JP3998043B2 - アゴニストペプチド二量体 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、細胞表面レセプターのアゴニスト及びアンタゴニストの二量化に向けられ、特に、二量体の形態で細胞表面レセプターのアゴニストとして挙動するペプチド二量体に向けられる。そのようなレセプターは、成長及び分化因子のレセプターにおいて屡々観察される二量化介在型活性クラスに属する。このクラスのレセプターのアゴニストはレセプターの二量化を遂行しこうしてシグナル開始を遂行するものと、理解されている。
本発明は、コアアミノ酸配列
Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
式中、各々のアミノ酸は標準的な一文字の略号で示され；Ｘ₃はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃであることができ；Ｘ₄はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであることができ；Ｘ₅はＭ、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₆は独立して遺伝的にコードされた２０個のＬ-アミノ酸または立体異性Ｄ-アミノ酸のいずれか１つから選択され；Ｘ₇はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃであることができるが、但し、Ｘ₃またはＸ₈のいずれかはＣまたはＨｏｃである、
を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）アゴニスト及びアンタゴニストの二量体を例示する。
発明の背景
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、分子量が約３４０００ダルトンの糖タンパク質ホルモンである。哺乳類の肝臓中で合成されるＥＰＯの主たる役割は、赤血球前駆細胞の分裂細胞分割と分化を刺激することである。結果として、ＥＰＯは、赤血球の産出を刺激し且つ調整する機能を果たす。赤血球及びそれに含まれるヘモグロビンは身体に酸素を供給するのに中心的な役割を果たす。こうして、赤血球の産出の刺激により、血液の酸素運搬能力の増大が可能となる。
通常の状態では、ＥＰＯは、血漿中に非常に低い濃度で存在する。しかし、低酸素症の状態では、循環におけるＥＰＯの量は、減少したＯ₂血液濃度に応答して増大する。低酸素症は、大量の血液の損失、放射線への過剰暴露もしくは化学療法剤による赤血球の破壊、高い高度もしくは長期の無意識疾患による酸素摂取量の減少を含む種々の疾患から、或いは種々の形態の貧血症によって引き起こされる。低酸素症が緩和されるにつれて、ＥＰＯの産出量は低減する。
赤血球形成におけるＥＰＯの本質的な役割の故に、該ホルモンは、少ないかまたは欠乏した赤血球産出によって特徴づけられる血液疾患の診断または処置に有用である。最近の諸研究は、下記に含まれるような種々の疾患、障害及び血液学的不整（hematologic irregularity）に対するＥＰＯ治療の有効性の基礎を提供する。
ベーターサラセミア（Vedovato et al．（１９８４）Acta．Haematol．７１：２１１−２１３）；嚢胞性線維症（See，Vichinsky et al．（１９８４）J．Pediatric １０５：１５−２１；妊婦及び月経の障害（See，cotes et al．（１９８３）Brit．J．Ostet．Gyneacol．９０：３０４−３１１）；early anemia of prematurity(See，Haga et al．（１９８３）Acta Pediatr．Scand．７２：８２７−８３１）；脊髄障害（Claus-Walker et al．（１９８４）Arch．Phvs．Med．Rehabil．６５：３７０−３７４参照）；宇宙飛行（Dunn，et al．（１９３４）Eur．J．Appl．Phvsiol．５２：１７８−１８２参照）；急性血液損失（Miller et al．（１９８２）Brit．J．Haematol．５２：５４５−５９０参照）；aging（Udupa et al．（１９８４）J．Lab．Clin．Med．１０３：５７４−５８８参照）；異常な赤血球造血に伴う種々の腫瘍性疾患（Dainiak et al．（１９８３）Cancer ５：１１０１−１１０６参照）；and腎不全（Eschbachet al．（１９８７）N．Eng．J．Med．３１６：７３−７８参照）。
精製された同質のＥＰＯは特性決定されているが、ＥＰＯ誘導赤芽球増殖及び分化のメカニズムについては殆ど知られていない。ＥＰＯと、未成熟赤血球、血小板及び巨核球の前駆細胞との特定の相互作用は記載されていない。この理由の一部は、通常の赤芽球上のまたは赤白血病細胞系上の表面ＥＰＯレセプター分子の数が少くないからである。
Krantz and Goldwasser（１９８４）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，８１：７５７４−７５７８；Branch et al．（１９８７）Blood ６９：１７８２−１７８５；Mayeux et al．（１９８７）FEBS Letters ２１１：２２９−２２３；Mufson and Gesner（１９８７）Blood ６９：１４８５−１４９０；Sakaquchi et al．（１９８７）Biochem．Biophys．Res．Commun．１４６：７−１２；Sawyer et al．（１９８７）Proc．Natl．Acad．Sci．USA ８４：３６９０−３６９４；Sawyer et al．（１９８７）J．Biol．Chem．２６２：５５５４−５５６２；and Todokoro et al．（１９８８）Proc．Natl．Acad．Sci．USA ８４：４１２６−４２３０を参照）。
ネズミ及びヒトのＥＰＯレセプタータンパク質のＤＮＡ配列及びコード化されたペプチド配列が記載されている。D'Andrea et al．ＰＣＴ特許公開Ｎｏ．ＷＯ ９０／０８８２２（１９９０年公開）を参照。
ＥＰＯレセプター（ＥＰＯ-Ｒ）は、リガンド誘導型タンパク質の二量化によって活性化される成長因子型クラスに属する。他のホルモン並びにサイトカイン、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）及びインシュリンが２つのレセプターを架橋し、その結果として２つの細胞質尾部が並置することができる。これらの二量化活性型レセプターの多くは、細胞質尾部内にタンパク質キナーゼ・ドメインを有しており、二量化の際に、隣接する尾部をリン酸化する。幾つかの細胞質尾部は固有のキナーゼ活性を欠いているのに対して、それらはタンパク質キナーゼと協同的に機能する。ＥＰＯレセプターは後者の型である。各々の場合に、リン酸化によりシグナル経路が活性化される。
本発明に従い、例えばＥＰＯ-Ｒのような二量化介在型レセプターのペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを二量化すると、“単量体”アゴニストの生物活性に較べて生物活性が増大し、これらの二量体がアゴニストとして機能して生物活性を示すように、アンタゴニストの性質を変えることが発見された。
発明の概要
第一の態様において、本発明は、細胞表面レセプターのアゴニストとして挙動するペプチド二量体に向けられる。該二量体は成長因子型レセプターの結合及びシグナル開始をなさしめる。
１つの態様において、本発明は、ＥＰＯアゴニストとして挙動するペプチド二量体を提供する。これらの二量体は、コアアミノ酸配列
Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
式中、各々のアミノ酸は標準的な一文字の略号で示され；Ｘ₃はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃであることができ、ここで、Ｈｏｃはホモシステインであり；Ｘ₄はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであることができ；Ｘ₅はＭ、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₆は独立して遺伝的にコードされる２０個のＬ-アミノ酸または立体異性Ｄ-アミノ酸のいずれか１つから選択され；Ｘ₇はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができるが、但し、Ｘ₃またはＸ₈のいずれかはＣまたはＨｏｃである、
を含む、１０〜４０個またはそれ以上のアミノ酸、好ましくは１４〜約２０残基鎖長のアミノ酸からなる２つの“単量体”ペプチド単位を有する。好ましくは、二量体の単量体ペプチド単位は、コア配列
ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
式中、各々のアミノ酸は標準的な一文字の略号で示され；Ｘ₂及びＸ₆の各々は独立して遺伝的にコードされた２０個のＬ-アミノ酸のいずれか１つから選択され；Ｘ₃はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができ；Ｘ₄がＲ、Ｈ、ＬまたはＷであることができ；Ｘ₅はＭ、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₇がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができるが、但し、Ｘ₃またはＸ₈のいずれかはＣまたはＨｏｃである、
を含む。
より好ましくは、二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列 Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
式中、各々のアミノ酸は標準的な一文字の略号で示され；Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₆、Ｘ₉、Ｘ₁₀及びＸ₁₁の各々は独立して遺伝的にコードされた２０個のＬ-アミノ酸のいずれか１つから選択され；Ｘ₃はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができ；Ｘ₄はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであり；Ｘ₅はＭ、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₇はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができるが、但し、Ｘ₃またはＸ₈のいずれかはＣまたはＨｏｃである、
を含む。
より好ましい態様において、Ｘ₃及びＸ₈の双方はＣであり、こうして二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列
Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
を含む。
より好ましくは、単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列
Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
式中、Ｘ₄はＲまたはＨであることができ；Ｘ₅はＦまたはＭであることができ；Ｘ₆はＩ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶであることができ；Ｘ₇はＤまたはＶであることができ；Ｘ₉はＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴであることができ；Ｘ₁₀はＡ、Ｇ、Ｐ、ＲまたはＹであることができる、
を含む。
最も好ましい態様において、二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列
Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
式中、Ｘ₁はＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであることができ；Ｘ₂はＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ及びＴであることができ；Ｘ₄はＲまたはＨであり；Ｘ₉はＫ、Ｒ、ＳまたはＴであることができ；Ｘ₁₀はＰである、
を含む。
特に好ましい二量体の単量体ペプチド単位は、

