端
アミノ酸部位であった。電気泳動による分離の分析。抗
ＨＳＶ−１（Ｈ−７２５）及び抗ＣＭＶ（ＣＨ２８−
３）モノクローナル抗体によるポリペプチドの電気的移
動から次のことが明らかにされてきた（図１１）： （１） ＣＭＶエピトープが、ＵＬ２６停止コドンから
上流に１２２アミノ酸のＭｓｔＩＩ部位に挿入されたプ
ラスミドＪによりトランスフェクトされた細胞は、前駆
体ＩＣＰ３５ｃ，ｄ及びＣＭＶ抗体（レーン８）と反応
する産生物ＩＣＰ３５ｅ，ｆの両方を作った。野生型蛋
白質に比較してＩＣＰ３５ｃ，ｄ，ｅ及びｆの電気泳動
移動度の減少は、ＣＭＶエピトープ挿入に起因する分子
量の増加分に相当している。 （２） プラスミドＱ（レーン３と６）によりトランス
フェクトさせた細胞に、ＩＣＰ３５ｃ，ｄのみが作られ
た。このプラスミドでは、ＣＭＶエピトープが、ＵＬ２
６．５停止コドンから２１アミノ酸上流にあるＵＬ２６
のＰｍＩＩ部位に挿入された。ＩＣＰ３５ｃ，ｄ型の同
定は、それらがトランスフェクション細胞中にＩＣＰ３
５ｃ，ｄしか発現しないプラスミドＬによって特定され
るｃ，ｄに相当する型と、共移動するという観察に基づ
いている（図１０、パネルＢ、レーン１７）。 （３） プラスミドＲのＰｍｌＩ部位制限エンドヌクレ
アーゼ部位への配列ｃの挿入によって、この部位が破壊
され、カルボキシル末端アミノ酸とＵＬ２６の停止コド
ンの間に新たにＰｍｌＩ切断部位が作られたが、ＵＬ２
６又はＵＬ２６．５のアミノ酸配列に変化はなかった。
Ｈ７２５モノクローナル抗体によって検出されたＩＣＰ
３５ｃ，ｄ，ｅ及びｆは、標準蛋白質（レーン１１）と
共移動したが、これは配列ｃの挿入がＩＣＰ３５の発現
とプロセシングに影響しないことを示している。 （４） プラスミドＳとＷでは、ＣＭＶエピトープは、
ＵＬ２６．５のカルボキシル末端にあるプラスミドＲの
新らしいＰｍｌＩ部位に挿入された。これらのプラスミ
ドによりトランスフェクトされた細胞は、ＨＳＶ−１
Ｈ７２５モノクローナル抗体（レーン１０，１４）と反
応性を示すＩＣＰ３５ｃ，ｄ，ｅ，ｆを蓄積したが、Ｃ
ＭＶ ＣＨ２８−２モノクローナル抗体（レーン９，１
４）と反応したのはＩＣＰ３５ｃ，ｄの型のみであっ
た。注目すべき発見は、プラスミドＳのＩＣＰ３５ｃ及
びｄ型は、プラスミドＪの相当する型、それらは野生型
より２１アミノ酸長い、と共移動したが、ＩＣＰ３５
ｅ，ｆは、ＣＭＶエピトープをエンコードする挿入され
たアミノ酸配列が取り除かれたことを示しているという
ことである（レーン９及び１０）。プラスミドＷにより
特定化された産生物は同じ挙動を示した（図１１）。プ
ラスミドＷにより特定化されたＩＣＰ３５ｅ及びｆは、
プラスミドＳ及びＲにより特定化されたそれらよりも多
かったが、これは多分、プラスミドＷでは、ＵＬ２６読
み取り枠全体が再構成され、蛋白質産生物が多く発現
し、ＩＣＰ３５のプロセシングに利用されたことによる
と思われる。前駆体ＩＣＰ３５蛋白質の切断は、カルボ
キシル末端コドンからおよそ２０アミノ酸である。この
結論の証拠は、次のことによった。 （１） 末端からＣＭＶエピトープ２１アミノ酸の挿入
は切断を妨げたが、一方、カルボキシ末端でのエピトー
プの挿入は、切断を効果的に生じさせた； （２） ＩＣＰ３５ｅ′とｆ′（ＣＭＶエピトープによ
る）及びＩＣＰ３５ｃ，ｄの共移動。共移動は、ＣＭＶ
挿入ｅ及びｆを、標準の蛋白質中のｃ，ｄとおよそ同じ
ゲル位置に配置する。ＩＣＰ３５サブユニットの生産と
ＵＬ２６プロテアーゼの自動プロセスに用いられる切断
機構の間の予期しない相互関係は、共にカルボキシル末
端蛋白質分解切断を含むことであった。前項において、
ＵＬ２６は、ＩＣＰ３５のカルボキシル末端蛋白質分解
プロセシングに責任ある唯一のウイルス因子であること
が証明されてきた。プロテアーゼをコードするＵＬ２６
とＩＣＰ３５をコードするＵＬ２６．５はまた、同じカ
ルボキシル末端アミノ酸配列を分け合っている。ＵＬ２
６がそれ自身を切断する可能性は、プラスミドＰ（図
１）によりトランスフェクトさせ、３４℃または３９℃
で、ＨＳＶ−１（Ｆ）により重複感染させたＢＨＫ細胞
内に、ＣＨ２８−２モノクローナル抗体と反応したＵＬ
２６の二重バンド（図１１、レーン４と５）が発現され
たという観察から明らかにされた。この観察は、ＨＳＶ
−１（Ｆ）が本来３９℃で遺伝子を発現するので、ＵＬ
２６はそれ自身の切断に触媒作用を示す可能性を示唆し
たものである。
【００４１】例１２ プロテアーゼは、自身を切断する ＵＬ２６読み取り枠によってエンコードされ、変性ポリ
アクリルアミドゲル中で電気泳動法で分離された、３５
Ｓ−メチオニン標識ポリペプチドのオートラジオグラフ
の画像が図１２に示されている。プラスミドＵ及びＶ
（図１）に含まれるＵＬ２６読み取り枠は、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで転写され、ヌクレアーゼ処理のウサギ網状赤血
球溶解質内で翻訳された。示されているレーンは、翻訳
開始後１０，２０，９０及び３６０分の、翻訳混合物か
ら離れた位置を表す。レーン４−７及び１２−１５に示
される試料について、シクロヘキシイミドを翻訳開始１
０分後に添加して、それ以上の翻訳を阻害した。レーン
１−３の場合には、翻訳開始直後の翻訳混合物を、シク
ロヘキシイミド（１００μｇ／ｍｌ）を含む燐酸緩衝溶
液で１０倍に稀釈した。ＵＬ２６が、それ自身の触媒作
用で切断される証拠はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験
からも明らかにされた。Ｓｐ６ ＲＮＡポリメラーゼの
Ｔ７によってｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミドＵまたはＶ
（図１）から転写されたＲＮＡは、〔３５Ｓ〕−メチオ
ニンの存在する、ヌクレアーゼ処理ウサギ網状赤血球溶
解質に翻訳された。電気泳動により分離した翻訳反応産
生物の分析結果は次の通りであった（図１２）。 （１） シクロヘキシイミドの存在でのＵプラスミド
の翻訳産生物の培養の結果、ＵＬ２６蛋白質の切断産物
（Ｐｒｂ）がゆるやかに蓄積した。切断産生物の蓄積量
は、培養期間に比例した（レーン１６−１９）。 （２） プラスミドＶの翻訳産生物について同じ結果
が得られた。この実験の意義は、ＵＬ２６のカルボキシ
ル末端におけるＣＭＶエピトープの存在から生ずる。期
待のように、プラスミドＶから作られたＵＬ２６の前駆
体の形は、プラスミドＵから得られた標準の蛋白質より
ももっとゆっくりと移動した。しかしながら、プラスミ
ドＶから合成されたＵＬ２６のプロセス形成物はプロセ
スＵからの標準の蛋白質のそれと共移動した。これは、
ＵＬ２６の自動プラスミドはカルボキシル末端蛋白質分
解切断を含むことを示している。
【００４２】例１３ ＩＣＰ３５ｃ，ｄ及びＰｒａの切断は、特異配列であ
り、同じ部位である。プラスミドＵまたはＶ中でエンコ
ードされた配列からｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された、あ
るいは、プラスミドＸまたはＺによりトランスフェクト
させ、ＨＳＶ−１（Ｆ）またはＨＳＶ−１（Ｇ）で重複
感染させた細胞の溶解質に含まれるポリペプチド（図１
３、パネルＢ）のオートラジオグラフの画像（図１３、
パネルＡ）及び写真は、図１３に提示されている。ｉｎ
ｖｉｔｒｏで合成されたポリペプチドと細胞溶解質に
含まれたポリペプチドを、同じ変性１２％ポリアクリル
アミドゲル中で電気泳動によって分離し、電気的にニト
ロセルローズシートに移動し、西洋わさびパーオキシダ
ーゼ（抗−ＩｇＧ）のみと結合したモノクローナル抗体
抗−マウスＩｇＧ、またはモノクローナル抗体Ｈ７２５
（ＨＳＶ Ａｂ）またはＣＨ２８−２（ＣＭＶ Ａｂ）
に加えて、この抗−ＩｇＧ抗体と反応させた。ダッシュ
は、細胞が感染したがしかし、トランスフェクトしなか
ったことを示す。パネルＡに示されるポリペプチドは、
３５Ｓ−メチオニンで標識された。バンド名称は次の通
りである：プライム符号のない文字Ｃ，ｄ，ｅ，ｆは、
ＵＬ２６．５読み取り枠の標準のＩＣＰ３５産生物を示
している。Ｐｒａ及びＰｒｂは、ＵＬ２６読み取り枠の
プロテアーゼ産生物の翻訳加工形態である。二重、三重
プライム符号は、蛋白質がまた、ＣＭＶエピトープ及び
スタフイロコカス蛋白質Ａのドメインと結合する２つの
ＩｇＧと５つのＩｇＧをそれぞれエンコードする配列を
含むこを示している。ＰＡ″及びＰＡ″′は、ＩＣＰ３
５ｃ，ｄ及びＣＭＶエピトープの挿入物とＩｇＧ結合ド
メインを含むＰｒａ蛋白質の切断カルボキシ末端産生物
である。ＩＣＰ３５ｃ，ｄ及びＰｒａの切断は、配列−
特異的であり、同じ部位である。ここに示される実験の
結果は、ＵＬ２６とＵＬ２６．５の産生物の切断／プロ
セシングは、蛋白質のカルボキシ末端からおよそ１８−
２５アミノ酸の部位に起ったことが示唆された。これら
の蛋白質のプロセシングは、予見の位置で起ることを証
明するためには、同じゲル上での切断反応の両産生物を
証明することが必要であった。両産生物を具体化するた
めに、ＣＭＶモノクローナル抗体のためのエピトープ
と、スタフィロコカル蛋白質ＡのＩｇＧ結合ドメインを
エンコードする配列の両方を、予見のカルボキシル末端
でコーディング配列に挿入することが必要であった。プ
ラスミドＸとＺは、ＣＭＶエピトープの３′末端とＵＬ
２６の末端コドンの間の枠にある蛋白質Ａのそれぞれ２
つ及び５つのＩｇＧ結合ドメインから成る１２９及び２
５６アミノ酸をコードする配列をフレームで挿入するこ
とによって組み立てられた（図１）。２つの実験が行わ
れた。第１に、プラスミドＵ及びＹ内のＨＳＶ−１読み
取り枠が、転写され、６時間翻訳された。ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで、翻訳された蛋白質は次に、変性ゲル中（図１
３、パネルＡ）で電気泳動法で分離された。第２の実験
では、ＢＨＫ細胞を、プラスミドＺまたはＸによってト
ランスフェクトさせ、次にＨＳＶ−２（Ｇ）により重複
感染させた。細胞溶解質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳蛋
白質の分離に用いたのと同じゲル中で、電気泳動法で分
離し、ニトロセルローズシートに電気的に移動させ、そ
してＣＭＶ、ＨＳＶに対する抗体と、あるいは蛋白質Ａ
（図１３、パネルＢ）のＩｇＧ結合ドメインに結びつく
抗−ＩｇＧ抗体と反応させた。その結果は次の通りであ
る。 （ｉ） プラスミドＵ内でｉｎ ｖｉｔｒｏで転写さ
れ、翻訳されたＨＳＶ−１配列の自動触媒プロセシング
は、期待されたように、Ｐｒａ，Ｐｒｂと名づけられた
蛋白質バンドを生じた。Ｚバンドの産生物の同じような
自動触媒的プロセシングで３つのバンドが生産された。
