JP3408526B2 - 哺乳類ホスホジエステラーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

哺乳類ホスホジエステラーゼをコードするｄｎａ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、哺乳類Ca2+／カルモジ
ュリン刺激ホスホジエステラーゼ(CaM-PDEs)およびサイ
クリック-GMP-刺激ホスホジエステラーゼ(cGS-PDEs)を
コードする新規の精製され、単離されたヌクレオチド配
列に関する。 また、前記ヌクレオチド配列に対応する
組み換え発現物質、該物質に特異的に反応する免疫学的
試薬、およびかような発現物質の酵素活性を調節する化
合物を同定するための方法も提供される。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする問題点】サ
イクリック・ヌクレオチドは、生物化学的刺激物質を多
種多様の細胞性反応に介在するとして知られている。
サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ(P
DEs)は、サイクリック・アデノシン・モノホスフェート
(cAMP)や、サイクリック・グアノシン・モノホスフェー
ト(cGMP)などの3'、5'サイクリック・ヌクレオチドの、
対応する 5'-ヌクレオチド・モノホスフェートへの加水
分解を触媒し、従って、サイクリック・ヌクレオチドの
細胞性濃度の調節において重要である。 一方、PDEs
は、トランスメンブラン・シグナルもしくはカルシウム
・イオン (Ca2+) あるいはcGMPなどの第二メッセンジャ
ー物質により調節される。
【０００３】そして、PDEsは、細胞外ホルモン、神経伝
達物質、あるいはメッセンジャーとしてサイクリック・
ヌクレオチドを用いる他のシグナルからの情報の流れを
調節する際の中心的役割を果たす。
【０００４】PDEsは、大きく、複雑な酵素の集団であ
る。 それらは、ほとんどの真核生物の細胞および組織
全体に分布しているが、普通は、微量でしか存在してい
ない。
【０００５】少なくとも五つの異なる科が、基質特異
性、動力学的特性、細胞性調節条件、大きさ、ある場合
には、選択的阻害剤による調整、などの特徴を基にして
記されている。 [Beavo, Adv. in Second Mess. and P
rot. Phosph. Res. 22: 1-38 (1988)] 。 この五つの
科とは、次のものを含む。
【０００６】Ｉ Ca2+／カルモジュリン−刺激 II cGMP−刺激 III cGMP−阻害 IV cAMP−特異性 Ｖ cGMP−特異性 各科には、密接に関連したPDEsの複数の形態がある。
Cyclic NucleotidePhosphodiesterase: Structure, Reg
ulation and Drug Action, Beavo, J. andHouslay, M.
D., Eds.; John Wiley & Sons, New York (1990) にあ
る、Beavo,"Multiple Phosphodiesterase Isozymes Bac
kground, Numenclature and Implications", pp. 3-15;
Wang et al., "Calmodulin-Stimulated Cyclic Nucleo
tidePhosphodiesterases", pp.19-59; およびManganiel
lo et al., "Cyclic GMP-Stimulated Cyclic Nucleotid
e Phosphodiesterases", pp.62-85 を参照のこと。
【０００７】Ca2+／カルモジュリン依存性PDEs(CaM-PDE
s)は、cAMPおよび／またはcGMPの細胞内濃度の減少をも
たらす細胞内カルシウムに対する反応により特徴付けら
れる。
【０００８】cGMP−刺激ホスホジエステラーゼ(cGS-PDE
s)に特有の特徴は、cAMP加水分解においてcGMPにより刺
激される能力である。
【０００９】In vitro研究では、試験した哺乳類組織の
ほとんどすべて、ならびにキイロショウジョウバエ、タ
マホコリカビ、および睡眠病病原虫での、Ca2+／カルモ
ジュリンに対する増大したPDE活性が見られた。 組
織、細胞性および亜細胞性区画でのCaM-PDE のレベル
は、多様に変化する。 ほとんどの細胞は、脳、特に、
シナプス領域において、最も高い組織レベルで、少量の
CaM-PDE 活性を含む。 Greenberg et al., Neuropharm
acol., 17: 737-745 (1978)およびKincaid et al.,PNAS
(USA), 84: 1118-1122 (1987)。 ムスカリン刺激に応
答するアストロチトーム細胞でのcAMPの減少は、CaM-PD
E活性でのカルシウム依存性の増大によるものと思われ
る。 Tanner et al., Mol. Pharmacol., 29: 455-460
(1986)。また、CaM-PDE は、甲状腺組織におけるcAMPの
重要な調節器であろう。 Erneuxet al.,Mol. Cell. End
ocrinol., 43: 123-134 (1985)。
【００１０】初期の研究では、独特のCaM-PDEsの組織特
異性イソ酵素があることを示唆していた。 CaM-PDE 科
のいくつかが、ウシ心臓から単離した59kDaのイソ酵
素、およびウシ脳から単離した61および63kDaのイソ酵
素を含むことが記されている。LaPorte et al., Bioche
mistry, 18:2820-2825 (1979); Hansen et al., Proc.N
atl. Acad. Sci. USA, 79: 2788-2792 (1982); およびS
harma et al., J. Biol.Chem., 261: 14160-14166 (198
6)。 ウシの59および61kDaイソ酵素の相似物が、ラッ
トの組織からも単離されており、Hansen et al., J. Bi
ol. Chem., 261:14636-14645 (1986)、これら二つのイ
ソ酵素が他の哺乳動物種においても発現されうることを
示唆している。
【００１１】分子量指標に加えて、他の証拠が、イソ酵
素のCaM-PDE科での類似性および相違性双方を支持して
いる。 例えば、59kDa心臓イソ酵素および61kDa脳イソ
酵素CaM-PDEsは、SDS-PAGEでの移動度およびDEAEクロマ
トグラフィーでの溶出位置において相違し、59kDaイソ
酵素は、カルモジュリンよりも少なくとも10〜20倍高い
親和性を有している。 胎盤および形質転換した細胞に
おいて非常に高い濃度で存在する胎児／オンコカルシウ
ム結合タンパク質であるオンコモジュリンも、61kDa酵
素よりも高い親和性で59kDa 酵素と結合する。 しかし
ながら、61kDa脳イソ酵素および59kDa心臓イソ酵素共
に、単一モノクローナル抗体によって認識される。この
抗体は、PDE単独の場合よりも100倍高い親和性で、Ca2+
/CaM-PDE複合体に結合する。 前出のHansen et al., 1
986。 59および61kDaイソ酵素は、ほとんど同一の基質
特性ならびに動力学定数を有している。 Krinks et a
l., Adv. Cyc.Nucleotide Prot. Phosphorylation Re
s., 16:31-47 (1984) は、ペプチド解析実験を基にし
て、心臓59kDaタンパク質が脳61kDaイソ酵素のタンパク
質分解形態であると示唆している。
【００１２】63kDaウシ脳イソ酵素は、59および61kDaイ
ソ酵素とは実質的に相違する。 63kDa酵素は、59およ
び61kDa酵素に結合するモノクローナル抗体によって認
識されない。 前出のHansen et al., 1986。 61kDaタ
ンパク質が燐酸化されるのに対し、63kDaタンパク質
は、cAMP依存性タンパク質キナーゼによってin vitroで
は燐酸化されない。 そして、63kDaタンパク質は、CaM
-キナーゼIIによってのみin vitroで燐酸化される。 Sh
arma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:2603
-2607 (1985) ; およびHashimoto et al., J. Biol. Ch
em., 264:10884-10887(1989)。 しかしながら、ウシ脳
からの61および63kDa CaM-PDEイソ酵素は、同様のCaM-
結合親和性を有するように思われる。 Staphylococcal
V8 プロテアーゼで限界タンパク分解して調製したペプ
チド地図、 Sharma et al., J. Biol. Chem., 259: 924
8 (1984) は、61および63kDa タンパク質は異なるアミ
ノ酸配列を有することを示唆している。
【００１３】cGMP-刺激PDEs(cGS-PDEs)は、cGMPによるc
AMP加水分解を刺激する、非触媒作用、cGMP-特異性部位
を有するものと提案された。 Stoop et al., J. Biol.
Ch em., 264:13718 (1989)。 この酵素は、生理学的サ
イクリック・ヌクレオチド濃度にて、cAMPの向上した加
水分解によって、高められたcGMP濃度に応答する。
【００１４】そして、cGS-PDEは、cAMP-介在反応を調節
もしくは阻害するために、cGMP濃度の上昇を許容する。
本出願の発明者との共同執筆に係る最近の、LeTrong
et al.,Biochemistry, 29: 10280 (1990)に載せられた
主要配列は、調節特性ならびにこの酵素の領域基礎構造
を理解し、および異なるシグナルに応答する他のPDEイ
ソ酵素と比較するための分子骨格が提供されている。
この文献は、cGS-PDEをコードする2.2kbウシ副腎皮質cD
NA断片のクローニングも述べている。 ラット褐色細胞
腫細胞からの「Type II PDE」のクローニングを報告し
ているThompson etal., FASEB J., 5(6):A1592 (Abstra
ct No. 7092) も参照のこと。
【００１５】多数の異なるPDEsおよび細胞内シグナルに
おけるその重要な役割の発見に伴い、特異性PDEイソ酵
素を選択的に活性化あるいは阻害する薬剤の発見に努力
が払われてきた。 細胞性PDE活性に影響を及ぼし、そ
して細胞性cAMPを改変する薬剤は、広範な疾患および生
理学的条件を制御するために積極的に使用できる。PDEs
を阻害することによりcAMPレベルを向上するいくつかの
薬品が使用されているが、一般的には広範な非特異的阻
害剤として機能し、目的としない型の組織および細胞に
おけるcAMP活性に関して心身に有害な副作用を呈する。
従って、選択されたPDEイソ酵素に特異的な薬剤が必
要とされていたのである。 特異的PDEイソ酵素の選択
的阻害剤は、強心薬剤、抗抑制薬、抗高血圧、抗血栓
症、および他の薬剤として有用であろう。 しかしなが
ら、特定の分析用調製物中に存在する特定のPDEイソ酵
素を同定することの困難さがために、作用薬／拮抗薬の
スクリーニング研究は複雑なものであった。 さらに、
すべてのPDEsが同じ基礎反応を触媒し、すべてのPDEsの
基質特異性が重複しており、および、すべてのPDEsが微
量でしか存在しない。
【００１６】PDEs間の区別化が、いくつかの異なる方法
によって試みられてきた。 各新規イソ酵素を単離およ
び研究する古典的な酵素学的方法は、精製技術の限界な
らびにイソ酵素の完全な分離がなされたか否かを正確に
評価できないことによって、妨げられている。 第二の
方法は、ひとつのイソ酵素に寄与し、他の酵素への寄与
を最小限にする、イソ酵素特異的分析条件を同定するも
のであった。 他の方法は、免疫学的同定および科集団
および／または各イソ酵素への分離であった。
【００１７】疑いのない同定および特定のイソ酵素の研
究のためのこれら各方法には、時間を費やし、ある場合
には、技術的に非常に困難な確立する必要のある多数の
識別基準という問題がある。 その結果、ほとんどの研
究では、一個より以上のイソ酵素を含むであろう部分的
にのみ純粋なPDE 調製物を用いて行われていた。 さら
に、ほとんどの組織における多くのPDEsは、限定タンパ
ク質分解に非常に感受的であり、その親物質とは異なる
動力学的、調節的、および生理学的特性を有するであろ
う活性タンパク質分解生成物を容易に形成する。
【００１８】新規で、特異的PDE-調節剤の開発は、組み
換え手段による大量の組織特異性PDEsを単離する能力に
よって、大きく促進される。 比較的わずかなPDE 遺伝
子が今日までクローニングされており、クローニングさ
れたこれらのほとんどが、ホスホジエステラーゼのcAMP
特異性(cAMP-PDEs) の科に属している。 Cyclic Nucle
otide Phosphodiesterases: Structure, Regulation an
d Drug Action, Beavo, J and Houslay, M.D., Eds. Jo
hn Wiley & Sons, New York; 1990 の Davis,"Molecula
r Genetics of the Cyclic Nucleotide Pho-sphodieste
rases", pp.227-241を参照のこと。 Faure, et al., PN
AS(USA), 85:8076 (1988)-D. discoideum; Sass et a
l., PNAS(USA), 83:9303 (1986)-S. cerevisiae; PDE2
と称するPDE class IV;Nikawa et al., Mol. Cell. Bio
l., 7:3629 (1987)-S. cerevisiae; PDE1 と称する; Wi
lson et al., Mol. Cell. Biol., 8:505 (1988)-S. cer
evisiae; SRA5 と称する; Chen et al., PNAS(USA), 8
3:9313 (1986)-D. melanogaster, dnc+ と称する; Ovch
innikow et al., FEBS, 223:169 (1987)- ウシ網膜、GM
P PDE と称する; Davis et al., PNAS(USA), 86:3604
(1989)-ウサギ肝臓、rat dnc-1 と称する; Colicelli e
t al., PNAS(USA), 86:3599 (1989)- ウサギ脳、rat DP
D と称する; Swinnen et al., PNAS(USA), 86:5325 (19
89)- ラット精巣、rat PDE1、PDE2、PDE3およびPDE4;
および Livi et al., Mol. Cell. Biol., 10:2678 (199
0)-ヒト単球、hPDE1 と称するも参照のこと。 前出のLe
Tronget al.,および前出のThompson et al., も参照の
こと。
【００１９】相補性スクリーニングが、PDEsのあるタイ
プをコードする哺乳類cDNAクローンを検出し、単離する
ために用いられてきた。 Colicelli et al., PNAS(US
A),86:3599 (1989) には、S. cerevisiae発現ベクター
でのラット脳cDNAライブラリーの構築、該ライブラリー
からの酵母においてRAS2Val19の表現型効果を抑制する
よう機能する能力がある遺伝子の単離、ヒトHRAS遺伝子
の発癌変異体に対するRAS2遺伝子類似体の変異体を報告
している。 クローニングされ、 DPD（ラットdunce様
ホスホジエステラーゼ）と称されたcDNAは、酵母株 TK1
61-R2V (A.T.C.C. 74050)にある活性化RAS2Val19と関連
する生長調節の欠損、ならびに酵母PDE遺伝子座(pd
e-1、pde-2) 双方にて欠陥のある酵母変異株10DAB (A.
T.C.C. 74049)の生長調節表現型の類似体欠陥を相補あ
るいは「救済」する能力を有している。 高親和性cAMP
特異性ホスホジエステラーゼをコードする遺伝子のアミ
ノ酸配列は、Drosophila melanogasterのdunce座によっ
てコードされるcAMP特異性ホスホジエステラーゼと高い
相同性を示す。
【００２０】本出願の親出願である米国特許出願No. 07
/688,356の出願日まで、哺乳類Ca2+／カルモジュリン刺
激またはcGMP刺激PDEs（PDE科ＩおよびII) のいずれも
コードするDNA配列のクローニングおよび発現は報告さ
れておらず、従って、当該分野においては、引き続き、
これらPDEsの完全なヌクレオチド配列情報が要望されて
いるのである。
【００２１】
【問題点を解決するための手段】本発明は、哺乳類種
（例えば、ヒトおよびウシ）Ca2+／カルモジュリン刺激
サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼお
よびcGMP刺激サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジエ
ステラーゼ・ポリペプチドの発現をコードする新規に精
製され、単離したポリヌクレオチド配列（例えば、セン
スおよびアンチセンス鎖を含むDNAおよびRNA）を提供す
る。 本発明によって提供されたゲノミックおよびcDNA
配列は、メッセンジャーRNAへのin vivoおよびin vitro
での転写を許容する、プロモーター、オペレーター、レ
ギュレーター、ターミネーターなどの同種あるいは異種
発現調節DNA配列、そして、機能性ホスホジエステラー
ゼおよび関連ポリペプチドを大量に調製するためのmRNA
sの転写に関連があるものと思われる。
【００２２】本発明によって特に得られるものは、米国
特許商標庁およびブダペスト条約の規定に従って、1991
年４月11および15日ならびに1992年４月14日の、Americ
anType Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, R
ockville, Maryland 20852への寄託の対象となった細菌
プラスミドおよびウィルス・ベクターでの哺乳類DNA挿
入体として存在する、ホスホジエステラーゼおよびその
断片をコードする哺乳類DNA 配列である。 本発明に関
連して寄託したDNAsには、下記のものを含む。 １．61kDa CaM-PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNA挿
入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 68576) 中のプラ
スミドpCAM-40; ２．63kDa CaM-PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNA挿
入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 68577) 中のプラ
スミドp12.3A; ３．61kDa CaM-PDEイソ酵素を断片的にコードするヒト
海馬cDNA挿入体を含むバクテリオファージλ CaM H6a
（A.T.C.C. 受託 No. 75000); ４．61kDa CaM-PDEイソ酵素をコードする混成ヒトcDNA
挿入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 68963) 中のプ
ラスミドpHcam61-6N-7; ５．61kDa CaM-PDEに相同な新規のPDE をコードするヒ
ト海馬cDNA挿入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 689
64) 中のプラスミドpcamH3EF; ６．61kDa CaM-PDEに相同な新規のPDE をコードするヒ
ト心臓cDNA挿入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 689
65) 中のプラスミドpcamHella; ７．cGS-PDEイソ酵素をコードするウシ副腎cDNA挿入体
を含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 68579) 中のプラスミ
ドp3CGS-5; ８．cGS-PDEイソ酵素断片をコードするウシ脳cDNA挿入
体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 68578) 中のプラス
ミドpBBCGSPDE-5; ９．cGS-PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNAを含む大
腸菌（A.T.C.C.受託 No.68580) 中のプラスミドpBBCGSP
DE-7; 10．cGS-PDEイソ酵素断片をコードするヒト心臓cDNAを
含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 68583) 中のプラスミド
pGSPDE6.1; 11．cGS-PDEイソ酵素断片をコードするヒト海馬cDNA挿
入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託 No. 68585) 中のプラ
スミドpGSPDE7.1;および 12．cGS-PDEイソ酵素断片をコードするヒト海馬cDNA挿
入体を含むプラスミドpGSPDE9.2（A.T.C.C.受託 No. 68
584) 。 13．cGS-PDEをコードするヒトcDNA挿入体を含む大腸菌
（A.T.C.C.受託 No. 68962) 中のプラスミドpHcgs6n。
【００２３】本発明によって特に提供されるものは、ウ
シ59kDa CaM-PDEをコードするヌクレオチドを含み、配
列番号：16および17のDNA配列およびアミノ酸配列で特
徴付けられるウシcDNA配列である。
【００２４】関連する態様において、本発明は、それぞ
れ酵素もしくは酵素断片の発現のために操作的に連繋し
た、転写プロモーターを含むDNA構築物、PDEあるいはそ
の断片をコードするDNA配列、および転写ターミネータ
ーに関する。 構築物は、宿主細胞、好ましくは真核細
胞、より好ましくは哺乳類もしくは酵母細胞を形質転換
あるいは形質変換するために用いるのが好ましい。 大
量生産の目的で、発現したPDEは、例えば、免疫親和的
精製により細胞から単離できる。
【００２５】標準的形質転換手法および形質変換手法に
よって、原核および真核宿主細胞への、適切なDNAおよ
びRNAウィルスベクターおよび環状DNAプラスミドベクタ
ーを含む、DNA配列の組み込みも本発明の範疇にあり、
今まで自然界から多量の入手ができなかった有用なタン
パク質の提供も期待される。 本発明によって提供され
たシステムは、上述したものを含んだ形質転換した大腸
菌細胞、ならびに、酵母および哺乳類細胞を含んだ他の
形質転換した真核細胞を含む。 哺乳類宿主細胞は、本
発明の組み換え発現物質に関する至適生物学的活性を参
照する必要に迫られることから、翻訳後の修飾（例え
ば、先端削除、脂質化、およびチロシン、セリン、もし
くはスレオニン燐酸化）への使用が予想される。
【００２６】本発明の新規タンパク生成物は、上記核酸
配列の発現生成物、およびCaM-PDEの一次構造配座（す
なわち、アミノ酸配列）を有するポリペプチド、および
cGS-PDEタンパク質ならびにそのペプチド断片、およ
び、複製するよう組み立てられた、そのアミノ酸配列の
合成ペプチドを含む。 本発明のタンパク質、タンパク
質断片、および合成ペプチドは、治療、診断、および予
後での用途を含む多くの用途を意図しており、本発明の
タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナルおよ
びポリクローナル抗体の基礎を提供するであろう。
【００２７】本発明のタンパク質、その断片およびペプ
チドに高い免疫特異性で結合し、他のタンパク質と共通
しない独特のエピトープを認識する能力によって特徴付
けられる（ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、
キメラ抗体、一本鎖抗体などを含む）抗体基質が、本発
明によってさらに提供される。 本発明のモノクローナ
ル抗体は、CaM-PDEsおよびcGS-PDEsの親和的精製、例え
ば、Hansen et al.,Meth. Enzymol., 159:543 (1988)
に使用できる。
【００２８】CaM-PDEsならびにcGS-PDEsの正常、不正
常、もしくは変異形態、およびそれに関連した核酸（例
えば、DNAおよびmRNA）の検出および／または定量のた
めの新規の手法が、本発明によってさらに提供される。
例示的に、本発明の抗体は、流体および組織標本中の
これらタンパク質、および適切に標識付けされ、これら
タンパク質をコードするmRNAの定量検出のために用いら
れるであろう本発明のDNA 配列の定量検出のための公知
の免疫学的手法において用いられるであろう。
【００２９】それ故、本発明の数々の態様の中には、
(a) ポリヌクレオチド配列をコードする新規のCaM-PDE
およびcGS-PDE、(b) 本明細書に記載した条件とほぼ同
等、あるいはそれよりストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で、新規のCaM-PDEおよびcGS-PDEをコ
ードする配列とハイブリダイズする哺乳類CaM-PDEある
いは哺乳類cGS-PDEの活性を有するポリペプチドをコー
ドし、本発明のcDNAsの初期単離に用いられたポリヌク
レオチド配列、および(c) 少なくとも部分的に、変性コ
ドンを使用する時に、同じもの（もしくは、対立性変異
体もしくは類似体ポリペプチド）をコードするポリヌク
レオチド配列がある。 ポリヌクレオチド配列および該
ポリヌクレオチド配列ならびにベクターで形質転換ある
いは形質変換された原核および真核宿主細胞に組み込ま
れたウィルスDNAおよびRNAベクターあるいは環状プラス
ミドDNAベクター、ならびに、これら宿主の培養成長に
よるこれらタンパク質の組み換え生成のための新規の方
法、および宿主あるいはその培地からの発現タンパク質
の単離が、対応して提供される。
【００３０】さらに他の実施態様において、本発明は、
PDE活性を調節できる化合物を同定するための組成物と
方法を提供する。 そのような方法は、組み換えPDEポ
リペプチドを発現する真核細胞でPDE調節活性が評価さ
れる化合物をインキュベートし、遺伝子発現によっても
たらされるホスホジエステラーゼ活性に関する該化合物
の効果を決定することを含む。 この方法は、全細胞あ
るいは細胞溶解調製物のいずれでも効果的である。 好
ましい態様において、真核細胞は、酵母細胞もしくは内
因性ホスホジエステラーゼ活性が欠けている哺乳類細胞
である。 ホスホジエステラーゼ活性に関する化合物の
効果は、cAMPおよび／またはcGMPの加水分解を観察する
生物化学的分析法、あるいは組み換えPDEポリペプチド
の有無に関連する真核細胞の表現型特性の改変に関する
化合物の効果を追跡することにより、決定することがで
きる。
【００３１】本発明の他の態様および利点は、本発明の
実用での数々の例示的実施例を含む下記の本発明の詳細
な説明、図面に関する記載を考慮すれば明確になるであ
ろう。
【００３２】図１には、61kDa(ウシ脳）イソ酵素の完全
配列と共に並べた、単離した59kDa(ウシ心臓) および63
kDa(ウシ脳)CaM-PDEタンパク質のアミノ酸配列決定の結
果を示している。 61kDaイソ酵素に対する59および63k
Da タンパク質の同一部分を下線で示した。 仮想同一
部を半行下がりで示し、およびハイフンは、未同定残基
を示している。 リシルペプチドでブロックしたアミノ
末端の組成物からメチオニルペプチド(mDDHVTIRRK)を除
去することで決定される、59kDa イソ酵素のN-末端を括
弧で示した。 黒塗枠を、61および59kDa イソ酵素で同
定したCaM-結合部位中の残基上に置いた。
【００３３】
【実施例】以下の実施例に、本発明の実例を示した。
実施例１は、ウシ脳からの61kDaCaM-PDEの単離、精製、
および配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞でのその発現
に関する。 実施例２は、ウシ肺からの59kDa CaM-PDE
の単離、精製、および配列決定、ならびに哺乳類宿主細
胞でのその発現に関する。 実施例３は、ウシ脳からの
63kDa CaM-PDEの単離、精製、および配列決定、ならび
に哺乳類宿主細胞でのその発現に関する。 実施例４
は、ウシ副腎皮質からのcGS-PDE cDNAの単離、精製、お
よび配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞でのDNAの発現
に関する。実施例５は、ウシ脳からのcGS-PDE cDNAの単
離、精製、および配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞で
のその発現に関する。 実施例６は、ヒトcGS-PDE cDNA
の取得、およびcGS-PDEをコードするヒトcDNAの開発の
ための、cGS-PDE ウシ副腎cDNAの使用に関する。 実施
例７は、ヒトCaM-PDE 61kDa cDNAおよび新規構造の関連
cDNAの取得のための、CaM-PDE 61kDaウシ脳cDNAの使用
に関する。 実施例８は、酵母表現型欠陥の相補性およ
び発現生成物のホスホジエステラーゼ活性の確認のため
の、ウシおよびヒトPDE cDNAの発現に関する。 実施例
９は、ノザン分析および本発明のポリヌクレオチド（特
に、cDNAs およびアンチセンスRNAs) を用いたRNアーゼ
保護研究を含む組織発現研究に関する。
【００３４】冗長なオリゴヌクレオチドの構成を本明細
書で称する場合、J. Biol. Chem.,261:13-17 (1986)に
て報告された、下記表１の一文字表記を、不明瞭なヌク
レオチド配列のために用いることを勧める。
【００３５】
【表１】
【００３６】実施例１：ウシ脳からの61kDa CaM-PDE cD
NAの単離、精製、および配列決定この実施例では、タン
パク質のアミノ末端をコードする61kDaウシ脳CaM-PDEの
遺伝子部分に相当するcDNA配列が、ウシ脳mRNAから調製
した第一鎖状cDNAsのコレクションからPCRによって単離
された。 PCR-調製した断片は、全長ウシ脳CaM-PDE配
列を単離するために用いられた。
【００３７】全RNA が、Chomczynski et al., Anal. Bi
ochem., 162:156-159 (1987)の方法を用いて、ウシ心臓
から調製され、そしてmRNAが、Poly (A) Quick（登録商
標）mRNA精製キットを用いて、その使用説明書に従って
選択された。 第一鎖状cDNAは、50mM Tris HCl(pH8.
