JP3368909B2

JP3368909B2 - 新規シスタチンポリペプチド、その製法及び該ポリペプチドを有効成分とする酵素阻害剤

Info

Publication number: JP3368909B2
Application number: JP25253591A
Authority: JP
Inventors: 芳夫小出; 浩司川内; 一郎川添
Original assignee: マルハ株式会社
Priority date: 1991-09-30
Filing date: 1991-09-30
Publication date: 2003-01-20
Anticipated expiration: 2018-01-20
Also published as: JPH05247093A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規シスタチン、その製
造法及び用途に関する。シスタチンは、生体内に存在す
るパパイン、カテプシン等システインを活性中心にもつ
酵素を阻害するポリペプチドであるので、食品及び医薬
品分野において広い用途が期待される。

【０００２】

【従来の技術】シスタチンは、システインを活性中心に
もつ酵素、例えば、植物由来のパパイン、動物細胞内の
カテプシン等を特異的に阻害する酵素阻害剤であり、現
在までに、ヒト、ウシ、ラット、ニワトリの組織に存在
することが報告されている。例えば、Takio, K. らによ
る Biochem. Biophys. Res. Commun., 115, 902 (198
3)、Takio, K. らによる Biochem. Biophys. Res. Comm
un., 121, 149 (1984)、Ritonja, A. らによる Bioche
m. Biophys. Res. Commun., 131, 1187 (1985) 、Isemu
ra, S. らによる J. Biochem., 96, 489, (1984) 、Ab
e, K. らによる J.Biol. Chem., 262, 16793 (1987)、O
hkubo, I.らによる Biochemistry, 23, 5691 (1984) 、
Lee, C.-C.らによる Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 8
4：4403 (1987)等である。これらの報告によればシス
タチンはその由来より構造及び阻害活性にそれぞれ相違
がある。しかし、魚類からシスタチンを抽出精製した例
はない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】生鮮食品、特に魚類は
体内の酵素により自己消化が進み、変質しやすく、その
鮮度保持は大きな課題である。そのため、保存剤等によ
り自己消化を抑制している。しかし、保存料として用い
られる多くの合成保存料には長期にわたる安全性におい
て種々の問題点が指摘されている。この目的のため、自
己消化を抑制する酵素阻害剤を保存料として用いること
が検討されている。

【０００４】一方、近年人間のウイルス感染による疾病
に関するウイルスがヒト細胞内での自己のタンパク合成
においてプレプロタンパクを合成し、システインを活性
中心にもつ酵素等のプロセッシングにより成熟タンパク
を得ていることが判ってきた。このことより、システイ
ンを活性中心にもつ酵素の阻害剤がウイルスの増殖を抑
制する医薬品として期待されている。

【０００５】これらの目的のため、シスタチンの応用が
考えられている。他方、アミノ酸配列が決定されている
既知のシスタチンポリペプチドのシステインを活性中心
にもつ酵素の阻害活性を比較すると力価に相違がある。
従って、より高い力価のシスタチンポリペプチドの開発
が望まれる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の新規ポリペプチ
ドは、配列番号１で示されるものである。本発明のポリ
ペプチドは、サケ、例えばシロサケの脳下垂体より抽出
・精製することにより製造することができる。かかる製
造法において、抽出溶媒としては、エタノール等が用い
られる。また、精製法としては、各種クロマトグラフィ
ーが用いられ、この際シスタチン活性が指標となる。

【０００７】更に、本発明は、配列番号１で示されるポ
リペプチドを有効成分とする酵素阻害剤にある。本発明
のシスタチンポリペプチドとして魚類から初めて得られ
たものである。また、脳下垂体からの製造も、これま
で、哺乳類等で発見されているシスタチンポリペプチド
が脳、皮膚表皮、血液及び髄液等からで、初めてであ
る。従って、多種類のシステイン酵素に対する力価が、
本発明のシスタチンポリペプチドと、既知のシスタチン
ポリペプチドとの相違が考えられる。

【０００８】

【実施例】以下、実施例及び参考例により本発明を更に
詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらにより
限定されるものではない。

