JP3836151B2 - Ｒｎａを添加された抗原提示細胞を用いる癌および病原体感染の治療方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、患者の腫瘍形成または病原体感染を治療するまたは予防する方法に関する。
これまでに記載された癌の治療方法には、化学療法、放射線療法および選択的手術が含まれる。数種類の腫瘍抗原の識別は、細胞に基づいた療法の開発をもたらした。これらの方法は、腫瘍抗原（すなわち、非腫瘍細胞に相対して腫瘍細胞において優先的に発現されるポリペプチド）を最初に識別することに頼っている。いくつかのヒト腫瘍抗原が黒色腫患者から単離され、そして識別され且つ特性決定された（Boonおよびvan der Bruggen，1996,J.Exp.Med.183:725-729）。これらポリペプチド抗原は、抗原提示細胞上に添加された後、免疫療法の方式で（すなわち、ワクチンとして）患者に投与することができる。或いは、ポリペプチドを添加された抗原提示細胞を用いて、ex vivoのＣＴＬ増殖を刺激することができる。次に、刺激されたＣＴＬを、養子免疫療法の方式で患者に対して投与する。
ウイルスおよび細菌などの細胞内病原体による感染の治療について様々な方法が記載されてきた。例えば、抗生物質は、細菌感染を治療するのに一般的に用いられる。死滅した病原体の標品もまた、ワクチンとして役立ちうる。更に、ＣＴＬに基づく療法は、このような感染を治療するために記載されてきた。
発明の概要
ここで、患者の腫瘍形成は、その患者に対して、腫瘍に由来するＲＮＡ中でコードされた抗原を添加されている１種類または複数の抗原提示細胞を投与することによって治療できるしまたは予防できるということを発見した。便宜上、ＲＮＡが豊富な腫瘍標品を、精製ＲＮＡの代りに用いることができる。したがって、本発明は、ＲＮＡを精製するまたは腫瘍抗原を単離し且つ識別する必要性を免れる。同様の方法および病原体由来ＲＮＡを用いると、患者の病原体感染を治療できるしまたは予防できる。ＲＮＡ添加抗原提示細胞は、ex vivoまたはin vivoのＣＴＬ増殖を刺激するのに用いることができる。ex vivoで増殖したＣＴＬは、養子免疫療法の方式で患者に対して投与することができる。
したがって、本発明は、ＲＮＡ添加抗原提示細胞（ＡＰＣ）を生産する方法であって、（ｉ）Ｔ細胞増殖を引き起こす細胞表面腫瘍抗原エピトープをコードする腫瘍特異的ＲＮＡを含む腫瘍由来ＲＮＡまたは（ii）Ｔ細胞増殖を引き起こす病原体抗原エピトープをコードする病原体特異的ＲＮＡを含む病原体由来ＲＮＡをin vitroのＡＰＣ中に導入することを含む上記方法を特徴とする。ＲＮＡをＡＰＣ中に導入すること（すなわち、ＲＮＡをＡＰＣに「添加すること」）で、そのＲＮＡはＡＰＣ内で翻訳され、そして得られたタンパク質は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスIIのプロセッシングおよび提示経路によって処理される。ＲＮＡでコードされたペプチドの提示は、その免疫系が、提示されたペプチドに対する応答を開始する一連の現象を開始する。
好ましくは、ＡＰＣは、樹状細胞またはマクロファージなどの専門的なＡＰＣである。例えば、内皮細胞および人工的に作られたＡＰＣを用いることができる。ＡＰＣ上に添加されるＲＮＡは、ＡＰＣに対して精製ＲＮＡとしてまたは腫瘍若しくは病原体の分別された標品として与えることができる。そのＲＮＡには、ポリＡ+ＲＮＡが含まれることができ、これは、慣用法を用いること（例えば、ポリｄＴクロマトグラフィーの使用）によって単離することができる。細胞質ＲＮＡも核ＲＮＡも、本発明において有用である。本発明において更に有用なのは、明らかにされた腫瘍または病原体の抗原またはエピトープをコードしているＲＮＡ、およびＲＮＡ「ミニ遺伝子」（すなわち、明らかにされたエピトープをコードしているＲＮＡ配列）である。所望ならば、腫瘍特異的または病原体特異的ＲＮＡを用いることができるが、このようなＲＮＡは、非腫瘍細胞からのＲＮＡに対する、または関連しているが非病原体の細菌若しくはウイルスに対する差引きハイブリダイゼーションなどの技術上知られている技法を用いて製造することができる。
ＡＰＣ上に添加されるＲＮＡは、細胞から単離することができるし、または慣用的な分子生物学技術を用いることによってそれを製造することができる。例えば、ＲＮＡは、腫瘍細胞から抽出され、ｃＤＮＡ中に逆転写されることができ、これをＰＣＲによって増幅させることができ、そして次に、本発明において用いられるＲＮＡ中にそのｃＤＮＡを転写する。所望ならば、そのｃＤＮＡをＲＮＡ合成の鋳型として用いる前に、プラスミド中にそれをクローン化することができる。in vitroで合成されるＲＮＡは、当然ながら、リボヌクレオチド類似体または誘導体を用いて部分的にまたは完全に合成することができる。このような類似体および誘導体は、当該技術分野において周知であり、そして例えば、ヌクレアーゼ耐性ＲＮＡを製造するのに用いることができる。ＲＮＡ増幅技術の使用は、多量のＲＮＡ抗原を少数の細胞から得ることを可能にする。
本発明の範囲内に包含されるのは、ＲＮＡを凍結組織または固定組織から単離する方法である。腫瘍検体は、一般的に、癌患者から単離された後、例えば、クリオスタットまたはホルマリン固定されたパラフィン包埋組織切片として貯蔵される。癌患者は、しばしば、腫瘍細胞がほとんどないため、固定組織からのＲＮＡの単離は、その方法が僅かな組織試料を用いることができるので、本発明のＡＰＣを生産する場合に特に好都合である。顕微解剖技術は、腫瘍細胞を正常細胞から分離するのに用いることができる。次に、ＲＮＡを腫瘍細胞から単離し、そしてin vitroで増幅させることができる（例えば、ＰＣＲまたは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって）。次に、得られた増幅ＲＮＡを用いて、本明細書中に記載のＲＮＡ添加ＡＰＣを生産することができる。
所望ならば、イムノモジュレーターをコードしているＲＮＡも、腫瘍由来または病原体由来のＲＮＡを添加されたＡＰＣ中に導入することができる。この実施態様において、ＲＮＡにコードされたイムノモジュレーターは、ＡＰＣ中で発現され、そしてＲＮＡ添加ＡＰＣの治療的作用を促進する（例えば、ワクチンとして）。好ましくは、そのイムノモジュレーターは、サイトカインまたは補助刺激因子（costimulatory factor）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２若しくはＩＬ−１５などのインターロイキンまたはＧＭ−ＣＳＦ）である。
ＲＮＡをＡＰＣ中に導入するために、ＡＰＣを、ＤＯＴＡＰまたは１：１（ｗ／ｗ）ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（すなわち、リポフェクチン）などのカチオン脂質の存在下において腫瘍または病原体由来ＲＮＡと接触させることができる。或いは、「裸の」ＲＮＡを細胞中に導入することができる。他の技術上知られているトランスフェクション法を用いてＲＮＡをＡＰＣ中に導入することもできる。
上の方法の変法において、ＡＰＣ中に導入されるＲＮＡは、それが、腫瘍抗原または病原体抗原の他に細胞輸送用シグナル配列をコードするように遺伝子操作されうる。このような遺伝子操作されたＲＮＡは、共有結合していて且つキメラポリペプチドの発現を支配する二つのＲＮＡ配列を含有すると考えられうる。一方のＲＮＡ配列は腫瘍または病原体抗原をコードしているが、もう一方のＲＮＡ配列は細胞輸送用配列をコードしているので、キメラポリペプチドが形成される。輸送用配列に対する結合した抗原を含有するキメラポリペプチドは、ＭＨＣクラスII抗原提示経路に方向付けられる。適当な輸送用配列の例は、下記で与えられる。
本発明の実施は、腫瘍細胞または病原体の抗原を識別する必要がないので、本質的にはいずれの種類の腫瘍または病原体に由来するＲＮＡも有用である。例えば、本発明は、黒色腫、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌および卵巣癌を処置する療法の開発に応用できるが、これらに制限されるわけではない。更に、本発明は、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスまたは風疹ウイルスなどの病原体による感染を治療できるしまたは予防できる。
本発明によって生産された抗原提示細胞は、in vivoおよびex vivoのＣＴＬ応答を引き起こすのに用いることができる。したがって、本発明は、患者の腫瘍形成を治療するまたは予防する方法であって、該患者に対して治療的有効量の腫瘍由来ＲＮＡ添加ＡＰＣを投与することによる上記方法を包含する。腫瘍由来ＲＮＡは、患者から、例えば、ＲＮＡの豊富な腫瘍標品として得ることができる。或いは、このような治療法で用いられる腫瘍由来ＲＮＡは、同じまたは類似した種類の癌に罹患した別の患者から得ることができる。同様に、病原体由来ＲＮＡを添加されたＡＰＣを用いて、患者の病原体感染を治療できるしまたは予防できる。
本発明の範囲内に含まれるのは、細胞障害性Ｔリンパ球を生産する方法である。このようなＣＴＬは、in vitroのＴリンパ球を、腫瘍由来または病原体由来ＲＮＡを添加されている抗原提示細胞と接触させ、そしてＣＴＬ増殖を導く条件下でそのＴリンパ球を維持することによってＣＴＬを生産することにより生産することができる。得られたＣＴＬは、添加されたＲＮＡが由来する病原体または腫瘍細胞に対して著しい特異性を示す。このようなＣＴＬは、慣用的な養子免疫療法の変法において患者に対して投与することができる。所望ならば、ＣＴＬの感作（すなわち、活性化）について検定することができる。この目的には、細胞障害性検定などの技術上知られているいずれの検定も用いることができる。例えば、細胞障害性検定は、１種類または複数のＲＮＡ添加細胞（例えば、ＲＮＡによってコードされた腫瘍抗原エピトープまたは病原体抗原エピトープを細胞表面上で提示する、本明細書中で記載のように生産された線維芽細胞または樹状細胞（すなわち、ＲＮＡ添加細胞））の致死の検出を含むことができる。ＣＴＬ感作を検出するもう一つ適当な方法は、ＣＴＬに接触する前に得られたサイトカイン分泌（例えば、ＴＮＦ−αまたはγ−インターフェロン）のレベルに相対するサイトカイン分泌の増加を検出することによる（例えば、ELISPOT検定などのin situ免疫検定において）。
上の方法の変法において、本発明は、腫瘍特異的（または病原体特異的）ＣＴＬ応答を生じる方法を提供する。大部分の癌患者は、当然、検出不能なまたは不十分な腫瘍特異的ＣＴＬ応答を示すため、この方法は、いずれの患者からも得られた抗原を用いてＣＴＬ応答を生じる方法を提供するので、これは特に有用である。ＣＴＬ応答がいったん生じたら、慣用法を用いて、ＣＴＬ応答を引き起こす抗原を識別することができる。例えば、腫瘍抽出物中の抗原を分別することができ（例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって）、そしてその画分を検定して、本発明によって生産された腫瘍特異的ＣＴＬによって認識される抗原をどの画分が含んでいるか確認することができる。したがって、本発明の方法は、抗原発見の方針として役立つ。その方法は、
（ａ）in vitroの抗原提示細胞中に、少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも９０％または１００％）のポリＡ+ＲＮＡ種を含むポリＡ+ＲＮＡを導入し、それによってＲＮＡ添加ＡＰＣを生産し；そして
（ｂ）Ｔリンパ球を、そのＲＮＡ添加ＡＰＣと接触させ、それによって腫瘍特異的または病原体特異的ＣＴＬ応答を引き起こすことを行う。所望ならば、このようなＣＴＬ応答の誘導は、本明細書中に記載の方法を用いて、接触したＴリンパ球の感作を検出することによって検出できる。この方法を実施する場合、腫瘍由来（または病原体由来）の未分別の全ＲＮＡは、腫瘍抗原（または病原体抗原）をコードするＲＮＡ種を確実に含有しているので、典型的に、全ＲＮＡを用いて、ＲＮＡ添加ＡＰＣを生産するであろう。
本発明は、患者の腫瘍形成を治療するまたは予防する方法であって、該患者に対して治療的有効量の腫瘍由来ＲＮＡ添加ＡＰＣを投与することによる上記方法も包含する。同様に、本発明は、患者の病原体感染を治療する方法であって、該患者に対して治療的有効量の病原体由来ＲＮＡ添加ＡＰＣを投与することによる上記方法を提供する。これら種々の治療方法で用いられるＴリンパ球は、治療される患者から得ることができるしまたはドナーからのハロタイプ適合ＣＴＬを用いることができる。同様に、これらの方法で用いられるＲＮＡは、治療される患者から得ることができるしまたはドナーからのＲＮＡを用いることができる。
「ＲＮＡ添加」または「ＲＮＡパルス」抗原提示細胞とは、ＲＮＡ、例えば、腫瘍または病原体に由来するＲＮＡと一緒にインキュベートされたまたはＲＮＡでトランスフェクションされたＡＰＣ（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）を意味する。このようなＲＮＡは、脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウムトランスフェクションなどの慣用的な核酸トランスフェクション法を用いることによってＡＰＣ上に添加することができる。例えば、ＲＮＡは、ＡＰＣをＲＮＡと一緒に、好ましくは、カチオン脂質の存在下において３７℃で１〜２４時間（例えば、２時間）インキュベートすることによってＡＰＣ中に導入することができる。
「腫瘍由来」ＲＮＡとは、腫瘍細胞にその起原があるＲＮＡの試料を意味し、これには、１種類または複数の腫瘍抗原に対応するＲＮＡが含まれる。包含されるのは、予め識別された腫瘍抗原の全部または一部分をコードするＲＮＡである。同様に、「病原体由来」ＲＮＡは、病原体（例えば、細胞内病原体を含めた細菌またはウイルス）にその起原があるＲＮＡの試料である。このようなＲＮＡは、「in vitro転写される」ことができ、例えば、逆転写されて、ＰＣＲによって増幅されうるｃＤＮＡを生じた後、そのｃＤＮＡのクローン化を伴ってまたは伴うことなくin vitroで転写される。更に含まれるのは、腫瘍細胞または病原体の分別された標品として提供されるＲＮＡである。未分別のＲＮＡ標品（例えば、全ＲＮＡまたは全ポリＡ＋ＲＮＡ）でも用いることができるので、腫瘍または病原体抗原を識別する必要はない。一つの実施態様において、その標品は、タンパク質、脂質および／またはＤＮＡなどの非ＲＮＡ成分の濃度を減少させ且つ標品のＲＮＡを豊富にするために、細胞の１種類または複数の非ＲＮＡ成分に関して分別される。所望ならば、その標品を、「腫瘍特異的」または「病原体特異的」ＲＮＡを生じるように、ＲＮＡに関して（例えば、差引きハイブリダイゼーションによって）更に分別することができる。
「腫瘍特異的」ＲＮＡとは、非腫瘍細胞と比較して優先的に腫瘍細胞中に存在するＲＮＡを、未分別の腫瘍由来ＲＮＡに相対して高含有量で有するＲＮＡ試料を意味する。例えば、腫瘍特異的ＲＮＡには、腫瘍細胞中に存在するが非腫瘍細胞中には存在しないＲＮＡが含まれる。この定義で更に包含されるのは、腫瘍細胞中にも非腫瘍細胞中にも存在するが、非腫瘍細胞中よりも高レベルで腫瘍細胞中に存在するＲＮＡを含むＲＮＡ試料である。この定義の範囲内に更に包含されるのは、以前に同定された腫瘍抗原をコードするＲＮＡであり、これはin vitroで、例えば、プラスミドからまたはＰＣＲによって製造される。或いは、腫瘍特異的ＲＮＡは、腫瘍抗原に対応するＲＮＡの百分率が、未分別の腫瘍由来ＲＮＡに相対して増加するようにＲＮＡ試料を分別することによって製造することができる。例えば、腫瘍特異的ＲＮＡは、非腫瘍細胞からのＲＮＡに対して慣用的な差引きハイブリダイゼーション技術を用いて腫瘍由来ＲＮＡを分別することによって製造することができる。同様に、「病原体特異的」ＲＮＡとは、細菌またはウイルスの非病原体株と比較して優先的に病原体中に存在するＲＮＡを、未分別の病原体由来ＲＮＡに相対して高含有量で有するＲＮＡ試料を意味する。
「輸送用配列」とは、アミノ酸配列が結合しているポリペプチドの細胞内輸送（例えば、オルガネラからオルガネラまたは細胞表面に対して方向付けられた移動）を調節するように機能するそのアミノ酸配列（またはアミノ酸配列をコードしているＲＮＡ）を意味する。
