JP3636207B2

JP3636207B2 - Immunostimulatory / infection-preventing agent and method for producing the same

Info

Publication number: JP3636207B2
Application number: JP26678192A
Authority: JP
Inventors: 誠一荒木; 護鈴木; 昌俊藤本; 勝三井田
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-09-10
Publication date: 2005-04-06
Anticipated expiration: 2020-04-06
Also published as: JPH05201864A

Description

【０００１】
本発明はヒト又は動物等の免疫機能を賦活させ感染を防御する医薬に関する。
【０００２】
【従来技術及び発明の背景】
近年、免疫学の進歩により、ヒト及び動物の種々の疾患あるいは感染症は、免疫機能の低下または免疫機能の不全が原因と考えられるようになっている。
【０００３】
例えば、ヒトの場合、気管支喘息、アレルギー疾患、関節リュウマチ、自己免疫疾患、栄養障害、外科手術、高齢化、妊娠等により、多くの場合免疫機能が低下しまたは不全になり、呼吸器感染症、敗血症、尿路感染症等の感染症を併発する。従来、このような疾患や感染症に対しては各種抗生物質が投与されている。
【０００４】
一方、畜水産業においては、家畜、家禽または養殖魚を効率よく飼育するために、大規模経営、過密飼育が行われているが、このような飼育に対しては、抗生物質の大量投与が採用されている。
【０００５】
このような状況の中で、特開昭６２−２８６９２３号公報はタンパク質の分解で生ずるアミノ酸の一種であるプロリン（ピロリジン−２−カルボン酸）に免疫増強作用があることが開示されている。また、特公昭６３−３８９８５号公報はプロリンの誘導体であるグルタミンが免疫増強作用があることを開示している。
【０００６】
ところで、本発明で使用されるリボフラビンは、生体内でリン酸化され補酵素（例えば、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド）としてアミノ酸酸化酵素、キサンチン酸化酵素など20数種のフラビン酵素を形成し、生体の酸化還元機構に関与し、糖質、脂質、タンパク質などの代謝に重要な役割を果たしている。
【０００７】
また、リボフラビンは、ヒトの場合、これが欠乏すると、口唇炎、急慢性湿疹、日光性湿疹、脂漏性湿疹、結膜炎、口角炎、舌炎、ペラグラ等を招来することが知られている。従って、リボフラビンはこれらビタミンＢ₂欠乏症の予防、治療に使用されている。
【０００８】
そして、リボフラビン誘導体は、リボフラビンと実質的に同様の薬理作用があり適応症も同じことが知られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
抗生物質を継続的に使用すると、耐性菌が発生し、特定の抗生物質の効力が減弱する。また、最近クローズアップされている病院内感染の問題もあり、抗生物質の使用量を減らし、免疫機能そのものを高めることによる予防、治療薬の開発が望まれている。
【００１０】
一方、畜水産業における過密飼育では、ストレスや幼若期における免疫不全により各種感染症が多発するという問題があり、その対策として抗生物質の大量投与を行うと、今度は抗生物質の残留や耐性菌の増加の問題が起きている。
【００１１】
本発明者らは、上述の抗生物質の問題点に鑑み、ヒトあるいは動物に安全な、感染防御剤について長年鋭意検討を重ねてきた。その結果、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体に免疫機能賦活作用があることを見出た。そして、さらに、水溶性高分子等に、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体の免疫機構賦活作用を増強し、かつ持続させる作用があることも見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明はリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体を含有する免疫賦活・感染防御剤、すなわち感染症の予防、治療剤（ただし、壊死感染症及び牛の角結膜炎症を除く）に関する。ここに、リボフラビン誘導体とは、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド及びリボフラビンの薬理学的に許容される塩（例えば、リン酸リボフラビンナトリウム、リン酸リボフラビンのモノジエタノールアミン塩など）である。
【００１３】
プロリン及びグルタミンに免疫機能賦活作用があることは前述したとおりであるが、本発明に従ってリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体に、プロリン及び／またはグルタミンを同時に使用することによって、意外にも、免疫機構賦活作用が相乗的に向上することがわかった。従って、本発明はリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体を含有し、さらにプロリン及び／またはグルタミンを含有する免疫賦活・感染防御剤である。
【００１４】
そして、本発明のリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体及び抗生剤（ただし、ゲンタマイシンを除く）を含有する免疫賦活感染防御剤は、両者を併用することによって、それぞれ単独で使用した場合に得られる以上の、いわゆる相乗効果を意外にも発現し、結果として抗生剤の使用量を著しく減少させるという重要な効果を与えることが見出された。つまり、本発明はリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体及び抗生剤（ただし、ゲンタマイシンを除く）を含有する免疫賦活感染防御剤である。
【００１５】
また、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と、水溶性高分子またはレシチンとより成る免疫賦活・感染防御剤は、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と、水溶性高分子またはレシチンとを併用することにより、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体の感染防御効果が意外にも増強されることがわかった。従って、本発明はリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と、水溶性高分子またはレシチンとより成る免疫賦活・感染防御剤である。
【００１６】
更に、本発明のリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体及びワクチンを含有する免疫賦活感染防御効果のあるワクチン製剤は、両者を併用することによって、それぞれ単独で使用した場合に得られる感染防御効果以上の、いわゆる相乗効果を意外にも得られることがわかった。つまり、本発明はリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体及びワクチンを含有するワクチン製剤である。
【００１７】
また、本発明はリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と、水溶性高分子またはレシチンとより成る免疫賦活・感染防御剤の製造方法に関する。
【００１８】
リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と、レシチンとより成る免疫賦活・感染防御剤、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と水溶性高分子とより成る免疫賦活・感染防御剤は、一部のリボフラビン誘導体やレシチンが水に溶けにくい為、単なる混合では製剤化できないが、リボフラビン誘導体、レシチンを乳化することで製剤化が可能となる。従って、本発明はレシチン並びに、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体を溶媒に乳化させることを特徴とする製造方法、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と水溶性高分子を溶媒に乳化することを特徴とする製造方法である。