3、42℃)、10mM MgCl2、10mM ジチオトレイトール、0.5
mM (それぞれ) デオキシヌクレオチド三燐酸、50mM塩化
カリウム、2.5mMナトリウムピロ燐酸、５μg デオキシ
チミジル酸オリゴマー（12〜18塩基) および65℃で15分
間かけて変性した５μgウシ心臓mRNAを含む反応混合物
（最終体積40μl)に、AMV逆転写酵素の80単位を加える
ことによって合成された。
【００３８】第一鎖状cDNA合成物を定量するために、[
32P]-ラベルした１μl のdCTP(3000Ci/mmol)が混合され
た。 反応物は、42℃で60分間インキュベートした。
反応物は、フェノール／塩化メチル抽出され、エタノー
ル沈澱された。 核酸ペレットが、10mM Tris -HCl(pH
7.5)/0.1mM EDTAの50μlに、最終濃度が、15ng/μlにな
るよう再懸濁した。
【００３９】図１にある61kDaペプチド配列に対応する
冗長なセンスおよびアンチセンス・オリゴマーは、目的
鋳型に特異的にハイブリダイズするに充分な長さにま
で、最小限の冗長になるようにデザインされている。
【００４０】CaM PCR-2Sと称する、最初の23塩基オリゴ
マーを、Applied Biosystems社製のDNA合成機で合成し
た。 そのオリゴマーは、下記アミノ酸配列； 配列番号：２ KMGMMKKK に特異的な下記配列を有していた。
【００４１】配列番号：１ 5'-AARATGGGNATGAARAARAA-
3' CaM PCR-3AS と称する、下記アミノ酸配列； 配列番号：４ MQEEEMNV に対応する下記配列の二番目の23塩基オリゴマーが合成
された。
【００４２】配列番号：３ 5'-ACRTTCATYTCYTCYTCYTGC
AT-3' 612bp CaM PDE cDNA断片が、PCR増幅手法を用いて、50m
M塩化カリウム、10mMTris-HCl (pH 9.0)、1.5mM MgC
l2、0.01% ゼラチン、0.1% Triton X-100、0.2mM(それ
ぞれ) デオキシヌクレオチド三燐酸、１μM(それぞれ)
CaM PCR 2SおよびCaM PCR-3AS オリゴマー、およびTher
mus aquaticus DNA ポリメラーゼの2.5単位を含む反応
混合物に、15ngの第一鎖状cDNAを加えることによって合
成された。反応物は、90℃で１分間、50℃で２分間、お
よび72℃で２分間の、30サイクルでインキュベートし
た。 反応生成物は、0.5μg/mlエチジウムブロミドを
含んだ0.04M Tris-酢酸/0.001M EDTA緩衝液を用いた１
％アガロースゲルにて精製した。
【００４３】DNA生成物は、紫外線で視覚化され、カミ
ソリ刃でゲルからていねいに切り出され、Geneclean II
試薬キットを用いて精製され、そして、EcoRVで切り出
されたpBluescript ベクターDNAに繋がれた。
【００４４】PCR増幅生成物が、CaM PDE cDNAであるか
を決定するために、サブクローニングしたPCR DNA生成
物を、T3およびT7プロモータープライマー、およびSequ
enaseあるいはTaqポリメラーゼ配列決定キットのいずれ
かを用いて、末端から配列決定を行った。 DNAのこの
断片の各末端から約 250塩基が配列決定され、図１の59
および61kDa CaM-PDEsのアミノ酸配列と対応するcDNAか
らの推定アミノ酸配列が、PCR DNA生成物は CaM PDE cD
NAの一部であることを確認した。
【００４５】(Ronald E. Diehl、 Merck、 Sharp & Doh
meから提供された) ラムダZAP ベクターで構築されたウ
シ脳cDNAライブラリーは、PCR増幅により得られた放射
ラベルした 615bp CaM-PDE cDNAでスクリーニングし
た。 プローブは、 Feinberg et al., Anal. Bioche
m., 137:266-267 (1984)の方法を用いて調製し、[32P]-
ラベルしたDNAは、 Elutip-D(登録商標) カラムを用い
て精製した。 円形フィルターに結合したプラーク (12
〜150mmプレート上での700,000プラーク) を、50%ホル
ムアミド、20mM Tris-HCl (pH 7.5)、1X Denhardt 溶
液、10% デキストラン硫酸、0.1%SDSおよび106cpm/mlの
[32P]-ラベルしたプローブ(109cpm/μg)を含む溶液中
で、42℃で、終夜ハイブリダイズした。 フィルター
は、室温で、15分間、2X SSC/0.1% SDSで三度洗浄し、
次いで、45℃で、15分間、0.1X SSC/0.1% SDSで二度洗
浄した。フィルターは、終夜Ｘ線フィルムに曝された。
【００４６】[32P]-ラベルしたプローブとハイブリダイ
ズした46個のプラークの内、任意に選択した８個のクロ
ーンを、再培養およびスクリーニングを数回行うことに
より精製し[Maniatis et al., Molecular Cloning: A L
aboratory Manual 545pp. ColdSpring Harbor Laborato
ry, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982)] 、挿入cDNA
は、製造者が勧めているように、in vivo 削除[Short e
t al., Nuc. Acids Res., 16:7583-7599 (1988)] によ
り、pBluescript SK(-) にサブクローニングされた。
【００４７】各クローンの培地から調製されたプラスミ
ドDNA は、EcoRIを用いた制限分析に供した。 適切な
長さの二つのクローンが、Taq TaK(登録商標) およびSe
quenase(登録商標) 配列決定キットを用いた配列解析の
ために選択された。 その二つのクローンとは、pCAM-4
0 (2.3kb) とpCAM-34 (2.7kb) である。 この方法から
の配列情報は、pCAM-40の挿入が、ウシ脳61kDa CaM-PDE
の全長をコードすることを確認した。 このクローンの
配列、およびそこから推定されたアミノ酸配列を、配列
番号：５および６に示した。
【００４８】COS-7細胞 (A.T.C.C. CRL 1651)での61kDa
CaM-PDE cDNAの過渡発現を下記のようにして、行っ
た。 大腸菌宿主細胞MC1061-p3中のベクターpCDM8 [Se
ed, Nature, 329:840-843 (1987)] は、マサチューセッ
ツ州、ボストンのマサチューセッツ総合病院のBrian Se
ed博士より提供を受けた。 このベクターは、Invitrog
en社（カリフォルニア州、サンジエゴ）からも入手でき
る。 プラスミドpCAM-40 は、HindIIIおよびNotIで消
化され、HindIIIおよびNotIで消化されたCDM8ベクターD
NAに繋がれる2.3kb断片を産生した。 得られたプラス
ミドは、MC1061-p3細胞にて増殖された。 プラスミドD
NAは、Ausubel et al., eds., Current Protocols in M
olecular Biology, 1:1.7.1 (John Wiley & Sons, New
York, 1989)のアルカリ溶解法を用いて調製され、Qiage
n-Tip 500カラム(Qiagen社、カリフォルニア州、チャッ
ツワース) を用いて、使用説明書に従って精製した。
【００４９】COS-7 細胞は、前出のAusubel et al., at
1:9.2 et seq のDEAEデキストラン法を用いて、p-CAM-
40/CDM8構築物（あるいは、CDM8ベクターのみで形質変
換したモデル) で形質変換された。 具体的には、エタ
ノール沈澱したDNAの10μgを80μl TBS 緩衝液に再懸濁
し、10% NuSerumを補ったDMEMの４ml中の50%融合性COS-
7細胞の100mmプレートに、10mg/ml DEAEデキストランの
160μlを滴下して加え、渦巻攪拌して混合した。 細胞
は、水飽和、７%二酸化炭素雰囲気下で、37℃で、３〜
４時間インキュベートした。 培地を取り除き、細胞を
直ちに、PBS中の10%DMSOで１分間処理した。 この処理
の後、細胞はPBS、次いでDMEMで洗浄され、そして最終
的に、10%胎児ウシ血清ならびに抗生物質（50μg/mlス
トレプトマイシン硫酸) を補ったDMEMにて、7%二酸化炭
素インキュベーターで、36時間培養した。
【００５０】COS細胞は、プレートから掻き取られ、40m
M Tris-HCl (pH=7.5)、５mM EDTA、15mM ベンズアミジ
ン、 15mM β−メルカプト・エタノール、１ml当たり１
μgのペプスタチンＡ、および１ml当たり１μg のロイ
ペプチンを含む緩衝液(100mmプレート当たり１ml) に
て、Dounceホモジェナイザーで均質化した。 均質化物
は、基質として[3H]cGMPを用いて、Hanson et al., Pro
c. Nat'l. Acad. Sci., U.S.A., 79:2788-2792 (1982)
の方法に従って、PDE 活性について分析された。 20mM
Tris-HCl (pH=7.5)、20mM イミダゾール(pH=7.5)、３m
M MgCl2、15mM 酢酸マグネシウム、１ml当たり0.2mgのB
SA、および２mM EGTA もしくは0.2mM塩化カルシウムを
伴う１μM 3H-cAMP 、および１ml当たり４μgのCaMを含
む緩衝液にて、30℃で、10分間反応を行った。 分析
は、90℃の水浴で試験管を１分間インキュベートするこ
とで終了した。 冷却後、１ml当たり2.5mgのヘビ毒10
μlを各分析物に添加し、37℃で、５分間インキュベー
トした。 試料は、20mM Tris-HCl (pH=7.5)の250μlで
希釈され、直ちに0.7ml A-25 イオン交換カラムに適用
された。 カラムは20mM Tris-HCl (pH=7.5)の0.5mlで
三度洗浄され、シンチレーション瓶に回収された。 試
料は、シンチレーション計測器 Packard Model 1600TR
を用いて、１分間計測した。 特異的サイクリック・ヌ
クレオチド加水分解活性が、１mgタンパク質当たりの１
分当たりに加水分解されたcAMPあるいはcGMPのピコモル
として表現される。 タンパク質濃度は、標準としてBS
Aを用いた、Bradford, Anal. Biochem., 72:248-254 (1
976)の方法に従って見積もった。 模擬的に形質変換し
た細胞と比較して、pCAM-40 cDNAで形質変換した細胞の
抽出物は、EGTAの存在下で、非常に大きなcAMPおよびcG
MP加水分解活性を有していた。 カルシウムおよびCaM
の存在下での、pCAM-40 cDNA形質変換細胞の分析は、cA
MPおよびcGMP加水分解の刺激を示す結果となった。
【００５１】実施例２：ウシ肺からの59kDa CaM-PDEの
単離、精製、および配列決定 ウシ心臓59kDa CaM-PDEからアミノ酸配列 配列番号：７ MDDHVTI に対応する完全に変性したセンス・オリゴヌクレオチド
が合成された。 このオリゴヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列は、 配列番号：８ 5'-ATGAGRAGRCAYGTHACNAT-3' である。
【００５２】配列番号：10 5'-CTGCTTCACTAAGCATCTTAG
-3' の配列を有するアミノ酸配列 配列番号：９ LRCLVKQ に対応する、ウシ脳 61kDa CaM-PDEの図１の配列から、
アンチセンス・オリゴヌクレオチドがデザインされた。
【００５３】プライマー対が、鋳型として（実施例１で
調製したような）ウシ心臓第一鎖状cDNAを用いたPCR 反
応を起こすために使われた。 この反応では、59kDa配
列独特の75bp、54bp、ならびに59kDaと61kDaイソ酵素と
の間で共有される21bpのPCR生成物が予想される。 PCR
生成物は、アガロースゲル電気泳動を篩うことによって
分析され、75bpに泳動しているバンドをゲルから削り取
った。 DNAは pBluescript KS+にサブクローニングさ
れ、青／白選択法による陽性コロニーが、ベクター配列
に対抗するプライマーを使用したPCR によってスクリー
ニングされた。 適当な大きさの挿入体を有するコロニ
ーが選択され、これらの一つ（pCaM59/75.14) が配列決
定のために選抜された。 Quiagen P20 プッシュ・カラ
ムを用いて、プラスミドDNAが調製され、ジデオキシ法
を用いた配列決定での鋳型として用いられた。 PCR生
成物の配列は、 配列番号：11 5'-ATGAGAAGGCACGTAACGATCAGGAGGAAACAT
CTCCAAAGACCCATCTTT-AGACTAAGATGCTTAGTGAAGCAG-3' で
ある。
【００５４】配列の分析では、得られた配列と予想して
いた配列との間に二つのコドンの相違が認められた。
センス・オリゴヌクレオチドプライマー配列の再検討
は、二つのコドンのふとした転位が、オリゴヌクレオチ
ドのデザインにおける誤りを導くことを示していた。
59および61kDaイソ酵素との重複が最小限である54bp生
成物と思われる二番目のオリゴヌクレオチドPCR プライ
マー対に加えて、最初のセンス・プライマーのデザイン
での誤りが訂正された第二センス・プライマーが調製さ
れた。 センス・オリゴヌクレオチドは、配列 配列番号：12 5'-ATGGAYGAYCACGTAACGATC-3' を有しており、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、
配列 配列番号：13 5'-AAGTATCTCATTGGAGAACAG-3' を有して
いた。
【００５５】このプライマー対は、鋳型としてウシ心臓
第一鎖状cDNAを用いたPCR反応を起こすために用いら
れ、PCR生成物は上記したように、サブクローニングさ
れ、正確にスクリーニングされた。 二つのクローン
（pCaM59/54.9 およびpCaM59/54.10) が挿入体の大きさ
を基にして、配列決定のために選択され、上記したよう
に配列決定され、双方のクローンが、アミノ酸配列 配列番号：15 MDDHVTIRRKHLQRPIFR が予想される、予想された配列 配列番号：14 5'-ATGGATGATCACGTAACGATCAGGAGGAAACAT
CTCCAAAGACCCATCTT-TAGA-3' の54bp挿入体を含んでいた。
【００５６】cDNAライブラリーがウシ肺mRNAから構築さ
れ、ウシ副腎皮質ライブラリーのスクリーニングに関す
る、下記、実施例４に記載された手法を用いてスクリー
ニングした。 約1.2×106プラーク形成単位が、32P-ラ
ベルしたpCAM-40 cDNAの1.6kbEcoRI制限エンドヌクレア
ーゼ開裂生成物でプローブ検定された。 この最初のス
クリーニングで、四つの推定59kDa CaM-PDE cDNAクロー
ンが生成した。 予備的な配列解析にて、p59KCAMPDE-2
と称する、一つのクローンが、推定59kDa CaM-PDEの完
全なコード配列を含んでいることを示した。 一連の入
れ子状欠失が、p59KCAMPDE-2プラスミド[Sonnenburg et
al., J. Biol. Chem., 266 (26):17655-17661 (1991)
参照] から構築され、得られた鋳型の配列決定をTaq Dy
eDeoxy（登録商標）ターミネーター・サイクル・配列決
定キットおよびApplied BiosystemsModel 373A DNA 配
列決定システムを用いて行った。 DNAと推定アミノ酸
配列を、配列番号：16および17にそれぞれ示した。 cD
NAにある大きな読取枠が、アミノ末端18残基を除く、61
kDa CaM-PDE アミノ酸配列とほぼ同一の約59キロダルト
ンの推定分子量を伴う 515残基ポリペプチドをコードす
る。 さらに、p59KCAMPDE-2読取枠の予想されたアミノ
酸配列は、ウシ心臓から精製された59kDa CaM-PDE の利
用可能な配列、Novack, et al., Biochemistry, 30: 79
40-7947 (1991)と同一である。 これら結果は、 p59KC
AMPDE-2 cDNAが、59kDa CaM-PDE をコードするmRNA種で
あることを意味している。
【００５７】59kDa ウシ肺PDE の一過性の発現は、実施
例１でのように達成された。 具体的には、2.66kbの、
p59KCAMPDE-2 cDNAのEcoRI/ブラント・エンドした断片
が、XhoIで消化され、およびブラント・エンドされたpC
DM8 にサブクローニングされた。 p59KCAM PDE-2 と称
する組換えプラスミドが、COS-7 細胞を一過的に形質変
換するために用いられ、形質変換したCOS-7細胞から調
製された抽出物は、２μM cAMPを用いてCaM-PDE 活性に
関して分析された。 p59KCAMPDE-2 cDNAで形質変換し
たCOS-7細胞は、カルシウムおよびカルモジュリンの存
在下で、４〜５倍の刺激を受けたcAMP加水分解活性を産
生した。 模擬的に形質変換したCOS-7細胞では、カル
モジュリン刺激cAMP加水分解活性は検出されなかった。
【００５８】実施例３：ウシ脳からの63kDa CaM-PDEの
単離、精製および配列決定 図１にて報告されたアミノ酸配列に対応する多数の全体
的および部分的冗長なオリゴヌクレオチドが、63kDa Ca
M-PDEのためのcDNAクローンを取得する試験に使用する
ために合成された。 ポリメラーゼ連鎖反応に用いられ
たアニーリング温度は、各センス−アンチセンス対の最
も低い融解オリゴヌクレオチドのための理論的融点より
低い２〜20℃の間で変化した。 後述するプローブ 63-
12s および 63-13a を除いて、多様な条件下でのオリゴ
ヌクレオチド対の各々のPCR生成物は、アガロース・ゲ
ル電気泳動した時に、複数のエチジウムブロミドの帯を
形成した。63-12sおよび63-13aの使用は、配列決定した
時に、63kDa CaM-PDEをコードするためのPCR生成物に帰
する結果となった。
【００５９】63-12sと称する全体的冗長なセンス23-mer
オリゴヌクレオチドは、61kDaウシCaM-PDEs（図１参
照）に保存されているアミノ酸配列 配列番号：19 IHDYEHTG を基にして、下記配列 配列番号：18 5'-ATHCAYGAYTAYGARCAYACNGG-3' を含むように組み立てられた。 63-13aと称する部分的
冗長なセンス32-merオリゴヌクレオチドは、 配列番号：20 5'-TCYTTRTCNCCYTGNCGRAARAAYTCYTCCAT-
3' の配列を有しており、さらに63kDa CaM-PDEに保存され
ている下記配列 配列番号：21 MEEFFRQGDKE、を基にしている。
【００６０】ウシ大脳皮質および選択されたポリＡ+ か
らメッセンジャーRNAが調製された。
【００６１】第一鎖状相補性DNAが、AMVまたはMMLV逆転
写酵素を用いて生成された。 脱トリチル化したオリゴ
ヌクレオチドは、１×106cpm/nmolの１mM [γ-32P]ATP
およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて燐酸化し
た。 NENsorb 20カラムを用いた遊離ATPからの5' 32P-
ラベルしたオリゴヌクレオチドの分離の後、それぞれが
20μM (5' 燐酸) ストックとして懸濁され、最終的にPC
Rにおいてそれぞれ400nMにて合わされる。 反応は、約
１μg のPCR生成物を得るために、50ng 全cDNAおよび20
0μM dNTPを用いて実施された。 反応には、５分間・9
4℃の最初の変性工程に続いて、１分間・94℃の変性、
１分間・50℃のアニーリング工程、および２分間・72℃
の伸長工程の30サイクルが含まれていた。 反応条件下
にて、450塩基対の単一のエチジウムブロミド染色バン
ドが、100ngのPCR生成物のアガロースゲル電気泳動にて
得られた。 5'燐酸化PCR生成物の５μgが、5% PEG-600
0 中のT4 DNAリガーゼを用いて、21℃で、12時間かけ
て、 15ng EcoRV-切断 Bluescript KS(+)プラスミドに
繋いだ。 XL 1-blue形質転換の推定陽性体は、発色選
択のためのイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)および
ブロモ-クロロ-インドリル-ガラクトシド(Xgal)を用い
れば白いコロニーを形成した。 この精選物は、T3もし
くはT7プライマー、ジデオキシヌクレオチド・ターミネ
ーター、およびシークエナーゼを用いて配列決定を行っ
た。
【００６２】得られた一つのクローン(p11.5B)は、配列
番号：22および配列番号：23にそれぞれ示した、ヌクレ
オチド配列および翻訳したアミノ酸配列を有していた。
オリゴヌクレオチド63-12sに見られたアミノ酸YEHへ
のコドンは、p11.5Bにあるアミノ酸配列NTRへのコドン
に取って代わられた。 これはおそらく、63-12sでの汚
染物質によるものであろう。 翻訳した読取枠(ORF)
が、図１にて報告された63kDa CaM PDEと類似している
ので、p11.5Bは、cDNAクローン全長について、ウシ脳cD
NAライブラリーをスクリーニングするために用いられ
た。
【００６３】ウシ脳cDNAライブラリーは、λ ZAP IIに
構築された。 第一鎖状cDNAは、第二鎖状cDNAを合成す
るために、 RNase H、E. coli DNAポリメラーゼ、およ
びE.coli DNA リガーゼで処理された。 cDNAは、T4-DN
Aポリメラーゼでブラントエンドされ、cDNAのEcoRI 部
位は、EcoRIメチラーゼおよびS-アデノシルメチオニン
で保護され、T4 DNAリガーゼを用いてEcoRIリンカーが
そこに繋がれた。 EcoRI制限酵素処理した後、遊離リ
ンカーが、Sepharose CL-4B を用いたゲル濾過によって
cDNAから分離された。 λ ZAP IIの腕はcDNAに繋が
れ、Stratagene社から入手したin vitro Gigapack Gold
パッケージング・キットでまとめた。 9.5×105の組換
体が、IPTGおよびX-galを置くことによって検定した5.8
%非組換体プラークによって得られた。 ライブラリー
は、プレート溶解法によって、 1.4×10 7pfu/mlにまで
一度増幅された。
【００６４】λ ZAP IIにある全ウシ脳cDNAライブラリ
ーの最初のスクリーニングが実施された。 ハイブリダ
イゼーション時に32P-ラベルしたオリゴヌクレオチド63
-1sを用い、そして40℃の温度で洗浄して、700,000pfu
がスクリーニングされた。オリゴヌクレオチド63-1s
は、アミノ酸配列 配列番号：25 KKNLEYTA に対応する配列 配列番号：24 5'-AARAARAAYYTNGARTAYACNGC-3' を有する完全に冗長な23-merである。
【００６５】21個の推定陽性体のすべてが選び取られ
た。 後続の再スクリーニングが、このスクリーニング
法を用いて認められた非常に高いバックグラウンドによ
って妨げられた。 それ故、最初に選び取った各々がプ
ールされ、プールした内の50,000pfuが任意のプライマ
ーおよび [α-32P]dCTP によって放射標識付けされたp1
1.5Bと取り代えられ、再スクリーニングされた。 プラ
ーク精製した一つの陽性体が得られ、そしてプラスミド
p12.3aとして取得した。 そのDNA 配列を配列番号：26
に示した。
【００６６】そして、ウシ大脳皮質ライブラリーが、p1
1.5Bでさらにスクリーニングされた。さらに二つの独立
したクローン、p12.27.9およびp12.27.11が、最初のス
クリーニングでの1.4×106pfuから得られた。 これら
は、プラーク精製されて、配列決定のために取得され
た。
【００６７】クローンp12.3aは、図１に示したようなウ
シ 63kDa CaM-PDEから単離された整列したペプチドのほ
とんどのタンパク質配列をコードする。 配列番号：26
および配列番号：27に、p12.3aのコード領域（すなわ
ち、約 2.5キロベース挿入体の1844ヌクレオチド）を示
した。 塩基番号 248-290は、アミノ酸配列 配列番号：28 QLENGEVNIEELKK をコードする一方で、対応するペプチド（図１）は、 配列番号：29 QLIPGRVNIISLKK を有していた。
【００６８】塩基番号 942-990は、アミノ酸配列 配列番号：30 KSECAILYNDRSVLEN をコードする一方で、対応する単離したペプチド（図