本発明は、いくつかの利点を与える。本発明によって行われるワクチン接種は、未分別のＲＮＡを用いる場合、１種類または複数の正しい抗原が腫瘍または病原体由来ＲＮＡから自動的に選択されるので、特異的な腫瘍拒絶抗原または病原体抗原を識別する必要を免れる。所望ならば、腫瘍特異的ＲＮＡを用いることによって、自己免疫応答を生じる危険を減少させることができる。更に、未分別の腫瘍由来ＲＮＡを添加された細胞を用いるワクチン接種は、いくつかの腫瘍抗原に対する免疫応答を引き起こし、「逸脱（escape）突然変異体」の可能性を減少させると考えられる。本発明は、癌の大部分である特異的腫瘍抗原がまだ識別されていない癌を治療するための活発な免疫療法の使用にも及ぶ。更に、ＡＣＰ中に導入されるＲＮＡは、固定組織試料から得ることができる。腫瘍組織の固定試料は、癌を診断する過程で常套手段によって調製され、したがって、このような試料からのＲＮＡの使用は、患者が追加の侵襲性の方法を受けることを必要としない。大部分の癌患者は腫瘍荷重が低いので、固定腫瘍組織からのＲＮＡの単離および増幅を行う本発明の方法は、特に有効である。本発明は、腫瘍自体が不十分な免疫原性を示すとしても、有効に用いることができる。更に、本発明は、一次腫瘍の除去後でさえも、転移を含めた既存の腫瘍の寸法を減少させるのに有用である。最終的に、本発明は、in vitroで転写されたＲＮＡを添加されている抗原提示細胞が、ペプチド抗原を添加されている抗原提示細胞より強力なワクチンでありうるという利点を与える。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＮＡでパルスされた樹状細胞を用いるin vitroの一次ＯＶＡ特異的ＣＴＬ誘導を示すグラフである。ＤＣは、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ若しくは′ＥＬ４細胞から得られた全ＲＮＡ若しくはポリＡ+ＲＮＡまたはin vitro転写されたＯＶＡ ＲＮＡを用いて、本明細書中で記載のカチオン脂質ＤＯＴＡＰの存在下でパルスされた。ＯＶＡペプチドでパルスされたＤＣは、比較のために用いられた。ＤＣおよびナイーブＴ細胞を、２０：１のＲ／Ｓで５日間インキュベートした。生存しうるリンパ球を採取し、そしてＣＴＬ活性を、常套のユーロピウム放出検定で測定した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡおよびＥＬ４細胞は標的として用いられた。この実験を３回繰返し、同様の結果を得た。
図２は、ＯＶＡ特異的一次ＣＴＬ応答の刺激に関するＥ．Ｇ７−ＯＶＡ ＲＮＡパルスＤＣの感作が、ＲＮＡのポリＡ+部分によって媒介されることを示すグラフである。ＤＣは、全ＲＮＡ、ポリＡ-ＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡでパルスされ、そしてナイーブＴ細胞と一緒に９６ウェルＵ字形底プレート中で５日間培養された。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞からのポリＡ+ＲＮＡ部分を、ＯＶＡ遺伝子のＣＴＬエピトープコード領域に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドで処理した後、ＲＮアーゼＨ処理を行って、ハイブリッド形成したＲＮＡを除去した。ＯＶＡペプチドでパルスされたＤＣは対照として用いられた。ＯＶＡペプチドでパルスされたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ、ＥＬ４およびＲＭＡ細胞は、標的として用いられた。
図３は、ＲＮＡでパルスされたＤＣを用いる１回の免疫感作後のマウスにおけるin vivoの抗腫瘍免疫の誘導を示すヒストグラムである。ＤＣは、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞若しくはＥＬ４細胞からの全ＲＮＡ若しくはポリＡ+ＲＮＡでかまたはin vitro転写されたＯＶＡ ＲＮＡ若しくは対照アンチセンスＯＶＡ ＲＮＡでパルスされた。マウスは、腹腔内注射される２×１０6個のＤＣまたは５×１０6個の照射Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ若しくはＥＬ４細胞で免疫感作された後、２×１０7個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ生細胞を試験投与された。マウスは、腫瘍成長について定期的に調べられ、そして腫瘍直径が３〜４ｃｍに達した時点で屠殺された。マウスは全て、試験投与後３５〜４０日目に屠殺された。
図４は、Ｂ16−Ｆ10.9黒色腫モデルにおいて、ポリＡ+ＲＮＡまたは全ＲＮＡでパルスされたＤＣをワクチン接種されたマウスの自然転移の後退を示すヒストグラムである。マウスに、Ｆ10.9生細胞を足裏内注射によって与え、そして腫瘍直径が５．５〜７．５ｍｍに達した時点で、その脚部を切断した。ワクチン接種を切断後２日目に開始し、そして１週間間隔で更に２回のワクチン接種を続けて行った。マウスは、２×１０6個の全、ポリＡ-若しくはポリＡ+ＲＮＡパルスＤＣ、または照射Ｆ10.9細胞若しくはＦ10.9／Ｋ１細胞、或いはＰＢＳ（対照として）を腹腔内にワクチン接種された。マウスは、非免疫感作群または対照群における転移性死に基づいて屠殺された（切断後２８〜３２日目）。転移性荷重は、肺を秤量することによっておよび転移性結節の数を計数することによって検定された。
詳細な説明
本発明の詳細な実施例を与える前に、本発明のいくつかのパラメーターを一般的に記載する。
本発明で用いることができる腫瘍または病原体由来ＲＮＡを製造するのに、様々な方法が適している。次の実施例が示すように、ＲＮＡがＡＰＣに対して精製された形で与えられる必要はない。好ましくは、ＲＮＡ試料（すなわち、分別された腫瘍標品またはＩＶＴ ＲＮＡ試料）は、少なくとも５０％、更に好ましくは７５％、９０％または９９％ものＲＮＡ（重量／容量）である。本発明を実施する場合、抗原提示細胞、好ましくは、樹状細胞またはマクロファージなどの専門的なＡＰＣを用いる。このような細胞は、前に記載された手順にしたがって単離することができる。
様々な方法のいずれを用いても、ＲＮＡ含有腫瘍標品を製造することができる。例えば、腫瘍標品は、Opti-ＭＥＭなどの哺乳動物細胞培地またはリン酸緩衝溶液などの緩衝液中において腫瘍細胞を音波処理することによって製造することができる。同様に、病原体由来ＲＮＡは、病原性細菌、または病原性ウイルス含有細胞を音波処理することによって製造することができる。細胞を破壊する他の方法も、その方法が腫瘍または病原体由来ＲＮＡを完全に分解しないという条件ならば適している。典型的に、ＲＮＡ標品は、１０6〜１０8個／ｍｌの細胞、最も好ましくは、１０7個／ｍｌの細胞を有する。音波処理に代るものとしてまたはそれに加えて、腫瘍または病原体由来ＲＮＡは、ポリＡ+ＲＮＡを単離するイソチオシアン酸グアニジニウム法および／またはオリゴｄＴクロマトグラフィー法などの慣用的なＲＮＡ精製法を用いることによって製造することができる。慣用法によって合成されたＩＶＴ ＲＮＡは、腫瘍標品中のＲＮＡの代りに用いることができる。例えば、腫瘍または病原体からのＲＮＡは、ｃＤＮＡ中に逆転写されることができ、次に、それを慣用的なＰＣＲ技術によって増幅させて、腫瘍または病原体ＲＮＡ抗原に対応するｃＤＮＡを本質的に無制限に供給する。次に、慣用的なin vitro転写技術および細菌ポリメラーゼを用いて、ＩＶＴ ＲＮＡを製造する。他に、ＩＶＴ ＲＮＡは、腫瘍または病原体ポリペプチド抗原をコードしているクローン化ＤＮＡ配列から合成することができる。このような抗原を識別する方法は、当該技術分野において知られており、例えば、いくつかの黒色腫ペプチド抗原が識別されている。識別されたペプチド抗原をコードしているｃＤＮＡからin vitro転写されたＲＮＡは、本発明において腫瘍または病原体特異的ＲＮＡとして役立ちうる。他に、ＲＮＡは、エピトープをコードする腫瘍抗原ｃＤＮＡの一部分から成る「ミニ遺伝子」から転写されうる。腫瘍または病原体特異的ＲＮＡは、差引きハイブリダイゼーションのための慣用的な技術を用いることによっても製造することができる。例えば、腫瘍細胞および非腫瘍細胞からのＲＮＡ試料を差引きハイブリダイゼーション法で用いて、腫瘍特異的ＲＮＡを得ることができる。
所望ならば、腫瘍由来または病原体由来ＲＮＡは、凍結したまたは固定された組織から製造することができる。必要ではないが、その組織試料は、腫瘍特異的ＲＮＡを豊富にされうる。腫瘍細胞を非腫瘍細胞から分離するのに適している顕微解剖技術が記載されてきた（Zhuangら，1995,Cancer Res.55:467-471;Luqmaniら，1992,Analy,Biochem.200:291-295;Luqmaniら，1994,Analy.Biochem.222:102-109;Turbettら，1996,BioTech.20:846-853）。いったん腫瘍細胞が非腫瘍細胞から分離されたら、技術上知られている技法を用いて、腫瘍由来ＲＮＡをその腫瘍細胞から単離することができる。例えば、腫瘍由来ポリＡ+ＲＮＡは、常磁性ビーズに対して結合したオリゴ（ｄＴ）などの固相に対してＲＮＡをハイブリッド形成させることによって単離することができる（例えば、Raineriら，1991,Nucl.Acids.Res.19:4010を参照されたい）。次に、逆転写によって最初のｃＤＮＡ鎖を合成し、そのＲＮＡを除去し、そして第二鎖を合成する（例えば、ＤＮＡポリメラーゼを用いて）。次に、慣用的なin vitro転写法を用いてＲＮＡを合成することができる。少数の細胞からまたはたとえ１個の細胞からでもＲＮＡを増幅させる他の技術上知られている方法も、本発明において用いることができる。
腫瘍または病原体抗原性エピトープをコードするＲＮＡ分子は、所望ならば、それが細胞輸送用シグナル配列もコードするように遺伝子操作されうる。このようなキメラＲＮＡ分子は、慣用的な分子生物学技術を用いて製造することができる。ＡＰＣ中に導入されるキメラＲＮＡは、キメラポリペプチドをコードしていて、そのキメラポリペプチドをＭＨＣクラスII抗原提示経路中へ向ける輸送用配列に対して結合した抗原を含有する。例えば、本発明のこの実施態様において用いられる輸送用配列は、小胞体（ＥＲ）、リソソームまたはエンドソームに対するポリペプチドの輸送を支配することができ、そしてシグナルペプチド（翻訳の際にタンパク質をＥＲ中へ向けるアミノ末端配列）、ＫＤＥＬ（配列番号：１）などのＥＲ保持ペプチド；およびＫＦＥＲＱ（配列番号：２）、ＱＲＥＫ（配列番号：３）およびＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＬから選択される４個の残基が片側に隣接したＱを有する他のペンタペプチドなどのリソソーム標的ペプチドを含む。本発明において用いることができる好ましいシグナルペプチドは、ＬＡＭＰ−１ソーティングシグナルである（Wuら，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.92:11671-11675;Linら，1996,Cancer Research 56:21-26）。本発明において有用であるシグナルペプチドのもう一つの例は、クラスIIαまたはβなどのＭＨＣサブユニットの場合と実質的に同一のシグナルペプチドであり、例えば、ＭＨＣクラスIIαのシグナルペプチドは、配列ＭＡＩＳＧＶＰＶＬＧＦＦＩＩＡＶＬＭＳＡＱＥＳＷＡ（配列番号：４）中に含まれる。所望ならば、本発明のＲＮＡによってコードされたシグナルペプチドは、特定された２５残基配列の一部分（典型的に、少なくとも１０アミノ酸残基）のみを含むことができるが、但し、その部分は、ＥＲに対するポリペプチドの輸送を引き起こすという条件付きである。
抗原提示細胞中に腫瘍または病原体由来ＲＮＡを導入するのに適しているトランスフェクション法は、当該技術分野において知られている。例えば、５００μｌのOpti-ＭＥＭ中５〜５０μｇのＲＮＡを、１０〜１００μｇの濃度のカチオン脂質と一緒に混合し、そして室温で２０〜３０分間インキュベートすることができる。他の適当な脂質には、リポフェクチン（LIPOFECTIN）TM（１：１（ｗ／ｗ）ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）、リポフェクタミン（LIPOFECTAMINE）TM（３：１（ｗ／ｗ）ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）、ＤＯＤＡＣ：ＤＯＰＥ（１：１）、ＣＨＯＬ：ＤＯＰＥ（１：１）、ＤＭＥＤＡ、ＣＨＯＬ、ＤＤＡＢ、ＤＭＥＤＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＲＩ、ＤＯＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰおよびＤＯＴＭＡが含まれる。次に、得られたＲＮＡ−脂質複合体を、約２ｍｌの全容量中（例えば、Opti-ＭＥＭ中）１〜３×１０6個、好ましくは、２×１０6個の抗原提示細胞に対して加え、そして３７℃で２〜４時間インキュベートする。或いは、そのＲＮＡを、５×１０6個の細胞および５〜５０μｇのＲＮＡを用いるエレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションなどの慣用的な技法を用いることによって抗原提示細胞中に導入することができる。典型的に、５〜２０μｇのポリＡ+ＲＮＡまたは２５〜５０μｇの全ＲＮＡを用いる。
ＲＮＡが腫瘍または病原体標品として与えられる場合、その標品は、典型的に、分別されるかまたは他に処理されて、その標品中のタンパク質、脂質および／またはＤＮＡの濃度を減少させ、そしてその標品のＲＮＡを豊富にする。例えば、技術上知られているＲＮＡ精製法を用いて、腫瘍細胞または病原体から少なくとも部分的にＲＮＡを精製することができる。プロテアーゼまたはＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼを用いてＲＮＡ標品を処理することも許容できる。当然ながら、ＲＮＡは、そのＲＮＡがリボヌクレアーゼに対してあまり感受性でないように、技術上知られているヌクレアーゼ耐性類似体または誘導体を用いて合成することができる。
所望ならば、サイトカインまたは補助刺激因子などのイムノモジュレーターをコードしているＲＮＡを、本発明のＲＮＡ添加ＡＰＣ中に導入することができる。本発明のこの実施態様において、イムノモジュレーターをコードしているＲＮＡは、腫瘍または病原体由来ＲＮＡの導入の前に、と同時に、またはに引続いて、ＡＰＣ中に導入することができる。腫瘍由来または病原体由来ＲＮＡをＡＰＣ中に導入することに関して本明細書中で記載された方法もまた、イムノモジュレーター（例えば、サイトカインまたは補助刺激因子）をコードしているＲＮＡをＡＰＣ中に導入するのに適している。多数のタンパク質をコードしている配列は、当該技術分野において知られているので、本発明において用いることができる。所望ならば、２種類またはそれ以上のイムノモジュレーターをコードしているＲＮＡをＡＰＣ中に導入することができる。典型的に、５〜２０μｇのそれぞれのＲＮＡを、腫瘍および病原体由来ＲＮＡについて上に記載のようにＡＰＣ中に導入する。
本発明のＲＮＡ添加抗原提示細胞は、in vivoまたはex vivoのＣＴＬ増殖を刺激するのに用いることができる。ＣＴＬ応答を刺激するＲＮＡ添加抗原提示細胞の能力は、例えば、慣用的な細胞障害性検定においてＴ細胞活性化を測定するかまたは検出することによって測定することができるしまたは検出することができる。下記で与えられた実施例において、細胞障害性検定は、標的細胞を溶解するエフェクター細胞の能力を検定することを行う。所望ならば、標的細胞は、本発明によって製造されたＲＮＡ添加ＡＰＣ（すなわち、Ｔ細胞増殖を引き起こす、ＲＮＡでコードされた細胞表面腫瘍または病原体抗原エピトープを提示するＡＰＣ）でありうる。下記で記載されるように、一般的に用いられるユーロピウム放出検定は、ＣＴＬ感作を検定するのに用いることができる。典型的に、５〜１０×１０6個の標的細胞を、ジエチレントリアミンペンタ酢酸ユーロピウムで４℃において２０分間標識する。数回洗浄後、１０4個のユーロピウムで標識された標的細胞およびエフェクター細胞の連続希釈を５０：１〜６．２５：１の範囲のエフェクター：標的比率で、９６ウェルプレート中において１０％熱失活ウシ胎児血清を含む２００μｌのＲＰＭＩ 1640中でインキュベートする。それらプレートを５００×ｇで３分間遠心分離し、そして５％ＣＯ2中において３７℃で４時間インキュベートする。上澄みの５０μｌアリコートを集め、そして時間分解蛍光によってユーロピウム放出を測定する（Volgmannら，J.Immunol.Methods 119:45-51,1989）。
ＣＴＬ感作を検出する別の方法では、ＣＴＬによるサイトカイン分泌の増加を、ＣＴＬとＲＮＡ添加ＡＰＣと接触させる前のサイトカイン分泌のレベルに相対して検出する。ELISPOT検定などのin situハイブリダイゼーション検定は、ＴＮＦ−αおよび／またはγ−インターフェロンなどのサイトカインの分泌を検出するのに用いることができる。
実施例
次の実施例は、本発明を詳しく説明するためのものであり、制限するためのものではない。最初に、これら実施例において用いられる方法を記載する。
マウス
７〜８週令で且つ繁殖を退いた雌Ｃ57ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b）を、Jackson Laboratory（バー・ハーバー，ＭＥ）から入手した。
細胞系
