JP4031033B2 - Ｔ細胞の改良トランスフェクション法 - Google Patents
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Description
政府支持
本明細書に記載した研究は、ＮＭＲＤＣ認可６１１５３ＮＡＥ．４１２０．００１．１４０２により一部支持されている。従って、米国政府は、本発明の権利を有する。
発明の背景
真核細胞における外来ＤＮＡの発現は、遺伝子発現の調節から遺伝子導入に基づく治療法まで広範囲にわたる生物学的主題の研究を可能にするものである。哺乳動物細胞へ遺伝子導入する多くの方法が考案されている。これらには、クローン化レトロウイルスベクターによるインビボおよびインビトロ感染（Shimotohno,K.,およびTemin,H.M.(1981)Cell 26:67-77;Cone,R.D.Mおよびulligan,R.C.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6349-6353;Dubensky,T.W.,Campbell,B.A.,およびVillareal,L.P.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7529-7533;Seeger,C.,Ganem.D.およびVarmus,H.E.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5849-5852）、リン酸カルシウムによるＤＮＡの共沈（Chu,G.,およびSharp,P.(1981)Gene 13;197-202;Benvenistry,N.およびReshef,L.(1986)Proc Natl.Acad.Sci.USA 83:9551-9555）、ＤＡＮのリポソーム封入（Felgner,P.I.,およびRingold,G.M.(1989)Nature 337:387-388;Kaneda,Y.,Iwai,K.,およびUchida,T.(1989)Science 243:375-378）、プラスミドＤＮＡの直接注入（Walff,J.A.,Malone,R.W.,Williams,P.,Chong,W.,Acsadi,G.,Jani,A.,およびFelgner,P.L.(1991)Science 247:1465-1468）、ＤＥＡＥ−デキストラン（McCutchan,J.H.,およびPagano,J.S.(1968)J.Natl.Cancer Inst 41:351-357）、エレクトロポレーション（Neumann,E.,Schaefer-Ridder,M.Wang,Y.,およびHofschneider,P.H.(1982)EMBO J.1:841-845;Cann,A.J.,Koyanagi,Y.,およびChen,I.S.Y.(1988)Oncogene 3:123-128）、および細胞および組織のＤＮＡ−被覆粒子ボンバードメント（Yang,N-S.,Burkholder,J.,Roberts,B.,Martinell,B.,およびMcCabe,D.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9568-9572）がある。
遺伝子を含む外来核酸分子での様々な細胞タイプのトランスフェクションは、外来遺伝子の発現には有効であるが、個体から得られた一次Ｔリンパ球類、例えば、末梢血Ｔリンパ球は、外来ＤＮＡのトランスフェクションおよび発現に対して不応であることが分かっている。一次Ｔリンパ球類はまた、増殖のために第１刺激を与えたときに、導入した核酸の発現に対して不応であることも分かっている。そのため、外来ＤＮＡを効率良く一次Ｔ細胞へ導入でき、Ｔ細胞中で外来ＤＮＡを発現させるシステムに対する要望が依然としてある。
概要
本発明は、遺伝子のＴ細胞中での発現を古典的なトランスフェクション技術と比較して高めた、遺伝子を含む核酸分子でのＴ細胞の改良トランスフェクション法を提供する。本発明の方法は、特に、古典的なトランスフェクション技術には不応である一次Ｔ細胞のトランスフェクションに有用である。この方法は、増殖Ｔ細胞をその増殖Ｔ細胞を刺激する１またはそれ以上の作用物質と、核酸分子をそのＴ細胞に導入する前に、接触させることを含む。本発明の一実施態様では、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に対する一次活性化シグナルを提供する第１作用物質およびコスティミュラトリー・シグナル（costimulatory signal）を提供する第２作用物質を組み合わせたもので刺激する。本発明の方法は、特に、遺伝子治療における様々な応用を有する。
【図面の簡単な説明】
図１は、１μg／mlの抗ＣＤ３被覆プレートおよび抗ＣＤ２８で刺激した（０日目）後、１、５、７、９および１１日目のＣＤ２８+Ｔ細胞の相対細胞数および細胞容量グラフ表示を表す。
図２は、抗ＣＤ２８mＡb９．３（αＣＤ２８）の存在下、飽和量の固定化抗ＣＤ３mＡbＧ１９−４（αＣＤ３）で刺激した、新たに単離したＣＤ２８+Ｔ細胞の成長曲線を表す。
図３は、飽和量の固定化抗ＣＤ３mＡbＧ１９−４（αＣＤ３）および抗ＣＤ２８mＡb９．３（αＣＤ２８）による第１刺激（１日目）または第２刺激（８日目）後、０、６、２４および７２時間培養した一次ＣＤ２８+Ｔ細胞中のＥts−１（ＥＴＳ−１）およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）mＲＮＡのレベルを示すノーザン・ブロットである。
図４は、まず休止Ｔ細胞（Rest）を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に２日間インキュベーションし、次いで、抗ＣＤ２８単独（αＣＤ２８）で３日間インキュベーションし、トランスフェクションの１０時間前に刺激（第１刺激）し、Ｔ＝０でトランスフェクションし、トランスフェクション後３０時間で再刺激（第２刺激）し、１０時間後に収集するというトランスフェクションプロトコールの一例の略式表示である。
図５は、トランスフェクションの１０時間前にホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）または、ならし培地単独（ＭＥＤ）で刺激し、トランスフェクション後４０時間で収集した、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせた、指数増殖しているＴ細胞由来の細胞抽出物で実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図６（パネルＡ〜Ｄ）は、アクリジンオレンジ染色した一次Ｔ細胞のフロー・サイトメトリー分析および下記の条件で培養した一次Ｔ細胞の増殖アッセイの結果を示す：未処理休止一次Ｔ細胞（パネルＡ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で３日間刺激したＴ細胞（パネルＢ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で３日間刺激し、その後、新たな培地で更に３日間インキュベーションしたＴ細胞（パネルＣ）、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で３日間刺激し、ホルボール−１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ）とイオノマイシンで１０時間刺激し、その後、新たな培地で更に２日間と１４時間インキュベーションしたＴ細胞（パネルＤ）。アクリジンオレンジ染色した細胞のフロー・サイトメトリー分析のグラフ表示は、細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ含量を示し、これは、細胞周期のＧ０（％Ｇ０）、Ｇ１（％Ｇ１）、およびＳ／Ｇ２Ｍ（％Ｓ／Ｇ２Ｍ）期における細胞数の指標である。
図７は、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、１０時間後に収集した指数増殖しているＴ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図８は、ＨＩＶ−１−ＣＡＴ発現構築物でトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、１０時間後に収集した指数増殖しているＴ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図９は、ノーザン・ブロット分析により測定した、培地単独（ＭＥＤ）で１２時間または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３）で１、６、１２および２４時間培養したＣＤ２８+Ｔ細胞中の総ＲＮＡ含量（パネルＡ）またはＩＬ−２の場合のmＲＮＡレベル（パネルＢ）およびＨＬＡの場合のmＲＮＡレベル（パネルＣ）を表す。パネルＤは、培地単独（ＭＥＤ）と共に１２時間または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３）と共に１、６、１２、２４または４８時間インキュベーションしたＴ細胞により産生されたＩＬ−２の量、および抗ＣＤ３と共に培養後４８時間での細胞周期のＳ期、Ｇ２またはＭ期の細胞割合を示す。
図１０は、ＩＬ２−ＣＡＴ発現構築物でトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、１０時間後に収集した指数増殖しているＴ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図１１は、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせた休止Ｔ細胞で、トランスフェクションの１０時間前に培地単独（１日目：ＭＥＤ）、抗ＣＤ２８（１日目：αＣＤ２８）、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（１日目：ＳＥＡ）、またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（１日目：ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で、または、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で５日間処理し、次いで、トランスフェクション前の１０時間、ならし培地（６日目：ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（６日目：ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で処理した休止Ｔ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図１２は、増殖Ｔ細胞をＲＳＶ−ＣＡＴで、またはプラスミドなし（ＭＯＣＫ）でトランスフェクションさせた後０、６、２４または４８時間の増殖Ｔ細胞で、トランスフェクションの１０時間前にホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）または、ならし培地単独（ＭＥＤ）で刺激し、ＲＳＶ−ＣＡＴのＣＡＴコード領域由来のＥcoＲＩフラグメントとハイブリダイズさせたＴ細胞から抽出した核ＤＮＡ（ＮＵＣＬＥＡＲ、パネルＡ）または細胞質ＤＮＡ（ＣＹＴＯ、パネルＢ）のサザン・ブロットのオートラジオグラムを示す。１（１ｃ）、１０（１０ｃ）、１００（１００ｃ）、および１０００（１０００ｃ）コピーのＲＳＶ−ＣＡＴ／細胞に相当するプラスミドＤＮＡを対照として使用した。（lin）鎖状プラスミド；（sc）スーパーコイル状プラスミド。分子量マーカーからのフラグメントのサイズ（キロベース、kb）は、サザン・ブロットの左側に表す。
図１３は、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、ＲＳＶ−ＣＡＴのＣＡＴコード領域由来のＥcoＲＩフラグメントとハイブリダイズさせた指数増殖しているＴ細胞から抽出した核ＤＮＡのサザン・ブロットのオートラジオグラムを示す。１（１ｃ）、１０（１０ｃ）、１００（１００ｃ）、および１０００（１０００ｃ）コピーのＲＳＶ−ＣＡＴ／細胞に相当するプラスミドＤＮＡを対照として使用した。（lin）鎖状プラスミド；（sc）スーパーコイル状プラスミド。Ｍ：分子量マーカー。
図１４は、ＩＬ２−ＣＡＴ発現構築物でトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、ＩＬ２−ＣＡＴのＣＡＴコード領域由来のＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントとハイブリダイズさせた指数増殖しているＴ細胞から抽出した核ＤＮＡのサザン・ブロットのオートラジオグラムを示す。１、１０、１００、および１０００コピーのＩＬ２−ＣＡＴ／細胞に相当するプラスミドＤＮＡを対照として使用した。（lin）鎖状プラスミド；（sc）スーパーコイル状プラスミド。Ｍ：分子量マーカー。
図１５は、32Ｐ−放射性標識した鎖状化ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前にホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）または、ならし培地単独（ＭＥＤ）で刺激し、トランスフェクション直後（０）、トランスフェクション後６、２４または４８時間で収集したＴ細胞の核または細胞質から回収した毎分のカウント数（cpm）の割合を表す。毎分のカウント数の割合は、トランスフェクション細胞足す毎分のカウント数の総数に比例して計算される。
図１６は、ＲＳＶ−ＣＡＴまたはＨＩＶ−１−ＣＡＴでトランスフェクションさせた増殖Ｔ細胞で、培地単独（ＭＥＤ）、単球（ＭＯＮＯ）、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、または単球およびスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＭＯＮＯ＋ＳＥＡ）でトランスフェクション前時間処理し、トランスフェクション後４０時間で収集した増殖Ｔ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
詳細な説明
本発明は、遺伝子をＴ細胞中で発現させるための、遺伝子を含む核酸分子によるＴ細胞の改良トランスフェクション法を提供する。本発明の方法は、増殖Ｔ細胞をその増殖Ｔ細胞を刺激する少なくとも１つの作用物質と、核酸分子をそのＴ細胞に導入する前に接触させ、そうしてその遺伝子をそのＴ細胞中で発現させることを含む。
本発明の方法は、少なくともその一部において、遺伝子を含む核酸により一次Ｔ細胞をトランスフェクションしても一次Ｔ細胞が増殖しておらず、また更に、Ｔ細胞中で一次活性化シグナルおよびコスティミュラトリー・シグナルを誘起する作用物質などの刺激性作用物質で刺激しない場合にはその遺伝子はほとんど発現されないという観察に基づくものである。Ｔ細胞は、好ましくは、核酸をＴ細胞に導入する約１０時間前に刺激性作用物質と接触させる。こうして、増殖Ｔ細胞を、遺伝子を含む核酸をそのＴ細胞に導入する前に刺激することにより、Ｔ細胞中での外来遺伝子の有意な発現を達成できる。
従って、本発明は、遺伝子をＴ細胞中で発現させるための、遺伝子を含む核酸分子によるＴ細胞の改良トランスフェクション法を提供する。古典的なＴ細胞トランスフェクション法に優る本発明方法により提供される改良点は、核酸分子を増殖Ｔ細胞に導入する前（例えば、数時間前）にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させることを含む。本発明の方法により、在来のトランスフェクション技術よりもずっと高い、Ｔ細胞に導入した遺伝子の発現が可能である。本発明の方法は、特に、対象となる遺伝子を一次Ｔ細胞に導入し、かつ発現させるのに有用である。そのため、本発明の具体的な実施態様では、Ｔ細胞を被験体から入手し、本発明の方法に従い核酸分子によりインビトロでトランスフェクションさせ、宿主に再度与える。対象となる遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子、またはアンチセンス分子またはリボザイムなどの機能性ＲＮＡ分子をコードする遺伝子であり得る。対象となる遺伝子は、Ｔ細胞を保護するタンパク質類、Ｔ細胞にとって毒性であるタンパク質類、またはＴ細胞から分泌されて他の細胞に作用するタンパク質類を含む対象となるあらゆるタンパク質をコードし得る。従って、本発明の方法は、例えば、遺伝子療法、Ｔ細胞機能の変更およびＴ細胞中でのタンパク質の産生に応用できる。
１．本発明の方法に従いトランスフェクションさせることができるＴ細胞
本発明は、遺伝子を含む核酸分子でＴ細胞をトランスフェクションさせ、その遺伝子をＴ細胞中で発現させる方法に関する。用語“Ｔ細胞”は、当分野で定義されているＴリンパ球を表し、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図する。Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ８+Ｔ細胞、またはＣＤ４-ＣＤ８-Ｔ細胞であることができる。Ｔ細胞はまた、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞などのＴヘルパー細胞であることもできる。ＣＤ４などの少なくとも１つのマーカーにより互いに異なるＴ細胞は、本明細書ではＴ細胞の“サブセット”と称する。
Ｔ細胞は、純粋なＴ細胞集団であることができ、あるいは、Ｔ細胞は、Ｂ細胞および／または他の末梢血細胞などの異なるタイプの細胞をもつ集団中にあることもできる。Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞などのＴ細胞サブセットの純粋な集団であることができ、またＴ細胞の異なるサブセットを含むＴ細胞集団であることもできる。本発明の他の実施態様では、Ｔ細胞は、長期間培養維持されるＴ細胞クローンである。Ｔ細胞クローンは、様々な度合で形質転換させることができる。特定の実施態様では、Ｔ細胞は、培養中無期限に増殖するＴ細胞クローンである。
本発明の好ましい実施態様では、Ｔ細胞は、一次Ｔ細胞である。用語“一次Ｔ細胞”は、長期間培養維持されるＴ細胞とは反対に、個体から得られたＴ細胞を含むことを意図する。そのため、一次Ｔ細胞は、好ましくは、被験体から得られた末梢血Ｔ細胞である。一次Ｔ細胞集団は、ほとんど一種のＴ細胞サブセットから構成され得る。あるいは、一次Ｔ細胞集団は、異なるＴ細胞サブセットから構成されていてもよい。
Ｔ細胞は、健常個体由来のものであることができ、またあるいは、Ｔ細胞は、疾病をもった個体由来のものであってもよい。この疾病とは、ウイルス感染、細菌感染またはその他微生物による感染から起こるような感染性疾患であり得る。特定の実施態様では、Ｔ細胞は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した個体由来のものである。本発明のまた別の実施態様ではＴ細胞は、自己免疫疾患を罹病している被験体、またはこれを受け易い被験体由来のものである。Ｔ細胞は、ヒト起源、ハツカネズミ起源、またはその他あらゆる哺乳動物種のものであり得る。