を含む。
他の特に好ましい本発明の二量体の単量体ペプチド単位は、
（ＡＸ₂）_nＸ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
式中、Ｘ₂〜Ｘ₈は本明細書で既述されたとおりであり（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ｎは０または１であり、そしてＡはＹ（チロシン）を除く、天然源のＬ-アミノ酸のいずれか１つであり、ｎは本明細書においてコア配列において０または１であることができる（ＡＸ₂）の出現数（the number of occurrence）であると規定される、
を含むペプチドを含んでなる。
（ＡＸ₂）が存在する場合には、すなわち、ｎ＝１である場合には、Ａはチロシンではなく、またいずれかの非天然源の芳香族アミノ酸類似体でもない。そのような本発明の二量体の単量体ペプチド単位は、例えば、図９のペプチドを、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜９３のＮ-末端からＹ（チロシン）残基まで切除することによって調製することができる。そのような単量体ペプチドは、また、図９のペプチドのＡ位をＹで置換することにより調製することもできる。
本発明においては、二量体の単量体単位は、同一であっても相異なっていてもよい。
好ましい態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、共有結合を介して本発明の二量体ペプチドを形成するためのリンカーとして採用される。
別の態様において、本発明は、本発明の二量体ペプチドの少なくとも１つ及び製薬学的キャリヤーを含む製薬学的組成物に向けられる。
更なる態様において、本発明は、本発明の二量体ペプチドの少なくとも１つを投与することにより、ホルモンまたは成長因子の欠乏に起因する疾患を有する哺乳類を治療する方法を提供する。
別の更なる態様において、本発明は、ＥＰＯの欠乏に起因するか或いは赤血球数の減少によって低減した血液酸素濃度に起因する疾患を有する哺乳類を治療する方法を提供する。
本発明の別の態様において、細胞表面レセプターまたは二量化介在型レセプターのクラスのアゴニストを二量化し、これにより、単量体アゴニスト（二量体はこれに由来する）に較べて細胞表面レセプターのインビトロまたはインビボでの生物活性を促進させる、細胞表面レセプターのアゴニストの調製方法が提供される。さらに、この方法は、そのような成長因子型レセプターのアンタゴニストの二量化による、そのようなレセプターのアゴニストの調製にも向けられる。こうして二量化された“アンタゴニスト”はインビトロまたはインビボでアゴニスト生物活性を示す。好ましい態様において、本発明の方法は、単量体ＥＰＯ-ＲアンタゴニストからのＥＰＯ-Ｒ二量体アゴニストの調製にも向けられる。
簡単な図面の説明
図１は、保持時間３７分での二量化ＥＰＯペプチド、ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の主要ピークを示す。
図２は、二量化ＥＰＯペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の精製後の、保持時間４８分での主要ピークを示す。
図３は、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）及びＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）を含む二量化ペプチドのＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトル分析を示す。
図４は、ＥＰＯアゴニストペプチドの存在下または不存在下でのＥＰＯ結合タンパク質（ＥＢＰ）のＤＰＤＰＢ架橋のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す。
図５は、平衡ＥＰＯ結合対固定化ＥＰＯ結合タンパク質を示す。パネルＡは平衡結合データを示し、そしてパネルＢ（挿入部）はパネルＡのデータを線形変換（スキャッチャード）したものである。
図６は、ＥＢＰビーズに対しての［¹²⁵Ｉ］ＥＰＯとの競合的結合についての、ＥＰＯアゴニストペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）上で行った競合的結合測定の結果（パネルＡ）；並びにヒト（パネルＢ）またはネズミ（パネルＣ）ＥＰＯレセプターのいずれかを含むＦＤＣ-Ｐ１由来の細胞系におけるＥＰＯ応答性細胞増殖研究の結果を示す。
図７は、過低酸素症（exhypoxic）マウスのバイオアッセイ；ＥＰＯによる新生赤血球内への［⁵⁹Ｆｅ］の取り込みの刺激の結果［ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（パネルＡ）及びペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）二量体（パネルＢ）］を示すグラフである。
図８は、ヒトのＥＰＯレセプターを含むＦＤＣ-Ｐ１由来細胞系での、ＥＰＯ応答性細胞増殖研究におけるペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）のＰＥＧ二量化の効果を示す。
図９は、典型的な本発明の単量体ペプチドの配列を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、細胞表面レセプターのアゴニストとして挙動するペプチド二量体に関する。この二量体は、成長因子型レセプターの結合及びシグナル開始をなさしめるものである。リガンド誘導型二量化またはリガンド安定化二量化によって活性化されるものと理解され、屡々、細胞表面レセプター、成長因子型レセプターまたは二量化介在型アクチベーター-レセプターと呼ばれる分子のクラスがある。そのようなレセプターのアゴニストは、典型的には、サイトカイン、インシュリン及び種々の他の成長または分化因子を含む大量のポリペプチドホルモンを含む。アゴニストは、レセプターの二量化を誘導することによりシグナル開始を遂行するものと理解されている。そのようなアゴニストは効率的に２つのレセプターを架橋し、結果として細胞質尾部の位置を変え、これにより直接的または間接的に細胞質尾部のリン酸化及びシグナル経路の活性化を遂行するものと信じられている。
本発明は、特に、本発明に従って二量化されたときに、細胞表面レセプターのアゴニストとして挙動する分子を含む。そのような二量体アゴニストは“単量体”単位を含むことができる。該“単量体”単位は、関連するレセプター分子に対してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すものであり、同一であっても相異なっていてもよい。二量体は、好ましくはペプチドであるが、或いは小分子のファーマコホア（pharmacophore）であってもよい。これらの分子は、二量化されたときに、インビトロまたはインビボで細胞表面レセプターのアゴニスト活性を示す。そのようなレセプターには、例えば、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、インシュリン及びＦＧＦが含まれる。
さらに、ＩＬ-３、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-２及びＴＰＯを含む、ヘテロ二量化または多量化によって活性化される他のペプチドを、このメカニズムによる活性化に付することができる。本発明の二量体は、１０〜４０個またはそれ以上のアミノ酸、好ましくは１４〜約２０個のアミノ酸残基鎖長からなる２つの“単量体”ペプチド単位を有する。
好ましい態様において、これらの単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列
Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
式中、各々のアミノ酸は標準的な一文字の略号で示され；Ｘ₃はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができ；Ｘ₄はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであることができ；Ｘ₅はＭ、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₆は独立して遺伝的にコードされる２０個のＬ-アミノ酸または立体異性Ｄ-アミノ酸のいずれか１つから選択され；Ｘ₇はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができるが、但し、Ｘ₃またはＸ₈のいずれかはＣまたはＨｏｃである、
を含む。
好ましくは、二量体の単量体ペプチド単位は、コア配列
ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
式中、各々のアミノ酸は標準的な一文字の略号で示され；Ｘ₂及びＸ₆の各々は独立して遺伝的にコードされた２０個のＬ-アミノ酸のいずれかから選択され；Ｘ₃はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができ；Ｘ₄がＲ、Ｈ、ＬまたはＷであることができ；Ｘ₅はＭ、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₇がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができるが、但し、Ｘ₃またはＸ₈のいずれかはＣまたはＨｏｃである、
を含む。
より好ましくは、二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列
Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
式中、各々のアミノ酸は標準的な一文字の略号で示され；Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₆、Ｘ₉、Ｘ₁₀及びＸ₁₁の各々は独立して遺伝的にコードされた２０個のＬ-アミノ酸のいずれかから選択され；Ｘ₃はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができ；Ｘ₄はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであることができ；Ｘ₅がＭ、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₇はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはＨｏｃ（ここで、Ｈｏｃはホモシステインである）であることができるが、但し、Ｘ₃またはＸ₈のいずれかはＣまたはＨｏｃである、
を含む。
より好ましい態様において、Ｘ₃及びＸ₈の双方はＣであり、こうして二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列
Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
を含む。
より好ましくは、単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列
Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
式中、Ｘ₄はＲまたはＨであることができ；Ｘ₅はＦまたはＭであることができ；Ｘ₆はＩ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶであることができ；Ｘ₇はＤまたはＶであり；Ｘ₉はＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴであることができ；そしてＸ₁₀はＡ、Ｇ、Ｐ、ＲまたはＹであることができる、を含む。
最も好ましい態様において、二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸のコア配列
Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
式中、Ｘ₁はＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであることができ；Ｘ₂はＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ及びＴであることができ；Ｘ₄はＲまたはＨであり；Ｘ₉はＫ、Ｒ、ＳまたはＴであることができ；そしてＸ₁₀はＰである、
を含む。
特に好ましい本発明の二量体の単量体ペプチド単位には下記するものが含まれる。

本発明の二量体ペプチドは、単量体アゴニスト（これから二量体ペプチドが誘導される）に較べて、インビボまたはインビトロでの増大された生物学活性（biological potency）を示す。さらに、細胞表面レセプターアンタゴニストは、本発明に従って、細胞表面レセプターアゴニストに変換し得る。特に、細胞表面レセプターアンタゴニストは、ＰＥＧまたは他の適宜のリンカーにより二量化でき、これにより、単量体部分のレセプターとの相互結合が許容される。結果として、二量体は標的レセプターに対して有効な結合を示し、アゴニストとして挙動する。従って、本発明の二量体は、それらの単量体の形態に較べて、増大したインビボまたはインビトロでの生物活性を示す。
本発明の二量体ペプチドは、細胞表面レセプターに結合するかまたは細胞表面レセプターを生物学的に活性化させるか或いはアゴニストとして挙動するものであり、そして好ましくは、リンカーとしてポリエチレングリコールを用いて、本明細書中に記載された単量体ペプチド単位間で形成される。他の公知の高分子性化合物の使用を含めた、他の慣用の化学システムを採用することも可能であるが、ペジレーション（pegy-lation）が好ましい。
本発明の結合用化合物（リンカー）には、適宜の距離で単量体ペプチドを共有結合させるか、或いは特定の細胞表面レセプターの二量化を遂行してこれにより生物活性をスタートさせるどのような分子も含まれる。
まず、遊離のアミノ基或いは例えばヒドロキシル、カルボン酸もしくはスルフヒドリルのような他の反応性部位を含む適宜の合成ペプチドについて説明すると、対応する反応性ポリマーを含む反応混合物に、ペプチドを過剰に加える。ポリマーは、例えばポリエチレングルコール、ペプチド、改変（modified）ペプチドまたはペプチド類似体のような、繰返し性を有する。或いは、ペプチドを、例えば活性ベノジアゼピン（benodiazepin）、オキサゾロン（oxazolone）、アザラクトン、アミニミド（aminimide）またはジケトピペラジンのような小分子スカフォールド（scaffold）上で二量化することもできる。最も容易に入手し得る可変距離を有するリンカーは、線状非分枝のポリエチレングルコールに基づくものである。
二量体ペプチドの単量体単位間のリンカーとしてＰＥＧスクシンイミジル（succinimidyl）プロピオネートを用いる好ましい合成方法の式を下記に示す。