１）配列は、 配列番号：31 KDETAILYNDRTVLEN である。
【００６９】p12.3aのいかなる読取枠にも、非整列の63
kDa ペプチド配列は認められず、また翻訳した、p12.3a
の読取枠分子量は60,951であり、63,000ではなかった。
それ故、このcDNAは、63kDaタンパク質のイソ酵素変
異体を意味している。 他の二つの独立したクローン
(p12.27.9およびp12.27.11)は、p12.3aと同一の読取枠
配列を有しているように思われる。 一方のクローンの
読取枠は、p12.3aのヌクレオチド番号 823から始まり、
その終止コドン通じてp12.3aと同一である。 他方のク
ローンは、p12.3aのヌクレオチド番号198から開始し、
その長さからしてp12.3aと同一である。 三つのクロー
ンのいずれも、p11.5Bに変則NTR ペプチド配列を持って
おらず、三つすべてが、61kDa CaM PDE としてYEH を有
している。
【００７０】COS-7細胞での63kDa CaM-PDEの一過性の発
現が、下記のようにして行われた。
【００７１】配列番号：26の領域をコードし、BamHI制
限部位に位置させたタンパク質を含むプラスミド p12.3
のcDNA挿入体の断片が、PCRによって調製された。 具
体的には、（推定開始コドンを含んだ）塩基番号94-117
および（終止コドンの3'に近接した配列を含んだ）配列
番号：26の塩基番号1719-1735のアンチセンスに対応す
るオリゴヌクレオチドが、その5'末端にある二つの一列
に並んだBamHI部位によって合成された。 二つのプラ
イマーは、下記の配列を有していた。
【００７２】配列番号：32 5'-GGATCCGGATCCCGCAGACGG
AGGCTGAGCATGG-3' 配列番号：33 5'-GGATCCGGATCCAGGACCTGGCCAGGCCCGGC-
3' 二つのオリゴヌクレオチドは、72℃・10分間の最終伸長
反応を含む、94℃・１分間のインキュベーションから、
72℃・２分間のインキュベーションに至る30回のPCRサ
イクルに用いられた。 ５μgの1665塩基対生成物を生
成するために、100μl反応物には、20μMの各オリゴヌ
クレオチドならびに鋳型としての100pgのp12.3aを用い
た。
【００７３】生成物は、1:1フェノール：クロロフォル
ムの等量で一旦抽出され、酢酸ナトリウムに関して 0.3
Mとされ、およびエタノールの二倍量で終夜沈澱され
た。沈澱物は乾燥され、50μl中に再水和され、そしてc
DNAは、37℃で、１時間、５単位のBamHI制限エンドヌク
レアーゼで消化された。 その後、溶液は１：１フェノ
ール：クロロフォルムの等量で一旦抽出された。 BamH
I 5'ならびに3'端を持つ1641塩基対cDNAは、Qiagen Q-2
0 カラム（Qiagen社、チャッツワース、カリフォルニア
州）およびメーカーが作成した使用説明書を用いて、水
層から精製された。
【００７４】切断し、精製した PCR生成物は、BamHI消
化したアルカリフォスファターゼ処理した Bluescript
KS(+) プラスミドに繋げられた。 連繋生成物は、XL1
細胞にサブクローニングされ、得られた形質転換体は、
配列決定によりスクリーニングされた。 （p11.6.c6と
称する）ある形質転換体は、Bluescript KS(+)HindIII
制限部位が、開始コドンをコードする挿入体の配列の5'
側の30塩基であるように調整したBamHI挿入体を用いて
単離された。 このプラスミドは、1689塩基対断片を遊
離するために、HindIIIおよびXbaI制限エンドヌクレア
ーゼで消化された。 この断片は、実施例１のように、
HindIII-およびXbaI-消化したCDM8ベクターDNAに繋い
だ。
【００７５】COS-7細胞は、p12.3.a/CDM8構築物で形質
変換、あるいは実施例１に記載したようなDEAE-デキス
トラン法を用いてCDM8のみで模擬的に形質変換した。
培地中の100μg/mlの最終DEAE-デキストラン濃度にて、
10μg DNA/ 400μg DEAE-デキストランの比率が用いら
れた。 48時間後、細胞は１mlの均質化緩衝液（40mMTr
is-HCl, pH=7.5 、15mMベンズアミジン塩酸、15mM 6-メ
ルカプトエタノール、0.7μg/mlペプスタチンＡ、 0.5
μg/ml ロイペプチン、および５mM Na4EDTA)に懸濁さ
れ、Dounceホモジェナイザーを用いて氷上に粉砕した。
−20℃での貯蔵用に最終50%(v/v)グリセロールを作成
するために、均質化物は1/2に希釈され、そしてホスホ
ジエステラーゼ活性の検定あるいはタンパク質濃度を決
定のいずれかのために使用された。 CaM-依存性および
非依存性活性が、実施例１のように決定された。 p12.
3.a DNAで形質変換された細胞は、基準レベルからし
て、15倍に増大したCaM-刺激性cAMPホスホジエステラー
ゼ活性および12倍に増大したCaM-刺激性cGMPホスホジエ
ステラーゼ活性を有していた。 模擬的に形質変換した
COS-7細胞は、CaM刺激であっても、基準レベルからし
て、PDE活性が認められなかった。
【００７６】実施例４：ウシ副腎皮質からのcGS-PDE cD
NAの単離、精製、および配列決定、および発現 全RNA が、前出のChomczynski et al., の方法を用いて
ウシ副腎外皮質から調製した。 ポリアデニリル化RNA
を、Poly(A) Quick(登録商標) mRNA精製キットを用い
て、使用説明書に従って、全RNA 調製物から精製され
た。 第一鎖状cDNAは、80単位のAMV逆転写酵素を、50m
M Tris-HCl(pH 8.3、42℃)、10mM 塩化マグネシウム、
10mM ジチオトレイトール、 0.5mM（それぞれ) デオキ
シヌクレオチド三燐酸、 50mM 塩化カリウム、2.5mM ナ
トリウムピロ燐酸、５μg デオキシチミジル酸オリゴマ
ー（12〜18塩基対) および65℃で、15分間かけて変性し
た５μg ウシ副腎皮質mRNAを含む反応混合物（40μl:最
終体積) に添加することにより合成された。 反応物
は、42℃で、60分間インキュベートされた。 第二鎖状
cDNAは、Watson et al., DNA Cloning: Practical Appr
oach, 1:79-87 (1985)の方法を用いて合成され、cDNAの
端は、T4 DNAポリメラーゼで鈍化させた。 EcoRI制限
エンドヌクレアーゼ部位は、EcoRIメチラーゼ(Promega)
を用いてメチル化され[前出のManiatis et al.,]、Eco
RIリンカー（50倍モル過剰）は、T4 DNAリガーゼを用い
てcDNAに連結された。 過剰のリンカーは、cDNAをEcoR
I制限エンドヌクレアーゼで消化し、Sepharose CL-4B
クロマトグラフィーによって除去した。 前出のAusube
l et al.。 （１μg ベクター当たり25〜50ngの）cDNA
は、EcoRI消化した脱燐酸化ZAP(登録商標）II (Stratag
ene社) アームに連繋し [Short et al.,Nuc. Acids Re
s., 16:7583-7599 (1988)]、Gigapack(登録商標）Gold
抽出物に、使用説明書に従って包み込んだ [前出のMani
atis et al.] 。
【００７７】最初に、未増幅のウシ副腎皮質cDNAライブ
ラリーを作成し、末端をγ-[32P]ATPおよびT4ポリヌク
レオチドキナーゼでラベルした冗長な23-merアンチセン
ス・オリゴヌクレオチド・プローブでスクリーニングし
た。 アミノ酸配列 配列番号：34 EMMMYHMK および 配列番号：35 YHNWMHAF に対応するオリゴマーが、Applied Biosystems model 3
80A DNA 合成装置を用いて作成された。 これらの配列
は、以下の通りである。
【００７８】配列番号：36 5'-TT CAT RTG RTA CAT CA
T CAT YTC-3' 配列番号：37 5'-AA NGC RTG CAT CCA RTT RTG RTA-3' 12個体集合 150mmプレート（１プレート当たり約50,000
pfu)からのプラークを有する円形の複製ニトロセルロー
ス・フィルターを、6x SSC、1x Denhardt 溶液、100μg
/ml酵母tRNA、0.05% ナトリウムピロ燐酸、および（１p
mol当たり106cpm を超える) 10cpm/ml放射ラベルしたプ
ローブを含む溶液中にて、45℃で一晩ハイブリダイズし
た。 フィルターを、室温にて、6x SSCで三度洗浄し、
続いて、オリゴマー・プローブの最低融点より10℃低い
温度にて、綿密に調製された6x SSCで洗浄し、そして、
Ｘ線フィルムに一晩曝した。
【００７９】（pcGS-3:2.1と称する）単一の2.1kb cDNA
クローンが単離され、そして配列決定された。 このク
ローンの大きな読取枠によって囲まれたアミノ酸配列
は、ウシ心臓破砕懸濁液の上清画分から精製されたcGS-
PDEのペプチド配列と同一であった。 前出のLeTrong et
al.。
【００８０】増幅された第二ウシ副腎皮質cDNAライブラ
リーが、（3CGS-5と称する）4.2kbcDNAを産生する、[32
P] ラベルしたCGS-3:2.1部分cDNAを用いてスクリーニン
グされた。
【００８１】ライブラリーは構築され、前出のManiatis
et al.にあるようにして増幅され、移植され、そし
て、クローンCGS-3:2.1 からのウシcDNA挿入体でスクリ
ーニングされた。 プローブは、前出のFeinberg et a
l.,の方法を用いて調製され、そして、放射ラベルしたD
NAが、Elutip-D（登録商標）カラムを用いて精製され
た。円形フィルターに結合した（12個の150mmプレート
にある600,000pfuの) プラークは、50％ホルムアミド、
20mM Tris-HCl (pH 7.5)、1x Denhardt 溶液、10％デキ
ストラン硫酸、0.11% SDS、および106cpm/ml の[32P]
ラベルしたプローブ(10 9cpm/μg)を含んだ溶液中で、42
℃で、一晩ハイブリダイズした。 フィルターは、室温
にて、15分間、6x SSC/0.1% SDSで三度洗浄し、そし
て、45℃で、15分間、0.1x SSC/0.1% SDS で二度洗浄し
た。 フィルターは、Ｘ線フィルムに一晩曝した。前出
のAusubel et al.。
【００８２】この最初のスクリーニングから、52個の推
定クローンが同定された。 これらクローンの20個が任
意に選択され、再移植とスクリーニング[前出のManiati
s etal.] を数回反復することにより精製され、そして
挿入cDNAsは、製造者が推奨するように、in vivo削除
[前出のShort et al.] によって、pBlue-script SK(-)
へサブクローニングされた。 これらクローンから調製
されたプラスミドDNAは、制限分析および／または配列
決定により解析された。 この研究から、最も大きな読
取枠を表現する4.2kb cDNAが同定された。 他の推定ク
ローンからのcDNA挿入体は短く、挿入端のヌクレオチド
配列の基づいた同一のものであるように思われた。
【００８３】推定cGS-PDE cDNAsは、製造者が指示して
いるように、Sequenase(登録商標）あるいは Taq Trak
(登録商標）キットを用いてSangerの方法[Sanger et a
l., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467] の修
正法によって配列決定された。 鋳型は、製造者の使用
説明書に従ったエキソヌクレアーゼIIおよびヤエナリ・
ヌクレアーゼを用いたベクター、pBluescript SK(-)(St
ratagene社)での一連の巣状削除 [Heinkoff, Gene, 28:
351-359 (1984)] を構築することにより、cDNAsから調
製された。 この方法によって、重複した鋳型が得られ
なかった場合には、cDNAsは好適な制限エンドヌクレア
ーゼ部位で開裂されてpBluescriptにサブクローニング
されるか、あるいは配列決定のための鋳型を用意するた
めに特定のオリゴマーが製造される。 一本鎖DNA 鋳型
は、製造者(Stratagene 社) が推奨するように、pBlues
criptプラスミド [前出のLevinson, et al.]に宿るヘル
パー・ファージ感染XL1 細胞によって分泌されたファー
ジからのDNAを単離することにより選抜した。 GENEBAN
K(Release 66.0)、EMBL(Release 25.0)、およびNBRF核
酸(Release 36.0)、およびタンパク質 (Release 26.0)
データベースの相同関係調査が、Devereux et al., Nu
c. Acids Res.,12:387-395 (1984)のGenetics Computer
Group ソフトウェアー・パッケージによって提供され
た Worldsearch、FASTA およびTFASTAプログラムを用い
て実施された。
【００８４】p3CGS-5 cDNAクローン挿入体の大きな読取
枠によってコードされるヌクレオチド配列および推定ア
ミノ酸配列を、配列番号：38および配列番号：39に示し
た。
【００８５】最初のメチオニン・コドンから始まって、
cDNAは算定分子量約103,000の921残基ポリペプチドをコ
ードする。 この配列に先んじる終止コドンは無いもの
の、反応開始メチオニン一致配列[Kozak、J. Cell Bio
l., 108:229-241 (1989)]は同定されていた。 転写終
止一致配列 [Birnstiel et al., Cell, 41:349-359 (19
85)]に先んじられたcDNAの3'端の36アデノシン残基は、
cGS-PDE mRNAの3'未翻訳配列のすべてが、このクローン
によって表現されていることを示唆している。
【００８６】S49 細胞[Bourne et al., J. Cell. Physi
ol., 85:611-620 (1975)] の推定ホスホジエステラーゼ
欠陥(PPD)株は、DEAEデキストラン法を用いて、cGS-PDE
cDNAで一過的に形質変換した。 cGS-PDE cDNAは、pZE
M 228と称する、亜鉛誘導できるメタロチオネイン・プ
ロモーターに続き、SV40転写終止配列に先がけた、哺乳
類発現ベクターにある独特のBamHIクローニング部位に
繋がれた。 DNAは、製造者が指示したように、Qiagen
pack-500カラムを用いて大規模プラスミド調製物から精
製された。 PPD-S49細胞は、10％心臓不活化ウマ血清、
50μg/mlペニシリンＧ、および50μg/mlストレプトマイ
シン硫酸を含むDMEMにて、37℃、水飽和７％二酸化炭素
雰囲気下で培養した。 形質変換に先立って、細胞の集
合100mmプレートは、当初の1/5の密度で、再移植され、
24〜36時間インキュベートした。 典型的な形質変換実
験において、PPD-S49(50-80%集合) は、Tris緩衝化食塩
水で洗浄し、約２×107個の細胞が、１ml TBS中の400μ
g DEAEデキストランと混合した10μg のDNAで形質変換
した。 細胞は、20分ごとにゆっくり攪拌して、37℃
で、１時間インキュベートした。 次に、最終濃度が10
％になるようDMSOが添加され、ピペットで吸引・排出し
て直ちに混合した。 ２分後、細胞は15容量部のTBSで
希釈され、遠心分離で回収され、そしてTBSとDMEMで連
続的に洗浄した。 細胞は、完全培地に再懸濁され、新
鮮な100mmプレート（1〜2 x 107細胞/10mm/プレート)
に播種された。 24時間後、細胞はTBSのみ、あるいは
（最終濃度が125μMの) 硫酸亜鉛を含むTBSで処理さ
れ、さらに24時間インキュベートした。 最終細胞ペレ
ットは、２mlの均質化緩衝液(40mM Tris-HCl; pH=7.5、
15mMベンズアミジン、 15mM β−メルカプトエタノー
ル、 0.7μg/mlペプスタインＡ、0.5μg/mlロイペプチ
ン、および５mM EDTA)に再懸濁され、dunce ホモジェナ
イザーを用いて氷上で粉砕した。 均質化物は、４℃
で、５分間、10,000 x gで遠心分離され、上清はホスホ
ジエステラーゼ活性およびタンパク質濃度について分析
された。
【００８７】cGS PDE 活性は、Martins et al., J. Bio
l. Chem., 257:1973-1979 (1982)にあるように基質とし
て[3H]cAMPを用いた先に示した方法によって決定した。
ホスホジエステラーゼ分析は、三つ並行して行った。
標準としてBSAを用いたBradford分析法[Bradford, An
al. Biochem., 72:248-254 (1976)] が、タンパク質を
定量するために用いられた。
【００８８】亜鉛処理を行わない場合、cGS PDE-ZEM 22
8構築物あるいはベクターのみで形質変換されたPPD S49
細胞では、基本活性あるいはcGMP刺激ホスホジエステラ
ーゼ活性の増加は検出されなかった。 しかしながら、
ベクターのみでなく、cGS-PDE cDNAで形質変換した亜鉛
処理した細胞は、cDNAがcGS-PDEをコードすることを示
す、cGMP強化cAMPホスホジエステラーゼ活性を発現し
た。 均質化物と50,000x g上清の総活性には、顕著な
相違は認められなかった。
【００８９】COS-7 細胞でのcGS-PDE cDNAの一過的発現
が、実施例１のようにして行われた。
【００９０】p3CGS-5の4.2kb 断片が、HindIIIとNotIを
用いて単離され、同じ酵素で消化されているプラスミド
pCDM8に挿入された。 p3CGS-5/pCDM8構築物で形質転換
されたCOS-7細胞に生成した生成物の特性は、下記実施
例５にて議論する。
【００９１】実施例５：ウシ脳からのcGS-PDE cDNAの単
離、精製、および部分的配列決定 Ａ．ウシ脳cGS-PDE cDNAクローン、pBBCGSPDE-5の単離 (Merck、Sharp & Dohme のRonald E. Diehl 氏から提供
された)λ ZAPベクターで構築されたウシ脳cDNAライブ
ラリーが、(p3CGS-5) ヌクレオチド位置番号１〜452に
対応する p3CGS-5 cDNAの450bp EcoRI/ApaI制限エンド
ヌクレアーゼ開裂断片でスクリーニングされた。 前出
のFeinberg et al.の方法を用いてプローブが調製さ
れ、[32P] ラベルしたDNA が、Elutip D（登録商標）カ
ラムを用いて精製された。 円形フィルターに結合した
（12〜150mmプレート上の全600,000の）プラークを、50
％ホルムアミド、20mM Tris-HCl (pH 7.5)、1x Denhard
t 溶液、10％デキストラン硫酸、0.1% SDS、および106c
pm/mlの[32P] ラベルしたプローブ(109cpm/μg)を含ん
だ溶液中で、42℃で、一晩ハイブリダイズした。 フィ
ルターは、室温にて、15分間、2x SSC/0.1% SDS で三度
洗浄し、そして、45℃で、15分間、0.1x SSC/0.1% SDS
で二度洗浄した。 フィルターは、Ｘ線フィルムに一晩
曝した。
【００９２】この最初のスクリーニングから40個の推定
クローンを選び取り、その内の６個を任意に選抜して、
再移植とスクリーニングを数回反復して精製した[前出
のManiatis et al.]。 挿入cDNAは、製造者の推奨にあ
るように、in vivo削除によってpBluescript SK(-) に
サブクローニングした。 各クローンの培地から調製し
たプラスミドcDNAは、SequenaseおよびTaq Trak配列決
定キットを用いて両端から配列決定を行った。 この実
験から得られた配列は、ウシ脳cDNAクローンpBBCGSPDE-
5がcGS-PDE cDNAであり、5-端側の副腎cGS-PDE cDNAと
は相違することを確認した。
【００９３】（タンパク質のアミノ末端領域をコードす
る）pBBCGSPDE-5 挿入体の5'末端の部分的配列解析は、
配列番号：40に示したセンス鎖を示し、一方で、該挿入
体の3'末端の配列決定は、配列番号：41に示したアンチ
センス配列を示した。
【００９４】Ｂ．ウシ脳cGS-PDE cDNAクローン、pBBCGS
PDE-7の単離 上記した最初の一連の精製から選択された40個の推定ク
ローンを、それぞれ宿主XL1細胞にスポットし、37℃
で、一晩インキュベートした。 プラークを、（p3CGS-
5 ヌクレオチド位置番号2661〜3034に対応する) p3CGS-
5 cDNAの370bp PstI/SmaI制限エンドヌクレアーゼ開裂
断片によってスクリーニングされた。 プローブは、前
出のFeinberg et al.の方法を用いて調製され、[32P]
ラベルしたDNAをElutip-D(登録商標) カラムで精製し
た。 円形フィルターに結合しているプラークを、50％
ホルムアミド、20mM Tris-HCl (pH 7.5)、1x Denhardt
溶液、10％デキストラン硫酸、0.1% SDS、および106cpm
/mlの[32P] ラベルしたプローブ(109cpm/μg)を含んだ
溶液中で、42℃で、一晩ハイブリダイズした。 フィル
ターは、室温にて、15分間、2x SSC/0.1% SDS で三度洗
浄し、そして、45℃で、15分間、0.1xSSC/0.1% SDS で
二度洗浄した。 フィルターは、Ｘ線フィルムに一晩曝
した。
【００９５】移植と再スクリーニングを数回反復した
後、６つの推定クローンが精製され、両端から配列決定
を行った。 cDNAクローンpBBCGSPDE-7の5-端側の配列
は、クローンpBBCGSPDE-5と同一であったが、副腎由来
クローンp3CGS-5 とは異なっていた。pBBCGSPDE-7 cDNA
クローンの3-端側の配列は、p3CGS-5挿入配列と同一で
あった。
【００９６】pBBCGSPDE-7挿入体の配列解析は、配列番
号：42にあるDNA配列と配列番号：43のアミノ酸配列を
示した。
【００９７】大きな読取枠は、副腎cGS-PDEイソ酵素(92
1残基）とほぼ同一の942残基ポリペプチドをコードす
る。 これら二つのイソ酵素の第一次構造における相違
点は、脳cGS-PDEのアミノ末端残基1〜46、および副腎cG
S-PDEの残基1〜25にある。 脳および副腎cGS-PDE の残
りのカルボキシ末端残基は同一である。
【００９８】COS-7 細胞での一過的発現のために、Hind
IIIおよびNotIを用いてpBBCGSPDE-7の3.8kb 断片が単離
され、HindIIIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで切
断されたプラスミドpCDM8に挿入された。 組み換えpBB
CGSPDE-7/pCDM8構築物は、COS-7細胞を一過的に形質変
換するために用いられた。 次いで、pBBCGSPDE-7/pCDM
8構築物および実施例４にて調製したp3CGS-5/pCDM8構築
物の特性を、比較した。 膜と上清画分は、形質変換し
たCOS-7細胞の抽出物から調製され、cGS-PDE活性に関し
て分析された。 pBBCGSPDE-7/pCDM8 およびp3CGS-5/pC
DM8プラスミド構築物双方が、COS-7細胞抽出物にて、cG
S-PDE活性を呈し、その活性の大半は上清画分で検出さ
れた。 しかしながら、pBBCGSPDE-7/pCDM8構築物で形
質変換したCOS-7細胞抽出物からの膜において、p3CGS-5
/pCDM8構築物で形質変換したCOS-7細胞から調製した膜
よりも10倍高いパーセント数の全cGS-PDE活性が検出さ
れた。 これら結果は、副腎cGS-PDE に関して、pBBCGS
PDE-7 cDNAによってコードされたイソ酵素が、細胞膜と
優先的に関連することを示すものである。
【００９９】実施例６：ヒトcGS-PDE cDNAsの取得のた
めのcGS-PDEウシ副腎cDNAの使用 ウシ・サイクリックGMP-刺激ホスホジエステラーゼをコ
ードするcDNAクローンに相同な、いくつかのヒトcDNAク
ローンが、ウシcDNAから誘導した核酸プローブを用いた
ハイブリダイゼーションによって単離された。 配列解
析とハイブリダイゼーション研究の組み合わせは、これ
らヒトcDNAクローンが、ヒト・ホスホジエステラーゼに
対応する読取枠を含んでいることを示している。
【０１００】cDNAライブラリーは、ウシcGS-PDE をコー
ドする4.2kb cDNA挿入体を含むプラスミドp3CGS-5から
のDNAで調査した。 このプラスミドは、制限酵素SmaI