【００１９】
本発明の目的は、免疫機能を賦活させることにより、上述したような抗生物質（ただし、ゲンタマイシンを除く）投与に伴う欠点がなくヒトあるいは動物に安全な、感染から生体を防御する薬剤を提供することである。
【００２０】
本発明における免疫賦活とは、ヒト、動物例えば魚類等の免疫機能を高めることを意味する。
【００２１】
従って、本発明はヒトあるいは動物等の免疫機能を高めることにより各種の疾患の予防、治療、各種感染症に対する予防、治療薬として有用であるので、特に症例が特定されるものではない。例えば、ヒトの場合、癌、臓器移植、白血球減少症、関節リウマチ、自己免疫疾患、気管支喘息、栄養障害、外科手術、加齢疾患あるいは呼吸器感染症、敗血症、尿路感染症などの各種感染症である。
【００２２】
また、動物の場合、例えば、豚の下痢、流行性肺炎、萎縮性鼻炎、伝染性胃腸炎等、鶏の肺炎、マレック病、牛の下痢、肺炎、乳房炎、ペットのエイズ及び猫白血病（ただし、牛の角結膜炎を除く）である。
【００２３】
さらに、本発明の適用される養殖魚の感染症も特定されないが、例えば、レンサ球菌、類結節症等の細菌感染症、ウイルス感染症等広範である。
【００２４】
本発明においては、リボフラビン及びリボフラビン誘導体は単独で用いることができるし、また、両者を組み合わせて用いることもできる。リボフラビン誘導体とは、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド及びリボフラビンの薬理学的に許容される塩（例えば、リン酸リボフラビンナトリウム、リン酸リボフラビンのモノジエタノールアミン塩など）である。
【００２５】
本発明におけるリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体の用量は使用される動物種等により異なるため、特に限定されない。一般には、体重１Kg当たり０.1〜500mg の範囲であり、好ましくは、１〜100mg の範囲である。
【００２６】
本発明におけるリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体とプロリン及び／またはグルタミンとの配合比は限定されないが、一般に、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体１重量部に対し０.1〜10重量部であり、好ましくは、０.5〜５重量部である。
【００２７】
本発明においては、プロリン及びグルタミンは単独でリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と配合することができるし、両者を混合して配合してもよい。
【００２８】
そして、併用される抗生剤は特に限定されないが、例えば、アモキシシリン、テトラサイクリン、塩酸オキシサイクリン等を挙げることができる。
【００２９】
アモキシシリンはペニシリン系抗生剤で細胞壁合成阻害による抗菌作用を有し、アモキシシリン感性の大腸菌、インフルエンザ菌、溶血レンサ球菌、ブドウ球菌などによる各種感染症に対して適応される。
【００３０】
さらに、本発明におけるリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と抗生剤の配合比は特に限定されないが、一般には、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体１重量部に対し抗生剤０.01 〜１重量部であり、好ましくは、０.05 〜０.5重量部である。
【００３１】
そして、本発明におけるリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体と、水溶性高分子またはレシチンとの配合比は特に限定されないが、一般には、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体１重量部に対し水溶性高分子またはレシチン0.01〜100 重量部であり、好ましくは0.05〜50重量部である。さらに好ましくは0.1 〜10重量部である。
【００３２】
水溶性高分子は特に限定されるものではないが、好ましくは、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びポリビニルアルコールなどがある。これらはｌ種又は２種以上を任意選択して使用することができる。
【００３３】
レシチンは特に限定されないが、卵黄レシチン、大豆レシチン及び各水添レシチンが挙げられ、１種または２種以上を任意選択して使用する。
【００３４】
また、本発明において併用されるワクチンの種類や配合比は、ヒト、動物例えば魚類等の種類により異なり、特に限定されるものではないが、例えば、特に動物では、鶏マイコプラズマワクチン、鶏伝染性コリーザＡ・Ｃ型不活性化ワクチン、豚ボルデテラ不活性化ワクチン及び豚ヘモフィルス（アクチノバチルス）不活性化ワクチン等の各種ワクチンがある。
【００３５】
本発明にかかる免疫賦活・感染防御剤がヒト、動物等に投与される際の剤形は特に限定されず、注射剤、顆粒剤、散剤、錠剤等とすることができる。
【００３６】
本発明を製剤化する場合、剤型に応じた各種の添加剤が配合され得る。例えば、固形または粉末状に製剤する場合には賦形剤、着色剤、滑沢剤、結合剤、被覆剤等が配合されうる。
【００３７】
難溶性物質を注射剤とする場合には、しばしば界面活性剤等の溶解補助剤が用いられる。本発明においても、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤等が使用されるが、これらの物質は、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体の免疫賦活・感染防御作用を意外にも増加させることを見い出し添加されるものであって、単なる溶解補助剤としての作用を有するだけではない。
【００３８】
本発明中のリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体を含有する、または、これらにさらにプロリン及び／またはグルタミンを含有する免疫賦活・感染防御剤を食品に添加することにより、個々の疾病の予防を特異目的としている生体調節機能を有する食品、いわゆる機能性食品として用いることができる。
【００３９】
さらに、抗生剤にみられる耐性菌の影響、残留の問題も無いので、安全かつ生体防御調節機能を有する飼料、すなわち、機能性飼料として、豚、鶏、牛、馬、羊などの家畜や魚類、ペット（犬、猫、鳥）などに使用することもできる。
【００４０】
本発明中のリボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体を含有する、免疫賦活・感染予防剤、または、リボフラビン及び／またはリボフラビン誘導体及び抗生剤を含有する免疫賦活・感染防御剤は、ヒト、動物に投与する場合、筋肉注射、静脈注射、皮下注射、経口投与で行う。
【００４１】
【作用】
本発明者等はリボフラビン誘導体が免疫機構を賦活する生体内作用機構を完全には解明していないが、白血球中の食細胞例えばマクロファージ及び好中球を活性化していることが認められており、また白血球数（特に好中球数）を増加させることを見出している。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。実施例で使用する物質の投与量に関する記載、例えば、「10mg/Kg i.m.」は体重１Kg当たり10mgを筋肉注射したという意味である。また、表１〜表７のx²検定の欄で使用する「＊」及び「＊＊」は各々ｐ＜0.05及びｐ＜0.01を表す。
【００４３】
【実施例１】
ＳＬＣ：ＩＣＲ雄性マウス各々10匹（週齢５〜６、体重25〜30g ）にリボフラビン10、30、100mg/Kg及びコントロールとして生理食塩水を筋肉注射した。そして24時間後に臨床由来の大腸菌（２.6×10⁷CFU/Mouse,0.2ml）を各マウスに皮下接種し、感染７日目の生存数から生存率を求め、コントロールに対する有意差を求めた。結果を表１に示した。
【００４４】
【表１】