Ｃ57ＢＬ／６起原のＢ１６黒色腫のＦ10.9クローンは、極めて転移性で、免疫原性の少ない且つクラスＩ発現性の低い細胞系である。Ｆ10.9／Ｋ１は、クラスＩ分子Ｈ−２ＫbｃＤＮＡでＦ10.9細胞をトランスフェクションすることによって得られた転移性の少ない且つ極めて免疫原性の細胞系である。ＲＭＡおよびＲＭＡ−Ｓ細胞は、Ｃ57ＢＬ／６（Ｈ−２b）起原のラッシャー白血病ウイルスに誘導されたＴ細胞リンパ腫ＲＢＬ−５に由来する。用いられた他の細胞系は、ＥＬ４（Ｃ57ＢＬ／６，Ｈ−２b，胸腺腫）、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ（ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）のｃＤＮＡでトランスフェクションされたＥＬ４細胞）、Ａ20（Ｈ−２dＢ細胞リンパ腫）およびＬ929（Ｈ−２k線維芽細胞）であった。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２５ｍＭヘペス、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足されたＤＭＥＭ中で維持された。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞は、４００μｇ／ｍｌのＧ418（GIBCO，グランド・アイランド，ＮＹ）を補足された培地中で維持され、そしてＦ10.9／Ｋ１細胞は、８００μｇ／ｍｌのＧ418を含有する培地中で維持された。
抗原提示細胞および応答動物Ｔ細胞
ナイーブＣ57ＢＬ／６の繁殖を退いた雌から得られた膵臓細胞を、塩化アンモニウムトリス緩衝液で３７℃において３分間処理して、赤血球を消耗させた。２×１０7個／ｍｌの膵臓細胞（３ｍｌ）を、２ｍｌメトリザマイド勾配カラム（Nycomed Pharma AS，オスロ，ノルウェイ；分析用，１００ｍｌのＰＢＳに対して加えられた１４．５ｇ，ｐＨ７．０）上に置き、そして６００ｇで１０分間遠心分離した。界面からの樹状細胞の豊富な部分を、９０分間の付着によって更に豊富にした。付着性細胞（大部分の樹状細胞（ＤＣ）および僅かな混入マクロファージ（Ｍφ））を静かに掻取ることによって回収し、そして２回目の付着を３７℃で９０分間行って、混入Ｍφを消耗させた。非付着性細胞は膵臓ＤＣとしてプールされ、そしてＦＡＣＳ分析は、約８０％〜８５％のＤＣ（ｍＡｂ ３３Ｄ１）、１〜２％のＭφ（ｍＡｂ Ｆ4/80）、１０％のＴ細胞および＜５％のＢ細胞（データは示されていない）を示した。
そのペレットを再懸濁させ、そして３７℃で各９０分間の２回の付着によってＭφを豊富にした。８０％を越える付着性集団は、ＦＡＣＳ分析により、５％のリンパ球および＜５５％のＤＣと共にＭφと識別された。
Ｂ細胞を、抗Ｉｇ被覆プレート上でパニング（panning）することによって非付着性集団（ＢおよびＴ細胞）から分離した。分離した細胞集団は、ＦＡＣＳ分析によって＞８０％のＴリンパ球を含んで成り、これを応答動物Ｔ細胞として用いた。
全およびポリＡ + 細胞ＲＮＡの単離
全ＲＮＡは、前に記載されたように（ChomczynskiおよびSacchi，1987，Analy.Biochem.162:156-159）、活発に成長する組織培養細胞から単離された。簡単にいうと、１０7個の細胞を、イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＴ）緩衝液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム，２５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０；０．５％サルコシル，２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール）１ｍｌ中で溶解させた。試料を回転させ後、３Ｍ酢酸ナトリウム１００μｌ、水飽和フェノール１ｍｌおよびクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）２００μｌを逐次的に加えた。懸濁液を回転させた後、氷上に１５分間置いた。それら試験管を１００００×ｇで４℃において２０分間遠心分離し、そしてその上澄みを新しい試験管に注意深く移した。等容量のイソプロパノールを加え、そして試料を２０℃で少なくとも１時間置いた。ＲＮＡは、上のような遠心分離によってペレット化された。そのペレットをＧＴ緩衝液３００μｌ中に再懸濁させた後、ミクロ遠心分離管に移した。等容量のイソプロパノールを加え且つその管を−２０℃で少なくとも１時間置くことによって、ＲＮＡを再度沈澱させた。それら管を高速で４℃において２０分間ミクロ遠心分離した。上澄みを傾瀉し、そしてペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。それらペレットを室温で乾燥させた後、ＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。そのＲＮＡ試料を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴおよび５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（Boehringer-Mannheim）中において３７℃で１５分間インキュベートすることにより、可能性のある混入ＤＮＡを除去した。その溶液を、１０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳおよび１ｍｇ／ｍｌプロナーゼ（Pronase）（Boehringer-Mannheim）に調整した後、３７℃で３０分間のインキュベーションを行った。試料をフェノール−クロロホルムで１回およびクロロホルムで１回抽出し、ＲＮＡをイソプロパノール中において−２０℃で再度沈澱させた。遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄した後、自然乾燥させ、そして滅菌水中に再懸濁させた。全ＲＮＡは、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を測定することによって定量された。ＯＤ２６０／２８０比は、典型的に、１．６５〜２．０であった。そのＲＮＡを−７０℃で貯蔵した。
ポリＡ+ＲＮＡは、OLIGOTEXTMポリＡ+精製キット（Qiagen）を用いて全ＲＮＡからかまたは、メッセンジャーＲＮＡ単離キット（Stratagene）を用いて組織培養細胞から直接的に、製造者のプロトコールによって単離された。所望ならば、別の慣用法を用いてポリＡ+ＲＮＡを製造することができる。
in vitro転写されたＲＮＡの製造
コード領域および３′非翻訳領域を含有するｐＵＣ１８（McReynoldsら，1978，Nature 273:723）中のニワトリオボアルブミンｃＤＮＡの１．９ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＧＥＭ４Ｚ（Promega）のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した。センスおよびアンチセンス両方の配向でインサートを含有するクローンを単離し、そしてMaxi Prep Kits TMプラスミド製造キット（Qiagen）を用いて大規模なプラスミドプレプを製造した。プラスミドは、in vitro転写の鋳型として用いるためにＢａｍＨＩで線状化された。転写は、MEGAscript In Vitro Transcription Kit TM（Ambion）を製造者のプロトコールにしたがって用い、そしてＧＴＰ濃度を１．５ｍＭに調整し且つ６ｍＭ ｍ7Ｇ（５1）ｐｐｐ（５1）Ｇキャップ類似体（Ambion）を含んで３７℃で３〜４時間行われた。他の慣用的なin vitro転写法も適している。鋳型ＤＮＡは、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ１で消化され、そしてＲＮＡは、フェノール：クロロホルムおよびクロロホルム抽出に続くイソプロパノール沈澱によって回収された。ＲＮＡをミクロ遠心分離によってペレット化し、そしてそのペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。そのペレットを自然乾燥かせ、そして滅菌水中に再懸濁させた。
ＲＮＡを、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＡＴＰおよび５０００Ｕ／ｍｌの酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（United States Biochemical）中において３０℃で３０間インキュベートした。キャップ付きのポリアデニル化ＲＮＡは、フェノール：クロロホルムおよびクロロホルム抽出に続くイソプロパノール沈澱によって回収された。ＲＮＡをミクロ遠心分離によってペレット化し、そしてそのペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。そのペレットを自然乾燥させ、そして滅菌水中に再懸濁させた。ＲＮＡは、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＯＤを測定することによって定量され、そしてそのＲＮＡを−７０℃で貯蔵した。
ＲＮアーゼＨによるオリゴデオキシヌクレオチドに支配されたＯＶＡ ｍＲＮＡの切断
オボアルブミンｍＲＮＡのＲＮアーゼＨ部位特異的切断に用いられた手順は、前に記載されたもの（Donis-Keller，1979，Nucl.Acid.Res.7:179-192）から適応された。簡単にいうと、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞からの５〜１０μｇのｍＲＮＡを、２０ｍＭヘペス−ＫＯＨ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣＬ2、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび、ＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号：６）をコードするＯＶＡ ｍＲＮＡ中の配列に対してハイブリッド形成する5'-CAG TTT TTC AAA GTT GAT TAT ACT-3'（配列番号：５）かまたは負の対照として役立つ5'-TCA TAT TAG TTG AAA CTT TTT GAC-3'（配列番号：７）（Oligos等）の２μＭのオリゴデオキシヌクレオチド中に懸濁させた。それら試料を５０℃まで３分間加熱した後、３７℃で３０分間のインキュベーションを行った。ＲＮアーゼＨ（Boehringer-Mannheim）を１０Ｕ／ｍｌで加え、そして消化を３７℃で３０分間進行させた。ＲＮＡは、フェノール：クロロホルムおよびクロロホルム抽出に続くイソプロパノール沈澱によって回収された。ＲＮＡをミクロ遠心分離によってペレット化し、そしてそのペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。次に、そのペレットを自然乾燥させ、そして滅菌水中に再懸濁させた。ＯＶＡ ｍＲＮＡの切断は、試験試料および対照試料のオリゴｄＴでプライムされた逆転写に続いて、切断部位に隣接するＯＶＡ特異的プライマーを用いるＰＣＲよって確認された。アクチン特異的プライマーを用いるＰＣＲは、試験試料と対照試料との間を調節するのに用いられた。
ＡＰＣのパルス
ＡＰＣを，Opti-ＭＥＭ培地（GIBCO，グランド・アイランド，ＮＹ）中で２回洗浄した。細胞をOpti-ＭＥＭ培地中に２〜５×１０6個／ｍｌで再懸濁させ、そして１５ｍｌポリプロピレン試験管（Falcon）に加えた。カチオン脂質ＤＯＴＡＰ（Boehringer-Mannheim Biochemicals，インディアナポリス，ＩＮ）を用いて、ＲＮＡを細胞中に供給した（Walkerら，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7915-7918）。ＲＮＡ（Opti-ＭＥＭ培地２５０〜５００μｌ中）およびＤＯＴＡＰ（Opti-ＭＥＭ培地２５０〜５００μｌ中）を、１２×７５ｍｍポリスチレン試験管中において室温（ＲＴ）で２０分間混合した。常套に用いられたＲＮＡ対ＤＯＴＡＰ比は１：２であったが、いくつかの実験では２：１〜１：２に変更された。その複合体を、２ｍｌの全容量のＡＰＣ（細胞２〜５×１０6個）に対して加え、そして水浴中において時々撹拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、そしてin vitroの一次ＣＴＬ誘導の刺激因子として用いた。
ニワトリオボアルブミンＯＶＡ中のＣＴＬエピトープａａ 257-264 ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｈ−２Ｋb）（配列番号：６）をコードしている合成ペプチドを、ペプチドパルス用に用いた。そのペプチドは、保護されていない（遊離）アミノおよびカルボキシル末端を有した（Research Genetics，バーミンガム，ＡＬ）。ペプチドを血清不含ＩＭＤＭ中に溶解させ、そして−２０℃で貯蔵した。
in vitroのＣＴＬ誘導
Ｔ細胞（５×１０6個／ｍｌ）およびＲＮＡまたはペプチドでパルスされたＡＰＣ（２．５×１０5個／ｍｌ）を、９６ウェルＵ字形底プレート中において、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５×１０-5Ｍ β−メルカプトエタノールを含むＩＭＤＭ中で培養して、２０：１のＲ／Ｓ比を与えた。５日後、細胞を、標準的な４時間ユーロピウム放出検定においてエフェクターとして用いた。
細胞障害性検定
これらの検定において、５〜１０×１０6個の標的細胞を、ジエチレントリアミンペンタ酢酸ユーロピウムで４℃において２０分間標識した。数回洗浄後、１０4個のユーロピウムで標識された標的およびエフェクター細胞の連続希釈を、５０：１〜６．２５：１のエフェクター：標的比で、９６ウェルＶ字形底プレート中において１０％熱失活ＦＣＳを含む２００μｌのＲＰＭＩ 1640中でインキュベートした。それらプレートを５００ｇで３分間遠心分離し、そして３７℃および５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。上澄み５０μｌを採取し、そしてユーロピウム放出を時間分解蛍光によって測定した（δフルオロメーター，Wallace Inc.，ゲイサーズバーグ，ＭＤ）。自然放出は２５％未満であった。三重反復試験培養の平均の標準誤差（ＳＥ）は５％未満であった。
免疫療法
Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡモデル：Ｃ57ＢＬ／６マウスを、照射ＲＮＡパルスＡＰＣ（細胞２×１０6個／マウス）または５×１０6個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ若しくはＥＬ４細胞で１回免疫感作した。免疫感作後１０〜１４日目に、マウスの側腹部に皮下注射される２×１０7個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ生細胞を試験投与した。マウスの腫瘍成長および寸法について一定の基準で監視した。腫瘍寸法が＞３．５ｃｍのマウスを屠殺した。生存動物は全て、試験投与後４０日目に屠殺された。
Ｆ10.9−Ｂ16黒色腫モデル：マウスに、足裏内注射によって２×１０5個のＦ10.9細胞を与えた。外科手術後プロトコールは、本質的に前に記載された通りであった（Porgadorら，1995，Cancer Res.55:4941-4949）。足裏の局所腫瘍が直径５．５〜７．５ｍｍになった時点で、それらマウスの脚部を切断した。切断後死亡率は５％未満であった。切断後２日目に、マウスの腹腔内に免疫感作した後、合計３回のワクチン接種のために週１回のワクチン接種を２回行った。マウスは、非免疫感作群または対照群における転移性死に基づいて屠殺された（切断後２８〜３２日目）。転移性荷重は、肺を秤量することによっておよび転移性結節の数を計数することによって検定された。
ニワトリオボアルブミンＲＮＡでトランスフェクションされた樹状細胞を用いるin vitroの一次ＣＴＬ応答の誘導
Ｃ57ＢＬ／６（Ｈ−２Ｋb）マウスに由来するＲＮＡでパルスされた膵臓樹状細胞（ＤＣ）のin vitroで一次ＣＴＬ応答を引き起こす能力を、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍系で示した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞は、ニワトリオボアルブミンｃＤＮＡを用いるトランスフェクションによってＥＬ４腫瘍細胞系（Ｈ−２Ｋbハロタイプ）から得られた（Mooreら，1988，Cell 54:777-785）。ニワトリオボアルブミンは、Ｃ57ＢＬ／６マウスのただ一つ優性なエピトープ（ａａ 257-264）をコードしている（Rotzschkeら，1991，Euro.Journal Immunology,21:2891-2891）。