本発明の方法によれば、活発に増殖しているＴ細胞に核酸分子を導入する。Ｔ細胞を様々な作用物質、例えば、Ｔ細胞に一次活性化シグナルおよびコスティミュラトリー・シグナルを与える作用物質類の組み合わせ、と接触させることにより、Ｔ細胞を刺激して、増殖させることができる。Ｔ細胞を刺激して増殖させるのに使用され得る作用物質類は、当分野ではよく知られており、下記２章に記載している。増殖のために刺激されるＴ細胞は、細胞拡張、クランピング（clumping）、および培養培地の酸性化を特徴とする。このため、Ｔ細胞増殖は、例えば、コウルター計数器（Coulter Counter）などによるＴ細胞のサイズ検査または容量測定により立証できる。休止Ｔ細胞は、平均直径約６．８ミクロンを有する。初期活性化および刺激後のＴ細胞平均直径は、４日目に１２ミクロンに上昇し、およそ６日目に減少し始めるであろう。更に、Ｔ細胞増殖は、トリチウム化チミジン摂取などの当分野の標準技術によっても評価できる。
２．刺激性作用物質
本発明の方法は、核酸分子を増殖Ｔ細胞に導入する前に、増殖Ｔ細胞を少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させることを含む。用語“刺激性作用物質”は、Ｔ細胞中へトランスフェクションした核酸分子に含まれる遺伝子の発現レベルが、核酸分子をＴ細胞に導入する前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させた場合に、核酸分子を導入する前に刺激性作用物質と接触させなかったＴ細胞におけるよりも高いように、Ｔ細胞にシグナルを提供する作用物質類を含むことを意図する。
本発明の具体的な実施態様では、刺激性作用物質は、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質である。用語“一次活性化シグナル”は、典型的には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して誘発される、Ｔ細胞の活性化を誘起するシグナル類を含むことを意図する。Ｔ細胞の活性化は、コスティミュラトリー・シグナルなどの第２シグナル受容時にＴ細胞を増殖および分化させるようにＴ細胞を誘導するようなＴ細胞の修飾を含むことを意図する。具体的な実施態様では、一次活性化シグナルは、Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体と関連するＣＤ３複合体を接触させる作用物質により提供される。好ましい実施態様では、この作用物質は、ＣＤ３に反応性の抗体、例えば、モノクローナル抗体ＯＫＴ３（American Type Culture Collection, Rockville,MDから入手；番号ＣＲＬ８００１）である。本発明のその他の実施態様では、刺激性作用物質は、Ｔ細胞上でＣＤ２複合体を刺激する作用物質、例えば、抗体の組み合わせ、例えば、Ｔ１１．３＋Ｔ１１．１またはＴ１１．３＋Ｔ１１．２である（例えば、Meuer,S.C.等,(1984)Cell36:897-906参照）。
本発明の好ましい実施態様では、Ｔ細胞中で一次活性化シグナルおよびコスティミュラトリー・シグナルの両方を刺激する作用物質の組み合わせでＴ細胞を刺激する。用語“共刺激性（コスティミュラトリー）作用物質（costimulatory agent）”は、一次活性化シグナルを受けたＴ細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）を刺激して増殖させるかまたはＩＬ−２、ＩＬ−４、またはインターフェロン−γなどのサイトカインを分泌させるようなコスティミュラトリー・シグナルをＴ細胞に提供する作用物質類を含むことを意図する。特定の実施態様では、共刺激性作用物質はＣＤ２８またはＣＴＬＡ４分子とＴ細胞表面で相互作用する。更に一層具体的な実施態様では、コスティミュラトリー・シグナルは、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４のリガンド、例えば、Ｂリンパ球抗原Ｂ７−１またはＢ７−２である。用語“ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態”は、Ｂ７−１およびＢ７−２分子、それらのフラグメント、またはそれらの修飾形を含むことを意図し、これらは、Ｔ細胞にコスティミュラトリー・シグナルを提供する能力がある。ＣＤ２８の天然リガンドの共刺激性形態は、例えば、活性化末梢血リンパ球をＣＤ２８の天然リガンドの一形態と接触させ、標準Ｔ細胞増殖アッセイを実施することにより、同定できる。従って、ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態は、Ｔ細胞の増殖を刺激する能力がある。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４の天然リガンドの刺激性形態は、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９５／０３４０８に記載されている。
核酸分子をＴ細胞に導入する前に、Ｔ細胞刺激のために使用できるその他の作用物質類には、Ｔ細胞活性化および／または共刺激（コスティミュレーション）に関連する１またはそれ以上の細胞内シグナル伝達経路を刺激する作用物質類がある。本発明の好ましい実施態様では、刺激性作用物質はイオノマイシンまたはＡ２３１８７などのカルシウムイオノホアである。あるいは、刺激性作用物質は、ホルボールエステルなどのタンパク質キナーゼＣを刺激する作用物質であることもできる。好ましいホルボールエステルは、ホルボール−１２，１３−ジブチレートである。本発明の更に一層好ましい実施態様では、核酸分子でのトランスフェクションの前に、Ｔ細胞をカルシウムイオノホアとホルボールエステルとの組み合わせと接触させる。刺激性作用物質は、タンパク質チロシンキナーゼを活性化する作用物質であってもよい。タンパク質チロシンキナーゼを刺激する好ましい作用物質はペルバナデートである（O'Shea,J.J.,等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10306）。
本発明の更にその他の実施態様では、刺激性作用物質はポリクローナルアクチベーターである。ポリクローナルアクチベーターには、Ｔ細胞の原形質膜上で発現する糖タンパク質に結合する作用物質類があり、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリン（Ｃon Ａ）およびアメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）などのレクチン類がある。
クローンに特異的活性化シグナルを提供することにより、Ｔ細胞集団においてＴ細胞のあるクローンのみを選択的にトランスフェクションさせることが可能である。Ｔ細胞クローンの特異的活性化は、例えば、抗原提示細胞により与えられる特異的抗原を用いて達成できる。
本方法の更にその他の実施態様では、刺激性作用物質は、ＩＬ−２などのリンホカインである。リンホカインは、好ましくは、Ｔ細胞を刺激するその他の作用物質、例えば、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質、と組み合わせて使用する。従って、本発明の好ましい実施態様では、核酸分子がＴ細胞中で発現するよう、核酸分子でＴ細胞をトランスフェクションさせる前に、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質（例えば、抗ＣＤ３抗体）と有効量のＩＬ−２を組み合わせたものと接触させる。
使用できるその他の刺激性作用物質には、スーパー抗原類がある。本明細書で定義した用語“スーパー抗原”は、Ｔ細胞増殖を刺激する能力がある細菌エンテロトキシン類またはその他の細菌タンパク質を含むことを意図する。スーパー抗原類には、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、およびＳＥＥなどのスタフィロコッカスエンテロトキシン（ＳＥ）がある。スーパー抗原類はまた、レトロウイルススーパー抗原のようにウイルス起源であることができる。
当分野で既知の、または本明細書に記載したＴ細胞刺激アッセイを用いて同定できる、単独またはその他の作用物質と併用するかのいずれかでＴ細胞を刺激する能力のある別の作用物質類もまた、本発明の範囲内である。核酸分子をＴ細胞に導入する前にＴ細胞を刺激するために、上記作用物質類のあらゆる組み合わせが使用できる。
刺激性作用物質は、溶液で、または固体表面に結合させて使用できる。この固体表面は、例えば、組織培養皿またはビーズの表面であり得る。刺激性作用物質の性質にもよるが、固体表面への結合は、当分野でよく知られている方法により実施できる。例えば、市販の架橋剤（Pierce,Rockford IL）を用いてタンパク質を細胞表面に化学的に架橋させることもでき、また、４℃で一晩インキュベーションすることによりプラスチック上に固定化することもできる。数種の作用物質を用いてＴ細胞を刺激する場合、その幾つかが溶液状であってもよく、またその幾つかが固体支持体に結合させたものであってもよい。好ましい実施態様では、固相結合抗ＣＤ３抗体と可溶性抗体ＣＤ２８抗体を組み合わせたものでＴ細胞を刺激する。
Ｔ細胞に添加される刺激性作用物質の特定用量は、刺激性作用物質の種類によって変わる。典型的には、当分野で報告されているように、Ｔ細胞を刺激して増殖およびサイトカインを分泌させるのに使用される用量と同量で刺激性作用物質を使用する。
３．トランスフェクション前刺激のプロトコール
本発明の特定の実施態様では、遺伝子を含む核酸分子をＴ細胞に導入する前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の好ましい実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する少なくとも２時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明のその他の実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する少なくとも４時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の別の実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する少なくとも６時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の別の実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する少なくとも８時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。別の実施態様では、トランスフェクションの多くとも約２時間前、トランスフェクションの多くとも約４時間前、トランスフェクションの多くとも約６時間前、トランスフェクションの多くとも約８時間前、トランスフェクションの多くとも約１０時間前、トランスフェクションの多くとも約１２時間前、トランスフェクションの多くとも約１４時間前、トランスフェクションの多くとも約１６時間前、トランスフェクションの多くとも約１８時間前、トランスフェクションの多くとも約２０時間前、トランスフェクションの多くとも約２２時間前、トランスフェクションの多くとも約２４時間前に、Ｔ細胞を刺激性作用物質と接触させる。
本発明のより一層好ましい実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する約１時間から２４時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の最も好ましい実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子をトランスフェクションする約５から１５時間前、例えば約１０時間前に増殖Ｔ細胞を少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させる。
本方法の一実施態様では、増殖Ｔ細胞を少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させ、更に核酸分子でトランスフェクションさせる。本方法のその他の実施態様では、非増殖Ｔ細胞を増殖させるために刺激し、それから、本発明の方法に従いトランスフェクションさせる前に少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させる。非増殖Ｔ細胞は、上記“刺激性作用物質類”のところで記載のような当分野でよく知られている作用物質を用いて刺激し、増殖させる。好ましい作用物質類には、一次活性化シグナルを提供する作用物質およびコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質の組み合わせがある。Ｔ細胞の増殖を刺激するその他の好ましい作用物質類の組み合わせには、ホルボールエステルとカルシウムイオノホア、またはＰＭＡとＩＬ−２の組み合わせがある。
一次Ｔ細胞のトランスフェクション法の最も好ましい実施態様によれば、休止一次Ｔ細胞を、まず、Ｔ細胞の増殖を刺激する少なくとも１つの作用物質、例えば、カルシウムイオノホアとホルボールエステルの組合わせ物と接触させる。Ｔ細胞増殖誘起後、およそ３から８時間の間で、好ましくはおよそ５時間で、増殖Ｔ細胞を、そのＴ細胞を刺激する少なくとも１つの作用物質と接触させる。最後に、刺激性作用物質と接触後、２から１５時間、好ましくは約１０時間で、Ｔ細胞を対象となる遺伝子を含む核酸分子でトランスフェクションさせ、そうしてその遺伝子をＴ細胞中で発現させる。その他の実施態様では、Ｔ細胞のトランスフェクション後に、Ｔ細胞を更に、Ｔ細胞を刺激する作用物質と接触させる。
被験体から一次Ｔ細胞を得るために、末梢血単核細胞を被験体から単離し、密度勾配遠心分離、例えば、Ficoll/Hypaqueにより精製できる。具体的な実施態様では、次いで、精製した末梢血細胞を本発明の方法に従い核酸分子でトランスフェクションさせる。本方法の他の実施態様では、トランスフェクションさせる前に、更に特定の細胞タイプ中で末梢血単核細胞を豊富化する。単球は、例えば、プラスチック上に付着させることにより除去できる。所望ならば、更に、ＣＤ４+Ｔ細胞集団を、市販のモノクローナル抗体（mＡb）（例えば、抗ＣＤ１４（Ｍo２）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍo１）、抗ＣＤ２０（Ｂ１）、抗ＣＤ１６（３Ｇ８）および抗ＣＤ８（７ＰＴ ３Ｆ９）mＡb）を用いるモノクローナル抗体（mＡb）および抗マウス−Ｉg被覆化磁気ビーズを用いて残りの単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＣＤ８+Ｔ細胞から分離することにより、豊富化できる。本発明の方法は、また、ＣＤ４+Ｔ細胞のサブセット、例えば、ＣＤ４+ＣＤ４５ＲＡ+（天然ＣＤ４+Ｔ細胞）およびＣＤ４+ＣＤ４５ＲＯ+（記憶Ｔ細胞）Ｔ細胞サブセットにも応用できる。これらは、上記のようにして製造でき、ＣＤ４+ＣＤ４５ＲＡ+細胞の製造には更に抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１）を使用し、またＣＤ４+ＣＤ４５ＲＯ+Ｔ細胞の製造には更に抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（２Ｈ４）を使用する。
精製効率は、Ｔ細胞の特定のサブセットを認識する抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４mＡb、または更なる抗体、その後、フルオレセインイソチオシアナートコンジュゲート化ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Fisher,Pittsburgh,PA）、または他の第２抗体を用いるフロー・サイトメトリー（Coulter, EPICS Elite）により分析できる。
本発明の好ましい実施態様では、本発明の方法は、実施例の章で記載のように、更に、Ｔ細胞のトランスフェクション後にＴ細胞を刺激してインビトロで拡張（expand）させることができる。具体的な実施態様では、Ｔ細胞を、一次活性化シグナルを提供する作用物質、例えば抗ＣＤ３、およびコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質、例えば抗ＣＤ２８抗体と共にインキュベーションする。２日後、細胞を新しい培地で希釈し、コスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質を培養物に加える。次いで、Ｔ細胞を、そのサイズ分布が休止細胞プロフィール近くに戻る（約１０日）まで２日毎にカウントし、サイズ測定し、新たな培地で希釈する。その後、Ｔ細胞を、一次活性化シグナルを提供する作用物質およびコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質で再刺激できる。Ｔ細胞サイズ測定およびカウントは、本明細書に記載のように、コウルター計数器を用いて実施できる。
更に一層好ましい実施態様では、Ｔ細胞は一次Ｔ細胞である。従って、Ｔ細胞を被験体から入手し、本発明の方法に従いトランスフェクションさせ、インビトロで拡張させることができる。本発明のその他の実施態様では、トランスフェクションさせ、かつ拡張させたＴ細胞を被験体に再度投与する。被験体に投与する前に、例えば、勾配遠心分離により更にＴ細胞を精製するのが好ましい場合もある。
４．Ｔ細胞のトランスフェクション
本発明は、遺伝子を含む核酸でＴ細胞をトランスフェクションさせ、その遺伝子をＴ細胞中で発現させる方法に関する。“Ｔ細胞をトランスフェクションさせる”の用語は、核酸分子をＴ細胞に導入できるあらゆる手段を含むことを意図する。用語“トランスフェクション”は、エレクロトポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス感染を含む、核酸の哺乳動物細胞への導入に有用な様々な技術を包含する。哺乳動物細胞をトランスフェクションさせる適切な方法は、Sambrook等（Molecular Cloning;A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)）およびその他の実験書に見ることができる。