【０００９】

【参考例】活性測定法シスタチンの活性測定は Barrettらの方法 (Methods in
Enzymology, Vol 80,pp771-778)を用いた。即ち、酵素
としてパパイン、基質として Bz-DL-Arg-p-ニトロアニ
リドを用いた。基質溶液１ml (Bz-DL-Arg-p- ニトロア
ニリドの43.5mgをDMSO 1mlに溶解し、２mM エチレンジ
アミノ四酢酸(EDTA)及び５mM システインを加えた 50m
M トリス塩酸緩衝液、pH7.５で１00mlとした。) にパパ
イン溶液0.１ml (パパイン濃度：パパイン0.５mg/ml
水) 及びシスタチン溶液0.１ml (シスタチン濃度：シス
タチン0.05〜0.１mg/ml 水) を加え、37℃で25分間反応
させ、30％酢酸水溶液0.２ml添加により反応を停止し、
410nm の吸光度で測定した。

【００１０】

【実施例１】（１）抽出・精製法参考例にもとづいて、シスタチンの活性を指標にしなが
らシスタチンの精製を行った。液体窒素で凍結し、−80
℃で冷凍保存した、雌のシロサケ脳下垂体30ｇを、１00
mlのエタノール抽出液 (35％エタノール、10％酢酸アン
モニウム、1.5mMEDTA、1.５mM PMSF(フッ化フェニルメ
チルスルホニル）、pH6.１) ４℃で14時間抽出を行い、
３00mlの冷エタノールに上清を加え攪拌後４℃で24時間
放置し沈澱を凍結乾燥しエタノール抽出物を得た。

【００１１】エタノール抽出物をDE-52 陰イオン交換ク
ロマトグラフィー (カラムサイズ：１×30cm) に付し
た。溶出は0.05M 重炭酸アンモニウム、pH9.０、流速は
１時間に60ml、吸光度を280nm で測定し、各画分を凍結
乾燥した (図１) 。DE-52 の素通り画分、フラクション
１ (図１、参照) 170mg にシスタチン活性が特異的に確
認されたので、このフラクションを、CM−セファデック
ス C-50 (カラムサイズ：１×30cm) 陽イオン交換クロ
マトグラフィーに付した。溶出は0.05M 酢酸アンモニウ
ム (pH4.6)、0.１M (pH4.6) 、0.２M (pH9.0) のステッ
プワイズ法で行った。流速は１時間に60ml、吸光度を28
0nm で測定し、各画分を凍結乾燥した (図２) 。

【００１２】CM−セファデックス C-50 カラム画分、フ
ラクション５ (図２、参照) 51.7mgにシスタチン活性が
特異的に確認されたので、このフラクションを0.05M 重
炭酸アンモニウム、pH9.０により平衡化したセファデッ
クスG-75SF (カラムサイズ：2.２×90cm) でゲル濾過し
た。溶出は0.05M 重炭酸アンモニウム、pH9.０、流速は
１時間に20mlとし、前流を120ml 分取した。各画分は凍
結乾燥した (図３) 。

