JP3677288B2 - マクロファージ炎症蛋白質−３、−４および−１▲下γ▼ - Google Patents

Description

この発明は新規に確認したポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、これらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用法、ならびにこれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製法に関する。さらに特定的には、本発明のポリペプチドはヒトのマクロファージ炎症蛋白質−３（ＭＩＰ−３）、マクロファージ炎症蛋白質−４（ＭＩＰ−４）およびマクロファージ炎症蛋白質−１_γである。本発明はこのようなポリペプチドの作用の阻止にも関連する。
マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ類）は、たとえばグラム陰性菌、リポ多糖類およびコンカナバリンＡのような、刺激に反応して、例えばマクロファージおよびリンパ球など、ある種の哺乳類細胞によって生産される蛋白質である。そこで、ＭＩＰ分子は感染症、癌、炎症、造血機能障害、および自己免疫疾患の検出および処置のために診断的および治療的有用性を持つであろう。ネズミＭＩＰ−１は、リポ多糖類で刺激されたネズミマクロファージ腫瘍細胞系ＲＡＷ２６４．７からの主要な分泌蛋白質である。これは精製され、関連蛋白質２種、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βから構成されることが発見された。
いくつかの研究グループがＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのヒト同族体であるらしいものをクローニングしている。これら全ての場合に、ｃＤＮＡは活性化Ｔ細胞ＲＮＡに対して製造したライブラリーから分離された。
マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）はプロ炎症的性質を示すことが証明されている。ＭＩＰ−１αはヒト好酸球および単球に遊走および活性化を誘発し、またマクロファージに化学走化性を誘発できる。これに加え、ネズミＭＩＰ−１αはヒトの造血幹細胞の増殖に抑制的効果を示すが、ネズミＭＩＰ−１βはＭＩＰ−１αの阻止効果を消去できる。最後に、ＭＩＰ−１蛋白質は早期傷害炎症細胞に検出でき、傷害線維芽細胞からのＩＬ−１とＩＬ−６との生産を誘導することが証明されている。
ＭＩＰ−１類はケモカイン族の一部であり炎症または傷害の治癒、免疫抑制に関連する多数の機能を示し、また多数の疾患状態において活発な役割を演じる。さらに、ＭＩＰ−１は造血器官の強化効果を示すことが発見されている。Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０巻：１５８３〜９４頁（１９８９年）およびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．など、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：１１１０〜６頁（１９９０年）。
ＭＩＰ−１の生物活性の定義は広範に研究され、天然ＭＩＰ−１および、極く最近には組換えＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを使用されてきた。精製天然ＭＩＰ−１（ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βポリペプチドを含む）はマウスの足蹠に皮下注射するか、またはウサギの脳脊髄液に脳槽内注射すると（ＷｏｌｐｅとＣｅｒａｍｉ、１９８９年、ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、３巻：２５６５〜７３頁）、急性の炎症を起こす。直接的または間接的でありうるＭＩＰ−１のこれらプロ炎症的性質に加え、無菌傷害房を採用する実験マウスモデルにおける傷害治癒の早期炎症相の間にＭＩＰが回収されている（Ｆａｈｅｙなど、１９９０年、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２巻：９２頁）。例えば、Ｃｈｉｒｏｎ社が出願したＰＣＴ出願・米国９１／０６４８９は、酵母における哺乳類マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ類）のための鋳型として活性なＤＮＡ分子を開示している。
ネズミのＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βは別物だが、近縁のサイトカインである。この蛋白質２種の部分的に精製した混合物は好中球の機能に影響を与え、局所的な炎症と発熱とを起こす。ＭＩＰ−１αの特殊な性質は造血幹細胞増殖の阻止に一致するものとして確認されている。ＭＩＰ−１αは酵母細胞中に発現され、均質まで精製されている。構造的分析ではＭＩＰ−１αは血小板第４因子およびインターロイキン８に非常に類似した第二次および第三次構造を示すが、配列の相同性は限定されたものであることが確認されている。ＭＩＰ−１αは試験管内で幹細胞を阻止する性質を示すことが発見されている。また、ＭＩＰ−１αは後続する試験管内でのトリチオ化チミジンによる殺細胞作用からマウスの幹細胞を生体内で保護することについて活性なことが証明されている。ＭＩＰ−１αが顆粒球のマクロファージコロニー刺激因子に反応して前駆顆粒球マクロファージコロニー形成細胞の増殖を強化することも証明されている。Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｍ．など、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、４巻：７６〜８２頁（１９９２年）。
ＭＩＰ−１αは６〜８ｋｄの、リポ多糖類誘発性の単球、好中球および好酸球の化学走化性蛋白質である。ＭＩＰ−１αはヒトの好酸性顆粒球の遊走および活性化も誘発できる。ＭＩＰ−１αは急性的および慢性的炎症において重要であるかもしれない。肺臓肉芽腫形成の間に起きる同期化マンソン住血吸虫におけるネズミＭＩＰ−１αの逐次的生産、起源、および生体内の寄与が測定されている。Ｌｕｋａｃｓ，Ｎ．Ｗ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：１５５１〜９頁（１９９３年）。
本発明の一側面に従えば、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、ＭＩＰ−１_γ、ならびにそれらの類縁体および誘導体である新規成熟ポリペプチドが提供される。本発明のＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γはヒト起源である。
本発明のさらに別の側面に従えば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。
本発明のなお別の側面に従えば、このようなポリペプチドを組換え技術によって製造する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面に従えば、これらポリペプチド、またはこれらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、例えば、炎症活性、造血およびリンパ球輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を含む免疫制御、骨髄幹細胞コロニー形成の阻止、乾癬、固形癌の処置および耐性慢性感染症に対する宿主防御の強化など、治療目的のために利用する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面に従えば、これらのポリペプチドに対する抗体が提供される。
本発明のさらに別の側面に従えば、例えば動脈硬化症、自己免疫性および慢性炎症および感染性疾患、ヒスタミン介在アレルギー反応、好酸球増加症候群、珪肺症、類肉腫症状、肺臓炎症性疾患、ＩＬ１およびＴＮＦの阻害、再生不良性貧血、および骨髄形成異常症候群などにおける処置において、これらポリペプチドの作用を阻止するために使用しうる、これらポリペプチドに対する拮抗剤／阻害剤が提供される。
本発明のこれらおよびその他の側面はここに教示するものから当業者には明瞭となる筈である。
下記の図面は本発明の態様の例示であって、請求項によって包含される本発明範囲の限定を意味するものではない。
図１はＭＩＰ−３をコードするｃＤＮＡ配列およびそれに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最初のアミノ酸４５個は演繹された推測上のリーダー配列を示す。
図２はＭＩＰ−４をコードするｃＤＮＡ配列およびそれに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最初のアミノ酸１９個は演繹された推測上のリーダー配列を示す。
図３はＭＩＰ−１αの部分に照準を合わせたＭＩＰ−３の演繹されたアミノ酸配列の一部に対応する。上段の配列はヒトのＭＩＰ−３アミノ酸配列であり、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆体）。
図４はアミノ酸配列２個を図示し、上段の配列はヒトＭＩＰ−４アミノ酸配列であり、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆体）。
図５は大腸菌の細菌発現系内での発現後に精製したＭＩＰ−４蛋白質に対応する蛋白質バンドを示す。
図６はＭＩＰ−４のノーザンブロット分析であって、この蛋白質が最も共通に存在する細胞を示す。
図７はｐＱＥ−９ベクターの模式図である。
図８はＭＩＰ−１_γをコードするｃＤＮＡ配列およびそれに対応する演繹されたアミノ酸配列を図示する。最初のアミノ酸２４個は演繹されたリーダー配列を示す。
図９はヒトＭＩＰ−１蛋白質の部分アミノ酸配列２個を図示する。上段の配列はヒトのＭＩＰ−１_γであり、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆体）。
図１０は細菌発現系における発現および精製後のＭＩＰ−１_γ蛋白質に対応するレーン５における蛋白質バンドを示す。
図１１はＭＩＰ−１_γのＣＯＳ発現に対応する蛋白質バンドを示す。
図１２はＭＩＰ−１_γのノーザンブロット分析であって、この蛋白質が最も共通に存在する組織を示す。
本発明の一側面に従えば、図１、２および８の演繹されたアミノ酸配列を持つ成熟ポリペプチドをコードするか、または１９９４年２月９日にＡＴＣＣ寄託番号７５６７６として寄託したクローンのｃＤＮＡがコードする成熟ＭＩＰ−３ポリペプチド、および１９９４年２月９日にＡＴＣＣ寄託番号７５６７５として寄託したクローンのｃＤＮＡがコードする成熟ＭＩＰ−４ポリペプチド、および１９９３年１０月１３日にＡＴＣＣ寄託番号７５５７２として寄託したクローンのｃＤＮＡがコードする成熟ＭＩＰ−１_γポリペプチド、をコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは構造的にはサイトカインまたはケモカイン族内にあるプロ炎症超遺伝子「インタークリン（ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅ）」に関連する。ＭＩＰ−３およびＭＩＰ−４はともにＭＩＰ−１の同族体であって、ＭＩＰ−１βよりもＭＩＰ−１αに相同的である。ＭＩＰ−３をコードするポリヌクレオチドは大動脈内皮のｃＤＮＡライブラリーから誘導されたもので、アミノ酸残基１２１個のポリペプチドをコードするオープン読み枠を含み、これはケモカイン多数に明瞭な相同性を示す。最高の一致はヒトのマクロファージ炎症蛋白質１αへのものであって、３６％の同一性と６６％の類似性とを示す（図３）。
ＭＩＰ−４をコードするポリヌクレオチドは成人肺臓のｃＤＮＡライブラリーから誘導されたもので、アミノ酸残基８９個のポリペプチドをコードするオープン読み枠を含み、これはケモカイン多数に明瞭な相同性を示す。最高の同一性はヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８β蛋白質へのものであって、６０％の同一性と８９％の類似性を示す（図４）。その上、特徴的モチーフとして全ケモカインに存在するシステイン残基４個は両クローンに保存されている。我々の遺伝子では最初のシステイン２個が隣接する位置にあるという事実は、これをケモカインの「Ｃ−Ｃ」またはβ−サブファミリーに分類する。「ＣＸＣ」またはαサブファミリーと呼ばれる別種のサブファミリーでは、最初のシステイン残基２個はアミノ酸１個だけ隔離されている。
ＭＩＰ−１_γをコードするポリヌクレオチドはアミノ酸残基９３個のポリペプチドをコードするオープン読み枠を含み、ヒトのマクロファージおよび霊長類の蛋白質−αにはアミノ酸８０個の長さにわたって４８％の同一性と７２％の類似性とを示す明瞭な相同性を示し、マウスのＭＩＰ−１βにはアミノ酸８２個の領域にわたって４６％の同一性と６７％の類似性とを示す明瞭な相同性を示す。さらに、特徴的モチーフを含むシステイン残基４個が保存されている。
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形でありうる。このＤＮＡは２本鎖または１本鎖でありうるし、およびもし一本鎖ならコード鎖または非コード鎖（アンチセンス）鎖でもありうる。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は図１および図２に示すコード配列または寄託したクローンのものと同一でありうるし、またはそのコード配列が重複性または縮退性の結果として、図１および図２のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする、相異なるコード配列でもありうる。