第一のバンドは、蛋白質Ａの追加の２５６アミノ酸及び
ＣＭＶエピトープの２１アミノ酸構成物の存在から予想
されるように、標準前駆体Ｐｒａよりも、遅く移動し
た。第２のバンドは、Ｐｒｂバンドと共移動し、それ
故、翻訳産物の自動触媒的切断産物である。第３のバン
ドは、以下に述べる、そして抗−ＩｇＧ抗体と同様にＣ
ＭＶと反応するバンドと共移動した。 （ｉｉ） プラスミドＸの予想された翻訳産物はＩＣＰ
３５ｃ，ｄ及びＰｒａであった。プラスミドＺの翻訳産
物は、蛋白質Ａ配列のより小さな挿入物であることか
ら、これらの蛋白質が、プラスミドＸのそれらよりも、
対応して、より速く移動するだろうという点を除けば、
同様であろうと予想された。これは実際にそうであった
（レーン３，５及び８を４，６及び９と比較せよ）。若
しもＩＣＰ３５ｃ，ｄの切断が予想通り標準蛋白質のカ
ルボキシル末端から２０アミノ酸で起こるならば、切断
反応のアミノ末端産生物は、標準ＩＣＰ３５と共移動す
べきであり、またＨＳＶ−１モノクローナル抗体とのみ
反応すべきことがまた予想された。これは、実際に、プ
ラスミドＺ及びＸ（レーン５及び６）によって産生した
ＩＣＰ３５ｅとｆが、標準ＩＣＰ３５ｅとｆ（レーン
７）と共移動し、単に、ＨＳＶ−１特定のモノクローナ
ル抗体によって、検出が可能であったので、その通りの
状態になった。逆に、切断反応のカルボキシル末端産生
物は、それらの大きさに従って移動すべきであり、抗Ｉ
ｇＧ及びＣＭＶ抗体の両方と反応すべきであると予見す
ることができた。図７のパネルＢに示されるように、プ
ラスミドＸによりトランスフェクトさせた細胞の溶解質
からの抗ＩｇＧ抗体と反応性のあるバンドは、相当する
Ｚバンドよりも遅く移動した。しかしながら、すべての
カルボキシル末端切断産物は、蛋白質ＡのＩｇＧ結合ド
メインを含んでいたので、すべての蛋白質産生物は、免
疫グロブリン（例えば、バンド５と６）の特性に関わり
なく、ＩｇＧと反応することが予期されるだろう。両方
の産生物が検出されたので、その結果は、ＵＬ２６．５
とＵＬ２６のそれぞれの産生物であるＩＣＰ３５ｃ，ｄ
及びＰｒａは、共に切断によって翻訳的にプロセスされ
たものであることを示した。２つの蛋白質は、ＩＣＰ３
５ｃ，ｄの全長についてのアミノ酸配列を分け合い、か
つまた、その切断産物が共移動することから、２つの蛋
白質は同じ部位で切断されている。最終的に、両方の読
み取り枠のｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳産物は、二重バンド
に分解する。二重バンドは特にＩＣＰ３５（Ｃ及びＤ
型）の場合に目立っている。図１１に示されるものを含
めて今日までのすべての実験において、切断のカルボキ
シル末端産生物は、単一バンドを形成した。この観察
は、二重線を形成する蛋白質での相違は、蛋白質のカル
ボキシル末端よりはむしろアミノ末端であるという仮説
に一致している。
【００４３】例１４ 分析法としてのプロテアーゼの発現方式、 図１４に示されるのは、ＵＬ２６読み取り枠によってエ
ンコードされ、変性ゲル中で電気泳動により分離され
た、３５Ｓ−メチオニン標識ポリペプチドのオートラジ
オグラフの画像である。プラスミドＵ及びＹ（図１）に
含まれるＵＬ２６読み取り枠は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転
写され、ヌクレアーゼ処理されたウサギ網状赤血球溶解
質で転写された。レーン１は、翻訳開始後３６０分での
翻訳混合物から移動した部分を示す。２−５で示される
レーンは、翻訳開始後、１０分（０）または３６０分
（３６０）の翻訳混合物から移動部分を表わす。レーン
２−５に示される例では、翻訳開始後１０分における翻
訳混合物の当量は、シクロヘキシルイミド（１００μｇ
／ｍｌ）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（０．
４％）（レーン３）かまたはフェニルメタンスルホニル
フルオライド（ＰＭＳＦ）（５００μｇ／ｍｌ）（レー
ン４）を含む燐酸緩衝溶液で２０倍に稀釈された。図１
４に示されるように、ＰＭＳＦは、一部プロテアーゼ自
己切断を阻害する能力があった。レーン５に、正常な自
己切断が示されている。ライン３に、ＳＤＳによる１０
０％阻害がある。図１４の解釈は、１）ＳＤＳ、変性界
面活性剤、完全にプロテアーゼ活性を阻害する（レーン
３）；２）プロテアーゼは、プロテアーゼ阻害剤の存在
しない場合、自己切断することができる；そして３）Ｐ
ＭＳＦ、セリンプロテアーゼ阻害剤により、プロテアー
ゼの部分的な阻害がある。 例１５ プロテアーゼ蛋白質のドメインの特徴 プロテアーゼ蛋白質の特徴は：（ｉ）それはその触媒活
性のために必要ではないいくつかのドメインを含む。そ
して（ｉｉ）活性部位は、プロテアーゼのアミノ末端の
近くである。これらの特徴に到達するために用いた実験
設計は、２つの観察に基づくものであった。第１に、ス
タフィロコカル蛋白質ＡからのＩｇＧ結合ドメインを含
む追加アミノ酸配列のプロテアーゼのカルボキシ末端へ
の挿入は、プロテアーゼの自己切断を妨害しないが、し
かし、容易に検出できる反応産物を生ずる。第２に、ヒ
トサイトメガロウィルスモノクローナル抗体の２０アミ
ノ酸エピトープをエンコードする配列の、ＵＬ２６及び
ＵＬ２６．５ ＯＲＦのコーディングドメイン内部への
フレームでの挿入は、２つの目的のために役立ってい
る。第１に、特性的に、これらのＯＲＦの産生物の同定
に役立つ。第２に、プロテアーゼの色々なドメインを分
離することにより、その触媒機能に近接していなければ
ならないプロテアーゼの領域を同定することに役立って
いる。 Ａ． Ｕ Ｌ ２６蛋白質の機能的ドメインの素描 ＵＬ２６プロテアーゼ（表１）の突然変異の３セット
が、プロテアーゼドメインを調査することに用いられ
た。セット１は、ＵＬ２６とＵＬ２６．５読み取り枠の
マッピングのために作られ、色々な部位において、フレ
ームで挿入される３つのＵＬ２６遺伝子、２０アミノ酸
ＣＭＶエピトープをエンコードするＤＮＡ配列から成
る。第２セットは、停止コドンまたは、遺伝子の色々な
領域にわたる欠失をもつ１０のＵＬ２６遺伝子構成物か
ら成る（表１）。セット３は、アミノ酸の７から２１５
の領域で始まる、予見されたアミノ酸配列内の置換を含
む６つのＵＬ２６遺伝子から成る。次項で述べるよう
に、これらのプラスミドの各々におけるＵＬ２６遺伝子
は、α４プロモーターから発現された。プロテアーゼの
標的は、通常プラスミドＬ（図１）にクローンされ、そ
してＣＭＶエピトープ挿入物をフレームで含むＵＬ２
６．５遺伝子であった。例外の、クローンＰ及びＪは、
ＵＬ２６及びＵＬ２６．５遺伝子の両方（プラスミド
Ｊ）のコーディング配列の中に、あるいはＵＬ２６コー
ディングドメイン（プラスミドＰ）の中にだけ、ＣＭＶ
エピトープを含むＵＬ２６遺伝子を含んでいた。一般的
に、ＢＨＫ細胞を、プラスミドＬとプロテアーゼをエン
コードするプラスミドの１つによってトランスフェクト
させ、次にＨＳＶ−１（Ｆ）により、３９℃で重複感染
させた。細胞溶解質を、変性ゲル中で電気泳動法によっ
て分離し、ニトロセルローズシートに移動し、それか
ら、すべてのＵＬ２６．５産生物と反応するＨＳＶモノ
クローナル抗体Ｈ７２５と、そしてまた、ＣＭＶエピト
ープ（図１５参照）を含むＵＬ２６．５産生物とのみ反
応するＣＭＶモノクローナル抗体ＣＨ２８−２と反応さ
せた。ＨＳＶ−１（Ｆ）は、主なＨＳＶ−１調節蛋白質
を特定するα４遺伝子中に温度感受性の病変を含むの
で、それ自身のＵＬ２６プロテアーゼまたは基質を３９
℃では発現しない。しかしながら、α−遺伝子トランス
誘導因子（ＶＰ１６）は、高温で機能し（Ｐｏｓｔ等、
１９８１；Ｂａｔｔｅｒｓｏｎ等、１９８３）、プロテ
アーゼ（ＵＬ２６）及び基質（ＵＬ２６．５）の両方を
特定する遺伝子の発現をトランス活性化する。結果（図
１５）は次の通りであった： （１） ＵＬ２６．５遺伝子は、ＨＳＶモノクローナル
抗体と３４℃（レーン１と１４）で反応性を示すが、３
９℃（レーン２と１５）では反応性を示さない蛋白質バ
ンドを生産するウィルスゲノム内に生息している。さら
に、蛋白質分解切断（バンドｅ及びｆ）の産生物の存在
は、ＵＬ２６によりエンコードされたウィルスプロテア
ーゼはまた、３４℃で作られたことを示している。 （２） ウィルスゲノム中でエンコードされたＵＬ２６
プロテアーゼは、３９℃（レーン３）で発現しなかっ
た。かくして、プロテアーゼをエンコードするプラスミ
ドがない場合、プラスミドＬによりエンコードされた基
質は作られた（バンドｃ，ｄ）けれども切断されず、バ
ンドｅ，ｆは生じなかった。このことは、ウィルスゲノ
ム内でエンコードされたプロテアーゼは、許容温度以外
では発現されなかったことを示している。 （３） プラスミドＬから得られたＩＣＰ３５ｃ，ｄの
前駆体の形態だけは、プラスミドＨ（レーン４）、Ｇ
（レーン５）、ＣＣ（レーン７）、Ｄ（レーン９）、Ｄ
Ｄ（レーン１１）、ＦＦ（３レーン１３）、ＩＩ（レー
ン２１）、及びＪＪ（レーン３３）中の突然変異したＵ
Ｌ２６遺伝子によってトランスフェクトされた細胞内に
蓄積した。これらのプラスミドの中で、遺伝子産生物の
プロテアーゼ活性が不活性化された。 （４） 前駆体と、プラスミドから得られたＩＣＰ３５
の産生物の両方共に、突然変異ＵＬ２６遺伝子ＡＡ（レ
ーン６）、Ｂ（図１５、レーン８）、ＢＢ（レーン１
０）、ＥＥ（レーン１２）、ＧＧ（レーン２０）、ＨＨ
（３レーン１９）、そしてＫＫ（レーン２２）、Ｐ（レ
ーン２５）、ＭＭ（レーン２６）及びＮＮ（レーン２
７）によってトランスフェクトされた細胞に蓄積した。 （５） 上記のように、プラスミドＰにおいて、２０ア
ミノ酸エピトープは、アミノ酸２１８の後、すなわち、
ＵＬ２６．５によってエンコードされた基質蛋白質のコ
ーディングドメインから上流、に挿入された。プラスミ
ドＰによりエンコードされたプロテアーゼは、それ自身
（レーン１６，１７）とＩＣＰ３５（レーン２５）を切
断した。プラスミドＪは、アミノ酸５１４（図１）の後
にＣＭＶ挿入物を含んでいた。分析（レーン１８）によ
れば、それは、プラスミドＪそれ自身の中で、エンコー
ドされたＵＬ２６の産生物を切断した。この分析で検出
された切断産生物は、バンドｅのみであった。エピトー
プはまた、ＵＬ２６．５蛋白質の中に挿入されたので、
挿入された２０アミノ酸エピトープが妨害し、切断の効
率を落としたことはあり得ることである。アミノ酸６１
５の後に挿入されたエピトープが切断を妨害したことか
ら、プラスミドＱ（図１及び表１）は、その他のプラス
ミドによって特定されるがそれ自身のドメインの中にエ
ンコードされる遺伝子によっては特定されないＵＬ２６
遺伝子の産生物を切断したプロテアーゼをエンコードす
る。図１６は、突然変異試験の結果の図式表示のまとめ