単量体ペプチドの内部共有結合よりも、頭部対頭部（アミノ末端対アミノ末端）または頭部対尾部（アミノ末端対カルボキシル末端）配置での二量化、特にペジレーション（pegylation）が好ましい。本発明の二量体ペプチドの“単量体”単位は同一であっても相異なっていてもよいが、同一である方が好ましい。
本発明の二量体を形成するのに使用する単量体ペプチドは、当業者に周知である古典的な化学的方法で調製することができる。標準的な方法には、例えば、エクスクルーシブ（exclusive）固相合成法及び組換えＤＮＡ法が含まれる。例えばMerrifield（1963）J．Am．Chem．Soc．８５：２１４９を参照されたい。固相合成は、典型的にはα-アミノ保護樹脂を用いて、ペプチドのＣ末端から開始される。好適な出発物質は、要求されるα-アミノ酸を、クロロメチル化樹脂（例えばＢＩＯ-ＢＥＡＤＳ ＳＸ-１，Bio Rad Laboratories，Richmonod，ＣＡ）、ヒドロキシル樹脂（Bodonszky et al．（1966）Chem．Ind．（London）38:1597に記載された）またはベンゾヒドリルアミン樹脂（Pietta and Marshall（1970）Chem．Commn．650に記載された）に付着させることにより調製することができる。
α-アミノ保護基は、ペプチドの段階的合成の技術において有用であると知られているものである。これには、アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）及び置換Cbz］、脂肪族ウレタン型保護基［例えば、t-ブチルオキシカルボニル（Boc）、イソプロピオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］並びにアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が含まれる。好ましいＸ-アミノ酸保護基は、Ｆｍｏｃである。側鎖保護基（典型的には、エーテル、エステル、トリチル、ＰＭＣなど）は、カップリングの際にそのまま残り、アミノ末端保護基の脱保護またはカップリングの際に分断されない。側鎖保護基は、最終ペプチドの合成が完了した際に、標的ペプチドを改変しない条件下で、除去されなければならない。
Ｔｙｒの側鎖保護基には、テトラヒドロピラニル、t-ビチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、Ｚ-Ｂｒ-Ｃｂｚ及び２，５-ジクロロベンジルが含まれる。Ａｓｐの側鎖保護基には、ベンジル、２，６-ジクロロベンジル、メチル、エチル及びシクロヘキシルが含まれる。Ｔｈｒ及びＳｅｒの側鎖保護基には、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６-ジクロロベンジル及びＣｂｚが含まれる。好ましいＴｈｒ及びＳｅｒの側鎖保護基はベンジルである。Ａｒｇの側鎖保護基には、ニトロ、Ｔｏｓｙ．（Ｔｃｓ）、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニル メシトイルスルホニル（Ｍｔｓ）またはＢｏｃが含まれる。Ｌｙｓの側鎖保護基には、Ｃｂｚ、２-クロロベンジルオキシカルボニル（２-Ｃｌ-Ｃｂｚ）、２-ブロモベンジルオキシカルボニル（２-ＢｒＣｂｚ）、ＴｏｓまたはＢｏｃが含まれる。
α-アミノ保護基の除去後に、残存する保護アミノ酸を、望まれる順番で段階的にカップリングさせる。一般に、メチレンクロライド（ＣＨ₂ＣＩ₂）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物の溶液中で、例えば２-（１Ｈ-ベンゾトリアゾル-１-イル）-１，１，３，３-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような適宜のカルボキシルアクチベーターを用いて、各々の保護アミノ酸を約３倍過剰で反応させる。
望みのアミノ酸配列が完了した後に、混合物を例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はフッ化水素（ＨＦ）のような試薬で処理することにより、望みのペプチドを樹脂担体（support）から離脱させる。このような試薬は、樹脂からペプチドを分断するのみならず、残存するすべての側鎖保護基を裂く。クロロメチル化樹脂を用いる場合には、フッ化水素処理により、遊離のペプチド酸が形成される。ベンゾヒドリルアミン樹脂を用いる場合には、フッ化水素処理により、直接的に遊離のペプチドアミドが得られる。或いは、クロロメチル化樹脂を採用する場合には、ペプチド樹脂をアンモニアで処理することにより、側鎖保護型ペプチドが分断され、望みの側鎖保護型アミドが得られるか或いはアルキルアミンで処理することにより、側鎖保護型アルキルアミドまたはジアルキルアミドが得られる。次いで、フッ化水素による通常の様式で、側鎖保護が除去されて、遊離のアミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドが得られる。
さらに、本発明の化合物のいずれかの１つ、２つまたはそれ以上の位置に、天然起源の遺伝的にコード化された２０個のアミノ酸以外のアミノ酸が置換されたペプチドを合成するために、これらの手法を用いることもできる。例えば、ナフチルアラニンをトリプロファンで置換して、合成を促進させることができる。本発明のペプチド中に置換されることができる他の合成アミノ酸には、Ｌ-ヒドロキシプロピル、Ｌ-３，４-デヒドロキシフェニルアラニル、δ-アミノ酸、例えば、Ｌ-δ-ヒドロキシシリル、Ｄ-δ-メチルアラニル、Ｌ-α-メチルアラニル、β-アミノ酸及びイソキノリルが含まれる。さらに、Ｄ-アミノ酸及び非天然起源の合成アミノ酸を本発明のペプチド中に挿入することもできる。
本発明の別の態様において、インビトロまたはインビボでの細胞表面レセプターアゴニストの生物活性を増大させる方法が提供される。この方法は、レセプターアゴニストをＰＥＧのようなリンカー分子で二量化することにより達成される。こうして、二量体の単量体ペプチド単位の間に適宜の空間関係が形成され、これにより、二量体の構成要素の各々がこれらレセプターに結合し、増大された生物活性が得られる。換言すれば、二量化することにより、レセプターが活性化され、特定の細胞表面レセプター、例えば、ＥＰＯ-Ｒの、関連する生物活性が誘導される。生物活性は、種々のインビトロまたはインビボでのアッセイで、専門家により測定されることができ、そして本発明の実施例で証明されている。
所定のレセプターに対して結合アフィニティーを有するペプチドまたは分子は、増大した配座（conformational）柔軟性を有し、有効なレセプター相互作用及び引き続くレセプター活性化に対する障害を少なくするであろう。このことはまた、レセプターサブタイプに結合はできるがレセプターサブタイプを活性化できない分子が、リガンド結合よりも有効なインヒビターになることができることを示唆している。
さらに、本発明は、細胞表面レセプターアンタゴニスト（レセプター結合は示すが生物活性を示さない）分子を、インビトロまたはインビボで細胞表面レセプターアゴニストとして挙動するように変える（alter）方法を提供する。この方法は、アンタゴニスト分子を、適宜のリンカー分子、例えば、ＥＰＯ、他の重合分子またはペプチドで二量化することにより達成される。好ましい態様において、ＥＰＯアンタゴニスト、すなわち、レセプター結合は示すが生物ＥＰＯ活性を示さないペプチドを、二量化によって改変することができ、ＥＰＯレセプターアゴニストとして挙動する二量体が得られる。従って、例えば、ＥＰＯ-Ｒの場合には、これらには、式
（ＡＸ₂）_nＸ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
式中、Ｘ₂〜Ｘ₈は本明細書の（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で既に規定したとおりであり、ｎは１または０であり、そしてＡはＹ（チロシン）を除いた天然起源のＬ-アミノ酸のいずれか１つであり；ｎはコア配列中の（ＡＸ₂）の出現数として本明細書中で規定されたものであり、１または０であることができる、
のコア配列を含む、本発明の二量体の単量体ペプチド単位が含まれる。
Ｘ₂が存在する場合、すなわち、ｎ＝１で場合には、Ａはチロシンではなく、そしてＡはいずれかの非天然起源の芳香族アミノ酸類似体でもない。本発明の二量体のそのような単量体ペプチド単位は、図９のペプチドを、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜９３におけるＮ-末端からＹ（チロシン）残基を除去することにより、調製することができる。そのような単量体ペプチドは、また、図９のペプチド中のＹを置換することによっても調製することができる。
これらの分子は、その“単量体”では結合活性のみを示すが、ＰＥＧのような結合性化合物（リンカー）との二量化後にはアゴニスト活性を示す。従って、本発明の方法は、本明細書中で記載されるような生物活性を示さない単量体ペプチドを同定し、そして本発明に従ってそのアンタゴニストを二量化して、細胞表面レセプターアゴニストを二量体形態で得ることを含む。適宜の細胞表面レセプターを、こうして形成された二量体活性化体と接触させて、すなわち、レセプターを二量化させて、レセプターの生物活性を誘導する。図９に示されるような単量体単位をＮ-末端から例えばＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）を切除して、式（ＡＸ₂）_nＸ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）のＡの位置のチロシン残基を除去することができるか、或いは残りの１９個の天然起源のアミノ酸のいずれかとまたは非天然起源の芳香族アミノ酸類似体以外のものと置換させることもできる。本発明に従って、上記式のＡの位置のチロシン残基が単量体ペプチドの生物活性に臨界的であることが決定された。チロシンの切除または置換は生物活性を失わせる。しかしながら、二量化された場合には、全体が増大した生物活性を示す。
例えば、ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）中のチロシン（Ｙ）をｐ-インドヒドロキシフェニルアラニン、ｐ-フルオロヒドロキシフェニルアラニン、ｐ-アミノ-ヒドロキシアラニンで置換すると、ＥＰＯ-Ｒ単量体アゴニストとして作用するが、Ｙの位置でチロシンをトレオニンまたはアラニンと置換すると、単量体ペプチドはＥＰＯ-Ｒ単量体アンタゴニストとして作用する。しかしながら、本発明に従って二量化させた場合には、そのような二量体はＥＰＯ-Ｒアゴニストとして挙動する。図９に示される単量体ペプチド単位は、例えば、上記式のＹの位置でチロシンが不存在の場合には、ＥＰＯ-Ｒアンタゴニストとして挙動する。そのようなアンタゴニストが二量化された場合には、二量体はＥＰＯ-Ｒアゴニストとして挙動する。
本発明のさらなる態様において、本発明の二量体の少なくとも１つを含む製薬学的組成物を、例えば、ＥＰＯ、ＧＨ、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、インシュリン、ＦＧＦのような生物因子の欠乏から生じる疾患を治療するために用いることができる。これらの製薬学的組成物は、組成物を安定化するためにまたは二量化分子の運搬を助けるために、緩衝液、塩及び他の賦形剤を含んでいてもよい。
好ましい態様において、本発明は、ＥＰＯの欠乏に随伴する疾患を処置する方法を提供する。疾患症状を緩和させるのに十分な、すなわち、ＥＰＯレセプターの二量化または生物活性化を遂行するのに十分な、回数及び条件下で、本明細書に示される二量体の少なくとも１つを投与することにより、この方法は達成される。ＥＰＯの場合には、そのような方法は、末期の腎不全／透析；特にＡＩＤＳに関連する貧血症或いは慢性炎症、例えば、慢性関節リウマチ及び慢性腸炎；自己免疫疾患の処置に有用であり、そして必要時に、例えば、手術前又は輸液（輸血）の前処置に、患者の赤血球数を上げるために有用である。ＥＰＯアゴニストとして挙動する本発明の二量体は、巨核球を活性化させるために使用することができる。
ＥＰＯは、脈管内皮細胞に対して細胞分裂促進性且つ走化性の影響を及ぼし、そして中枢コリン性ニューロンに対して影響を与える（例えば、Amagnostou et al．（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA ８７：５９７８０５９８２ and Konishi et al．（1993）Brain Res．６０９：２９−３５を参照）。このため、本発明の化合物は、また、種々の脈管疾患、例えば、傷の回復の促進、側副枝冠状血管の成長（例えば心筋梗塞の後に起こるようなもの）、外傷、及び脈管移植の後処置、並びに、一般にアセチルコリンの低い絶対濃度または他の神経活性物質、例えば、他の神経刺激性物質に較べてアセチルコリンの低い相対濃度によって特徴づけられる種々の神経疾患を処置するために使用することもできる。
従って、本発明は、製薬学的キャリヤーまたは希釈剤と共に、本発明のペプチド二量体の少なくとも１つを活性成分として含有する製薬学的組成物を含む。本発明の二量体は、経口、腸管外［筋内、腹腔内、静脈（ＩＶ）または皮下注射］、経皮（受動的にかまたはイオン導入法もしくは電気穿孔法を使用して）或いは経粘膜（鼻、膣、直腸または舌下）の投与ルートで、各投与ルートに適宜の投与形態で投与することができる。
経口用の液体投与形態には、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤及び顆粒剤が含まれる。そのような固体投与形態において、活性化合物は、少なくとも１つの製薬学的に許容され得る不活性のキャリヤー、例えば、スクロース、ラクトースまたは澱粉と混合される。そのような投与形態は、通常、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含むことができる。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、該投与形態はさらに緩衝剤を含むことができる。錠剤及び丸剤は、さらに腸溶コーティングを用いて調製することもできる。
経口用の固体投与形態には、製薬学的に許容され得る乳剤、溶剤、懸濁剤、シロップ剤、並びに、当該技術分野で通常使用されている水のような不活性希釈剤を含有するエリキシルが含まれる。そのような不活性希釈剤以外にも、組成物はさらに補助剤、例えば湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤及び香料を含むことができる。
本発明に従う腸管外投与用の調合物は、殺菌水性もしくは非水性溶液、懸濁液または乳液を含む。非水性溶液または賦形剤の例としては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油またはコーン油、ゼラチン及び注射可能な有機エステル類、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。そのような投与形態は、さらに、補助剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含んでいてもよい。それらを、例えば、バクテリア保持フィルターを通す濾過により、殺菌剤を組成物に加えることにより、組成物に放射線を施すことにより、または組成物を加熱するなどして、殺菌することもできる。使用の直前に、それらは、さらに、殺菌水または幾つかの他の殺菌性で注入可能な媒体を用いて調製することができる。
直腸用または膣用の組成物は、好ましくは、活性物質の外に賦形剤、例えばココアバターまたは座剤用ワックスを含む座剤である。鼻用または舌下投与用の組成物は、当該技術分野で周知の標準的な賦形剤をさらに用いて調製される。
本発明の組成物中の有効成分の用量は変動してもよい。しかしながら、有効成分の量は適切な投与形態が得られるような量とすることが必要である。選択される用量は、望まれる治療効果、投与ルート及び望まれる治療期間に依存する。一般には、一日あたり、体重の０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルが哺乳類に投与される。
上記の開示から理解され得るように、本発明は広範囲の用途を有している。従って、以下の実施例は、説明のために提供されるのであって、限定するために提供されるのではない。
実施例１
ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル［１０〜２０％グラディエントＳＤＳ-ＰＡＧＥプレート、８４ ｘ ７０ ｘ １．０ｍｍ、統合型分離システム（Integrated Separation Systems)，Natick，MA］を、クーマシーブリリアントブルー［Coomasie Brilliant Blue Ｒ-２５０（BioRad）］で染色した。活性化二官能性ポリエチレングリコール［ＰＥＧ-スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ２、分子量：約３４００）］の商業的製剤を、単官能性試薬であるメトキシ-ＰＥＧ-スクシンイミジルプロピオネート（分子量：約５０００）と同様に、Sharwater Polymers，Huntsville，ALから購入した。ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）及び他のすべてのペプチドを、Peptide Synthesis Facility RWJ-PRI，La Jolla，CAまたはQuality controlled Biochemical，Hopkinton MAから得た。これらのペプチドを、それらの分子内システインを介して環化させ、Ｃ末端でアミド化（amidate）し、そしてＦＡＢ-ＭＳで質量を確認した。すべてのものが、エルマン反応（Ellman Reaction）でネガティブであった。トリス（tris）塩基をBioRad，Hercules，CAから得た。（ＤＰＤＰＢ）及びトリフルオロ酢酸（ＨＰＬＣ等級）をPierce Chemical Co．，Rockford ILから得た。
ペプチドＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）のモノ-ＰＥＧ結合
この実施例は、本明細書中に記載される実験において対照として使用される単官能性アミン反応性ポリマー類似体、ｍ-ＳＰＡ-ＰＥＧを用いるペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）のモノ-ＰＥＧ結合体の調製を記載する。
１４２．５ｍｇ（０．０２８６ｍｍｏｌ、分子量：約５０００）のポリマーを、４ｍｌのｐＨ７．５のＰＢＳに再懸濁させ、１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した２０ｍｇのペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（０．００９２ｍｍｏｌ、分子量：約２０９２）を添加して、反応を実施した。混合物を氷上で２０時間インキュベートした。次いで、ｐＨ７．５の１Ｍトリス-ＨＣｌを加えて、反応液を５０ｍＭトリス（Tris）の最終濃度に調整した。反応混合液を、氷上で１時間インキュベートした。分析用ＨＰＬＣは、ベースラインで分割されていない、大きさがほぼ等しい２つの主要な反応生成物の存在を示唆している。実施例８に記載された平坦グラディエントシステム（flatter gradient system）を用いて調製用（preparative）ＨＰＬＣを行い、そして保存用切断（conservative cut）を行った結果、約４４及び４７分で溶出した２つの生成物ピークが回収された。凍結乾燥後に、２４．８ｍｇ及び１６．５ｍｇの各種がそれぞれ回収された。これら２種の質量スペクトル分析は、ペプチドに対する１つまたは２つのＰＥＧ分子の結合をそれぞれ示す、７０９２（ピーク１）及び１２０３６（ピーク２）の中心質量（centroid mass）を示した（表１）。
トリス不活性化ポリマー
ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス-ＨＣｌと共に、ＰＢＳ（Gibco，Gaithersburg，MD）中に溶解させた５ｍＭ ＳＰＡ２ポリマーをインキュベートすることにより、トリス不活性化ポリマーを形成し、さらなる精製を行うことなく使用した。