ナイーブマウスからのＴ細胞と一緒にインキュベートされた、ＯＶＡペプチド（ａａ 257-264）でパルスされた樹状細胞は、in vitroで強力なＣＴＬ応答を引き起こす（図１）。この実験は、ＲＮＡを、ＤＣを感作する抗原源として用いて、ＣＤ８+Ｔ細胞に対して抗原を与えることができることを示す。膵臓ＤＣは、Ｃ57ＢＬ／６マウスから単離され、そしてＯＶＡペプチドでパルスされるかまたはニワトリオボアルブミンｃＤＮＡをコードしているプラスミドからin vitroで合成されたＲＮＡ（ＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡ）と一緒にインキュベートされ、そしてin vitroのＯＶＡ特異的一次ＣＴＬ応答を刺激するのに用いられた。図１で示されたように、ＯＶＡペプチドでパルスされたＤＣもＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡでパルスされたＤＣも、ＯＶＡ特異的一次ＣＴＬ応答を引き起こすことができた（図１）。ＲＮＡパルスＤＣは、一貫して、ペプチドパルスＤＣより有効な刺激因子であった。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞から単離されたＲＮＡが、一次ＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を刺激するようにＤＣを感作することができたかどうか調べるために、全ＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡを、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡまたはＥＬ４細胞から単離し、そしてＤＣと一緒にインキュベートした。図１で示されたように、ＥＬ４細胞からではなくＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞からの全ＲＮＡかまたはポリＡ+ＲＮＡでパルスされたＤＣは、強力なＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を引き起こすことができた。驚くべきことに、未分別のＲＮＡ、全ＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡでパルスされたＤＣは、明らかにされているＣＴＬエピトープをコードしているＯＶＡペプチドでパルスされたＤＣと同程度に強力な一次ＣＴＬ応答の誘導物質であった。（全またはポリＡ+）ＥＬ４ＲＮＡパルスＤＣによるＣＴＬ応答の刺激は、（ＯＶＡペプチドまたはＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡでパルスされたＤＣで刺激されたＣＴＬによるＥＬ４標的の溶解と比較して）バックグラウンドを最低限しか越えないし且つ統計的に有意でなく、ＯＶＡエピトープの免疫優性およびＥＬ４でコードされた抗原の相対的弱さを反映した。
図２で示されるように、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞から単離されたポリＡ-ＲＮＡ以外の全ＲＮＡもポリＡ+ＲＮＡも、一次ＣＴＬ応答を刺激するようにＤＣを感作することができる。ＤＣの感作がＲＮＡによって実際に媒介されることを実証するために、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞からのポリＡ+ＲＮＡを、ニワトリオボアルブミン遺伝子中に存在するただ一つのＣＴＬエピトープをコードしている配列に及ぶアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒にかまたは対照オリゴデオキシヌクレオチドと一緒にインキュベートした後、ＲＮアーゼＨで処理して、そのオリゴデオキシヌクレオチドがハイブリッド形成したＲＮＡ配列を全て除去した。図２で示されるように、一次ＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答の誘導は、ポリＡ+ＲＮＡを対照オリゴデオキシヌクレオチドではなくアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと一緒にインキュベートした場合に消滅した。図２は、完全なオボアルブミン遺伝子を発現する細胞、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞および、ただ一つ優性なＣＴＬエピトープをコードしている８アミノ酸長さＯＶＡペプチドでパルスされたＲＭＡ−Ｓ細胞が、全またはポリＡ+Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ ＲＮＡでパルスされたＤＣによる刺激後に、同様の程度まで溶解されるということも示している。これは、したがって、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ ＲＮＡパルスＤＣによって与えられたエピトープの大部分が、ニワトリオボアルブミン遺伝子中でコードされた以前に明らかにされたただ一つ優性なＣＴＬエピトープに対応することを示している。
腫瘍ＲＮＡでパルスされたＤＣによる抗腫瘍免疫の誘導
この実施例は、ＯＶＡ ＲＮＡパルスＤＣを用いるマウスのワクチン接種が、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍細胞を用いる試験投与に対して防御を与えたことを示す。マウスは、２×１０6個のＲＮＡパルスＤＣでまたは５×１０6個の照射Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞で１回免疫感作された。１０日後、マウスに腫瘍形成性量のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を試験投与した。腫瘍の外観および寸法を一定の基準で測定した。図３は、腫瘍移植後３７日目の腫瘍の寸法を示す。照射ＥＬ４細胞で免疫感作されたマウスの平均腫瘍寸法は２５ｃｍであったが、ＯＶＡ発現性ＥＬ４細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）で免疫感作された動物の平均腫瘍寸法は僅か７．０３ｃｍであった。この差は、ＥＬ４細胞で発現されたニワトリＯＶＡ抗原の高い免疫原性および親のＥＬ４腫瘍細胞系の不十分な免疫原性の反映である。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞に由来するＲＮＡ（全またはポリＡ+部分）でパルスされたＤＣを用いるワクチン接種は、極めて免疫原性のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を用いるワクチン接種と同程度に有効であった（平均腫瘍寸法７ｃｍ）。ＥＬ４腫瘍細胞に由来する全またはポリＡ+ＲＮＡと一緒にインキュベートされたＤＣを用いるワクチン接種は、僅かな防御作用があり（平均腫瘍寸法：それぞれ２２ｃｍおよび１９．５ｃｍ）、これは統計的に有意ではなかったが、ＥＬ４由来抗原の不十分〜検出不能な免疫原性と一致した。一次ＣＴＬ誘導データ（図１）と一致して、ＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡパルスＤＣを用いるマウスのワクチン接種は、最も有効な抗腫瘍応答を与えたが（平均腫瘍寸法：３．９ｃｍ）、対照アンチセンスＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡを用いるワクチン接種は、有意の防御応答を引き起こさなかった。
腫瘍由来ＲＮＡでパルスされたＤＣの効力は、Ｂ16／Ｆ10.9（Ｈ−２b）黒色腫転移モデルにおいて更に評価された。Ｂ16／Ｆ10.9黒色腫腫瘍は、免疫原性が少なく、低レベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現し、そして実験および自然の転移検定システム双方において極めて転移性である（Porgadorら，1996，J.Immunology 156:1772-1780）。Porgadorらは、ワクチン接種が一次腫瘍移植片の除去後に行われる場合、ＩＬ−２およびＨ−２Ｋb遺伝子両方で形質導入された照射腫瘍細胞だけが、肺におけるＢ16／Ｆ10.9腫瘍細胞の転移拡散に有意に影響を与えることができるということを示した（Porgadorら，1995，Cancer Research 55:4941-4949）。したがって、Ｂ16／Ｆ10.9黒色腫モデルおよびPorgadorらによって用いられた実験計画は、転移性癌のアジュバント処置の有効性を評価する厳格な且つ臨床的に適切な実験系を構成する。
本発明による腫瘍ＲＮＡパルスＤＣを用いる免疫感作が、既存の肺転移の後退を引き起こすことができたことを実証するために、足裏のＢ16／Ｆ10.9腫瘍細胞の移植によって一次腫瘍を誘導した。足裏が直径５．５〜７．５ｍｍに達した時点で、それら腫瘍を外科手術によって除去した。２日後、マウスは、照射Ｂ16／Ｆ10.9細胞、Ｈ−２Ｋb遺伝子で形質導入された照射Ｂ16／Ｆ10.9細胞（Ｆ10.9Ｋ１）またはＲＮＡパルスＤＣ標品で免疫感作された（図４）。マウスは、１週間間隔で与えられる全部で３回のワクチン接種を受けた。正常マウスの平均肺重量は０．１８〜０．２２ｇである。ＰＢＳ（負対照）で処置されたマウスは、転移によって圧倒された。この実験群のマウスの平均肺重量は０．８１ｇであったが、その重量の約４分の３は転移によって与えられており、これらは多すぎて計数できなかった（＞１００個の結節）。同様の転移荷重は、マウスを照射Ｂ16／Ｆ10.9細胞で処置した場合に見られたが（データは示されなかった）、これは、照射Ｂ16／Ｆ10.9腫瘍細胞単独での処置にはこの腫瘍モデルにおいて治療上の利点がなかったという多数の前の知見を確証している。前にも示されたように、Ｈ−２Ｋb発現性Ｂ16／Ｆ10.9細胞（Ｆ10.9Ｋ１、正対照として）での免疫感作には、この処置群の動物の平均肺重量の統計的に有意の減少によって示されるように、適度の治療上の利点があった。しかしながら、本発明によるＦ10.9細胞に由来する全ＲＮＡでパルスされたＤＣで処置された動物において、劇的な応答が見られた。この処置群のマウスの平均肺重量は０．３７ｇであった。本発明によるＦ10.9細胞に由来するポリＡ+ＲＮＡでパルスされたＤＣで処置されたマウスでも、有意の劇的な応答が見られた（平均肺重量：０．４２ｇ）。対照的に、Ｆ10.9細胞に由来するポリＡ-ＲＮＡ部分でかまたはＥＬ４腫瘍細胞から単離された全ＲＮＡでパルスされたＤＣで処置されたマウスでは、転移荷重の統計的に有意の減少は見られなかった。
ＯＶＡタンパク質を発現する細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）またはＯＶＡペプチドでパルスされた細胞はＣＴＬによって有効に溶解されたという知見、およびポリＡ+ＲＮＡと一緒に分別されたＤＣの感作は、ＣＴＬのＲＮＡに媒介された刺激が、導入ＲＮＡの翻訳、および予想上のクラスＩ制限エピトープ、この場合、ニワトリＯＶＡペプチド中でコードされたただ一つ優性なエピトープの発生によって起こることを示唆する。これらデータは、ＤＣのＲＮＡに媒介された感作が、トランスフェクションされたＲＮＡは抗原性ペプチドの製造用の連続的な源として役立ちうるので、ペプチドを用いるパルスより有効であることを示している。
治療的使用
本発明を用いて、患者の腫瘍形成（例えば、黒色腫腫瘍、膀胱腫瘍、乳癌腫瘍、結腸癌腫瘍、前立腺癌腫瘍および卵巣癌腫瘍）を治療できるしまたは予防できる。同様に、本発明を用いて、細菌（例えば、サルモネラ属、赤痢菌属またはエンテロバクター属）またはウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスまたは風疹ウイルス）などの病原体による患者の感染を治療できるしまたは予防できる。
患者の腫瘍形成または病原体感染を治療するまたは予防する場合、その患者に対して投与される１種類または複数の細胞は、その患者に由来する必要がない。したがって、抗原提示細胞は、適合したドナーからまたはin vitroで増殖した細胞の培養物から得ることができる。ハロタイプを適合させる方法は、当該技術分野において知られている。同様に、ＲＮＡは、処置される患者に由来する必要がない。ドナーからのＲＮＡを用いることができる。
処置は、腫瘍形成または感染の前または開始時に始め、そしてその癌または感染が改善されるまで続けることが好ましい。しかしながら、本明細書中で記載の実施例で詳しく説明しているように、本発明は、腫瘍の後退を引き起こすことができるので、本発明は、腫瘍が形成された後でも用いるのに適している。本発明によって製造された細胞またはワクチンで患者を処置する場合、そのワクチンまたは細胞の最適用量は、哺乳動物の体重、癌または感染の重症度およびＣＴＬエピトープの強さなどの因子に依存する。概して、ＲＮＡ添加抗原提示細胞１０5〜１０8個／ｋｇ（体重）、好ましくは、１０6〜１０7個／ｋｇ（体重）の用量を、患者に対して薬学的に許容しうる賦形剤中で投与すべきである。細胞は、癌治療法で一般的に用いられる注入技術を用いることによって投与することができる（例えば、Rosenbergら，New Eng.J.of Med.319:1676，1988を参照されたい）。具体的な患者のための最適用量および治療計画は、疾患の微候について患者を監視し、そしてそれによって処置を調整することにより、当医療業者が容易に決定できる。
抗原提示細胞を用いてin vitroのＣＴＬ応答を引き起こす場合、得られたエフェクターＣＴＬは、ＣＴＬに基づく治療法において哺乳動物に対して引続き投与することができる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ91/06441号を参照されたい）。本発明の抗原提示細胞を用いてin vitroで生産されたＣＴＬは、慣用的な注入法を用いることによって哺乳動物に対して薬学的に許容しうる賦形剤中で投与することができる（例えば、Rosenbergら，上記を参照されたい）。典型的に、１０9〜１０10個の細胞を３０分間にわたって投与し、必要に応じて処置を繰返す。このようなＣＴＬに基づく治療法は、本発明の抗原提示細胞の直接投与などの他の方法と組合わせることができる。ＣＴＬおよび抗原提示細胞は、治療を受ける患者に対して自己であってよいしまたは異種であってよい。所望ならば、その処置は、ＣＴＬ増殖を促進するマイトジェン（例えば、フィトヘマグルチニン）またはリンホカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）の投与を含んでもよい。
本発明は、患者の腫瘍形成または病原体感染を治療するまたは予防する方法に関する。
これまでに記載された癌の治療方法には、化学療法、放射線療法および選択的手術が含まれる。数種類の腫瘍抗原の識別は、細胞に基づいた療法の開発をもたらした。これらの方法は、腫瘍抗原（すなわち、非腫瘍細胞に相対して腫瘍細胞において優先的に発現されるポリペプチド）を最初に識別することに頼っている。いくつかのヒト腫瘍抗原が黒色腫患者から単離され、そして識別され且つ特性決定された（Boonおよびvan der Bruggen，1996,J.Exp.Med.183:725-729）。これらポリペプチド抗原は、抗原提示細胞上に添加された後、免疫療法の方式で（すなわち、ワクチンとして）患者に投与することができる。或いは、ポリペプチドを添加された抗原提示細胞を用いて、ex vivoのＣＴＬ増殖を刺激することができる。次に、刺激されたＣＴＬを、養子免疫療法の方式で患者に対して投与する。
ウイルスおよび細菌などの細胞内病原体による感染の治療について様々な方法が記載されてきた。例えば、抗生物質は、細菌感染を治療するのに一般的に用いられる。死滅した病原体の標品もまた、ワクチンとして役立ちうる。更に、ＣＴＬに基づく療法は、このような感染を治療するために記載されてきた。
発明の概要
ここで、患者の腫瘍形成は、その患者に対して、腫瘍に由来するＲＮＡ中でコードされた抗原を添加されている１種類または複数の抗原提示細胞を投与することによって治療できるしまたは予防できるということを発見した。便宜上、ＲＮＡが豊富な腫瘍標品を、精製ＲＮＡの代りに用いることができる。したがって、本発明は、ＲＮＡを精製するまたは腫瘍抗原を単離し且つ識別する必要性を免れる。同様の方法および病原体由来ＲＮＡを用いると、患者の病原体感染を治療できるしまたは予防できる。ＲＮＡ添加抗原提示細胞は、ex vivoまたはin vivoのＣＴＬ増殖を刺激するのに用いることができる。ex vivoで増殖したＣＴＬは、養子免疫療法の方式で患者に対して投与することができる。
