JP3699399B2 - 癌治療への応答を決定する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、各々２０００年１月１２日出願の米国仮特許出願第６０／１７６５１４号および第６０／１７６５１５号の継続であり、その開示は各々出展明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は個体における癌治療への応答を決定または予測する方法に関する。とりわけ本発明は画像解析を用いて老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカーの発現レベルを検出することにより、化学療法および化学防御薬での処置を必要とするヒトにおいて、このような薬物の効果を評価する方法に関する。より具体的には本発明は、化学療法および化学防御薬に曝露する前および後に個体から取り出した組織および細胞サンプルにおいて、老化、アポトーシスまたは末端分化マーカーの量を定量する方法を提供する。
【０００３】
２．発明の背景
癌治療の主たる目標は、無秩序に成長する悪性細胞を選択的に死滅させるかまたは阻害し、その上、正常細胞には有害な影響を及ぼさないことである。伝統的な化学療法薬は、好ましくは正常細胞よりも悪性細胞により強度な親和性を有するか、または高率な代謝活性を基盤とする悪性細胞に少なくとも優先的に影響する、高度な細胞毒性物質である。しかし、これらの物質はしばしば正常細胞を害する。
【０００４】
抗癌剤、モノクローナル抗体、または化学防御薬を使用する場合、成長停止、末端分化および癌細胞または前癌細胞の細胞死が意図される（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１：３３９−４４（１９９０）；Ｈａｎｃｏｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４５７５−８０（１９９１）；Ａｒｔｅａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３７５８−６５（１９９４）；Ｐｉｅｔｒａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ９：１８２９−３８（１９９４）；Ｂａｃｕｓら、Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．１９：３１６−２８（１９９７）；Ｂａｃｕｓら、Ｂｒｅａｓｔ Ｊ．（１９９９）；Ｂａｓｅｌｇａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＡＡＣＲ ＮＣＩ ＥＯＲＴＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ９８（１９９９）；Ｃｏｂｌｅｉｇｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２６３９−４８（１９９９）；ＤｉＧｉｏｖａｎｎａ、ＰＰＯ Ｕｐｄａｔｅｓ：Ｐｒｉｎｃ．Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｎｃｏｌ．１３：１−９（１９９９）；Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２５−２９（１９９９）；Ｓｈａｋ、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：７１−７７（１９９９）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６０−７０（１９９９）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：２３１−３８（２０００））。薬物誘起による成長停止または細胞死は、しばしば、プログラム細胞死または末端分化（有糸核分裂細胞死とは対照的である）に付随する形態学的および生化学的変化により特徴づけられる。
【０００５】