【００４５】
表１に見る如く、リボフラビンの効果は投与量依存的でありリボフラビンが感染防御効果を有していることは明らかである。その効果は、リボフラビン30mg/Kg 及び100mg/Kg投与での生存率は各々50％及び90％という強い感染防御効果を示している。
【００４６】
【実施例２】
ＳＬＣ：ＩＣＲ雄性マウス各々10匹（週齢５〜６、体重22〜30g ）に、表２に示すようにグルタミン、プロリン及びリボフラビンをそれぞれ単独または組み合わせて、及びコントロール（生理食塩水）を筋肉注射した。そして24時間後に臨床由来の大腸菌（２.6×10⁷CFU/Mouse,0.2ml）を各マウスに接種し、感染７日目の生存数から生存率を求めた。
【００４７】
更に、グルタミン、プロリン、リボフラビンをそれぞれ単独または組み合わせたものについて、それぞれコントロールに対する有意差を求めて得た結果を表２に記載する。
【００４８】
【表２】

【００４９】
更に、グルタミン、プロリン及びリボフラビンを組み合わせたものについて、グルタミン、プロリンを組み合わせたものに対する有意差を表３に記載する。
【００５０】
【表３】

【００５１】
表２に見る如く、プロリン100mg/Kg投与は生存率40％で、コントロールと比較して有意差が出ており感染防御効果を示している。リボフラビン30mg/Kg 及び100 mg/Kg 投与での生存率は、各々50％及び90％であって、プロリンと比較しても投与量依存的に強い感染防御効果を示していることが分かる。
【００５２】
また、表２からはグルタミン、プロリン及びリボフラビンを組み合わせることにより、それぞれ単独に得られる効果の和としての相加効果以上の効果、つまり、相乗効果が得られることが確認された。
【００５３】
更に、表３からもグルタミン、プロリン及びリボフラビンを組み合わせたものが、生存率 100％と極めて強い感染防御効果を示している。これを、グルタミンとプロリンとの組み合わせたものの効果に、リボフラビン単独の効果を加えた効果と比較すると、明らかに有意な相乗効果が得られることが確認された。
【００５４】
【実施例３】
ＳＬＣ：ＩＣＲ雄性マウス各々１０匹（週齢５〜６、体重25〜30ｇ）にリン酸リボフラビンナトリウム10、30、 100、300mg/Kg及びコントロールとして生理食塩水を筋肉注射した。そして24時間後に臨床由来の大腸菌（２.6×10⁷CFU/Mouse,0.2ml）を各マウスに皮下接種し、感染７日目の生存数から生存率を求め、コントロールに対する有意差を求めた。結果を表４に示した。
【００５５】
【表４】

【００５６】
表４に見る如く、感染防御効果はリン酸リボフラビンナトリウム10、30、 100、及び300mg/Kgにおいて用量依存性である。特に300mg/Kgは極めて強い感染防御効果を示すことが確認された。
【００５７】
【実施例４】
ＳＬＣ：ＩＣＲ雄性マウス各々10匹（週齢５〜６、体重25〜30ｇ）にリン酸リボフラビンナトリウム10mg/Kg 、アモキシシリン（AMPC）0.39mg/Kg をそれぞれ単独及び組み合わせて、感染24時間前及び感染30分後に筋肉注射した。臨床由来の大腸菌（2.6 ×10⁷CFU/Mouse,0.2ml）を各マウスに皮下接種し、感染７日目の生存数から生存率を求め、結果を表５に示した。
【００５８】
【表５】

【００５９】
表５に見る如く、アモキシシリンとリン酸リボフラビンナトリウムとを組み合わせることにより、それぞれ単独に得られる効果の和としての相加効果以上の効果、つまり、有意な相乗効果が得られることが確認された。
【００６０】
【実施例５】
ＳＬＣ：ＩＣＲ雄性マウス各々１０匹（週齢５〜６、体重２５〜３０ｇ）にフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、リボフラビンそれぞれ１００ｍｇ／Ｋｇとポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−Ｋ３０）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣＮａ）、精製ダイズレシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン２０モルソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ−８０）及びコントロール（生理食塩水）を下表６のような組み合わせで、筋肉注射した。そして３日後に臨床由来の大腸菌（２．６×１０^７ＣＦＵ／Ｍｏｕｓｅ，０．２ｍｌ）を各マウスに皮下接種し、感染７日目の生存数から生存率を求め、コントロールに対する有意差を求めた。結果を表６に示した。
【００６１】
【表６】