したがって、本発明は、ＲＮＡ添加抗原提示細胞（ＡＰＣ）を生産する方法であって、（ｉ）Ｔ細胞増殖を引き起こす細胞表面腫瘍抗原エピトープをコードする腫瘍特異的ＲＮＡを含む腫瘍由来ＲＮＡまたは（ii）Ｔ細胞増殖を引き起こす病原体抗原エピトープをコードする病原体特異的ＲＮＡを含む病原体由来ＲＮＡをin vitroのＡＰＣ中に導入することを含む上記方法を特徴とする。ＲＮＡをＡＰＣ中に導入すること（すなわち、ＲＮＡをＡＰＣに「添加すること」）で、そのＲＮＡはＡＰＣ内で翻訳され、そして得られたタンパク質は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスIIのプロセッシングおよび提示経路によって処理される。ＲＮＡでコードされたペプチドの提示は、その免疫系が、提示されたペプチドに対する応答を開始する一連の現象を開始する。
好ましくは、ＡＰＣは、樹状細胞またはマクロファージなどの専門的なＡＰＣである。例えば、内皮細胞および人工的に作られたＡＰＣを用いることができる。ＡＰＣ上に添加されるＲＮＡは、ＡＰＣに対して精製ＲＮＡとしてまたは腫瘍若しくは病原体の分別された標品として与えることができる。そのＲＮＡには、ポリＡ+ＲＮＡが含まれることができ、これは、慣用法を用いること（例えば、ポリｄＴクロマトグラフィーの使用）によって単離することができる。細胞質ＲＮＡも核ＲＮＡも、本発明において有用である。本発明において更に有用なのは、明らかにされた腫瘍または病原体の抗原またはエピトープをコードしているＲＮＡ、およびＲＮＡ「ミニ遺伝子」（すなわち、明らかにされたエピトープをコードしているＲＮＡ配列）である。所望ならば、腫瘍特異的または病原体特異的ＲＮＡを用いることができるが、このようなＲＮＡは、非腫瘍細胞からのＲＮＡに対する、または関連しているが非病原体の細菌若しくはウイルスに対する差引きハイブリダイゼーションなどの技術上知られている技法を用いて製造することができる。
ＡＰＣ上に添加されるＲＮＡは、細胞から単離することができるし、または慣用的な分子生物学技術を用いることによってそれを製造することができる。例えば、ＲＮＡは、腫瘍細胞から抽出され、ｃＤＮＡ中に逆転写されることができ、これをＰＣＲによって増幅させることができ、そして次に、本発明において用いられるＲＮＡ中にそのｃＤＮＡを転写する。所望ならば、そのｃＤＮＡをＲＮＡ合成の鋳型として用いる前に、プラスミド中にそれをクローン化することができる。in vitroで合成されるＲＮＡは、当然ながら、リボヌクレオチド類似体または誘導体を用いて部分的にまたは完全に合成することができる。このような類似体および誘導体は、当該技術分野において周知であり、そして例えば、ヌクレアーゼ耐性ＲＮＡを製造するのに用いることができる。ＲＮＡ増幅技術の使用は、多量のＲＮＡ抗原を少数の細胞から得ることを可能にする。
本発明の範囲内に包含されるのは、ＲＮＡを凍結組織または固定組織から単離する方法である。腫瘍検体は、一般的に、癌患者から単離された後、例えば、クリオスタットまたはホルマリン固定されたパラフィン包埋組織切片として貯蔵される。癌患者は、しばしば、腫瘍細胞がほとんどないため、固定組織からのＲＮＡの単離は、その方法が僅かな組織試料を用いることができるので、本発明のＡＰＣを生産する場合に特に好都合である。顕微解剖技術は、腫瘍細胞を正常細胞から分離するのに用いることができる。次に、ＲＮＡを腫瘍細胞から単離し、そしてin vitroで増幅させることができる（例えば、ＰＣＲまたは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって）。次に、得られた増幅ＲＮＡを用いて、本明細書中に記載のＲＮＡ添加ＡＰＣを生産することができる。
所望ならば、イムノモジュレーターをコードしているＲＮＡも、腫瘍由来または病原体由来のＲＮＡを添加されたＡＰＣ中に導入することができる。この実施態様において、ＲＮＡにコードされたイムノモジュレーターは、ＡＰＣ中で発現され、そしてＲＮＡ添加ＡＰＣの治療的作用を促進する（例えば、ワクチンとして）。好ましくは、そのイムノモジュレーターは、サイトカインまたは補助刺激因子（costimulatory factor）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２若しくはＩＬ−１５などのインターロイキンまたはＧＭ−ＣＳＦ）である。
ＲＮＡをＡＰＣ中に導入するために、ＡＰＣを、ＤＯＴＡＰまたは１：１（ｗ／ｗ）ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（すなわち、リポフェクチン）などのカチオン脂質の存在下において腫瘍または病原体由来ＲＮＡと接触させることができる。或いは、「裸の」ＲＮＡを細胞中に導入することができる。他の技術上知られているトランスフェクション法を用いてＲＮＡをＡＰＣ中に導入することもできる。
上の方法の変法において、ＡＰＣ中に導入されるＲＮＡは、それが、腫瘍抗原または病原体抗原の他に細胞輸送用シグナル配列をコードするように遺伝子操作されうる。このような遺伝子操作されたＲＮＡは、共有結合していて且つキメラポリペプチドの発現を支配する二つのＲＮＡ配列を含有すると考えられうる。一方のＲＮＡ配列は腫瘍または病原体抗原をコードしているが、もう一方のＲＮＡ配列は細胞輸送用配列をコードしているので、キメラポリペプチドが形成される。輸送用配列に対する結合した抗原を含有するキメラポリペプチドは、ＭＨＣクラスII抗原提示経路に方向付けられる。適当な輸送用配列の例は、下記で与えられる。
本発明の実施は、腫瘍細胞または病原体の抗原を識別する必要がないので、本質的にはいずれの種類の腫瘍または病原体に由来するＲＮＡも有用である。例えば、本発明は、黒色腫、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌および卵巣癌を処置する療法の開発に応用できるが、これらに制限されるわけではない。更に、本発明は、サルモネラ属（Salmonella）、赤痢菌属（Shigella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスまたは風疹ウイルスなどの病原体による感染を治療できるしまたは予防できる。
本発明によって生産された抗原提示細胞は、in vivoおよびex vivoのＣＴＬ応答を引き起こすのに用いることができる。したがって、本発明は、患者の腫瘍形成を治療するまたは予防する方法であって、該患者に対して治療的有効量の腫瘍由来ＲＮＡ添加ＡＰＣを投与することによる上記方法を包含する。腫瘍由来ＲＮＡは、患者から、例えば、ＲＮＡの豊富な腫瘍標品として得ることができる。或いは、このような治療法で用いられる腫瘍由来ＲＮＡは、同じまたは類似した種類の癌に罹患した別の患者から得ることができる。同様に、病原体由来ＲＮＡを添加されたＡＰＣを用いて、患者の病原体感染を治療できるしまたは予防できる。
本発明の範囲内に含まれるのは、細胞障害性Ｔリンパ球を生産する方法である。このようなＣＴＬは、in vitroのＴリンパ球を、腫瘍由来または病原体由来ＲＮＡを添加されている抗原提示細胞と接触させ、そしてＣＴＬ増殖を導く条件下でそのＴリンパ球を維持することによってＣＴＬを生産することにより生産することができる。得られたＣＴＬは、添加されたＲＮＡが由来する病原体または腫瘍細胞に対して著しい特異性を示す。このようなＣＴＬは、慣用的な養子免疫療法の変法において患者に対して投与することができる。所望ならば、ＣＴＬの感作（すなわち、活性化）について検定することができる。この目的には、細胞障害性検定などの技術上知られているいずれの検定も用いることができる。例えば、細胞障害性検定は、１種類または複数のＲＮＡ添加細胞（例えば、ＲＮＡによってコードされた腫瘍抗原エピトープまたは病原体抗原エピトープを細胞表面上で提示する、本明細書中で記載のように生産された線維芽細胞または樹状細胞（すなわち、ＲＮＡ添加細胞））の致死の検出を含むことができる。ＣＴＬ感作を検出するもう一つ適当な方法は、ＣＴＬに接触する前に得られたサイトカイン分泌（例えば、ＴＮＦ−αまたはγ−インターフェロン）のレベルに相対するサイトカイン分泌の増加を検出することによる（例えば、ELISPOT検定などのin situ免疫検定において）。
上の方法の変法において、本発明は、腫瘍特異的（または病原体特異的）ＣＴＬ応答を生じる方法を提供する。大部分の癌患者は、当然、検出不能なまたは不十分な腫瘍特異的ＣＴＬ応答を示すため、この方法は、いずれの患者からも得られた抗原を用いてＣＴＬ応答を生じる方法を提供するので、これは特に有用である。ＣＴＬ応答がいったん生じたら、慣用法を用いて、ＣＴＬ応答を引き起こす抗原を識別することができる。例えば、腫瘍抽出物中の抗原を分別することができ（例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって）、そしてその画分を検定して、本発明によって生産された腫瘍特異的ＣＴＬによって認識される抗原をどの画分が含んでいるか確認することができる。したがって、本発明の方法は、抗原発見の方針として役立つ。その方法は、
（ａ）in vitroの抗原提示細胞中に、少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも９０％または１００％）のポリＡ+ＲＮＡ種を含むポリＡ+ＲＮＡを導入し、それによってＲＮＡ添加ＡＰＣを生産し；そして
（ｂ）Ｔリンパ球を、そのＲＮＡ添加ＡＰＣと接触させ、それによって腫瘍特異的または病原体特異的ＣＴＬ応答を引き起こすことを行う。所望ならば、このようなＣＴＬ応答の誘導は、本明細書中に記載の方法を用いて、接触したＴリンパ球の感作を検出することによって検出できる。この方法を実施する場合、腫瘍由来（または病原体由来）の未分別の全ＲＮＡは、腫瘍抗原（または病原体抗原）をコードするＲＮＡ種を確実に含有しているので、典型的に、全ＲＮＡを用いて、ＲＮＡ添加ＡＰＣを生産するであろう。
本発明は、患者の腫瘍形成を治療するまたは予防する方法であって、該患者に対して治療的有効量の腫瘍由来ＲＮＡ添加ＡＰＣを投与することによる上記方法も包含する。同様に、本発明は、患者の病原体感染を治療する方法であって、該患者に対して治療的有効量の病原体由来ＲＮＡ添加ＡＰＣを投与することによる上記方法を提供する。これら種々の治療方法で用いられるＴリンパ球は、治療される患者から得ることができるしまたはドナーからのハロタイプ適合ＣＴＬを用いることができる。同様に、これらの方法で用いられるＲＮＡは、治療される患者から得ることができるしまたはドナーからのＲＮＡを用いることができる。
「ＲＮＡ添加」または「ＲＮＡパルス」抗原提示細胞とは、ＲＮＡ、例えば、腫瘍または病原体に由来するＲＮＡと一緒にインキュベートされたまたはＲＮＡでトランスフェクションされたＡＰＣ（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）を意味する。このようなＲＮＡは、脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウムトランスフェクションなどの慣用的な核酸トランスフェクション法を用いることによってＡＰＣ上に添加することができる。例えば、ＲＮＡは、ＡＰＣをＲＮＡと一緒に、好ましくは、カチオン脂質の存在下において３７℃で１〜２４時間（例えば、２時間）インキュベートすることによってＡＰＣ中に導入することができる。
「腫瘍由来」ＲＮＡとは、腫瘍細胞にその起原があるＲＮＡの試料を意味し、これには、１種類または複数の腫瘍抗原に対応するＲＮＡが含まれる。包含されるのは、予め識別された腫瘍抗原の全部または一部分をコードするＲＮＡである。同様に、「病原体由来」ＲＮＡは、病原体（例えば、細胞内病原体を含めた細菌またはウイルス）にその起原があるＲＮＡの試料である。このようなＲＮＡは、「in vitro転写される」ことができ、例えば、逆転写されて、ＰＣＲによって増幅されうるｃＤＮＡを生じた後、そのｃＤＮＡのクローン化を伴ってまたは伴うことなくin vitroで転写される。更に含まれるのは、腫瘍細胞または病原体の分別された標品として提供されるＲＮＡである。未分別のＲＮＡ標品（例えば、全ＲＮＡまたは全ポリＡ＋ＲＮＡ）でも用いることができるので、腫瘍または病原体抗原を識別する必要はない。一つの実施態様において、その標品は、タンパク質、脂質および／またはＤＮＡなどの非ＲＮＡ成分の濃度を減少させ且つ標品のＲＮＡを豊富にするために、細胞の１種類または複数の非ＲＮＡ成分に関して分別される。所望ならば、その標品を、「腫瘍特異的」または「病原体特異的」ＲＮＡを生じるように、ＲＮＡに関して（例えば、差引きハイブリダイゼーションによって）更に分別することができる。
「腫瘍特異的」ＲＮＡとは、非腫瘍細胞と比較して優先的に腫瘍細胞中に存在するＲＮＡを、未分別の腫瘍由来ＲＮＡに相対して高含有量で有するＲＮＡ試料を意味する。例えば、腫瘍特異的ＲＮＡには、腫瘍細胞中に存在するが非腫瘍細胞中には存在しないＲＮＡが含まれる。この定義で更に包含されるのは、腫瘍細胞中にも非腫瘍細胞中にも存在するが、非腫瘍細胞中よりも高レベルで腫瘍細胞中に存在するＲＮＡを含むＲＮＡ試料である。この定義の範囲内に更に包含されるのは、以前に同定された腫瘍抗原をコードするＲＮＡであり、これはin vitroで、例えば、プラスミドからまたはＰＣＲによって製造される。或いは、腫瘍特異的ＲＮＡは、腫瘍抗原に対応するＲＮＡの百分率が、未分別の腫瘍由来ＲＮＡに相対して増加するようにＲＮＡ試料を分別することによって製造することができる。例えば、腫瘍特異的ＲＮＡは、非腫瘍細胞からのＲＮＡに対して慣用的な差引きハイブリダイゼーション技術を用いて腫瘍由来ＲＮＡを分別することによって製造することができる。同様に、「病原体特異的」ＲＮＡとは、細菌またはウイルスの非病原体株と比較して優先的に病原体中に存在するＲＮＡを、未分別の病原体由来ＲＮＡに相対して高含有量で有するＲＮＡ試料を意味する。
「輸送用配列」とは、アミノ酸配列が結合しているポリペプチドの細胞内輸送（例えば、オルガネラからオルガネラまたは細胞表面に対して方向付けられた移動）を調節するように機能するそのアミノ酸配列（またはアミノ酸配列をコードしているＲＮＡ）を意味する。
本発明は、いくつかの利点を与える。本発明によって行われるワクチン接種は、未分別のＲＮＡを用いる場合、１種類または複数の正しい抗原が腫瘍または病原体由来ＲＮＡから自動的に選択されるので、特異的な腫瘍拒絶抗原または病原体抗原を識別する必要を免れる。所望ならば、腫瘍特異的ＲＮＡを用いることによって、自己免疫応答を生じる危険を減少させることができる。更に、未分別の腫瘍由来ＲＮＡを添加された細胞を用いるワクチン接種は、いくつかの腫瘍抗原に対する免疫応答を引き起こし、「逸脱（escape）突然変異体」の可能性を減少させると考えられる。本発明は、癌の大部分である特異的腫瘍抗原がまだ識別されていない癌を治療するための活発な免疫療法の使用にも及ぶ。更に、ＡＣＰ中に導入されるＲＮＡは、固定組織試料から得ることができる。腫瘍組織の固定試料は、癌を診断する過程で常套手段によって調製され、したがって、このような試料からのＲＮＡの使用は、患者が追加の侵襲性の方法を受けることを必要としない。大部分の癌患者は腫瘍荷重が低いので、固定腫瘍組織からのＲＮＡの単離および増幅を行う本発明の方法は、特に有効である。本発明は、腫瘍自体が不十分な免疫原性を示すとしても、有効に用いることができる。更に、本発明は、一次腫瘍の除去後でさえも、転移を含めた既存の腫瘍の寸法を減少させるのに有用である。最終的に、本発明は、in vitroで転写されたＲＮＡを添加されている抗原提示細胞が、ペプチド抗原を添加されている抗原提示細胞より強力なワクチンでありうるという利点を与える。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＮＡでパルスされた樹状細胞を用いるin vitroの一次ＯＶＡ特異的ＣＴＬ誘導を示すグラフである。ＤＣは、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ若しくは′ＥＬ４細胞から得られた全ＲＮＡ若しくはポリＡ+ＲＮＡまたはin vitro転写されたＯＶＡ ＲＮＡを用いて、本明細書中で記載のカチオン脂質ＤＯＴＡＰの存在下でパルスされた。ＯＶＡペプチドでパルスされたＤＣは、比較のために用いられた。ＤＣおよびナイーブＴ細胞を、２０：１のＲ／Ｓで５日間インキュベートした。生存しうるリンパ球を採取し、そしてＣＴＬ活性を、常套のユーロピウム放出検定で測定した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡおよびＥＬ４細胞は標的として用いられた。この実験を３回繰返し、同様の結果を得た。