化学療法薬は、細胞死を招くのに十分な高量で投与できるが、このような用量は概して腫瘍細胞のみならず正常細胞に有害な影響を及ぼす。分化物質、および低用量の化学療法の薬剤および作用薬は、しばしば細胞死よりむしろ成長停止につながる；このような停止は続いてアポトーシスおよびセル死に至るか、またはいったん化学療法薬を中止しても増殖を続けうる。細胞毒性および化学療法薬の投与か、または電離放射線により、一時的な成長停止、すなわちｐ５３およびｐ５３制御サイクリン依存性キナーゼインヒビター（例えばｐ１６、ｐ２７およびｐ１９）または成長インヒビター（例えばＴＧＦ−β、ＩＬ−４、およびＩＬ−６）の機能に大きく依存する状態を誘起することもできる。化学療法薬を除去すると、薬物処置に供した細胞は結局再度分割を再開し、増殖を続けるか、または死ぬ。ある薬物処置した腫瘍細胞では、成長停止の延長が起こり、薬物の中断で細胞分割の再開に失敗する。
【０００６】
正常な細胞では、末端増殖停止により、末端分化または複製老化に至りうる。老化は正常細胞の増殖期間を制限する生理学的過程である。ヒト細胞において慣用される老化のマーカーは、老化付随βガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）の発現である。このタンパク質はインビトロでの老化細胞培養における老化およびインビボでの細胞と相関している。ＤＮＡ損傷薬またはγ線照射で処置することにより、正常細胞の末端増殖停止を迅速に誘起することができ、老化の形態学的特徴およびＳＡ−β−Ｇａｌの誘導を伴う。老化の加速は、発癌の衝撃に対する細胞の保護的応答である可能性がある。正常細胞の別の損傷応答、例えば静止およびアポトーシスに類似して、老化様末端増殖停止はタンパク質、例えば野生型ｐ５３の機能およびｐ２１^ＷＡＦ１、ｐ１６、ｐ１９およびｐ２７のようなタンパク質の上方制御に関係する（ＫｗｏｋおよびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１：１０２０−２４（１９８９）；ＫｗｏｋおよびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４９：７３−７６（１９９１）；Ｋａｓｔａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６３０４−１１（１９９１）；Ｌａｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ３５８：１５−１６（１９９２）；Ｋｕｅｒｂｉｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７４９１−９５（１９９２）；Ｇｕら、Ｎａｔｕｒｅ３６６：７０７−１０（１９９３）；Ｈａｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：１０１８−２１（１９９５）；ＳｈｅｒｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：１１４９−６３（１９９５）；Ｌｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ３７５：１５９−６１（１９９５）；Ｄｉｍｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９３６３−６７（１９９５）；Ｂａｃｕｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１２：２５３５−４７（１９９６）；Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３１−３５（１９９６）；Ｗａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１７：１９２３−３０（１９９８）；Ｃｈａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８：４８０８−１８（１９９９）；Ｈｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２８４７−５２（１９９９）；ＳｉｏｎｏｖおよびＨａｕｐｔ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８：６１４５−５７（１９９９）；Ｗｏｕｔｅｒｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８：６５４０−４５（１９９９））。
【０００７】
腫瘍細胞は老化および末端増殖停止に至る能力を保持しているようである。細胞分化に影響する異なるクラスの薬剤、および抗癌剤による腫瘍細胞の処置は、容易に老化の形態学的、酵素的およびその他の変化を引き起こす（例えばｐ５３、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＳＡ−β−Ｇａｌの上方制御）。この老化様表現型（ＳＬＰ）は、安定した成長停止形態になるだろう細胞を、薬物曝露から回復して増殖を続ける細胞から区別する。このように、老化様末端増殖停止の誘導により、腫瘍細胞における処置の応答の重要な決定が為される。