である。番号は、ＭｃＧｅｏｃｈ等（１９８８）により
報告されたＵＬ２６ ＯＲＦのヌクレオチド配列から予
見されたアミノ酸番号を示す。挿入として示されるアミ
ノ酸は、すぐに挿入場所に先行する。アミノ酸は単一文
字コードで識別される。開いたシンボルは、プロテアー
ゼが機能したことを示している。閉じたシンボルは、突
然変異により不活性化したプロテアーゼを示す。図の下
部の線は、プロテアーゼのドメインを識別する（Ｎｏｓ
１−ＩＶ）。制限エンドヌクレアーゼ部位は次のよう
に略記された：Ｂ：ＢｓｔＩＩ，Ｈ：ＨｐａＩ，Ｍ：Ｍ
ｓｔＩＩ，Ｐ：ＰｍｌＩ．Ｍｅは、ＵＬ２６．５読み取
り枠のメチオニン翻訳開始コドンを表わす。
【００４４】
【表１】 表 １ 野生型遺伝子に導入されたＵＬ２６プロテアーゼ指定突然変異をエンコードし た遺伝子における突然変異のリスト 挿入突然変異体（２０アミノ酸ＣＭＶエピトープ） Ｐ アミノ酸２１８後の挿入 Ｊ アミノ酸５１４後の挿入 Ｑ アミノ酸６１５後の挿入 欠失突然変異体の構成物 Ｄ アミノ酸１−２２０の欠失 Ｇ アミノ酸２１９−６１５の欠失 ＥＥ アミノ酸１−９の欠失 ＦＦ アミノ酸１−３２の欠失 ＡＡ アミノ酸６１５後、停止コドンの挿入 ＢＢ アミノ酸５１４後、停止コドンの挿入 ＣＣ アミノ酸２８７後、停止コドンの挿入 ＤＤ アミノ酸２１８後、停止コドンの挿入 ＭＭ アミノ酸３０６後、停止コドンの挿入 ＮＮ アミノ酸３０７−６３５の欠失 アミノ酸置換 ＧＧ ＳｅｒＡｒｇＴｈｒによるＧｌｙ７ＡｓｐＡｒｇ（新ＸｂａＩ部位）＊ ＨＨ ＬｅｕＡｓｐＭｅｔによるＡｓｐ３１ＳｅｒＧｌｙ（新ＸｂａＩ部位） ＩＩ ＶａｌによるＨｉｓ６１（新ＡａｔＩＩ部位） ＪＪ ＡｌａによるＨｉｓ１４８（新ＰｓｔＩ部位） ＫＫ ＡｌａによるＳｅｒ２１５（新ＮｈｅＩ部位） ＬＬ ＡＬａによるＡｓｐ３４（新ＮｈｅＩ部位） ＊ 置換配列は次のようであった：プラスミドＧＧ：ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＣ ＡＴＧによるＣＣＧＧＧＡＧＡＣＣＧＡＴＧ；プラスミドＨＨ：ＴＡＴＣＴＡＧ ＡＣＡＴＧＧＡＣによるＴＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＧＧＡＣ；プラスミドＩＩ：Ｇ ＡＣＧＴＣＣＧＣによるＧＡＣＣＡＣＣＧＣ；プラスミドＪＪ：ＧＣＴＧＣＡＧ ＴＣによるＧＣＧＣＡＣＧＴＣ；プラスミドＫＫ：ＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣに よるＡＣＧＣＴＴＴＣＣＡＣＣ；プラスミドＬＬ：ＧＧＧＧＣＴＡＧＣＧＧＣに よるＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＧＧ
【００４５】Ｂ． Ｕ Ｌ ２６プロテアーゼのドメインの
特徴 図１５に示され、図１６に要約された結果は、ＵＬ２６
プロテアーゼが４個のドメインからなり、内２個は非必
須であり、２個はそうではないことを示す。非必須ドメ
イン１及びＩＶは、それぞれ、アミノ酸１から９を通る
が３２までは伸びず、またカルボキシル末端（アミノ酸
６３５）から少なくとも３０７まで、しかし２８７まで
は伸びない。ドメインＩＩＩは、少なくともアミノ酸２
１８から最大アミノ酸３０６まで伸びるように見える。
このドメインは、プロテアーゼのアミノ末端部分に比例
する少なくとも２０アミノ酸（アミノ酸２１８後のＣＭ
Ｖエピトープ挿入）によって置きかえられ得る。ドメイ
ンＮＯ．ＩＩはまた非必須ではなく、明らかにアミノ酸
１０と２１８の間に位置している。 Ｃ． Ｕ Ｌ ２６プロテアーゼの触媒ドメイン プロテアーゼ阻害剤による試験は、ＵＬ２６がセリンプ
ロテアーゼ（Ｋｒａｕｔ，１９７７：Ｎｅｕｒａｔｈ，
１９８３）のキモトリプシンまたはスブチリシン上科に
属すると予見され得ることを示唆している。２つのセリ
ンプロテアーゼ上科の共有の特性は、ヒスチジン、アス
パラギン酸、そしてセリンアミノ酸を含む活性部位であ
る。プロテアーゼの基質、ＩＣＰ３５は、ＨＳＶキャプ
シド（Ｎｅｗｃｏｍｂ等、１９９１）のアセンブリ内の
骨核蛋白質としての役割りを演ずると報告されてきた。
他のヘルペスウィルスの複製における結合点の配列も類
似しており、ＩＣＰ３５の相同体が報告されてきた（Ｒ
ｏｂｓｏｎ及びＧｉｂｓｏｎ、１９８９）。特に興味が
あるのは、他のヘルペスウィルス内のＵＬ２６ ＯＲＦ
の相同体が、ＵＬ２６プロテアーゼの蛋白質分解活性に
三つ組残基が役割りを演ずる保護ヒスチジン、アスパラ
ギン酸そしてセリンアミノ酸を含むか否かという疑問で
あった。ヌクレオチド配列の比較で、水痘帯状疱疹ヘル
ペスウィルスのＯＲＦ３３と、ヒトサイトメガロウィル
スのＣＭＶ ＵＬ８０ ＯＲＦが、ＨＳＶ−１のＵＬ２
６ ＯＲＦの相同体をエンコードすることが示されてい
る（ＭｃＧｅｏｃｈ等、１９８８；Ｃｈｅｅ等、１９９
０；Ｄａｒｉｓｏｎ及びＳｃｏｔｔ、１９８６）。ＨＳ
Ｖ ＵＬ２６、ＣＭＶ ＵＬ８０そしてＶＺＶ遺伝子３
３蛋白質の間のアミノ酸配列の比較では、アミノ末端は
ＵＬ２６プロテアーゼの最も保護されるドメインである
ことが示された。プロテアーゼがＵＬ２６ ＯＲＦのア
ミノ近接ドメイン内に位置しているという結論は、ＵＬ
２６．５ ＯＲＦの産生物、ＩＣＰ３５が酵素的活性を
欠いているという観察に一致している。ＵＬ２６のアミ
ノ近接ドメイン内の保護アミノ酸を探査するため、プラ
スミドＧＧ，ＩＩ，ＪＪ，ＫＫそしてＬＬ内にエンコー
ドされたアミノ酸置換基が、Ａｓｐ３１Ｓｅｒ３２，Ａ
ｓｐ３４，Ｈｉｓ６１．Ｈｉｓ１４８そしてＳｅｒ
２１５を調査した。その結果、置換によって酵素的活性
を失ったアミノ酸は、位置６１と１４８の保護ヒスチジ
ンのみであることが示された。さらに明確なマッピング
試験を期待しつつ、プロテアーゼの触媒的ドメインは、
多分ＵＬ２６プロテアーゼのドメインＩＩ内に位置して
いると思われる。 Ｄ ．Ｕ Ｌ ２６プロテアーゼの他のドメインの機能 ドメインＩ，ＩＩ及びＩＩＩの機能は知られていない。
基質、ＩＣＰ３５はＨＳＶキャプシドの骨核形成のため
に集まるので、多分プロテアーゼもまた骨核内に含ま
れ、少なくともドメインＩＩＩそして恐らくはＩとＩＶ
もＩＣＰ３５とコンプレックスを作るために必要である
と思われる。
【００４６】例１６ ＵＬ２６遺伝子は、セリンプロテアーゼをエンコードす
る。ここに述べた２０アミノ酸ＣＭＶエピトープとそし
て蛋白質Ａ（プラスミドＹ、図１）の２５６アミノ酸Ｉ
ｇＧ結合ドメインが、ＵＬ２６ ＯＲＦの末端アミノ酸
と停止コドンの間に挿入された。Ｓｐ６ ＲＮＡポリメ
ラーゼによるプラスミドＹのコーディングドメインの転
写は、〔３５Ｓ〕−メチオニンの存在下で、ヌクレアー
ゼー処理されたウサギ網状赤血球溶解質内で、１０分間
翻訳された。それ以上の翻訳を停止するためシクロヘキ
シイミドを添加し、そしてＹプラスミドの翻訳産物が自
己分解を行うように、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、
さらに６時間培養させた。反応産生物は、それから変性
ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動法で分離された。
プラスミド構成物Ｙ中にクローンされたＵＬ２６ ＯＲ
Ｆをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された合成ＲＮＡから、ヌ
クレアーゼ処理のウサギ網状赤血球溶解質にｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで翻訳され、電気泳動により分離されたポリペプ
チドのオートラジオグラフの画像は、図１７に示されて
いる。示されているレーンは、１０分間の合成（レーン
１５，２８）後、または、シクロヘキシイミド（１００
μｇ／ｍｌ）のみの存在下またはプロテアーゼ阻害剤
（μＭ）との共存下（レーン１−４，１６−２７及び２
９−４７）で追加６時間の反応後、直ちに電気泳動のた
め変性された部分を表わしている。すべてのプロテアー
ゼ阻害剤は、使用前にジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）に溶解させた。結果（図１７）は次の通りであっ
た。 （１） １０分間翻訳の産生物は、切断されないプロテ
アーゼ（Ｐｒａ）（レーン１５と２８）を含む一本の標
識ポリペプチドバンドを形成した。 （２） シクロヘキシイミド（１００μｇ／ｍｌ）の存
在下でプロテアーゼのない場合の６時間の反応後、翻訳
混合物は、無傷の翻訳産物（Ｐｒａ）、アミノ末端（Ｐ
ｒｂ）、及び翻訳の切断産物のカルボキシ末端（ＰＡ）
部分（レーン９，１０，２１，２２及び３３）に相当す
る３つのバンドを形成した。 （３） 切断産生物、Ｐｒｂ及びＰＡの量は、シクロヘ
キシイミド及び低濃度のセリンプロテアーゼ阻害剤ジイ
ソプロピルフルオロ燐酸塩（ＤＦＰ，Ｓｉｇｍａ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｌ）、Ｌ−１−トシルアミド−２−
フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ，Ｓｉｇ
ｍａ）、Ｎ−ａ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチル
ケトン（ＴＬＣＫ，Ｓｉｇｍａ）、フェニルメチルスル
ホニルフルオライド（ＰＭＳＦ，Ｓｉｇｍａ）、及びキ
モスタチン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｅｈｉｍ．
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の存在下で反応した
翻訳混合物では減少した。高濃度の試験では、消化産物
は検出されなかった（レーン１，２９，３４，３９及び
４４）。 （４） 翻訳産物（Ｐｒａ）の切断は、システインプロ
テアーゼ阻害剤ヨード醋酸（Ｓｉｇｍａ）及びシステイ
ン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ；（レー
ン５−９，２２−２７）により、エチレングリコール−
ビス（β−アミノエチルエーテル）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′，−テトラ醋酸（ＥＧＴＡ）、メタロプロテアーゼ
のキレーター及び阻害剤（レーン１２−１４）により、
あるいはアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤ペプスタチ
ン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ；（レー
ン１５−２１）によって影響されなかった。これらの結