図１、図２および図８の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは寄託したｃＤＮＡがコードする成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには：成熟ポリペプチドのコード配列のみ、成熟ポリペプチドのコード配列およびたとえばリーダー配列または分泌配列またはプロ蛋白質配列のような付加的コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および、要すれば付加的コード配列）およびたとえばイントロンまたは非コード配列のような非コード配列、成熟ポリペプチド用コード配列の５’および／または３’を包含しうる。
このようにして、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」はそのポリペプチド用コード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的コード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、図１、図２および図８の演繹されたアミノ酸配列を持つポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡがコードするポリペプチドの断片、同族体および誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体にも関連する。このポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然起源対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然起源変異体でもありうる。
このように、本発明は図１、２および８に示すものと同一の成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡがコードする同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに図１、２および８のポリペプチドの断片、誘導体または同族体または寄託したクローンのｃＤＮＡがコードするポリペプチドをコードするこれらポリヌクレオチドの変異体を包含する。そのようなヌクレオチド変異体は欠失、変異、置換変異体および付加または挿入変異体を包含する。
ここに示すように、このポリヌクレオチドは図１、図２および図８に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然起源対立遺伝子変異体であるコード配列を持ちうる。当分野で公知の通り、対立遺伝子変異体はポリヌクレオチド配列の別型であって、ヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能を実質的に変化しない置換、欠失または付加１個またはそれ以上を持ちうる。
本発明はまた、例えば細胞からのポリペプチド輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列など、宿主細胞でのポリペプチドの発現および分泌を援助するポリヌクレオチド配列に成熟ポリペプチド用のコード配列が同一読み枠内で融合しているポリヌクレオチドを包含する。リーダー配列を持つポリペプチドはプレ蛋白質であって、成熟型ポリペプチドを形成するために宿主細胞により切断されるリーダー配列を持ちうる。このポリヌクレオチドはまた成熟蛋白質プラス付加的５’アミノ酸残基であるプロ蛋白質をコードしうる。プロ配列を持つ成熟蛋白質はプロ蛋白質であって、蛋白質の不活性型である。このプロ配列が切断されると活性な成熟蛋白質が生成する。
このようにして、例えば本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白質、またはプロ配列を持つ蛋白質、またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）との両方を持つ蛋白質をコードしうる。
本発明のポリヌクレオチドはまた本発明のポリペプチドの精製のための標識配列に枠内で融合したコード配列を持ちうる。標識配列は細菌宿主の場合に標識に融合した成熟ポリペプチドを生成するためにｐＱＥ−９ベクターが供給するヘキサヒスチジンタグでありうるし、または、例えば標識配列はたとえばＣＯＳ−７細胞など哺乳類宿主を使用する時にはヘマグルチニン（ＨＡ）タグでありうる。ＨＡタグは流行性感冒ヘマグルチニン蛋白質から誘導したエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁（１９８４年））。
本発明はさらにもし前記配列との間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の同一性があれば前記配列にハイブリド化したポリヌクレオチドに関する。本発明は殊に前記ポリヌクレオチドに緊密条件下にハイブリド化するポリヌクレオチドに関する。ここで使用する用語「緊密条件」は両配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性があればハイブリッド化を起こすことを意味する。好適な態様での前記ポリヌクレオチドにハイブリッド化するポリヌクレオチドは図１のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡがコードする成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドをコードする。
ここに参照する寄託物は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って維持することになっている。これらの寄託物は当業者の便宜のためにのみ提供するものであって、米国特許法１１２条の規定が求める寄託であるとの容認ではない。寄託物内に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにこれらがコードするポリペプチドのアミノ酸配列は参考のために引用するものであって、本文記載の配列に何らかの争いが生じた場合に対照とするものである。寄託した材料を製造、使用または販売するためには実施許諾が必要になりうるし、ここではそのような実施許諾を保証するものではない。
本発明はさらに図１、図２および図８の演繹されたアミノ酸配列を持つか、または寄託したｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を持つＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの断片、同族体および誘導体に関する。
図１、図２および図８または寄託したｃＤＮＡを参照する時、用語「断片」、「誘導体」および「同族体」はそれらポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。そこで、同族体はプロ蛋白質部分の切断により活性成熟ポリペプチドを生産して活性化されることのできるプロ蛋白質を包含する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドでありうるが、好ましくは組換えポリペプチドである。
図１、図２および図８のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡがコードするポリペプチドの断片、誘導体または同族体は（ｉ）アミノ酸残基１個またはそれ以上が保存または非保存アミノ酸残基で置換されており（好ましくは保存アミノ酸残基）、そのような置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされていてもいなくてもよいもの、または（ｉｉ）アミノ酸残基１個またはそれ以上が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、たとえばポリペプチドの半減期を増加する化合物（例えばポリエチレングリコールなど）のような他の化合物と融合しているもの、または（ｉｖ）成熟ポリペプチドにリーダー配列または分泌配列または成熟ポリペプチドまたはプロ蛋白質配列の精製に採用する配列のような付加的アミノ酸が融合しているもの、でありうる。そのような断片、誘導体および同族体はここでの教示から当該技術範囲内にあると見做される。
本発明のポリペプチドは好ましくは分離した型で提供され、好ましくは均質になるまで精製される。
用語「分離」はその物質がその起源の環境（たとえば、もし天然起源であれば天然環境）から移動されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然起源ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離されていないが、同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドでも天然システム内で共存する物質のいくつかまたは全てから離されていれば、分離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であることができ、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であることができるが、そのようなベクターまたは組成物は、その天然環境の一部ではないという点で、なお分離されているものである。
本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明のベクターで遺伝子工学的に処理した宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの生産法に関する。
宿主細胞は、例えばクローニングベクターでも発現ベクターでもありうるが、この発明のベクターで遺伝子工学的に処理（形質導入またはまたは形質転換または遺伝子移入）される。このベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどでありうる。遺伝子工学的に処理した宿主細胞はプロモーターの活性化、形質転換体の選択またはＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γ遺伝子の増幅に適当なように修正した通常の栄養培地中で培養できる。たとえば、温度、ｐＨ、その他のような培養条件は以前に発現用に選択した宿主細胞について使用されたものであって、通常の専門家には明白である。
本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によるポリペプチド生産用に採用しうる。そこで、例えばそのポリヌクレオチド配列を発現伝達体多数のどれか一つ、殊にポリペプチドの発現用ベクターまたはプラスミド、に含有させうる。そのようなベクターには染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡ、たとえば天然痘、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスＤＮＡとの結合で誘導されたベクターを包含する。しかしながら、宿主中で複製でき、利用できる限り、いかなる他種プラスミドまたはベクターも使用しうる。
適当なＤＮＡ配列は種々の操作法の一つによってベクター内に挿入されうる。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野で公知の操作法により適当な単数または複数の制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような操作法その他は当技術分野の範囲内にあると見做される。
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指向する適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に結合する。そのようなプロモーターの代表例としては：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核生物、真核生物またはそのウイルス中の遺伝子発現を制御することが公知なその他のプロモーターを指摘しうる。発現ベクターはまた翻訳開始用リボソーム結合部位および転写終結部位も含有する。ベクターはまた発現増幅用に適当な配列も含有しうる。
これに加え、発現ベクターは真核生物にはたとえばジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性のような、また、大腸菌にはたとえばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性のような形質転換体宿主細胞に選択の表現型特性を提供する遺伝子を含むものが好ましい。
前記の適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを採用して適当な宿主を形質転換して宿主に蛋白質を発現させうる。
適当な宿主の代表例としては：たとえば大腸菌、ストレプトマイセス菌、サルモネラ・ティフィリウム菌のような細菌細胞、たとえば酵母のようなカビ細胞、キイロショウジョウバエ属およびＳｆ９のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫のような動物細胞；植物細胞、その他を指摘しうる。適当な宿主の選択はここでの教示を基にすれば当技術範囲内にあると見做される。