【０００８】
アポトーシスは一般に種々の生理学的または病理学的刺激に対する活性な自殺応答であると考えられている。最近の研究では、Ｘ線照射およびいくつかの化学療法薬（例えばアルキル化剤およびトポイソメラーゼＩＩインヒビター）などを含む種々のＤＮＡ損傷物質が壊死を引き起こし、またアポトーシスに至る経路を開始することが示されている。これらの物質によりアポトーシスが引き起こされる正確なメカニズムは未だ解っていない。しかしながら、抑制遺伝子ｐ５３の発現がこの過程に関与している（ＫｗｏｋおよびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１：１０２０−２４（１９８９）；ＫｗｏｋおよびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４９：７３−７６（１９９１）；Ｌａｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ３５８：１５−１６（１９９２）；Ｋｕｅｒｂｉｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７４９１−９５（１９９２）；Ｌｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ３７５：１５９−６１（１９９５）；Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３１−３５（１９９６）；ＭｅｌｌｉｎｇｈｏｆｆおよびＳａｗｙｅｒｓ、ＰＰＯ Ｕｐｄａｔｅｓ１４：１−１１（２０００））。加えて、カスパーゼ（例えばカスパーゼ９またはカスパーゼ３）またはそのシャペロン分子（例えば熱ショックタンパク質６０）の上方制御がアポトーシスに付随している。
【０００９】
アポトーシスを起こしている細胞では、ＤＮＡ損傷刺激が細胞内ｐ５３タンパク質レベルの上昇につながりうる。野生型ｐ５３のレベル上昇は順次、細胞サイクルをＧ_１で阻害し、従って損傷細胞がＤＮＡ修復されることが可能になる。しかし、もし損傷細胞にＤＮＡ修復が起こらなければ、ｐ５３がプログラム細胞死の引き金となり得る。プログラム細胞死の引き金を引く能力が、化学療法薬への曝露に続く腫瘍細胞死の誘導に寄与する。
【００１０】
ｐ５３のレベル上昇はまた、ＭＤＭ−２オンコジーン、Ｂａｘ、およびＷＡＦ１／ＣＩＰ１遺伝子をはじめとする、野生型ｐ５３結合配列を含有する多くの遺伝子を活性化につながりうる。ＷＡＦ１／ＣＩＰ１遺伝子は、サイクリンＣｄｋ複合体と会合する２１０００のＭ_ｒを有するタンパク質をコードし、これらの複合体と会合するキナーゼ活性を阻害することができる。ＷＡＦ（ｐ２１またはＣＩＰ）阻害の主要な標的は、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２キナーゼ複合体であり、その活性はＧ_０からＳ相の細胞サイクル進行に必要である。ＷＡＦ１／ＣＩＰ１遺伝子は、野生型ｐ５３を有する細胞でＧ_１停止またはアポトーシスの引き金を引くＤＮＡ損傷物質に応答して転写的に活性化されるが、ｐ５３遺伝子が欠失または変異を含んでいる腫瘍細胞では活性化されない。しかしＷＡＦ１／ＣＩＰ１はまた、ｐ５３非依存性メカニズムにより、分化する細胞または細胞サイクル停止でも上方制御されることも示されている。
【００１１】
このように、化学療法および化学防御の薬剤および作用薬の効果を検出するために用いることができる、老化、アポトーシスおよび末端増殖停止の種々の細胞性マーカーがある。これらのマーカーは、インビボで腫瘍細胞に及ぼす抗癌効果に影響する、いずれかの特定の化学療法および化学防御の薬剤および作用薬、またはそれらの組み合わせの、有効または無効を評価することに用いることができる。
【００１２】