実施例２
ペプチドＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）のＰＥＧ二量化（ｌｏｔ ＃１）
実施例２〜７は、本発明に記載される種々のペプチドの二量化を記載する。２５ｍｇ（０．００７１ｍｍｏｌ）のポリマーを４ｍｌのｐＨ７．５のＰＢＳに再懸濁させ、そして１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した３倍モル過剰のペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（０．０２１３ｍｍｏｌ、４４．５ｍｇ、分子量：２０９２）を添加することにより、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の改変（modification）を実施した。混合物を氷上でインキュベートした。３時間インキュベートした後に、さらなる７．５ｍｇ（０．００３６ｍｍｏｌ）の凍結乾燥ペプチドを加えて、最終比をＳＰＡ２各１モル当たりペプチド３．５モルとした。混合物を氷上でさらに１７時間インキュベートした。ｐＨ７．５の１Ｍトリス-ＨＣｌを加えて、反応混合液を５０ｍＭのトリスの最終濃度に調整し、そして１時間氷上でインキュベートした。試料を、実施例８に記載されているような分析用及び調製用（preparative）ＨＰＬＣに付した。調製用ＨＰＬＣ及び凍結乾燥を行った後に、３８ｍｇのＰＥＧ二量体を回収した。この実験についての理論収量は７６００ｍｇ／ｍｍｏｌの計算質量に基づいて５５ｍｇであり、収率は６９％であった（表Ｉ）。
実施例３
ペプチドＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）のＰＥＧ二量化（ｌｏｔ ＃２）
２５ｍｇ（０．００７１ｍｍｏｌ）のポリマーを４ｍｌのｐＨ７．５のＰＢＳに再懸濁させ、そして１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した約３倍モル過剰のペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（０．０２１３ｍｍｏｌ、４５．８ｍｇ、分子量：２０９２）を添加することにより、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の改変を実施した。混合物を氷上で２２時間インキュベートした。そのときに、ｐＨ７．５の１Ｍトリス-ＨＣｌを加えて、反応液を５０ｍＭトリスの最終濃度に調整した。反応混合液を氷上で１時間インキュベートした。試料を、実施例８に記載されているような分析用及び調製用ＨＰＬＣに付した。調製用ＨＰＬＣ及び凍結乾燥を行った後に、３７ｍｇのＰＥＧ二量体を回収した。この実験についての理論収量は７６００ｍｇ／ｍｍｏｌの計算質量に基づいて５５ｍｇであり、収率は６８％であった（表Ｉ）。
実施例４
ペプチドＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のＰＥＧ二量化
１１．２ｍｇ（０．００３３ｍｍｏｌ）のポリマーを２．５ｍｌのｐＨ７．５のＰＢＳに再懸濁させ、そして０．２５ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した約３倍モル過剰のペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）（０．０１０ｍｍｏｌ、２０ｍｇ、分子量：１９７８）を添加することにより、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の改変を実施した。混合物を氷上で２０時間インキュベートした。そのときに、０．２５ｍｌのｐＨ７．５の１Ｍトリス-ＨＣｌを加えた。反応混合液を４℃で１時間インキュベートした。試料を、実施例８に記載されているような分析用及び調製用ＨＰＬＣに付した。主要な調製用反応生成物のピークが約４３分で溶出した。調製用ＨＰＬＣ及び凍結乾燥を行った後に、１３．３ｍｇのＰＥＧ二量体を回収した。この実験についての理論収量は７４００ｍｇ／ｍｍｏｌの計算質量に基づいて２４．４２ｍｇであり、収率は５４％であった（表Ｉ）。
実施例５
ペプチドＡｃ−ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）のＰＥＧ二量化
１０．５ｍｇ（０．００３１ｍｍｏｌ）のポリマーを２．５ｍｌのｐＨ７．５のＰＢＳに再懸濁させ、そして０．２５ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した約３倍モル過剰のペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）（０．００９４ｍｍｏｌ、２０ｍｇ、分子量：２１３３）を添加することにより、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）の改変を実施し、そして混合物を４℃で２８時間インキュベートした。そのときに、ＨＰＬＣにより監視した結果、反応は約３０％完了しているものと推定され、温度を周囲温度にシフトし、そしてさらに２７時間インキュベートしたところ、合計生成物の増大はみられなかった。反応性ポリマーの可能な加水分解を考慮して、さらなる５ｍｇのポリマーを加え、インキュベーションをさらに１６時間継続した。そのときに、０．２５ｍｌのｐＨ７．５の１Ｍトリス-ＨＣｌを加え、反応混合液を４℃でさらに１時間インキュベートした。試料を、実施例８に記載されているような平坦グラディエントシステムを用いる分析用及び調製用ＨＰＬＣに付した。主要な調製用反応生成物のピークは約４８分で溶出した。調製用ＨＰＬＣ及び凍結乾燥を行った後に、１０．４ｍｇのＰＥＧ二量体を回収した。この実験についての理論収量は７６５０ｍｇ／ｍｍｏｌの計算質量に基づいて３４．４ｍｇであり、収率は３０％であった（表Ｉ）。
実施例６
ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）のＰＥＧ二量化
２．６ｍｇ（０．０００７６ｍｍｏｌ）のポリマーを３．０ｍｌのｐＨ７．５のＰＢＳに再懸濁させ、そして０．１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した約３倍モル過剰のペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）（０．００２２９ｍｍｏｌ、５ｍｇ、分子量：２１７７）を添加することにより、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）の改変を実施した。混合物を氷上で２６時間インキュベートした。そのときに、０．２５ｍｌのｐＨ７．５の１Ｍトリス-ＨＣｌを加えた。反応混合液を４℃で１時間インキュベートした。試料を、実施例８に記載されているような平坦グラディエントシステムを用いる分析用及び調製用ＨＰＬＣに付した。主要な調製用反応生成物のピークは約４６分で溶出した。調製用ＨＰＬＣ及び凍結乾燥を行った後に、２．２ｍｇのＰＥＧ二量体を回収した。この実験についての理論収量は７４００ｍｇ／ｍｍｏｌの計算質量に基づいて２４．４２ｍｇであり、収率は３７％であった（表Ｉ）。
実施例７
ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）のＰＥＧ二量化
１．２ｍｇ（０．０００３６ｍｍｏｌ）のポリマーを０．５ｍｌのｐＨ７．５のＰＢＳに再懸濁させ、そして０．０５ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した約３倍モル過剰のペプチド（０．００１１ｍｍｏｌ、１．５ｍｇ、分子量：２１７７）を添加することにより、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）の改変を実施した。混合物を氷上で２０時間インキュベートした。そのときに、０．１ｍｌのｐＨ７．５の１Ｍトリス-ＨＣｌを加えた。反応混合液を４℃で１時間インキュベートした。試料を、実施例８に記載されているような分析用ＨＰＬＣシステムを用いる精製に付した。主要な調製用反応生成物のピークは約３８分で溶出した。調製用ＨＰＬＣ及び凍結乾燥を行った後に、１ｍｇのＰＥＧ二量体を回収した。この実験についての理論収量は６１５０ｍｇ／ｍｍｏｌの計算質量に基づいて２．２ｍｇであり、収率は４５％であった（表Ｉ）。
実施例８
分析用及び調製用ＨＰＬＣ分析
上記実施例１〜７に記載された累積した二量体を、分析用逆相ＨＰＬＣで監視した。Vydac C-18タンパク質-ペプチドカラム（０．４６ｘ２５ｃｍ、パーツNo．218TP54）及びDynamax二重波長検出器（dual wavelength detector）を備えたRaininグラディエント（Gradient）ＨＰＬＣシステムを用いて、分析を行った。注入の際に、カラムをｄＨ₂Ｏ中の０．１％ＴＦＡ中で平衡化し、そして注入の１０分後に、４５分間の、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル（ＡＣＮ）の（０〜１００％）の線状グラディエントで、展開（development）を開始した。フロー速度を、１ｍｌ／分に、一定にした。これらの分析条件下で、ＳＰＡ２ポリマー及びトリス不活性化ポリマーはカラムに結合したようにみえなかったが、保持時間（３７分間）で主要な反応生成物が同定された（図１）。ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）は３５分間の保持時間を示し、そして反応に使用した過剰のペプチドは、生じたばかりの反応生成物から明確に識別された。
Vydac C-18タンパク質-ペプチドカラム（２．２ｘ２５ｃｍ、パーツNo．218TP15022）を用いる同一のクロマトグラフィーシステム上の調製用逆相ＨＰＬＣによって、主要な反応生成物ピークを精製した。８ｍｌ／分の一定フロー速度で、８０：２０のＨ₂Ｏ：ＡＣＮ（双方共に０．１％ＴＦＡを含む）によりカラムを平衡化し、反応混合液（６ｍｌ）を注入した。２０分間洗浄した後に、カラムを、６０分間、１００％ＡＣＮ／０／１％ＴＦＡの線状グラディエントを適用して展開させた。４８分で溶出した主要な生成物ピークを回収しそして凍結乾燥した（図２）。その後、幾つかの結合（conjugation）生成物ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ｍＰＥＧ-ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を反応生成物からよりよく分離するために、これらの溶出条件を変えた。このことは、６０分間にわたって、２０〜８０％のＢの平坦線状グラディエントを適用することにより、達成された。ペプチドが異なることに起因する保持時間の変動及び溶出条件の変動は、各合成実施例の一部として記載されている。次に、各反応からの各主要生成物ピークから回収した物質を、分析用逆相ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトル、ＥＰＯ競合的結合ポテンシャルによって分析し、そしてインビトロでの生物活性について分析した。