さらに具体的には、本発明は広義には前記したような配列１個またはそれ以上を含む組換え構築物も含有する。この構築物は正方向または逆方向に本発明の配列を挿入した、たとえばプラスミドまたはウイルスベクターのような、ベクターを含む。この態様の好適な側面では、この構築物はさらに、例えば該配列に作動可能に結合するプロモーターなど、制御配列を含む。適当なベクターおよびプロモーター多数が当業者に公知であり、商業的に購入できる。下記ベクターを例示する。細菌ではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｕｉａｇｅｎ社）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、真核生物ではｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。しかしながら、その他のいかなるプラスミドまたはベクターもそれらが宿主中で複製可能で利用可能である限り使用しうる。
プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコール転移酵素）ベクターまたはその他の選択マーカーを持つベクターを使用していかなる所望の遺伝子からも選択できる。適当なベクター２個は、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。殊に有名な細菌性プロモーターにはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ即時早期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉを包含する。適当なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当分野の通常熟練の水準内にある。
別の態様では本発明は前記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、たとえば哺乳類細胞のような高等真核生物細胞、または、たとえば酵母細胞のような低級真核生物細胞であることができ、または、宿主細胞はたとえば細菌細胞のような原核生物細胞であることができる。宿主細胞への構築物の導入は燐酸カルシウム遺伝子移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介遺伝子移入または電気穿孔法によって達成することもできる。（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．、「分子生物学における基礎的手法（Ｂａｓｉｃ・Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（１９８６年））。
宿主細胞中の構築物は組換え配列がコードする遺伝子生成物を生産するための通常の方法で使用できる。あるいは、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合成機によって合成的に生産できる。
成熟蛋白質は適当なプロモーターの制御下に哺乳類細胞、酵母、細菌、またはその他の細胞中で発現できる。無細胞翻訳システムを採用して本発明のＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを使用してそのような蛋白質を生産できる。原核生物および真核生物宿主で使用する適当なクローニングベクターおよび発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋなど、「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ社、Ｎ．Ｙ．、（１９８９年）に記載があり、これを参考のためにここに引用する。
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加する。エンハンサーはＤＮＡのシス作用要素であって、通常約１０から３００ｂｐまでで、プロモーターに作用して転写を増加する。この例にはｂｐ１００から２７０の複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
一般に、組み替え発現ベクターは複製開始点および、たとえば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および酵母のＴＲＰ１遺伝子などの宿主細胞の形質転換を許す選択標識、および下流の構造配列転写を指向する高度に発現された遺伝子から誘導したプロモーターを包含するであろう。このようなプロモーターは、殊にたとえば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック蛋白質のような、解糖酵素をコードするオペロンから誘導できる。異種構造配列を適当なフェーズ中で翻訳の開始および終結配列および、好ましくは細胞質周辺空隙または細胞外媒体への翻訳した蛋白質の分泌を指向することのできるリーダー配列と結合する。要すれば、異種配列は、たとえば、発現した組換え生成物の安定化または精製単純化など、所望の性質を与えるＮ−末端認識ペプチドを含む融合蛋白質をコードできる。
細菌での使用に有用な発現ベクターは所期蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列を機能性プロモーターを持つ作動可能な読み枠中の適当な翻訳開始および終結シグナルとともに挿入することによって構築する。ベクターはベクターの維持を確保し、および、もし所望なら、宿主内での増幅を提供するために表現型選択標識１個またはそれ以上および複製開始点を含むであろう。形質転換のために適当な原核生物宿主には大腸菌、枯草菌、サルモネラ・ティフィムリウム、およびシュードモナス、ストレプトマイセスおよびアタフィロコッカス属の様々な菌種を含むが、その他のものも選択の対照としうる。
代表的であるが限定性のない実例として、細菌で使用する有用な発現ベクターは選択マーカーおよびよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子的要素を含み、商業的に購入可能なプラスミドから誘導した細菌の複製開始点を含有できる。この商業的ベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スエーデン）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ・Ｂｉｏｔｅｃ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）などを含む。これらｐＢＲ３２２「バックボーン」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と結合する。適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度までの宿主株の生育後、選択したプロモーターを適当な方法により誘導し（たとえば温度変化または化学的誘導）、細胞を付加的期間培養する。
典型的には細胞を遠心分離によって収穫し、物理的または化学的方法によって破砕し、得られる粗製の抽出物をさらなる精製のために保存する。
蛋白質の発現に採用する微生物細胞は、いずれも当業者によく公知の方法である凍結−解凍の循環、超音波処理、機械的崩壊、または細胞溶解剤の使用を含む便利な方法のいずれかにより崩壊する。
様々な哺乳類細胞培養システムを組換え蛋白質発現のために採用できる。哺乳類発現システムの例にはＧｌｕｚｍａｎがＣｅｌｌ、２３巻：１７５頁（１９８１年）に記載したサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系および適応性あるベクターを発現することができるその他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系などを含む。哺乳類発現ベクターは複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、およびまた必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスのドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’−隣接非転写配列のいずれかをも含むであろう。ＳＶ４０スプライスから誘導されるＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は必要な非転写遺伝子要素を提供するために使用しうる。
ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸性抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む方法により組換え細胞培養物から回収し、精製する。精製の間に存在するカルシウムイオンを低濃度（約０．１５〜５ｍＭ）にすることが好ましい。（Ｐｒｉｃｅなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４４巻：９１７頁（１９６９年））。必要に応じて、成熟蛋白質の立体配置を完成するために蛋白質再折りたたみ段階を使用できる。最後に、最終的な精製段階用に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を採用できる。
本発明のポリペプチドは、天然品精製生産物または化学合成的操作の生産物、または原核生物または真核生物宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞による）から組換え技術により生産したものでありうる。組換え生産操作に採用する宿主に依存して、本発明のポリペプチドは哺乳類またはその他の真核生物炭水化物でグリコシル化、または非グリコシル化されうる。本発明のポリペプチドはイニシャルメチオニンアミノ酸残基を含有しうる。
本発明のポリペプチドは様々な免疫制御および炎症機能、また多数の疾患で使用しうる。ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γはケモカイン族に属し、そのためこれらは白血球（たとえば単球、好中球、Ｔリンパ球、好酸球、好塩基球、など）の化学誘引剤である。従って、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは標的免疫細胞の傷害領域への浸透を制御することによって傷害の治癒を促進するために使用できる。同様な様式で、本発明のポリペプチドは殺微生物白血球の誘引および活性化を通して、たとえばマイコバクテリアなどの慢性感染症に対する宿主の防御を強化できる。
さらに、本発明のポリペプチドは、例えばカポジ肉腫の処置において、腫瘍に注射されたケモカイン発現細胞は腫瘍の縮退を起こす証拠があるので抗腫瘍療法において有用である。また、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは、たとえば細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージなど、宿主防御（殺腫瘍）細胞の侵襲および活性化を刺激するので、この様にして固形癌の処置に使用しうる。
このポリペプチドはまた白血病で骨髄幹細胞のコロニー形成を阻止するため、および腫瘍化学療法の間に造血幹細胞の付随的保護処置としても使用しうる。
本発明のポリペプチドのもう一つの使用は、例えば自己免疫疾患およびリンパ球白血病などでの、ＩＬ−２生合成の阻止を経るＴ細胞増殖の阻止である。
ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは皮内ケラチノサイト増殖を阻止するためにも使用しうるし、皮膚内のランゲルハンス細胞はＭＩＰ−１αを生産することが発見されているので乾癬（ケラチノサイト増殖過剰症）での有用性がある。
ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは破砕物の除去と結合組織促進性炎症細胞の補充との双方を通して、またＴＧＦβ−媒介の過剰線維症制御の可能性により傷害治癒の間の瘢痕予防に使用しうる。これに加え、これらポリペプチドはＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは血管透過性を増強するので、発作、血栓血球症、肺塞栓および骨髄増殖性疾患の処置に有用でありうる。
これらポリペプチドは、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる、生体内におけるこれらポリペプチドの本発明に従った生体内における発現に採用できる。
すなわち、例えば患者からの細胞を生体外でポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を遺伝子工学的に処理し、次に処理した細胞をそのポリペプチドで処理すべき患者に戻す。このような方法は当業者によく公知である。例えば、細胞を当業界で公知の操作法により本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して処理しうる。
同様にして、例えば当業者公知の操作法により、ポリペプチドの生体内発現用に生体内で処理しうる。当業界で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を生産するための生産細胞を患者に投与して、生体内で細胞を処理し、生体内でそのポリペプチドを発現する。かかる方法により本発明のポリペプチドを投与するための前記およびその他の方法は本発明の教示から当業者には明白である。例えば、細胞を工学的に処理するための発現ビヒクルは、例えば適当な送達ビヒクルと結合した後に生体内で細胞を遺伝子工学的に処理するために使用しうるアデノウイルスなど、レトロウイルス以外でありうる。
本発明のポリペプチドは適当な医薬的担体と組合せて使用しうる。このような組成物には治療的有効量の蛋白質、および医薬的に許容しうる担体または添加剤を包含する。このような担体にはこれに限定するものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセリン、およびこれらの組合せを包含する。剤型は投与態様に適合さすべきである。