【００６２】
表６に見る如く、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−Ｋ３０）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣＮａ）、ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン２０モルソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ−８０）などの各種水溶性高分子や、精製ダイズレシチン、卵黄レシチンなどのレシチンが、ＦＭＮ、リボフラビンの感染防御効果を増強し、かつ持続させることが確認された。
【００６３】
【実施例６】
表７のようにリボフラビンまたは、リン酸リボフラビンナトリウムと卵黄レシチンを単独または組み合わせて、リン酸緩衝液で20倍に希釈し、更に、市販のActinobacillus pleueopneumoniae 不活性化ワクチンと混合して、ワクチン製剤とした。これと、コントロールのリン酸緩衝液とを、それぞれ0.5 mlづつＳＬＣ：ＩＣＲ雄性マウス各々20匹（週齢３、体重12〜15ｇ）に、腹腔内投与した。投与後１４日後にActinobacillus pleueopneumoniae ３×10⁸をマウスに0.5ml 腹腔内接種して、７日後の生存率を表７に示した。この実験は、ワクチン国家検定法に準じて実施した。
【００６４】
【表７】

【００６５】
表７に見る如く、リボフラビン、リン酸リボフラビンナトリウム及びワクチンを組み合わせることにより、それぞれ単独で使用した感染防御効果の和である相加効果以上の、つまり有意な相乗効果が確認された。この相乗効果は、ワクチンの感染防御効果が高まったことを示し、つまりはワクチン増強効果にほかならない。
【００６６】
【実施例７】
フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）５ｇ、Ｄ−ソルビトール５ｇ、リン酸二ナトリウム0.04ｇ、リン酸一ナトリウム0.04ｇ及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−Ｋ３０）15ｇを注射用水に溶解し 100mlとした。この溶液を５mlアンプルに分注充填し、蒸気滅菌し、免疫賦活感染防御剤とした。
【００６７】
【実施例８】
実施例７において、ＰＶＰ−Ｋ３０の１５ｇの代わりに、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）３ｇを使用する以外は実施例７と同様に行い、免疫賦活感染防御剤とした。
【００６８】
【実施例９】
実施例７において、ＰＶＰ−Ｋ３０の１５ｇの代わりに、ヒドロオキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）２ｇを使用する以外は実施例７と同様に行い、免疫賦活感染防御剤とした。
【００６９】
【実施例１０】
実施例７において、ＰＶＰ−Ｋ30の15ｇの代わりに、コンドロイチン硫酸ナトリウム20ｇを使用する以外は実施例７と同様に行い、免疫賦活感染防御剤とした。
【００７０】
【実施例１１】
卵黄レシチン10ｇを超音波乳化機を用いて分散させた後、これにＤ−ソルビトール５ｇ、リン酸二ナトリウム0.03ｇ、リン酸一ナトリウム0.02ｇ及びＦＭＮ３ｇを溶解させ、注射用水に溶解し 100mlとした。この溶液を５mlアンプルに分注充填し、蒸気滅菌し、免疫賦活感染防御剤とした。
【００７１】
【実施例１２】
実施例１１において、卵黄レシチン10ｇの代わりに、部分水添ダイズレシチン10ｇを使用し、ＦＭＮは４ｇに変更して使用する以外は実施例１１と同様に行い、免疫賦活感染防御剤とした。
【００７２】
【実施例１３】
微細結晶リボフラビン５ｇを、Ｄ−ソルビトール５ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC Na）１ｇ、リン酸二ナトリウム0.04ｇ及びリン酸一ナトリウム0.04ｇを含有する注射水溶液で懸濁し100 mlとした。この懸濁液を超音波乳化機を用いて分散させ、５mlアンプルに分注充填し、蒸気滅菌し、免疫賦活感染防御剤とした。
【００７３】
【実施例１４】
実施例１３において、CMC Naの１ｇの代わりに、ＨＰＭＣの３ｇを使用する以外は実施例１３と同様に行い、免疫賦活感染防御剤とした。
【００７４】
【実施例１５】
実施例１３において、CMC Naの 1ｇの代わりに、ポリビニルアルコール３ｇを使用する以外は実施例１３と同様に行い、免疫賦活感染防御剤とした。
【００７５】
【実施例１６】
部分水添卵黄レシチン10ｇ及びＤ−ソルビトール５ｇを超音波乳化機を用いて分散させた後、これにリン酸二ナトリウム0.03ｇ、リン酸一ナトリウム0.02ｇ及びＦＭＮ３ｇを溶解させた。この溶液にリボフラビン５ｇを添加し懸濁し、更に注射用水に溶解し100ml とした。この溶液を５mlアンプルに分注充填し、蒸気滅菌し、免疫賦活感染防御剤とした。
【００７６】
実施例７〜１６に示した製造法により本発明の免疫賦活感染防御剤は調製される。
【００７７】
【発明の効果】
上記の試験例から、免疫賦活・感染防御剤およびワクチン製剤は、優れた免疫機構賦活作用を有し、従って、各種の疾患の予防、治療、各種感染症に対する予防、治療薬として有用である。[0001]
The present invention relates to a medicine that activates immune functions of humans or animals to prevent infection.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
In recent years, due to advances in immunology, various diseases and infectious diseases in humans and animals are considered to be caused by decreased immune function or impaired immune function.
[0003]
For example, in the case of humans, bronchial asthma, allergic diseases, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, nutritional disorders, surgery, aging, pregnancy, etc. often lead to decreased or impaired immune function, respiratory infections, Infectious diseases such as sepsis and urinary tract infection. Conventionally, various antibiotics have been administered for such diseases and infections.
[0004]
On the other hand, in the livestock and fishery industry, large-scale management and overcrowded breeding are carried out in order to efficiently raise livestock, poultry or farmed fish. It has been adopted.
[0005]
Under such circumstances, Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-286923 discloses that proline (pyrrolidine-2-carboxylic acid), which is a kind of amino acid generated by protein degradation, has an immunopotentiating action. Japanese Examined Patent Publication No. 63-38985 discloses that glutamine, a derivative of proline, has an immunopotentiating action.
[0006]
By the way, riboflavin used in the present invention is phosphorylated in vivo and forms 20 or more kinds of flavin enzymes such as amino acid oxidase and xanthine oxidase as coenzymes (for example, flavin mononucleotide, flavin adenine dinucleotide), It is involved in the redox mechanism of the living body and plays an important role in the metabolism of carbohydrates, lipids, and proteins.
[0007]
In addition, riboflavin is known to cause cheilitis, acute chronic eczema, sunlight eczema, seborrheic eczema, conjunctivitis, stomatitis, glossitis, pellagra and the like when it is deficient in humans. Therefore, riboflavin is used for the prevention and treatment of these vitamin B ₂ deficiencies.
[0008]
Riboflavin derivatives are known to have substantially the same pharmacological action as riboflavin and have the same indication.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
If antibiotics are used continuously, resistant bacteria develop and the effectiveness of certain antibiotics is diminished. In addition, there is a problem of hospital infection that has been recently closed up, and it is desired to develop preventive and therapeutic drugs by reducing the amount of antibiotics used and enhancing the immune function itself.
[0010]
On the other hand, overcrowded breeding in the livestock and fisheries industry has a problem that various infectious diseases occur frequently due to stress and immunodeficiency in early childhood. There is a problem of increase in fungi.
[0011]
In view of the above-mentioned problems of antibiotics, the present inventors have been eagerly studying for many years on infection protection agents that are safe for humans or animals. As a result, it was found that riboflavin and / or riboflavin derivatives have an immune function stimulating action. Furthermore, the present inventors have also found that water-soluble polymers and the like have an action of enhancing and sustaining the immune mechanism activation action of riboflavin and / or riboflavin derivatives, and completed the present invention.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to an immunostimulatory / infective protective agent containing riboflavin and / or a riboflavin derivative, that is, a preventive or therapeutic agent for infectious diseases (however, excluding necrotic infection and cattle keratoconjunctivitis). Here, the riboflavin derivative is a pharmacologically acceptable salt of flavin mononucleotide, flavin adenine dinucleotide and riboflavin (for example, riboflavin sodium phosphate, monodiethanolamine salt of riboflavin phosphate, etc.).