これらの実験に用いた活性化ＰＥＧは約３４００の分子量を有し、そして２官能性線状ポリマーのいずれかの末端にアミン反応性スクシンイミジル基を有する。この反応基を、２つのスクシンイミジル部分を同時に遊離させ、２つのペプチド等価物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（分子量＝２０９２）をポリマーに結合させるために用い、結果として、式Ｉに示されるような二量体生成物を得た。ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）は２つの潜在的に反応性のアミンを有しており、２つのアミンのうちの１つはペプチドのＮ-末端にあり、そしてもう１つはペプチド配列内の単一のリジンの側鎖内にある。それ故、２つの分子間における多数の異なる結合が可能である。
７６６１の中心質量（centroid mass）を有する主要種によって示唆されるように、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトル分析によって、予測された二量体生成物の存在が支持された（図３）。このデータは、本明細書に記載される方法を用いて、本発明に記載される二量体生成物が製造されることを示している。
実施例９
ＥＢＰ（ＥＰＯ結合タンパク質）の二量化
この実施例は、２官能性スルフヒドリル反応性リンカーである（１，４-ジ-［３'（２'-ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタンＤＰＤＰＢを用いた、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）及びペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）と、ＥＰＯ結合タンパク質（ＥＢＰ）との相互作用を証明する。
ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）とＥＢＰとの相互作用を研究するために、疑似依存性（mimetic dependent）二量体構造を安定化させる目的で、２官能性スルフヒドリル反応性架橋剤（crosslinker）ＤＰＤＰＢを使用した。対照実験は、架橋剤がＥＢＰのＥＰＯ結合ポテンシャルまたはペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の増殖能力を不活性化しないことを、証明した。図４に示されるように、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＤＰＤＰＢ及びＥＢＰを同時にインキュベートすることによって、二量体ＥＢＰ生成物が形成された。このデータは、可溶性レセプター二量体の形成を仲介（mediate）するペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の能力を示す。この問題をさらに研究するために、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）及び（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）について、それらの二量化仲介能力を試験した。図４のレーン７Ａ及び８Ａに示されるように、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）がカルボキシル末端で切除された場合に、インビトロでの良好な生物活性が保持され、そしてインビボでの生物活性が改善され、その結果、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）と同様の架橋シグナルを得た。しかし、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）は二量化シグナルを安定化するようにはみえなかった（図４、レーン９Ａ）が、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）は強い二量化バンドを与えた（図４、レーン５Ａ、６Ａ）。これらの２つのペプチドは、単一のＮ-末端のチロシン残基が異なり、インビトロでの増殖分析でも同様の性質を示し、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）は不活性であった。ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）は、ネズミのレセプター細胞上で３μｍのＥＤ₅₀を有している。双方のペプチドは同様のＩＣ₅₀値を有し、このことはそれら双方が結合活性を保持していることを示唆する。これらの結果は、ＥＢＰ二量化はＥＰＯペプチド群の性質であり、そしてこの活性に対してはチロシンの存在が臨界的であり、そしてこれはインビトロでの生物活性に対応することを、証明している。
実施例１０
固定化ＥＢＰに基づく［ ¹²⁵ Ｉ］ＥＰＯ競合的結合アッセイ
この研究は、ＥＰＯ ＰＥＧ二量体のＥＰＯレセプターへの結合能力を試験したものである。
ヒトのエリスロポエチンレセプター（ＥＰＯ結合タンパク質、ＥＢＰ）の細胞外ドメインは、大腸菌（E．Coli）中で発現され、過剰産出される。大腸菌中に産出される他の多くの組換え真核タンパク質と同様に、このタンパク質は、研究所規模での発酵においては不溶性生成物として現れ、再度折り畳まれ、精製されて、活性タンパク質が得られる。この方法によってつくられたＥＰＯ結合タンパク質は、１つの遊離のスルフヒドリル基を含む。該フヒドリル基を、リガンドの溶液相結合を遂行することなく改変することができる。平衡結合アッセイ及び競合的結合アッセイのために、ＥＰＯ結合タンパク質を固定化するために、ＥＰＯ結合タンパク質をアガロースビーズに共有結合させた。
スルホリンク（Sulfolink）ビーズ（Pierce Chemical Co，Rockford，IL）のインドアセチル活性化学（indoacetyl activation chemistry）は、遊離のチオールに特異的であり、結合が容易には可逆にならないことを確保している。ＥＢＰ-スルホリンクビーズを下記のように調製した。スルホリンクゲル懸濁液（１０ｍｌ）をカップリング用緩衝液（４０ｍｌ：５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３、５ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合し、ゲルを沈降させた。上澄液を除去し、そして結合されるべきＥＰＯ結合タンパク質（カップリング用緩衝液中０．３〜１ｍｇ／ｍｌ）を、洗浄したビーズに直接添加した。混合物を３０分間室温で穏やかに揺すって、ビーズを１時間室温で沈降させた。上澄液を除去し、保持しておいた。ビーズを２０ｍｌのカップリング用緩衝液で２回洗浄した。同様に、洗浄液を回収した。次に、ビーズを２０ｍｌの０．０５Ｍシステインで３０分間室温で処理して、未結合部位をブロックした。最後に、ビーズを５０ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌで次いで３０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、そして４℃で保存した。もとのＥＢＰ溶液のＯＤ₂₈₀と、反応上澄液と２つの２０ｍｌの洗浄液中に回収された合計のＯＤ₂₈₀とを比較することにより、ビーズに共有結合されたＥＢＰの量を測定した。典型的には、用いたＥＢＰの４０〜６０％がビーズと結合して残った。
ＥＰＯ結合タンパク質ビーズ（５０μｌ）を個々の反応チューブに添加して、競合的アッセイを開始した。０．３〜３０ｎＭの［¹²⁵Ｉ］ＥＰＯ（NEN Research Products，Boston MA，100μCi/μg）を含むチューブ内で、合計結合を測定した。非特異的結合を測定する為に、未標識ＥＰＯを対応する［¹²⁵Ｉ］ＥＰＯ濃度の１０００，倍過剰のレベルで添加した。各々の反応容量を、結合用緩衝液（ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ）を用いて５００μｌにした。チューブを５時間（平衡を達成するのに十分であると実験的に決定された時間）室温で穏やかに揺すりながらインキュベートした。５時間後に、各反応混合物を、グラスウールを詰めた１ｍｌのピペットチップを通して通過させた。チューブを１ｍｌの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／５％ＢＳＡ）で洗浄し、そしてこの容量及び２つのさらなる１ｍｌの洗浄緩衝液をピペットチップを通して通過させ、遊離のＥＰＯ濃度を測定するために回収した。これらのアガロースビーズ上に固定化された［¹²⁵Ｉ］ＥＰＯとＥＰＯ疑似結合タンパク質との特異的結合について平衡結合測定を行ったところ、等結合線（binding isotherm）（図５）の線形変換（スキャッチャード）に基づき、５ｎＭ±２のＫｄが示された。
候補の（candidate）ペプチド及び二量体ペプチドの競合的結合アッセイを、次に概説するように行った。個々のペプチドをＤＭＳＯ中に溶解し、１ｍＭのストック溶液を調製した。二量体ペプチドを５ｍＭの濃度でＰＢＳ内に含ませた。すべての反応チューブ（２回）は、５００μＬの結合用緩衝液内に５０μＬのＥＢＰビーズ、０．５ｎＭ［¹²⁵Ｉ］ＥＰＯ及び０〜５００μＭのペプチドを含んでいた。
すべてのペプチドアッセイチューブにおいて、ＤＭＳＯの最終濃度を２．５％に調整した。この濃度のＤＭＳＯは検出に関して影響を及ぼさなかった。何故なら、ＤＭＳＯに対するアッセイの鋭敏性の試験により、２５％（V/V）までの濃度のＤＭＳＯは結合に悪影響を及ぼさないことが証明されたからである。大量の非標識ＥＰＯ（１０００ｎＭ）を含むチューブを混入させることにより、各々個々のアッセイにおいて非特異的結合を測定した。合計結合を測定するために、各々のアッセイにおいて、ペプチドを添加しない初期のアッセイ点を含ませた。結合混合物を、穏やかに揺すりながら、室温で一夜インキュベートした。次に、ミクロカラム［Micro-columns（Isolab，Inc．）］を用いてビーズを回収し、そして３ｍＬの洗浄用緩衝液で洗浄した。洗浄ビーズを含むカラムを、１２ｘ７５ｍｍのガラスチューブ内に収容し、そしてガンマカウンター中で結合放射能濃度を測定した。結合［¹²⁵Ｉ］ＥＰＯの量を結合対照（合計＝１００％）のパーセンテージとして表し、非特異性結合について補正した後に、ペプチド濃度に対してプロットした。
ＩＣ₅₀は、ＥＢＰビーズに対する［¹²⁵Ｉ］ＥＰＯの結合を５０％だけ低減させる分析物（analyte）の濃度として規定される。すべてのデータは、５μＭのＩＣ₅₀を示すペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に対して報告されている。
競合的結合アッセイにより、同一のアッセイで、精製二量体について５μＭのＩＣ₅₀が示され、すなわち、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）よりも４倍大きい値が示された（図５及び表II）。トリス-ＨＣｌで処理されて不活性化されたポリマーは、単独で、検出可能な競合的結合シグナルを示したが、このシグナルは、ＰＥＧ-ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）二量体のＩＣ₅₀で控えめ〈１０％）であった。