【００１３】セファデックス G-75SF カラム画分、フラ
クション３ (図３、参照) １mgにシスタチン活性が特異
的に確認されたので、このフラクションを0.１％トリフ
ルオロ酢酸 (TFA)に溶かし、 TSKゲルODS-120T (カラム
サイズ：0.46×25cm) 逆相高速液体クロマトグラフィー
に付した。カラム温度は40℃にし、溶出は、0.１％ TFA
を含むアセトニトリル溶液20％から50％の直線濃度勾配
で行った。流速は１時間に60ml、吸光度を220nm で測定
し、各画分を凍結乾燥した (図４) 。シスタチン活性は
フラクション15に特異的に確認された。フラクション15
(図４、参照)はパパインの酵素活性を50％阻害した
(図５) 。（２）構造決定法−１上記（１）に従い単離したシスタチンポリペプチドのピ
リジルエチル化は、シスタチンポリペプチド１00μg に
0.２％の濃度に調製したEDTAと６M の濃度に調製した塩
酸グアニジンを含む1.５M トリス塩酸緩衝液 (pH8.６)
30μl を加え溶解し、DTT （ジチオスレイトール）10μ
l を加えて４時間還元後、４−ビニルピリジン１μl を
加えて行った。脱塩は、反応溶液にギ酸４μl を加えた
後、TSKgel ODS-120T (0.45×25cm) 逆相高速液体クロ
マトグラフィーで行った。溶出は、0.１％ TFAを含む10
％〜80％のアセトニトリル溶液の直線濃度勾配法で行っ
た。（３）構造決定法−２上記（２）に従い還元ピリジルエチル化したシスタチン
ポリペプチドを0.１M重炭酸アンモニウム (pH8.0) 200
μl に溶解し、基質／酵素の比が1/60になるようにリジ
ルエンドペプチダーゼ (和光純薬 Lot NO. CTP9276) を
加え、37℃で18時間消化した。消化後、消化物を TSKゲ
ルODS-120T (0.46×25cm) 逆相高速液体クロマトグラフ
ィーに付した。各フラグメントペプチドの溶出は、0.１
％ TFAを含む５〜50％イソプロパノール溶液の90分の直
線濃度勾配で行った。カラム温度は40℃、流速は１時間
に30ml、吸光度を210nm で測定し、各画分を凍結乾燥し
た(図６) 。（４）構造決定法−３シスタチンポリペプチドを70％ギ酸水溶液２00μl に溶
解後、臭化シアン１00μg を加え室温で24時間インキュ
ベートした。分解物を TSKゲルODS- 120T (0.46×25c
m) 逆相高速液体クロマトグラフィーに付した。各フラ
グメントペプチドの溶出は、0.１％ TFAを含む５〜50％
イソプロパノール溶液の90分の直線濃度勾配で行った。
カラム温度は40℃、流速は１時間に30ml、吸光度を210n
m で測定し、各画分を凍結乾燥した。（５）構造決定法−４上記（２）に従い還元ピリジルエチル化したシスタチ
ン、上記（３）に従いリジルエンドペプチダーゼ消化し
て得られた各フラグメント及び上記（４）に従い臭化シ
アン分解して得られた各フラグメントのアミノ酸配列
を、気相自動アミノ酸配列分析装置 (島津 PSQ-1) にて
全構造を決定した (図７) 。

【００１４】

【発明の効果】本発明によれば、酵素阻害剤として有用
な新規シスタチンポリペプチドを提供することができ
た。

【００１５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：110 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列： Gly Leu Ile Gly Gly Pro Met Asp Ala Asn Met Asn Asp Gln Gly 15 Thr Arg Gln Ala Leu Gln Phe Ala Val Val Glu His Asn Lys Lys 30 Thr Asn Asp Met Phe Val Arg Gln Val Ala Lys Val Val Asn Ala 45 Gln Lys Gln Val Val Ser Gly Met Lys Tyr Ile Phe Thr Val Gln 60 Met Gly Arg Thr Pro Cys Arg Lys Gly Gly Asn Glu Lys Ile Cys 75 Ser Val His Lys Asp Pro Gln Met Ala Val Pro Tyr Lys Cys Thr 90 Phe Glu Val Trp Ser Arg Pro Trp Met Ser Gly Ile Lys Met Val 105 Lys Asn Gln Cys Glu 110

【図面の簡単な説明】

【図１】DE-52 陰イオン交換クロマトグラフィーの結果
を示す図。

【図２】CM- セファデックスC-50陽イオン交換クロマト
グラフィーの結果を示す図。

【図３】セファデックスG-75SFを用いたゲル濾過の結果
を示す図。

【図４】TSK ゲルODS-120T逆相高速液体クロマトグラフ
ィーの結果を示す図。

【図５】本発明のシスタチンポリペプチドのパパインに
対する阻害作用を示す図。

【図６】TSK ゲルODS-120T逆相高速液体クロマトグラフ
ィーの結果を示す図。

【図７】気相自動アミノ酸配列分析装置による構造決定
の結果を示す図。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 - 14/825 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で示されるアミノ酸配列を含
み、パパインの酵素活性を阻害するポリペプチド。
【請求項２】サケ脳下垂体より、抽出・精製すること
を特徴とする請求項１記載のポリペプチドの製造法。
【請求項３】サケがシロサケである請求項２記載の製
造法。
【請求項４】請求項１記載のポリペプチドを有効成分
とする酵素阻害剤。