[0013]
As described above, proline and glutamine have an immune function-stimulating effect, but surprisingly, by using proline and / or glutamine simultaneously with riboflavin and / or riboflavin derivatives according to the present invention, an immune mechanism-stimulating effect is obtained. Was found to improve synergistically. Therefore, the present invention is an immunostimulatory / infective protective agent containing riboflavin and / or a riboflavin derivative and further containing proline and / or glutamine.
[0014]
And, the immunostimulatory infection protective agent containing the riboflavin and / or riboflavin derivative of the present invention and an antibiotic (excluding gentamicin) is more than that obtained when each is used alone, It has been found that a so-called synergistic effect is surprisingly produced, resulting in an important effect of significantly reducing the amount of antibiotic used. That is, the present invention is an immunostimulatory infection protective agent containing riboflavin and / or a riboflavin derivative and an antibiotic (but excluding gentamicin).
[0015]
Further, an immunostimulatory / infection-preventing agent comprising riboflavin and / or riboflavin derivative and a water-soluble polymer or lecithin can be obtained by using riboflavin and / or riboflavin derivative and water-soluble polymer or lecithin in combination. It was found that the protective effect of riboflavin derivatives was unexpectedly enhanced. Accordingly, the present invention is an immunostimulatory / infective protective agent comprising riboflavin and / or a riboflavin derivative and a water-soluble polymer or lecithin.
[0016]
Furthermore, an immunostimulatory infection-protective vaccine preparation containing the riboflavin and / or riboflavin derivative of the present invention and a vaccine is a so-called infection-protective effect that is greater than the infection-protective effect obtained when each is used alone. It was found that a synergistic effect can be obtained unexpectedly. That is, the present invention is a vaccine preparation containing riboflavin and / or a riboflavin derivative and a vaccine.
[0017]
The present invention also relates to a method for producing an immunostimulatory / infective protective agent comprising riboflavin and / or a riboflavin derivative and a water-soluble polymer or lecithin.
[0018]
Immunostimulation / infection prevention agents consisting of riboflavin and / or riboflavin derivatives and lecithin, and immunostimulation / infection prevention agents consisting of riboflavin and / or riboflavin derivatives and water-soluble polymers, some riboflavin derivatives and lecithin are water. However, it cannot be formulated by simple mixing, but can be formulated by emulsifying a riboflavin derivative and lecithin. Accordingly, the present invention provides a production method comprising emulsifying lecithin and riboflavin and / or riboflavin derivatives in a solvent, and a production method comprising emulsifying riboflavin and / or riboflavin derivatives and a water-soluble polymer in a solvent. It is.
[0019]
An object of the present invention is to provide an agent that protects a living body from infection without causing the drawbacks associated with the administration of antibiotics (excluding gentamicin) as described above, by stimulating immune function, and is safe for humans or animals. That is.
[0020]
The immunostimulation in the present invention means enhancing the immune function of humans, animals such as fish.
[0021]
Therefore, since the present invention is useful as a preventive and therapeutic agent for various diseases and preventive and therapeutic agents for various infectious diseases by enhancing the immune function of humans or animals, no particular case is specified. For example, in the case of humans, various infections such as cancer, organ transplantation, leukopenia, rheumatoid arthritis, autoimmune disease, bronchial asthma, nutritional disorders, surgery, age-related disease or respiratory infection, sepsis, urinary tract infection, etc. It is symptom.
[0022]
In the case of animals, for example, porcine diarrhea, epidemic pneumonia, atrophic rhinitis, infectious gastroenteritis, chicken pneumonia, Marek's disease, cattle diarrhea, pneumonia, mastitis, pet AIDS and feline leukemia (however, , Except cattle keratoconjunctivitis).
[0023]
Furthermore, the infectious diseases of the cultured fish to which the present invention is applied are not specified, but are widespread, for example, bacterial infections such as streptococci and nodules, and viral infections.
[0024]
In the present invention, riboflavin and riboflavin derivatives can be used alone or in combination. The riboflavin derivative is a pharmacologically acceptable salt of flavin mononucleotide, flavin adenine dinucleotide and riboflavin (for example, riboflavin sodium phosphate, monodiethanolamine salt of riboflavin phosphate, etc.).
[0025]
The dose of riboflavin and / or riboflavin derivative in the present invention is not particularly limited because it varies depending on the animal species used. Generally, it is in the range of 0.1 to 500 mg / kg body weight, and preferably in the range of 1 to 100 mg.
[0026]