実施例１１
ＥＰＯ依存性細胞増殖アッセイ
この実施例は、ヒト及びネズミの細胞系内のＥＰＯレセプターに対するＰＥＧ-ＥＰＯペプチド二量体の改善された活性（potency）を示す。
ネズミのＥＰＯレセプターを発現するＥＰＯ依存性系である細胞系ＥＤＣ-Ｐ１／ＥＲを成長させて、既述したように保持した（Carroll et al．1991）。さらに、官能基切除（Ｃ-末端のアミノ酸が欠乏している）ヒトＥＰＯレセプターを発現する細胞系ＥＤＣ-Ｐ１／ｔｒＥＲを用いた。両方の細胞系はＥＰＯ依存性細胞増殖を示す。１０％の熱不活性化胎児小牛血清及び１０単位／ｍｌの組換えヒトＥＰＯを含むＲＰＭＩ １６４０媒体中に細胞を短時間保持した。細胞増殖アッセイのために、ＥＤＣ-Ｐ１／ＥＲまたはＥＤＣ-Ｐ１／ｔｒＥＲ細胞を定常期まで成長させ、遠心し、ＲＰＭＩ １６４０媒体（ＥＰＯなし）で洗浄し、そしてＥＰＯマイナス媒体中で２４時間培養した。
２４時間後に、細胞をカウントし、８０００００細胞／ｍｌに再懸濁させ、そして４００００細胞／ウエルに分散させた。ペプチド二量体（ＰＢＳ中５ｍＭ）及びペプチド（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）のストック液を調製し、１x１０^-10Ｍ〜１x１０^-5Ｍの最終濃度まで３回希釈し、そして０．２ｍｌの最終容量に調整した。０．１％（ｖ／ｖ、最大）以下の最終ＤＭＳＯ濃度は、細胞毒性または刺激効果をもたないことが分かった。各々のアッセイ系について、標準ＥＰＯ用量応答曲線をつくった。
３７℃で４２時間インキュベーション（約２倍の細胞増加）した後に、１μＣｉ／ウエルの［³Ｈ］チミジンを添加し、そしてインキュベーションを６時間継続したが、このときに、細胞を捕獲して細胞をカウントし、細胞増殖の目安として［³Ｈ］チミジン挿入を測定した。結果は、組換えＥＰＯを用いて得られる最大活性の１／２を得るのに必要なペプチドまたは二量体ペプチドの量として表した。
図５及び表IIに示されるように、ＰＥＧ-ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）二量体の最初のロットは、ネズミまたはヒトのＥＰＯレセプターを含むＥＰＯ応答性細胞系中で、０．０１μｍ及び０．００１５μｍのＥＤ₅₀値をそれぞれ示した。双方の細胞系において、親ペプチドであるペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）は０．１μＭのＥＤ₅₀値を示したが、このことは、ネズミの応答性レセプター系で１０倍そしてヒトのレセプター含有細胞で約６０倍の活性増大を示す。従って、二量体は、ペプチドそれ自体よりもネズミ及びヒト系中で一層活性であることが明らかである。このことは、ＰＥＧ-ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）二量体の第２の合成ロットを作出して、ネズミ及びヒト系中でそれぞれ１０倍及び４５倍活性が増大したことによって確認された。トリス-ＨＣｌで処理されて不活性化したポリマーは、単独では、細胞増殖アッセイにおいて活性を示さなかった。
さらに、第２のＥＰＯ疑似ペプチドである、配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱをもつペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）について上述したと同様のＰＥＧ二量化プロトコールに付した。ＰＥＧ-ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の二量体生成物も、また、非結合親化合物よりも一層活性であった（表II）。これらの二量体ペプチドの双方は０．００２μＭ近くの最終ＥＤ₅₀値を有する。このより控えめな増大にも拘わらず、実験証拠は、これらペプチドとＰＥＧとの二量化により、改善された活性が得られることを明瞭に示す。
実施例１２
ＰＥＧに対する本発明のペプチドの結合能力をさらに試験するために、内部リジン基のみを含むペプチド分子を用い、Ｎ-末端がアセチル化されたペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）類似体、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、並びに反応性Ｎ-末端アミンのみを有する配列類似体ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）類似体を、ＰＥＧで二量化した。これらの化合物のインビトロでの増殖データは、遊離のアミノ末端を介する可能な二量化が生物活性に最も強い影響を与え、単量体の親ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）二量体よりも約８０倍も活性な種が得られることを、示唆する。モノ-ＰＥＧまたはジ-ＰＥＧ結合のように、リジン側鎖を介する結合はペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）の活性に真の影響を及ぼさなかった（表III）。このデータは、ＰＥＧリンカーを用いる、頭部対頭部（head to head）の二量体（双方のペプチドがＮ-末端を介して結合する）の創製がＥＰＯペプチドの活性を大きく増大させ、遊離の親ペプチドよりもおよそ２対数（log）大きいレベルまで近づくことを、示唆している。さらに、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）への線状ＰＥＧの単なる共有結合では、この効果が観察されなかったが、このことは、二量化がこの増大した活性の臨界的な決定因子であることを示唆する。