本発明は本発明の医薬的組成物の成分１個またはそれ以上を充填した容器１個またはそれ以上からなる医薬的パックまたはキットも提供する。このような容器に伴って、医薬的または生物学的生産物の製造、使用または販売を規制する政府機関が規定する形式でヒト投与用製造、使用または販売の機関による承認を反映する注意書も添付する。これに加え、本発明のポリペプチドは他の治療用化合物とともに採用しうる。
この医薬的組成物は、たとえば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路のような常用の様式で投与しうる。被投与者に投与するＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γの用量と投与法とは、たとえば投与様式、処理すべき状態の性質および処方する医師の判断のような因子多数に依存する。一般的に言えば、例えば少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇの治療的有効用量で投与し、および殆どの場合に約ｍｇ／体重ｋｇを超えない日用量、好ましくは投与経路、症状、その他を考慮して用量は約１０μｇ／体重ｋｇからの日用量である。
本発明の配列は染色体同定用にも価値がある。この配列は殊に個人のヒト染色体の特殊な場所を標的とするもので、そこにハイブリド化できる。さらに、最近は染色体特定部位の同定への必要が存在する。染色体部位標識用に実際的な配列データ（反復多型）に基づいて染色体を標識する試薬は現在ではまだ殆ど入手できない。本発明に従う染色体へのＤＮＡ地図作成は疾患に関する遺伝子の配列を関連付ける重要な第一段階である。
略述すれば、ＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）をｃＤＮＡから製造することにより配列を染色体に配置できる。ｃＤＮＡのコンピューター分析を使用して迅速にゲノムＤＮＡ中の増幅過程を複雑化するエクソン１個以上にわたるプライマーでないプライマーを選択する。これらプライマーを使用して次に各ヒト染色体を含む体細胞のハイブリッドをＰＣＲスクリーニングする。プライマーに対応するヒトの遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅した断片を得る。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲ地図作成は特定染色体に特定のＤＮＡを割り当てる迅速な手段である。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用いれば、同様にして特定の染色体または大きなゲノムクローンのプールからの断片集団についてサブローカリゼーションを達成できる。同様に染色体地図作成に使用できる他の地図作成方策は原位置ハイブリド化、標識したフロー選択染色体での前スクリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリッド化による前選択を包含する。
分裂中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの螢光ｉｎ・ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は染色体上の厳密な配置を一段階で提供できる。この技術は５００または６００塩基までの短さのｃＤＮＡで使用できるが、しかしながら、２０００ｂｐ以上のクローンは単一の検出について十分なシグナル強度で独特な染色体位置への結合をする見込みが高い。ＦＩＳＨではＥＳＴが誘導されたクローンの使用を必要とし、長い方がよい。例えば、２０００ｂｐは良いが、４０００ｂｐはさらに良く、時間の合理的百分率で良い結果を得るためには４０００以上は必要ではない。この技術の綜説についてはＶｅｒｍａなど、「ヒト染色体：基礎技術便覧（Ｈｕｍａｎ・Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ・Ｍａｎｕａｌ・ｏｆ・Ｂａｓｉｃ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ（１９８８年）を参照のこと。
ある配列が染色体上の精密な位置に配置されると、その配列の染色体上の物理的な位置を遺伝子地図データと関連付けできる。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、「ヒトでのメンデル的遺伝（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ・Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ・ｉｎ・Ｍａｎ）」（Ｊｏｈｎｓ・Ｈｏｐｋｉｎｓ・Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ・Ｗｅｌｃｈ・Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｌｉｂｒａｒｙから購入可能）に見出される。同じ染色体領域に配置された遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）によって確認される。
次に、患者と非患者との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。もし患者の一部か全部に突然変異が観察されるが、いずれの非患者でも観察されなければ、その突然変異はその疾患の原因であると見込まれる。
物理的地図作成および遺伝子的地図作成技術の最近の解決法によれば、疾患に関連ある染色体領域に精密に配置されたｃＤＮＡは可能性ある原因遺伝子５０個と５００個との間の中の一つである。（これは１メガ塩基の地図作成分析および１遺伝子２０ｋｂと仮定している）。
患者と非患者との比較は一般に、まず、たとえば染色体スプレッドに見られるかまたはｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを使用して検出される欠失または転座のような、染色体中の構造変化を探す。究極的には突然変異の存在を確認し、および突然変異を多形性から識別するためには、数人からの遺伝子を完全に配列決定することが必要である。
本発明はさらにアンチセンス技術の使用によって、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γを生体内で阻害することを指向している。アンチセンス技術はポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいて、三重ラセン形成か、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡか、の方法を通して遺伝子発現を制御するために使用できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするそのポリヌクレオチド配列の５’−コード部分を使用して、長さ約１０から４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子領域に相補的なように設計（三重ラセンについては、Ｌｅｅなど、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、６巻：３０７３頁（１９７９年）；Ｃｏｏｎｅｙなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：４５６頁（１９８８年）；およびＤｅｒｖａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：１３６０頁（１９９１年）を参照のこと）し、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γの転写および生産を予防する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは生体内でｍＲＮＡにハイブリッド化して、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する（アンチセンスについては、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁（１９９１年）；「遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ・ａｓ・Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ・Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ・ｏｆ・Ｇｅｎｅ・Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、ＣＲＣ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｂｏｃａ・Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８年）参照）。
その他に前記オリゴヌクレオチドは、前記の様式でＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γの産生を阻止するため、生体内でアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが発現されうるような当分野の操作法によって細胞まで送達できる。
従って、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γへのアンチセンス構築物をＭＩＰが誘発するか強化するかいずれかの疾患、例えば動脈硬化症、たとえば多発性硬化症およびインシュリン依存性糖尿病などのような自己免疫疾患、および慢性炎症および感染性疾患、ヒスタミン媒介性アレルギー反応、リュウマチ性関節炎、珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症、その他の肺臓の慢性炎症疾患、特発性好酸球過剰症候群、内毒素性ショック、ヒスタミン媒介アレルギー性反応、プロスタグランジン−非依存性発熱、および再生不良性貧血、その他の骨髄不全性疾患など、を処置するために使用できる。
これらポリペプチド、その断片またはその他の誘導体、または同族体、またはこれらを発現する細胞はそれらに対する抗体を生産するための免疫原として使用できる。これら抗体は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができる。本発明はまたキメラ、単一鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ断片またはＦａｂ発現ライブラリー生産物を包含する。そのような抗体と断片との生産のためには当業界で公知の様々な操作法を使用しうる。
本発明の配列に対応するポリペプチドまたはその生体内受容体に対する抗体はそのポリペプチドを直接に動物に注射するかまたは動物、好ましくはヒト以外、に投与することによって生産できる。こうして得た抗体はポリペプチドに結合する。この様式で、そのポリペプチドの断片のみをコードする配列さえ全天然ポリペプチドを結合する抗体を発生させるために使用できる。そのような抗体を次にそのポリペプチドを発現する組織から、そのポリペプチドを分離するために使用できる。
モノクローナル抗体を製造するには、連続的細胞系培養によって抗体を与えるいかなる技術も使用できる。例にはハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒなど、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）、およびヒトのモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅなど、１９８５年、「モノクローナル抗体および癌治療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ・ａｎｄ・Ｃａｎｃｅｒ・Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ａｌａｎ・Ｒ．Ｌｉｓｓ社、中、７７〜９６頁）を包含する。
単鎖抗体の生産法について記載された技術（米国特許４９４６７７８号）は単鎖抗体を生産するようにこの発明の免疫原性ポリペプチド生産物に適応できる。
本発明はまたポリペプチドの機能を阻止または除去する本発明のポリペプチドの拮抗剤／阻害剤をも指向する。
そこで、例えば、拮抗剤は本発明のポリペプチドに結合して、その機能を阻止または除去する。この拮抗剤は、例えばこのポリペプチドまたは、場合によってはオリゴヌクレオチドに結合するポリペプチドに対する抗体であることができよう。阻害剤の例は、ポリペプチドの触媒部位に結合し、占有して基質が触媒部位に接近できなくして正常な生物学的活性を阻止するような低分子である。低分子の例は、これに限定するものではないが、低分子のペプチドまたはペプチド様分子である。
その他に、本発明のポリペプチドに対する拮抗剤には正常には本発明のポリペプチドが結合する受容体に結合するものを採用しうる。この拮抗剤は、天然蛋白質の受容体部位を認識し、結合するが、しかしながら、それらはポリペプチドの不活性型であって受容体部位を占有するので、そこでＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γの活性を阻止するような、極めて近縁な蛋白質でありうる。