果は、ＵＬ２６遺伝子産物がセリンプロテアーゼである
という仮定と一致している。
【００４７】例１７ 候補阻害物質の検索 さらに進んだ態様において、本発明は、“候補化合物”
と呼ぶことができるヘルペスウィルスプロテアーゼの阻
害化合物を同定する方法に関する。このスクリーニング
の技術はヘルペスのプロテアーゼを阻害する目的に役立
ついかなる化合物の一般的確認にも有用であることが分
ると考えられる。さらにこの点に関して有用な化合物
は、決して蛋白質やペプチド化合物だけに限られるもの
ではないと考察される。事実、本スクリーニング検定法
の適用を通じて確認するための薬理学的に最も有用な化
合物は、非ペプチド性であり、例えば該酵素によって認
識され、結合され、強固な結合、または他の化学的相互
作用を通じて酵素を不活性化するのに役立つ場合がある
ことが判明され得る。したがって、これらの態様におい
ては、本発明は、候補化合物がヘルペスプロテアーゼを
阻害する能力を測定する方法を標的としている。本方法
は一般的に以下の段階を含む。 （ａ） それ自身のアミノ酸配列を開裂し、ＩＣＰ３５
蛋白質、またはこのプロテアーゼに対する開裂部位を含
むいかなるアミノ酸配列をも開裂することができるヘル
ペスプロテアーゼを含む組成物を得ること； （ｂ） 候補化合物とプロテアーゼ組成物を混合するこ
と。そして （ｃ） プロテアーゼが、候補物質の存在下で開裂を行
う能力を測定すること。本発明の候補物質のスクリーニ
ング検定法の重要な側面は、例えば、本発明中において
考察されたやり方で、プロテアーゼ組成物を比較的精製
された形で調製できるということである。少くとも比較
的精製された調製物なしでは、そのときプロテアーゼに
影響するかもしれない他の物質に対する阻害の効果では
なく、プロテアーゼ阻害に対して特異的に検定を行うこ
とはできないという点から、このことは、候補物質のス
クリーニング検定法の重要な面である。いずれにせよ、
プロテアーゼの単離の成功によって、今回はじめて、こ
のヘルペス関連蛋白質を阻害するために使用することが
できる新しい化合物を確認することが可能となった。候
補化合物スクリーニング検定法は、極めて簡単に用意
し、遂行することができる。そして多くの仕方で、上に
考察したプロテアーゼ活性を測定するための検定法と関
連している。したがって、プロテアーゼの比較的精製さ
れた調製物を得た後、望ましくは阻害物質が含まれてい
なければプロテアーゼがその開裂機能を作動することが
できると考えられる条件下で、該プロテアーゼ調製物と
候補化合物を単に混合することが望まれる。したがっ
て、例えば、典型的には、ＵＬ２６．５のコーディング
配列によってコードされたアミノ酸配列、もしくは少く
ともその位置においてプロテアーゼがＩＣＰ３５ｃ，ｄ
をｅ，ｆに開裂する開裂部位のような既知のプロテアー
ゼ基質のある量を混合物内に加えることが望まれる。こ
のやり方で、候補物質の存在下で、候補化合物が、ヘル
ペスプロテアーゼの基質の開裂を相対的に減少させた
り、変化させたりする能力を測定することができる。し
たがって、候補物質の相対的阻害能力を評価するために
は、比較的精製されたプロテアーゼの活性を、候補化合
物の存在における活性と比較して、検定した候補物質の
不在下で測定、すなわち定量することが望まれる。さら
に進めた態様においては、本発明は、上に考察したペプ
チド化合物群の一員のようなあるプロテアーゼ阻害剤の
効果的な濃度に曝すことを含むプロテアーゼを阻害する
方法、または、候補化合物のスクリーニング検定の態様
にしたがって確認された候補物質に関する。これは、ヘ
ルペスプロテアーゼを阻害することによって、ヘルペス
感染の種々の面を治療することができると考えられる点
で、勿論、発明の重要な面である。キャプシド蛋白質を
産生する作用を遮断するためにこのような阻害剤を使用
することは、ウィルスの感染を治療し、軽減することに
役立ち、それら単独で、または、他のヘルペス治療との
併用で有用であると考えられる。
【００４８】１． マーカー（トレーサー） ２つのモノクローナル抗体をマーカー（トレーサー）と
して使用した。１つは、ＵＬ２６とＵＬ２６．５の両方
の読み取り枠によってコードされた定常エピトープに対
するモノクローナル抗体であり、１つは、“転移性エピ
トープ”と反応するモノクローナル抗体である。後者
は、２つの読み取り枠の生成物の同定、その蛋白質の機
能の決定、ならびに開裂部位のマッピングに不可欠な道
具であった。“転移性エピトープ”がなければ、分析は
放射性トレーサー、または該遺伝子の種々の領域に相当
するオリゴペプチドに対するモノクローナル抗体に依存
するしかないであろう。転移性エピトープは、いかなる
読み取り枠の産生物に対しても即時抗体を提供し、本発
明に関連して使用されるとき、それが挿入された遺伝子
の産生物の機能の確認を著しく容易にする。サイトメガ
ロウィルスモノクローナル抗体及びブドー球菌ＡのＩｇ
Ｇ結合領域の同族体に反応性するエピトープのコーディ
ング配列を２つの読み取り枠のコーディング領域の３′
末端へ挿入することによって、プロテアーゼ開裂生成
物、すなわちＰｒｂ、およびＩＣＰｅとｆと名付けられ
た開裂したプロテアーゼが同定された。この方法によっ
て、ＩＣＰ３５蛋白質に対する開裂部位と全プロテアー
ゼをＰｒａとＰｒｂへ分離する開裂部位は、プロテアー
ゼとＩＣＰ前駆体の両方のカルボキシル末端から約２０
このアミノ酸だけ離れた位置にあることも決定された。
マーカーを持ったプラスミドを使用したヘルペスゲノム
の検討の例として、ヘルペスゲノムの一部で細胞をトラ
ンスフェクトするのに使用されたマーカーを挿入したプ
ラスミドの１つＳ（図１）の効果が例証となる。このプ
ラスミドにおいては、ＣＭＶエピトープは、ＩＣＰ３５
配列のカルボキシル末端において挿入された。このよう
にしてヘルペスゲノムの一部で感染した細胞を、次に集
め細胞内の蛋白質が分析できるように開裂させた。次に
これらの蛋白質を分子量によって電気泳動的にバンドに
分離した。ＩＣＰ３５は、ＨＳＶ抗体によって免疫学的
に同定できる。ＣＭＶエピトープが、エピトープに対す
る抗体を適用し、抗原−抗体複合体の産生を示すシグナ
ルを検出することによって、バンド中に検索された。こ
の免疫学的分析の結果から、ＣＭＶエピトープは、バン
ドｃとｄに検出されたが、ｅとｆには検出されないこと
が分った。このことは、ｃとｄのカルボキシル末端の開
裂が起きてｅとｆを生じたことを示した。
【００４９】２． 無細胞系蛋白質合成 有用な別の技術は、無細胞系蛋白合成系であった。ＵＬ
２６とＵＬ２６．５のメッセンジャーＲＮＡに相当する
ＲＮＡをＳｐ６ ＲＮＡポリメラーゼによって転写し、
無細胞系“リボゾーム機械”であるヌクレアーゼ処理し
たウサギ網状赤血球溶解物系において翻訳した。無細胞
系でｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳された蛋白質を放射性ラベ
ルで標識し、ゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラ
フィーを行って標識を含むバンドの位置をつきとめた。
この一般的方法論を用いた２組の実験があった。 （ｉ） 次第にＵＬ２６蛋白質の開裂産物（Ｐｒｂ）が
漸次蓄積する結果となったシクロヘキシミドの存在下で
の翻訳産物のインキュベーション。開裂産物の集積量は
インキュベーション時間の長さに比例した。（図１２、
レーン１２−１５）。 （ｉｉ） プラスミドＶ（レーン４−７）の翻訳産物に
ついて同一の結果が得られた。本実験の有意性は、ＵＬ
２６のカルボキシル末端におけるＣＭＶエピトープの存
在から生ずる。予期されるように、プラスミドＶから作
られた翻訳生産物ＵＬ２６のＰｒａは、プラスミドＵに
由来した標準蛋白質よりももっと遅く移動した。しか
し、プラスミドＶから合成され、プロセスされたＵＬ２
６のＰｒｂの形は、プラスミドＵからの標準蛋白質のそ
れと同位置に移動し、ＵＬ２６のオートプロセシングに
は、カルボキシル末端蛋白分解開裂を含むことが示唆さ
れている。
【００５０】３． 温度感受性変異株、ＨＳＶ−１
（Ｆ） ＨＳＶゲノムの分析に使用された別の道具は、ＨＳＶ−
１（Ｆ）であった。すなわち３９℃ではそれ自身のＵＬ
２６とＵＬ２６．５の読み取り枠を発現しない温度感受
性変異株である。むしろ、非許容温度におけるＨＳＶ−
１（Ｆ）は、α−遺伝子プロモーター（Ｐｏｓｔら、１
９８１）を誘導し、主としてα型遺伝子を発現する。 ４． プロテアーゼ阻害の確認と使用 プロテアーゼの作用が阻害されるならば、キャプシド産
生ができなくなり、ウィルスは複製されない。この阻害
は、転写、翻訳、もしくは蛋白質の作用のレベルにおい
てであってでもよい。転写の妨害は、ＤＮＡテンプレー
ト上のメッセンジャーＲＮＡの生成の妨害を必要とする
であろう。翻訳についての妨害はメッセンジャーＲＮＡ
上の蛋白合成の妨害を必要とするであろう。もしくは、
プロテアーゼ作用それ自身が、プロテアーゼの構造、な
かんずく、その蛋白開裂構造単位を破壊すること、その
基質の開裂部位を変更すること、乃至はプロテアーゼを
非可逆的阻害剤と結合させることのいずれかによって崩
壊され得る。プロテアーゼの機能を遮断する特別にデザ
インされたペプチドは、ヘルペス感染を防ぎ、治療する
上で極めて価値が高い。これら遮断剤の態様には、いか
ような基質類似体も、またはセリンプロテアーゼ阻害
剤、例えば、プロテアーゼによって認識される開裂部位
のアミノ酸配列を含むオリゴペプチド、またはそれらの
誘導体が含まれる。候補化合物から適切なプロテアーゼ
阻害剤を同定するための方法は例１７に開示されてい
る。阻害剤を検出するのに使用するためのウィルスプロ
テアーゼを製造するための周到な手段を提供し、治療法
を開発し、ウィルス感染の検出のための抗体を開発し、
プロテアーゼの不活性変異株を発現することが本発明の
さらなる目的である。プロテアーゼ蛋白質を調製するた
めの模範的な態様は、望ましいプロテアーゼ蛋白質、ま
たはポリペプチドをコードすることができる核酸配列を
含む核酸のセグメントを調製することである。このセグ
メントは、全プロテアーゼ、または例えば、プロテアー
ゼの蛋白分解性領域のようなそのある部分だけをコード
するものであってよい。このセグメントは抗体との陽性
シグナルの引き金を引き、それによってウィルス感染の
存在を同定することができるだけのセグメント程度に小
さいことがある。本発明において開発された図１におい
て示されているものと機能的に等価なセグメントも、生
産されるべき望ましいポリペプチド次第では選ばれるこ
とがある。機能的相当物は、セグメントが、ＩＣＰ３５
前駆物質かＰｒプロテアーゼのいずれかを開裂すること
ができるかどうかを、例えば、本発明中に開示された候
補物質の中からプロテアーゼ阻害物質を検出する技術を