本発明の好ましい実施態様では、対象となる遺伝子をコードする核酸分子をウイルスベクターを用いてＴ細胞に導入する。このようなウイルスベクターには、例えば、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス１がある。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボでの特にヒトへの外来遺伝子導入の優れた組換え遺伝子運搬システムであると一般に理解されている。あるいは、それらは、外来遺伝子をエクスビボでＴ細胞に導入するのにも使用できる。これらのベクターは、遺伝子をＴ細胞へ効率良く運ぶものであり、導入された核酸は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに安定に組込まれる。レトロウイルスの使用に当たっての重要な必須要件は、特に、細胞集団中で野生型ウイルスが蔓延する可能性について、その使用の安全性を確実にすることである。複製欠損性レトロウイルスのみを産生する分化した細胞系列（“パッケージング細胞”と称する）の開発は、遺伝子治療目的の遺伝子導入における使用について十分に特徴付けられている（検討のためMiller,A.D.(1990)Blood 76:271参照）。従って、レトロウイルスコード配列（gag、pol、env）の一部を対象となる遺伝子で置き換えてレトロウイルスを複製欠損性にすることにより組換えレトロウイルスを構築できる。この場合、複製欠損性レトロウイルスは、ビリオン中にパッケージされるので、これを、標準技術によりヘルパーウイルスを使用して、標的細胞を感染させるのに使用できる。組換えレトロウイルスを産生し、かかるウイルスを用いてインビトロまたはインビボで細胞を感染させるプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等（編）Greene Publishing Associates,(1989),Sections 9.10-9.14およびその他の標準実験マニュアルに見ることができる。適切なレトロウイルスの例には、当分野ではよく知られているpＬＪ、pＺＩＰ、pＷＥおよびpＥＭがある。同種指向性および両種指向性レトロウイルス系の両方を製造するのに適切なパッケージングウイルス系列の例には、ΨＣrip、ΨＣre、Ψ２およびΨＡmがある。
更に、ウイルス粒子表面のウイルスパッケージングタンパク質を修飾してレトロウイルスの感染スペクトル、更にレトロウイルス基盤のベクターの感染スペクトルを制限することが可能であることが示されている（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／２５２３４およびＷＯ９４／０６９２０参照）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルの修飾法は、細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスのenvタンパク質に結合させる（Roux等(1989)PNAS 86:9079-9083;Julan等(1992)J.Gen.Virol 73:3251-3255；およびGoud等(1983)Virology 163:251-254）；または細胞表面受容体リガンド類をウイルスenvタンパク質に結合させる（Neda等(1991)J.Biol.Chem.266:14143-14146）ことを含む。結合は、タンパク質またはその他の様々なもの（例えば、envタンパク質をアジアロ糖タンパク質に変換するラクトース）との化学的架橋形態であることができ、同じく、融合タンパク質（例えば、単鎖抗体／env融合タンパク質）を作成することによる。従って、本発明の具体的な実施態様では、適切な調節配列に作動可能に連結させた対象となる遺伝子を含む核酸分子を含有するウイルス粒子を、例えば、上記の方法に従い修飾することにより、それらはＴ細胞のサブセットを特異的に標的とすることができる。例えば、ウイルス粒子を、あるタイプのＴ細胞に特異的な、表面分子に対する抗体で被覆できる。特に、Ｔ細胞のＣＤ４分子を認識するウイルス粒子抗体に連結させることにより選択的にＣＤ４+Ｔ細胞を標的とすることが可能である。そのため、ＣＤ４+Ｔ細胞の感染は、ＣＤ８+Ｔ細胞の感染よりも優先的に起こるであろう。この方法は、特に、Ｔ細胞の特定のサブセットのみをトランスフェクションさせたい場合に有用である。一次Ｔ細胞を含むＴ細胞に対象となる遺伝子を含む核酸分子を導入し、かつ発現させるための更なるレトロウイルス系は、Kasid,A.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,473;Morecki,S.等(1991)Cancer Immunol.Immunother.32,342;Culver,K.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,88,3155；およびFiner,M.H.等(1994)Blood,83,43に記載されている。
本発明の有用なその他のウイルス遺伝子運搬システムは、アデノウイルス由来ベクターである。アデノウイルスのゲノムは、それが対象となる遺伝子産物をコードし発現するが、正常な細胞溶解ウイルス生活環で見られる複製能力については不活性化されているように、操作することができる。例えば、Berkner等(1988)Bio Techniques 6:616；Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434；およびRosenfeld等(1992)Cell 68:143-155参照。アデノウイルス株Ａdタイプ５ dl３２４またはその他のアデノウイルス株（例えば、Ａd２、Ａd３、Ａd７等）に由来する適切なアデノウイルスベクターは当業者にはよく知られている。組換えアデノウイルスは、細胞分裂していない細胞には感染する能力がない点である環境では有利であり得る。更に、ウイルス粒子は、精製および濃縮に対して相対的に安定かつ従順であり、また上記のように、感染スペクトルに作用するように修飾することもできる。更に、導入したアデノウイルスＤＮＡ（およびそれに含有される外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組込まれないが、エピソームの状態であり、よって、導入したＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）に組込まれるに至る状況で挿入突然変異誘発の結果として発生し得る潜在的な問題を回避できる。更に、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ収容力は、その他の遺伝子運搬ベクターと比べて大きい（８キロベースまで）（Berkner等、前掲、Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57:267）。現在使用されており、故に本発明でも好ましい多くの複製欠損性アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または部分を欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％ほどを保持している（例えば、Jones等(1979)Cell 16:683;Berkner等、前掲；およびGraham等, in Methods inMolecular Biology,E.J.Murray,Ed.(Humana,Clifton,NJ,1991)vol7,pp.109-127）。核酸分子に含まれる対象となる遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連リーダー配列、Ｅ３プロモーター、または外来的に付加したプロモーター配列の制御下にあり得る。
対象となる遺伝子を含む核酸分子の運搬に有用な更に別のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなど、効率良い複製および生産性生活環のためにヘルパーウイルスなどのその他のウイルスを必要とする天然の欠損ウイルスである（例えば、Muzyczka等、Curr.Topics in Micro. and Immunol.(1992)158:97-129参照）。アデノ随伴ウイルスは、高頻度の安定な組込み（インテグレーション）を示す（例えば、Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell,Mol.Biol.7:349-356;Samulski等(1989)J.Virol.63:3822-3828；およびMcLaughlin等(1989)J.Virol.62:1963-1973）。ＡＡＶの３００塩基対程を含むベクターをパッケージすることもでき、組込むことができる。外来ＤＮＡのためのスペースは、約４．５kbに限られている。Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260に記載されているようにＡＡＶベクターを用いてＤＮＡをＴ細胞中に導入できる。様々な核酸がＡＡＶベクターを用いて異なる細胞タイプに導入されている（例えば、Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.4:2072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51:611-619；およびFlotte等(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790参照）。遺伝子治療に応用できるその他のウイルスベクターシステムは、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、および数種のＲＮＡウイルスから誘導されている。
本発明のその他の実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子を、当分野ではよく知られている非ウイルス媒介トランスフェクション法によりＴ細胞に導入する。これらの方法には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、およびＤＥＡＥデキストラントランスフェクションがある。
更にその他の実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子を細胞運搬ベヒクルに載せてＴ細胞に輸送する。このようなベヒクルには、例えば、カチオン性リポソーム類（Lipofection（登録商標））または誘導体化（例えば、抗体コンジュゲート化）ポリリジンコンジュゲート類、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ類がある。これらのベヒクルは、プラスミド、ベクター、またはウイルスＤＮＡ中に取り込まれた核酸を運搬できる。具体的な実施態様では、Philip,R.等(1994)Mol.Cell.Biol.14,2411に記載のように、一次Ｔリンパ球を、カチオン性リポソームと複合体形成させたアデノ随伴ウイルスプラスミドＤＮＡでトランスフェクションさせることにより、一次Ｔリンパ球に核酸分子を効果的に導入できる。
本発明のその他の実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子を可溶性分子複合体の形態で特定の細胞中に運搬する。この複合体は、核酸結合剤および特異的Ｔ細胞の表面分子に結合する細胞特異的結合剤からなるキャリアーに解離可能に結合した核酸を含有し、続いて細胞にインターナリゼーションされ得るサイズのものである。このような複合体類は、米国特許第５，１６６，３２０号に記載されている。
本発明のその他の実施態様では、Yang,N.S.およびSun,W.H.(1995)Nature Medicine 1,481に記載のように粒子ボンバードメントにより核酸をＴ細胞に導入する。
５．対象となる遺伝子を含む核酸分子
本発明は、遺伝子を含む核酸分子をＴ細胞に導入する改良法に関する。用語“核酸分子”は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むこと、および一本鎖または二本鎖であり得ることを意図する。用語“遺伝子”は、ＲＮＡに転写され得るＤＮＡヌクレオチド配列、あるいは、少なくとも１つのタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ分子を含むことを意図する。
本発明の具体的な実施態様では、本発明の方法によりＴ細胞にトランスフェクションした際に、少なくとも１つのタンパク質がＴ細胞中で合成されるように、その遺伝子は、１またはそれ以上のオープン・リーディング・フレーム（転写解読枠）を含有するヌクレオチド配列、即ち、ペプチドをコードする配列からなる。少なくとも１つのタンパク質をコードするその遺伝子は、サイトカインをコードする遺伝子のようなあらゆる遺伝子であることができる。その遺伝子は１つのペプチドをコードしていてもよく、また数種のペプチド類をコードすることもできる。
本発明の別の実施態様では、その遺伝子は、本発明方法に従いＴ細胞に導入した際に１またはそれ以上の機能性ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子）中で発現される、ヌクレオチド配列である。本発明の好ましい実施態様では、機能性ＲＮＡ分子は、１またはそれ以上の外来遺伝子のＴ細胞中での発現を阻害または少なくとも低減する。そのため、本発明の方法は、選択した遺伝子のＴ細胞中での発現を低減するのに有用である。例えば、外来ＲＮＡの翻訳を低減させるために、Ｔ細胞をアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子を含む核酸分子でトランスフェクションさせる。“アンチセンス”核酸は、ワトソンおよびクリックの塩基対形成規則に従い構築される“センス”核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、タンパク質をコードするmＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合し得る。mＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、mＲＮＡのコード領域にみられる配列に相補的であることができるか、またはmＲＮＡの５’または３’非翻訳領域に相補的であることができる。好ましくは、アンチセンス核酸は、開始コドンの前にあるかまたは開始コドンにまたがる領域に、またはmＲＮＡの３’非翻訳領域内の領域に相補的である。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節については、Weintraub,H等, Antisense RNA as amolecular tool for genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986参照。
本発明のその他の実施態様では、本発明の方法に従い、Ｔ細胞にリボザイムをコードする核酸を導入することにより、外来遺伝子のＴ細胞中での発現を低減させる。リボザイムは、mＲＮＡなどの一本鎖核酸に対する相補的領域を有し、その一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。対象となる核酸に対する特異性を有するリボザイムは、核酸のヌクレオチド配列に基づき設計できる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を、その活性部位の塩基配列が対象となるmＲＮＡ中の切断される塩基配列と相補的であるように構築することができる。例えば、Cech等、米国特許第４，９８７，０７１号；およびCech等、米国特許第５，１１６，７４２号参照。
遺伝子を含む“核酸分子”は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であることができる。その核酸分子は、天然核酸分子の一部であってもよく、また合成的に作成したものであってもよい。核酸分子は、典型的には、その遺伝子を作動可能に連結させた調節配列を含有する。“作動可能に連結させた”とは、遺伝子のヌクレオチド配列を、Ｔ細胞中で遺伝子が発現（即ち、転写）できるような手段で、少なくとも１つの調節配列に連結させたという意味を意図する。調節配列は、当分野では認められており、適切なＴ細胞中での遺伝子の発現を目的として選択される。従って、調節配列の用語は、プロモーター類、エンハンサー類、およびその他の発現制御配列類を包含する。このような調節配列は、当業者には知られており、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press,San Diego,CA(1990)にも記載されている。
これらの調節配列には、遺伝子の転写および翻訳に必要とされるものがあり、プロモーター類、エンハンサー類、ポリアデニル化シグナル、および適切な細胞コンパートメントに分子を輸送するのに必要な配列があり得る。核酸が組換え発現ベクター中のｃＤＮＡであるとき、ｃＤＮＡの転写および／または翻訳を担う調節機能は、ウイルス配列により与えられることが多い。通常使用されるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０、およびレトロウイルスＬＴＲsに由来するものがある。
ｃＤＮＡに連結させる調節配列を選択して、例えば、誘導性エンハンサーの使用により構成的または誘導的転写を与えることができる。そのため、本発明の具体的な実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子は誘導性制御配列の制御下にあり、そうして、その核酸を含有するＴ細胞をその誘導性制御配列に影響を与える作用物質と接触させるか、または接触させないことにより、それぞれ、遺伝子の発現をオンまたはオフにすることができる。
具体的な実施態様では、核酸分子は、誘導性制御配列の制御下にある。哺乳動物細胞に使用する誘導性調節システムは、当分野では知られており、例えば、遺伝子発現を重金属イオン（Mayo等(1982)Cell 29:99-108;Brinster等(1982)Nature 296:39-43；Searle等(1985)Mol.Cel..Biol.5:1480-1489）、熱ショック（Nouer等(1991)in Heat Shock Response,e.d.Nouer,L.,CRC,Boca Raton,FL,pp167-220）、ホルモン（Lee等(1981)Nature 294:228-232;Hynes等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2038-2042；Klock等(1987)Nature 329:734-736;Israel & Kaufman(1989)Nucl.Acids Res.17:2589-2604およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／２３４３１）、テトラサイクリン（Gossen,M.およびBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／２９４４２）またはＦＫ５０６関連分子（ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／１８３１７）により調節するシステムがある。