伝統的な抗癌方法と対照的に、外科的介入の補助として、およびその後に化学療法薬処置が行われる場合、癌患者の最初の処置であるネオアジュバント（または１次）化学療法は薬物投与からなる。このようなやり方の１つの利点は、原発腫瘍が３ｃｍ以上である場合、このやり方により大部分の患者において保存的外科的方法（例えば乳癌患者における乳房切除とは対照的に）の使用が可能になる。別の利点は、多くの癌では全例の約３分の２で部分的および／または完全な反応が得られることである。大部分の患者が化学療法の２から３サイクルの後に反応するので、最終的には用いる化学療法計画のインビボ有効性をモニター観察することが可能であり、これは化学療法治療に反応しないこれらの癌を適時に同定するのに重要である。適時に非反応性の腫瘍を同定することにより、臨床医が順次、癌患者が不必要な副作用に冒されるのを制限し、別の処置を始めることが可能になる。
【００１３】
特定の癌の処置における化学療法薬の効果は予測できない。この非予測性の観点から、治療を開始する前に１つまたはそれ以上の選択した物質が抗腫瘍薬として活性であるかどうか決定すること、または個々の患者の一連の処置の正確な予知を提供することはできなかった。個々の患者において提示された治療物質（または物質の組み合わせ）の効果を決定できるのが非常に望ましい。時間的および経費的の双方で効率がよく、癌患者の外傷性が最低限である、化学療法プログラムの効果を評価する方法が、技術的に求められている。
【００１４】
（発明の要約）
本発明は個体における癌治療の応答を決定する方法を提供する。本発明は具体的には、老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカーの発現レベルを検出することにより、化学療法および化学防御薬の処置を必要するヒトにおいてこのような物質の効果を評価する方法を提供する。本発明の方法では、化学療法および化学防御薬に曝露する前および後に個体から取り出した組織および細胞サンプルにおいて、１つまたは複数の老化、アポトーシスまたは末端分化マーカーの量を定量する。好ましい実施形態では、該マーカーの量は、患者の腫瘍から得られた免疫組織化学的染色組織または細胞サンプルの画像解析を用いて決定される。
【００１５】
本発明の方法の１つの実施形態では、個体を化学療法および化学防御薬に曝露する前に個体から第１の組織または細胞サンプルを収集し、個体を化学療法および化学防御薬に曝露した後に個体から第２の組織または細胞サンプルを収集し、老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカーに対して指向する検出可能な標識抗体を用いて第１および第２の組織または細胞サンプルを免疫組織化学的に染色し、第１および第２の組織または細胞サンプルにおけるマーカーの量を決定し、化学療法または化学防御薬に曝露した後、老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカーの発現が増加したかどうかを決定することにより、個体における化学療法または化学防御薬に対する応答を決定する。好ましい実施形態では、検出可能な標識はクロマゲンまたはフルオロフォアである。
【００１６】
本発明の具体的な好ましい実施形態は、以下の特定の好ましい実施形態のより詳細な記載および請求の範囲より明らかになろう。
【００１７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の方法は個体における癌治療への応答を決定するのに有用である。具体的には、本発明はこのような処置を必要とする個体を化学療法または化学防御薬で処置する効果の評価方法を提供し、該方法では化学療法または化学防御薬に曝露する前および後に個体から取り出した、免疫組織学的に染色した組織または細胞における老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカーの発現レベルを定量する。好ましい実施形態では、コンピューター使用画像解析システムを用いて発現レベルを定量する。
【００１８】
本発明の１つの実施形態では、個体を化学療法および化学防御薬に曝露する前の個体から第１の組織または細胞サンプルを収集し、個体を化学療法および化学防御薬に曝露した後の個体から第２の組織または細胞サンプルを収集し、第１および第２の組織または細胞サンプルを老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカーに対して指向する検出可能な標識抗体を用いて免疫組織化学的に染色し、第１および第２の組織または細胞サンプルにおける老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する１つまたは複数の生物学的マーカーの発現量を決定し、化学療法または化学防御薬に曝露した後、老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカー（群）の発現が増加したかどうかを決定することにより、個体における化学療法または化学防御薬に対する応答を決定する。