使用して試験することによって決定することができる。
選択された核酸の切片は、ポリペプチドとしての切片の
発現に適当な環境に移される。この環境は、例えばウサ
ギの網状赤血球溶解物のような発現を誘発できる混合物
を含む容器であってよい。さもなければ、切片は、宿主
細胞に形質転換、組換え体発現ベクターによるトランス
フェクション、電気穿孔法、すなわち“ジーン ガン”
によって宿主細胞に移すことができる。宿主細胞は、Ｂ
ＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ，Ｈｅｌａ，Ｅ．ｃｏｌｉなどから
選ぶことができる。組換え体発現ベクターには、プロモ
ーターが含まれることがある。プロモーターの態様は、
α４プロモーター、ＵＬ２６．５の生得のプロモータ
ー、および他の原核生物、あるいは真核生物性プロモー
ターである。別の態様においては、核酸セグメントは、
ヘルペス細胞からゲノム核酸を得、ゲノム核酸内の蛋白
分解部位保持核酸配列を増幅し、該増幅核酸配列を含む
組換え体クローンを調製し、望ましい増幅核酸配列を含
むクローンを選ぶことによって調製することができる。
ウィルスプロテアーゼは、プロテアーゼを含む試料を
得、その試料をホモジナイズし、ホモジネートを分画し
て、プロテアーゼ画分を得ることによって調製すること
もできる。プロテアーゼを含む試料には、例えば、ウィ
ルスが感染した組織のような生体試料が含まれる。
【００５１】５．ヘルペス感染の治療 考えられる治療方式には、局所および全身的治療剤が含
まれる。真皮と表皮の病巣には、プロテアーゼ阻害剤を
含むクリーム、軟膏またはスプレーが考えられる。代替
策としては、静脈注射または注入による全身的処置は、
宿主細胞の潜在ウィルスの再活性化によるウィルスの複
製の有害な勃発を防ぐものと考えられる。 ６．ウィルスと細胞 本発明に使用されるＨＳＶ−１（Ｆ）、ＨＳＶ−２
（Ｇ）、プロトタイプＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２株と
それぞれの性質、およびチミジンキナーゼ欠損ベビーハ
ムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）の維持と増殖は、以前に記
述されており、ここに参考文献によって組込まれてい
る。（Ａｒｓｅｎａｋｉｓら．，１９８６；Ｅｊｅｒｃ
ｉｔｏら，１９６８；ＲｏｚｉｍａｎとＳｐｅａｒ，１
９６８）。 ７．モノクローナル抗体 ＩＣＰ３５とＣＭＶ糖蛋白質Ｂのそれぞれに対するモノ
クローナル抗体Ｈ７２５とＣＨ２８−２は既に以前に記
述されている（Ｂｒａｕｎら．，１９８３，１９８４；
Ｚｗｅｉｇ，１９８０，ＬｉｕとＲｏｉｚｍａｎ，１９
９１も参照のこと）。モノクローナル抗体Ｈ７２５は、
ＨＳＶ−１のＩＣＰ３５と反応するがＨＳＶ−２蛋白質
とは反応しない（Ｂｒａｕｎら，１９８３，１９８
４）。ＣＨ２８−２は、Ｌ．Ｐｅｒｅｉｒａ（Ｌｉｕと
Ｒｏｉｚｍａｎ，１９９１ａ；Ｂｒａｕｎら．，１９８
４）から得られた。代替物として、知られているどのエ
ピトープに対する市販の抗体も使用されることがある。
ＣＨ２８−２は、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）
の糖蛋白質Ｂを標的としたモノクローナル抗体である。
この抗体のエピトープは、蛋白質の予知されたヌクレオ
チド配列によって合成された部分的に重複した一連のペ
プチドの反応性を検定することによってＮ−ＫＧＱＫＰ
ＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨ−Ｃ，の２０このアミ
ノ酸からなるペプチドであるとマッピングされた。
【００５２】８．Ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写と翻訳 Ｅ ｃｏＲＩまたはＨｉｎｄ ＩＩＩで直線化されたプ
ラスミドＤＮＡテンプレート５μｇを調製し、キャップ
類似体ＧＰＰＧ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ，ＭＡ）の存在下でＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅ
ｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによって推奨される如くＳｐ
６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写された。１μ
ｇの量のＲＮＡｓを、ヌクレアーゼ処理ウサギ網状赤血
球溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＷＩ）と
〔３５Ｓ〕−メチオニン（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｎｅｗ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ）を含む５０μｌの反応
混合液中において１０分間翻訳した。そして翻訳は、次
に崩壊緩衝液（０．０５ＭトリスｐＨ７．０，８．５％
ｖ／ｖ、蔗糖、５％ｖ／ｖ β−メルカプトエタノー
ル、および２％ｖ／ｖナトリウム ドデシル サルフェ
ート）か、シクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ最終濃
度）と種々の濃度のプロテアーゼ阻害剤を含むリン酸緩
衝液中２０倍に希釈することによって停止させた。シク
ロヘキシミドの存在下で６時間反応させた後、混合物を
崩壊緩衝液中で変性させ、ポリアクリルアミドゲル中電
気泳動にかけ、本発明中に記述したように（ＬｉｕとＲ
ｏｚｉｍａｎ，１９９１およびＢｒａｕｎ，１９８４も
参照のこと）電気的にニトロセルローズシートに移し、
Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔフィルムへ露出した。 ９．プラスミドＤＮＡｓでトランスフェクトした細胞の
トランスフェクションと 重感染 トランスフェクションは、ウェルが一般的に１０μｇの
ＤＮＡでトランスフェクトされたことを除きＫｒｉｓｔ
ｉｅとＲｏｚｉｍａｎ（１９８４）によって記述された
ように行った。ＢＨＫ細胞の６穴Ｃｏｓｔａｒ（Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）プレート培養はウェルあたり
約１０６の細胞を含んでいた。大半の実験においては、
結果において述べられているように、トランスフェクシ
ョンの１８から２０時間後に細胞あたりＨＳＶ−１
（Ｆ）か、ＨＳＶ−２（Ｇ）に暴露した。細胞をウィル
スに１０℃で２時間暴露した後、イノキュラムを１０％
ウシ胎児血清を補添したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグ
ル培地で置換し、細胞を３４℃、３７℃または３９℃で
２０時間インキュベートした。ウィルス感染を含まなか
った実験では細胞はトランスフェクション後４０−４２
時間後に収穫した。感染から２０時間後において、細胞
は１ｍｌの培地（１％仔牛血清を補添したメチオニンな
しの１９９）中５０μＣｉの３５Ｓメチオニンで２０時
間標識した。収穫した細胞をリン酸塩緩衝化食塩水で１
度洗い、ＤｕＰｏｎｔ遠心機中ＳＳ３４Ｓｏｒｖａｌｌ
ロータースパンで、約４，０００ｒｐｍで５分間遠心分
離することによってペレットとなし、崩壊緩衝液中に懸
濁させ、氷中で２０秒間超音波処理し、そして１分間煮
沸してから変性ゲル中で電気泳動分離を行った。（Ｌｉ
ｕとＲｏｉｚｍａｎ，１９９１ａとｂ；Ｅｊｅｒｃｉｔ
ｏら．，１９６８も参照のこと） １０．電気泳動による分離とモノクローナル抗体での感
染細胞の蛋白質の染色 細胞溶解物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳からの変
性、溶解させたポリペプチドを、ＧｉｂｓｏｎとＲｏｉ
ｚｍａｎ（１９７２，１９７４），とＢｒａｕｎら（１
９８４）によって記述されたようにＮ，Ｎ′−ジアリル
タルタルジアミドで架橋された９．５％または１２％
（ｖ／ｖ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離
した。ＢＨＫ細胞から分離されたポリペプチドを電気的
にニトロセルローズ膜へ移した。そして、エンザイム結
合イムノアッセイにおいて、セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅ
ｉｇｈｔｓ，ＩＬ）と結合した抗−マウスＩｇＧのみ
と、または、ＨＳＶ−１、ＩＣＰ３５に対するモノクロ
ーナル抗体Ｈ７２５、または、以前に記述されたように
（Ｂｒａｕｎら．，１９８４）ＣＭＶエピトープに対す
るモノクローナル抗体ＣＨ２８−２に加えてこの抗−マ
ウスＩｇＧと反応させた。網状赤血球溶解物から翻訳さ
れた分離ポリペプチドを含むゲルを乾燥し、Ｋｏｄａｋ
Ｘ−Ｏｍａｔフィルムへ露出した。
【００５３】１１．原形質ＲＮＡの単離とＳ１分析 原形質ＲＮＡを、ＪｅｎｋｉｎｓとＨｏｗｅｔｔ（１９
８４）によって以前に記述された如く、偽装感染させた
か、細胞あたり２０ＰＦＵのＨＳＶ−１（Ｆ）で感染さ
せたＶｅｒｏ細胞から精製し、１２時間維持した。ＨＳ
Ｖ−１ ＤＮＡプローブ（０．０２ｐ ｍｏｌ）は、
〔γ３２Ｐ〕ＡＴＰ（Ｄｕｐｏｎｔ，ＮＥＮＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で標識した５′末端であ
り、全細胞質ＲＮＡの５０μｇとハイブリッドを形成さ
せ、ＳＩヌクレアーゼで消化し、８Ｍ尿素の存在下で７
％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。（Ｊｅｎｋｉ
ｎｓとＨｏｗｅｔｔ，１９８４）。
【００５４】１２．本発明の蛋白質を調製する方法 組換え体ベクターは、多量のプロテアーゼまたは、ＩＣ
Ｐ３５をコードするＤＮＡ自身を調製するための手段と
して、または、コードされた蛋白質を調製する手段とし
て有用である。発明の蛋白質が組換え体の技術から作ら
れる場合には、人々は、原核生物、もしくは真核生物の
発現系を使用すると考えられる。真核宿主中のヘルペス
核酸の発現が考えられる場合には、ｐＣＭＶ４のような
ｐＣＭＶシリーズのベクターによって例証されるような
真核生物の複製の開始点に組み込まれるプラスミドのよ
うなベクターを使用することが望ましいと考えられる。
その上、真核生物システム中での発現の目的のために
は、人々は、プロテアーゼやＩＣＰ３５をコードする配
列を、ＳＶ４０、またはＣＭＶプロモーターのような効
果的な真核生物のプロモーターに隣接して位置をとり、
その制御下に置きたいと考えるであろう。それが真核生