これらの方法にる、これら拮抗剤／阻害剤は白血球の誘引および活性化を予防することによって抗炎症薬剤として使用しうる。それらはまた自己免疫性および慢性炎症性および感染性疾患において、マクロファージおよびその前駆体および好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびある種のＴ細胞サブセットの化学走化性および活性化を阻止するために；ＭＩＰ誘発性幹細胞および好塩基球の脱顆粒化を阻止し、そこでヒスタミン媒介アレルギー反応を低下させるために；ＭＩＰが生合成を刺激するＩＬ−１およびＴＮＦが一次的に起こす有害な過程を阻止するために；リュウマチ性関節炎；およびＭＩＰが駆動する主に好中球性炎症からマクロファージが主役の病理へ移行して急性の消散する炎症的防御から慢性の究極的には破壊的な、たとえば自己免疫疾患などの、機構への移行を阻止するために；有用でありうる。
これら拮抗剤／阻害剤はまた珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症およびその他の肺慢性炎症性疾患の処置；ＭＩＰ生産の上昇は好酸球生産および移動を悪化させるので特発性好酸球過剰性症候群の処置；内毒素に反応するＭＩＰ水準上昇に起因する内毒素性ショックの処置；ＭＩＰ誘発性の幹細胞および好塩基球脱顆粒化阻止によるヒスタミン媒介アレルギー反応の処置；ＭＩＰ−１αが誘発するプロスタグランジン非依存性発熱の阻止；および形成不全性貧血およびその他の骨髄不全症例における過剰なＭＩＰ−１αによる抑制効果の予防；にも有用でありうる。
これら抗体はまた病状進行および治療的介入の効果を把握するための予後適用および臨床スクリーニングにも有用であると思われる。常在性マクロファージはＭＩＰｍＲＮＡを全くまたは殆ど生産しないので、これを検出できる診断用抗体は自己免疫疾患および慢性炎症性および感染性病状の有用な指標であると思われる。
この拮抗剤／阻害剤は、たとえば前記のような医薬的担体との組成物中に採用しうる。
本発明をさらに下記実施例に照らして記載する。しかしながら、本発明はこれら実施例に限定されないことを理解すべきである。別段の指摘がない限り、比率または量は重量による。
下記実施例の理解を促進するために頻繁に出現する方法および／または用語をいくつか記載しよう。
「プラスミド」は小文字のｐと、その前におよび／またはそれに続く、大文字および／または数字とで示す。ここで出発プラスミドは商業的に購入可能であるか、公衆が制限なしに入手しうるか、または出版された操作法に従って入手可能なプラスミドから構築することができる。これに加え、前記のものと均等なプラスミドは当業者に公知であり、通常の熟練者には明白となろう。
ＤＮＡの「消化」はＤＮＡ中でのある配列でのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的切断を示す。ここで使用する様々な制限酵素は商業的に購入可能で、それらの反応条件、補助因子およびその他の必要条件は通常の当業者に公知なようにして使用されよう。分析目的のためには、典型的にはプラスミドまたはＤＮＡ断片１μｇを酵素約２単位とともに緩衝液約２０μＬ中で使用する。プラスミド構築のためにＤＮＡ断片を分離する目的のためには、典型的には５から５０μｇのＤＮＡを２０から２５０単位の酵素でさらに大きい容積中で消化する。特定の制限酵素用に適当な緩衝液および基質量は製造社が指定する。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、供給社の指示に従って変動しうる。消化後、反応物を直接にポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して所期の断片を分離する。
切断した断片のサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．など、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを使用して実行する。
「オリゴヌクレオチド」は化学合成されたものでもよい一本鎖ポリデオキシヌクレオチド１個か、相補二本鎖ポリデオキシヌクレオチドかのいずれかを示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５’−ホスフェートを持たないので、キナーゼの存在下でもＡＴＰでホスフェートを付加しなければ、他のオリゴヌクレオチドには結合しない。合成オリゴヌクレオチドは脱燐酸化していない断片に結合する。
「結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）」は二本鎖核酸断片２個の間のホスホジエステル結合形成の過程を示す（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．など、前出、１４６頁）。別段の指摘がない限り、結合は約等モル量の結合すべき両ＤＮＡ断片０．５μｇについてＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）１０単位とともに既知の緩衝液および条件を使用して達成しうる。
別段の指摘がない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．とＶａｎ・ｄｅｒ・Ｅｂ，Ａ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７３年）の方法に記載されているようにして実行した。
実施例１ ＭＩＰ−３の細菌での発現および精製
ＭＩＰ−３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ♯７５６７６、は最初に５’およびプロセッシングされたＭＩＰ−３蛋白質（マイナスシグナルペプチド配列）の配列およびＭＩＰ−３遺伝子の３’へのベクターの配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対応する付加的なヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加した。５’−オリゴヌクレオチドプライマーは配列５’−ＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ−３’を持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロセッシングされた蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸から始まるＭＩＰ−３のコード配列１８ヌクレオチドを包含する。３’−配列である３’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−５’はＸｂａＩ部位とＭＩＰ−３ＤＮＡ挿入物の３’に位置するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター配列とへの相補配列を包含する。これら両制限酵素部位は細菌発現ベクターＰＱＥ−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、９２５９，Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ＰＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化する。増幅した配列をＰＱＥ−９に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列を持つフレーム中に挿入する。図６はこの取合せの図式的表現を示す。次に結合混合物を使用して商標Ｍ１５／ｒｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株を形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ４はｌａｃＩ抑制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含有し、カナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）も与える。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力により認定し、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により確認する。所期の構築物を含むクローンを一夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体培地中で生育させる。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１００から１：２５０の比率で大きな培地に植菌する。細胞を光学的密度６００（Ｏ．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４から０．６までの間になるまで生育させる。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭになるまで添加する。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑制因子を不活化して、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのクリアリングを誘発する。細胞をさらに３から４時間生育させる。次に細胞を遠心分離により収穫する。細胞ペレットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解する。稠明化後、溶解したＭＩＰ−３をこの溶液からニッケルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを包含する蛋白質による強固な結合をさせる条件下にクロマトグラフィーして精製する。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−３（純度９５％）はこのカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離し、再生のため３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍＭ−燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元型）および２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整する。この溶液中で１２時間インキュベーション後、この蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析する。誘導後、１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在はＭＩＰ−３の発現を証明する。
実施例２ ＭＩＰ−４の細菌での発現および精製
ＭＩＰ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ♯７５６７５、はまずプロセッシングされたＭＩＰ−４蛋白質の５’−配列（マイナスシグナルペプチド配列）およびＭＩＰ−４遺伝子の３’へのｐＢＳＫベクター中の配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対応する付加的なヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加した。５’−オリゴヌクレオチドプライマーは配列ＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣを持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロセッシングされた蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸から始まるＭＩＰ−４のコード配列１８ヌクレオチドを包含する；３’−配列ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴはＸｂａＩ部位およびＭＩＰ−４ＤＮＡ挿入物の３’に位置するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター配列への相補配列を包含する。これら両制限酵素部位は細菌の発現ベクターｐＱＥ−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、９２５９，Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ｐＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した。増幅した配列をｐＱＥ−９に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列を持つフレーム中に挿入した。図６はこの取合せの図式的表現を示す。次に結合混合物を使用して商標Ｍ１５／ｒｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はｌａｃＩ抑制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含有し、カナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）も与える。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力により認定し、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により確認した。所期の構築物を含むクローンを一夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体培地中で生育させた。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１００から１：２５０の比率で大きな培地に植菌する。