図２は、ＯＶＡ特異的一次ＣＴＬ応答の刺激に関するＥ．Ｇ７−ＯＶＡ ＲＮＡパルスＤＣの感作が、ＲＮＡのポリＡ+部分によって媒介されることを示すグラフである。ＤＣは、全ＲＮＡ、ポリＡ-ＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡでパルスされ、そしてナイーブＴ細胞と一緒に９６ウェルＵ字形底プレート中で５日間培養された。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞からのポリＡ+ＲＮＡ部分を、ＯＶＡ遺伝子のＣＴＬエピトープコード領域に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドで処理した後、ＲＮアーゼＨ処理を行って、ハイブリッド形成したＲＮＡを除去した。ＯＶＡペプチドでパルスされたＤＣは対照として用いられた。ＯＶＡペプチドでパルスされたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ、ＥＬ４およびＲＭＡ細胞は、標的として用いられた。
図３は、ＲＮＡでパルスされたＤＣを用いる１回の免疫感作後のマウスにおけるin vivoの抗腫瘍免疫の誘導を示すヒストグラムである。ＤＣは、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞若しくはＥＬ４細胞からの全ＲＮＡ若しくはポリＡ+ＲＮＡでかまたはin vitro転写されたＯＶＡ ＲＮＡ若しくは対照アンチセンスＯＶＡ ＲＮＡでパルスされた。マウスは、腹腔内注射される２×１０6個のＤＣまたは５×１０6個の照射Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ若しくはＥＬ４細胞で免疫感作された後、２×１０7個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ生細胞を試験投与された。マウスは、腫瘍成長について定期的に調べられ、そして腫瘍直径が３〜４ｃｍに達した時点で屠殺された。マウスは全て、試験投与後３５〜４０日目に屠殺された。
図４は、Ｂ16−Ｆ10.9黒色腫モデルにおいて、ポリＡ+ＲＮＡまたは全ＲＮＡでパルスされたＤＣをワクチン接種されたマウスの自然転移の後退を示すヒストグラムである。マウスに、Ｆ10.9生細胞を足裏内注射によって与え、そして腫瘍直径が５．５〜７．５ｍｍに達した時点で、その脚部を切断した。ワクチン接種を切断後２日目に開始し、そして１週間間隔で更に２回のワクチン接種を続けて行った。マウスは、２×１０6個の全、ポリＡ-若しくはポリＡ+ＲＮＡパルスＤＣ、または照射Ｆ10.9細胞若しくはＦ10.9／Ｋ１細胞、或いはＰＢＳ（対照として）を腹腔内にワクチン接種された。マウスは、非免疫感作群または対照群における転移性死に基づいて屠殺された（切断後２８〜３２日目）。転移性荷重は、肺を秤量することによっておよび転移性結節の数を計数することによって検定された。
詳細な説明
本発明の詳細な実施例を与える前に、本発明のいくつかのパラメーターを一般的に記載する。
本発明で用いることができる腫瘍または病原体由来ＲＮＡを製造するのに、様々な方法が適している。次の実施例が示すように、ＲＮＡがＡＰＣに対して精製された形で与えられる必要はない。好ましくは、ＲＮＡ試料（すなわち、分別された腫瘍標品またはＩＶＴ ＲＮＡ試料）は、少なくとも５０％、更に好ましくは７５％、９０％または９９％ものＲＮＡ（重量／容量）である。本発明を実施する場合、抗原提示細胞、好ましくは、樹状細胞またはマクロファージなどの専門的なＡＰＣを用いる。このような細胞は、前に記載された手順にしたがって単離することができる。
様々な方法のいずれを用いても、ＲＮＡ含有腫瘍標品を製造することができる。例えば、腫瘍標品は、Opti-ＭＥＭなどの哺乳動物細胞培地またはリン酸緩衝溶液などの緩衝液中において腫瘍細胞を音波処理することによって製造することができる。同様に、病原体由来ＲＮＡは、病原性細菌、または病原性ウイルス含有細胞を音波処理することによって製造することができる。細胞を破壊する他の方法も、その方法が腫瘍または病原体由来ＲＮＡを完全に分解しないという条件ならば適している。典型的に、ＲＮＡ標品は、１０6〜１０8個／ｍｌの細胞、最も好ましくは、１０7個／ｍｌの細胞を有する。音波処理に代るものとしてまたはそれに加えて、腫瘍または病原体由来ＲＮＡは、ポリＡ+ＲＮＡを単離するイソチオシアン酸グアニジニウム法および／またはオリゴｄＴクロマトグラフィー法などの慣用的なＲＮＡ精製法を用いることによって製造することができる。慣用法によって合成されたＩＶＴ ＲＮＡは、腫瘍標品中のＲＮＡの代りに用いることができる。例えば、腫瘍または病原体からのＲＮＡは、ｃＤＮＡ中に逆転写されることができ、次に、それを慣用的なＰＣＲ技術によって増幅させて、腫瘍または病原体ＲＮＡ抗原に対応するｃＤＮＡを本質的に無制限に供給する。次に、慣用的なin vitro転写技術および細菌ポリメラーゼを用いて、ＩＶＴ ＲＮＡを製造する。他に、ＩＶＴ ＲＮＡは、腫瘍または病原体ポリペプチド抗原をコードしているクローン化ＤＮＡ配列から合成することができる。このような抗原を識別する方法は、当該技術分野において知られており、例えば、いくつかの黒色腫ペプチド抗原が識別されている。識別されたペプチド抗原をコードしているｃＤＮＡからin vitro転写されたＲＮＡは、本発明において腫瘍または病原体特異的ＲＮＡとして役立ちうる。他に、ＲＮＡは、エピトープをコードする腫瘍抗原ｃＤＮＡの一部分から成る「ミニ遺伝子」から転写されうる。腫瘍または病原体特異的ＲＮＡは、差引きハイブリダイゼーションのための慣用的な技術を用いることによっても製造することができる。例えば、腫瘍細胞および非腫瘍細胞からのＲＮＡ試料を差引きハイブリダイゼーション法で用いて、腫瘍特異的ＲＮＡを得ることができる。
所望ならば、腫瘍由来または病原体由来ＲＮＡは、凍結したまたは固定された組織から製造することができる。必要ではないが、その組織試料は、腫瘍特異的ＲＮＡを豊富にされうる。腫瘍細胞を非腫瘍細胞から分離するのに適している顕微解剖技術が記載されてきた（Zhuangら，1995,Cancer Res.55:467-471;Luqmaniら，1992,Analy,Biochem.200:291-295;Luqmaniら，1994,Analy.Biochem.222:102-109;Turbettら，1996,BioTech.20:846-853）。いったん腫瘍細胞が非腫瘍細胞から分離されたら、技術上知られている技法を用いて、腫瘍由来ＲＮＡをその腫瘍細胞から単離することができる。例えば、腫瘍由来ポリＡ+ＲＮＡは、常磁性ビーズに対して結合したオリゴ（ｄＴ）などの固相に対してＲＮＡをハイブリッド形成させることによって単離することができる（例えば、Raineriら，1991,Nucl.Acids.Res.19:4010を参照されたい）。次に、逆転写によって最初のｃＤＮＡ鎖を合成し、そのＲＮＡを除去し、そして第二鎖を合成する（例えば、ＤＮＡポリメラーゼを用いて）。次に、慣用的なin vitro転写法を用いてＲＮＡを合成することができる。少数の細胞からまたはたとえ１個の細胞からでもＲＮＡを増幅させる他の技術上知られている方法も、本発明において用いることができる。
腫瘍または病原体抗原性エピトープをコードするＲＮＡ分子は、所望ならば、それが細胞輸送用シグナル配列もコードするように遺伝子操作されうる。このようなキメラＲＮＡ分子は、慣用的な分子生物学技術を用いて製造することができる。ＡＰＣ中に導入されるキメラＲＮＡは、キメラポリペプチドをコードしていて、そのキメラポリペプチドをＭＨＣクラスII抗原提示経路中へ向ける輸送用配列に対して結合した抗原を含有する。例えば、本発明のこの実施態様において用いられる輸送用配列は、小胞体（ＥＲ）、リソソームまたはエンドソームに対するポリペプチドの輸送を支配することができ、そしてシグナルペプチド（翻訳の際にタンパク質をＥＲ中へ向けるアミノ末端配列）、ＫＤＥＬ（配列番号：１）などのＥＲ保持ペプチド；およびＫＦＥＲＱ（配列番号：２）、ＱＲＥＫ（配列番号：３）およびＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＬから選択される４個の残基が片側に隣接したＱを有する他のペンタペプチドなどのリソソーム標的ペプチドを含む。本発明において用いることができる好ましいシグナルペプチドは、ＬＡＭＰ−１ソーティングシグナルである（Wuら，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.92:11671-11675;Linら，1996,Cancer Research 56:21-26）。本発明において有用であるシグナルペプチドのもう一つの例は、クラスIIαまたはβなどのＭＨＣサブユニットの場合と実質的に同一のシグナルペプチドであり、例えば、ＭＨＣクラスIIαのシグナルペプチドは、配列ＭＡＩＳＧＶＰＶＬＧＦＦＩＩＡＶＬＭＳＡＱＥＳＷＡ（配列番号：４）中に含まれる。所望ならば、本発明のＲＮＡによってコードされたシグナルペプチドは、特定された２５残基配列の一部分（典型的に、少なくとも１０アミノ酸残基）のみを含むことができるが、但し、その部分は、ＥＲに対するポリペプチドの輸送を引き起こすという条件付きである。
抗原提示細胞中に腫瘍または病原体由来ＲＮＡを導入するのに適しているトランスフェクション法は、当該技術分野において知られている。例えば、５００μｌのOpti-ＭＥＭ中５〜５０μｇのＲＮＡを、１０〜１００μｇの濃度のカチオン脂質と一緒に混合し、そして室温で２０〜３０分間インキュベートすることができる。他の適当な脂質には、リポフェクチン（LIPOFECTIN）TM（１：１（ｗ／ｗ）ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）、リポフェクタミン（LIPOFECTAMINE）TM（３：１（ｗ／ｗ）ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）、ＤＯＤＡＣ：ＤＯＰＥ（１：１）、ＣＨＯＬ：ＤＯＰＥ（１：１）、ＤＭＥＤＡ、ＣＨＯＬ、ＤＤＡＢ、ＤＭＥＤＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＲＩ、ＤＯＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰおよびＤＯＴＭＡが含まれる。次に、得られたＲＮＡ−脂質複合体を、約２ｍｌの全容量中（例えば、Opti-ＭＥＭ中）１〜３×１０6個、好ましくは、２×１０6個の抗原提示細胞に対して加え、そして３７℃で２〜４時間インキュベートする。或いは、そのＲＮＡを、５×１０6個の細胞および５〜５０μｇのＲＮＡを用いるエレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションなどの慣用的な技法を用いることによって抗原提示細胞中に導入することができる。典型的に、５〜２０μｇのポリＡ+ＲＮＡまたは２５〜５０μｇの全ＲＮＡを用いる。
ＲＮＡが腫瘍または病原体標品として与えられる場合、その標品は、典型的に、分別されるかまたは他に処理されて、その標品中のタンパク質、脂質および／またはＤＮＡの濃度を減少させ、そしてその標品のＲＮＡを豊富にする。例えば、技術上知られているＲＮＡ精製法を用いて、腫瘍細胞または病原体から少なくとも部分的にＲＮＡを精製することができる。プロテアーゼまたはＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼを用いてＲＮＡ標品を処理することも許容できる。当然ながら、ＲＮＡは、そのＲＮＡがリボヌクレアーゼに対してあまり感受性でないように、技術上知られているヌクレアーゼ耐性類似体または誘導体を用いて合成することができる。
所望ならば、サイトカインまたは補助刺激因子などのイムノモジュレーターをコードしているＲＮＡを、本発明のＲＮＡ添加ＡＰＣ中に導入することができる。本発明のこの実施態様において、イムノモジュレーターをコードしているＲＮＡは、腫瘍または病原体由来ＲＮＡの導入の前に、と同時に、またはに引続いて、ＡＰＣ中に導入することができる。腫瘍由来または病原体由来ＲＮＡをＡＰＣ中に導入することに関して本明細書中で記載された方法もまた、イムノモジュレーター（例えば、サイトカインまたは補助刺激因子）をコードしているＲＮＡをＡＰＣ中に導入するのに適している。多数のタンパク質をコードしている配列は、当該技術分野において知られているので、本発明において用いることができる。所望ならば、２種類またはそれ以上のイムノモジュレーターをコードしているＲＮＡをＡＰＣ中に導入することができる。典型的に、５〜２０μｇのそれぞれのＲＮＡを、腫瘍および病原体由来ＲＮＡについて上に記載のようにＡＰＣ中に導入する。
本発明のＲＮＡ添加抗原提示細胞は、in vivoまたはex vivoのＣＴＬ増殖を刺激するのに用いることができる。ＣＴＬ応答を刺激するＲＮＡ添加抗原提示細胞の能力は、例えば、慣用的な細胞障害性検定においてＴ細胞活性化を測定するかまたは検出することによって測定することができるしまたは検出することができる。下記で与えられた実施例において、細胞障害性検定は、標的細胞を溶解するエフェクター細胞の能力を検定することを行う。所望ならば、標的細胞は、本発明によって製造されたＲＮＡ添加ＡＰＣ（すなわち、Ｔ細胞増殖を引き起こす、ＲＮＡでコードされた細胞表面腫瘍または病原体抗原エピトープを提示するＡＰＣ）でありうる。下記で記載されるように、一般的に用いられるユーロピウム放出検定は、ＣＴＬ感作を検定するのに用いることができる。典型的に、５〜１０×１０6個の標的細胞を、ジエチレントリアミンペンタ酢酸ユーロピウムで４℃において２０分間標識する。数回洗浄後、１０4個のユーロピウムで標識された標的細胞およびエフェクター細胞の連続希釈を５０：１〜６．２５：１の範囲のエフェクター：標的比率で、９６ウェルプレート中において１０％熱失活ウシ胎児血清を含む２００μｌのＲＰＭＩ 1640中でインキュベートする。それらプレートを５００×ｇで３分間遠心分離し、そして５％ＣＯ2中において３７℃で４時間インキュベートする。上澄みの５０μｌアリコートを集め、そして時間分解蛍光によってユーロピウム放出を測定する（Volgmannら，J.Immunol.Methods 119:45-51,1989）。
ＣＴＬ感作を検出する別の方法では、ＣＴＬによるサイトカイン分泌の増加を、ＣＴＬとＲＮＡ添加ＡＰＣと接触させる前のサイトカイン分泌のレベルに相対して検出する。ELISPOT検定などのin situハイブリダイゼーション検定は、ＴＮＦ−αおよび／またはγ−インターフェロンなどのサイトカインの分泌を検出するのに用いることができる。
実施例
次の実施例は、本発明を詳しく説明するためのものであり、制限するためのものではない。最初に、これら実施例において用いられる方法を記載する。
マウス
７〜８週令で且つ繁殖を退いた雌Ｃ57ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b）を、Jackson Laboratory（バー・ハーバー，ＭＥ）から入手した。
細胞系
Ｃ57ＢＬ／６起原のＢ１６黒色腫のＦ10.9クローンは、極めて転移性で、免疫原性の少ない且つクラスＩ発現性の低い細胞系である。Ｆ10.9／Ｋ１は、クラスＩ分子Ｈ−２ＫbｃＤＮＡでＦ10.9細胞をトランスフェクションすることによって得られた転移性の少ない且つ極めて免疫原性の細胞系である。ＲＭＡおよびＲＭＡ−Ｓ細胞は、Ｃ57ＢＬ／６（Ｈ−２b）起原のラッシャー白血病ウイルスに誘導されたＴ細胞リンパ腫ＲＢＬ−５に由来する。用いられた他の細胞系は、ＥＬ４（Ｃ57ＢＬ／６，Ｈ−２b，胸腺腫）、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ（ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）のｃＤＮＡでトランスフェクションされたＥＬ４細胞）、Ａ20（Ｈ−２dＢ細胞リンパ腫）およびＬ929（Ｈ−２k線維芽細胞）であった。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２５ｍＭヘペス、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足されたＤＭＥＭ中で維持された。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞は、４００μｇ／ｍｌのＧ418（GIBCO，グランド・アイランド，ＮＹ）を補足された培地中で維持され、そしてＦ10.9／Ｋ１細胞は、８００μｇ／ｍｌのＧ418を含有する培地中で維持された。
抗原提示細胞および応答動物Ｔ細胞
ナイーブＣ57ＢＬ／６の繁殖を退いた雌から得られた膵臓細胞を、塩化アンモニウムトリス緩衝液で３７℃において３分間処理して、赤血球を消耗させた。２×１０7個／ｍｌの膵臓細胞（３ｍｌ）を、２ｍｌメトリザマイド勾配カラム（Nycomed Pharma AS，オスロ，ノルウェイ；分析用，１００ｍｌのＰＢＳに対して加えられた１４．５ｇ，ｐＨ７．０）上に置き、そして６００ｇで１０分間遠心分離した。界面からの樹状細胞の豊富な部分を、９０分間の付着によって更に豊富にした。付着性細胞（大部分の樹状細胞（ＤＣ）および僅かな混入マクロファージ（Ｍφ））を静かに掻取ることによって回収し、そして２回目の付着を３７℃で９０分間行って、混入Ｍφを消耗させた。非付着性細胞は膵臓ＤＣとしてプールされ、そしてＦＡＣＳ分析は、約８０％〜８５％のＤＣ（ｍＡｂ ３３Ｄ１）、１〜２％のＭφ（ｍＡｂ Ｆ4/80）、１０％のＴ細胞および＜５％のＢ細胞（データは示されていない）を示した。