実施例１３
赤血球増加性・過低酸素症（Exhypoxic）マウスのバイオアッセイ
この研究は、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）／ＰＥＧ-二量体がインビボで生物活性を保持する能力を証明する。Cotes and Bangham（1961），Nature 191：1065-1067に記載された方法を改変したところの赤血球増加マウスのバイオアッセイによって、ペプチドのインビボでの活性を分析した。ＢＤＦ１マウスを７〜１０日間周囲条件に順応させた。すべての動物について体重を測定した。低体重の動物（１５グラム未満）は使用しなかった。マウスを低圧室に移し、０．４０％±０．０２気圧で１８時間、次に周囲圧で６時間からなる２４時間のコンディショニング・サイクルに、合計１４日間、付した。この１４日間の後に、投与前に、マウスを７２時間、周囲圧下に置いた。試験試料または組換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）標準品を、リン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）-０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなるアッセイ用賦形剤で希釈した。ペプチド試料のストック溶液（ペプチド二量体を除く）を最初にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。対照群は、賦形剤のみからなる１つの群と最終濃度１％の（ＤＭＳＯ）からなる１つの群を含んでいた。各投与群は１０匹のマウスを含んでいた。マウスの首筋に０．５ｍｌの適宜の試料を皮下注射した。試料を注射してから４８時間後に、マウスに０．２ｍｌの［⁵⁹Ｆｅ］（１８．０ミリキュリー／ミリグラム、Du pont、NEN）を、０．７５ミクロキュリー／マウスで、腹腔内注射した。
［⁵⁹Ｆｅ］を注射してから２４時間後にマウスの体重を測定し、そして［⁵⁹Ｆｅ］の注射後４８時間後にマウスを殺した。心臓穿刺によって各動物から血液を採取し、ヘマトクリットを測定した（ヘパリンを抗凝固剤として用いた）。Packardガンマ・カウンターを用いて、各血液試料（０．５ｍｌ）について［⁵⁹Ｆｅ］取込みを分析した。非応答性マウス（すなわち、ネガティブ対照群よりも少ない放射能取込みを示すマウス）をデータセットから除いた。さらに、５３％未満のヘマトクリット値をもつマウスも除いた。
このアッセイは、外因的に投与した化合物が新たな赤血球合成を誘導する能力または言い換えればＥＰＯもしくはＥＰＯ疑似体として機能する能力を試験した。各実験投与につき、１０匹の動物のセットから結果を得た。図７及び表IVに示されるように、データは、モル等量に基づき、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）／ＰＥＧ-二量体がペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）単量体よりも約１０倍活性であることを示唆する。これらの結果は、ネズミのＥＰＯ-Ｒ含有細胞で１０倍の増大した活性値がみられたインビトロでの結果と一致する。