【００１９】
好ましい実施形態では、細胞性老化、アポトーシスおよび末端分化において発現が誘導される、または増加する生物学的マーカーには、非限定例としてはｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＳＡ−β−Ｇａｌなどがあり、一般的および包括的に老化様表現型（ＳＬＰ）として知られている。この老化様表現型（ＳＬＰ）を用いて限定的な増殖能力を有する細胞と、薬物に曝露された後増殖を続ける細胞を区別でき、これは老化様末端増殖停止がヒト癌の処置の応答を決定するのに重要であることを示唆している。
【００２０】
細胞毒性薬物で処理した細胞では、ＳＬＰ誘導および細胞死は併発性および独立性の応答であるようだ。このように、ＳＡ−β−Ｇａｌ^＋細胞およびＳＡ−β−Ｇａｌ⁻細胞は共に、薬物処理中または薬物を中止した後数日中に分裂死する類似の可能性を有する。しかしながら、細胞死の急速な過程が一度完了すると、ＳＬＰを用いて、成長遅延および非クローン形成性細胞を、回復性および増殖性細胞から区別できる。従って化学防御または化学療法薬を用いる処理の全体的な結果を、細胞死（有糸分裂細胞死またはアポトーシス）および老化様末端増殖停止の誘導に寄与する因子の組み合わせにより決定する。
【００２１】
中程度の用量のドキソルビシンに曝露してＳＬＰを誘導する。しかしながら、患者を別の物質、例えばタキソールまたはタキソテールで処置する場合、アポトーシス並びにｐ５３およびｐ２１の上方制御がより顕著になる。オンコジーンレセプターＨＥＲ−２／ｎｅｕのモノクローナル抗体であるハーセプチン（商標）で患者を処置する場合も、同様である。従って、ＳＬＰ誘導は細胞増殖抑制性の分化物質、例えばレチノイドおよびその他の化学防御薬の処置結果の第１決定因子になり得る。加えて、画像解析を用いて、キナーゼインヒビターで処置する前および後に、組織において活性化される経路（例えばリン酸化ＭＡＰキナーゼおよびＡｋｔ）に関与するタンパク質の発現を定量することにより治療応答を調べることができる。
【００２２】
臨床上の癌におけるＳＬＰマーカー例えばβ−Ｇａｌ、ｐ５３、およびｐ２１を分析することにより、異なる治療形態に応答する腫瘍をモニター観察するための重要な診断の手掛かりを提供でき、分析は老化に付随する種々の因子に関する染色を換算することにより行われ、顕微鏡基盤の画像解析により定量できる。
【００２３】
本発明の方法の具体的な実施形態では、推定抗癌剤で処置する前および後に個体から細胞を取り出し、パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定する。次いで細胞サンプルを有機溶媒、例えばアセトン、ホルマリン、またはメタノールと反応させ、細胞に免疫組織学的色素が浸透できるようにする。固定方法は当業者に公知である。
【００２４】
ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６、ｐ２７、またはｐ２１−ＷＡＦ１タンパク質の存在および分布が決定される場合、適当な抗体系、例えばサンドイッチ系を用い、目的のタンパク質に特異的に結合する１次抗体および１次抗体に結合する２次抗体を用いてタンパク質を同定する。次いで適当な色素を用いて抗体系を可視化する（Ｂａｃｕｓら、Ｂｒｅａｓｔ Ｊ．（１９９９））。一般に、これらの標的タンパク質に特異的に結合する抗体およびその他の分子は当業界で公知であり、老化、アポトーシスまたは末端分化の該生物学的マーカーのいずれかに特異的に結合するいずれかの抗体またはその他の分子もしくは分子の集合を用いて本発明の方法を実行することができる。
【００２５】
ｐ５３、ｐ２１およびｐ１６に結合する１次抗体の例としてはモノクローナル抗体Ａｂ−２（Ｏｎｃｏｇｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ）などがある。同様に、ｐ２１タンパク質に結合する抗体の実例にはモノクローナル抗体Ａｂ−１（Ｏｎｃｏｇｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などがある。これらの１次抗体のいずれかと共に用いることができる２次抗体の実例にはウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ペンシルバニア）がある。抗体に曝露した後、酵素複合体、例えばＡＢＣ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，カリフォルニア）を加えて抗体サンドイッチ系を完成し、染色および対比染色をし易くする。画像解析技術を用いて定量を完了する。