誘導性制御配列は、全てのＴ細胞において、あるいは、Ｔ細胞の特定のサブセットにおいてのみ、例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、Ｔヘルパー２（Ｔh２）細胞において誘導性であることができる。誘導性制御配列は、１タイプのＴ細胞（例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞）中の一要因によって誘導可能であり、かつその他のタイプのＴ細胞（例えば、ＣＤ８+Ｔ細胞）中の他の要因によって誘導可能である配列であることもできる。
本発明のその他の実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子は、核酸分子の発現を構成的に起こす調節配列の制御下にある。核酸分子の構成的発現を起こすために核酸分子に作動可能に連結させた調節配列は、ウイルスの配列であり得る（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、またはレトロウイルスに由来する）。あるいは、Ｔ細胞受容体エンハンサーなどの構成性Ｔ細胞エンハンサーを使用できる（例えば、WinotoおよびBaltimore(1989)EMBO J.8:729-733）。
調節配列に作動可能に連結させた対象となる遺伝子を含む核酸分子は、典型的には、細菌中でのベクターのインビトロ選択および増幅に必要な配列を含むベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスＤＮＡ）内にある。そのベクターに乗せた遺伝子を発現させることができるベクターを本明細書では“発現ベクター”と称する。
６．本発明方法の応用性
本発明は、核酸分子中に含まれる遺伝子をＴ細胞に導入し発現させる改良法に関する。本発明の好ましい実施態様では、Ｔ細胞は、一次Ｔ細胞である。従って、本発明の方法により、従来の一次Ｔ細胞トランスフェクション法に比べて、一次Ｔ細胞に導入した遺伝子を高レベルで発現させることが可能である。遺伝子を含む核酸分子で一次Ｔ細胞をトランスフェクションさせて、その遺伝子をＴ細胞中で発現させる能力は、特に遺伝子治療において、多大の応用性を有する。
具体的な実施態様では、末梢血Ｔ細胞を、対象から入手し、対象となるタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸分子でエクスビボでトランスフェクションさせ、そのタンパク質をＴ細胞中で合成させる。そのＴ細胞を更に、対象に再投与してもよい。具体的な実施態様では、Ｔ細胞中で合成させた外来タンパク質をＴ細胞により分泌させる。従って、本発明は、個体中で分泌可能タンパク質を産生する方法を提供するものである。本発明の範囲内のタンパク質は、例えば、サイトカイン類、リンホカイン類、成長因子類がある。そのため、トランスフェクション化Ｔ細胞により産生されるタンパク質は、Ｔリンパ球自身よりも他の細胞を優先的に標的とすることができる。
あるいは、トランスフェクション化Ｔ細胞により産生されるタンパク質は、細胞内タンパク質または膜タンパク質である。具体的な実施態様では、外来タンパク質は、例えばウイルスにより感染からＴ細胞を防御するタンパク質である。かかる方法は、その一部がウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染してるいＴ細胞集団を拡張（イクスパンド）するのに有用である。そのため、Ｔ細胞集団を、全ての細胞に感染を付随蔓延させることなく、展開させることができる。
その他の実施態様では、外来タンパク質は、毒素などの特定のＴ細胞サブセットを殺すタンパク質である。そのタンパク質は、特定のＴ細胞サブセットに特異的な調節制御配列の制御下で遺伝子を持つことにより、選択的にそのＴ細胞サブセットを標的とすることができる。また、あるＴ細胞サブセットの選択的トランスフェクションを可能にするトランスフェクション法を用いることにより、外来遺伝子は特異的にあるタイプのＴ細胞を標的とすることも可能である。例えば、その膜上にＴ細胞サブセット特異的分子のリガンドを含有するリポソームでＴ細胞をトランスフェクションさせることができる。本発明方法によりＴ細胞に導入された遺伝子は、アデニンデアミナーゼ欠損に起因する深刻な複合免疫不全症などの遺伝子疾患を処置するために遺伝子設計することもできる。例えば、アデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子は、本発明の方法を用いて、一次Ｔリンパ球に導入し、そこで発現させることができる。本発明のその他の実施態様は、Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド（gp３９）の突然変異を特徴とし、かつヘルパーＴ細胞依存性抗体応答の欠如を特徴とする遺伝子疾患である、高ＩgＭ症候群の処置に関する。高ＩgＭ症候群の患者由来のＴ細胞を、gp３９をコードする核酸で、好ましくはそれ自身のプロモーターの制御下、エクスビボでトランスフェクションさせ、その後、患者にそのＴ細胞を投与できる。Ｔ細胞中の機能不全遺伝子、例えばＴ細胞シグナル伝達経路に関連するタンパク質をコードする遺伝子、に起因するその他の遺伝子疾患も、本発明の方法により処置できる。
続く発明は、下記実施例により更に例示説明するが、これは、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本出願に引用した全ての文献、継続中特許出願、および公開特許の内容は、出典明示により本明細書の一部とする。
実施例
実施例１−ＣＤ２８ + 末梢血Ｔリンパ球のインビトロ長期培養
直接的トランスフェクション実験は、生体内の推定上の調節配列の機能的重要性を証明することがしばしば要求される。この種の研究は、典型的には形質転換もしくは不滅化した細胞系を使用する。しかしながら、対象とする一次細胞の調節ＤＮＡ配列を検討するのが好ましい。細胞サイクル調節、特にＧ０−特異的遺伝子発現の予測的研究のためには、生理学的背景の維持が要求される。これらの実施例は、一次Ｔ細胞にトランスフェクションされた外来ＤＮＡの発現を促す条件の開発を行うようにデザインされている。
末梢血Ｔ細胞は、次のようにして調製した。軟膜を、２１−３１才の健康なドナーの白血球フォレシスによりまたは赤十字から入手した。末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、Ｆicoll−Ｈypaque（Ｐharmacia）クッションによる密度勾配遠心分離または白血球分離培地（Ｌitton Ｂionetics）で取得した。Ｔ細胞のＣＤ２８+サブセットは、文献（Ｊune, Ｃ.Ｈ., Ｌedbetter, Ｊ.Ａ., Ｇillespic, Ｍ.Ｍ., Ｌindste, Ｔ., and Ｔyhompson, Ｃ.Ｂ.(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol. 11:5435-5445）のヤギ抗マウスＩｇをコートした磁気粒子（Ｄynal Ｉnc）による免疫吸着を利用するネガティブ分離によって、PBMCsから単離した。細胞精製は、流速血球計および組織化学により、機械的に監視した。得られた細胞群は、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）をコンジュゲイトしたｍＡｂｓを用いる蛍光活性化細胞ソーター（FACS）分析によれば、＞９９％ＣＤ２+で、＞９８％ＣＤ２８+であった。単球、Ｂ細胞および大顆粒白血球は免疫蛍光分析では検出できなかった。別法としては、休止Ｔ細胞を、文献（Ｔhompson, Ｃ.Ｂ., Ｒyan, Ｊ.Ｊ., Ｓieckmann, Ｄ.Ｇ., Ｆinkelman, Ｆ.Ｄ., Ｍond, Ｊ.Ｊ. and Ｓcher, Ｉ.(1983)Ｊ. Ｉmmunol. Ｍethods 63:299-307）の遠心溶出法により単核細胞画分から調製した。これらの細胞は、流速血球計の測定では、＞９５％ＣＤ２+であった。両方法とも、細胞生存率は、トリパン・ブルー・エクスクルージョンによる測定では、＞９９％であった。
上記のようにして得られたヒト末梢血Ｔ細胞は、＞９９％ＣＤ２+、＞９８％ＣＤ２８+であり、休止期にあることが示された。この研究に使用された精製Ｔ細胞は、アクセサリー細胞を含まず、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、フォルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）またはイオノマイシン単独で刺激しても、試験管内で増殖しなかった。しかしながら、これらのＴ細胞は、固定化モノクローナル抗体（mAb）でTCK-CD3架橋させることにより、また適量のPMAとイオノマイシン（Ｌindsten, Ｔ., Ｊune, Ｃ.Ｈ., and Ｔhompson, Ｃ.Ｂ.(1988)ＥＭＢＯ Ｊ.,7:2787-2794）により刺激されて分裂し得た。この条件下で、休止Ｔ細胞の＞９０％が活性化され、細胞の大多数が同期的に細胞分裂の１回を行った。
休止Ｔ細胞を活性化し、培養による長期拡張（long-term expansion）を促進するには、上記のようにして新たに単離した休止Ｔ細胞を２×１０6個／mlの濃度で、完全培地（RPMI 1640(GIBCO)に１０％加熱不活化ウシ胎児血清(GIBCO)、2mML−グルタミン、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００mg／ml）および１５ml Ｈepes（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸；ｐＨ７．４；GIBCO）を添加し、３７℃で５％ＣＯ2とともに１夜静置したもの）中で培養した。１夜培養後、拡張プロトコールの第１日に、休止Ｔ細胞を、Ｊune et al.,(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.11；5433-5445に記載の可溶化抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８）ｍＡｂ ９．３（１μg/ml）の存在下にＣＤ３ε鎖に対する固定化抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）ｍＡｂＧ１９−４の飽和量で刺激した。CD3mAbG19-4(IgG1)は、文献（Ｌedbettger, Ｊ.Ａ., Ｍartin, Ｐ.Ｊ., Ｓpooner, Ｃ.Ｅ., Ｗofsy, Ｄ., Ｔsu, Ｔ.Ｔ., Ｂeatty, Ｐ.Ｇ. and Ｇladstone, Ｐ.(1985)Ｊ. Ｉmmunol.135:2331-2336）の方法で調製され、精製された。mAbG19-4は、文献（Ｇeppert, Ｔ.Ｄ., and Ｌipsky, Ｐ.Ｆ.,(1987)Ｊ. Ｉmmunol. 138:1660-1666）の記載によってプラスチック組織培養フラスコ／プレートの表面に増殖に適当な量を吸着させた。これを実施したのは、架橋（Ｗilliams, Ｊ.Ｍ., Ｒansil, Ｂ.Ｊ., Ｓhapiro, Ｈ.Ｍ., and Ｓtrom, Ｔ.Ｂ.(1984)Ｊ. Ｉmmunol. 133;2986-2995）が必要とされるからであり、ＣＤ３複合体のインターナリゼーション（Ｌebetter, Ｊ.Ａ., Ｈune, Ｃ.Ｈ., Ｍartin, Ｐ.Ｊ., Ｓpooner, Ｃ.Ｅ., Ｈansen, Ｊ.Ａ. and Ｍeier, Ｋ.Ｅ.(1986)Ｊ. Ｉmmunol. 136:3945-3952）を阻止するためであった。CD28mAb9.3(IgG2a)はプロテインＡ−セファローズで精製し、PBSに対して透析し、０．２２μm滅菌フィルターで濾過し、遠心分離（１００，０００×ｇ、４５分間）で凝集物を除き、１μg／mlで使用した（Ｌedbetter, Ｊ.Ａ., Ｍartin, Ｐ.Ｊ., Ｓpooner, Ｃ.Ｅ., Ｗofsy, Ｄ., Ｔsu, Ｔ.Ｔ., Ｂeaty, Ｐ.Ｇ. and Ｇladstone, Ｏ.(1985)Ｊ. Ｉmmunol., 135:2331-2336）。
２日後、つまり第３日目に、活性化Ｔ細胞を計数し、サイジングし、新しい完全培地で０．５×１０6個／mlの濃度に希釈した。サイズの分布が休止細胞のプロフィールに近くなるまで、細胞の計数、サイジング、希釈を２日毎に繰返した。そこで、Ｔ細胞を２×１０6個／mlの濃度で完全培地に再懸濁し、上記のようにして再刺激する（第１回の再刺激は通常第１０日頃）。
細胞は、コールターＺＭカウンター（Ｃoulter Ｅlectronics）を用いて計数した。細胞は、円筒状の７０μmアパーチャーを備えたコールター・計数器ＺＭモデルとＩＢＭのＰＣコンピューター接続したチャネライザーＣ−２５６モデルで、直線目盛り上にサイジングした。細胞はイソトンに懸濁し、一定の径を持つラテックス・ビーズを用いてキャリブレイションした。
マイトジェンまたは抗Ｔ細胞レセプター（抗ＴＣＲ）刺激Ｔ細胞をαＣＤ２８で処理するとＴ細胞増殖の相乗的増加を誘発した。休止Ｔ細胞をαＣＤ３およびαＣＤ２８で共刺激（コスティミュレーション）すると、初期に激しい指数的増殖が起り、細胞の肥大、集合および培地の酸性化によって特徴づけられる代謝が生じる。細胞は、培養の初期７−８日に数回の細胞分裂を行い、細胞数は６−８培となった。この時点で、細胞の増殖率は低下した。培養第１０−１１日には細胞分裂は停止し、細胞はそのサイズについて休止細胞に類似してきた（図１）。拡張プロトコールのこの点で細胞はαＣＤ２８の存在下に固定化したαＣＤ３で再刺激し、細胞の集合と肥大で特徴づけられる再度の指数増殖期を経過した。
図２はこの方法で培養した細胞の増殖特性を示している。ここに示されているように、細胞はαＣＤ３／αＣＤ２８共刺激の繰返しによって多週にわたって（３か月以上）指数的状態に維持され、増殖した。流速血球計分析を種々の時点で行い、これらの細胞の表現型進化を追跡した。時間とともに、こうして拡張された細胞は、表現型におけるナイーブなＴヘルパー（Ｔｈ）細胞から記憶細胞への転換を反映して、次第に、よりＣＤ４+４５ＲＯ+となった。これは、αＣＤ３／αＣＤ２８共刺激の後に外来ＩＬ−２の存在下に増殖させた細胞と直接対照的である。これらの細胞は、時間と共に次第によりＣＤ８+となり、最終的には培地中で増殖できなくなった。これらの観察は、ＣＤ４+細胞によって生産される何らかの因子が連続的なＴ細胞の増殖に必要とされることを示している。
実施例２ 細胞増殖は外来ＤＮＡの発現に充分ではない。
一次Ｔ細胞の長期クローン拡張のための反復αＣＤ３／αＣＤ２８共刺激を確立し、このプロトコールを用いて増殖させた細胞について、ノーザン・ブロット分析により、内生ets−１ ｍＲＮＡの発現を分析した。
ＲＮＡの抽出のために、細胞を遠心分離により採取し、グアニジン・イソチオシアネート（Ｃhirgwin et al, 1979）を用いて総細胞ＲＮＡを抽出した。試料をｒＲＮＡに関して均等化し、均等化を、文献（Ｊune, Ｃ.Ｈ., Ｌedbetter, Ｊ.Ａ., Ｇillespie, Ｍ.Ｍ., Ｌindsten, Ｔ., and Ｔhompson, Ｃ.Ｂ.(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol. 11:5435-5445）の記載により、非変性１％アガロース・ゲル上で分離したＲＮＡ試料の均等量のエチジウム・ブロミド染色によって確認した。これらの均等化したＲＮＡ試料（５−１０μg）を１％アガローズ／フォルムアルデヒド・ゲル上で分離し、ニトロセルロースに移した。ＤＮＡプローブは、３−９×１０8cpm／μgの比活性にニック・トランスレーションで標識した。ＩＬ−２特異的プローブは、ｐＴＣＧＦ５プラスミド（Ｃlark, Ｓ.Ｃ., Ｗong−Ｓtaal, Ｆ., Ｍatsumoto−Ｋobayashi, Ｍ., Ｋay,Ｒ.Ｍ., Ｋaufman, Ｒ.Ｊ., Ｂrown, Ｅ.Ｌ., Ｓhoemaker, Ｃ., Ｃopeland, Ｔ., and Ｏroszian, Ｓ. et al,(1984)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 81:2543-2547）由来の１．０kb ＰstＩcＤＮＡインサートであった。ＨＬＡＢ７プローブはｐＨＬＡ−Ｂ７から単離された１．４kb ＰstＬフラグメントであった（Ｓood, Ａ.Ｋ., Ｐereira, Ｄ., and Ｗeissman, Ｓ.Ｍ.(1981)Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ 78;616-620）。est−１ＤＮＡプローブは、１．９kb est−１ ｃＤＮＡからの４４２塩基対ＥcoＲＩ／ＸbaＩフラグメントからなるものであった（Ｈo, Ｉ−Ｃ., Ｂhat, Ｎ.Ｋ. Ｇottschalk, Ｌ.Ｒ., Ｌindsten, Ｔ., Ｔhompson, Ｃ.Ｂ., Ｐapas, Ｔ.Ｓ. and Ｌeiden, Ｊ.Ｍ.(1990)Ｓcience 250:814-817）。膜は洗浄後、Ｘ線フィルム（Ｋodak ＸＡＲ−２またはＸＡＲ-5）に、増感スクリーンを使用して、−７０℃で４時間ないし７日間暴露した。
ノーザン・ブロット作成のために、ＲＮＡは、第１日のαＣＤ３／αＣＤ２８共刺激の後または第８日の再刺激の後の種々の時点で、上記の一次Ｔ細胞の長期クローン拡張のプロトコールに従って培養された末梢血Ｔ細胞から抽出された。ノーザン・ブロット分析の結果は図３に示されている。休止ヒトＴ細胞はest−１ ｍＲＮＡおよびタンパクを高度に発現している。休止Ｔ細胞および第８日の“活性化”細胞は、est−１ ｍＲＮＡを高度に発現した。αＣＤ２８の存在下に抗原レセプター架橋を行った後は、est−１ ｍＲＮＡは６時間で検出できない程に減少した。第１日および第８日の細胞は両方共にest−１ ｍＲＮＡを再発現し、刺激後２４ないし７２時間維持された。
どのシス作用性調節配列がest−１遺伝子の発現を調節しているかを決定するために、対数生育期にある一次細胞を、ＣＡＴ遺伝子に結合したest−１プロモーター（EST−１-CAT-2）を含むプラスミドで、長期培養プロトコールの第６日にトランスフェクションした。この構成はジャーカットＴ細胞で強力なレポーター活性を発揮した。一次Ｔ細胞の、いずれかのＤＥＡＥ−デキストランによる１μg ＤＮＡのトランスフェクション後に（Ｈo, Ｉ−Ｃ., Ｂhat, Ｎ.Ｋ., Ｇottschalk, Ｌ.Ｒ., Ｌindsten, Ｔ., Ｔhompson, Ｃ.Ｂ., Ｐapas, Ｔ.Ｓ., and Ｌeiden, Ｊ.Ｍ.(1990)Ｓcience 250:814-817）、細胞を反復して洗浄し、完全培地に再懸濁した。トランスフェクションの４０時間後に、細胞を採取し、ＣＡＴ活性を測定した。