細胞を光学的密度６００（Ｏ．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４から０．６までの間になるまで生育させた。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭになるまで添加した。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑制因子を不活化して、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのクリアリングを誘発する。細胞をさらに３から４時間生育させた。次に細胞を遠心分離によって収穫した。細胞ペレットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解した。稠明化後、溶解したＭＩＰ−４をこの溶液からニッケルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを包含する蛋白質による強固な結合をさせる条件下にクロマトグラフィーして精製した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−４（純度９５％）はこのカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離し、再生の目的で３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍＭ−燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元型）および２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中で１２時間インキュベーション後、この蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析した。誘導後、１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在がＭＩＰ−４の発現を証明した。（図５）。
実施例３ 組換えＭＩＰ−３のＣＯＳ細胞中での発現
プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−３ＨＡの発現は１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−４前駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にクローニングするため、組換え蛋白質の発現はＣＭＶプロモーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマグルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応する。ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したことで、ＨＡエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検出が容易になる。
プラスミド構築の方策を次に記述する：
ＭＩＰ−３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ♯７５６７６はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳＴでのＰＣＲにより構築する。５’−プライマー（５’ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＧＣＴ−３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く開始コドンから出発するＭＩＰ−３のコード配列１８ヌクレオチドとを包含し；３’配列（５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣ−３’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドン、ＨＡタグおよびＭＩＰ−３のコード配列の最後の２０ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を包含する。それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩＰ−３のコード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタグ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ部位を包含する。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片およびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、結合する。結合混合物で大腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７から入手可能）を形質転換して、形質転換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から分離し、制限分析によって正しい断片の存在を調査する。組換えＭＩＰ−３の発現用に、ＤＥＡＥデキストラン法によってこの発現ベクターをＣＯＳ細胞に遺伝子移入する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。ＭＩＰ−３−ＨＡ蛋白質の発現は放射能標識および免疫沈降法により検出する。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８８年））。遺伝子移入２日後に細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間標識する。次に培地を集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁（１９８４年））で溶解する。細胞溶解物および培地の双方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈降した蛋白質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析する。
実施例４ 組換えＭＩＰ−４のＣＯＳ細胞中での発現
プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−４ＨＡの発現は１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−４前駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にクローニングするため、組換え蛋白質の発現はＣＭＶプロモーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマグルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応する。ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したことで、ＨＡエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検出が容易になる。
プラスミド構築の方策を次に記述する：
ＭＩＰ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ♯７５６７５はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳＴでのＰＣＲにより構築する。５’−プライマー（５’ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣ−３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く開始コドンから出発するＭＩＰ−４のコード配列２０ヌクレオチドを包含し；３’配列（５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＢＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧ-ＴＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＣ−３’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドン、ＨＡタグおよびＭＩＰ−４のコード配列の最後の１９ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を包含する。それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩＰ−４のコード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタグ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ部位を包含する。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片およびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、結合する。結合混合物で大腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７から入手可能）を形質転換して、形質転換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から分離し、制限分析によって正しい断片の存在を調査する。組換えＭＩＰ−４の発現用に、この発現ベクターをＤＥＡＥデキストラン法によってＣＯＳ細胞に遺伝子移入する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。ＭＩＰ−４−ＨＡ蛋白質の発現は放射能標識および免疫沈降法により検出する。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８８年））。遺伝子移入２日後に、細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間標識する。次に培地を集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）。（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁（１９８４年））で溶解する。細胞溶解物と培地との双方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈降した蛋白質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析する。
実施例５ ヒト組織中でのＭＩＰ−３の発現パターン
ノーザンブロット分析を実施してヒト組織中でのＭＩＰ−３の発現水準を調査した。細胞の全ＲＮＡ標本はＲＮＡｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルター上で染色する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮＡ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行う。標識したＤＮＡはＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製する（５・Ｐｒｉｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フィルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４および７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放射能標識した全長ＭＩＰ−３遺伝子と一夜６５℃でハイブリド化する。室温で２回と６０℃で２回、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０℃で強化スクリーンに一夜露出する。
実施例６ ヒト組織中でのＭＩＰ−４の発現パターン
ノーザンブロット分析を実施してヒト細胞中でのＭＩＰ−４の発現水準を調査した。細胞の全ＲＮＡ標本はＲＮＡｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルター上で染色した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮＡ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡはＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した。（５・Ｐｒｉｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フィルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４および７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放射能標識した全長ＭＩＰ−４遺伝子と一夜６５℃でハイブリド化した。室温で２回と６０℃で２回、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０℃で強化スクリーンに一夜露出した。図６参照。
実施例７ ＭＩＰ−１ _γ の細菌での発現および精製