物の、あるいは原核生物性のプロモーターであるにせ
よ、コーディング配列をプロモーターの制御下に置くた
めに一般的に必要であることのすべては、その蛋白質の
転写読み取枠の転写開始部位の５′末端を選ばれたプロ
モーターの約１から５０ヌクレオチド下流に位置させる
ことである。さらに、真核生物発現が考えられるところ
では、人々は、望ましいペプチドまたは蛋白質と適切な
ポリアデニル化部位（例えば５′−ＡＡＴＡＡＡ−
３′）を含む転写単位を組込みたいと考える。典型的に
はポリＡ部位は転写停止の前の位置にある蛋白質の停止
部位の約３０から２０００ヌクレオチド“下流”に位置
している。前記のすべてを含み、本発明のヘルペス遺伝
子がさしたる困難もなく挿入することができる有用な真
菌生物ベクターがよく知られている。例えば、適切なベ
クターにはｐＣＤとｐＣＭＶがあり、最も好ましい系は
ｐＣＭＶである。ｐＣＤとｐＣＭＶベクターの外に、他
の好ましい真菌生物性発現ベクターには、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ＬＫＢ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．からのｐＭＳＧとｐＳＶＬが含まれ
る。これらはＭＭＴＶとＳＶ４０の後期プロモーターを
それぞれ利用する。図１に示されているようなヘルペス
蛋白質の全読み取り枠を組込むｃＤＮＡは、コードされ
たＩＣＰ３５前駆物質の翻訳を開始する開始コドン（Ａ
ＴＧ）の“上流”（つまり５′側の）のＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ制限部位（ＡＡＧＣＴＴ）を経て前記ベクターの１つ
に容易に導入されることができる。事実上、常用される
真核生物性宿主細胞のいずれも、本発明に従ったヘルペ
ス遺伝子の発現と関連して使用できると考えられる。例
としては、ＡｔＴ−２０，ＨｅｐＧ２，ＶＥＲＯ，Ｈｅ
Ｌａ．ＣＨＯ，ＷＩ３８，ＢＨＫ，ＣＯＳ−７ ＲＩＮ
およびＭＤＣＫ細胞系のような、真核生物の発現のため
に典型的に用いられた系が含まれる。本発明の真菌細胞
発現の態様において使用されるより好ましい細胞系はＢ
ＨＫシステムである。原核生物による発現は、望まれる
場合には用いることができる代替である。たとえ必要と
されないとしても、原核生物による発現が考えられる場
合には、人々は一般的に、さらなる処理工程が必要とさ
れないように、図１における態様によって代表される望
まれるペプチドそれ自身だけに相当する読み取り枠を組
込む転写単位を用いることを熱望する。典型的には、使
用されることがある原核生物性プロモーターには、Ｐ
Ｌ，Ｔ７およびｌａｃプロモーターがあり、Ｔ７が一般
的に好ましい。他の好ましいバクテリア性発現ベクター
には、ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙから得られるプラスミドＰＫＫ２３３−２とＰＫＫ２
３３−３が含まれる。これらは、それぞれｔａｃとｔｒ
ｃプロモーターを利用する。勿論、真核生物のフックア
ップと発現が使用されるときでさえ、人々は、それにも
かかわらず、原核細胞系で作動する選択的マーカーと同
様に発現の原核細胞性開始点を含め、配列を原核生物で
の構築から真核生物での発現への“シャトリング”がで
きるようにしたいと強く望む。ある態様においては、人
々は、化学的合成または無細胞系リボゾーム“機械”に
よるような非組換え体合成手段により本発明にしたがっ
てヘルペス蛋白質やペプチドを簡単に調製することを強
く望むことがあると思われる。適切なペプチドシンセサ
イザーは市販されており（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）、使用することができる。本発明のある態
様においては、図１からの配列を組み込む比較的短い
か、比較的長いかの、両方のＤＮＡ断片は、短い活性ペ
プチドの調製における、あるいは例えばクローンバンク
をスクリーニングする短いＤＮＡ断片としての使用を含
めてさらなる有用性が見出されている。いずれにせよ、
１４−２０程度の短いヌクレオチド鎖に相当する図１の
配列に相当する断片は、これらまたはその他の態様にし
たがって有用性が見出される。図１あるいはそれらの相
補体の核酸セグメントと共通な少くとも１４この範囲を
持つことによって、ＤＮＡのセグメントは、特に０．１
５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、
ｐＨ７．４で５０℃といったよりきびしい条件ではヘル
ペス種のＤＮＡと優先的にハイブリッドを形成する能力
がある。約１４程度の長さの相補的または共通なヌクレ
オチドは、安定なハイブリッドを形成する能力を確保す
るが、もっと長い相補性のヌクレオチドの方が、ある使
用のためにはもっと望ましいことが照明されることがあ
る。したがって、ある使用については、人々は例えば１
８、２２または２５さえのより長い範囲の相補性が組込
まれたＤＮＡ切片を熱望すると思われる。
【００５５】１３．本発明の蛋白質に対する抗体 他の態様においては、本発明は、組換え体か、非組換え
体的に調製されたヘルペスプロテアーゼとそれから誘導
された蛋白質に対する抗体の調製に関する。例えば、図
１のヘルペスプロテアーゼ、またはウシまたはブタのよ
うなヒト以外の種に対して調製された抗体は、特に減弱
した強さのイムノ結合が望ましい態様においてヒトの蛋
白質種に対して調製された抗体よりもある種の利点があ
ると考えられる。本発明のモノクローナル抗体を含む組
成物は、最初にげっ歯類の脾細胞を同じげっ歯類の種か
らの骨髄腫細胞と融合させることによって調製すること
ができる。その場合脾細胞を提供するげっ歯類は、ヘル
ペスペプチド、前駆体、もしくは関連ペプチドで免疫さ
れている。特に人々が図１のヘルペスプロテアーゼに対
する抗体を作ることを求める場合では、利用されるげっ
歯類の種は一般的にマウスである。勿論、構造的変異を
組込むプロテアーゼが調製される場合には、人々は興味
のある種にしたがってハイブリドーマシステムを首尾よ
く使用することができるようである。その上、本発明
は、抗原的にＨＳＶ−１のそれと交差反応性であること
が見出される可能性があるプロテアーゼを他の種から単
離する方法を提供する。この方法には、それにプロテア
ーゼに対する抗体を付着させた免疫吸着剤を調製するこ
とが含まれる。多数の免疫吸着剤物質は、この技術に熟
達している人々にとって知られており、例えばＡｆｆｉ
−Ｇｅｌ、Ｃｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、蛋白質Ａ＝Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅおよび他のよく知られた免疫吸着技術が
含まれる。これらの技術は、すべて本発明に適用するこ
とができ、イムノ交差反応種の単離に役立つことが分る
はずである（さらに完全なリストについては、本発明に
参考として組み入れられたＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈ
ｎＧ．Ｈｕｒｒｅｌｌ，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，
１９８２を参照のこと）。その上、本発明にしたがって
キットを用意し、生体検体中の、ヘルペスプロテアー
ゼ、および関連プロテアーゼの臨床的検出ができるよう
にすることが可能である。免疫検出試薬は、抗体／抗原
複合体の生成を検出したり、定量したりするすべての試
薬と定義される。典型的な免疫検出試薬には、放射性標
識されたか、酵素標識された抗原、もしくは抗体の使用
が含まれる。標識された抗体を組み込む技術には、例え
ば、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）およびエリザ（エ
ンザイム結合イムノアッセイ）が含まれる。しかし、本
発明にしたがって免疫検出キットにおいて使用される可
能性がある多数の他の技術が知られている。適切な技術
を教える特許には、例えば、米国特許４，４４６，２３
２；４，４０７，９４３；４，３９９，２９９；および
４５４，２３３がある。
【００５６】したがって、エリザ技術に基く典型的な検
出キットには、抗−ヘルペスプロテアーゼモノクローナ
ル抗体、もしくは精製プロテアーゼ抗原（その場合は人
々は循環している抗体を検出することを求める）、そし
て精製された抗原、もしくは抗−プロテアーゼ抗体と特
異的に免疫反応することができる２番目の“免疫検出”
抗体が含まれ得る。２番目の抗体は、それに結合した、
例えば付着した、ペルオキシダーゼ、酵素の呈色反応活
性を持つことが可能である。このようなやり方で２番目
の“免疫検出”抗体が使用されるとき、人々は、一般的
に試験されるべき生体試料、例えば、血清、血漿、尿、
または組織試料と抗体との間に先づ免疫複合体を形成す
る。このような免疫複合体を形成した後、免疫検出抗体
を加え、プロテアーゼ結合抗体と定量的に反応させる。
この複合体形成は次にペルオキシダーゼ比色検定によっ
て定量される。上記の二重抗体技術を使用する代りに、
酵素または放射性リガンドを抗プロテアーゼ抗体上に直
接合体させてもよい。そして定量はこの直接的に標識し
た抗体の使用で直接に行われる。前述の型のキットと方
法はよく知られており、一般的に、患者から生体試料を
得て、その生体試料を、抗体／抗原複合体の生成を促進
する条件下で抗−ヘルペスプロテアーゼ、モノクローナ
ル抗体と接触させ、モノクローナル抗体と試料の間の特
異的免疫反応の生成を検出する段階を含むものとして見
ることができる。プロテアーゼ、またはそのセグメント
に結合したとき、プロテアーゼの蛋白分解能を無作用性
にする中和抗体も考えられる。
【００５７】１４．宿主培養とベクター 一般的には、ＤＮＡ配列の初期クローニングと本発明に
おいて有用なベクターを構築するためには原核生物が望
ましい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４（Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．３１４４６０）は特別に有用である。使
用されることがある他の微生物菌株のなかには、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ Ｂ、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＴ
Ｃ Ｎｏ．３１５３７）などのＥ．ｃｏｌｉ菌株があ
る。これらの例は例証として意図されており、それによ
って制限を受けるという意味ではない。原核生物は、発
現にも使用される。上記の菌株ならびにＥ．ｃｏｌｉ