そのペレットを再懸濁させ、そして３７℃で各９０分間の２回の付着によってＭφを豊富にした。８０％を越える付着性集団は、ＦＡＣＳ分析により、５％のリンパ球および＜５５％のＤＣと共にＭφと識別された。
Ｂ細胞を、抗Ｉｇ被覆プレート上でパニング（panning）することによって非付着性集団（ＢおよびＴ細胞）から分離した。分離した細胞集団は、ＦＡＣＳ分析によって＞８０％のＴリンパ球を含んで成り、これを応答動物Ｔ細胞として用いた。
全およびポリＡ + 細胞ＲＮＡの単離
全ＲＮＡは、前に記載されたように（ChomczynskiおよびSacchi，1987，Analy.Biochem.162:156-159）、活発に成長する組織培養細胞から単離された。簡単にいうと、１０7個の細胞を、イソチオシアン酸グアニジニウム（ＧＴ）緩衝液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム，２５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０；０．５％サルコシル，２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール）１ｍｌ中で溶解させた。試料を回転させ後、３Ｍ酢酸ナトリウム１００μｌ、水飽和フェノール１ｍｌおよびクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）２００μｌを逐次的に加えた。懸濁液を回転させた後、氷上に１５分間置いた。それら試験管を１００００×ｇで４℃において２０分間遠心分離し、そしてその上澄みを新しい試験管に注意深く移した。等容量のイソプロパノールを加え、そして試料を２０℃で少なくとも１時間置いた。ＲＮＡは、上のような遠心分離によってペレット化された。そのペレットをＧＴ緩衝液３００μｌ中に再懸濁させた後、ミクロ遠心分離管に移した。等容量のイソプロパノールを加え且つその管を−２０℃で少なくとも１時間置くことによって、ＲＮＡを再度沈澱させた。それら管を高速で４℃において２０分間ミクロ遠心分離した。上澄みを傾瀉し、そしてペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。それらペレットを室温で乾燥させた後、ＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。そのＲＮＡ試料を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴおよび５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（Boehringer-Mannheim）中において３７℃で１５分間インキュベートすることにより、可能性のある混入ＤＮＡを除去した。その溶液を、１０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳおよび１ｍｇ／ｍｌプロナーゼ（Pronase）（Boehringer-Mannheim）に調整した後、３７℃で３０分間のインキュベーションを行った。試料をフェノール−クロロホルムで１回およびクロロホルムで１回抽出し、ＲＮＡをイソプロパノール中において−２０℃で再度沈澱させた。遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄した後、自然乾燥させ、そして滅菌水中に再懸濁させた。全ＲＮＡは、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を測定することによって定量された。ＯＤ２６０／２８０比は、典型的に、１．６５〜２．０であった。そのＲＮＡを−７０℃で貯蔵した。
ポリＡ+ＲＮＡは、OLIGOTEXTMポリＡ+精製キット（Qiagen）を用いて全ＲＮＡからかまたは、メッセンジャーＲＮＡ単離キット（Stratagene）を用いて組織培養細胞から直接的に、製造者のプロトコールによって単離された。所望ならば、別の慣用法を用いてポリＡ+ＲＮＡを製造することができる。
in vitro転写されたＲＮＡの製造
コード領域および３′非翻訳領域を含有するｐＵＣ１８（McReynoldsら，1978，Nature 273:723）中のニワトリオボアルブミンｃＤＮＡの１．９ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＧＥＭ４Ｚ（Promega）のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した。センスおよびアンチセンス両方の配向でインサートを含有するクローンを単離し、そしてMaxi Prep Kits TMプラスミド製造キット（Qiagen）を用いて大規模なプラスミドプレプを製造した。プラスミドは、in vitro転写の鋳型として用いるためにＢａｍＨＩで線状化された。転写は、MEGAscript In Vitro Transcription Kit TM（Ambion）を製造者のプロトコールにしたがって用い、そしてＧＴＰ濃度を１．５ｍＭに調整し且つ６ｍＭ ｍ7Ｇ（５1）ｐｐｐ（５1）Ｇキャップ類似体（Ambion）を含んで３７℃で３〜４時間行われた。他の慣用的なin vitro転写法も適している。鋳型ＤＮＡは、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ１で消化され、そしてＲＮＡは、フェノール：クロロホルムおよびクロロホルム抽出に続くイソプロパノール沈澱によって回収された。ＲＮＡをミクロ遠心分離によってペレット化し、そしてそのペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。そのペレットを自然乾燥かせ、そして滅菌水中に再懸濁させた。
ＲＮＡを、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＡＴＰおよび５０００Ｕ／ｍｌの酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（United States Biochemical）中において３０℃で３０間インキュベートした。キャップ付きのポリアデニル化ＲＮＡは、フェノール：クロロホルムおよびクロロホルム抽出に続くイソプロパノール沈澱によって回収された。ＲＮＡをミクロ遠心分離によってペレット化し、そしてそのペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。そのペレットを自然乾燥させ、そして滅菌水中に再懸濁させた。ＲＮＡは、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＯＤを測定することによって定量され、そしてそのＲＮＡを−７０℃で貯蔵した。
ＲＮアーゼＨによるオリゴデオキシヌクレオチドに支配されたＯＶＡ ｍＲＮＡの切断
オボアルブミンｍＲＮＡのＲＮアーゼＨ部位特異的切断に用いられた手順は、前に記載されたもの（Donis-Keller，1979，Nucl.Acid.Res.7:179-192）から適応された。簡単にいうと、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞からの５〜１０μｇのｍＲＮＡを、２０ｍＭヘペス−ＫＯＨ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣＬ2、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび、ＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号：６）をコードするＯＶＡ ｍＲＮＡ中の配列に対してハイブリッド形成する5'-CAG TTT TTC AAA GTT GAT TAT ACT-3'（配列番号：５）かまたは負の対照として役立つ5'-TCA TAT TAG TTG AAA CTT TTT GAC-3'（配列番号：７）（Oligos等）の２μＭのオリゴデオキシヌクレオチド中に懸濁させた。それら試料を５０℃まで３分間加熱した後、３７℃で３０分間のインキュベーションを行った。ＲＮアーゼＨ（Boehringer-Mannheim）を１０Ｕ／ｍｌで加え、そして消化を３７℃で３０分間進行させた。ＲＮＡは、フェノール：クロロホルムおよびクロロホルム抽出に続くイソプロパノール沈澱によって回収された。ＲＮＡをミクロ遠心分離によってペレット化し、そしてそのペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。次に、そのペレットを自然乾燥させ、そして滅菌水中に再懸濁させた。ＯＶＡ ｍＲＮＡの切断は、試験試料および対照試料のオリゴｄＴでプライムされた逆転写に続いて、切断部位に隣接するＯＶＡ特異的プライマーを用いるＰＣＲよって確認された。アクチン特異的プライマーを用いるＰＣＲは、試験試料と対照試料との間を調節するのに用いられた。
ＡＰＣのパルス
ＡＰＣを，Opti-ＭＥＭ培地（GIBCO，グランド・アイランド，ＮＹ）中で２回洗浄した。細胞をOpti-ＭＥＭ培地中に２〜５×１０6個／ｍｌで再懸濁させ、そして１５ｍｌポリプロピレン試験管（Falcon）に加えた。カチオン脂質ＤＯＴＡＰ（Boehringer-Mannheim Biochemicals，インディアナポリス，ＩＮ）を用いて、ＲＮＡを細胞中に供給した（Walkerら，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7915-7918）。ＲＮＡ（Opti-ＭＥＭ培地２５０〜５００μｌ中）およびＤＯＴＡＰ（Opti-ＭＥＭ培地２５０〜５００μｌ中）を、１２×７５ｍｍポリスチレン試験管中において室温（ＲＴ）で２０分間混合した。常套に用いられたＲＮＡ対ＤＯＴＡＰ比は１：２であったが、いくつかの実験では２：１〜１：２に変更された。その複合体を、２ｍｌの全容量のＡＰＣ（細胞２〜５×１０6個）に対して加え、そして水浴中において時々撹拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、そしてin vitroの一次ＣＴＬ誘導の刺激因子として用いた。
ニワトリオボアルブミンＯＶＡ中のＣＴＬエピトープａａ 257-264 ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｈ−２Ｋb）（配列番号：６）をコードしている合成ペプチドを、ペプチドパルス用に用いた。そのペプチドは、保護されていない（遊離）アミノおよびカルボキシル末端を有した（Research Genetics，バーミンガム，ＡＬ）。ペプチドを血清不含ＩＭＤＭ中に溶解させ、そして−２０℃で貯蔵した。
in vitroのＣＴＬ誘導
Ｔ細胞（５×１０6個／ｍｌ）およびＲＮＡまたはペプチドでパルスされたＡＰＣ（２．５×１０5個／ｍｌ）を、９６ウェルＵ字形底プレート中において、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５×１０-5Ｍ β−メルカプトエタノールを含むＩＭＤＭ中で培養して、２０：１のＲ／Ｓ比を与えた。５日後、細胞を、標準的な４時間ユーロピウム放出検定においてエフェクターとして用いた。
細胞障害性検定
これらの検定において、５〜１０×１０6個の標的細胞を、ジエチレントリアミンペンタ酢酸ユーロピウムで４℃において２０分間標識した。数回洗浄後、１０4個のユーロピウムで標識された標的およびエフェクター細胞の連続希釈を、５０：１〜６．２５：１のエフェクター：標的比で、９６ウェルＶ字形底プレート中において１０％熱失活ＦＣＳを含む２００μｌのＲＰＭＩ 1640中でインキュベートした。それらプレートを５００ｇで３分間遠心分離し、そして３７℃および５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。上澄み５０μｌを採取し、そしてユーロピウム放出を時間分解蛍光によって測定した（δフルオロメーター，Wallace Inc.，ゲイサーズバーグ，ＭＤ）。自然放出は２５％未満であった。三重反復試験培養の平均の標準誤差（ＳＥ）は５％未満であった。
免疫療法
Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡモデル：Ｃ57ＢＬ／６マウスを、照射ＲＮＡパルスＡＰＣ（細胞２×１０6個／マウス）または５×１０6個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ若しくはＥＬ４細胞で１回免疫感作した。免疫感作後１０〜１４日目に、マウスの側腹部に皮下注射される２×１０7個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ生細胞を試験投与した。マウスの腫瘍成長および寸法について一定の基準で監視した。腫瘍寸法が＞３．５ｃｍのマウスを屠殺した。生存動物は全て、試験投与後４０日目に屠殺された。
Ｆ10.9−Ｂ16黒色腫モデル：マウスに、足裏内注射によって２×１０5個のＦ10.9細胞を与えた。外科手術後プロトコールは、本質的に前に記載された通りであった（Porgadorら，1995，Cancer Res.55:4941-4949）。足裏の局所腫瘍が直径５．５〜７．５ｍｍになった時点で、それらマウスの脚部を切断した。切断後死亡率は５％未満であった。切断後２日目に、マウスの腹腔内に免疫感作した後、合計３回のワクチン接種のために週１回のワクチン接種を２回行った。マウスは、非免疫感作群または対照群における転移性死に基づいて屠殺された（切断後２８〜３２日目）。転移性荷重は、肺を秤量することによっておよび転移性結節の数を計数することによって検定された。
ニワトリオボアルブミンＲＮＡでトランスフェクションされた樹状細胞を用いるin vitroの一次ＣＴＬ応答の誘導
Ｃ57ＢＬ／６（Ｈ−２Ｋb）マウスに由来するＲＮＡでパルスされた膵臓樹状細胞（ＤＣ）のin vitroで一次ＣＴＬ応答を引き起こす能力を、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍系で示した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞は、ニワトリオボアルブミンｃＤＮＡを用いるトランスフェクションによってＥＬ４腫瘍細胞系（Ｈ−２Ｋbハロタイプ）から得られた（Mooreら，1988，Cell 54:777-785）。ニワトリオボアルブミンは、Ｃ57ＢＬ／６マウスのただ一つ優性なエピトープ（ａａ 257-264）をコードしている（Rotzschkeら，1991，Euro.Journal Immunology,21:2891-2891）。
ナイーブマウスからのＴ細胞と一緒にインキュベートされた、ＯＶＡペプチド（ａａ 257-264）でパルスされた樹状細胞は、in vitroで強力なＣＴＬ応答を引き起こす（図１）。この実験は、ＲＮＡを、ＤＣを感作する抗原源として用いて、ＣＤ８+Ｔ細胞に対して抗原を与えることができることを示す。膵臓ＤＣは、Ｃ57ＢＬ／６マウスから単離され、そしてＯＶＡペプチドでパルスされるかまたはニワトリオボアルブミンｃＤＮＡをコードしているプラスミドからin vitroで合成されたＲＮＡ（ＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡ）と一緒にインキュベートされ、そしてin vitroのＯＶＡ特異的一次ＣＴＬ応答を刺激するのに用いられた。図１で示されたように、ＯＶＡペプチドでパルスされたＤＣもＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡでパルスされたＤＣも、ＯＶＡ特異的一次ＣＴＬ応答を引き起こすことができた（図１）。ＲＮＡパルスＤＣは、一貫して、ペプチドパルスＤＣより有効な刺激因子であった。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞から単離されたＲＮＡが、一次ＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を刺激するようにＤＣを感作することができたかどうか調べるために、全ＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡを、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡまたはＥＬ４細胞から単離し、そしてＤＣと一緒にインキュベートした。図１で示されたように、ＥＬ４細胞からではなくＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞からの全ＲＮＡかまたはポリＡ+ＲＮＡでパルスされたＤＣは、強力なＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を引き起こすことができた。驚くべきことに、未分別のＲＮＡ、全ＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡでパルスされたＤＣは、明らかにされているＣＴＬエピトープをコードしているＯＶＡペプチドでパルスされたＤＣと同程度に強力な一次ＣＴＬ応答の誘導物質であった。（全またはポリＡ+）ＥＬ４ＲＮＡパルスＤＣによるＣＴＬ応答の刺激は、（ＯＶＡペプチドまたはＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡでパルスされたＤＣで刺激されたＣＴＬによるＥＬ４標的の溶解と比較して）バックグラウンドを最低限しか越えないし且つ統計的に有意でなく、ＯＶＡエピトープの免疫優性およびＥＬ４でコードされた抗原の相対的弱さを反映した。