ＤＥＡＥ−デキストランでのトランスフェクション・プロトコールでは、細胞はＰＢＳで１回、ＴＳ緩衝液ｐＨ７．４で１回洗浄した。２度目の洗浄の後、細胞はＤＥＡＥ−デキストラン（分子量５００，０００）５００μgとスーパーコイル状プラスミド１−１０μgを含むＴＳ緩衝液中に１０7／mlで再懸濁させた。この混合物を、時々かき混ぜながら室温で１２−１５分間放置した。ＲＰＭＩ１６４０ １０mlに２０％熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミンおよび１５ｍＭＨepesを添加して（ＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈ）、細胞に加えた。細胞を組織培養フラスコに移し、５％ＣＯ2中３７℃で３０分間培養した。細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈで１回洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈ １０ml中に３７℃、５％ＣＯ2で再懸濁した。
ここに記載した他の例では、一次Ｔ細胞をエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。エレクトロポレーションプロトコールでは、細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、氷冷したＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈ中に、２０×１０6細胞／mlで再懸濁した。３００μl中に６×１０6細胞を含む懸濁液を滅菌した０．４cmのエレクトロポレーション用キュベット（ＢioＲad）に移した。レポーター・プラスミド１−１０μgを加え、ジーン・パルサー（ＢioＲad）を使用して２５０Ｖ、９６０マイクロファラッドで細胞にエレクトロポレーションを行った。細胞を氷上で１０分間培養し、ＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈ １０mlで希釈し、５％ＣＯ2中３７℃に保持した。
等容積の細胞抽出液を１６時間の反応でＣＡＴ活性を測定した。ＥＤＴＡを最終濃度が５ｍＭになるように添加し、抽出液は６５℃で１０分間アセチルＣｏ−Ａの加水分解とクロラムフェニコールの脱アセチル化を阻害するように加熱した（Ｃrabb, Ｄ.Ｗ., and Ｄixon, Ｊ.Ｅ.(1987)Ａnal. Ｂiochem. 163:88-92）。ＣＡＴ測定の薄層クロマトグラフィー上でのオートラジオグラフィーの前に、［14Ｃ］クロラムフェニコールおよびそのアセチル化誘導体のスポットをベータスコープ（Ｂetagen）またはフォスフォリメイオジャー（Ｍolecular Ｄynamics）をもちいて定量した。アセチル化のパーセントは、アセチル化および非アセチル化の実験値からバックグラウンド値を差し引いて計算した。もし、トランスフェクションの与えられた一つのセットについてのアセチル化のパーセントが測定の直線領域を超えたときは、等容量の細胞抽出液を希釈して、ＣＡＴ測定を再試行した。ＣＡＴ活性は、結いで反応中のタンパク量に対して正規化した。正規化したＣＡＴ活性は（パーセント・アセチル化／mgタンパク）×５０として表す。すべてのレポーター活性の比較は、同時に、かつ同一の試薬により刺激され、トランスフェクションさせ、採取され、測定された細胞について行う。
本方法でトランスフェクションさせた一次細胞には、EST-1-CAT-2レポーター活性は検出されなかった。内生のest−１ ｍＲＮＡは休止細胞で優先的に発現し、Ｔ細胞刺激の約２−３日後に再誘発されるので、EST-1-CAT-2レポーター発現は、Ｔ細胞が休止期に再度入ったかどうかに係わりなく期待された。驚くべきことに、RSV-CAT、HIV-1-CATおよびHILV-1-CATのような陽性対照による細胞のトランスフェクションもまた証明できるようなレポーター活性を与えなかった。細胞数の増加により、長期培養プロトコールの第６日での細胞は対数増殖期にあった（図２）。しかしながら、構成的レポーター構築物のこれら細胞へのトランスフェクションは検出可能なレポーター活性を与えず、効率的な導入遺伝子の発現には、増殖だけでは不十分であるのとを示唆した。
“活性な”シグナル伝達がレポーター遺伝子の発現に必要かどうかを決定するために、培養プロトコールの第５日の対数増殖期にある一次Ｔ細胞を、フォルボール・エステル（ＰＤＢＵ）とカルシウム・イオノホア（イオノマイシン）でトランスフェクションの１０時間前に刺激した。
図４はこの、そしてその後のトランスフェクションに用いた時刻表を示している。休止しているＴ細胞を、飽和量の固定化した抗ＣＤ３抗体と１μg／mlの抗ＣＤ２８とともに培養して増殖するように刺激した。２日後、第３日に活性化されたＴ細胞を計数し、サイズ分けし、新鮮な完全培地で０．５×１０6細胞／mlの濃度に希釈した。第５日に、細胞をホルボール・１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ、ＬＣ Ｓervices Ｃorp.）１０ng／mlとイオノマイシン（Ｃalbiochem）０．４μg／mlで刺激した。第６日、刺激後１０時間で、細胞は、実質的に文献（Ｈo, Ｉ−Ｃ., Ｂhat, Ｎ.Ｋ., Ｇottschalk, Ｌ.Ｒ., Ｌindsten, Ｔ., Ｔhompson, Ｃ.Ｂ., Ｐapas, Ｔ.Ｓ. and Ｌeiden, Ｊ.Ｍ.(1990)Ｓcience 250:814-817）に記載されているように、ＤＥＡＥ−デキストランを使用し、構成的発現レポーター構築物RSV-CAT １０μgでトランスフェクトした。pRSV-CAT(RSV-CAT)は、CATをコードする配列の５’末端にRSVLTRが融合している構成である（Ｇorman, Ｃ.Ｍ., Ｍerlino, Ｇ.Ｔ., Ｗillingham, Ｍ.Ｃ., Ｐastan, Ｉ., and Ｈpward, Ｂ.Ｈ.(1982)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ 79:6777-6781）。細胞を４０時間後に採取し、ＣＡＴ活性を測定した。
結果は、図５に示されている。増殖中の一次細胞のＰＤＢＵ＋イオノマイシンによる前刺激は、ならし培地のみで処理した細胞に比して、ＲＳＶ−ＣＡＴレポーターの発現が６７倍増大した。このＲＳＶ−ＣＡＴレポーター活性の劇的な相異が、刺激された細胞と刺激されていない細胞との増殖能力の違いによるものかどうかを決めるために、これらの細胞の増殖状態を次の方法で調べた：１）細胞周期の分析のためのアクリジン・オレンジ染色、２）ＤＮＡ合成の指標としてのトリチル化チミジン［3Ｈ］ＴｄＲの取り込み、および３）細胞活性化の一般的指標としての細胞のサイジング。自家休止の一次細胞と長期培養プロトコールの第３日のαＣＤ３／αＣＤ２８刺激細胞とを、静止期（Ｇ０／Ｇ１境界）と旺盛な増殖期のコントロールとして同時に測定した。
精製した休止Ｔ細胞（第１日）は、αＣＤ２８ｍＡｂ ９．３（１μg/ml）の存在下にαＣＤ３ ｍＡｂ Ｇ１９−４の飽和量で刺激した。第３日に活性化Ｔ細胞は新鮮な完全培地で０．５×１０6／mlの濃度に希釈し、ｍＡｂ ９．３を最終濃度０．５μg／mlとなるように加えた。第６日に、指数増殖期の細胞をホルボール１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ、ＬＣ Ｓervices Ｃorp.）１０ng／mlとイオノマイシン（Ｃalbiochem）０．４μg／mlまたはならし培地のみで１０時間処理した。第３日および第６日の細胞を、下記のようにして細胞周期分析のためにアクリジン・オレンジで染色した。非刺激の細胞（第１日）は、同時にＧ０／Ｇ１境界の決定のために分析した。
細胞は、文献（Ｄarzynkiewicz(1990)Ｍethods Ｃell Ｂiol. 33:285-298）の方法によりアクリジン・オレンジ（Ｐolyscience）で染色した後ＦＡＣスキャン流速血球計（Ｂecton−Ｄickinson）でＲＮＡおよびＲＮＡ含量を分析した。１−５×１０6個の細胞をPBSで２回洗浄し、７０％冷エタノール中に２×１０6／mlの濃度に固定した。細胞を遠心分離し、洗浄し、２×１０6／ml以下の濃度で完全培地に再懸濁した。この細胞懸濁液０．２mlをアクリジン・オレンジで染色し、ＦＡＣスキャンによって分析した。増量したＲＮＡ含量と変化のないＤＮＡ含量を示す細胞はＧ１期の細胞と考えられた。増量したＲＮＡおよびＤＮＡ含量の細胞はＳまたはＧ２Ｍ期と考えられた。
第１、３および６日のＴ細胞のトリチル化チミジン［3Ｈ］ＴｄＲの取り込みを決定するために、細胞は、平底９６穴マイクロタイター・プレート（Ｃostar）上、５×１０5細胞／ウェルで、４重試料として培養した。１μＣiのトリチル化チミジン［3Ｈ］ＴｄＲ（ＩＣＮ）を各ウェルに加え、５％ＣＯ2中３７℃で６時間培養した。６時間後、細胞は、ＰＨＤ細胞採取器（Ｃambridge Ｔechnologies）を使用してガラスのマイクロフィルター・ストリップ（Ｗhatman）上に採取し、液体シンチレーション・カウンター（ＬＫＢ）で計測した。全ての数値は、４重試料について平均cpm±標準偏差として表される。
図６に示すように、αＣＤ３／αＣＤ２８による休止Ｔ細胞の刺激は、細胞の拡張の第３日までに９２％以上の細胞が細胞周期のＧ０からＧ１もしくはＳ／Ｇ２Ｍ相に進んでいた。これはトリチル化チミジンの２０７倍の増加および平均細胞容積の増加に対応していた。培養第６日までに、ならし培地のみに培養した９１％以上の細胞が細胞周期のＧ１またはＳ／Ｇ２Ｍ相にあった。ＰＤＢＵ＋イオノマイシン処理し、刺激の１０時間後にＲＮＡおよびＤＮＡの含量の測定に供した細胞の９２％以上が、細胞周期のＧ１またはＳ／Ｇ２Ｍ相にあることが見出された。これらのデータは、トランスフェクション時の細胞の活性な周期性とＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激細胞と無刺激細胞との同等の増殖性を示している。事実、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激細胞は、非刺激の対応細胞と比べたとき、ＤＮＡ合成率（［3Ｈ］ＴｄＲの取り込みで３５×１０3cpm対５２×１０3cpm）および平均細胞容積において如何なる増加も示さなかった。従って、これら二つの細胞群でトランスフェクション時には増殖力に差はなく、これはRSV-CATレポーター遺伝子の発現の差を説明している。
ラウス肉腫ウイルスＬＴＲは、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣaＭ−kinase）応答要素を含んでおり、これは増量したカルシウム・イオンの存在下に、活性化されたＣaＭ−kinaseによる転写の選択的誘導を付与することができる（Ｋaipiloff., Ｍ.Ｓ., Ｍathis, Ｊ.Ｍ., Ｎelson., Ｃ.Ａ., Ｌin, Ｃ.Ｒ., and Ｒosenfeld,Ｍ.Ｇ.(1991)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 88:3710-3714）。ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激細胞と非刺激細胞との間のＲＳＶ−ＣＡＴ発現の差異が、刺激後のＲＳＶ ＬＴＲの特異的トランス活性化から生じるかどうかを決定するために、細胞をＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激するかならし培地のみで処理するか、トランスフェクションし、次いでならし培地または完全培地中で培養した。トランスフェクションの３０時間後完全培地で培養した細胞をＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するか、単に培地で処理した。１０時間後に、ＣＡＴ活性を見るために細胞を採取した。もしシグナル伝達の唯一の役割がＲＳＶ ＬＴＲからの転写の活性化であれば、トランスフェクション後に刺激された細胞は増加したレポーター活性をも示さなければならない。図７に示すように、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激した細胞は、非刺激の増殖中のコントロールに比してＲＳＶ−ＣＡＴレポーター活性に関し３４５倍の増加が生じた。トランスフェクション３０時間後にαＣＤ３／αＣＤ２８またはＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで刺激した細胞は、ＲＳＶ−ＣＡＴレポーター活性に関し僅か３倍または３．５倍の増加をそれぞれ示した。トランスフェクションさせた細胞を成長コンピーテントならし培地で培養するとＣＡＴ活性が２．５倍増加した。さらに、トランスフェクションの直後にＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激した細胞はＲＳＶ−ＣＡＴ活性を僅か４−５倍増加させた。これらのデータは、トランスフェクション前の刺激はＲＳＶ−ＣＡＴ活性に必要であり、トランスフェクション時のシグナル形質導入は、トランスフェクションの効率を上げるか、導入遺伝子を発現可能にすることにより、レポーター遺伝子の発現を促進することを示唆している。このレポーター構築物を用いて、トランスフェクション後に細胞を刺激しても、レポーター遺伝子の発現の明らかな増加は起らなかった。
次の例では、一次Ｔ細胞の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８による、トランスフェクション１０時間後の刺激もレポーター構築物の大幅に増加した発現を起こした。先に報告されているHIV-1-CAT（Ｎabel,Ｇ.,and Ｂaltimore,Ｄ.(1987)Ｎature 326:711-713）をこの例で使用した。増殖中のＴ細胞はＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するかならし培地のみで処理し、HIV-1-CATでトランスフェクトし、次いでならし培地中で直ちに培養するか、トランスフェクションの３０時間後にＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するか培地のみで処理した。１０時間後に細胞を採取し、ＣＡＴ活性を測定した。ＣＡＴ測定の結果は、図８に示されている。この結果は、トランスフェクションの１０時間前に一次Ｔ細胞を前刺激すると、前刺激なしにトランスフェクションしたのに比して、HIV-1-CATレポーター構築物の発現を大幅に増加させることを示している。従って、レポーター構築物の発現増加は、この構築物のプロモーターやエンハンサーのタイプに依存しない。さらに、これらの結果はトランスフェクションしたレポーター構築物の発現を増加させるための一次Ｔ細胞の前刺激は、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８の組み合わせ物によってもなされ得ることを示している。
実施例３ 外来ＤＮＡの発現はトランスフェクション時にＴＣＲ依存のシグナル伝達を必要とする。
一次Ｔ細胞における効果的な導入遺伝子の発現の要件をさらに吟味するために、広範に研究され、よく特性付けされている細胞性ＩＬ−２遺伝子のプロモーター／エンハンサーがトランスフェクションの実験に使用された。ノーザン・ブロット分析が、至適量の固定化αＣＤ３によるＴＣＲ−ＣＤ３複合体での刺激後のＩＬ−２遺伝子発現の速度論的検討に使用された。さらに、これらの培養物の上清でＩＬ−２含量を分析し、細胞で細胞周期進度を分析した。
結果は、図９に示されている。パネルＢは至適のαＣＤ３刺激により培養６時間でＩＬ−２ ｍＲＮＡの発現はピークに達し、培養１２時間までにＩＬ−２ ｍＲＮＡのレベルは検出不能なまでに低下した。この一過性のＩＬ−２ ｍＲＮＡの発現は、培地上清中の少量のＩＬ−２（２４時間で５Ｕ／ml）と活発な増殖（４８時間で４１％の細胞が細胞周期のＳ／Ｇ２Ｍ相）（パネルＤ）を伴っていた。要するに、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体での刺激は、６時間でピークに達し、刺激後１２時間で検出不能なまでに低下するＩＬ−２遺伝子転写の一過性の誘導を起こした。ＩＬ−２ ｍＲＮＡの転写が誘導性であり、一過性であるので、IL-2-CATレポーター遺伝子の発現のためのトランスフェクション時におけるシグナル伝達の必要性を調べた。IL-2-CATプラスミド（IL-2-CAT）は、文献（Ｂielinska, ＡＡ., Ｓhivdasani, Ｒ.Ａ., Ｚhang, Ｌ., and Ｎabel, Ｇ.Ｊ.(1990)Ｓcience 250:997-1000）に記載のように、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の５’に接してＩＬ−２プロモーター／エンハンサー（−５８５ないし＋１８）を含んでいる。拡張プロトコールの第５日、増殖中の一次Ｔ細胞はＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激されるか、ならし培地のみで処理され、ＩＬ−２−ＣＡＴレポータープラスミドでトランスフェクションさせ、直ちに増殖可能ならし培地または完全培地で培養した。トランスフェクションの３０時間後に、完全培地中で培養された細胞はＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するか、培地のみで処理した。１０時間後、細胞の数および生存能力をトリパン・ブルー・エクスクルージョンによって調べ、細胞をＣＡＴ活性測定のために採取した。
ＣＡＴの測定結果は図１０に示されており、その要点は次の通りである：１）前刺激をしない場合、増殖中の一次細胞は極低いレベルのＩＬ−２−ＣＡＴレポーターを発現した。２）トランスフェクション３０時間後の細胞の刺激はこの低レベルのＩＬ−２−ＣＡＴレポーター遺伝子発現を増加させなかった。３）ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激し、トランスフェクション後、細胞をリンフォカイン富化条件培地または完全培地に再懸濁した細胞もまた極低いレベルのＩＬ−２−ＣＡＴレポーターを発現した。４）ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激し、かつトランスフェクションの３０時間後にＴＣＲによる刺激を行うと、ＩＬ−２ＣＡＴレポーター活性は、前刺激のみの細胞に対して７９倍、無刺激増殖のコントロールに対して約２０倍に増加した。これらのデータは、ＩＬ−２ＣＡＴ ＤＮＡレポーター構築物の発現可能コンパートメントへの導入モデルまたはトランスフェクション前のＴＣＲ−依存的シグナル伝達を必要とする状態と一致する。しかしながら、ＩＬ−２ＣＡＴレポータープラスミドが発現と競合していも、最初のシグナル伝達がトランスフェクション１０時間前にされているため、ＩＬ−２ＣＡＴ転写が僅かに起こるか起こらず、上記ノーザン分析（図９）により、ＩＬ−２ｍＲＮＡ転写がこの時点までに低レベルに減少する。トランスフェクション後のＴＣＲ／ＣＤ３−依存性刺激は、発現成分ＩＬ−２プロモーター／エンハンサーおよびＣＡＴ ｍＲＮＡ転写を、得られるレポーター活性と共にもたらす。
実施例４ − 細胞性増殖はトランスジェニック発現に必要である