およびEcoRIで消化した。 cDNA挿入体から誘導した約
3.0kb断片は単離され、アガロースゲル電気泳動で精製
された。 この断片は、PDEの全読取枠を含んでいる。
この断片は、任意プライミングにより、放射性ヌクレオ
チドでラベルした。
【０１０１】cDNAライブラリーは、プレート当たり約5
0,000プラークの密度で、150mmペトリ皿に置かれた。
二つのニトロセルロースフィルターのレプリカを調製し
た。放射性核酸プローブを、50％ホルムアミド、5xSSPE
(0.9M 塩化ナトリウム、0.05M NaH2PO4・H2O 、0.04M
水酸化ナトリウム、および0.005M Na2EDTA・H2O)、0.5%
SDS、100μg/mlサケ精巣DNA 、および5x Denhardt 溶
液にて、42℃で、一晩、フィルターにハイブリダイゼー
ションするために用いた。 フィルターを室温にて洗浄
し、そして、65℃にて、0.1% SDSを含む2x SSC中で洗浄
した。 陽性プラークは精製され、その挿入体は標準的
手法によって、DNA配列解析用の適切な配列決定用ベク
ターにサブクローニングされた。
【０１０２】まず、 (Clontech、任意の、dTプライム化
した）ヒト海馬mRNAから調製されたλgt10 cDNAライブ
ラリーがスクリーニングされた。 検査した約500,000
プラークの内、33個がプローブとハイブリダイズした。
これらファージの一つを、cDNA挿入体を除去するため
にEcoRIで消化した。 このEcoRI断片を含む挿入体を、
EcoRIで消化された Bluescript KSにクローニングし、
そして子牛腸アルカリホスファターゼで処理した。
【０１０３】この反応の一つの生成物が、ウシcGS-PDE
cDNAと比較した際に大きな相違点が認められる、プラス
ミドpGSPDE9.2であった。 pGSPDE9.2挿入体の5'側の
0.4kbが、ウシcDNAから分岐していた。 ヒトcDNAの5'
端から約0.7kbに、ウシcDNAから分岐した0.7kb領域があ
る。 この領域は、イントロンであろう。 ウシ・プロ
ーブとハイブリダイズした残りの海馬プラークの内の25
個が、PCR、ハイブリダイゼーションおよび／または配
列決定により検定された。 この領域を通じて、ウシと
ヒトcDNAsとの間における相違点は皆無であった。
【０１０４】海馬ライブラリーからの他の二つのファー
ジ、ファージλGSPDE7.1およびλGSPDE7.4が、EcoRIとH
indIIIで消化された。 それぞれが、cDNA挿入体の大半
を含む1.8kb断片と、約0.2kbファージλDNAを産生し
た。 それぞれの場合において、cDNA挿入体を典型的に
一括するEcoRI部位の一つが、恐らくライブラリーを構
築する際に壊されるため、λDNAは該断片中に存在す
る。 EcoRI/HindIIIは、EcoRI とHindIIIで消化された
Bluescript KS にクローニングされた。 この方法によ
り、プラスミドpGSPDE7.1 とpGSPDE7.4 が得られた。
cDNA挿入体は、ウシ・ホスホジエステラーゼcDNAの3'部
分に相同のDNAをコードする。 これらクローンにある
双方のcDNA挿入体は、EcoRI部位に始まり、その配列は
この部位の直後と相同である。
【０１０５】pGSPDE7.1およびpGSPDE7.4 cDNA挿入体部
分が配列決定され、その3'端の短領域以外は同一であっ
た。 pGSPDE7.1 のcDNA挿入体は、約70個のアデニン塩
基の配列で終わっており、一方でpGSPDE7.4 のcDNA挿入
体は、約20個のアデニン塩基の配列が続く、pGSPDE7.1
に存在しない三つのヌクレオチドで終わっている。
【０１０６】次に、λZapII (Stratagene)にて、ヒト心
臓mRNAから調製されたcDNAライブラリーは、スクリーニ
ングした約500,000のプラークから、一つのハイブリダ
イズするプラークを産生した。 ハイブリダイズする挿
入体を含むBluescript SK(-)プラスミドpGSPDE6.1 が、
λZapIIクローンからin vivoにて削除された。 配列解
析は、挿入体がウシ・ホスホジエステラーゼcDNAと相同
であることを示した。
【０１０７】相同領域は、pGSPDE9.2からの挿入体の配
列とpGSPDE7.1もしくはpGSPDE7.4にある挿入体の配列を
接合することにより形成された配列中にあるEcoRIの位
置にまで及ぶ。 つまり、海馬からのクローンは、完全
な読取枠を形成しているものと考えられる。
【０１０８】ヒト胎盤mRNAから誘導したλgt10ライブラ
リーは、スクリーニングした約800,000のプラークから
五つのハイブリダイズするプラークを産生した。 これ
ら胎盤cDNAクローンは短く、その配列は、海馬cDNA pGS
PDE9.2の部分と同一であった。U118多形性神経膠cDNAラ
イブラリーからの５×105 プラーク、脾臓cDNAライブラ
リーからの５×105プラーク、および副腎ライブラリー
（クッシング症候群）からの５×105プラークのスクリ
ーニングでは、ハイブリダイズするプラークは得られな
かった。
【０１０９】ヒトとウシcGS-PDE 配列との間に大きな相
同性を付与すれば、0.4kb 5'配列が人造物であるか否か
を決定するための、ヒトcGS-PDE の5'端を含む多数の独
立したcDNAクローンを取得することが決断される。 ウ
シcGS cDNAプラスミドp3cgs5の5'端からの約0.95kb Eco
RI-HindIII断片は、任意にプライム化され、多数のヒト
cDNAライブラリーをスクリーニングするプローブとして
用いた。 海馬ライブラリーのスクリーニングは、上記
したスクリーニング条件と同一条件下で実施した。 残
りのスクリーニングのすべては、下記実施例７のヒト心
臓cDNAライブラリーのスクリーニングに関して記述した
ようにして実施した。 (Hut78、dt-プライム化した)
ヒトT4細胞ライブラリーからの５×105プラーク、 (任
意に、dt-プライム化した) 海馬cDNAライブラリーから
の106プラーク、 (dt-プライム化し、5'伸長した、Clon
tech) ヒト肝臓cDNAライブラリーからの５×105プラー
ク、(dt-プライム化した) ヒトSW1088多形性神経膠cDNA
ライブラリーからの５×105プラーク、 (任意に、dt-プ
ライム化した) 同様のヒトcDNAライブラリーからの５×
105プラーク、および (任意にプライム化した) ヒト肺c
DNAライブラリーからの1.5×106プラークのスクリーニ
ングでは、陽性体は得られなかった。 (任意に、dt-プ
ライム化した、Stratagene) ヒト胎児脳cDNAライブラリ
ーからの５×105プラークのスクリーニングでは、二つ
の陽性体が得られた。 これらを、HFB9.1およびHFB9.2
と称した。
【０１１０】Bluescript SK(-)プラスミドpHFB9.2 およ
びpHFB9.1は、λZapII クローンからin vivoにて削除さ
れた。 DNA配列解析では、HFB9.1は、HFB9.2よりもさ
らに3'側の約80個目のヌクレオチドから始まり、HFB9.2
への配列の約 1.9kbのイントロンへ読み込む。 HFB9.2
は、cGS-PDE の全読取枠を覆うが、停止コドンから後
の、イントロンと思われる59個のヌクレオチドを読み込
む。 双方共に、5'側の0.4kbとpGSPDE9.2 に見られる
推定したイントロンが欠けている。 HFB9.2の全読取枠
が、単離され、酵母発現ベクターpBNY6Nにて組み立てら
れた。 pHcgs6nと称する得られたプラスミドは、EcoRI/
XhoI挿入体として、cDNAのコード領域を含む。 挿入体
のDNA および推定アミノ酸配列を、配列番号：44および
45にそれぞれ示した。
【０１１１】実施例７：ヒトCaM-PDE 61kDa cDNAの取得
のためのCaM-PDE 61kDa ウシ脳cDNAの使用 ウシ61kDa CaM-PDEをコードするcDNAと相同な、ヒトcDN
Aクローン、λCaM H6aとλCaM H3aが、ウシ特異性酵素
をコードするcDNAから誘導された核酸プローブを用いた
ハイブリダイゼーションによって得られた。 配列解析
とハイブリダイゼーション研究の組み合わせは、λCaM
H6aが、ヒトCaM-PDEをコードする読取枠の大半を含むこ
とを示している。
【０１１２】ヒトDNAを単離するために用いたハイブリ
ダイゼーション・プローブは、PCR処理によるウシ肺組
織の第一鎖状cDNAから誘導された。 具体的には、実施
例１にてPCR-2Sと称した23-merのオリゴヌクレオチド
(配列番号：１参照）は、pCAM-40挿入体のコード領域の
大部分に相当する1098塩基対のcDNA断片を作成するため
に、実施例１および３の一般的手法に従って、アミノ酸
配列、 配列番号：47 NMKGTTNDを意味する 配列番号：46 5'-TCRTTNGTNGTNCCYTTCATRTT-3' のpCAM挿入配列を基にした、冗長なアンチセンス23-mer
のオリゴヌクレオチド(PCR-5AS)およびウシ肺cDNAと、P
CR反応において結合した。 PCR生成物は、0.5μg/mlの
エチジウムブロミドを含む0.4M Tris-酢酸/0.001M EDTA
緩衝液を用いた１％アガロース・ゲルにて精製した。
DNA生成物は、紫外線で視覚化され、カミソリ刃でゲル
よりきれいに摘出され、Geneclean II試薬キットを用い
て精製され、そして、EcoRV切断したpBluescript ベク
ターDNA に繋がれた。
【０１１３】PCR増幅生成物がCAM-PDE cDNAsであるか否
かを決定するために、サブクローニングしたPCR DNA生
成物は、T3およびT7プロモーター・プライマーと、Sequ
enaseあるいはTaq Polymerase配列決定キットのいずれ
かを用いて、両端から配列決定を行った。 このDNAの
各端から約250塩基は、ウシCAM-PDEのアミノ酸配列と比
較され、PCR DNA生成物が、部分的CAM PDE cDNAである
ことが確認された。 このクローンは、pCAM-1000と称
され、pCAM-40 の挿入体の409 から1505のヌクレオチド
に対応する1.1kb核酸の挿入体を含んでいた。 この1.1
kb断片は、アガロース・ゲル電気泳動で精製され、そし
て、制限酵素AccIで消化された。 この二つの断片は分
離され、そして、アガロース・ゲル電気泳動で精製され
た。 これら分離された断片は、任意プライミングによ
り、放射性ヌクレオチドがラベルされた。
【０１１４】ヒトcDNAライブラリーを、150mmペトリ皿
に、皿当たり約50,000プラークの密度で移植され、そし
て、複製ニトロセルロース・フィルター・レプリカが調
製された。 各プローブは、各組の複製フィルターにハ
イブリダイズされた。 フィルターは、3x SSC、0.1% s
arkosyl、50μg/mlサケ精巣DNA、10x Denhardt溶液、20
mM燐酸ナトリウム(pH 6.8)にて、65℃で、一晩ハイブリ
ダイズした。 フィルターは、65℃で、0.1% SDSを含ん
だ2x SSCで洗浄した。
【０１１５】ヒト海馬mRNAから調製したλgt10ライブラ
リーは、スクリーニングした約500,000プラークから、
三つのハイブリダイズするプラークを産生した。 これ
ら三つのハイブリダイズしたプラークの内、二つは双方
のプローブとハイブリダイズし、三番目のものは、二つ
のプローブよりも長いプローブとハイブリダイズした。
λCam H6aクローンは、pCAM-40のウシ・クローンをコ
ードするcDNAに相同な、約２kb挿入体を含む。
【０１１６】λCam H6a cDNAは、配列解析のために、プ
ラスミドBluescript KSにサブクローニングされた。 c
DNAライブラリーはEcoRIリンカーで構築されてきたが、
cDNA挿入体の側面に位置すべきEcoRI部位の一つが、Eco
RIで切断されていなかった。そして、cDNAは、約0.7kb
EcoRI/HindIII断片(pcamH6C)、および約1.3kbのcDNAと
側面に位置する0.25kbのλgt10ベクターDNA(pcamH6B)を
含む約1.6kb HindIII断片の二つの断片としてサブクロ
ーニングした。 DNA配列解析は、それが、コード領域
の中程にある二つの塩基対が欠けていると思われるヒト
cDNAを除いて、ウシ61k CaM-PDEと相同なヒトCaM-PDEの
大半をコードしていることを示している。 これら欠け
ているヌクレオチドは、最大の相同性を示すpCAM-40ウ
シ61kDa CaM-PDE(配列番号：５）と対照すれば、ヒトcD
NA配列の626および627の位置に対応する。
【０１１７】ウシ61kDa CaM-PDEプローブでスクリーニ
ングされた海馬cDNAライブラリーからの他のcDNAクロー
ンは、λcamH2aであった。 λcamH6a cDNAの場合のよ
うに、挿入体の両端に存在すべき二つのEcoRI部位の一
つのみを切断する。 このcDNAのための最初のサブクロ
ーニングとDNA配列解析は、側面に位置するλgt10ベク
ター・アーム中のオリゴで作成されたPCR断片を利用し
た。 このcDNAは、λcamH6aでの挿入体の5'端の多くと
重複しており、ウシ配列から推定された二つのヌクレオ
チドをさらに含み、そして、PDE読取枠を維持すること
を必要とする。λcamH2a挿入体も、イニシエーター・メ
チオニンと、HindIII部位の下流の、二つのイントロン
を含んでいるように思われる。 （pcamH6C によって覆
われる領域に相当する) λcamH2aからのEcoRI/HindIII
断片は、プラスミドBluescript SK-にサブクローニング
され、pcamH2A-16と称された。 これは、下記する酵母
発現プラスミドの構築における、さらに二つの塩基対の
源として用いられた。
【０１１８】二つの異なるプラスミドが、酵母にて、ヒ
トCaM-PDE発現のために構築された。
【０１１９】一方のプラスミド、pHcam61-6N-7は、全読
取枠を含んでいる。 二つ目のプラスミド、pHcam61met
140は、（ヌクレオチド位置505にて始まる) 内部メチオ
ニンから始まり、読取枠の終端まで伸びる。 これら発
現プラスミドは、読取枠の3'部分を修飾し、そして、3'
に二つの異なる修飾した5'端を付加することによって構
築される。 pHcam61-6N-7のcDNA挿入体の配列を、配列
番号：48に示し、それによってコードされるCaM-PDEの
推定アミノ酸配列を配列番号：49に示した。cDNA挿入体
の構築中に、826の位置のヌクレオチドは、ＴからＣに
改変されたが、コードされたアミノ酸は保存されてい
た。 上記したように、プラスミドpHcam61met140 は、
pHcam61-6N-7のコード領域の最初の140個のコドンが欠
けているcDNA挿入体を有しているが、その他は同一であ
る。
【０１２０】三番目のcDNA、λcamH3aは、約 2.7kb挿入
体を含んでいた。 このcDNA挿入体は、配列解析のため
にサブクローニングされた。 cDNAライブラリーは、Ec
oRIで構築されてきたが、λcamH3a中に挿入されたcDNA
は、EcoRIで摘出することはできなかった。 恐らく、E
coRI部位の一つは、ライブラリーの構築中に壊されたも
のと思われる。 cDNA挿入体は、λクローンからHindII
IおよびEcoRIでの消化によって摘出された。 この消化
によって、cDNA挿入体に付いたλgt10の左アームからの
DNAの一部分を含む0.6kb HindIII断片と、cDNA挿入体の
残りの部分を含む約2.4kbのHindIII/EcoRI断片、の二つ
の関連する断片を産生する。 これら二つの断片は、約
３kbの断片を産生するために、プラスミドBluescript K
Sにて組み立てられる。 小さなHindIII断片の配向は、
最初のλクローンと同じであった。このサブクローン
は、pcamH3EFとして知られている。 このcDNAは、ウシ
CaM-PDE 61kDa cDNAからのウシ・プローブとハイブリダ
イズするが、配列解析は、異なるCaM-PDE遺伝子の生成
物であると思われること示した。 プラスミドpcamH3EF
は、全読取枠であろうものを含んでおり、その大半の長
さにわたって、pHcam 61-6N-7の挿入体によってコード
されたタンパク質と、約75％相同であるタンパク質をコ
ードする。 DNAと推定アミノ酸配列を、配列番号：50
と51にそれぞれ示した。pcamH3EFのヌクレオチド80と10
0の間の領域のDNA 配列は判然としていない。この領域
は、イニシエーター・メチオニン・コドンの5'側である
ので、読取枠には効果が及ばない。
【０１２１】pcamH3EFの約2.4kbの断片は、制限酵素Hin
dIIIとEcoRIでの消化に続いて、ゲル精製された。 こ
の断片は、上記したスクリーニング方法と同様に、さら
にヒトcDNAライブラリーをスクリーニングするために用
いられた。 ヒト心臓cDNAライブラリー(Stratagene)か
らの約５×105個のプラークのスクリーニングは、pcamH
3EFプローブにハイブリダイズする二つのプラークを産
生した。 Bluescript SK-プラスミドpcamHellaは、これ
ら陽性λZapIIクローンの一つからin vivoにて摘出され
た。 cDNA挿入体のDNAと推定アミノ酸配列を、配列番
号：52と53にそれぞれ示した。 pcamHellaの配列解析
は、pcamH3EFのヌクレオチド位置610にて挿入が始ま
り、DNA配列がpcamH3EFのそれから分岐する位置である
ヌクレオチド位置2066までほとんど同一であった。 pc
amHellaのcDNA挿入体は、約0.6kbにまで続いていた。
この分岐の結果、cDNAにある読取枠によってコードされ
るタンパク質のカルボキシ末端が改変される。 pcamH3E
F cDNAは、634アミノ酸（分子量72,207)のタンパク質を
コードすることができた。 pcamHellaのcDNAの5'が、p
camH3EFの5' (ヌクレオチド位置610の5') と同じである
と仮定すれば、pcamHellaは、709 アミノ酸（分子量 8
0,759)をコードできる。 これら3'分岐端は、代替接
合、接合の欠如、もしくはクローニング過程で近接して
並べた関連のないDNA配列の結果によるものであろう。
【０１２２】実施例８：酵母表現型欠陥の相補性のため
のウシおよびヒトPDE cDNAの発現 この実施例は、酵母ホスホジエステラーゼ遺伝子の突然
変異に関連する熱ショック表現型を抑制する機能性PDE
発現物質の能力を実証する酵母中でのウシおよびPDEク
ローンの発現に関し、さらに発現生成物の生化学的分析
にも関する。これら実験に用いた宿主細胞は、共に熱シ
ョック感受性、すなわち、55〜56℃程度の昇温下に曝し
た細胞の生存不能によって特徴づけられる表現型に起因
するpde 1-、pde 2-であるS. cerevisiae酵母株 10DAB(AT
CC受託 No. 74049)およびYKS45である。これら相補性実
験において、挿入された遺伝子生成物が熱ショック表現
型を顕著に修飾することが認められた。 さらに、この
能力は、化学化合物の哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激
性およびcGMP刺激性サイクリックヌクレオチド・ホスホ
ジエステラーゼのin vivoでの酵素活性を修飾する能力
(および、特に阻害する能力) の検定するよう設計した
システムの可能性を実証している。
【０１２３】Ａ. CaM-PDEをコードするcDNAの発現によ
る酵母表現型相補性 酵母発現プラズミドpADNS (ATCC 受託No. 68588)および
pADNS(ATCC 受託No. 68587)へ挿入する2.2kb cDNA断片
は、ポリメラーゼ連鎖反応によるプラズミドpCAM-408
(実施例１) から誘導された。 要約すれば、下記のPCR
増幅が、pCAM-40DNA挿入体をベクター内においてADH1プ
ロモーターと共に適切に整列するよう改変するために用
いられた。
【０１２４】PCR反応に用いたオリゴヌクレオチド・プ
ライマー (オリゴA)の一つ 配列番号：54 5'-TACGAAGCTTTGATGGGGTCTACTGCTAC-3' は、塩基対位置100-116にてpCaM-40 cDNAクローンにア
ニールされ、開始メチオニンコドンの前にHindIII部位
を含んでいる。 第二オリゴヌクレオチド・プライマー
(オリゴ B) 配列番号：55 5'-TACGAAGCTTTGATGGTTGGCTTGGCATATC-
3' は、位置520-538にてアニールされるよう設計されてお
り、メチオニンコドンの前にHindIII部位の二つの塩基
も含んでいた。 三番目のオリゴヌクレオチド 配列番号：56 5'-ATTACCCCTCATAAAG-3' は、挿入体の3'であるプラスミド中の位置にアニールさ
れた。
【０１２５】ある反応のために、オリゴA とオリゴC
が、鋳型としてのpCAM-40共に、プライマーとして用い
られた。 この反応の核酸生成物は、全読取枠を含んで
いた。第二反応では、オリゴAとオリゴBを、鋳型pCAM-4
0 に、プライマーとして用い、カルモジュリン結合領域
をコードするcDNA配列部分が欠けた核酸生成物を産生し
た。 これら増幅産生物は、HindIIIおよびNotIで消化
され、HindIII/NotI消化酵母発現ベクターpADNSおよびp
ADANSに繋がれた。 挿入体を含むプラズミド・クロー
ンが選択され、リチウム酢酸形質転換によりS. crevisi
ae株10DABに形質転換された。
【０１２６】形質転換した酵母は、アミノ酸ロイシン(S
C-ロイシン寒天) が欠如している合成培地を含む寒天平
板上に画線培養し、30℃で、３日間生長させた。 この
寒天平板のレプリカを、三つのタイプの寒天平板：SC-
ロイシン寒天のレプリカ、室温でのYPD寒天のレプリ
カ、および56℃に温めたYPD寒天平板のレプリカ、を作
成した。 これら三つの温めたレプリカを、56℃で、1
0、20、または30分間維持した。これらレプリカは室温
にまで冷やされ、すべての平板を30℃にて置いた。 Ca
M-PDEを発現するよう構築したプラスミドで形質転換し
た酵母は、熱衝撃耐性であった。 より具体的には、全
読取枠を発現するように設計され、さらに、pADNSまた
はpADANSのいずれかにて、（触媒領域を含むが、カルモ
ジュリン結合領域を含まない）末端削除したタンパク質
を発現するように設計された構築物は、10DAB宿主細胞
の熱ショック感受性表現型、すなわち、56℃温度衝撃耐
性、に相補的であった。
【０１２７】同様の方法で、プラズミドpHcam61-6N-7と
pHcam61met140(実施例７)が、酵母宿主10DAB中に形質転
換された。 熱ショック表現型は、双方の形質転換にて
抑制された。
【０１２８】Ｂ．発現生成物の生化学的分析 ウシCaM-PDE 発現生成物も、10DAB酵母細胞からの細胞
を含まない抽出物を調製し、抽出物の生化学的ホスホジ
エステラーゼ活性を測定することによって評価した。
この目的のために、形質転換した酵母の200ml培養液
を、液体SC-ロイシン中にて約600万細胞/mlの密度にな
るまで生育させた。 細胞は遠心分離して回収され、細
胞ペレットは冷凍された。 抽出物は、氷上に冷凍細胞
を解凍し、PBS １mlと同量のガラス・ビーズと混合し、
酵母細胞を粉砕するためこれらを撹拌し、そして、不溶
性の残骸を除去するために、粉砕した細胞を約12,000 x
gで、５分間、遠心分離することにより調製した。 上
清が、ホスホジエステラーゼ活性について分析された。
【０１２９】50μlまでの酵母細胞の抽出物が、10×75m
mガラス製試験管中の、50mM Tris (pH 8.0)、1.0mM EGT
A、 0.01mg/mL BSA (ウシ血清アルブミン) 、[3H]- サ
イクリックヌオクレチド(4-10,000cpm/pmol)、および５
mM MgCl2の最終体積250μlにて、30℃で、ホスホジエス
テラーゼ活性が分析された。 インキュベーションを、
0.5M炭酸ナトリウムpH9.3、1M塩化ナトリウム、および
0.1% SDSからなる 250μl加えることで終了した。 ホ
スホジエステラーゼ反応の生成物は、BioRad Affi-Gel
601ホウ酸ゲルの８×33mmカラムでのクロマトグラフィ
ーにより、サイクリック・ヌクレオチドから分離され
た。 カラムは0.25M重炭酸塩ナトリウム(pH 9.3)と0.5
M 塩化ナトリウムで平衡化された。 反応はカラムにも
適用された。 検査用試験管は、0.25M 重炭酸塩ナトリ
ウム(pH 9.3)と0.5 M 塩化ナトリウムですすぎ、このす
すぎはカラムについても行った。 ホウ酸カラムは、3.