The mixing ratio of riboflavin and / or riboflavin derivative and proline and / or glutamine in the present invention is not limited, but is generally 0.1 to 10 parts by weight, preferably 1 to 10 parts by weight with respect to 1 part by weight of riboflavin and / or riboflavin derivative. 0.5 to 5 parts by weight.
[0027]
In the present invention, proline and glutamine can be blended alone with riboflavin and / or riboflavin derivatives, or both may be blended.
[0028]
The antibiotic used in combination is not particularly limited, and examples thereof include amoxicillin, tetracycline, oxycycline hydrochloride and the like.
[0029]
Amoxicillin is a penicillin antibiotic and has an antibacterial action by inhibiting cell wall synthesis, and is adapted for various infectious diseases caused by amoxicillin-sensitive Escherichia coli, Haemophilus influenzae, hemolytic streptococci, staphylococci and the like.
[0030]
Furthermore, the mixing ratio of riboflavin and / or riboflavin derivative and antibiotic in the present invention is not particularly limited, but generally 0.01 to 1 part by weight of antibiotic with respect to 1 part by weight of riboflavin and / or riboflavin derivative, preferably Is 0.05 to 0.5 parts by weight.
[0031]
The mixing ratio of riboflavin and / or riboflavin derivative and water-soluble polymer or lecithin in the present invention is not particularly limited. Generally, however, the water-soluble polymer or lecithin is 0.01% by weight with respect to 1 part by weight of riboflavin and / or riboflavin derivative. -100 parts by weight, preferably 0.05-50 parts by weight. More preferably, it is 0.1-10 weight part.
[0032]
The water-soluble polymer is not particularly limited, but preferably polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, sodium chondroitin sulfate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene sorbitan fatty acid Examples include esters and polyvinyl alcohol. These can be used by optionally selecting one type or two or more types.
[0033]
Lecithin is not particularly limited, and examples thereof include egg yolk lecithin, soybean lecithin, and hydrogenated lecithin, and one or two or more are optionally used.
[0034]
In addition, the type and blending ratio of the vaccine used in the present invention vary depending on the type of human, animal such as fish and are not particularly limited. For example, in animals, chicken mycoplasma vaccine, chicken infectious coryza There are various vaccines such as A / C type inactivated vaccine, swine Bordetella inactivated vaccine, and swine haemophilus (actinobacillus) inactivated vaccine.
[0035]
The dosage form when the immunostimulating / infection-preventing agent according to the present invention is administered to humans, animals and the like is not particularly limited, and may be injections, granules, powders, tablets and the like.
[0036]
When formulating the present invention, various additives depending on the dosage form can be blended. For example, in the case of preparation in a solid or powder form, an excipient, a colorant, a lubricant, a binder, a coating agent and the like can be blended.
[0037]
When a hardly soluble substance is used as an injection, a solubilizing agent such as a surfactant is often used. Also in the present invention, surfactants such as polyoxyethylene hydrogenated castor oil are used, but these substances have been found to unexpectedly increase the immunostimulatory / infection protective action of riboflavin and / or riboflavin derivatives. It is added and does not only have an action as a solubilizing agent.
[0038]
For the specific purpose of preventing individual diseases by adding an immunostimulatory / infective protective agent containing riboflavin and / or riboflavin derivatives in the present invention or further containing proline and / or glutamine to foods It can be used as a food having a biological regulation function, a so-called functional food.
[0039]
Furthermore, there is no effect of resistant bacteria found in antibiotics, and there is no problem of residuals, so feeds that are safe and have defense control functions, that is, functional feeds such as pigs, chickens, cows, horses, sheep and other livestock and fish It can also be used for pets (dogs, cats, birds) and the like.
[0040]
When the immunostimulatory / infection preventive agent containing riboflavin and / or riboflavin derivative in the present invention, or the immunostimulatory / infection preventive agent containing riboflavin and / or riboflavin derivative and antibiotic is administered to humans and animals Intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, or oral administration.
[0041]
[Action]
The present inventors have not fully elucidated the in vivo action mechanism in which the riboflavin derivative activates the immune mechanism, but it is recognized that phagocytic cells in white blood cells such as macrophages and neutrophils are activated, It has also been found to increase white blood cell count (particularly neutrophil count).
[0042]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. Description relating to the dose of the substance used in the examples, for example, “10 mg / Kg im” means that 10 mg per kg body weight was injected intramuscularly. Further, “*” and “**” used in the column of x ² test in Tables 1 to 7 represent p <0.05 and p <0.01, respectively.
[0043]
[Example 1]
SLC: 10 ICR male mice (5-6 weeks old, body weight 25-30 g) were injected intramuscularly with riboflavin 10, 30, 100 mg / Kg and physiological saline as a control. Then, 24 hours later, clinically derived E. coli (2.6 × 10 ⁷ CFU / Mouse, 0.2 ml) was subcutaneously inoculated into each mouse, and the survival rate was determined from the number of survivors on the 7th day of infection, and a significant difference from the control was determined. . The results are shown in Table 1.
[0044]
[Table 1]