トランスジーン発現における細胞性増殖の役割に取り掛かるために、新たに単離した休止Ｔ細胞をαＣＤ２８（１μg／ml）、ＳＥＡ（１０ng／ml、Ｔoxin Ｔechnologies）、ＰＤＢＵ（１０ng／ml）／ＩＯＮＯ（０．４μg／ml）または培地単独で１０時間刺激した。これらの細胞をＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせ、４０時間後ＣＡＴ活性のために回収した。活性化Ｔ細胞はマイトジェン刺激２４−３６時間後に細胞分裂した。従って、トランスフェクションの時、非常にまれに、もしあれば、Ｔ細胞はＭ期を通して進行している。トランスフェクション４０時間後（刺激後約５０時間）、ＳＥＡまたはＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで刺激したＴ細胞は増殖に関して（細胞性拡大、凝集）、表現型の変化は示さなかった。しかしながら、これらの集団は細胞数は増加しなかった。図１１に示されるように、全てのこれらのトランスフェクション条件に関する正常化ＣＡＴ活性は、相対的に低かった（０．０７−０．２６）。ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで刺激した休止細胞は、休止対照と比較して、ＲＳＶ−ＣＡＴ活性において、少ない３．７倍の増加を示した。ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激および休止細胞の間の低いＣＡＴ活性の増加は、単に細胞性活性の効果およびＲＳＶ ＬＴＲ転写の増殖を単に反映し得、一度この受容体プラスミドが最初のシグナル伝達の結果発現可能である。注目すべきは、αＣＤ２８またはＳＥＡで刺激された細胞のＣＡＴ活性が休止細胞と異ならなかった。αＣＤ２８またはＳＥＡ単独で、完全なマイトジェン刺激は構築されなかった。ＳＥＡによるＴ細胞増殖の導入に、アクセサリー細胞（主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスII提示が必要）またはＣＤ２８のモノクローナル抗体の刺激により提供される第２のコスティミュラトリー・シグナルの添加が必要であった（Ｇreen, Ｊ.Ｍ., Ｔurka, Ｌ.Ａ., Ｊunc, Ｃ. Ｈ.,およびＴhompson, Ｃ.Ｂ.(1992)Ｃell. Ｉmmunol. 145(1):11-20）。休止Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスII（ＨＬＡ−Ｄｒ）をその表面に発現しない（Ｍayforth, Ｒ. Ｄ.(1991)Ｐh.Ｄ. Ｄissertation, Ｕniv. of Ｃhicago）。従って、増殖刺激非存在下で、休止Ｔ細胞は構成性活性受容体プラスミドＲＳＶ−ＣＡＴの発現を証明しない。
これらの細胞がＲＳＶ−ＣＡＴを発現できることを証明するために、同じ細胞の他のアリコートをαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するか、またはならし培地単独で１０時間で処理し、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせ、次いで４０時間後ＣＡＴ活性について回収した。ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ予備刺激有りまたは無しの一日目（休止細胞）または６日目（増殖細胞）の細胞の相対的ＣＡＴ活性の比較を図１１に示す。増殖細胞のＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ予備刺激は、増殖非刺激対照と比較して１３．４倍のおよびＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激休止細胞より２３．７倍のＣＡＴ活性の増加をもたらした。従って、トランスフェクションの時の細胞性増殖は、ＲＳＶ−ＣＡＴレポーター発現を非常に促進する。上記のトランスフェクションの結果を一緒にして、これらのデータは、トランスジーン発現に増殖が必要であるが、十分ではないことを示す。
実施例５ − レポーター遺伝子活性の差はトランスフェクション効果の差によるものではない
上に証明するように、トランスフェクション時前のＴＣＲ−依存性シグナル伝達は、トランスジーン発現に必要である。トランスフェクション後の刺激は、殆どの場合、レポーター活性を明確に増加させない。シグナル伝達の多くの役割のいくつかが予測できる。最も単純なモデルにおいて、トランスフェクション時の増殖細胞のシグナル伝達は、トランスフェクション効果を増加でき、従って、核に到達するレポータープラスミドの量を増加できる。あるいは、シグナル伝達は、トランスフェクションＤＮＡの非転可能コンパートメントから転写可能コンパートメント、例えば、細胞質から核への移動を促進する。両方のシナリオは、シグナル伝達に続く核へのレポータープラスミドの増加の量に関して同じ結果をもたらす。これらの可能性の試験のために、ＤＮＡ侵入および局在化の動態を、トランスフェクション後の種々の時間の核および細胞質コンパートメント由来のトランスフェクトＤＮＡの救済および定量により試験した。
５日目の増殖した一次Ｔ細胞を、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで刺激するかまたはならし培地単独で処理し、ＲＳＶ−ＣＡＴレポータープラスミドでトランスフェクトし、細胞数および生存能力をコウルター計数器およびトリパンブルー・エクスクルージョンでそれぞれ測定した。
Ｄounceホモジナイゼーションに続く核および細胞質への分画に続いて、ＤＮＡをこれらの二つのフラクションから、ＳＤＳ可溶化およびプロテイナーゼＫ消化後に連続酢酸アンモニア／イソプロパノール沈殿を使用して両方の分画から抽出した。ＤＮＡ単離プロトコールは、低および高分子量ＤＮＡの両方の回収に関して定量的である。トランスフェクション後の種々の時点の核および細胞質コンパートメントのトランスジーンの相対的複製数を評価するために、１０5全細胞相当物の核および細胞質ＤＮＡを、先に記載のように、１．０％アガロースゲルでサイズ分画し、ニトロセルロースに移した（Ｔhompson, Ｃ. Ｂ. およびＮeiman, Ｐ. Ｅ.(1987)Ｃell 48:369-378）。ブロットをｐＲＳＣ−ＣＡＴのＣＡＴコード領域のＥcoＲＩフラグメントまたはｐＩＬ２ＣＡＴのＣＡＴコード領域のＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントのいずれかとハイブリダイズした。
サザンブロット分析の結果を図１２に示す。プラスミド／細胞の約１０5コピーを、ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン複合体の暴露の最初の３０分以内に取り込んだ。これは、トランスフェクトした全ＤＮＡの約１０％に対応する。この量で、核画分に約９０％が局在化する。トランスジーンの同じかわずかに増加した量が、トランスフェクション６、２４および４８時間後に核および細胞質に存在した。明らかに、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激および非刺激細胞の間で、いかなる時点でも核または細胞質でＤＮＡの量に明白な差はなかった。要するに、サザン分析は、シグナル伝達および非シグナル伝達細胞の間で核区画に到達するＤＮＡの量に証明可能な差のないことを確認した。
これらの発見を確認するために、一次Ｔ細胞をＲＳＶ−ＣＡＴまたはＩＬ−２ＣＡＴ受容体プラスミドで、それぞれ図７および図１０に記載のようにトランスフェクトした。図１３および１４に示すように、トランスフェクション４０時間後、ＲＳＶ−ＣＡＴプラスミドの約１０5コピー／細胞が核に存在し、全トランスフェクトＤＮＡの１０％である。上記のように、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激細胞、刺激細胞の核、またはＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ、αＣＤ３／αＣＤ２８またはならし培地でトランスフェクションした後刺激した細胞の各に存在するＤＮＡの量に明確な差がない。注目すべきは、細胞の低張融解に続いて単離されたＤＮＡのサザン分析でトランスフェクション４０時間後のプラスミド分解の証拠は見られなかった。
二つの異なるＤＮＡ単離法を使用してこの発見を総括すると、依然としてプラスミドＤＮＡの回収が完全に定量的でなかった可能性を考えないわけにはゆかなかった。これらの結果を個別に確認するために、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激および非刺激細胞を32Ｐ放射標識化鎖状ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションした。これらの細胞を次いで核および細胞質分画にトランスフェクション０、６、２４および４８時間後に分離した。次いで、分画を液体シンチレーションカウンターで計数した。
図１５に示す結果は、トランスフェクション３０分以内に、全cpmの１５．２％がＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激細胞に取り込まれることを示した。こでは標識刺激細胞の１１．９％と同等である。これらの計数で、前刺激細胞の核分画で９２％が、非刺激細胞で８４％が回収された。続く時点で、核分画から回収された全cpmの％は、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激細胞で０時間の１４．０から４８時間の１７．１％に、非刺激細胞で０時間の１０．０％から４８時間の１３．９％に増加した。この核計数における増加は、前刺激および非刺激細胞の両方の細胞質分画で回収された全cpmの割合の少しの減少と対応し、恐らく、ＤＮＡの細胞質から核への移動を反映する。しかしながら、非シグナル伝達およびＰＤＢＵ／ＩＯＮＯシグナル伝達細胞の各分画からの全cpmの回収の割合の少しの差は、これらの二つの集団の間でＲＳＣ−ＣＡＴレポーター遺伝子発現の劇的な６７から３４５倍増加を担わなかった。トランスフェクト放射標識ＤＮＡの計数結果は、細胞内に入った全プラスミド量および続くＤＮＡの核および細胞質区画への分散の両方でサザンブロット分析と非常に密接している。要約すると、細胞のＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激は、トランスフェクション効率の増加により、またはＤＮＡの細胞質から核への移動を促進することにより、レポーター遺伝子発現を増加するとは思えない。
実施例６ − スーパー抗原誘導ＴＣＲ活性化はレトロウイルスＬＴＲを含むＤＮＡの核破壊を変える
上記の実施例は、ＴＣＲ媒介シグナル伝達により抑制可能な細胞性機構の存在を示し、それはインビトロ外来ＤＮＡの暴露から、休止Ｔ細胞および非シグナル伝達増殖一次Ｔ細胞を防御する。レポーター遺伝子発現のためのＴＣＲ依存性シグナル伝達の必要性から、スーパー抗原がトランスジーン発現の十分な刺激物として働くかを調査した。
トランスフェクション１０時間前、指数増殖期の一次ヒトＴ細胞をならし培地単独、５×１０6放射自己単球、ＳＥＡ（１０ng／ml）またはＳＥＡ（１０ng／ml）＋５×１０6放射自己単球で処理した。細胞をＲＳＣ−ＣＡＴまたはIIIV−１−ＣＡＴでトンスフェクションさせ、トランスフェクション４０時間後に回収し、ＣＡＴ活性をアッセイした。
ＣＡＴアッセイの結果を図１６に示す。ＨＩＶ−１−ＣＡＴでのトランスフェクションにおいて、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激は非刺激増殖コントロールと比較して、ＣＡＴ活性の１５倍の増加をもたらした。Ｔ細胞と５×１０6放射自己単球の組み合わせは、ＣＡＴ活性の２．３倍の増加をもたらした。ＳＥＡ １０ng／mlでの処置は、ＣＡＴ活性の３２倍の増加をもたらしたが、Ｔ細胞とＳＥＡ（１０ng／ml）＋５×１０6放射自己単球の組み合わせは、１６倍の増加をもたらした。従って、ＳＥＡは単独またはＭＨＣクラスII（ＨＬＡ−ＤＲ）との組み合わせのいずれでも、ＨＩＶ−１−ＣＡＴレポーター遺伝子発現増加をもたらす。完全に同様な結果がＲＳＣ−ＣＡＴでのトランスフェクションでも見られる（図１６）。ＳＥＡおよびＳＥＡ＋ＭＯＮＯ刺激細胞の増殖状態は、トリチル化チミジン取り込みおよび細胞サイジングで測定して、非刺激増殖細胞と測定可能には差がなかった。従って、ＨＩＶ−１−ＣＡＴおよびＲＳＣ−ＣＡＴレポーター発現は、シグナル伝達におけるスーパー抗原の作用からもたらされ、増殖それ自体からではない。
このような機構およびその発現は、レトロウイルス発現に関する事象に非常に重要であり得る。例えば、休止Ｔ細胞のＨＩＶ−１の感染後、続くＴ細胞活性化がＨＩＶ−１ゲノムの宿主ゲノムへの組込みおよび感染ウイルスの製造に必要である（Ｓtevenson, Ｍ., Ｓtanwick, Ｔ.Ｌ., Ｄempsey, Ｍ. Ｐ.およびＬamonica, Ｃ. Ａ.(1990)ＥＭＢＯ Ｊ. 9(5):1551-1560；Ｚack, Ｊ. Ａ., Ａrrigo, Ｓ. Ｊ., Ｗeitsman, Ｓ. Ｒ., Ｇo, Ａ. Ａ., Ｈaislip. Ａ.,およびＣhen, Ｉ. Ｓ. Ｙ.(1990)Ｃell 61:213-222:Ｂukrinsky, Ｍ. Ｌ., Ｓtanwick, Ｔ. Ｌ. Ｄempsey, Ｍ. Ｐ., およびＳtevenson, Ｍ.(1991)Ｓcience 254:423-427）。これは、ＨＩＶ−１が、休止Ｔ細胞が続く抗原またはマイトジェン誘発Ｔ細胞活性化まで、非製造的染色体外状態で存続するモデルで示される。最近、休止Ｔ細胞でのＨＩＶの複製に、ＨＩＶ−１マトリックスタンパク質のチロシンホスホリレーションが必要であることが報告されている（Ｇallay, Ｐ. et al.,(1995)Ｃell 80:379）。
ＭＨＣクラスIIおよびＴＣＲを架橋する特異的ＴＣＲ Ｖβ遺伝子産物を発現するＴ細胞により認識される分子であるスーパー抗原は、細胞活性化、枯渇またはアネルギーを種々に導く。このタンパク質抗原グループは、多数の末梢血Ｔ細胞を活性化できる能力により特徴付けられる。哺乳動物レトロウイルスは、細胞性免疫反応性を阻止するために、または直接細胞活性の結果の複製を容易にするために、スーパー抗原をコードし得る。最近の報告は、ＨＩＶ−１スーパー抗原がＨＩＶ−１感染に見られるＴ細胞枯渇を媒体し得ることを示している（Ｉmberti, Ｉ., Ｓottini, Ａ., Ｂettinardi, Ａ. Ｐouti, Ｍ., およびＰrimi, Ｄ.(1991)Ｓcience 254:860-862；Ｃameron, Ｐ. Ｕ., Ｆrudentlial, Ｐ. Ｓ., Ｂarker, Ｊ. Ｍ., Ｇezelter, Ｓ. Ｉnaba, Ｋ., およびＳteinman, Ｒ. Ｍ.(1992)Ｓcience 257:383-387；Ｌaurence, Ｊ., Ｈodtsev, Ａ. Ｓ., およびＰosnett, Ｄ. Ｎ.(1992)Ｉnt. Ｃonf. ＡＩＤＳ Ｊul 19-24;8(1):Ｔh72；Ｐantaleo, Ｇ., Ｒebai, Ｎ., Ｇraziosi, Ｃ., Ｌane, Ｈ. Ｃ., Ｓekaly, Ｒ. Ｐ., およびＦauci, Ａ. Ｓ.(1992)Ｉnt. Ｃonf. ＡＩＤＳ Ｊul 19-24;8(1):Ｔh71）。Ｔ細胞のスーパー抗原活性化により誘発されるシグナル伝達経路の性質はまだ議論の余地がある（Ｌiu, Ｈ. Ｌampe, Ｍ. Ａ., Ｉregui, Ｍ. Ｖ., およびＣantor, Ｈ.(1991)Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 88(19):8705-8709；Ｋanner, Ｓ. Ｂ., Ｏdum, Ｎ., Ｇrosmaire, Ｌ., Ｍascwicz, Ｓ., Ｓvejgaard, Ａ., およびＬedbetter, Ｊ. Ａ.(1992)Ｊ. Ｉmmunol. 149(11):3482-3488；Ｏyaizu, Ｎ., Ｃhirmule, Ｎ., Ｙagura, Ｈ., Ｐahwa, Ｒ. Ｇood, Ｒ. Ａ., およびＰahwa, Ｓ.(1992)Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 89(17):8035-8039）。
実施例は、静止および増殖Ｔリンパ球を外来ＤＮＡの暴露から防御する、ＴＣＲ−媒介シグナル伝達により抑制可能な活性化機構の存在を示す。Ｔ細胞は、トランスフェクション前のシグナル伝達に続いて、外来ＤＮＡのみを発現する。この発見は、細胞性増殖のみでは外来ＤＮＡの十分な発現をするのに不十分であり得るため、体細胞遺伝子治療の分野で意味を有する。従って、本発明は、増殖Ｔ細胞に導入された遺伝子の十分な発現の方法を提供する。本発明の一つの態様において、Ｔ細胞を個体から得、刺激してエクスビボで増殖させ、本発明の方法により遺伝子的に形質導入し、個体に再投与する。この具体的態様において、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体、ホルボールエステルとイオノマイシンの組み合わせのようなＴ細胞受容体媒体シグナル伝達を刺激する、抗ＣＤ３抗体のような作用物質、または作用物質の組み合わせまたはＴ細胞受容体を迂回する作用物質と接触させる。
本発明はまたウイルスＤＮＡのような外来ＤＮＡの発現を阻止または減少させる方法を提供する。従って、ウイルスＤＮＡのような外来ＤＮＡを含む一次Ｔ細胞は、刺激または増殖できるが、ウイルス複製は、例えば、Ｔ細胞の増殖を外来遺伝子発現に必要な機構を活性化しない本明細書に記載の作用物質で刺激することにより阻害する。
同等物
当業者は、慣用の実験のみを使用して、本明細書に記載の具体的態様の多くの同等物ができることを認識するか、気づく。このような同等物は以下の請求の範囲に含まれると意図する。
本明細書に記載した研究は、ＮＭＲＤＣ認可６１１５３ＮＡＥ．４１２０．００１．１４０２により一部支持されている。従って、米国政府は、本発明の権利を有する。
発明の背景