75mlの0.25M重炭酸塩ナトリウム(pH 9.3)と0.5 M塩化ナ
トリウムで二度洗浄され、さらに、0.5mlの50mM酢酸ナ
トリウム(pH 4.5)によって洗浄された。 生成物は、0.
1Mソルビトールを含む2.5 mlの50mM酢酸ナトリウムによ
って溶出され、シンチレーション瓶に回収された。 溶
出物は、4.5mlのEcolite シンチレーション・カクテル
と共に混合され、液体シンチレーション分光測定法によ
って放射能が測定された。
【０１３０】pADNSあるいはpADANSのいずれにおいて
も、ウシ全読取枠を発現するよう、また、先端削除した
タンパク質を発現するよう設計された双方の構築物は、
細胞抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ分析により
決定した活性タンパク質を発現した。pcam61met140を宿
す10DAB の抽出物は、計測可能なホスホジエステラーゼ
活性 (下記、part Dの第二方法を参照) を呈する一方
で、pcamH61-6N-7を宿す10DAB細胞の抽出物は検出可能
な活性が欠如していた。
【０１３１】Ｃ．cGS-PDEをコードするcDNAの発現によ
る酵母表現型相補性 ウシcGS-PDEをコードする4.2kb DNA断片を含むプラスミ
ドp3CGS-5を、プラスミドの挿入に適した制限部位で、c
DNAの最初の147塩基を置き換えることにより、pADNSお
よびpADANSへのクローニングに適用した。 オリゴヌク
レオチドBS1は、HindIII 部位をコードする配列 配列番号：57 5'-TACGAAGCTTTGATGCGCCGACAGCCTGC を有し、cDNA挿入体の148-165 の位置にアニールした。
BS3と称するオリゴヌクレオチド 配列番号：58 GGTCTCCTGTTGCAGATATTG を、唯一のNsiI部位の3'の835-855の位置にアニールし
た。 HindIIIとNsiIでの消化を終えて得られたPCR-生
成断片は、HindIIIとNsiIで消化されたp3CGS-5に繋が
れ、これにより、ウシcDNAの最初の5'端を取り代えた。
この結合から得られたプラスミドは、修飾cDNA挿入体
を遊離するためにHindIIIとNotIで消化された。
【０１３２】挿入体は、そのHindIIIとNotI部位にて、p
ADNSおよびpADANSへクローニングされた。 そして、こ
れらプラスミドは、酢酸リチウム法によって、酵母株10
DABに形質転換され、形質転換された細胞を生長させ、
上記Ａにあるように昇温下に曝した。 ウシcGS-PDEを
発現するよう構築したプラスミドで形質転換した酵母
は、熱衝撃耐性であった。
【０１３３】同様の方法にて、プラスミドpHcgs6n(実施
例６) を、酢酸リチウム法によって、酵母宿主株YKS45
に形質転換した。 プレートを最初、二日間、30℃にて
培養し、温めたプレートを56℃にて、10、20、30および
45分間維持した以外は、上記したようにして、熱ショッ
ク分析を行った。 ヒトcGS-PDEの全長を発現するよう
に設計したプラスミドで形質転換した酵母は、熱衝撃耐
性であった。
【０１３４】Ｄ．発現生成物の生化学的分析 ウシcGS-PDEの発現も、酵母からの細胞を含まない抽出
物を調製し、抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ活
性を測定することによって評価した。 この目的のため
に、形質転換した10DAB酵母細胞の50ml培養液を、液体S
C-ロイシン中にて約1000万細胞/mlの密度になるまで生
育させた。 Sherman et al., Methods in Yeast Genet
ics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Ha
rbor, NewYork (1986) 。 細胞は遠心分離して回収さ
れ、細胞ペレットは一度洗浄され、そして最終細胞ペレ
ットは冷凍された。 抽出物を調製すつために、冷凍細
胞は氷上で解凍され、PBS １mlと同量のガラス・ビーズ
と共に混合し、酵母細胞を粉砕するためこれらを撹拌
し、そして、不溶性の残骸を除去するために遠心分離し
た。 そして、上清が、上記Ｂにあるように、ホスホジ
エステラーゼ活性について分析された。 pADNSあるい
はpADANSのいずれかにある構築物は、細胞抽出物の生化
学的ホスホジエステラーゼ活性によって決定された活性
タンパク質を発現した。
【０１３５】プラスミドpHcgs6nで形質転換したYKS45
を、1〜2×107細胞/mlになるまで SC-ロイシン培地にて
生育した。 細胞を遠心分離により採取し、細胞ペレッ
トを凍結した。 典型的には1010細胞を含んだ凍結細胞
ペレットは、全体積が 2.5mlになるように、溶解緩衝液
（25mM Tris-HCl pH 8、5mM EDTA、5mM EGTA、1mM o-フ
ェナントロリン、0.5mM AEBSF、0.01mg/mL ペプスタチ
ン、0.01mg/mL ロイペプチン、0.01mg/mL アプロチニ
ン、 0.1% 2-メルカプトエタノール）と共に混合した。
混合物を氷上で解凍し、そして、等量のガラス・ビー
ズを添加した。 細胞を、氷上での、攪拌および冷却の
サイクルによって粉砕し、そして、５mlの全溶解緩衝液
が加えられるように、粉砕した細胞と追加の溶解緩衝液
が混合された。 懸濁液は、12,000×gで、５分間、遠
心分離された。 上清は除去された後、直ちに分析に供
されるか、あるいはドライアイス・エタノール・バスに
て急速冷凍されてから、−70℃にて保存された。
【０１３６】ホスホジエステラーゼ活性は、５mM塩化マ
グネシウムおよび放射性物質を含んだ（40mM Tris-HCl
pH 8.0、1mM EGTA、0.1mg/mL BSA)にて、細胞抽出物の
部分試料を混合し、30分間まで30℃でインキュベート
し、そして、反応を停止緩衝液（0.1Mエタノールアミン
pH9.0、0.5M硫酸アンモニウム、10mM EDTA、最終濃度
0.05%のSDS)で終了することにより分析した。 生成物
は、BioRad Affi-Gel 601でのクロマトグラフィーによ
り、サイクリック・ヌクレオチド物質から分離された。
試料を、カラム緩衝液（0.5M硫酸アンモニウムを含ん
だ0.1Mエタノールアミン) にて平衡化した Affi-Gel 60
1の約0.25mlを含んだカラムに適用した。カラムを、カ
ラム緩衝液の0.5mlで５回洗浄した。 生成物は、0.25M
酢酸の４つの0.5ml部分試料で溶出され、５mlのEcolume
(ICN Biochemicals)と共に混合した。放射性生成物
は、シンチレーション計測法により測定された。 ヒト
cGS-PDEを発現する酵母からの抽出物は、サイクリックA
MPおよびサイクリックGMP双方を、このイソ酵素におい
ても予期されたように加水分解した。
【０１３７】実施例９：CaM-PDEおよびcGS-PDEポリヌク
レオチドを含む組織発現研究 Ａ．ノザン・ブロット分析 上記実施例１、３および４にて単離したDNAsを、様々な
組織から単離した全選択RNAsあるいはポリA-選択 RNAs
をスクリーニングするためのプローブを作成するために
使用し、その結果を下記にまとめた。
【０１３８】１．EcoRI およびSmaIで消化したプラスミ
ドp3CGS-5から単離した約３kbの放射ラベルしたcDNA断
片を用いて、ウシ副腎皮質、副腎髄質、心臓、大動脈、
大脳皮質、脳幹神経節、海馬、大脳、骨髄／脊髄、肝
臓、腎臓皮質、腎臓髄質、腎臓乳頭、気管、肺、脾臓お
よびT-リンパ球組織の種類から調製したmRNAにてノザン
分析を行った。 単一の4.5kb mRNAは、ほとんどの組織
にて検出された。 cGS-PDE mRNAの大きさは、大脳皮
質、脳幹神経節および海馬から単離したmRNAより若干大
きい（約4.6kb)ように思われた。 副腎皮質において
は、cGS-PDE mRNAが豊富であった。 副腎髄質および心
臓においても、cGS-PDE mRNAは豊富であった。脳と腎臓
の解剖学的に異なる領域において、特異的に発現してい
るようであった。五つの異なる脳の領域から単離したRN
Asの内、cGS-PDE mRNAは、海馬、大脳皮質および脳幹神
経節において最も豊富であった。 cGS-PDE転写は、大
脳あるいは骨髄および脊髄RNAsにおいては、ほとんど検
出されなかった。 cGS-PDE mRNAは、腎臓のすべての領
域にて検出されたが、外皮赤色骨髄および乳頭において
豊富に認められた。 cGS-PDE mRNAは、肝臓、気管、
肺、脾臓およびT-リンパ球RNAにおいても検出された。
大動脈から単離したRNAでは、cGS-PDE mRNAは、ほとん
ど検出されなかった。
【０１３９】２．放射ラベルしたDNAプローブが、プラ
スミドpCAM-40のcDNA挿入体の熱変性した1.6kb EcoRI制
限エンドヌクレアーゼ断片にまで及ぶ任意に六つのプラ
イム化をした断片から調製した。 ノザン分析にて、DN
A プローブは、脳の3.8および 4.4kb mRNAsとハイブリ
ダイズし、分析した他の組織のほとんどには、大脳皮
質、脳幹神経節、海馬、大脳、骨髄および脊髄、心臓、
大動脈、腎臓髄質、腎臓乳頭および肺が含まれる。 肝
臓、腎臓皮質および気管からの3.8kb mRNAとプローブと
のハイブリダイゼーションでは、比較的長い放射能写真
的露光の後にのみ検出された。
【０１４０】３．中枢神経系のいくつかの組織からのmR
NAのノザン・ブロット分析を、プローブとして（保存さ
れたPDE触媒領域のほとんどを含んだ) サブクローニン
グされ、ラベルされたp12.3a DNA断片を用いて行った。
最も強いハイブリダイゼーションシグナルが、脳幹神
経節からのmRNAにおいて認められ、また、強力なシグナ
ルが、腎臓乳頭および副腎髄質を含む他の組織からのmR
NAにおいても認められた。
【０１４１】Ｂ．RNAse保護 １．三つのアンチセンス・リボプローブが構築された。
すなわち、p3cGS-5の触媒領域コード部分 (配列番
号：38の塩基2393から2666に対応する273塩基対)に対応
するプローブ３；cGMP結合領域をコードする (塩基 959
から1426に対応する468塩基対) に対応するプローブ
２；および、アミノ末端コード領域 (塩基１から457に
対応する457塩基対) の部分およびその5'端に対応する
プローブ１である。
【０１４２】試験した組織のすべてから抽出した全RNAs
は、プローブ２および３を完全に保護した。 副腎皮
質、副腎髄質および肝臓から単離したRNAsで、リボプロ
ーブ・のほとんど完全な保護(457塩基) も観察された。
しかしながら、大脳皮質、脳幹神経節および海馬から
単離したRNAは、リボプローブ１の約268-塩基断片しか
保護されていなかった。 脳RNA 試料にて観察された大
きな断片と同一の大きさの部分的に保護されたプローブ
１の比較的少量が、肝臓を除く試験した組織のすべてか
ら単離したRNAsにおいても検出された。 興味深いこと
に、心臓RNAは、相補的に保護された（457塩基の) リボ
プローブと、脳RNAのような、268-塩基断片を産生し
た。 しかしながら、他のいかなる組織から単離したRN
Asを用いて観察された保護パターンと異なり、部分的に
保護されたリボプローブ１断片は、より豊富であるよう
に思われた。 試験結果は、二つの異なるcGS-PDE RNA
種が発現されていることを示唆している。
【０１４３】２．CaM-PDE の触媒領域もしくはCaM-結合
領域のいずれかの部分に対応する放射性ラベルしたアン
チセンス・リボプローブが、pCAM-40cDNA の制限エンド
ヌクレアーゼ開裂断片 (AccI/SstIおよびTth111I/HincI
I) から構築された。 五つの異なる脳領域（大脳皮
質、脳幹神経節、海馬、大脳、骨髄／脊髄）から単離し
た全RNAsは、CaM-結合および触媒領域の双方をコードす
るアンチセンス・リボプローブを完全に保護した。 心
臓、大動脈、肺、気管および腎臓からの全RNAsは、触媒
領域に対応するリボプローブを完全に保護するが、CaM-
結合領域リボプローブの約150塩基しか保護せず、61kD
CaM-PDEに構造的に関連するイソ形態が、これら組織に
て発現されていることを示唆している。
【０１４４】３．アンチセンス・リボプローブは、プラ
スミドp12.3aを基にして作成され、配列番号：26の塩基
-1から363および883から1278に対応する。 前者のプロ
ーブは、推定CaM-結合領域を通じて、5'非コード配列の
113 塩基と開始メチオニン・コドンを含んでいるもの
の、後者は触媒領域をコードした。 分析したすべての
組織の中で、脳幹神経節からのRNAが最も強力に各プロ
ーブを保護した。 アミノ末端を意味するプローブに相
当する大きさの強力なシグナルが、大脳皮質、小脳、脳
幹神経節、海馬および副腎髄質RNAによる保護において
観察された。 たとえ、組織が保存領域プローブのノザ
ン分析およびRNAse保護のシグナルを示していても、腎
臓乳頭あるいは精巣RNAによるプローブでは何の保護も
付与されず、構造的に関連のあるイソ酵素がこの組織に
て発現されていることを示唆している。
【０１４５】
【配列表】 S E Q U E N C E L I S T I N G <110> THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF WASHINGTON <120> DNA ENCODING MAMMALIAN PHOSPHODIESTERASES <130> 2001PA0248 <140> PCT/US92/03222 <141> 1992-04-20 <140> JP 04-511412 <141> 1992-04-20 <150> US 688,356 <151> 1991-04-19 <160> 58 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <400> 1 aaratgggna tgaaraaraa 20 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <400> 2 Lys Met Gly Met Met Lys Lys Lys 1 5 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <400> 3 acrttcatyt cytcytcytg cat 23 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <400> 4 Met Gln Glu Glu Glu Met Asn Val 1 5 <210> 5 <211> 2291 <212> DNA <220> <221> CDS <222> 100..1689 <400> 5 ggctcagaaa ctgtaggaat tctgatgtgc ttcggtgcat ggaacagtaa cagatgagct 60 gctttgggga gagctggaac gctcagtcgg agtatcatc atg ggg tct act gct 114 Met Gly Ser Thr Ala 1 5 aca gaa act gaa gaa ctg gaa aac act act ttt aag tat ctc att gga 162 Thr Glu Thr Glu Glu Leu Glu Asn Thr Thr Phe Lys Tyr Leu Ile Gly 10 15 20 gaa cag act gaa aaa atg tgg caa cgc ctg aaa gga ata cta aga tgc 210 Glu Gln Thr Glu Lys Met Trp Gln Arg Leu Lys Gly Ile Leu Arg Cys 25 30 35 tta gtg aag cag ctg gaa aaa ggt gat gtt aac gtc atc gac tta aag 258 Leu Val Lys Gln Leu Glu Lys Gly Asp Val Asn Val Ile Asp Leu Lys 40 45 50 aag aat att gaa tat gca gca tct gtg ttg gaa gca gtt tat att gat 306 Lys Asn Ile Glu Tyr Ala Ala Ser Val Leu Glu Ala Val Tyr Ile Asp 55 60 65 gaa aca agg aga ctg ctg gac acc gat gat gag ctc agt gac att cag 354 Glu Thr Arg Arg Leu Leu Asp Thr Asp Asp Glu Leu Ser Asp Ile Gln 70 75 80 85 tcg gat tcc gtc cca tca gaa gtc cgg gac tgg ttg gct tct acc ttt 402 Ser Asp Ser Val Pro Ser Glu Val Arg Asp Trp Leu Ala Ser Thr Phe 90 95 100 aca cgg aaa atg ggg atg atg aaa aag aaa tct gag gaa aaa cca aga 450 Thr Arg Lys Met Gly Met Met Lys Lys Lys Ser Glu Glu Lys Pro Arg 105 110 115 ttt cgg agc att gtg cat gtt gtt caa gct gga att ttt gtg gaa aga 498 Phe Arg Ser Ile Val His Val Val Gln Ala Gly Ile Phe Val Glu Arg 120 125 130 atg tac aga aag tcc tat cac atg gtt ggc ttg gca tat cca gag gct 546 Met Tyr Arg Lys Ser Tyr 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Glu Ile Leu Ala Met Val Phe Ala Ala Ala Ile His Asp Tyr 250 255 260 gag cat aca ggg act aca aac aat ttt cac att cag aca agg tca gat 930 Glu His Thr Gly Thr Thr Asn Asn Phe His Ile Gln Thr Arg Ser Asp 265 270 275 gtt gcc att ttg tat aat gat cgc tct gtc ctt gaa aat cat cat gtg 978 Val Ala Ile Leu Tyr Asn Asp Arg Ser Val Leu Glu Asn His His Val 280 285 290 agt gca gct tat cgc ctt atg caa gaa gaa gaa atg aat gtc ctg ata 1026 Ser Ala Ala Tyr Arg Leu Met Gln Glu Glu Glu Met Asn Val Leu Ile 295 300 305 aat tta tcc aaa gat gac tgg agg gat ctt cgg aac cta gtg att gaa 1074 Asn Leu Ser Lys Asp Asp Trp Arg Asp Leu Arg Asn Leu Val Ile Glu 310 315 320 325 atg gtg ttg tct aca gac atg tcg ggt cac ttc cag caa att aaa aat 1122 Met Val Leu Ser Thr Asp Met Ser Gly His Phe Gln Gln Ile Lys Asn 330 335 340 ata aga aat agt ttg cag caa cct gaa ggg ctt gac aaa gcc aaa acc 1170 Ile Arg Asn Ser Leu Gln Gln Pro Glu Gly Leu Asp Lys Ala Lys Thr 345 350 355 atg tcc ctg att ctc cat gca gca gac atc agt cac cca gcc aaa 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ttagtccttc aacagttcca 2119 gagttgtgac tgtgcttaat agtttgcata tgaattctgg atagaaatca aatcacaaac 2179 tgcatagaaa ttttaaaaac cagctccata ttaaattttt ttaagatatt gtcttgtatt 2239 gaaactccaa tactttggcc acctgatgca aagagctgac tcatttgaaa cc 2291 <210> 6 <211> 530 <212> PRT <400> 6 Met Gly Ser Thr Ala Thr Glu Thr Glu Glu Leu Glu Asn Thr Thr Phe 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Ile Gly Glu Gln Thr Glu Lys Met Trp Gln Arg Leu Lys 20 25 30 Gly Ile Leu Arg Cys Leu Val Lys Gln Leu Glu Lys Gly Asp Val Asn 35 40 45 Val Ile Asp Leu Lys Lys Asn Ile Glu Tyr Ala Ala Ser Val Leu Glu 50 55 60 Ala Val Tyr Ile Asp Glu Thr Arg Arg Leu Leu Asp Thr Asp Asp Glu 65 70 75 80 Leu Ser Asp Ile Gln Ser Asp Ser Val Pro Ser Glu Val Arg Asp Trp 85 90 95 Leu Ala Ser Thr Phe Thr Arg Lys Met Gly Met Met Lys Lys Lys Ser 100 105 110 Glu Glu Lys Pro Arg Phe Arg Ser Ile Val His Val Val Gln Ala Gly 115 120 125 Ile Phe Val Glu Arg Met Tyr Arg Lys Ser Tyr His Met Val Gly Leu 130 135 140 Ala Tyr Pro Glu Ala Val Ile Val Thr Leu Lys Asp Val Asp Lys 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Ser 355 360 365 His Pro Ala Lys Ser Trp Lys Leu His His Arg Trp Thr Met Ala Leu 370 375 380 Met Glu Glu Phe Phe Leu Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Leu Gly Leu 385 390 395 400 Pro Phe Ser Pro Leu Cys Asp Arg Lys Ser Thr Met Val Ala Gln Ser 405 410 415 Gln Ile Gly Phe Ile Asp Phe Ile Val Glu Pro Thr Phe Ser Leu Leu 420 425 430 Thr Asp Ser Thr Glu Lys Ile Ile Ile Pro Leu Ile Glu Glu Asp Ser 435 440 445 Lys Thr Lys Thr Pro Ser Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ser Asn Met Lys 450 455 460 Gly Thr Thr Asn Asp Gly Thr Tyr Ser Pro Asp Tyr Ser Leu Ala Ser 465 470 475 480 Val Asp Leu Lys Ser Phe Lys Asn Ser Leu Val Asp Ile Ile Gln Gln 485 490 495 Asn Lys Glu Arg Trp Lys Glu Leu Ala Ala Gln Gly Glu Pro Asp Pro 500 505 510 His Lys Asn Ser Asp Leu Val Asn Ala Glu Glu Lys His Ala Glu Thr 515 520 525 His Ser 530 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <400> 7 Met Asp Asp His Val Thr Ile 1 5 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <400> 8 atgagragrc aygthacnat 20 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <400> 9 Leu Arg Cys Leu Val Lys Gln 1 5 <210> 10 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140 gtt gat aaa tgg tct ttt gat gta ttt gcc ttg aat gaa gca agt gga 603 Val Asp Lys Trp Ser Phe Asp Val Phe Ala Leu Asn Glu Ala Ser Gly 145 150 155 gaa cac agt ctg aag ttt atg att tat gaa cta ttc acc aga tat gat 651 Glu His Ser Leu Lys Phe Met Ile Tyr Glu Leu Phe Thr Arg Tyr Asp 160 165 170 ctt atc aac cgt ttc aag att cct gtt tct tgc cta att gcc ttt gca 699 Leu Ile Asn Arg Phe Lys Ile Pro Val Ser Cys Leu Ile Ala Phe Ala 175 180 185 gaa gct cta gaa gtt ggt tac agc aag tac aaa aat cca tac cac aat 747 Glu Ala Leu Glu Val Gly Tyr Ser Lys Tyr Lys Asn Pro Tyr His Asn 190 195 200 ttg att cat gca gct gat gtc act caa act gtg cat tac ata atg ctt 795 Leu Ile His Ala Ala Asp Val Thr Gln Thr Val His Tyr Ile Met Leu 205 210 215 220 cat aca ggt atc atg cac tgg ctc act gaa ctg gaa att tta gca atg 843 His Thr Gly Ile Met His Trp Leu Thr Glu Leu Glu Ile Leu Ala Met 225 230 235 gtc ttt gcc gct gcc att cat gac tat gag cat aca ggg act aca aac 891 Val Phe Ala Ala Ala Ile His Asp Tyr Glu His Thr Gly Thr Thr Asn 240 245 250 aat ttt cac att cag aca agg tca gat gtt gcc att ttg tat aat gat 939 Asn Phe His Ile Gln Thr Arg Ser Asp Val Ala Ile Leu Tyr Asn Asp 255 260 265 cgc tct gtc ctt gaa aat cat cat gtg agt gca gct tat cgc ctt atg 987 Arg Ser Val Leu Glu Asn His His Val Ser Ala Ala Tyr Arg Leu Met 270 275 280 caa gaa gaa gaa atg aat gtc ctg ata aat tta tcc aaa gat gac tgg 1035 Gln Glu Glu Glu Met Asn Val Leu Ile Asn Leu Ser Lys Asp Asp Trp 285 290 295 300 agg gat ctt cgg aac cta gtg att gaa atg gtg ttg tct aca gac atg 1083 Arg Asp Leu Arg Asn Leu Val Ile Glu Met Val Leu Ser Thr Asp Met 305 310 315 tcg ggt cac ttc cag caa att aaa aat ata aga aat agt ttg cag caa 1131 Ser Gly His Phe Gln Gln Ile Lys Asn Ile Arg Asn Ser Leu Gln Gln 320 325 330 cct gaa ggg ctt gac aaa gcc aaa acc atg tcc ctg att ctc cat gca 1179 Pro Glu Gly Leu Asp Lys Ala Lys Thr Met Ser Leu Ile Leu His Ala 335 340 345 gca gac atc agt cac cca gcc aaa tcc tgg aag ctg cac cac cga tgg 1227 Ala Asp Ile Ser His Pro Ala Lys Ser Trp Lys Leu His His Arg Trp 350 355 360 acc atg gcc cta atg gag gag ttt ttc cta cag gga gat aaa gaa gct 1275 Thr Met Ala Leu Met Glu Glu Phe Phe Leu Gln Gly Asp Lys Glu Ala 365 370 375 380 gaa tta ggg ctt cca ttt tcc ccg ctt tgc gat cgg aag tca acg atg 1323 Glu Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Leu Cys Asp Arg Lys Ser Thr Met 385 390 395 gtg gcc cag tcc caa ata ggt ttc att gat ttc ata gta gaa cca aca 1371 Val Ala Gln Ser Gln Ile Gly Phe Ile Asp Phe Ile Val Glu Pro Thr 400 405 410 ttt tct ctt ctg aca gac tca aca gag aaa att att att cct ctt ata 1419 Phe Ser Leu Leu Thr Asp Ser Thr Glu Lys Ile Ile Ile Pro Leu Ile 415 420 425 gag gaa gac tcg aaa acc aaa act cct tcc tat gga gca agc aga cga 1467 Glu Glu Asp Ser Lys Thr Lys Thr Pro Ser Tyr Gly Ala Ser Arg Arg 430 435 440 tca aat atg aaa ggc acc acc aat gat gga acc tac tcc ccc gac tac 1515 Ser Asn Met Lys Gly Thr Thr Asn Asp Gly Thr Tyr Ser Pro