[0045]
As seen in Table 1, the effect of riboflavin is dose-dependent, and it is clear that riboflavin has an infection-protecting effect. The effect shows a strong protective effect of 50% and 90% of the survival rate after administration of riboflavin 30 mg / Kg and 100 mg / Kg, respectively.
[0046]
[Example 2]
SLC: 10 ICR male mice (5-6 weeks old, body weight 22-30 g), intramuscularly injected with glutamine, proline and riboflavin alone or in combination as shown in Table 2, and control (saline) did. Then, 24 hours later, clinically derived Escherichia coli (2.6 × 10 ⁷ CFU / Mouse, 0.2 ml) was inoculated into each mouse, and the survival rate was determined from the number of survivors on the seventh day of infection.
[0047]
Further, Table 2 shows the results obtained by obtaining significant differences from the controls for glutamine, proline and riboflavin alone or in combination.
[0048]
[Table 2]

[0049]
Further, Table 3 shows the significant difference between the combination of glutamine, proline and riboflavin with respect to the combination of glutamine and proline.
[0050]
[Table 3]

[0051]
As seen in Table 2, the proline 100 mg / Kg administration had a survival rate of 40%, showing a significant difference compared to the control, indicating a protective effect against infection. The survival rates after administration of riboflavin at 30 mg / Kg and 100 mg / Kg were 50% and 90%, respectively, indicating that even when compared with proline, a strong infection-protecting effect was shown in a dose-dependent manner.
[0052]
Further, from Table 2, it was confirmed that by combining glutamine, proline and riboflavin, an effect greater than the additive effect as the sum of the effects obtained independently, that is, a synergistic effect can be obtained.
[0053]
Furthermore, from Table 3, the combination of glutamine, proline and riboflavin shows a very strong infection protection effect with a survival rate of 100%. When this was compared with the effect of the combination of glutamine and proline plus the effect of riboflavin alone, it was clearly confirmed that a significant synergistic effect was obtained.
[0054]
[Example 3]
SLC: 10 ICR male mice (5-6 weeks old, body weight 25-30 g) were injected intramuscularly with sodium riboflavin sodium 10, 30, 100, 300 mg / Kg and physiological saline as a control. Then, 24 hours later, clinically derived E. coli (2.6 × 10 ⁷ CFU / Mouse, 0.2 ml) was subcutaneously inoculated into each mouse, and the survival rate was determined from the number of survivors on the 7th day of infection, and a significant difference from the control was determined. . The results are shown in Table 4.
[0055]
[Table 4]

[0056]
As seen in Table 4, the protective effect is dose dependent at riboflavin sodium phosphate 10, 30, 100, and 300 mg / Kg. In particular, 300 mg / Kg was confirmed to show a very strong infection-protecting effect.
[0057]
[Example 4]
SLC: 10 ICR male mice (5-6 weeks old, body weight 25-30 g), riboflavin sodium phosphate 10 mg / Kg and amoxicillin (AMPC) 0.39 mg / Kg, each alone and in combination, 24 hours before infection Intramuscular injection was performed 30 minutes later. Clinically derived Escherichia coli (2.6 × 10 ⁷ CFU / Mouse, 0.2 ml) was subcutaneously inoculated into each mouse, and the survival rate was determined from the number of survivors on the seventh day of infection. The results are shown in Table 5.
[0058]
[Table 5]

[0059]
As shown in Table 5, it was confirmed that by combining amoxicillin and sodium riboflavin phosphate, an effect greater than the additive effect as the sum of the effects obtained independently, that is, a significant synergistic effect was obtained.
[0060]
[Example 5]
SLC: 10 ICR male mice (age 5-6, body weight 25-30 g), flavin mononucleotide (FMN), riboflavin 100 mg / Kg and polyvinylpyrrolidone (PVP-K30), sodium carboxymethylcellulose (CMC Na), Combinations of purified soybean lecithin, egg yolk lecithin, polyoxyethylene (60) hydrogenated castor oil (HCO-60), polyoxyethylene 20 mol sorbitan monooleate (Tween-80) and control (saline) as shown in Table 6 below Then I made an intramuscular injection. Three days later, clinically derived Escherichia coli (2.6 × 10 ⁷ CFU / Mouse, 0.2 ml) was subcutaneously inoculated into each mouse, and the survival rate was determined from the number of survivors on the seventh day of infection, and a significant difference from the control was determined. It was. The results are shown in Table 6.
[0061]
[Table 6]

[0062]
As seen in Table 6, polyvinylpyrrolidone (PVP-K30), sodium carboxymethylcellulose (CMC Na), polyoxyethylene (60) hydrogenated castor oil (HCO-60), polyoxyethylene 20 mol sorbitan monooleate (Tween-80) It was confirmed that various water-soluble polymers such as purified soy lecithin and egg yolk lecithin enhance and sustain the protective effect of FMN and riboflavin on infection.
[0063]
[Example 6]
As shown in Table 7, riboflavin or phosphoflavin sodium phosphate and egg yolk lecithin alone or in combination, diluted 20-fold with phosphate buffer, and further mixed with a commercial Actinobacillus pleueopneumoniae inactivated vaccine, did. This and a control phosphate buffer solution were intraperitoneally administered to each of 20 male SLC: ICR mice (week 3; body weight 12-15 g) in 0.5 ml each. Fourteen days after the administration, 0.5 ml of Actinobacillus pleueopneumoniae 3 × 10 ⁸ was inoculated intraperitoneally into mice, and the survival rate after 7 days is shown in Table 7. This experiment was conducted according to the vaccine national assay method.
[0064]
[Table 7]