真核細胞における外来ＤＮＡの発現は、遺伝子発現の調節から遺伝子導入に基づく治療法まで広範囲にわたる生物学的主題の研究を可能にするものである。哺乳動物細胞へ遺伝子導入する多くの方法が考案されている。これらには、クローン化レトロウイルスベクターによるインビボおよびインビトロ感染（Shimotohno,K.,およびTemin,H.M.(1981)Cell 26:67-77;Cone,R.D.Mおよびulligan,R.C.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6349-6353;Dubensky,T.W.,Campbell,B.A.,およびVillareal,L.P.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7529-7533;Seeger,C.,Ganem.D.およびVarmus,H.E.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5849-5852）、リン酸カルシウムによるＤＮＡの共沈（Chu,G.,およびSharp,P.(1981)Gene 13;197-202;Benvenistry,N.およびReshef,L.(1986)Proc Natl.Acad.Sci.USA 83:9551-9555）、ＤＡＮのリポソーム封入（Felgner,P.I.,およびRingold,G.M.(1989)Nature 337:387-388;Kaneda,Y.,Iwai,K.,およびUchida,T.(1989)Science 243:375-378）、プラスミドＤＮＡの直接注入（Walff,J.A.,Malone,R.W.,Williams,P.,Chong,W.,Acsadi,G.,Jani,A.,およびFelgner,P.L.(1991)Science 247:1465-1468）、ＤＥＡＥ−デキストラン（McCutchan,J.H.,およびPagano,J.S.(1968)J.Natl.Cancer Inst 41:351-357）、エレクトロポレーション（Neumann,E.,Schaefer-Ridder,M.Wang,Y.,およびHofschneider,P.H.(1982)EMBO J.1:841-845;Cann,A.J.,Koyanagi,Y.,およびChen,I.S.Y.(1988)Oncogene 3:123-128）、および細胞および組織のＤＮＡ−被覆粒子ボンバードメント（Yang,N-S.,Burkholder,J.,Roberts,B.,Martinell,B.,およびMcCabe,D.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9568-9572）がある。
遺伝子を含む外来核酸分子での様々な細胞タイプのトランスフェクションは、外来遺伝子の発現には有効であるが、個体から得られた一次Ｔリンパ球類、例えば、末梢血Ｔリンパ球は、外来ＤＮＡのトランスフェクションおよび発現に対して不応であることが分かっている。一次Ｔリンパ球類はまた、増殖のために第１刺激を与えたときに、導入した核酸の発現に対して不応であることも分かっている。そのため、外来ＤＮＡを効率良く一次Ｔ細胞へ導入でき、Ｔ細胞中で外来ＤＮＡを発現させるシステムに対する要望が依然としてある。
概要
本発明は、遺伝子のＴ細胞中での発現を古典的なトランスフェクション技術と比較して高めた、遺伝子を含む核酸分子でのＴ細胞の改良トランスフェクション法を提供する。本発明の方法は、特に、古典的なトランスフェクション技術には不応である一次Ｔ細胞のトランスフェクションに有用である。この方法は、増殖Ｔ細胞をその増殖Ｔ細胞を刺激する１またはそれ以上の作用物質と、核酸分子をそのＴ細胞に導入する前に、接触させることを含む。本発明の一実施態様では、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に対する一次活性化シグナルを提供する第１作用物質およびコスティミュラトリー・シグナル（costimulatory signal）を提供する第２作用物質を組み合わせたもので刺激する。本発明の方法は、特に、遺伝子治療における様々な応用を有する。
【図面の簡単な説明】
図１は、１μg／mlの抗ＣＤ３被覆プレートおよび抗ＣＤ２８で刺激した（０日目）後、１、５、７、９および１１日目のＣＤ２８+Ｔ細胞の相対細胞数および細胞容量グラフ表示を表す。
図２は、抗ＣＤ２８mＡb９．３（αＣＤ２８）の存在下、飽和量の固定化抗ＣＤ３mＡbＧ１９−４（αＣＤ３）で刺激した、新たに単離したＣＤ２８+Ｔ細胞の成長曲線を表す。
図３は、飽和量の固定化抗ＣＤ３mＡbＧ１９−４（αＣＤ３）および抗ＣＤ２８mＡb９．３（αＣＤ２８）による第１刺激（１日目）または第２刺激（８日目）後、０、６、２４および７２時間培養した一次ＣＤ２８+Ｔ細胞中のＥts−１（ＥＴＳ−１）およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）mＲＮＡのレベルを示すノーザン・ブロットである。
図４は、まず休止Ｔ細胞（Rest）を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（αＣＤ３＋αＣＤ２８）と共に２日間インキュベーションし、次いで、抗ＣＤ２８単独（αＣＤ２８）で３日間インキュベーションし、トランスフェクションの１０時間前に刺激（第１刺激）し、Ｔ＝０でトランスフェクションし、トランスフェクション後３０時間で再刺激（第２刺激）し、１０時間後に収集するというトランスフェクションプロトコールの一例の略式表示である。
図５は、トランスフェクションの１０時間前にホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）または、ならし培地単独（ＭＥＤ）で刺激し、トランスフェクション後４０時間で収集した、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせた、指数増殖しているＴ細胞由来の細胞抽出物で実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図６（パネルＡ〜Ｄ）は、アクリジンオレンジ染色した一次Ｔ細胞のフロー・サイトメトリー分析および下記の条件で培養した一次Ｔ細胞の増殖アッセイの結果を示す：未処理休止一次Ｔ細胞（パネルＡ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で３日間刺激したＴ細胞（パネルＢ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で３日間刺激し、その後、新たな培地で更に３日間インキュベーションしたＴ細胞（パネルＣ）、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で３日間刺激し、ホルボール−１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ）とイオノマイシンで１０時間刺激し、その後、新たな培地で更に２日間と１４時間インキュベーションしたＴ細胞（パネルＤ）。アクリジンオレンジ染色した細胞のフロー・サイトメトリー分析のグラフ表示は、細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ含量を示し、これは、細胞周期のＧ０（％Ｇ０）、Ｇ１（％Ｇ１）、およびＳ／Ｇ２Ｍ（％Ｓ／Ｇ２Ｍ）期における細胞数の指標である。
図７は、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、１０時間後に収集した指数増殖しているＴ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図８は、ＨＩＶ−１−ＣＡＴ発現構築物でトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、１０時間後に収集した指数増殖しているＴ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図９は、ノーザン・ブロット分析により測定した、培地単独（ＭＥＤ）で１２時間または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３）で１、６、１２および２４時間培養したＣＤ２８+Ｔ細胞中の総ＲＮＡ含量（パネルＡ）またはＩＬ−２の場合のmＲＮＡレベル（パネルＢ）およびＨＬＡの場合のmＲＮＡレベル（パネルＣ）を表す。パネルＤは、培地単独（ＭＥＤ）と共に１２時間または抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３）と共に１、６、１２、２４または４８時間インキュベーションしたＴ細胞により産生されたＩＬ−２の量、および抗ＣＤ３と共に培養後４８時間での細胞周期のＳ期、Ｇ２またはＭ期の細胞割合を示す。
図１０は、ＩＬ２−ＣＡＴ発現構築物でトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、１０時間後に収集した指数増殖しているＴ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図１１は、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせた休止Ｔ細胞で、トランスフェクションの１０時間前に培地単独（１日目：ＭＥＤ）、抗ＣＤ２８（１日目：αＣＤ２８）、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（１日目：ＳＥＡ）、またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（１日目：ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で、または、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で５日間処理し、次いで、トランスフェクション前の１０時間、ならし培地（６日目：ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（６日目：ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で処理した休止Ｔ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
図１２は、増殖Ｔ細胞をＲＳＶ−ＣＡＴで、またはプラスミドなし（ＭＯＣＫ）でトランスフェクションさせた後０、６、２４または４８時間の増殖Ｔ細胞で、トランスフェクションの１０時間前にホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）または、ならし培地単独（ＭＥＤ）で刺激し、ＲＳＶ−ＣＡＴのＣＡＴコード領域由来のＥcoＲＩフラグメントとハイブリダイズさせたＴ細胞から抽出した核ＤＮＡ（ＮＵＣＬＥＡＲ、パネルＡ）または細胞質ＤＮＡ（ＣＹＴＯ、パネルＢ）のサザン・ブロットのオートラジオグラムを示す。１（１ｃ）、１０（１０ｃ）、１００（１００ｃ）、および１０００（１０００ｃ）コピーのＲＳＶ−ＣＡＴ／細胞に相当するプラスミドＤＮＡを対照として使用した。（lin）鎖状プラスミド；（sc）スーパーコイル状プラスミド。分子量マーカーからのフラグメントのサイズ（キロベース、kb）は、サザン・ブロットの左側に表す。
図１３は、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、ＲＳＶ−ＣＡＴのＣＡＴコード領域由来のＥcoＲＩフラグメントとハイブリダイズさせた指数増殖しているＴ細胞から抽出した核ＤＮＡのサザン・ブロットのオートラジオグラムを示す。１（１ｃ）、１０（１０ｃ）、１００（１００ｃ）、および１０００（１０００ｃ）コピーのＲＳＶ−ＣＡＴ／細胞に相当するプラスミドＤＮＡを対照として使用した。（lin）鎖状プラスミド；（sc）スーパーコイル状プラスミド。Ｍ：分子量マーカー。
図１４は、ＩＬ２−ＣＡＴ発現構築物でトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前（１°）に培地単独（ＭＥＤ）またはホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）で刺激し、トランスフェクション後３０時間（２°）で培地単独（ＭＥＤ）、ホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ３＋αＣＤ２８）または、ならし培地（ＣＯＮＤ ＭＥＤ）で刺激し、ＩＬ２−ＣＡＴのＣＡＴコード領域由来のＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントとハイブリダイズさせた指数増殖しているＴ細胞から抽出した核ＤＮＡのサザン・ブロットのオートラジオグラムを示す。１、１０、１００、および１０００コピーのＩＬ２−ＣＡＴ／細胞に相当するプラスミドＤＮＡを対照として使用した。（lin）鎖状プラスミド；（sc）スーパーコイル状プラスミド。Ｍ：分子量マーカー。
図１５は、32Ｐ−放射性標識した鎖状化ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせたＴ細胞で、トランスフェクションの１０時間前にホルボール−１２，１３−ジブチレートおよびイオノマイシン（ＰＤＢＵ＋ＩＯＮＯ）または、ならし培地単独（ＭＥＤ）で刺激し、トランスフェクション直後（０）、トランスフェクション後６、２４または４８時間で収集したＴ細胞の核または細胞質から回収した毎分のカウント数（cpm）の割合を表す。毎分のカウント数の割合は、トランスフェクション細胞足す毎分のカウント数の総数に比例して計算される。
図１６は、ＲＳＶ−ＣＡＴまたはＨＩＶ−１−ＣＡＴでトランスフェクションさせた増殖Ｔ細胞で、培地単独（ＭＥＤ）、単球（ＭＯＮＯ）、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、または単球およびスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＭＯＮＯ＋ＳＥＡ）でトランスフェクション前時間処理し、トランスフェクション後４０時間で収集した増殖Ｔ細胞由来の細胞抽出物を用いて実施したＣＡＴアッセイの結果を表す。正規化したＣＡＴ活性は（アセチル化％／タンパク質mg）×５０として表す。
詳細な説明
本発明は、遺伝子をＴ細胞中で発現させるための、遺伝子を含む核酸分子によるＴ細胞の改良トランスフェクション法を提供する。本発明の方法は、増殖Ｔ細胞をその増殖Ｔ細胞を刺激する少なくとも１つの作用物質と、核酸分子をそのＴ細胞に導入する前に接触させ、そうしてその遺伝子をそのＴ細胞中で発現させることを含む。
本発明の方法は、少なくともその一部において、遺伝子を含む核酸により一次Ｔ細胞をトランスフェクションしても一次Ｔ細胞が増殖しておらず、また更に、Ｔ細胞中で一次活性化シグナルおよびコスティミュラトリー・シグナルを誘起する作用物質などの刺激性作用物質で刺激しない場合にはその遺伝子はほとんど発現されないという観察に基づくものである。Ｔ細胞は、好ましくは、核酸をＴ細胞に導入する約１０時間前に刺激性作用物質と接触させる。こうして、増殖Ｔ細胞を、遺伝子を含む核酸をそのＴ細胞に導入する前に刺激することにより、Ｔ細胞中での外来遺伝子の有意な発現を達成できる。
従って、本発明は、遺伝子をＴ細胞中で発現させるための、遺伝子を含む核酸分子によるＴ細胞の改良トランスフェクション法を提供する。古典的なＴ細胞トランスフェクション法に優る本発明方法により提供される改良点は、核酸分子を増殖Ｔ細胞に導入する前（例えば、数時間前）にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させることを含む。本発明の方法により、在来のトランスフェクション技術よりもずっと高い、Ｔ細胞に導入した遺伝子の発現が可能である。本発明の方法は、特に、対象となる遺伝子を一次Ｔ細胞に導入し、かつ発現させるのに有用である。そのため、本発明の具体的な実施態様では、Ｔ細胞を被験体から入手し、本発明の方法に従い核酸分子によりインビトロでトランスフェクションさせ、宿主に再度与える。対象となる遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子、またはアンチセンス分子またはリボザイムなどの機能性ＲＮＡ分子をコードする遺伝子であり得る。対象となる遺伝子は、Ｔ細胞を保護するタンパク質類、Ｔ細胞にとって毒性であるタンパク質類、またはＴ細胞から分泌されて他の細胞に作用するタンパク質類を含む対象となるあらゆるタンパク質をコードし得る。従って、本発明の方法は、例えば、遺伝子療法、Ｔ細胞機能の変更およびＴ細胞中でのタンパク質の産生に応用できる。
１．本発明の方法に従いトランスフェクションさせることができるＴ細胞
本発明は、遺伝子を含む核酸分子でＴ細胞をトランスフェクションさせ、その遺伝子をＴ細胞中で発現させる方法に関する。用語“Ｔ細胞”は、当分野で定義されているＴリンパ球を表し、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図する。Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ８+Ｔ細胞、またはＣＤ４-ＣＤ８-Ｔ細胞であることができる。Ｔ細胞はまた、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞などのＴヘルパー細胞であることもできる。ＣＤ４などの少なくとも１つのマーカーにより互いに異なるＴ細胞は、本明細書ではＴ細胞の“サブセット”と称する。
Ｔ細胞は、純粋なＴ細胞集団であることができ、あるいは、Ｔ細胞は、Ｂ細胞および／または他の末梢血細胞などの異なるタイプの細胞をもつ集団中にあることもできる。Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞などのＴ細胞サブセットの純粋な集団であることができ、またＴ細胞の異なるサブセットを含むＴ細胞集団であることもできる。本発明の他の実施態様では、Ｔ細胞は、長期間培養維持されるＴ細胞クローンである。Ｔ細胞クローンは、様々な度合で形質転換させることができる。特定の実施態様では、Ｔ細胞は、培養中無期限に増殖するＴ細胞クローンである。
本発明の好ましい実施態様では、Ｔ細胞は、一次Ｔ細胞である。用語“一次Ｔ細胞”は、長期間培養維持されるＴ細胞とは反対に、個体から得られたＴ細胞を含むことを意図する。そのため、一次Ｔ細胞は、好ましくは、被験体から得られた末梢血Ｔ細胞である。一次Ｔ細胞集団は、ほとんど一種のＴ細胞サブセットから構成され得る。あるいは、一次Ｔ細胞集団は、異なるＴ細胞サブセットから構成されていてもよい。
Ｔ細胞は、健常個体由来のものであることができ、またあるいは、Ｔ細胞は、疾病をもった個体由来のものであってもよい。この疾病とは、ウイルス感染、細菌感染またはその他微生物による感染から起こるような感染性疾患であり得る。特定の実施態様では、Ｔ細胞は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した個体由来のものである。本発明のまた別の実施態様ではＴ細胞は、自己免疫疾患を罹病している被験体、またはこれを受け易い被験体由来のものである。Ｔ細胞は、ヒト起源、ハツカネズミ起源、またはその他あらゆる哺乳動物種のものであり得る。
本発明の方法によれば、活発に増殖しているＴ細胞に核酸分子を導入する。Ｔ細胞を様々な作用物質、例えば、Ｔ細胞に一次活性化シグナルおよびコスティミュラトリー・シグナルを与える作用物質類の組み合わせ、と接触させることにより、Ｔ細胞を刺激して、増殖させることができる。Ｔ細胞を刺激して増殖させるのに使用され得る作用物質類は、当分野ではよく知られており、下記２章に記載している。増殖のために刺激されるＴ細胞は、細胞拡張、クランピング（clumping）、および培養培地の酸性化を特徴とする。このため、Ｔ細胞増殖は、例えば、コウルター計数器（Coulter Counter）などによるＴ細胞のサイズ検査または容量測定により立証できる。休止Ｔ細胞は、平均直径約６．８ミクロンを有する。初期活性化および刺激後のＴ細胞平均直径は、４日目に１２ミクロンに上昇し、およそ６日目に減少し始めるであろう。更に、Ｔ細胞増殖は、トリチウム化チミジン摂取などの当分野の標準技術によっても評価できる。
２．刺激性作用物質