Ｗ３１１０（Ｆ−，λ−，原栄養株性，ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．２７３３２５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｓのようなバチルス属Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍやＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎ
ｓのような他の腸内細菌および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ種が使用され得る。一般的には、宿主細胞と適合
性である種から由来するレプリコンと調節配列を含むプ
ラスミドベクターが、これらの宿主と共に使用される。
ベクターは、通常、複製部位を担っていると同時に形質
転換細胞中表現系の選択を提供することができるマーカ
ー配列を担っている。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的
には、ｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。Ｅ．Ｃ
ｏｌｉ種ｐＢＲ３２２に由来するこのプラスミドは、ア
ンピシリンとテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、し
たがって形質転換細胞を同定する容易な方法を提供す
る。このｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミ
ド、またはファージもそれ自身の蛋白質の発現のために
微生物によって使用されることができるプロモーターを
含まなければならないか、それらを含むように改変され
なければならない。組換え体ＤＮＡ構築に最も普通に使
用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシ
リナーゼ）とラクトースプロモーターシステムおよびト
リプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステムがある。
これらは最も普通に使用されるが、他の微生物プロモー
ターが発見され、利用されている。それらのヌクレオチ
ド配列についての詳細が発表され、熟練した研究者がそ
れらを機能的にプラスミドベクターと結合させることが
できるようになった。
【００５８】原核生物に加えて、酵母の培養物のよう
な、真核微生物も使用されることがある。多数の他の菌
株が普通に利用されるけれども、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち普通のパン酵
母、が真核微生物の中で最も普通に使用される。Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現のためには、例えば
プラスミドＹｒｐ７が最も普通に使用されている。この
プラスミドは、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６また
はＰＥＰ４−１のようにトリプトファン中で生育する能
力を欠いている酵母の変異株に対する選択マーカーを提
供するｔｒｐｌ遺伝子を既に含んでいる。そうすると、
宿主酵母細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ障害の存在
は、トリプトファン不在における成長によって形質転換
を検出するための効果的な環境を提供する。酵母ベクタ
ー中の適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセ
リン酸キナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピ
ルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフラクト−キナー
ゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホ
グリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリリン
酸イソメラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、およびグ
ルコキナーゼのような他の解糖系酵素に対するプロモー
ターがある。適切な発現プラスミドを構築する上で、こ
れらの遺伝子と関連した停止配列も、メッセンジャーＲ
ＮＡの停止のポリアデニル化を提供するために、発現し
たい配列の発現ベクターの３′に連結される。成長条件
によって制御された転写のさらなる利点を有する他のプ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連し
た酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトースの
利用を司る酵素のためのプロモーター領域である。酵母
に適合性のプロモーター、複製の開始点および停止配列
を含むいずれのプラスミドも適切である。
【００５９】微生物の外に、多細胞性生物由来の細胞培
養も宿主として使用されることがある。原理的には、脊
椎動物、無脊椎動物からの培養のいずれにせよ、どのこ
のような細胞も有効である。しかし、脊椎動物細胞につ
いての関心が最大となっており、培養（組織培養）にお
ける脊椎動物細胞の増殖が近年においては日常的手法と
なっている。このような有用な宿主細胞の例は、ＡｔＴ
−２０ＶＥＲＯとＨｅＬａ細胞、チャイニーズ ハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞系およびＷ１３８，ＢＨＫ，Ｃ
ＯＳ−７ ２９３およびＭＤＣＫ細胞系である。このよ
うな細胞のための発現ベクターには、通常、（必要なら
ば）必要なリボゾームの結合部位、ＲＮＡスプライス部
位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列と共
に、複製の開始点と発現されるべき遺伝子の前に位置し
たプロモーターを含む。哺乳動物細胞に使用するために
は、発現ベクターについての調節機能は、ウィルスの物
質によって提供されることが多い。例えば、普通に使用
されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス
２、サイトメガロウィルスそして最も頻繁にＳｉｍｉａ
ｎ（サル）Ｖｉｒｕｓ４０（ＳＶ４０）に由来してい
る。ＳＶ４０の前期および後期プロモーターは、両者と
も、ＳＶ４０のウィルスの複製開始点も含む断片として
ウィルスから容易に得られるので特に有用である。Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ部位からウィルスの複製の開始点に位置して
いるＢｇｌ部位に向って広がっている約２５０の塩基対
が含まれていることを条件として、もっと小さいか、ま
たはもっと大きいＳＶ４０断片も使用されることがあ
る。さらに、このような制御配列が宿主細胞系と適合性
であるならば、望ましい遺伝子配列と正常に関連してい
るプロモーター、または制御配列を利用することも可能
であり、望ましいことが多い。複製の開始は、ＳＶ４０
か、他のウィルス（例えば、Ｐｏｌｙｏｍａ，Ａｄｅｎ
ｏ，ＨＳＶ，ＢＰＶ，ＣＭＶ）源から由来するような外
来の開始点を構築することによるか、宿主細胞の染色体
複製の機序によって提供されることがある。ベクター
が、宿主細胞の染色体に統合されるならば、後者が十分
であることが多い。
【００６０】１５．セリンプロテアーゼ、ＩＣＰ３５蛋
白質、またはそれらの生物学的機能性の等価体をコード
することができる配列を検出するための核酸によるハイ
ブリッド形成 本発明によって提供される核酸配列情報によって、プロ
テアーゼの少くとも蛋白質分解領域、またはＩＣＰ３５
問題の開裂部位をコードすることができる遺伝子配列と
特異的にハイブリッドを形成する能力を持つ比較的短い
ＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列を調製することができるよ
うになる。これらの面において適切な長さの核酸のプロ
ーブが図１において示される配列の考慮に基いて調製さ
れる。このような核酸のプローブが、プロテアーゼやＩ
ＣＰ３５の遺伝子配列に対して特異的にハイブリッド形
成する能力のため、様々な態様においてそれらに特別な
有用性が付与されている。該プローブが与えられた試料
における相補性配列の存在を検出するための種々の検定
において使用することができることが最も重要である。
変異種プライマー、または他の遺伝子構造体を調製する
のに使用するプライマーの調製のために配列情報を使用
することを含む他の使用が考えられる。本発明にしたが
ってある便益を提供するためにはハイブリッド形成の研
究、または、検定のために使用される好ましい核酸配列
は、図１に示される配列のうち少くとも１４この塩基ヌ
クレオチドの長さに相補的な配列を含む。長さが少くと
も１４このヌクレオチドの大きさが、該断片が、安定で
あると同時に選択的である二本鎖分子を形成するのに足
る長さであることを確保することに役立つ。このような
断片は、例えば化学的手段によって、直接的に断片を合
成することにより、米国特許４，６０３，１０２のＰＣ
Ｒ技術のような核酸再生の適用により、もしくは、組換
え体産生のために組換え体ベクターに選ばれた配列を導
入することによって容易に調製することができる。１８
から２５、もしくは３０から４０の塩基までさえ、およ
び完全遺伝子（単数または複数）をコードするに足る全
大きさまでのセグメントも本発明の範囲内にある。した
がって、本発明のヌクレオチド配列はそれらが相補的な
遺伝子鎖と選択的に２本鎖を形成することができるため
に重要である。考えられる適用次第で、種々のハイブリ
ッド形成条件を用いて標的配列に対する選択性の程度が
種々異なるプローブを作ることができる。高度な選択性
を必要とする適用については、例えば、５０℃から７０
℃の温度における０．０２Ｍ−０．１５ＭのＮａＣｌに
よって提供されるような比較的低塩濃度そして／または
高温条件を選んだ比較的厳格な条件を用いてハイブリッ
ドを形成することができる。これらの条件は、格別に選
択的であり、プローブとテンプレートまたは標的ストラ
ンドとの間の不適当な組合わせを殆ど起すことはない。
【００６１】例えば、基礎テンプレートに対してハイブ
リッドを形成した変異プライマー鎖を使用する変異体の
調製のような若干の適用には、あるいは、関連種、機能
的相当物といったものからプロテアーゼ、またはＩＣＰ
３５をコードする配列を単離するためには、ヘテロ二重