【００２６】
本発明の方法の好ましい実施形態および癌治療への応答を定量化するための以前に研究された方法に勝るその利点は図１から３および実施例１から６を参照することにより最もよく理解される。以下の実施例は本発明の具体的な実施形態および種々のその使用を説明する。これらは単に説明目的で提示するものであり、本発明を限定するために示されたものではない。
【００２７】
（実施例１）
β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）染色
細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタールアルデヒド中（または３％ホルムアルデヒド単独中）室温で３から５分間固定し、洗浄し、新鮮な老化付随β−Ｇａｌ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）染色溶液（１ｍｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）、２０ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド；４０ｍＭクエン酸／リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０；５ｍＭフェロシアン化カリウム；５ｍＭフェリシアンカリウム；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中３７℃でインキュベートした。２から４時間後、染色は明確になり、１２から１６時間後には最大染色に到達した。リソソームβ−Ｇａｌを検出するために、ｐＨ４．０でクエン酸／リン酸ナトリウムを用いて染色溶液を調製した（Ｂａｓｅｌｇａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＡＡＣＲ ＮＣＩ ＥＯＲＴＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ９８（１９９９））。
【００２８】
（実施例２）
コンピューター使用画像解析によるタンパク質発現の定量
老化またはアポトーシスに付随するタンパク質の発現を適当な１次抗体（例えばｐ５３にはＡｂ−２、または、ＷＡＦ１、ＨＳＰ６０、またはカスパーゼ３にはＡｂ−１）、２次抗体（例えばウサギ抗マウスＩｇＧ）、および３次ＡＢＣ複合体を用いて画像解析することにより定量する。
【００２９】
適当な条件下、切片をジアミノベニジジン（ＤＡＢ）色素と反応させることにより３次ＡＢＣ複合体を可視化する。第２の工程では、組織を別の光学的増強因子、好ましくはエチルグリーンで対比染色する。得られた調製物は核に局在する（そしてｐ５３、ｐ２１、ｐ１６、ＷＡＦ１、ＨＳＰ６０またはカスパーゼ３タンパク質の発現レベルを示す）、様々な程度の褐色のジアミノベジジン（ＤＡＢ）沈着物を伴なう緑色の核を有する。ペルオキシダーゼおよびエチルグリーンを用いる染色技術を例示するが、その他の染色および光学的増強因子もまた適している（例えば、特異的クロマゲン、例えばファストレッドまたはファストグリーンと結合するアルカリ性ホスファターゼ）。スペクトル研究により、イムノペルオキシダーゼ技術のＤＡＢ沈着物からエチルグリーン染色により良好なスペクトル分離が提供され、２つの異なる波長でフィルターを通すことにより画像の異なる特徴を容易に識別できることが示された。これにより画像が、１つは全ての細胞核が光学的に増強されており（エチルグリーンまたはファストグリーン）、１つはレセプター染色（ＤＡＢ）されているこれらの組織部分のみが光学的に増強されている、２つの別個の画像にデジタル化できる。好ましい実施形態では、画像を６００ナノメーター（赤色）フィルターにより分離して対比染色部分の画像を作り、５００ナノメーター（緑色）フィルターによりＤＡＢ沈着物で染色する組織部分の画像を作ることができる。
【００３０】
さらにこれらの部分を区別するために、画像を可視化する技術者が検討中の部分に境界を設定できる相互の閾値設定技術を用いることができる。境界を設定する場合、光学密度において閾値以下の画像の全部分を排除することにより画像を作製する。第１の画像用に閾値を設定し、第２の画像用に第２の閾値を設定する。