図２で示されるように、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞から単離されたポリＡ-ＲＮＡ以外の全ＲＮＡもポリＡ+ＲＮＡも、一次ＣＴＬ応答を刺激するようにＤＣを感作することができる。ＤＣの感作がＲＮＡによって実際に媒介されることを実証するために、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞からのポリＡ+ＲＮＡを、ニワトリオボアルブミン遺伝子中に存在するただ一つのＣＴＬエピトープをコードしている配列に及ぶアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒にかまたは対照オリゴデオキシヌクレオチドと一緒にインキュベートした後、ＲＮアーゼＨで処理して、そのオリゴデオキシヌクレオチドがハイブリッド形成したＲＮＡ配列を全て除去した。図２で示されるように、一次ＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答の誘導は、ポリＡ+ＲＮＡを対照オリゴデオキシヌクレオチドではなくアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと一緒にインキュベートした場合に消滅した。図２は、完全なオボアルブミン遺伝子を発現する細胞、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞および、ただ一つ優性なＣＴＬエピトープをコードしている８アミノ酸長さＯＶＡペプチドでパルスされたＲＭＡ−Ｓ細胞が、全またはポリＡ+Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ ＲＮＡでパルスされたＤＣによる刺激後に、同様の程度まで溶解されるということも示している。これは、したがって、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ ＲＮＡパルスＤＣによって与えられたエピトープの大部分が、ニワトリオボアルブミン遺伝子中でコードされた以前に明らかにされたただ一つ優性なＣＴＬエピトープに対応することを示している。
腫瘍ＲＮＡでパルスされたＤＣによる抗腫瘍免疫の誘導
この実施例は、ＯＶＡ ＲＮＡパルスＤＣを用いるマウスのワクチン接種が、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍細胞を用いる試験投与に対して防御を与えたことを示す。マウスは、２×１０6個のＲＮＡパルスＤＣでまたは５×１０6個の照射Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞で１回免疫感作された。１０日後、マウスに腫瘍形成性量のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を試験投与した。腫瘍の外観および寸法を一定の基準で測定した。図３は、腫瘍移植後３７日目の腫瘍の寸法を示す。照射ＥＬ４細胞で免疫感作されたマウスの平均腫瘍寸法は２５ｃｍであったが、ＯＶＡ発現性ＥＬ４細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）で免疫感作された動物の平均腫瘍寸法は僅か７．０３ｃｍであった。この差は、ＥＬ４細胞で発現されたニワトリＯＶＡ抗原の高い免疫原性および親のＥＬ４腫瘍細胞系の不十分な免疫原性の反映である。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞に由来するＲＮＡ（全またはポリＡ+部分）でパルスされたＤＣを用いるワクチン接種は、極めて免疫原性のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を用いるワクチン接種と同程度に有効であった（平均腫瘍寸法７ｃｍ）。ＥＬ４腫瘍細胞に由来する全またはポリＡ+ＲＮＡと一緒にインキュベートされたＤＣを用いるワクチン接種は、僅かな防御作用があり（平均腫瘍寸法：それぞれ２２ｃｍおよび１９．５ｃｍ）、これは統計的に有意ではなかったが、ＥＬ４由来抗原の不十分〜検出不能な免疫原性と一致した。一次ＣＴＬ誘導データ（図１）と一致して、ＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡパルスＤＣを用いるマウスのワクチン接種は、最も有効な抗腫瘍応答を与えたが（平均腫瘍寸法：３．９ｃｍ）、対照アンチセンスＯＶＡ ＩＶＴ ＲＮＡを用いるワクチン接種は、有意の防御応答を引き起こさなかった。
腫瘍由来ＲＮＡでパルスされたＤＣの効力は、Ｂ16／Ｆ10.9（Ｈ−２b）黒色腫転移モデルにおいて更に評価された。Ｂ16／Ｆ10.9黒色腫腫瘍は、免疫原性が少なく、低レベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現し、そして実験および自然の転移検定システム双方において極めて転移性である（Porgadorら，1996，J.Immunology 156:1772-1780）。Porgadorらは、ワクチン接種が一次腫瘍移植片の除去後に行われる場合、ＩＬ−２およびＨ−２Ｋb遺伝子両方で形質導入された照射腫瘍細胞だけが、肺におけるＢ16／Ｆ10.9腫瘍細胞の転移拡散に有意に影響を与えることができるということを示した（Porgadorら，1995，Cancer Research 55:4941-4949）。したがって、Ｂ16／Ｆ10.9黒色腫モデルおよびPorgadorらによって用いられた実験計画は、転移性癌のアジュバント処置の有効性を評価する厳格な且つ臨床的に適切な実験系を構成する。
本発明による腫瘍ＲＮＡパルスＤＣを用いる免疫感作が、既存の肺転移の後退を引き起こすことができたことを実証するために、足裏のＢ16／Ｆ10.9腫瘍細胞の移植によって一次腫瘍を誘導した。足裏が直径５．５〜７．５ｍｍに達した時点で、それら腫瘍を外科手術によって除去した。２日後、マウスは、照射Ｂ16／Ｆ10.9細胞、Ｈ−２Ｋb遺伝子で形質導入された照射Ｂ16／Ｆ10.9細胞（Ｆ10.9Ｋ１）またはＲＮＡパルスＤＣ標品で免疫感作された（図４）。マウスは、１週間間隔で与えられる全部で３回のワクチン接種を受けた。正常マウスの平均肺重量は０．１８〜０．２２ｇである。ＰＢＳ（負対照）で処置されたマウスは、転移によって圧倒された。この実験群のマウスの平均肺重量は０．８１ｇであったが、その重量の約４分の３は転移によって与えられており、これらは多すぎて計数できなかった（＞１００個の結節）。同様の転移荷重は、マウスを照射Ｂ16／Ｆ10.9細胞で処置した場合に見られたが（データは示されなかった）、これは、照射Ｂ16／Ｆ10.9腫瘍細胞単独での処置にはこの腫瘍モデルにおいて治療上の利点がなかったという多数の前の知見を確証している。前にも示されたように、Ｈ−２Ｋb発現性Ｂ16／Ｆ10.9細胞（Ｆ10.9Ｋ１、正対照として）での免疫感作には、この処置群の動物の平均肺重量の統計的に有意の減少によって示されるように、適度の治療上の利点があった。しかしながら、本発明によるＦ10.9細胞に由来する全ＲＮＡでパルスされたＤＣで処置された動物において、劇的な応答が見られた。この処置群のマウスの平均肺重量は０．３７ｇであった。本発明によるＦ10.9細胞に由来するポリＡ+ＲＮＡでパルスされたＤＣで処置されたマウスでも、有意の劇的な応答が見られた（平均肺重量：０．４２ｇ）。対照的に、Ｆ10.9細胞に由来するポリＡ-ＲＮＡ部分でかまたはＥＬ４腫瘍細胞から単離された全ＲＮＡでパルスされたＤＣで処置されたマウスでは、転移荷重の統計的に有意の減少は見られなかった。
ＯＶＡタンパク質を発現する細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）またはＯＶＡペプチドでパルスされた細胞はＣＴＬによって有効に溶解されたという知見、およびポリＡ+ＲＮＡと一緒に分別されたＤＣの感作は、ＣＴＬのＲＮＡに媒介された刺激が、導入ＲＮＡの翻訳、および予想上のクラスＩ制限エピトープ、この場合、ニワトリＯＶＡペプチド中でコードされたただ一つ優性なエピトープの発生によって起こることを示唆する。これらデータは、ＤＣのＲＮＡに媒介された感作が、トランスフェクションされたＲＮＡは抗原性ペプチドの製造用の連続的な源として役立ちうるので、ペプチドを用いるパルスより有効であることを示している。
治療的使用
本発明を用いて、患者の腫瘍形成（例えば、黒色腫腫瘍、膀胱腫瘍、乳癌腫瘍、結腸癌腫瘍、前立腺癌腫瘍および卵巣癌腫瘍）を治療できるしまたは予防できる。同様に、本発明を用いて、細菌（例えば、サルモネラ属、赤痢菌属またはエンテロバクター属）またはウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスまたは風疹ウイルス）などの病原体による患者の感染を治療できるしまたは予防できる。
患者の腫瘍形成または病原体感染を治療するまたは予防する場合、その患者に対して投与される１種類または複数の細胞は、その患者に由来する必要がない。したがって、抗原提示細胞は、適合したドナーからまたはin vitroで増殖した細胞の培養物から得ることができる。ハロタイプを適合させる方法は、当該技術分野において知られている。同様に、ＲＮＡは、処置される患者に由来する必要がない。ドナーからのＲＮＡを用いることができる。
処置は、腫瘍形成または感染の前または開始時に始め、そしてその癌または感染が改善されるまで続けることが好ましい。しかしながら、本明細書中で記載の実施例で詳しく説明しているように、本発明は、腫瘍の後退を引き起こすことができるので、本発明は、腫瘍が形成された後でも用いるのに適している。本発明によって製造された細胞またはワクチンで患者を処置する場合、そのワクチンまたは細胞の最適用量は、哺乳動物の体重、癌または感染の重症度およびＣＴＬエピトープの強さなどの因子に依存する。概して、ＲＮＡ添加抗原提示細胞１０5〜１０8個／ｋｇ（体重）、好ましくは、１０6〜１０7個／ｋｇ（体重）の用量を、患者に対して薬学的に許容しうる賦形剤中で投与すべきである。細胞は、癌治療法で一般的に用いられる注入技術を用いることによって投与することができる（例えば、Rosenbergら，New Eng.J.of Med.319:1676，1988を参照されたい）。具体的な患者のための最適用量および治療計画は、疾患の微候について患者を監視し、そしてそれによって処置を調整することにより、当医療業者が容易に決定できる。
抗原提示細胞を用いてin vitroのＣＴＬ応答を引き起こす場合、得られたエフェクターＣＴＬは、ＣＴＬに基づく治療法において哺乳動物に対して引続き投与することができる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ91/06441号を参照されたい）。本発明の抗原提示細胞を用いてin vitroで生産されたＣＴＬは、慣用的な注入法を用いることによって哺乳動物に対して薬学的に許容しうる賦形剤中で投与することができる（例えば、Rosenbergら，上記を参照されたい）。典型的に、１０9〜１０10個の細胞を３０分間にわたって投与し、必要に応じて処置を繰返す。このようなＣＴＬに基づく治療法は、本発明の抗原提示細胞の直接投与などの他の方法と組合わせることができる。ＣＴＬおよび抗原提示細胞は、治療を受ける患者に対して自己であってよいしまたは異種であってよい。所望ならば、その処置は、ＣＴＬ増殖を促進するマイトジェン（例えば、フィトヘマグルチニン）またはリンホカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−４）の投与を含んでもよい。
Claims (14)
- 腫瘍特異的エピトープをその表面上に提示する、ＲＮＡ添加抗原提示細胞（ＡＰＣ）を製造する方法であって、
腫瘍エピトープ又は抗原をコードする腫瘍特異的又は腫瘍由来ＲＮＡを含むＲＮＡをin vitroでＡＰＣ中に導入し、それによって、Ｔ細胞増殖を引き起こすように腫瘍特異的エピトープをその表面上に提示するＲＮＡ添加ＡＰＣを製造する、ことを含む上記方法。 - 病原体特異的エピトープをその表面上に提示する、ＲＮＡ添加抗原提示細胞（ＡＰＣ）を製造する方法であって、
病原体エピトープ又は抗原をコードするＲＮＡをin vitroでＡＰＣ中に導入し、それによって、Ｔ細胞増殖を引き起こすように病原体特異的エピトープをその表面上に提示するＲＮＡ添加ＡＰＣを製造する、ことを含む上記方法。 - 前記ＲＮＡが、黒色腫、膀胱癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌又は卵巣癌に特異的である、請求項１記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、ウイルスに特異的である、請求項２記載の方法。
- 前記ウイルスが、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス又は風疹ウイルスである、請求項４記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、サルモネラ属、赤痢菌属およびエンテロバクター属から成る群より選択される細菌に特異的である、請求項２記載の方法。
- 前記ＲＮＡが腫瘍特異的又は病原体特異的である、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＡＰＣが樹状細胞である、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが以下の性質のうち１又はそれより多くを有するものである、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法：
Ｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡを含む；
細胞質ＲＮＡを含む；
核ＲＮＡを含む；
ミニ遺伝子を含む；
細胞から単離されたものである；
凍結組織から単離されたものである；
核酸増幅を含む方法によって調製されたものである；
in vitro転写を含む方法によって調製されたものである；
ｃＤＮＡから転写されたものである；
クローン化ｃＤＮＡから転写されたものである；又は
カチオン脂質と混合されているものである。 - 前記ＲＮＡが、前記ＲＮＡにおいてコードされている抗原性エピトープを細胞内の小胞体、リソソーム又はエンドソームに導く、細胞輸送用シグナル配列もコードする、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
- 細胞輸送用シグナルが、ＬＡＭＰソーティングシグナルである、請求項１０記載の方法。
- 前記細胞輸送用シグナルが、ＫＤＥＬ（配列番号：１）；ＫＦＥＲＱ（配列番号：２）；ＱＲＥＫ（配列番号：３）；ＭＡＩＳＧＶＰＶＬＧＦＦＩＩＡＶＬＭＳＡＱＥＳＷＡ（配列番号：４）；あるいは、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＬから成る群より選択される４個の残基が片側に隣接したＱを含むペンタペプチドである、請求項１０記載の方法。
- ＡＰＣが、サイトカイン又は補助刺激因子から選択されるイムノモジュレーターをコードするＲＮＡを更に含む、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
- 腫瘍抗原を提示する細胞に対して細胞障害性である細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を製造する方法であって、
Ｔリンパ球を与え；
該Ｔリンパ球を、請求項１記載の方法によって調製されたＲＮＡ添加ＡＰＣとin vitroで接触させ；そして
該Ｔリンパ球を、ＣＴＬ増殖を導く条件下で維持し、それによって、腫瘍抗原を提示する細胞に対して細胞障害性であるＣＴＬを製造することを含む上記方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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