Asp Tyr 445 450 455 460 tcc ctt gcc agc gtg gac ctg aag agc ttc aaa aac agc ctg gtg gac 1563 Ser Leu Ala Ser Val Asp Leu Lys Ser Phe Lys Asn Ser Leu Val Asp 465 470 475 atc atc cag cag aac aaa gag agg tgg aaa gag tta gct gct caa ggt 1611 Ile Ile Gln Gln Asn Lys Glu Arg Trp Lys Glu Leu Ala Ala Gln Gly 480 485 490 gaa cct gat ccc cat aag aac tca gat cta gta aat gct gaa gaa aaa 1659 Glu Pro Asp Pro His Lys Asn Ser Asp Leu Val Asn Ala Glu Glu Lys 495 500 505 cat gct gaa aca cat tca taggtctgaa acacctgaaa gacgtctttc 1707 His Ala Glu Thr His Ser 510 attctaagga tgggagagtg ctgtaactac aaaactttca agcttctaag taaaaggaaa 1767 gcaaaaacaa aattacagaa aaatattttt gcagctctga ggctatttag attgtccttg 1827 ttgttttaaa tacatgggaa ccaagtgaga agaggggctg ctcagaagtt gtagtcgaag 1887 tcctaagaca acaatgaagc atcagagccc tgactctgtg acctgatgaa ctcttcgttg 1947 taactctcaa gctgggaaac cacagcgaat cctgttcctg aaagcagtga accagcctgc 2007 atccaccact gttattgcaa agcacgaaag catcacccac gtgggggtca tcacaatgca 2067 agtcacgcaa gacctatgac caagatgaca agaacctcca gcccttgttg gagacagaca 2127 ctagaactga gagtgggatt tgccttctgg ggtgttaatc ccatcaggat gtaacaaaat 2187 atattacagg tcaagggata agggacaaga agtgtgtgtc tgtgtgtgtg tgtgtgtatg 2247 tgcgcgcact caaaaatgtc tgtgaaaatg gaagcccaca ctcttctgca cagagagcat 2307 tatttgatgt gatttataat tttactacaa acaaacgaac tgcagccatt ggagactgct 2367 tccttgtcat gttttgcctg agcatgtgca gagccttgcc tttgttccaa attgaagaac 2427 tacctttatt tgttattagc tgccaagaaa ggtcaagccc aagtaggtgt tgtcattttc 2487 accgtacaaa ctcttcaatg attgttagac taaaggaatt tgtttttgtg aaaggtagaa 2547 attagatgga aaagatcaag agtagtcatc aattaaagaa gaaagtgaag gtggatatgt 2607 ccatcctaat gagttttctg ttgcacctgc ttcttccctg cgacagcaa 2656 <210> 17 <211> 514 <212> PRT <400> 17 Met Asp Asp His Val Thr Ile Arg Arg Lys His Leu Gln Arg Pro Ile 1 5 10 15 Phe Arg Leu Arg Cys Leu Val Lys Gln Leu Glu Lys Gly Asp Val Asn 20 25 30 Val Ile Asp Leu Lys Lys Asn Ile Glu Tyr Ala Ala Ser Val Leu Glu 35 40 45 Ala Val Tyr Ile Asp Glu Thr Arg Arg Leu Leu Asp Thr Asp Asp Glu 50 55 60 Leu Ser Asp Ile Gln Ser Asp Ser Val Pro Ser Glu Val Arg Asp Trp 65 70 75 80 Leu Ala Ser Thr Phe Thr Arg Lys Met Gly Met Met Lys Lys Lys Ser 85 90 95 Glu Glu Lys Pro Arg Phe Arg Ser Ile Val His Val Val Gln Ala Gly 100 105 110 Ile Phe Val Glu Arg Met Tyr Arg Lys Ser Tyr His Met Val Gly Leu 115 120 125 Ala Tyr Pro Glu Ala Val Ile Val Thr Leu Lys Asp Val Asp Lys Trp 130 135 140 Ser Phe Asp Val Phe Ala Leu Asn Glu Ala Ser Gly Glu His Ser Leu 145 150 155 160 Lys Phe Met Ile Tyr Glu Leu Phe Thr Arg Tyr Asp Leu Ile Asn Arg 165 170 175 Phe Lys Ile Pro Val Ser Cys Leu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Leu Glu 180 185 190 Val Gly Tyr Ser Lys Tyr Lys Asn Pro Tyr His Asn Leu Ile His Ala 195 200 205 Ala Asp Val Thr Gln Thr Val His Tyr Ile Met Leu His Thr Gly Ile 210 215 220 Met His Trp Leu Thr Glu Leu Glu Ile Leu Ala Met Val Phe Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ile His Asp Tyr Glu His Thr Gly Thr Thr Asn Asn Phe His Ile 245 250 255 Gln Thr Arg Ser Asp Val Ala Ile Leu Tyr Asn Asp Arg Ser Val Leu 260 265 270 Glu Asn His His Val Ser Ala Ala Tyr Arg Leu Met Gln Glu Glu Glu 275 280 285 Met Asn Val Leu Ile Asn Leu Ser Lys Asp 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Thr Asp Met Ser Cys His Phe Gln 65 70 75 80 Gln Val Lys Ser Met Lys Thr Ala Leu Gln Gln Leu Glu Arg Ile Asp 85 90 95 Lys Ser Lys Ala Leu Ser Leu Leu Leu His Ala Ala Asp Ile Ser His 100 105 110 Pro Thr Lys Gln Trp Ser Val His Ser Arg Trp Thr Lys Ala Leu Met 115 120 125 Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Lys 130 135 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <400> 24 aaraaraayy tngartayac ngc 23 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <400> 25 Lys Lys Asn Leu Glu Tyr Thr Ala 1 5 <210> 26 <211> 1844 <212> DNA <220> <221> CDS <222> 114..1715 <400> 26 ggctgggcag cgggaaagga ggagccgcag gaactgcagc tctgccagct tgggccgagc 60 tttagagacc cccggcctgg ctggtccctg ccagccgcag acggaggctg agc atg 116 Met 1 gag ctg tcc ccc cgc agc cct ccc gag atg cta gag tcg gac tgc cct 164 Glu Leu Ser Pro Arg Ser Pro Pro Glu Met Leu Glu Ser Asp Cys Pro 5 10 15 tca ccc ctg gag ctg aag tca gcc ccc agc aag aag atg tgg att aag 212 Ser Pro Leu Glu Leu Lys Ser Ala Pro Ser Lys Lys Met Trp Ile Lys 20 25 30 ctc cgg tct ctg ctg cgc tac atg gtg aag cag ttg gag aac ggg gag 260 Leu Arg Ser Leu Leu Arg Tyr Met Val Lys Gln Leu Glu Asn Gly Glu 35 40 45 gta aac att gag gag ctg aag aaa aac ctg gag tac aca gct tct ctg 308 Val Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys Asn Leu Glu Tyr Thr Ala Ser Leu 50 55 60 65 ctg gag gcc gtc tat ata gat gag act cgg caa atc ctg gac acg gag 356 Leu Glu Ala Val Tyr Ile Asp Glu Thr Arg Gln Ile Leu Asp Thr Glu 70 75 80 gat gag ctg cag gag ctg cgg tct gat gcg gtg cct tca gag gtg cgg 404 Asp Glu Leu Gln Glu Leu Arg Ser Asp Ala Val Pro Ser Glu Val Arg 85 90 95 gac tgg ctg gcc tcc acc ttc acc cag cag acc cgg gcc aaa ggc ccg 452 Asp Trp Leu Ala Ser Thr Phe Thr Gln Gln Thr Arg Ala Lys Gly Pro 100 105 110 agc gaa gag aag ccc aag ttc cgg agc atc gtg cac gcg gtg cag gct 500 Ser Glu Glu Lys Pro Lys Phe Arg Ser Ile Val His Ala Val Gln Ala 115 120 125 ggc atc ttt gtg gag cgg atg ttc cgg aga acg tac acc tct gtg ggc 548 Gly Ile Phe Val Glu Arg Met Phe Arg Arg Thr Tyr Thr Ser Val Gly 130 135 140 145 ccc acc tac tcc act gcc gtc ctc aac tgt ctc aag aac gtg gac ctt 596 Pro Thr Tyr Ser Thr Ala Val Leu Asn Cys Leu Lys Asn Val Asp Leu 150 155 160 tgg tgc ttt gat gtc ttt tcc ttg aac cgg gca gca gat gac cac gcc 644 Trp Cys Phe Asp Val Phe Ser Leu Asn Arg Ala Ala Asp Asp His Ala 165 170 175 ctg agg acc atc gtt ttt gag ctg ctg act cgg cac aac ctc atc agc 692 Leu Arg Thr Ile Val Phe Glu Leu Leu Thr Arg His Asn Leu Ile Ser 180 185 190 cgc ttt aag att ccc act gtg ttt ttg atg act ttc ctg gat gcc ttg 740 Arg Phe Lys Ile Pro Thr Val Phe Leu Met Thr Phe Leu Asp Ala Leu 195 200 205 gag aca ggc tac gga aag tac aag aac cct tac cac aac cag atc cac 788 Glu Thr Gly Tyr Gly Lys Tyr Lys Asn Pro Tyr His Asn Gln Ile His 210 215 220 225 gca gct gac gtc acc cag acg gtc cac tgc ttc ttg ctc cgc aca ggg 836 Ala Ala Asp Val Thr Gln Thr Val His Cys Phe Leu Leu Arg Thr Gly 230 235 240 atg gtg cac tgc ctg tcg gag att gag gtc ctg gcc atc atc ttt gct 884 Met Val His Cys Leu Ser Glu Ile Glu Val Leu Ala Ile Ile Phe Ala 245 250 255 gca gcg atc cac gac tat gag cac act ggc act acc aac agc ttc cac 932 Ala Ala Ile His Asp Tyr Glu His Thr Gly Thr Thr Asn Ser Phe His 260 265 270 atc cag acc aaa tcg gaa tgc gcc atc ctg tac aac gac cgc tca gtg 980 Ile Gln Thr Lys Ser Glu Cys Ala Ile Leu Tyr Asn Asp Arg Ser Val 275 280 285 ctg gag aat cac cac atc agc tcg gtt ttc cga atg atg cag gac gac 1028 Leu Glu Asn His His Ile Ser Ser Val Phe Arg Met Met Gln Asp Asp 290 295 300 305 gag atg aac atc ttc atc aac ctc acc aag gat gag ttt gta gag ctg 1076 Glu Met Asn Ile Phe Ile Asn Leu Thr Lys Asp Glu Phe Val Glu Leu 310 315 320 cgg gct ctg gtc att gag atg gtg ttg gcc aca gac atg tcc tgc cat 1124 Arg Ala Leu Val Ile Glu Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Cys His 325 330 335 ttc cag caa gtg aag tcc atg aag aca gcc ttg cag cag ctg gag agg 1172 Phe Gln Gln Val Lys Ser Met Lys Thr Ala Leu Gln Gln Leu Glu Arg 340 345 350 att gac aag tcc aag gcc ctc tct ctg ctg ctt cat gct gct gac atc 1220 Ile Asp Lys Ser Lys Ala Leu Ser Leu Leu Leu His Ala Ala Asp Ile 355 360 365 agc cac ccc acc aag cag tgg tcg gtt cac agc cgc tgg acc aag gcc 1268 Ser His Pro Thr Lys Gln Trp Ser Val His Ser Arg Trp Thr Lys Ala 370 375 380 385 ctc atg gag gaa ttc ttc cgc cag ggt gac aag gag gct gag ctg ggc 1316 Leu Met Glu Glu Phe Phe Arg Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Leu Gly 390 395 400 ctg ccc ttt tct ccg ctc tgt gac cgc act tcc acc ctc gtg gcg cag 1364 Leu Pro Phe Ser Pro Leu Cys Asp Arg Thr Ser Thr Leu Val Ala Gln 405 410 415 tcc cag att ggt ttc atc gac ttc att gtg gag ccc acg ttc tct gtg 1412 Ser Gln Ile Gly Phe Ile Asp Phe Ile Val Glu Pro Thr Phe Ser Val 420 425 430 ctc acc gat gtg gct gag aag agt gtc cag ccc acc ggg gac gac gac 1460 Leu Thr Asp Val Ala Glu Lys Ser Val Gln Pro Thr Gly Asp Asp Asp 435 440 445 tcg aag tct aaa aac cag ccc agc ttc cag tgg cgc cag cct tct ctg 1508 Ser Lys Ser Lys Asn Gln Pro Ser Phe Gln Trp Arg Gln Pro Ser Leu 450 455 460 465 gat gta gaa gtg gga gac ccc aac cct gac gtg gtc agc ttc cgc tcc 1556 Asp Val Glu Val Gly Asp Pro Asn Pro Asp Val Val Ser Phe Arg Ser 470 475 480 acc tgg acc aaa tac att cag gag aac aag cag aaa tgg aag gaa cgg 1604 Thr Trp Thr Lys Tyr Ile Gln Glu Asn Lys Gln Lys Trp Lys Glu Arg 485 490 495 gcg gcg agc ggc atc acc aac cag atg tcc att gac gaa ctg tcc cct 1652 Ala Ala Ser Gly Ile Thr Asn Gln Met Ser Ile Asp Glu Leu Ser Pro 500 505 510 tgt gag gaa gag gcc cca gcc tcc cct gcc gaa gac gag cac aac cag 1700 Cys Glu Glu Glu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Glu Asp Glu His Asn Gln 515 520 525 aac ggg aat ctg gac tagcggggcc tggccaggtc ctcactgagt cctgagtgtt 1755 Asn Gly Asn Leu Asp 530 cgatgtcatc agcaccatcc atcgggactg gctcccccat ctgctccgag ggcgaatgga 1815 tgtcaaggaa cagaaaaccc acccgaaga 1844 <210> 27 <211> 534 <212> PRT <400> 27 Met Glu Leu Ser Pro Arg Ser Pro Pro Glu Met Leu Glu Ser Asp Cys 1 5 10 15 Pro Ser Pro Leu Glu Leu Lys Ser Ala Pro Ser Lys Lys Met Trp Ile 20 25 30 Lys Leu Arg Ser Leu Leu Arg Tyr Met Val Lys Gln Leu Glu Asn Gly 35 40 45 Glu Val Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys Asn Leu Glu Tyr Thr Ala Ser 50 55 60 Leu Leu Glu Ala Val Tyr Ile Asp 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gtg cga gag 411 Cys Glu Glu Pro Pro His Glu Leu Pro Gln Glu Gly Lys Val Arg Glu 75 80 85 gct gtg atc tcc cgg aag cgg ctg ggc tgc aat gga ctg ggc ccc tca 459 Ala Val Ile Ser Arg Lys Arg Leu Gly Cys Asn Gly Leu Gly Pro Ser 90 95 100 gac ctg cct ggg aag ccc ttg gca agg ctg gtg gct cca ctg gct cct 507 Asp Leu Pro Gly Lys Pro Leu Ala Arg Leu Val Ala Pro Leu Ala Pro 105 110 115 120 gac acc caa gtg ctg gtc ata ccg ctg gtg gac aag gag gcc ggg gct 555 Asp Thr Gln Val Leu Val Ile Pro Leu Val Asp Lys Glu Ala Gly Ala 125 130 135 gtg gca gct gtc atc ttg gtg cac tgt ggt cag ctg agt gac aat gag 603 Val Ala Ala Val Ile Leu Val His Cys Gly Gln Leu Ser Asp Asn Glu 140 145 150 gag tgg agc ctg caa gct gtg gag aag cat acc ctg gtg gcc ctg aaa 651 Glu Trp Ser Leu Gln Ala Val Glu Lys His Thr Leu Val Ala Leu Lys 155 160 165 agg gtg cag gcc ttg cag cag cgc gag tcc agc gtg gcc ccg gaa gcg 699 Arg Val Gln Ala Leu Gln Gln Arg Glu Ser Ser Val Ala Pro Glu Ala 170 175 180 acc cag aat cct ccg gag gag gca gcg gga gac 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ggc tgt gag gtg cag gcc atg ctc tgt 1083 Gln Gln Leu Gln Ser Met Leu Gly Cys Glu Val Gln Ala Met Leu Cys 300 305 310 gtc cct gtc atc agc cgg gcc act gac cag gtc gtg gcc ctg gcc tgt 1131 Val Pro Val Ile Ser Arg Ala Thr Asp Gln Val Val Ala Leu Ala Cys 315 320 325 gcc ttc aac aag ctc gga gga gac ttg ttc aca gac cag gac gag cac 1179 Ala Phe Asn Lys Leu Gly Gly Asp Leu Phe Thr Asp Gln Asp Glu His 330 335 340 gtg atc cag cac tgc ttc cac tac acc agc aca gtg ctc acc agc acc 1227 Val Ile Gln His Cys Phe His Tyr Thr Ser Thr Val Leu Thr Ser Thr 345 350 355 360 ctg gcc ttc cag aag gag cag aag ctc aag tgt gag tgc cag gct ctt 1275 Leu Ala Phe Gln Lys Glu Gln Lys Leu Lys Cys Glu Cys Gln Ala Leu 365 370 375 ctc caa gtg gcg aag aac ctc ttc act cat ctg gat gac gtc tcc gtg 1323 Leu Gln Val Ala Lys Asn Leu Phe Thr His Leu Asp Asp Val Ser Val 380 385 390 ctg ctc cag gag atc atc aca gag gcc agg aac ctc agc aat gct gag 1371 Leu Leu Gln Glu Ile Ile Thr Glu Ala Arg Asn Leu Ser Asn Ala Glu 395 400 405 atc tgc tct gtg ttc ctg ctg gat cag aac gag ctg gtg gcc aag gtg 1419 Ile Cys Ser Val Phe Leu Leu Asp Gln Asn Glu Leu Val Ala Lys Val 410 415 420 ttc gat ggg ggt gtg gtg gaa gat gag agc tat gag atc cgc att ccc 1467 Phe Asp Gly Gly Val Val Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Arg Ile Pro 425 430 435 440 gct gac cag ggc atc gcg ggt cat gtg gcg acc acc ggc cag atc cta 1515 Ala Asp Gln Gly Ile Ala Gly His Val Ala Thr Thr Gly Gln Ile Leu 445 450 455 aac atc cca gat gct tac gca cat ccg ctt ttc tac cga ggc gtg gac 1563 Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Ala His Pro Leu Phe Tyr Arg Gly Val Asp 460 465 470 gac agc acc ggc ttc cgg acg cgc aac atc ctc tgc ttc ccc atc aag 1611 Asp Ser Thr Gly Phe Arg Thr Arg Asn Ile Leu Cys Phe Pro Ile Lys 475 480 485 aac gag aac cag gag gtc atc ggt gtg gcc gag ctg gtg aac aag atc 1659 Asn Glu Asn Gln Glu Val Ile Gly Val Ala Glu Leu Val Asn Lys Ile 490 495 500 aat gga cca tgg ttc agc aag ttt gat gaa gac ctg gct aca gcc ttc 1707 Asn Gly Pro Trp Phe Ser Lys Phe Asp Glu Asp Leu Ala Thr Ala Phe 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Lys Lys Gly Tyr Arg Asp 620 625 630 ccc ccc tac cac aac tgg atg cac gcc ttt tct gtc tcc cac ttc tgc 2091 Pro Pro Tyr His Asn Trp Met His Ala Phe Ser Val Ser His Phe Cys 635 640 645 tac ctg ctc tac aag aac ctg gag ctc acc aac tac ctc gag gac atg 2139 Tyr Leu Leu Tyr Lys Asn Leu Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Glu Asp Met 650 655 660 gag atc ttt gcc ttg ttt att tcc tgc atg tgt cac gac ctg gac cac 2187 Glu Ile Phe Ala Leu Phe Ile Ser Cys Met Cys His Asp Leu Asp His 665 670 675 680 aga ggc aca aac aac tcc ttc cag gtg gcc tcg aaa tct gtg ctg gcc 2235 Arg Gly Thr Asn Asn Ser Phe Gln Val Ala Ser Lys Ser Val Leu Ala 685 690 695 gcg ctc tac agc tcg gaa ggc tct gtc atg gag agg cac cac ttc gct 2283 Ala Leu Tyr Ser Ser Glu Gly Ser Val Met Glu Arg His His Phe Ala 700 705 710 cag gcc att gcc atc ctc aac acc cac ggc tgc aac atc ttt gac cac 2331 Gln Ala Ile Ala Ile Leu Asn Thr His Gly Cys Asn Ile Phe Asp His 715 720 725 ttc tcc cgg aag gat tat cag cgc atg ttg gac ctg atg cgg gac atc 2379 Phe Ser Arg Lys Asp Tyr Gln Arg Met Leu Asp Leu Met Arg Asp Ile 730 735 740 atc ttg gcc aca gat ctg gcc cac cac ctc cgc atc ttc aag gac ctc 2427 Ile Leu Ala Thr Asp Leu Ala His His Leu Arg Ile Phe Lys Asp Leu 745 750 755 760 caa aag atg gcc gaa gtg ggc tat gat cga acc aac aag cag cac cac 2475 Gln Lys Met Ala Glu Val Gly Tyr Asp Arg Thr Asn Lys Gln His His 765 770 775 agc ctc ctt ctc tgc ctc ctt atg acc tcc tgt gac ctc tct gac cag 2523 Ser Leu Leu Leu Cys Leu Leu Met Thr Ser Cys Asp Leu Ser Asp Gln 780 785 790 acc aag ggc tgg aag acc acg agg aag atc gcg gag ctg atc tac aaa 2571 Thr Lys Gly Trp Lys Thr Thr Arg Lys