鎖の形成を許すためには、勿論、厳密度がもっとゆるや
かなハイブリッド形成条件が要求される。これらの状況
では、使用される条件は、例えば、０．１５Ｍ−０．９
Ｍの塩、２０℃から５５℃の範囲の温度であろう。それ
によって交差ハイブリッド形成は、対照ハイブリッド形
成に関する陽性にハイブリッドを形成するシグナルとし
て容易に同定することができる。いずれにせよ、条件は
ホルムアミドの添加量を増すことによってより厳格にす
ることができることは一般的に評価されている。ホルム
アミドは、温度を増加させるのと同じ仕方でハイブリッ
ドを二重鎖を不安定化するのに役立つ。したがって、ハ
イブリッド形成条件は容易に操作することができ、この
ようにして、一般的に、望まれる結果次第で選択を行う
方法となっている。ある態様においては、本発明の核酸
配列をハイブリッド形成を決定する標識のような適切な
手段と組合せて使用することが有利である。放射性や酵
素的、またはアビジン／ビオチンのような他のリガンド
を含む広い範囲の適切な指標手段が知られており、それ
らは検出し得るシグナルを与えることができる。より好
ましい診断的態様においては、ウレアーゼ、アルカリ性
ホスファターゼ、もしくはペルオキシダーゼを、放射
性、または他の環境的に望ましくない試薬の代りに使用
することができる。酵素標識の場合には、相補性核酸を
含む試料と特異的なハイブリッド形成を同定するために
肉眼的に、または分光学的に観測することができる手段
を提供するために使用することができる比色分析のため
の指示基質が知られている。一般的に、本明細中に記述
されるプローブは固相を使用する態様におけると同様に
溶液におけるハイブリッド形成の試薬としても有用であ
ると考えられる。固相を含む態様においては、試薬ＤＮ
Ａ（またはＲＮＡ）は選択された基質または表面に他の
手段で付けられる。この固定した１重鎖核酸を次に望ま
しい条件下で、選ばれたプローブと特異的なハイブリッ
ド形成させる。選ばれる條件は要求される特別な基準に
基く特殊な状況に依存する（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的
核酸、核酸の源、ハイブリッド形成プローブの大きさな
どに依存する）。非特異的に結合したプローブ分子を除
くためにハイブリッド形成表面を洗浄した後、特異的ハ
イブリッド形成を、標識を利用して検出するか、定量さ
えする。細胞抽出物を検出する分子を作る一つの方法
は、蛍光性プローブを使用することである。蛍光プロー
ブはこの技術に熟達した人々にとってよく知られてい
る。一つの方法はフルオレセインで標識したアビジン
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌ
ｉｎｇａｍｅ，Ｃａ）をビオチン標識蛋白質に結合させ
ることである。このシグナルは増強されることがある。
【００６２】本発明は、本発明の実施のための好ましい
様式を含めるために本発明者らによって見出されたり、
提案された特別の態様によって記述されている。この分
野の技術に通暁している人々にとって、例証された特別
な態様において多数の修飾および変化が、本発明の精神
と範囲から離脱することなく、行われ得ることが理解さ
れる。例えば、コドンの重複のため、蛋白質の配列に影
響することなく基礎ＤＮＡを変更することができる。さ
らに生物学的機能等価性の考察によって、蛋白質の構造
を変化させ、なおかつ、有用なプロテアーゼや抗原性サ
ブフラグメントを達成できる。このような修飾のすべて
は添付した請求の範囲内に含めるよう意図されている。
【００６３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００６４】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１ＡはＨＳＶ−ゲノミムの配列及び供試プ
ラスミドの構造を示す。
【図１Ｂ】図１ＢはＵL２６読み取り枠の核酸及びアミ
ノ酸配列を示す。
【図２】図２はＨＳＶ−１ゲノムなどの模式図を示す。
【図３】図３はＤＮＡプローブ１（Ａ）などのオートラ
ジオグラフを示す。
【図４】図４は特定のポリペプチドの写真を示す。
【図５】図５は別の特定のポリペプチドの写真を示す。
【図６】図６はもう一つ別の特定のポリペプチドの写真
を示す。
【図７】図７はある特定のポリペプチドのオートラジオ
グラフを示す。
【図８】図８はある特定のポリペプチドのオートラジオ
グラフを示す。
【図９】図９はある特定のポリペプチドの写真を示す。
【図１０】図１０はある特定のポリペプチドの写真を示
す。
【図１１】図１１はある特定のポリペプチドの写真を示
す。
【図１２】図１２は35Ｓ−メチオニン標識ポリペプチド
のオートラジオグラフを示す。
【図１３】図１３は合成ポリペプチドのオートラジオグ
ラフを示す。
【図１４】図１４は35Ｓ−メチオニン標識ポリペプチド
のオートラジオグラフを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａはある特定のポリペプチドの写真
を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂはある特定のポリペプチドの写真
を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃはある特定のポリペプチドの写真
を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａはある特定のポリペプチドのオー
トラジオグラフを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂはある特定のポリペプチドのオー
トラジオグラフを示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃはある特定のポリペプチドのオー
トラジオグラフを示す。
【図１７】図１７は突然変移試験の手順及びその結果を
示すチャートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/535 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＹ 33/535 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献 ＬＩＵ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＴｈｅＰ ｒｏｍｏｔｅｒ，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｏｎａｌ Ｕｎｉｔ，ａｎｄ Ｃｏｄ ｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ Ｈｅｒ ｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ １ Ｆａｍｉｌｙ 35 Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ Ａｒｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ，米国，Ａｍｅｒｉｃａ ｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．65，Ｎｏ. １，ｐ．206−212 Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，英国, 1988年，Ｖｏｌ．69， ，ｐ．1531− 1574 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/50 ZNA C12N 1/21 C12N 9/99 C12N 15/09 C12Q 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヘルペスウイルスプロテアーゼを阻害す
    ることのできる物質を同定するためのアッセイ方法であ
    って、 （ａ）ＵＬ２６遺伝子の少なくとも領域ＩＩおよびＩＩ
    Ｉによってコードされる精製されたＨＳＶプロテアーゼ
    であって以下に示すアミノ酸配列の１０から３０６番目
    のアミノ酸残基からなるＨＳＶプロテアーゼ、または該
    １０から３０６番目のアミノ酸残基において１個もしく
    は数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加された
    アミノ酸残基からなるタンパク質であって該ＨＳＶプロ
    テアーゼと同様のＨＳＶプロテアーゼ活性を有するタン
    パク質を得て； （ｂ）該プロテアーゼもしくは該タンパク質に、該プロ
    テアーゼもしくは該タンパク質の開裂部位を含む蛋白質
    基質を、該蛋白質基質の蛋白分解が起こるに適した条件
    下で、加えて； （ｃ）該プロテアーゼもしくは該タンパク質に、基質阻
    害候補物質を加えて；次いで （ｄ）該蛋白質基質が開裂したか否かを測定する、 ことからなる上記方法。
  2. 【請求項２】 該ＨＳＶプロテアーゼが全ＵＬ２６遺伝
    子によってコードされる請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 該ＨＳＶプロテアーゼが組換え酵素であ
    る請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 該蛋白質基質がＨＳＶ ＩＣＰ３５であ
    る請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 工程（ｄ）は基質フラグメントの電気泳
    動による検出を含む請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 該基質フラグメントがＩＣＰ３５ｅおよ
    びＩＣＰ３５ｆである請求項５の方法。
  7. 【請求項７】 工程（ａ）は、 （ｉ）ＵＬ２６遺伝子を含む発現ベクターを調製し； 次いで （ｉｉ）該発現ベクターを、コード配列の発現が可能な
    条件下で、適当な宿主細胞中に置くことを含む請求項３
    の方法。
  8. 【請求項８】 工程（ａ）は更に、 （ｉｉｉ）該宿主細胞から該プロテアーゼを得ることを
    含む請求項７の方法。
  9. 【請求項９】 該ＵＬ２６遺伝子は真核プロモーターの
    コントロール下にある請求項７の方法。
  10. 【請求項１０】 該宿主細胞は真核宿主細胞である請求
    項７の方法。
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