[0065]
As shown in Table 7, by combining riboflavin, sodium riboflavin phosphate and vaccine, an additive effect which is the sum of the infection protection effects used alone, that is, a significant synergistic effect was confirmed. This synergistic effect indicates that the vaccine's protective effect has been increased, that is, the vaccine enhancement effect.
[0066]
[Example 7]
Flavin mononucleotide (FMN) 5 g, D-sorbitol 5 g, disodium phosphate 0.04 g, monosodium phosphate 0.04 g and polyvinylpyrrolidone (PVP-K30) 15 g were dissolved in water for injection to make 100 ml. This solution was dispensed and filled into 5 ml ampules, sterilized by steam, and used as an immunostimulating infection protective agent.
[0067]
[Example 8]
In Example 7, it carried out similarly to Example 7 except using 3g of hydroxypropyl cellulose (HPC) instead of 15g of PVP-K30, and it was set as the immunostimulation infection protective agent.
[0068]
[Example 9]
In Example 7, it replaced with 15g of PVP-K30, and carried out similarly to Example 7 except using 2g of hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), and it was set as the immunostimulation infection protective agent.
[0069]
[Example 10]
In Example 7, it carried out similarly to Example 7 except having used 20 g of sodium chondroitin sulfate instead of 15 g of PVP-K30, and it was set as the immunostimulation infection protective agent.
[0070]
Example 11
After dispersing 10 g of egg yolk lecithin using an ultrasonic emulsifier, 5 g of D-sorbitol, 0.03 g of disodium phosphate, 0.02 g of monosodium phosphate and 3 g of FMN were dissolved in 100 ml of water for injection. . This solution was dispensed and filled into 5 ml ampules, sterilized by steam, and used as an immunostimulating infection protective agent.
[0071]
Example 12
In Example 11, 10 g of partially hydrogenated soybean lecithin was used in place of 10 g of egg yolk lecithin, and FMN was changed to 4 g.
[0072]
Example 13
5 g of microcrystalline riboflavin was suspended in an injection solution containing 5 g of D-sorbitol, 1 g of sodium carboxymethylcellulose (CMC Na), 0.04 g of disodium phosphate and 0.04 g of monosodium phosphate to make 100 ml. This suspension was dispersed using an ultrasonic emulsifier, dispensed and filled into 5 ml ampules, sterilized by steam, and used as an immunostimulating infection protective agent.
[0073]
Example 14
In Example 13, it carried out similarly to Example 13 except using 3 g of HPMC instead of 1 g of CMC Na, and it was set as the immunostimulatory infection protective agent.
[0074]
Example 15
In Example 13, it carried out similarly to Example 13 except using 3 g of polyvinyl alcohol instead of 1 g of CMC Na, and it was set as the immunostimulation infection protective agent.
[0075]
Example 16
After partially dispersing 10 g of partially hydrogenated egg yolk lecithin and 5 g of D-sorbitol using an ultrasonic emulsifier, 0.03 g of disodium phosphate, 0.02 g of monosodium phosphate and 3 g of FMN were dissolved therein. To this solution, 5 g of riboflavin was added and suspended, and further dissolved in water for injection to make 100 ml. This solution was dispensed and filled into 5 ml ampules, sterilized by steam, and used as an immunostimulating infection protective agent.
[0076]
The immunostimulatory infection protective agent of the present invention is prepared by the production methods shown in Examples 7 to 16.
[0077]
【The invention's effect】
From the above test examples, the immunostimulatory / infection-preventing agent and the vaccine preparation have an excellent immune mechanism-stimulating action, and are therefore useful as preventive and therapeutic agents for various diseases, and preventive and therapeutic agents for various infectious diseases.

Claims

Prophylactic or therapeutic agent for infectious diseases containing riboflavin derivatives selected from riboflavin, riboflavin mononucleotide, or flavin adenine dinucleotide and / or their pharmacologically acceptable salts (however, necrotic infection and cattle keratoconjunctivitis) Excluding symptoms).

The preventive or therapeutic agent for infectious diseases according to claim 1, wherein the riboflavin derivative is riboflavin sodium phosphate (except for necrotic infection and cattle keratoconjunctivitis).

The preventive or therapeutic agent for infectious diseases according to claim 1 or 2, further comprising proline and / or glutamine.

The preventive or therapeutic agent for infectious diseases according to claim 1 or 2, further comprising an antibiotic (excluding gentamicin).

The preventive or therapeutic agent for infectious diseases according to claim 1 or 2, further comprising a water-soluble polymer or lecithin.

One or two water-soluble polymers selected from polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, sodium chondroitin sulfate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyvinyl alcohol 6. The preventive or therapeutic agent for infectious diseases according to claim 5, which is the above water-soluble polymer.

The preventive or therapeutic agent for infectious diseases according to claim 5, wherein the lecithin is one or more lecithins selected from egg yolk lecithin, soybean lecithin or hydrogenated lecithin thereof.

The vaccine preparation for infectious diseases according to claim 1 or 2, further comprising a vaccine.

Human leukopenia, autoimmune disease, sepsis or urinary tract infection, swine diarrhea, epidemic pneumonia, atrophic rhinitis or contagious gastroenteritis, chicken pneumonia or Marek's disease, cattle diarrhea, pneumonia or mastitis, The preventive or therapeutic agent for infectious diseases according to claim 1 or 2 against infectious diseases selected from feline leukemia.

A prophylactic or therapeutic agent for sepsis comprising a riboflavin derivative selected from riboflavin, riboflavin mononucleotide, or flavin adenine dinucleotide and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Infectious diseases in animals other than humans, comprising administering riboflavin derivatives selected from riboflavin, riboflavin mononucleotide, or flavin adenine dinucleotide and / or pharmacologically acceptable salts thereof to animals other than humans (provided that How to prevent and treat necrotic infections and cattle keratoconjunctivitis).

12. Excluding humans according to claim 11, which is an infection selected from porcine diarrhea, epidemic pneumonia, atrophic rhinitis or contagious gastroenteritis, chicken pneumonia or Marek's disease, cattle diarrhea, pneumonia or mastitis, feline leukemia Prevention and treatment of animal infections (except for necrotic infections and cattle keratoconjunctivitis).

13. Infectious disease in animals other than humans (excluding necrotic infection and keratoconjunctivitis in cattle) according to claim 11 or 12, comprising administering an antibiotic (except gentamicin) or a vaccine to animals other than humans. ) Prevention and treatment methods.