実施例１４
本実施例は、臨界的なチロシンペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、（ＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ）を欠く、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の不活性切除類似体を、ヒトのＥＰＯレセプター細胞系上でのＰＥＧ二量化によって、アゴニストに変換できることを示す。この実験において、１０^-5Ｍ濃度の親ペプチドがバックグラウンド以上の活性をもたなかったのに対して、二量体ペプチドはバックグラウンドの約２倍のｃｐｍの増殖レベルを示した。図８に示されるように、ペプチド（角）のみではＥＰＯ応答性細胞の増殖を誘発できないが、ＰＥＧ二量化（菱形）によって有意のアゴニスト効果が観察された。１０^-5Ｍ加えたペプチド二量体では、非刺激（non-stimulated）細胞に約２倍のｃｐｍが取り込まれた。折り曲げられたエラーバー

は、ペプチドまたはペプチド二量体の各濃度についての３つのアッセイ点の標準偏差を示す。
過低酸素症赤血球増加性マウスのバイオアッセイ：
過低酸素症マウスのバイオアッセイによって、ＰＥＧ二量体及び単量体親ペプチドＲＷＪ ６１７１８を比較した（表１）。このペプチドについては、二量化によってインビトロでの活性が８０倍増加した。単量体ペプチドに対する二量体の活性についてのネズミの研究（インビボ）は、二量化によってＲＷＪ ６１７１８の活性が２５０倍増加した。ネズミのレセプター含有細胞中でのこの二量体ペプチドの細胞増殖研究は、単量体に対して１６倍の増加を示したが、このことは、インビボでの２５０倍の増加が、例えば、ペプチド配列のＰＥＧ二量化によって生じた、改変した代謝或いは長くなった循環半減期などの他のファクターに起因することを示唆する。従って、二量化のみの効果以外に、ＰＥＧ改変は、インビボでの活性に影響を及ぼしそして個々のペプチド配列に特異的であることができる効果を与える。
細胞型（cell associated）ＥＰＯレセプターに対する競合的結合アッセイ
細胞型ヒトＥＰＯレセプターへの結合に関して、選択された単量体ペプチド及びこれらの同種の二量体生成物が放射標識ＥＰＯと競合する能力についての競合的結合アッセイを行った。エリスロポエチンレセプターへの競合的結合分析を、次のように行った。ＴＦ-１細胞を、ＲＰＭＩ １６４０、１０％胎児子牛血清、１％Ｌ-グルタミン、１％ペニシリン、０．１％ストレプトマイシン及び１ｎｇ／ｍｌのＧＭ-ＣＳＦ中に保持した。［１２５］−ＥＰＯをNEN Research Products社から得た。細胞を、遠心し、そして結合用緩衝液（ＲＰＭＩ １６４０、５％ＢＳＡ、２５ｍＭ Hepes、ｐＨ７．５、０．０２％ナトリウムアジド）で１回洗浄し、結合用緩衝液に再懸濁し、そして生存能力の目安としてトリパンルー（trypan lue）を用いてカウントした。各反応液は、２００μｌの最終容量中に、約５ｘ１０⁵細胞、［１２５］-ＥＰＯ（０．５ｎＭ）を含んでいたが、競合体（competitor）またはペプチドまたは二量体調製物を含んでいなかった。結合用反応液（２回）を４℃で一夜インキュベートした。結合後に、冷蔵遠心器中で、４℃で１分間１２０００ｒｐｍでチューブを遠心した。上澄液を除去し、細胞ペレットを１００μｌの結合用緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液を、０．７ｍｌの子牛血清上に層状に置いた。４℃で５分間１２０００ｒｐｍでチューブを遠心し、上澄液を除去し、チューブの底を切り取り、そして、細胞ペレットを、Micromedic ME Plusガンマカウンターでカウントを測定した。細胞を、［１２５］-ＥＰＯ及び１００倍過剰の非放射性ＥＰＯと共にインキュベートして、非特異的結合を測定した。これらのデータは、ペプチドＲＷＪ ６１２３３、ＲＷＪ ６１５９６及びＲＷＪ ６１７１８が、見かけ結合競合的アフィニティーをそれぞれ３．０倍、３．２倍及び８０倍の増加を示した（表２）。これらのペプチド及びそれらの二量体誘導体を用いたインビボでの増殖研究は、活性がそれぞれ約５０倍、１０倍及び８０倍増加したことを示すが、このことは、３つの種のうちの２つについては、増加した結合アフィニティーの大きさがペプチドの官能活性よりも勝ることを示唆する。それ故、二量化の効果及びその後の活性増大は、結合事象によってレセプターの横方向拡散が限定されて、レセプター刺激の効率が改善されることによるのであろう。従って、ペプチド二量化の結果として、幾つかのペプチド二量体配列については、疑似リガンド-レセプター結合によってエンタルピーが増すというよりはむしろエントロピーが増すのであろう。
レセプター結合についてのＰＥＧ二量体ペプチドの競合能力に対してペプチド二量化がネガティブに影響するところのＥＢＰ-ビーズＥＰＯ競合的結合アッセイとは異なり、細胞型レセプターの競合能力は二量化によって増大する。このことは、固定化ＥＢＰ単量体が同様に二量化することができないのに対して、細胞型レセプターの二量化能力に起因するのであろう。
さらに、ペプチドＲＷＪ ６１１７７の不活性から活性への変換が研究された。改良され且つ拡大された研究が行われた。これにより、活性ペプチドへの変換についての我々の先の観察が確認された（図６、パネルＤ）。

配列表
配列番号：１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１０
（Ｄ）他の情報：

（ｘｉ）配列：配列番号：１：

配列番号：２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１２
（Ｄ）他の情報：

（ｘｉ）配列：配列番号：２：

配列番号：３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１６
（Ｄ）他の情報：

（ｘｉ）配列：配列番号：３：

配列番号：４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４：

配列番号：５：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１６
（Ｄ）他の情報：

（ｘｉ）配列：配列番号：５：

配列番号：６：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１６
（Ｄ）他の情報：

（ｘｉ）配列：配列番号：６：

配列番号：７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７：

配列番号：８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８：

配列番号：９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：９：

配列番号：１０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１０：

配列番号：１１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１１：

配列番号：１２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１２：

配列番号：１３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１３：

配列番号：１４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１４：

配列番号：１５：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１５：

配列番号：１６：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１６：

配列番号：１７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１７：

配列番号：１８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：１８：

配列番号：１９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置：１．．１２
（Ｄ）他の情報：

（ｘｉ）配列：配列番号：１９：

配列番号：２０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２０：

配列番号：２１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２１：

配列番号：２２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２２：

配列番号：２３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２３：

配列番号：２４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２４：

配列番号：２５：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２５：

配列番号：２６：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２６：

配列番号：２７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２７：

配列番号：２８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２８：

配列番号：２９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：２９：

配列番号：３０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３０：

配列番号：３１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３１：

配列番号：３２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３２：

配列番号：３３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３３：

配列番号：３４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３４：

配列番号：３５：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３５：

配列番号：３６：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３６：

配列番号：３７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３７：

配列番号：３８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３８：

配列番号：３９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：３９：

配列番号：４０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４０：

配列番号：４１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４１：

配列番号：４２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４２：

配列番号：４３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４３：

配列番号：４４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４４：

配列番号：４５：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４５：

配列番号：４６：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４６：

配列番号：４７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４７：

配列番号：４８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４８：

配列番号：４９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：４９：

配列番号：５０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５０：

配列番号：５１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５１：

配列番号：５２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５２：

配列番号：５３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５３：

配列番号：５４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５４：

配列番号：５５：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５５：

配列番号：５６：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５６：

配列番号：５７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５７：

配列番号：５８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：６１：

配列番号：６２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：６２：

配列番号：６３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）配列の特徴
（ｘｉ）配列：配列番号：６３：

（ｘｉ）配列：配列番号：５８：

配列番号：５９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：５９：

配列番号：６０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：６０：

配列番号：６１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（ｘｉ）配列：配列番号：６６：

配列番号：６７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：６７：

配列番号：６８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：６８：

配列番号：６９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７７：

配列番号：７８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７８：

配列番号：７９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７９：

配列番号：８０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８０：

配列番号：８１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８１：

配列番号：８２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８２：

配列番号：８３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８３：

配列番号：８４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８４：

配列番号：８５：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８５：

配列番号：８６：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８６：

配列番号：８７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８７：

配列番号：８８：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８８：

配列番号：８９：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：８９：

配列番号：９０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：９０：

配列番号：９１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：９１：

配列番号：９２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：９２：

配列番号：９３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：９３：

（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：６９：

配列番号：７０：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７０：

配列番号：７１：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７１：

配列番号：７２：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７２：

配列番号：７３：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７３：

配列番号：７４：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７４：

配列番号：７５：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７５：

配列番号：７６：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号：７６：

配列番号：７７：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸

Claims (14)

1. ＥＰＯレセプターに結合する、２つの１０〜４０個のアミノ酸鎖長の単量体ペプチドからなるペプチド二量体であって、各々の単量体ペプチドは、アミノ酸配列
   Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含んでなり、
   式中、Ｘ₆は遺伝的にコードされた２０個のＬ-アミノ酸のいずれかから選択され；Ｘ₃はＣであり；Ｘ₄はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであり；Ｘ₅はＭ、ＦまたはＩであり；Ｘ₇はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；そしてＸ₈はＣである、ペプチド二量体。
2. 各々の該単量体ペプチドが、アミノ酸配列
   ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
   式中、Ｘ₂及びＸ₆の各々が独立して遺伝的にコードされた２０個のＬ-アミノ酸のいずれかから選択され；Ｘ₃がＣであり；Ｘ₄がＲ、Ｈ、ＬまたはＷであり；Ｘ₅がＭ、ＦまたはＩであり；Ｘ₇がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；そしてＸ₈がＣである、
   を含んでなる請求の範囲第１項記載のペプチド二量体。
3. 各々の該単量体ペプチドが、アミノ酸配列
   Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
   式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₆、Ｘ₉、Ｘ₁₀及びＸ₁₁の各々が独立して遺伝的にコードされた２０個のＬ-アミノ酸のいずれかから選択され；Ｘ₃がＣであり；Ｘ₄はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであり；Ｘ₅がＭ、ＦまたはＩであり；Ｘ₇がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；そしてＸ₈がＣである、
   を含んでなる請求の範囲第２項記載のペプチド二量体。
4. Ｘ₄がＲまたはＨであり；Ｘ₅がＦまたはＭであり；Ｘ₆がＩ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶであり；Ｘ₇がＤまたはＶであり；Ｘ₉がＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴであり；そしてＸ₁₀がＡ、Ｇ、Ｐ、ＲまたはＹである、請求の範囲第３項記載のペプチド二量体。
5. Ｘ₁がＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであり、Ｘ₂がＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＳまたはＴであり；Ｘ₄がＲまたはＨであり；Ｘ₉がＫ、Ｒ、ＳまたはＴであり；Ｘ₁₀がＰである、
   請求の範囲第４項記載のペプチド二量体。
6. 該単量体ペプチドが
   

   

   である、請求の範囲第１項記載のペプチド二量体。
7. 請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のペプチド二量体の少なくとも１つを含んでなる製薬学的組成物。
8. 請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のペプチド二量体の少なくとも１つを有効成分として含んでなる、欠乏したＥＰＯまたは少ないか欠乏した赤血球集団により特徴づけられる疾患を有する患者を処置するための製薬学的組成物。
9. 該二量体が共有結合を介してポリエチレングリコール・リンカーにより形成されたものである、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のペプチド二量体。
10. 該単量体ペプチド単位が、活性化ベノジアゼピン、オキシアザロン、アザラクトン、アミニミドまたはジケトピペラジン上で二量化されている、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のペプチド二量体。
11. 該単量体ペプチドが、Ｎ-末端対Ｎ-末端で共有結合されている、請求の範囲第９項記載のペプチド二量体。
12. 該単量体ペプチドが、Ｎ-末端対Ｎ-末端で共有結合されている、請求の範囲第１０項記載のペプチド二量体。
13. 該単量体ペプチドが、Ｎ-末端対Ｃ-末端で共有結合されている、請求の範囲第９項記載のペプチド二量体。
14. 該単量体ペプチドが、Ｎ-末端対Ｃ-末端で共有結合されている、請求の範囲第１０項記載のペプチド二量体。

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