Ile Ala Glu Leu Ile Tyr Lys 795 800 805 gag ttc ttc tcc cag gga gac ttg gag aag gcc atg ggc aac agg ccg 2619 Glu Phe Phe Ser Gln Gly Asp Leu Glu Lys Ala Met Gly Asn Arg Pro 810 815 820 atg gag atg atg gac cgt gag aag gcc tac atc ccc gag ctg cag atc 2667 Met Glu Met Met Asp Arg Glu Lys Ala Tyr Ile Pro Glu Leu Gln Ile 825 830 835 840 agc ttc atg gag cac atc gca atg ccc atc tac aag ctg ctg caa gac 2715 Ser Phe Met Glu His Ile Ala Met Pro Ile Tyr Lys Leu Leu Gln Asp 845 850 855 ctg ttc ccc aag gcg gcc gag ttg tac gaa cgc gtg gcc tct aat cgt 2763 Leu Phe Pro Lys Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Arg Val Ala Ser Asn Arg 860 865 870 gag cac tgg acc aag gtg tca cac aag ttc acc atc cga ggc ctc ccg 2811 Glu His Trp Thr Lys Val Ser His Lys Phe Thr Ile Arg Gly Leu Pro 875 880 885 agc aac aac tcg ttg gac ttc ctg gac gag gag tat gag gtg cct gac 2859 Ser Asn Asn Ser Leu Asp Phe Leu Asp Glu Glu Tyr Glu Val Pro Asp 890 895 900 ctg gat ggc gct agg gct ccc atc aat ggc tgt tgc agc ctt gat gct 2907 Leu Asp Gly Ala Arg Ala Pro Ile Asn Gly Cys Cys Ser Leu Asp Ala 905 910 915 920 gag tgagtccctc ctgggacccc tccctgtcca ggcctcctcc cacaagcctc 2960 Glu cacgggcctg gccgcacgcc ctgggaccag agccaagggt cctggattct aggccaggac 3020 ttcccatgtg acccgggcga ggtctgacct tcccgggcct cagctttctt gtctgtataa 3080 tggaagactt cagcctcact gagactttgt cacttgtcct ctgagagcac aggggtaacc 3140 aatgagcagt ggaccctgct ctgcacctct gaccgcatct tggcaagtcc ccaccctcca 3200 ggccactcct tctctgaggc agccggatgg tttcttctgg gccccattcc tgccctacca 3260 gacctgtgcc ctttcctgtg ggggcaccct cactggctcc caggatcctc aggcaagaac 3320 atgagacatc tgagtgggca aagggtgggt cttagagaca gttatcagcc tggctggagg 3380 actagaagta gccatgggac cacctgtggc ccagaggact gcctttgtac ttatggtggg 3440 gactgggacc tggggatata agggtcccag gaggacactg ccagggggcc agtgcagtgc 3500 tctggggaga gggggctcag gaagagagga ggataagaac agtgagaagg aaggatccct 3560 gggttgggag gcaggcccag catgggtcag ccatgcttcc tcctggctgt gtgaccctgg 3620 gcaagtccct tcccctctct gcgaaacagt agggtgagac aatccattct ctaagacccc 3680 ttttagatcc aagtccccat agttctgtgg agtcccagta gaggccaccg agggtccctg 3740 gcccccttgg gcacagagct gacactgagt ccctcagtgg ccccctgagt ataccccctt 3800 agccggagcc ccttccccat tcctacagcc agagggggac ctggcctcag cctggcaggg 3860 cctctctcct cttcaaggcc atatccacct gtgccccggg gcttgggaga ccccctaggg 3920 ccggagctct ggggtcatcc tggccactgg cttctccttt ctctgttttg ttctgtatgt 3980 gttgtggggt ggggggaggg gggccacctg ccttacctat tctgagttgc ctttagagag 4040 atgcgttttt tctaggactc tgtgcaactg ttgtatatgg ttccgtgggc tgaccgcttt 4100 gtacatgaga ataaatctat ttctttctac c 4131 <210> 39 <211> 921 <212> PRT <400> 39 Met Arg Arg Gln Pro Ala Ala Ser Arg Asp Leu Phe Ala Gln Glu Pro 1 5 10 15 Val Pro Pro Gly Ser Gly Asp Gly Ala Leu Gln Asp Ala Leu Leu Ser 20 25 30 Leu Gly Ser Val Ile Asp Val Ala Gly Leu Gln Gln Ala Val Lys Glu 35 40 45 Ala Leu Ser Ala Val Leu Pro Lys Val Glu Thr Val Tyr Thr Tyr Leu 50 55 60 Leu Asp Gly Glu Ser Arg Leu Val Cys Glu Glu Pro Pro His Glu Leu 65 70 75 80 Pro Gln Glu Gly Lys Val Arg Glu Ala Val Ile Ser Arg Lys Arg Leu 85 90 95 Gly Cys Asn Gly Leu Gly Pro Ser Asp Leu Pro Gly Lys Pro Leu Ala 100 105 110 Arg Leu Val Ala Pro Leu Ala Pro Asp Thr Gln Val Leu Val Ile Pro 115 120 125 Leu Val Asp Lys Glu Ala Gly Ala Val Ala Ala Val Ile Leu Val His 130 135 140 Cys Gly Gln Leu Ser Asp Asn Glu Glu Trp Ser Leu Gln Ala Val Glu 145 150 155 160 Lys His Thr Leu Val Ala Leu Lys Arg Val Gln Ala Leu Gln Gln Arg 165 170 175 Glu Ser 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ccagttgtgg 60 taggggggat cccggtagcc cttcttcacc atcaaacaga accgggccag tgtcgggcag 120 tcaattttgt agttattgat gaaattcatg ttctgcagca tgctcaggat ggccatggag 180 tgtcatcctt gggcagagag cgaggagtgt atgtgaactg gcaagttgga gtcgatggca 240 gccacaggct 250 <210> 42 <211> 3789 <212> DNA <220> <221> CDS <222> 181..3006 <400> 42 gcgggaactg ccagggcagc agggctggat tggggtgttg agtccaggct gagtcgggga 60 caggccactg ttcttggtcc ccgtgcctgc tgggccaggc gccctgcctg gagccccggg 120 cagggtggac agggtgaggt gccactttag tctggttggg gaggcagacg atgaggagcg 180 atg ggg cag gca tgc ggc cac tcc atc ctc tgc agg agc cag cag tac 228 Met Gly Gln Ala Cys Gly His Ser Ile Leu Cys Arg Ser Gln Gln Tyr 1 5 10 15 ccg gct gcg cga ccg gct gag ccg cgg ggc cag cag gtc ttc ctc aag 276 Pro Ala Ala Arg Pro Ala Glu Pro Arg Gly Gln Gln Val Phe Leu Lys 20 25 30 ccg gac gag ccg ccg ccg ccg ccg cag cca tgc gcc gac agc ctg cag 324 Pro Asp Glu Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro Cys Ala Asp Ser Leu Gln 35 40 45 gat gct ttg ctg agc ctg ggc tcc gtc att gac gtt gca ggc 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gag gag tgg agc 708 Val Ile Leu Val His Cys Gly Gln Leu Ser Asp Asn Glu Glu Trp Ser 165 170 175 ctg caa gct gtg gag aag cat acc ctg gtg gcc ctg aaa agg gtg cag 756 Leu Gln Ala Val Glu Lys His Thr Leu Val Ala Leu Lys Arg Val Gln 180 185 190 gcc ttg cag cag cgc gag tcc agc gtg gcc ccg gaa gcg acc cag aat 804 Ala Leu Gln Gln Arg Glu Ser Ser Val Ala Pro Glu Ala Thr Gln Asn 195 200 205 cct ccg gag gag gca gcg gga gac cag aag ggt ggg gtc gca tac aca 852 Pro Pro Glu Glu Ala Ala Gly Asp Gln Lys Gly Gly Val Ala Tyr Thr 210 215 220 gac caa gac cga aag atc ctg cag ctt tgc ggg gag ctc tac gac ctg 900 Asp Gln Asp Arg Lys Ile Leu Gln Leu Cys Gly Glu Leu Tyr Asp Leu 225 230 235 240 gat gca tct tcc ctg cag ctc aaa gtc ctc caa tat ctg caa cag gag 948 Asp Ala Ser Ser Leu Gln Leu Lys Val Leu Gln Tyr Leu Gln Gln Glu 245 250 255 acc cag gca tcc cgc tgc tgc ctg ctg ctg gta tcc gag gac aat ctt 996 Thr Gln Ala Ser Arg Cys Cys Leu Leu Leu Val Ser Glu Asp Asn Leu 260 265 270 cag ctc tcc tgc aag gtc att gga gat 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Phe Ile Asp Phe Ile Val Glu Pro Thr Phe 415 420 425 tct ctt ctg aca gac tca aca gag aaa att gtt att cct ctt ata gag 1346 Ser Leu Leu Thr Asp Ser Thr Glu Lys Ile Val Ile Pro Leu Ile Glu 430 435 440 445 gaa gcc tca aaa gcc gaa act tct tcc tat gtg gca agc agc tca acc 1394 Glu Ala Ser Lys Ala Glu Thr Ser Ser Tyr Val Ala Ser Ser Ser Thr 450 455 460 acc att gtg ggg tta cac att gct gat gca cta aga cga tca aat aca 1442 Thr Ile Val Gly Leu His Ile Ala Asp Ala Leu Arg Arg Ser Asn Thr 465 470 475 aaa ggc tcc atg agt gat ggg tcc tat tcc cca gac tac tcc ctt gca 1490 Lys Gly Ser Met Ser Asp Gly Ser Tyr Ser Pro Asp Tyr Ser Leu Ala 480 485 490 gca gtg gac ctg aag agt ttc aag aac aac ctg gtg gac atc att cag 1538 Ala Val Asp Leu Lys Ser Phe Lys Asn Asn Leu Val Asp Ile Ile Gln 495 500 505 cag aac aaa gag agg tgg aaa gag tta gct gca caa gaa gca aga acc 1586 Gln Asn Lys Glu Arg Trp Lys Glu Leu Ala Ala Gln Glu Ala Arg Thr 510 515 520 525 agt tca cag aag tgt gag ttt att cat cag taactcgag 1625 Ser Ser Gln Lys 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Leu Ile Thr Phe Ala Glu Ala Leu Glu 195 200 205 Val Gly Tyr Ser Lys Tyr Lys Asn Pro Tyr His Asn Leu Ile His Ala 210 215 220 Ala Asp Val Thr Gln Thr Val His Tyr Ile Met Leu His Thr Gly Ile 225 230 235 240 Met His Trp Leu Thr Glu Leu Glu Ile Leu Ala Met Val Phe Ala Ala 245 250 255 Ala Ile His Asp Tyr Glu His Thr Gly Thr Thr Asn Asn Phe His Ile 260 265 270 Gln Thr Arg Ser Asp Val Ala Ile Leu Tyr Asn Asp Arg Ser Val Leu 275 280 285 Glu Asn His His Val Ser Ala Ala Tyr Arg Leu Met Gln Glu Glu Glu 290 295 300 Met Asn Ile Leu Ile Asn Leu Ser Lys Asp Asp Trp Arg Asp Leu Arg 305 310 315 320 Asn Leu Val Ile Glu Met Val Leu Ser Thr Asp Met Ser Gly His Phe 325 330 335 Gln Gln Ile Lys Asn Ile Arg Asn Ser Leu Gln Gln Pro Glu Gly Ile 340 345 350 Asp Arg Ala Lys Thr Met Ser Leu Ile Leu His Ala Ala Asp Ile Ser 355 360 365 His Pro Ala Lys Ser Trp Lys Leu His Tyr Arg Trp Thr Met Ala Leu 370 375 380 Met Glu Glu Phe Phe Leu Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Leu Gly Leu 385 390 395 400 Pro Phe Ser Pro Leu Cys Asp Arg Lys Ser Thr Met Val Ala Gln Ser 405 410 415 Gln Ile Gly Phe Ile Asp Phe Ile Val Glu Pro Thr Phe Ser Leu Leu 420 425 430 Thr Asp Ser Thr Glu Lys Ile Val Ile Pro Leu Ile Glu Glu Ala Ser 435 440 445 Lys Ala Glu Thr Ser Ser Tyr Val Ala Ser Ser Ser Thr Thr Ile Val 450 455 460 Gly Leu His Ile Ala Asp Ala Leu Arg Arg Ser Asn Thr Lys Gly Ser 465 470 475 480 Met Ser Asp Gly Ser Tyr Ser Pro Asp Tyr Ser Leu Ala Ala Val Asp 485 490 495 Leu Lys Ser Phe Lys Asn Asn Leu Val Asp Ile Ile Gln Gln Asn Lys 500 505 510 Glu Arg Trp Lys Glu Leu Ala Ala Gln Glu Ala Arg Thr Ser Ser Gln 515 520 525 Lys Cys Glu Phe Ile His Gln 530 535 <210> 50 <211> 2693 <212> DNA <220> <221> CDS <222> 176..2077 <400> 50 gtcgcttcaa tatttcaaaa tggatccggt tctgtggcgg gtgcgagagt gaggctgtgg 60 gggacctcca ggccgaacct ccgcgaagcc tcggccttct gcgtgccctg gccccgggag 120 gataaggatt tcccttccct cctacttgcg cgcggagccg agctcttgtt gagct atg 178 Met 1 gag tcg cca acc aag gag att gaa gaa ttt gag agc aac tct ctg aaa 226 Glu Ser Pro Thr Lys Glu Ile Glu Glu Phe Glu Ser Asn Ser Leu Lys 5 10 15 tac ctg caa ccg gaa cag atc gag aaa atc tgg ctt cgg ctc cgc ggg 274 Tyr Leu Gln Pro Glu Gln Ile Glu Lys Ile Trp Leu Arg Leu Arg Gly 20 25 30 ctg agg aaa tat aag aaa acg tcc cag aga tta cgg tct ttg gtc aaa 322 Leu Arg Lys Tyr Lys Lys Thr Ser Gln Arg Leu Arg Ser Leu Val Lys 35 40 45 caa tta gag aga ggg gaa gct tca gtg gta gat ctt aag aag aat ttg 370 Gln Leu Glu Arg Gly Glu Ala Ser Val Val Asp Leu Lys Lys Asn Leu 50 55 60 65 gaa tat gca gcc aca gtg ctt gaa tct gtg tat att gat gaa aca agg 418 Glu Tyr Ala Ala Thr Val Leu Glu Ser Val Tyr Ile Asp Glu Thr Arg 70 75 80 aga ctc ctg gat aca gag gat gag ctc agt gac att cag tca gat gct 466 Arg Leu Leu Asp Thr Glu Asp Glu Leu Ser Asp Ile Gln Ser Asp Ala 85 90 95 gtg cct tct gag gtc cga gac tgg ctg gcc tcc acc ttc acg cgg cag 514 Val Pro Ser Glu Val Arg Asp Trp Leu Ala Ser Thr Phe Thr Arg Gln 100 105 110 atg ggg atg atg ctc agg agg agc gac gag aag ccc cgg ttc aag agc 562 Met Gly Met Met Leu Arg Arg Ser Asp 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Met His Ala Ala Asp Val Thr Gln Thr Val His 230 235 240 tac ctc ctc tat aag aca gga gtg gcg aac tgg ctg acg gag ctg gag 946 Tyr Leu Leu Tyr Lys Thr Gly Val Ala Asn Trp Leu Thr Glu Leu Glu 245 250 255 atc ttt gct ata atc ttc tca gct gcc atc cat gac tac gag cat acc 994 Ile Phe Ala Ile Ile Phe Ser Ala Ala Ile His Asp Tyr Glu His Thr 260 265 270 gga acc acc aac aat ttc cac att cag act cgg tct gat cca gct att 1042 Gly Thr Thr Asn Asn Phe His Ile Gln Thr Arg Ser Asp Pro Ala Ile 275 280 285 ctg tat aat gac aga tct gta ctg gag aat cac cat tta agt gca gct 1090 Leu Tyr Asn Asp Arg Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ser Ala Ala 290 295 300 305 tat cgc ctt ctg caa gat gac gag gaa atg aat att ttg att aac ctc 1138 Tyr Arg Leu Leu Gln Asp Asp Glu Glu Met Asn Ile Leu Ile Asn Leu 310 315 320 tca aag gat gac tgg agg gag ttt cga acc ttg gta att gaa atg gtg 1186 Ser Lys Asp Asp Trp Arg Glu Phe Arg Thr Leu Val Ile Glu Met Val 325 330 335 atg gcc aca gat atg tct tgt cac ttc caa caa atc aaa gca atg aag 1234 Met Ala Thr Asp Met Ser Cys His Phe Gln Gln Ile Lys Ala Met Lys 340 345 350 act gct ctg cag cag cca gaa gcc att gaa aag cca aaa gcc tta tcc 1282 Thr Ala Leu Gln Gln Pro Glu Ala Ile Glu Lys Pro Lys Ala Leu Ser 355 360 365 ctt atg ctg cat aca gca gat att agc cat cca gca aaa gca tgg gac 1330 Leu Met Leu His Thr Ala Asp Ile Ser His Pro Ala Lys Ala Trp Asp 370 375 380 385 ctc cat cat cgc tgg aca atg tca ctc ctg gag gag ttc ttc aga cag 1378 Leu His His Arg Trp Thr Met Ser Leu Leu Glu Glu Phe Phe Arg Gln 390 395 400 ggt gac aga gaa gca gag ctg ggg ctg cct ttt tct cct ctg tgt gac 1426 Gly Asp Arg Glu Ala Glu Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Leu Cys Asp 405 410 415 cga aag tcc act atg gtt gct cag tca caa gta ggt ttc att gat ttc 1474 Arg Lys Ser Thr Met Val Ala Gln Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Phe 420 425 430 atc gtg gaa ccc acc ttc act gtg ctt acg gac atg acc gag aag att 1522 Ile Val Glu Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr Asp Met Thr Glu Lys Ile 435 440 445 gtg agt cca tta atc gat gaa acc tct caa act ggt ggg 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tct gga gaa act aag aat caa gtc aat 1906 Gly Lys Ala Glu Lys Lys Thr Ser Gly Glu Thr Lys Asn Gln Val Asn 565 570 575 gga aca cgg gca aac aaa agt gac aac cct cgt ggg aaa aat tcc aaa 1954 Gly Thr Arg Ala Asn Lys Ser Asp Asn Pro Arg Gly Lys Asn Ser Lys 580 585 590 gcc gag aag tca tca gga gaa cag caa cag aat ggt gac ttc aaa gat 2002 Ala Glu Lys Ser Ser Gly Glu Gln Gln Gln Asn Gly Asp Phe Lys Asp 595 600 605 ggt aaa aat aag aca gac aag aag gat cac tct aac atc gga aat gat 2050 Gly Lys Asn Lys Thr Asp Lys Lys Asp His Ser Asn Ile Gly Asn Asp 610 615 620 625 tca aag aaa aca gat gat tca caa gag taaaaaagac ctcatagaca 2097 Ser Lys Lys Thr Asp Asp Ser Gln Glu 630 ataaaagagg ctgccagtgt cttgcatcat tctagctgag cttcttcatt ctccttcttc 2157 tccttcttcc acaaagaccc atatctggag aaggtgtaca actttcaaac acaagccccc 2217 caccccctga cccttggcct tccctcacac catctccttc caggggatga atctttgggg 2277 gttggtttga ggtcttagaa ctctggggga tattcccctg agcaaaacaa acaacgtgag 2337 atttttactc aaacagaaac aaaacatgaa ggggcatcct caaaatcctt tgctaatgac 2397 ctggctttca aggcatctgt ctggcctgat gagaatggac atcctggata tgctgggaga 2457 ggcctgaaaa aagccacaca cacagtaatt gccattttat gactgtcaat gccgttactt 2517 taaatgttgt catttttgca ctggctactg atgatacagc catgctgaca ttcatcaccg 2577 caaagatgat gattccagtc tctggttcct ttcctgagtc aggaacattt gttttctcca 2637 atttcctttc agacttaaaa ttgttcttat gctttttttc ccacttctgt aataca 2693 <210> 51 <211> 634 <212> PRT <400> 51 Met Glu Ser Pro Thr Lys Glu Ile Glu Glu Phe Glu Ser Asn Ser Leu 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Gln Pro Glu Gln Ile Glu Lys Ile Trp Leu Arg Leu Arg 20 25 30 Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Lys Thr Ser Gln Arg Leu Arg Ser Leu Val 35 40 45 Lys Gln Leu Glu Arg Gly Glu Ala Ser Val Val Asp Leu Lys Lys Asn 50 55 60 Leu Glu Tyr Ala Ala Thr Val Leu Glu Ser Val Tyr Ile Asp Glu Thr 65 70 75 80 Arg Arg Leu Leu Asp Thr Glu Asp Glu Leu Ser Asp Ile Gln Ser Asp 85 90 95 Ala Val Pro Ser Glu Val Arg Asp Trp Leu Ala Ser Thr Phe Thr Arg 100 105 110 Gln Met Gly Met Met Leu Arg Arg Ser Asp Glu Lys Pro Arg Phe Lys 115 120 125 Ser Ile Val His Ala Val Gln Ala Gly Ile Phe Val Glu Arg Met Tyr 130 135 140 Arg Arg Thr Ser Asn Met Val Gly Leu Ser Tyr Pro Pro Ala Val Ile 145 150 155 160 Glu Ala Leu Lys Asp Val Asp Lys Trp Ser Phe Asp Val Phe Ser Leu 165 170 175 Asn Glu Ala Ser Gly Asp His Ala Leu Lys Phe Ile Phe Tyr Glu Leu 180 185 190 Leu