ＭＩＰ−１_γをコードするＤＮＡ配列ＰＢＬＳＫＭＩＰ（ＡＴＣＣ♯７５５７２）はまずプロセッシングされたＭＩＰ−１_γ蛋白質（マイナスシグナルペプチド配列）の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対応する付加的ヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは配列ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣを持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロセッシングされた蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸から始まるＭＩＰ−１_γコード配列１５ヌクレオチドを包含する。３’−配列ＧＣＣＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧはＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドンおよびＭＩＰ−１_γコード配列の最後の２０ヌクレオチドを包含する。これら両制限酵素部位は細菌の発現ベクターＰＱＥ−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、９２５９，Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ＰＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩとＸｂａＩとで消化した。増幅した配列をＰＱＥ−９に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＳＢをコードする配列を持つフレーム中に挿入した。図６はこの取合せの図式的表現を示す。次に結合混合物を使用して、商標Ｍ１５／ｒｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はｌａｃＩ抑制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含有し、カナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）も与える。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力により認定されるが、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを分離して、制限分析により確認した。所期の構築物を含むクローンを一夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体培地中で生育させた。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１００から１：２５０比の大きな培地に植菌する。細胞を光学的密度６００（Ｏ．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４から０．６までの間になるまで生育させた。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭになるまで添加した。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑制因子を不活化して、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのクリアリングを誘発する。細胞をさらに３から４時間生育させた。次に細胞を遠心分離によって収穫した。細胞ペレットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解した。稠明化後、溶解したＭＩＰ−１_γをこの溶液からニッケルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを含有する蛋白質による強固な結合をさせる条件下にクロマトグラフィーして精製した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−１_γ（純度９５％）はこのカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離し、再生の目的で３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍＭ−燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元型）および２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中で１２時間インキュベーション後、この蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析した。誘導後、１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在はＭＩＰ−１_γの発現を証明した。（図３）。
実施例８ 組換えＭＩＰ−１ _γ のＣＯＳ細胞中での発現
プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−１_γＨＡの発現は１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を包含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。全ＭＩＰ−１_γ前駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに融合するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にクローニングしたので、組換え蛋白質の発現はＣＭＶプロモーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマグルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁）誘導されたエピトープに対応する。ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したのでＨＡエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検出が容易になる。
プラスミド構築の方策を次に記述する：
ＭＩＰ−１_γをコードするＤＮＡ配列ｐＢＬＳＫＭＩＰ（ＡＴＣＣ♯７５５７２）はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳＴでのＰＣＲにより構築した。５’−プライマー（５’ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣ−３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く開始コドンから始まるＭＩＰ−１_γコード配列２０ヌクレオチドを包含し；３’配列（５’ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧ−５’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドン、ＨＡタグおよびＭＩＰ−１_γコード配列の最後の１９ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を包含する。それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩＰ−１_γコード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタグ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ部位を包含する。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片およびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、結合した。結合混合物で大腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７から入手可能）を形質転換して、形質転換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から分離し、制限分析により正しい断片の存在を調査した。組換えＭＩＰ−１_γの発現用に、この発現ベクターをＣＯＳ細胞にＤＥＡＥデキストラン法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））によって遺伝子移入した。ＭＩＰ−１_γ−ＨＡ蛋白質の発現は放射能標識と免疫沈降法とにより検出した。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８８年））。遺伝子移入２日後に細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間標識した。次に培地を集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）。（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁（１９８４年））で溶解した。細胞溶解物および培地の双方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させた。沈降した蛋白質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
実施例９ ヒト組織中でのＭＩＰ−１ _γ の発現パターン
ノーザンブロット分析を実施してヒト組織中でのＭＩＰ−１_γの発現水準を調査した。細胞全ＲＮＡ標本はＲＮＡｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏｐ・Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で分離した。ヒトの各所定組織から分離した全ＲＮＡ約１０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルター上で染色した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。標識反応はＤＮＡ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡはＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製した（５・Ｐｒｉｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈｏｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フィルターを次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４および７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ｍＬで放射能標識した全長ＭＩＰ−１_γ遺伝子と一夜６５℃でハイブリド化した。室温で２回と６０℃で２回、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィルターを−７０℃で強化スクリーンに一夜露出した。ＭＩＰ−１_γ用のメッセージＲＮＡは脾臓、肺臓、肝臓に豊富であり、また、その他の組織ではそれらより少なかった。（図５）。
前記の教示に照らせば本発明の修正および変化は無数に可能であり、それ故、添付請求項の範囲内にあり、本発明は特定的に記載したものとは異なるようにも実行しうるものである。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：リ等
（ii）発明の名称：マクロファージ炎症蛋白質−３、−４および−１_γ
（iii）配列の数：６
（iv）連絡先：
（Ａ）宛名：カレラ、バーン、ベイン、ギルフィラン、セッチ、スチュアート・アンド・オルステイン
（Ｂ）通り：ベッカー・ファーム・ロード６番
（Ｃ）市：ローズランド
（Ｄ）州：ニュー・ジャージー
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：０７０６８
（ｖ）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：３．４インチディスケット
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ワード・パーフェクト５．１
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）優先権主張出願のデータ：
（Ａ）出願番号：０８／１７３，２０９
（Ｂ）出願日：１９９３年１２月２２日
（vii）優先権主張出願のデータ：
（Ａ）出願番号：０８／２０８，３３９
（Ｂ）出願日：１９９４年３月８日
（viii）弁理士／代理人 情報：
（Ａ）氏名：フェラーロ，グレゴリー・ディー
（Ｂ）登録番号：３６，１３４
（Ｃ）参照／整理番号：３２５８００−１６３
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：２０１−９９４−１７００
（Ｂ）ファックス番号：２０１−９９４−１７４４
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４７４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cＤＮＡ