【００３１】
次に画像処理方法は赤色フィルターで検討中の組織のマスク画像を作製することからなる。このマスク画像を保存し、次いで同一画像の緑色フィルター版を用いることにより、発現されたタンパク質定量のための別の画像が得られる。フィルターを組み合わせて用いることにより、組織成分がＤＡＢで染色されている（これは暗色になっている）これらの組織マスクの部分、および緑色の対比染色のみを有する（これは明色になっている）これらの組織成分が光学的に増強される。次いで染色され、マスク内である画像のこれら部分のみを用いて画像解析を行うことができる。
【００３２】
次いで標的タンパク質の量を２つの画像間の差異の統計分析により定量する。また、染色された全組織部分の比率またはパーセンテージを、第２の画像の抗体閾値レベルを超えて染色された部分として容易に算出できる。
【００３３】
赤色および緑色フィルターは本発明の実施に適している。ＳＡ−β−Ｇａｌ用には緑色フィルター（５００ｎｍ）を用いて、赤色エオシンで染色された全細胞質部分を決定し、赤色フィルターを用いて決定された、ＳＡ−β−Ｇａｌ（６００ｎｍ）に関して染色された青色部分と比較する。これを行うことにより対比染色された２つの部分を区別する便利で優れた方法が示される。１つの特定の部分または特徴をもう１つの細胞の特徴よりも光学的に増強するために用いることができる種々の別の染色方法または光学的増強方法およびフィルターリング方法があることは認識されている（例えばファストグリーンおよびエオシン）。本明細書で提供される具体的な実施例は、発現されたｐ５３、ＷＡＦ１タンパク質、およびＳＡ−β−Ｇａｌを含有する細胞核を可視化するための別の同等物を示唆する。
【００３４】
ｐ５３タンパク質またはＷＡＦ１タンパク質を含有する核の可視化に続いて、処置後の患者に由来する組織中のこのような細胞のパーセンテージを未処置組織中のこのような細胞のパーセンテージと比較できる。
【００３５】
これらの比較より、癌に対する推定される治療または化学防御薬の潜在効果を決定できる。具体的には、サンプルの処理部分のｐ５３、ＷＡＦ１、ＳＡ−β−Ｇａｌ、ＨＳＰ６０、またはカスパーゼ３を発現する細胞のパーセンテージがサンプルの未処理部分の細胞のパーセンテージよりも大きい場合、次いで処置に用いられる治療物質が癌の処置に潜在的に有効な物質であると予測される。逆に、サンプルの処理部分および未処理部分の双方でＳＡ−β−Ｇａｌ、ｐ５３、ＷＡＦ１、ＨＳＰ６０またはカスパーゼ３を発現する細胞のパーセンテージが実質的に等しい場合、またはサンプルの処理部分でタンパク質があまり発現されない場合、次いで推定治療薬が癌の処置に有効であるとは予測されない。
【００３６】
米国特許第５２５２４８７号および５２８８４７７号はＤＮＡおよびタンパク質を定量する１つの方法を開示し、これは出展明示により本明細書の一部とする。
【００３７】
（実施例３）
乳癌培養細胞株におけるドキソルビシンに対する応答
乳癌由来のヒト培養細胞株において中程度の用量のドキソルビシンおよびタキソールで処理することにより細胞変化を誘起する。ＭＣＦ７細胞を５０ｎＭドキソルビシンまたはタキソール（例えばＤｏｌｂｅａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：５５７３−７７（１９８３）に記載されるように、フローサイトメトリーにより測定される成長停止および細胞死が誘起される用量）で２から３日間処理し、次いで薬物を中止した後１０から１１日のＳＡ−β−Ｇａｌ発現に関して染色した。サブＧ_１分画およびＳＡ−β−Ｇａｌ^＋表現型の形成におけるこの処理の結果を図１Ａから１Ｂおよび２Ａから２Ｃに示す。タキソール誘起のアポトーシスはフローサイトメトリーヒストグラムの低二倍体ピークにより明白であるが、ドキソルビシン処理（およびモノクローナル抗体ハーセプチン（商標）による処理）により老化に至り、老化の形態学的特徴を有するＳＡ−β−Ｇａｌ^＋細胞に見られるようにＧ_１、Ｇ_２およびＧ_２Ｍで遮断する（図２Ａから２Ｃ並びに表ＩおよびＩＩ）。
【００３８】
（実施例４）
ハーセプチン（商標）による処理後のＳＡ−β−Ｇａｌ発現の定量
凍結腫瘍切片を固定し、次いでＳＡ−β−Ｇａｌ発現に関して染色した。明視野顕微鏡および画像解析を用いてＳＡ−β−Ｇａｌ^＋細胞を定量した。ハーセプチン（商標）のみを投与した患者から組織を入手した。ハーセプチン（商標）治療を開始する前に転移性疾患から第１の穿刺生検材料を入手した。１日に患者は４ｍｇ／ｌｇ．ｖ ハーセプチン（商標）を１０分間投与された。２日目に、患者が２回目のハーセプチン（商標）処理を受けた２４時間後、第２の生検材料を採取した。第３の生検材料は１４日目、患者が３回目のハーセプチン（商標）投与を受けた２４時間後に採取した。ＳＡ−β−Ｇａｌ定量の結果を図３Ａから３Ｃおよび表ＩＩに示す。