Thr Arg Tyr Asp Leu Ile Ser Arg Phe Lys Ile Pro Ile Ser Ala 195 200 205 Leu Val Ser Phe Val Glu Ala Leu Glu Val Gly Tyr Ser Lys His Lys 210 215 220 Asn Pro Tyr His Asn Leu Met His Ala Ala Asp Val Thr Gln Thr Val 225 230 235 240 His Tyr Leu Leu Tyr Lys Thr Gly Val Ala Asn Trp Leu Thr Glu Leu 245 250 255 Glu Ile Phe Ala Ile Ile Phe Ser Ala Ala Ile His Asp Tyr Glu His 260 265 270 Thr Gly Thr Thr Asn Asn Phe His Ile Gln Thr Arg Ser Asp Pro Ala 275 280 285 Ile Leu Tyr Asn Asp Arg Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ser Ala 290 295 300 Ala Tyr Arg Leu Leu Gln Asp Asp Glu Glu Met Asn Ile Leu Ile Asn 305 310 315 320 Leu Ser Lys Asp Asp Trp Arg Glu Phe Arg Thr Leu Val Ile Glu Met 325 330 335 Val Met Ala Thr Asp Met Ser Cys His Phe Gln Gln Ile Lys Ala Met 340 345 350 Lys Thr Ala Leu Gln Gln Pro Glu Ala Ile Glu Lys Pro Lys Ala Leu 355 360 365 Ser Leu Met Leu His Thr Ala Asp Ile Ser His Pro Ala Lys Ala Trp 370 375 380 Asp Leu His His Arg Trp Thr Met Ser Leu Leu Glu Glu Phe Phe Arg 385 390 395 400 Gln Gly Asp Arg Glu Ala Glu Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Leu Cys 405 410 415 Asp Arg Lys Ser Thr Met Val Ala Gln Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp 420 425 430 Phe Ile Val Glu Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr Asp Met Thr Glu Lys 435 440 445 Ile Val Ser Pro Leu Ile Asp Glu Thr Ser Gln Thr Gly Gly Thr Gly 450 455 460 Gln Arg Arg Ser Ser Leu Asn Ser Ile Ser Ser Ser Asp Ala Lys Arg 465 470 475 480 Ser Gly Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ile Asn Asn 485 490 495 Ser Val Ile Ser Val Asp Tyr Lys Ser Phe Lys Ala Thr Trp Thr Glu 500 505 510 Val Val His Ile Asn Arg Glu Arg Trp Arg Ala Lys Val Pro Lys Glu 515 520 525 Glu Lys Ala Lys Lys Glu Ala Glu Glu Lys Ala Arg Leu Ala Ala Glu 530 535 540 Glu Gln Gln Lys Glu Met Glu Ala Lys Ser Gln Ala Glu Glu Gly Ala 545 550 555 560 Ser Gly Lys Ala Glu Lys Lys Thr Ser Gly Glu Thr Lys Asn Gln Val 565 570 575 Asn Gly Thr Arg Ala Asn Lys Ser Asp Asn Pro Arg Gly Lys Asn Ser 580 585 590 Lys Ala Glu Lys Ser Ser Gly Glu Gln Gln Gln Asn Gly Asp Phe Lys 595 600 605 Asp Gly Lys Asn Lys Thr Asp Lys Lys Asp His Ser Asn Ile Gly Asn 610 615 620 Asp Ser Lys Lys Thr Asp Asp Ser Gln Glu 625 630 <210> 52 <211> 2077 <212> DNA <220> <221> CDS <222> 2..1693 <400> 52 a cgg aca tca aac atg gtt gga ctg agc tat cca cca gct gtt att 46 Arg Thr Ser Asn Met Val Gly Leu Ser Tyr Pro Pro Ala Val Ile 1 5 10 15 gag gca tta aag gat gtg gac aag tgg tcc ttt gac gtc ttt tcc ctc 94 Glu Ala Leu Lys Asp Val Asp Lys Trp Ser Phe Asp Val Phe Ser Leu 20 25 30 aat gag gcc agt ggg gat cat gca ctg aaa ttt att ttc tat gaa cta 142 Asn Glu Ala Ser Gly Asp His Ala Leu Lys Phe Ile Phe Tyr Glu Leu 35 40 45 ctc aca cgt tat gat ctg atc agc cgt ttc aag atc ccc att tct gca 190 Leu Thr Arg Tyr Asp 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Leu Gln Asp Asp Glu Glu Met Asn Ile Leu Ile Asn 160 165 170 175 ctc tca aag gat gac tgg agg gag ttt cga acc ttg gta att gaa atg 574 Leu Ser Lys Asp Asp Trp Arg Glu Phe Arg Thr Leu Val Ile Glu Met 180 185 190 gtg atg gcc aca gat atg tct tgt cac ttc caa caa atc aaa gca atg 622 Val Met Ala Thr Asp Met Ser Cys His Phe Gln Gln Ile Lys Ala Met 195 200 205 aag act gct ctg cag cag cca gaa gcc att gaa aag cca aaa gcc tta 670 Lys Thr Ala Leu Gln Gln Pro Glu Ala Ile Glu Lys Pro Lys Ala Leu 210 215 220 tcc ctt atg ctg cat aca gca gat att agc cat cca gca aaa gca tgg 718 Ser Leu Met Leu His Thr Ala Asp Ile Ser His Pro Ala Lys Ala Trp 225 230 235 gac ctc cat cat cgc tgg aca atg tca ctc ctg gag gag ttc ttc aga 766 Asp Leu His His Arg Trp Thr Met Ser Leu Leu Glu Glu Phe Phe Arg 240 245 250 255 cag ggt gac aga gaa gca gag ctg ggg ctg cct ttt tct cct ctg tgt 814 Gln Gly Asp Arg Glu Ala Glu Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Leu Cys 260 265 270 gac cga aag tcc act atg gtt gct cag tca caa gta ggt ttc att gat 862 Asp Arg Lys Ser Thr Met Val Ala Gln Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp 275 280 285 ttc atc gtg gaa ccc acc ttc act gtg ctt acg gac atg acc gag aag 910 Phe Ile Val Glu Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr Asp Met Thr Glu Lys 290 295 300 att gtg agt cca tta atc gat gaa acc tct caa act ggt ggg aca gga 958 Ile Val Ser Pro Leu Ile Asp Glu Thr Ser Gln Thr Gly Gly Thr Gly 305 310 315 cag agg cgt tcg agt ttg aat agc atc agc tcg tca gat gcc aag cga 1006 Gln Arg Arg Ser Ser Leu Asn Ser Ile Ser Ser Ser Asp Ala Lys Arg 320 325 330 335 tca ggt gtc aag acc tct ggt tca gag gga agt gcc ccg atc aac aat 1054 Ser Gly Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ile Asn Asn 340 345 350 tct gtc atc tcc gtt gac tat aag agc ttt aaa gct act tgg acg gaa 1102 Ser Val Ile Ser Val Asp Tyr Lys Ser Phe Lys Ala Thr Trp Thr Glu 355 360 365 gtg gtg cac atc aat cgg gag aga tgg agg gcc aag gta ccc aaa gag 1150 Val Val His Ile Asn Arg Glu Arg Trp Arg Ala Lys Val Pro Lys Glu 370 375 380 gag aag gcc aag aag gaa gca gag gaa aag gct cgc ctg gcc gca gag 1198 Glu Lys Ala Lys Lys Glu Ala Glu Glu Lys Ala Arg Leu Ala Ala Glu 385 390 395 gag cag caa aag gaa atg gaa gcc aaa agc cag gct gaa gaa ggc gca 1246 Glu Gln Gln Lys Glu Met Glu Ala Lys Ser Gln Ala Glu Glu Gly Ala 400 405 410 415 tct ggc aaa gct gag aaa aag acg tct gga gaa act aag aat caa gtc 1294 Ser Gly Lys Ala Glu Lys Lys Thr Ser Gly Glu Thr Lys Asn Gln Val 420 425 430 aat gga aca cgg gca aac aaa agt gac aac cct cgt ggg aaa aat tcc 1342 Asn Gly Thr Arg Ala Asn Lys Ser Asp Asn Pro Arg Gly Lys Asn Ser 435 440 445 aaa gct gag aag tca tca gga gaa cag caa cag aat ggt gac ttc aaa 1390 Lys Ala Glu Lys Ser Ser Gly Glu Gln Gln Gln Asn Gly Asp Phe Lys 450 455 460 gat ggt aaa aat aag aca gac aag aag gat cac tct aac atc gga aat 1438 Asp Gly Lys Asn Lys Thr Asp Lys Lys Asp His Ser Asn Ile Gly Asn 465 470 475 gat tca aag aaa aca gat ggc aca aaa cag cgt tct cac ggc tca cca 1486 Asp Ser Lys Lys Thr Asp Gly Thr Lys Gln Arg Ser His Gly Ser Pro 480 485 490 495 gcc cca agc acc agc tcc acg tgt cgc ctt acg ttg cca gtc atc aag 1534 Ala Pro Ser Thr Ser Ser Thr Cys Arg Leu Thr Leu Pro Val Ile Lys 500 505 510 cct cct ttg cgt cat ttt aaa cgc cct gct tac gca tct agc tcc tat 1582 Pro Pro Leu Arg His Phe Lys Arg Pro Ala Tyr Ala Ser Ser Ser Tyr 515 520 525 gca cct tca gtc tca aag aaa act gat gag cat cct gca agg tac aag 1630 Ala Pro Ser Val Ser Lys Lys Thr Asp Glu His Pro Ala Arg Tyr Lys 530 535 540 atg cta gat cag agg atc aaa atg aaa aag att cag aac atc tca cat 1678 Met Leu Asp Gln Arg Ile Lys Met Lys Lys Ile Gln Asn Ile Ser His 545 550 555 aac tgg aac aga aaa taggccgagg ggaagaagag agggagtgaa ggagggtcta 1733 Asn Trp Asn Arg Lys 560 cctatctgct tctcagcacc cactggccac agcaggacac acctccaaga cccttggagg 1793 ctgttggagc aggtactatc ctggttgact ccaccaaggt gaaatgaaag ttgtatgtga 1853 ttttcctctt tgttgttctt gtatagactt ttcaattgct gtatgtggga tcagcccaga 1913 cgccagcaac aaactagcaa gaggggtgtt tttatggtat aagtctctaa aagtctaaat 1973 tggaccaaaa ttaaaatgac acaaacttaa aaaaaaataa aattcctctc attgccactt 2033 ttttcaatct ctaaaagtta cttgccccca aaagaatatt ggtc 2077 <210> 53 <211> 564 <212> PRT <400> 53 Arg Thr Ser Asn Met Val Gly Leu Ser Tyr Pro Pro Ala Val Ile Glu 1 5 10 15 Ala Leu Lys Asp Val Asp Lys Trp Ser Phe Asp Val Phe Ser Leu Asn 20 25 30 Glu Ala Ser Gly Asp His Ala Leu Lys Phe Ile Phe Tyr Glu Leu Leu 35 40 45 Thr Arg Tyr Asp Leu Ile Ser Arg Phe Lys Ile Pro Ile Ser Ala Leu 50 55 60 Val Ser Phe Val Glu Ala Leu Glu Val Gly Tyr Ser Lys His Lys Asn 65 70 75 80 Pro Tyr His Asn Leu Met His Ala Ala Asp Val Thr Gln Thr Val His 85 90 95 Tyr Leu Leu Tyr Lys Thr Gly Val Ala Asn Trp Leu Thr Glu Leu Glu 100 105 110 Ile Phe Ala Ile Ile Phe Ser Ala Ala Ile His Asp Tyr Glu His Thr 115 120 125 Gly Thr Thr Asn Asn Phe His Ile Gln Thr Arg Ser Asp Pro Ala Ile 130 135 140 Leu Tyr Asn Asp Arg Ser Val Leu Glu Asn His His Leu Ser Ala Ala 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Leu Gln Asp Asp Glu Glu Met Asn Ile Leu Ile Asn Leu 165 170 175 Ser Lys Asp Asp Trp Arg Glu Phe Arg Thr Leu Val Ile Glu Met Val 180 185 190 Met Ala Thr Asp Met Ser Cys His Phe Gln Gln Ile Lys Ala Met Lys 195 200 205 Thr Ala Leu Gln Gln Pro Glu Ala Ile Glu Lys Pro Lys Ala Leu Ser 210 215 220 Leu Met Leu His Thr Ala Asp Ile Ser His Pro Ala Lys Ala Trp Asp 225 230 235 240 Leu His His Arg Trp Thr Met Ser Leu Leu Glu Glu Phe Phe Arg Gln 245 250 255 Gly Asp Arg Glu Ala Glu Leu Gly Leu Pro Phe Ser Pro Leu Cys Asp 260 265 270 Arg Lys Ser Thr Met Val Ala Gln Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Phe 275 280 285 Ile Val Glu Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr Asp Met Thr Glu Lys Ile 290 295 300 Val Ser Pro Leu Ile Asp Glu Thr Ser Gln Thr Gly Gly Thr Gly Gln 305 310 315 320 Arg Arg Ser Ser Leu Asn Ser Ile Ser Ser Ser Asp Ala Lys Arg Ser 325 330 335 Gly Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ile Asn Asn Ser 340 345 350 Val Ile Ser Val Asp Tyr Lys Ser Phe Lys Ala Thr Trp Thr Glu Val 355 360 365 Val His Ile Asn Arg Glu Arg Trp Arg Ala Lys Val Pro Lys Glu Glu 370 375 380 Lys Ala Lys Lys Glu Ala Glu Glu Lys Ala Arg Leu Ala Ala Glu Glu 385 390 395 400 Gln Gln Lys Glu Met Glu Ala Lys Ser Gln Ala Glu Glu Gly Ala Ser 405 410 415 Gly Lys Ala Glu Lys Lys Thr Ser Gly Glu Thr Lys Asn Gln Val Asn 420 425 430 Gly Thr Arg Ala Asn Lys Ser Asp Asn Pro Arg Gly Lys Asn Ser Lys 435 440 445 Ala Glu Lys Ser Ser Gly Glu Gln Gln Gln Asn Gly Asp Phe Lys Asp 450 455 460 Gly Lys Asn Lys Thr Asp Lys Lys Asp His Ser Asn Ile Gly Asn Asp 465 470 475 480 Ser Lys Lys Thr Asp Gly Thr Lys Gln Arg Ser His Gly Ser Pro Ala 485 490 495 Pro Ser Thr Ser Ser Thr Cys Arg Leu Thr Leu Pro Val Ile Lys Pro 500 505 510 Pro Leu Arg His Phe Lys Arg Pro Ala Tyr Ala Ser Ser Ser Tyr Ala 515 520 525 Pro Ser Val Ser Lys Lys Thr Asp Glu His Pro Ala Arg Tyr Lys Met 530 535 540 Leu Asp Gln Arg Ile Lys Met Lys Lys Ile Gln Asn Ile Ser His Asn 545 550 555 560 Trp Asn Arg Lys <210> 54 <211> 29 <212> DNA <400> 54 tacgaagctt tgatggggtc tactgctac 29 <210> 55 <211> 31 <212> DNA <400> 55 tacgaagctt tgatggttgg cttggcatat c 31 <210> 56 <211> 16 <212> DNA <400> 56 attacccctc ataaag 16 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <400> 57 tacgaagctt tgatgcgccg acagcctgc 29 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <400> 58 ggtctcctgt tgcagatatt g 21
【図面の簡単な説明】
【図１】 61kDa（ウシ脳）イソ酵素の完全配列と並列
せしめてなる、単離した59kDa（ウシ心臓) および63kDa
（ウシ脳）CaM-PDEタンパク質のアミノ酸配列決定の結
果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:865 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ベントレー， ジェイ．， ケリー アメリカ合衆国 98155 ワシントン シアトル ＃402 エヌ．イー． サン ドポイント ウェイ 6200 (72)発明者 シャルボンヌ， ハリー アメリカ合衆国 47906 インディアナ ダブリュ． ラファイッテ アプト. ディー ケストラル ブルーブァード 2447 (72)発明者 ソネン， ウィリアム， ケィ. アメリカ合衆国 98155 ワシントン シアトル モントレイク テラス 236 ス エス．ダブリュ．5704 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83，ＮＯ．24 （1986），ｐ．9308−9312 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．86，ＮＯ．10 （1989），ｐ．3599−3603 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトサイクリックＧＭＰ刺激サイクリッ
    クヌクレオチドホスホジエステラーゼポリペプチドをコ
    ードする精製および単離したポリヌクレオチドであっ
    て、ベクターｐGSPDE6.1（A.T.C.C. 68583）、ｐGSPDE
    7.1（A.T.C.C. 68585）、ｐGSPDE9.2（A.T.C.C. 6858
    4）およびｐHcgs6n（A.T.C.C. 68962）からなるグルー
    プから選択されるベクター内のヒトＤＮＡ挿入体を含
    む、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含
    むｃＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含
    むゲノミックＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のポリヌクレオチドが挿
    入されたＤＮＡベクター。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリヌクレオチドで安
    定して形質転換した原核宿主細胞。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリヌクレオチドで安
    定して形質転換した真核宿主細胞。
  7. 【請求項７】 前記細胞が、酵母細胞である請求項６に
    記載の宿主細胞。
  8. 【請求項８】 請求項５に記載の原核宿主細胞での発現
    によるポリペプチド生成物。
  9. 【請求項９】 請求項６に記載の真核宿主細胞での発現
    によるポリペプチド生成物。
  10. 【請求項１０】 請求項７に記載の酵母細胞での発現に
    よるポリペプチド生成物。
  11. 【請求項１１】 ヒトサイクリックＧＭＰ刺激ヌクレオ
    チドホスホジエステラーゼの酵素活性を有するポリペプ
    チドをコードする精製および単離したポリヌクレオチド
    であって、 (a) ベクターｐHcgs6n（A.T.C.C. 68962）内のヒトＤＮ
    Ａ挿入体； (b) ベクターｐHcgs6n（A.T.C.C. 68962）、ｐGSPDE6.1
    （A.T.C.C. 68583）、ｐGSPDE7.1（A.T.C.C. 68585）、
    およびｐGSPDE9.2（A.T.C.C. 68584）からな るグループ
    から選択されるベクター内のヒトＤＮＡ挿入体と、スト
    リンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブ
    リダイズするポリヌクレオチド；および (c) 変性コドンによって上記(a)および(b)に記載のＤＮ
    Ａ挿入体と同じポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チド； からなるグループから選択される精製および単離したポ
    リヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項11に記載のポリヌクレオチド
    で、形質転換あるいは形質変換した原核宿主細胞での発
    現によるポリペプチド生成物。
  13. 【請求項１３】 請求項11に記載のポリヌクレオチド
    で、形質転換あるいは形質変換した真核宿主細胞での発
    現によるポリペプチド生成物。
  14. 【請求項１４】 前記細胞が、酵母細胞である請求項13
    に記載のポリペプチド生成物。
  15. 【請求項１５】 請求項８、９、10、12、13および14の
    いずれかに記載のポリペプチド生成物と特異的な免疫反
    応性を示す抗体。
  16. 【請求項１６】 ヒトサイクリックＧＭＰ刺激サイクリ
    ックヌクレオチドホスホジエステラーゼの酵素活性を有
    するポリペプチドの製造方法であって、以下の工程、す
    なわち、 (a) 請求項１または11に記載のポリヌクレオチドで、宿
    主細胞を、安定して形質転換または形質変換し、および (b) 工程(a)で形成した宿主細胞を、栄養培地にて、当
    該宿主細胞にて当該ポリヌクレオチドの発現を許容する
    条件下で生育する、 工程を含む、ことを特徴とするヒトサイクリックＧＭＰ
    刺激サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの
    酵素活性を有するポリペプチドの製造方法。
  17. 【請求項１７】 前記宿主細胞での前記ポリヌクレオチ
    ドの発現によって、ポリペプチド生成物を単離する工程
    をさらに含む、請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記宿主細胞が、酵母細胞である請求
    項16または17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ヒトサイクリックＧＭＰ刺激サイクリ
    ックヌクレオチドホスホジエステラーゼの酵素活性を修
    飾する化学薬品を同定するための分析方法であって、以
    下の工程、すなわち、 (a) 請求項１または11に記載のポリヌクレオチドで、当
    該ポリヌクレオチドの発現が宿主細胞にてあり次第に改
    変感受性になる表現型特性を有する宿主細胞を、安定し
    て形質転換し； (b) 工程(a)で形成した宿主細胞を、栄養培地にて、当
    該宿主細胞表現型の改変に対応して当該宿主細胞にて当
    該ポリヌクレオチドの発現を許容する条件下で生育し； (c) 工程(b)で生育した宿主細胞と、分析する化学薬品
    を接触させ；および (d) 工程(c)にて当該化学薬品と接触した当該宿主細胞
    の表現型の改変における修飾を決定する、 工程を含む、ことを特徴とするヒトサイクリックＧＭＰ
    刺激サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの
    酵素活性を修飾する化学薬品を同定するための分析方
    法。
  20. 【請求項２０】 前記宿主細胞が、酵母細胞である請求
    項19に記載の分析方法。
  21. 【請求項２１】 ヒトサイクリックＧＭＰ刺激サイクリ
    ックヌクレオチドホスホジエステラーゼの酵素活性を修
    飾する化学薬品を同定するための分析方法であって、以
    下の工程、すなわち、 (a) 請求項１または11に記載のポリヌクレオチドで、当
    該ポリヌクレオチドの発現が宿主細胞にてあり次第に改
    変感受性になる表現型特性を有する宿主細胞を、安定し
    て形質転換し； (b) 工程(a)で形成した宿主細胞を、栄養培地にて、当
    該宿主細胞にて当該ポリヌクレオチドの発現を許容する
    条件下で生育し； (c) 改変した表現型を有する宿主細胞を同定し； (d) 当該宿主細胞を粉砕し； (e) 当該粉砕した宿主細胞から細胞質ゾルを単離し； (f) 当該細胞質ゾルと、当該化学薬品を接触させ；およ
    び (g) 当該酵素活性が改変されたかどうかを決定する、 工程を含む、ことを特徴とするヒトサイクリックＧＭＰ
    刺激サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの
    酵素活性を修飾する化学薬品を同定するための分析方
    法。
  22. 【請求項２２】 前記宿主細胞が、酵母細胞である請求
    項21に記載の分析方法。
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