（xi）配列：配列番号１：

（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２：

（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cＤＮＡ
（xi）配列：配列番号３：

（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号４：

（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２７０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cＤＮＡ
（xi）配列：配列番号５：

（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号６：

Claims (54)

1. （ａ）配列番号４のポリペプチドの少なくとも成熟形をコードする核酸；
   （ｂ）ポリペプチドの少なくとも成熟形をコードする配列番号３のコード配列；
   （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５６７６号中のＭＩＰ−３ ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの少なくとも成熟形をコードする核酸；
   （ｄ）ポリペプチドの少なくとも成熟形をコードするＡＴＣＣ寄託番号第７５６７６号中のＭＩＰ−３ ｃＤＮＡのコード配列；および
   （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドにおいては、（i）１のアミノ酸残基が置換され、；（ii）アミノ酸残基の１つは置換基を含み、又は（iii）そのポリペプチドは他の化合物と融合しており；該ポリペプチドは白血球の誘引物質であり、又は骨髄幹細胞コロニー形成を阻害し、又は癌化学療法の間造血幹細胞を保護する核酸；
   よりなる群から選択される核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドの相補性ストランド。
2. 核酸が、白血球の誘引物質であり、又は骨髄幹細胞コロニー形成を阻害し、又は癌化学療法の間造血幹細胞を保護するポリペプチドをコードする請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
3. コードされたポリペプチドが白血球の誘引物質である請求項１又は２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
4. コードされたポリペプチドが単球、好中球、Ｔ−リンパ球、好酸球、又は好塩基球の誘引物質である請求項１又は２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
5. コードされたポリペプチドが骨髄幹細胞コロニー形成を阻害する請求項１又は２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
6. コードされたポリペプチドが癌化学療法の間造血幹細胞を保護する請求項１又は２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
7. 更に異種の核酸を含む請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
8. 該異種の核酸が最初のメチオニンアミノ酸残基をコードする請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
9. 該異種の核酸が異種ポリペプチドをコードする請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
10. 配列番号４のアミノ酸残基＋１〜＋７６をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド。
11. 配列番号３のヌクレオチド１３６〜３６３を含む請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
12. 更に異種の核酸を含む請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
13. 該異種の核酸が最初のメチオニンアミノ酸残基をコードする請求項１２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
14. 該異種の核酸が異種ポリペプチドをコードする請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
15. 請求項１０に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドにおいては、（i）１のアミノ酸残基が置換され、；（ii）アミノ酸残基の１つは置換基を含み、又は（iii）そのポリペプチドは他の化合物と融合しており；該ポリペプチドは白血球の誘引物質であり、又は骨髄幹細胞コロニー形成を阻害し、又は癌化学療法の間造血幹細胞を保護する核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドの相補性ストランド。
16. 核酸が、白血球の誘引物質であり、骨髄幹細胞コロニー形成を阻害し、又は癌化学療法の間造血幹細胞を保護するポリペプチドをコードする請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
17. コードされたポリペプチドが白血球の誘引物質である請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
18. コードされたポリペプチドが単球、好中球、Ｔ−リンパ球、好酸球、又は好塩基球の誘引物質である請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
19. コードされたポリペプチドが骨髄幹細胞コロニー形成を阻害する請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
20. コードされたポリペプチドが癌化学療法の間造血幹細胞を保護する請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
21. 更に異種の核酸を含む請求項１５〜２０のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
22. 該異種の核酸が最初のメチオニンアミノ酸残基をコードする請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
23. 該異種の核酸が異種ポリペプチドをコードする請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
24. ＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１〜２３のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
25. ゲノムＤＮＡである請求項２４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
26. 請求項１〜２５のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
27. 単離されたポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に結合している請求項２６に記載のベクター。
28. 請求項１〜２５のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項２６又は２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
29. 請求項１〜２５のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを製造する方法であって、請求項２８に記載の宿主細胞を培養し、コードされたポリペプチドを回収することを含む方法。
30. 請求項１〜２５のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされ又は請求項２９に記載の方法により得られ得るポリペプチド。
31. （ａ）配列番号４のポリペプチドの成熟形；
    （ｂ）配列番号４の完全長のポリペプチド；
    （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５６７６号中のＭＩＰ−３ ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの成熟形；
    （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５６７６号中のＭＩＰ−３ ｃＤＮＡによりコードされる完全長のポリペプチド；および
    （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドであって、該ポリペプチドにおいては、（i）１のアミノ酸残基が置換され；（ii）アミノ酸残基の１つは置換基を含み、又は（iii）そのポリペプチドは他の化合物と融合しており；該ポリペプチドは白血球の誘引物質であり、又は骨髄幹細胞コロニー形成を阻害し、又は癌化学療法の間造血幹細胞を保護するポリペプチド。
32. ポリペプチドが白血球の誘引物質である請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
33. ポリペプチドが単球、好中球、Ｔ−リンパ球、好酸球、又は好塩基球の誘引物質である請求項３２に記載の単離されたポリペプチド。
34. ポリペプチドが骨髄幹細胞コロニー形成を阻害する請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
35. ポリペプチドが癌化学療法の間造血幹細胞を保護する請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
36. 更に、最初のメチオニンアミノ酸残基を含む請求項３１〜３５のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
37. 更に異種のポリペプチドを含む請求項３１〜３５のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
38. 配列番号４のアミノ酸残基＋１〜＋７６を含む単離されたポリペプチド。
39. 更に、最初のメチオニンアミノ酸残基を含む請求項３８に記載の単離されたポリペプチド。
40. 更に異種のポリペプチドを含む請求項３８に記載の単離されたポリペプチド。
41. （i）１のアミノ酸残基が置換され；（ii）アミノ酸残基の１つは置換基を含み、又は（iii）そのポリペプチドは他の化合物と融合しており；該ポリペプチドは白血球の誘引物質であり、又は骨髄幹細胞コロニー形成を阻害し、又は癌化学療法の間造血幹細胞を保護する、請求項３８に記載のポリペプチド。
42. ポリペプチドが白血球の誘引物質である請求項４１に記載の単離されたポリペプチド。
43. ポリペプチドが単球、好中球、Ｔ−リンパ球、好酸球、又は好塩基球の誘引物質である請求項４２に記載の単離されたポリペプチド。
44. ポリペプチドが骨髄幹細胞コロニー形成を阻害する請求項４１に記載の単離されたポリペプチド。
45. ポリペプチドが癌化学療法の間造血幹細胞を保護する請求項４１に記載の単離されたポリペプチド。
46. 更に、最初のメチオニンアミノ酸残基を含む請求項４１〜４５のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
47. 更に異種のポリペプチドを含む請求項４１〜４５のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
48. （ａ）請求項３０〜４７のいずれかに記載の単離されたポリペプチドを細胞により発現させ；そして
    （ｂ）該単離されたポリペプチドを回収すること
    を含む方法により製造された単離されたポリペプチド。
49. 更にポリエチレングリコールを含む請求項３０〜４８のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
50. グリコシル化されている請求項３０〜４８のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
51. 請求項３０〜４８のいずれかに記載のポリペプチドに特異的な単離された抗体。
52. ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ヒト化、Ｆａｂ断片、又はＦａｂ発現ライブラリーの生成物である請求項５１に記載の単離された抗体。
53. 請求項３０〜５０のいずれかに記載の単離されたポリペプチドに対するアンタゴニストを同定する方法であって、
    （ａ）推定アンタゴニスト及び請求項３０〜５０のいずれかに記載のポリペプチドと受容体を接触させ；そして
    （ｂ）アンタゴニストの結合が該ポリペプチドの結合を防止するかどうかを測定する
    ことを含む方法。
54. 請求項３０〜５０のいずれかに記載のポリペプチドの阻害剤を同定する方法であって、
    （ａ）推定阻害剤と請求項３０〜５０のいずれかに記載のポリペプチドを接触させ；そして
    （ｂ）阻害剤の結合が該ポリペプチドの生物学的活性を阻害するかどうかを測定する
    ことを含む方法。

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