【００３９】
（実施例５）
ドキソルビシン処理後のｐ２１ ^ＷＡＦ１ 発現の定量
ＭＣＦ７細胞をドキソルビシンで３日間処理し、次いでｐ５３およびｐ２１^{ＣＩＰ１／ＷＡＦ１}発現に関して染色した。細胞を培養し、染色し、適当な抗体を用いてＳＡ−β−Ｇａｌに関して記載したように分析した。ｐ５３およびｐ２１^{ＣＩＰ１／ＷＡＦ１}定量の結果を表ＩＩＩに示す。
【００４０】
（実施例６）
化学療法後の個体におけるｐ２１ ^ＷＡＦ１ 発現の定量
２０人の乳癌患者からの組織サンプルをネオアジュバント化学療法の前および後の画像解析によりｐ２１発現に関して分析した。Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ（ＩＣＲＦ；オックスフォード大学、英国）により実験を実施した。この分析結果により処置の前および後に収集された組織サンプルにおいて著明な差異が認められる（表ＩＶ）。
【００４１】
前記の開示は本発明の特定の具体的な実施形態を強調しており、それと等価の修飾または変更は添付の請求の範囲に示す本発明の精神および範囲に包含されることが理解されるだろう。
【００４２】
【表１】

【００４３】
【表２】

【００４４】
【表３】

【００４５】
【表４】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａから１Ｂは未処理（Ａ）またはドキソルビシンで処理（Ｂ）し、次いでＳＡ−β−Ｇａｌ活性に関して染色したＭＣＦ７細胞の分析結果を示す。
【図２】 図２Ａから２Ｃは未処理（Ａ）またはドキソルビシンで処理（Ｂ）するか、またはタキソールで処理（Ｃ）したＭＣＦ７細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す。
【図３】 図３Ａから３Ｃはハーセプチン（商標）（オンコジーンタンパク質ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対する抗体）で処置した後、個体から取り出した腫瘍サンプルの分析の結果を図解する。腫瘍組織はヘモトキシンおよびエオシン（Ａ）、ＳＡ−β−Ｇａｌ（ハーセプチン（商標）での処置後２４時間；Ｃ）、またはハーセプチン（商標）で処置後１４日にＳＡ−β−Ｇａｌのいずれかで染色した。

Claims (6)

1. 以下からなる、個体への化学療法または化学防御薬の投与に対する効果の測定方法。
   （ａ）老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカーに対して指向する検出可能な標識抗体を用い、化学療法または化学防御薬に個体を曝露する前に個体から採取した第1の組織または細胞サンプル、および、化学療法または化学防御薬に個体を曝露した後に個体から採取した第２の組織または細胞サンプルを、免疫組織化学的に染色すること；
   （ｂ）工程（ａ）にあるように染色された細胞の光学密度を測定することであって、ここで染色細胞は、色素に吸収される波長を有する光を照射される；
   （ｃ）老化、アポトーシスまたは末端分化に付随する生物学的マーカーの発現が、化学療法または化学防御薬に曝露した後の、増強の有無を測定すること。
2. 検出可能な標識がクロマゲンまたはフルオラフォアである、請求項１に記載の方法。
3. 生物学的マーカーがｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、ＴＧＦ−β、またはＳＡ−β−Ｇａｌである、請求項２に記載の方法。
4. 生物学的マーカータンパク質の量がＥＬＩＳＡアッセイにより決定される、請求項１に記載の方法。
5. 染色細胞の光学密度が画像解析により実施される、請求項１に記載の方法。
6. 染色された生物学的サンプルの光学密度からなるシグナルを、異なる吸収および透過特性を有する光学フィルターを用いて加工される複数のシグナルに分離することにより、各シグナルを生物学的サンプルの細胞を染色するために用いられる複数の色素の１つに特異的であるようにして画像解析を実施する、請求項５に記載の方法。

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