本発明の方法は、核酸分子を増殖Ｔ細胞に導入する前に、増殖Ｔ細胞を少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させることを含む。用語“刺激性作用物質”は、Ｔ細胞中へトランスフェクションした核酸分子に含まれる遺伝子の発現レベルが、核酸分子をＴ細胞に導入する前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させた場合に、核酸分子を導入する前に刺激性作用物質と接触させなかったＴ細胞におけるよりも高いように、Ｔ細胞にシグナルを提供する作用物質類を含むことを意図する。
本発明の具体的な実施態様では、刺激性作用物質は、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質である。用語“一次活性化シグナル”は、典型的には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して誘発される、Ｔ細胞の活性化を誘起するシグナル類を含むことを意図する。Ｔ細胞の活性化は、コスティミュラトリー・シグナルなどの第２シグナル受容時にＴ細胞を増殖および分化させるようにＴ細胞を誘導するようなＴ細胞の修飾を含むことを意図する。具体的な実施態様では、一次活性化シグナルは、Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体と関連するＣＤ３複合体を接触させる作用物質により提供される。好ましい実施態様では、この作用物質は、ＣＤ３に反応性の抗体、例えば、モノクローナル抗体ＯＫＴ３（American Type Culture Collection, Rockville,MDから入手；番号ＣＲＬ８００１）である。本発明のその他の実施態様では、刺激性作用物質は、Ｔ細胞上でＣＤ２複合体を刺激する作用物質、例えば、抗体の組み合わせ、例えば、Ｔ１１．３＋Ｔ１１．１またはＴ１１．３＋Ｔ１１．２である（例えば、Meuer,S.C.等,(1984)Cell36:897-906参照）。
本発明の好ましい実施態様では、Ｔ細胞中で一次活性化シグナルおよびコスティミュラトリー・シグナルの両方を刺激する作用物質の組み合わせでＴ細胞を刺激する。用語“共刺激性（コスティミュラトリー）作用物質（costimulatory agent）”は、一次活性化シグナルを受けたＴ細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）を刺激して増殖させるかまたはＩＬ−２、ＩＬ−４、またはインターフェロン−γなどのサイトカインを分泌させるようなコスティミュラトリー・シグナルをＴ細胞に提供する作用物質類を含むことを意図する。特定の実施態様では、共刺激性作用物質はＣＤ２８またはＣＴＬＡ４分子とＴ細胞表面で相互作用する。更に一層具体的な実施態様では、コスティミュラトリー・シグナルは、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４のリガンド、例えば、Ｂリンパ球抗原Ｂ７−１またはＢ７−２である。用語“ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態”は、Ｂ７−１およびＢ７−２分子、それらのフラグメント、またはそれらの修飾形を含むことを意図し、これらは、Ｔ細胞にコスティミュラトリー・シグナルを提供する能力がある。ＣＤ２８の天然リガンドの共刺激性形態は、例えば、活性化末梢血リンパ球をＣＤ２８の天然リガンドの一形態と接触させ、標準Ｔ細胞増殖アッセイを実施することにより、同定できる。従って、ＣＤ２８の天然リガンドの刺激性形態は、Ｔ細胞の増殖を刺激する能力がある。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４の天然リガンドの刺激性形態は、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９５／０３４０８に記載されている。
核酸分子をＴ細胞に導入する前に、Ｔ細胞刺激のために使用できるその他の作用物質類には、Ｔ細胞活性化および／または共刺激（コスティミュレーション）に関連する１またはそれ以上の細胞内シグナル伝達経路を刺激する作用物質類がある。本発明の好ましい実施態様では、刺激性作用物質はイオノマイシンまたはＡ２３１８７などのカルシウムイオノホアである。あるいは、刺激性作用物質は、ホルボールエステルなどのタンパク質キナーゼＣを刺激する作用物質であることもできる。好ましいホルボールエステルは、ホルボール−１２，１３−ジブチレートである。本発明の更に一層好ましい実施態様では、核酸分子でのトランスフェクションの前に、Ｔ細胞をカルシウムイオノホアとホルボールエステルとの組み合わせと接触させる。刺激性作用物質は、タンパク質チロシンキナーゼを活性化する作用物質であってもよい。タンパク質チロシンキナーゼを刺激する好ましい作用物質はペルバナデートである（O'Shea,J.J.,等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10306）。
本発明の更にその他の実施態様では、刺激性作用物質はポリクローナルアクチベーターである。ポリクローナルアクチベーターには、Ｔ細胞の原形質膜上で発現する糖タンパク質に結合する作用物質類があり、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリン（Ｃon Ａ）およびアメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）などのレクチン類がある。
クローンに特異的活性化シグナルを提供することにより、Ｔ細胞集団においてＴ細胞のあるクローンのみを選択的にトランスフェクションさせることが可能である。Ｔ細胞クローンの特異的活性化は、例えば、抗原提示細胞により与えられる特異的抗原を用いて達成できる。
本方法の更にその他の実施態様では、刺激性作用物質は、ＩＬ−２などのリンホカインである。リンホカインは、好ましくは、Ｔ細胞を刺激するその他の作用物質、例えば、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質、と組み合わせて使用する。従って、本発明の好ましい実施態様では、核酸分子がＴ細胞中で発現するよう、核酸分子でＴ細胞をトランスフェクションさせる前に、Ｔ細胞を、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する作用物質（例えば、抗ＣＤ３抗体）と有効量のＩＬ−２を組み合わせたものと接触させる。
使用できるその他の刺激性作用物質には、スーパー抗原類がある。本明細書で定義した用語“スーパー抗原”は、Ｔ細胞増殖を刺激する能力がある細菌エンテロトキシン類またはその他の細菌タンパク質を含むことを意図する。スーパー抗原類には、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、およびＳＥＥなどのスタフィロコッカスエンテロトキシン（ＳＥ）がある。スーパー抗原類はまた、レトロウイルススーパー抗原のようにウイルス起源であることができる。
当分野で既知の、または本明細書に記載したＴ細胞刺激アッセイを用いて同定できる、単独またはその他の作用物質と併用するかのいずれかでＴ細胞を刺激する能力のある別の作用物質類もまた、本発明の範囲内である。核酸分子をＴ細胞に導入する前にＴ細胞を刺激するために、上記作用物質類のあらゆる組み合わせが使用できる。
刺激性作用物質は、溶液で、または固体表面に結合させて使用できる。この固体表面は、例えば、組織培養皿またはビーズの表面であり得る。刺激性作用物質の性質にもよるが、固体表面への結合は、当分野でよく知られている方法により実施できる。例えば、市販の架橋剤（Pierce,Rockford IL）を用いてタンパク質を細胞表面に化学的に架橋させることもでき、また、４℃で一晩インキュベーションすることによりプラスチック上に固定化することもできる。数種の作用物質を用いてＴ細胞を刺激する場合、その幾つかが溶液状であってもよく、またその幾つかが固体支持体に結合させたものであってもよい。好ましい実施態様では、固相結合抗ＣＤ３抗体と可溶性抗体ＣＤ２８抗体を組み合わせたものでＴ細胞を刺激する。
Ｔ細胞に添加される刺激性作用物質の特定用量は、刺激性作用物質の種類によって変わる。典型的には、当分野で報告されているように、Ｔ細胞を刺激して増殖およびサイトカインを分泌させるのに使用される用量と同量で刺激性作用物質を使用する。
３．トランスフェクション前刺激のプロトコール
本発明の特定の実施態様では、遺伝子を含む核酸分子をＴ細胞に導入する前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の好ましい実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する少なくとも２時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明のその他の実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する少なくとも４時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の別の実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する少なくとも６時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の別の実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する少なくとも８時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。別の実施態様では、トランスフェクションの多くとも約２時間前、トランスフェクションの多くとも約４時間前、トランスフェクションの多くとも約６時間前、トランスフェクションの多くとも約８時間前、トランスフェクションの多くとも約１０時間前、トランスフェクションの多くとも約１２時間前、トランスフェクションの多くとも約１４時間前、トランスフェクションの多くとも約１６時間前、トランスフェクションの多くとも約１８時間前、トランスフェクションの多くとも約２０時間前、トランスフェクションの多くとも約２２時間前、トランスフェクションの多くとも約２４時間前に、Ｔ細胞を刺激性作用物質と接触させる。
本発明のより一層好ましい実施態様では、核酸分子をＴ細胞に導入する約１時間から２４時間前にＴ細胞を刺激性作用物質と接触させる。本発明の最も好ましい実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子をトランスフェクションする約５から１５時間前、例えば約１０時間前に増殖Ｔ細胞を少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させる。
本方法の一実施態様では、増殖Ｔ細胞を少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させ、更に核酸分子でトランスフェクションさせる。本方法のその他の実施態様では、非増殖Ｔ細胞を増殖させるために刺激し、それから、本発明の方法に従いトランスフェクションさせる前に少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させる。非増殖Ｔ細胞は、上記“刺激性作用物質類”のところで記載のような当分野でよく知られている作用物質を用いて刺激し、増殖させる。好ましい作用物質類には、一次活性化シグナルを提供する作用物質およびコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質の組み合わせがある。Ｔ細胞の増殖を刺激するその他の好ましい作用物質類の組み合わせには、ホルボールエステルとカルシウムイオノホア、またはＰＭＡとＩＬ−２の組み合わせがある。
一次Ｔ細胞のトランスフェクション法の最も好ましい実施態様によれば、休止一次Ｔ細胞を、まず、Ｔ細胞の増殖を刺激する少なくとも１つの作用物質、例えば、カルシウムイオノホアとホルボールエステルの組合わせ物と接触させる。Ｔ細胞増殖誘起後、およそ３から８時間の間で、好ましくはおよそ５時間で、増殖Ｔ細胞を、そのＴ細胞を刺激する少なくとも１つの作用物質と接触させる。最後に、刺激性作用物質と接触後、２から１５時間、好ましくは約１０時間で、Ｔ細胞を対象となる遺伝子を含む核酸分子でトランスフェクションさせ、そうしてその遺伝子をＴ細胞中で発現させる。その他の実施態様では、Ｔ細胞のトランスフェクション後に、Ｔ細胞を更に、Ｔ細胞を刺激する作用物質と接触させる。
被験体から一次Ｔ細胞を得るために、末梢血単核細胞を被験体から単離し、密度勾配遠心分離、例えば、Ficoll/Hypaqueにより精製できる。具体的な実施態様では、次いで、精製した末梢血細胞を本発明の方法に従い核酸分子でトランスフェクションさせる。本方法の他の実施態様では、トランスフェクションさせる前に、更に特定の細胞タイプ中で末梢血単核細胞を豊富化する。単球は、例えば、プラスチック上に付着させることにより除去できる。所望ならば、更に、ＣＤ４+Ｔ細胞集団を、市販のモノクローナル抗体（mＡb）（例えば、抗ＣＤ１４（Ｍo２）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍo１）、抗ＣＤ２０（Ｂ１）、抗ＣＤ１６（３Ｇ８）および抗ＣＤ８（７ＰＴ ３Ｆ９）mＡb）を用いるモノクローナル抗体（mＡb）および抗マウス−Ｉg被覆化磁気ビーズを用いて残りの単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＣＤ８+Ｔ細胞から分離することにより、豊富化できる。本発明の方法は、また、ＣＤ４+Ｔ細胞のサブセット、例えば、ＣＤ４+ＣＤ４５ＲＡ+（天然ＣＤ４+Ｔ細胞）およびＣＤ４+ＣＤ４５ＲＯ+（記憶Ｔ細胞）Ｔ細胞サブセットにも応用できる。これらは、上記のようにして製造でき、ＣＤ４+ＣＤ４５ＲＡ+細胞の製造には更に抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１）を使用し、またＣＤ４+ＣＤ４５ＲＯ+Ｔ細胞の製造には更に抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（２Ｈ４）を使用する。
精製効率は、Ｔ細胞の特定のサブセットを認識する抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４mＡb、または更なる抗体、その後、フルオレセインイソチオシアナートコンジュゲート化ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Fisher,Pittsburgh,PA）、または他の第２抗体を用いるフロー・サイトメトリー（Coulter, EPICS Elite）により分析できる。
本発明の好ましい実施態様では、本発明の方法は、実施例の章で記載のように、更に、Ｔ細胞のトランスフェクション後にＴ細胞を刺激してインビトロで拡張（expand）させることができる。具体的な実施態様では、Ｔ細胞を、一次活性化シグナルを提供する作用物質、例えば抗ＣＤ３、およびコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質、例えば抗ＣＤ２８抗体と共にインキュベーションする。２日後、細胞を新しい培地で希釈し、コスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質を培養物に加える。次いで、Ｔ細胞を、そのサイズ分布が休止細胞プロフィール近くに戻る（約１０日）まで２日毎にカウントし、サイズ測定し、新たな培地で希釈する。その後、Ｔ細胞を、一次活性化シグナルを提供する作用物質およびコスティミュラトリー・シグナルを提供する作用物質で再刺激できる。Ｔ細胞サイズ測定およびカウントは、本明細書に記載のように、コウルター計数器を用いて実施できる。
更に一層好ましい実施態様では、Ｔ細胞は一次Ｔ細胞である。従って、Ｔ細胞を被験体から入手し、本発明の方法に従いトランスフェクションさせ、インビトロで拡張させることができる。本発明のその他の実施態様では、トランスフェクションさせ、かつ拡張させたＴ細胞を被験体に再度投与する。被験体に投与する前に、例えば、勾配遠心分離により更にＴ細胞を精製するのが好ましい場合もある。
４．Ｔ細胞のトランスフェクション
本発明は、遺伝子を含む核酸でＴ細胞をトランスフェクションさせ、その遺伝子をＴ細胞中で発現させる方法に関する。“Ｔ細胞をトランスフェクションさせる”の用語は、核酸分子をＴ細胞に導入できるあらゆる手段を含むことを意図する。用語“トランスフェクション”は、エレクロトポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス感染を含む、核酸の哺乳動物細胞への導入に有用な様々な技術を包含する。哺乳動物細胞をトランスフェクションさせる適切な方法は、Sambrook等（Molecular Cloning;A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)）およびその他の実験書に見ることができる。
本発明の好ましい実施態様では、対象となる遺伝子をコードする核酸分子をウイルスベクターを用いてＴ細胞に導入する。このようなウイルスベクターには、例えば、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス１がある。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボでの特にヒトへの外来遺伝子導入の優れた組換え遺伝子運搬システムであると一般に理解されている。あるいは、それらは、外来遺伝子をエクスビボでＴ細胞に導入するのにも使用できる。これらのベクターは、遺伝子をＴ細胞へ効率良く運ぶものであり、導入された核酸は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに安定に組込まれる。レトロウイルスの使用に当たっての重要な必須要件は、特に、細胞集団中で野生型ウイルスが蔓延する可能性について、その使用の安全性を確実にすることである。複製欠損性レトロウイルスのみを産生する分化した細胞系列（“パッケージング細胞”と称する）の開発は、遺伝子治療目的の遺伝子導入における使用について十分に特徴付けられている（検討のためMiller,A.D.(1990)Blood 76:271参照）。従って、レトロウイルスコード配列（gag、pol、env）の一部を対象となる遺伝子で置き換えてレトロウイルスを複製欠損性にすることにより組換えレトロウイルスを構築できる。この場合、複製欠損性レトロウイルスは、ビリオン中にパッケージされるので、これを、標準技術によりヘルパーウイルスを使用して、標的細胞を感染させるのに使用できる。組換えレトロウイルスを産生し、かかるウイルスを用いてインビトロまたはインビボで細胞を感染させるプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等（編）Greene Publishing Associates,(1989),Sections 9.10-9.14およびその他の標準実験マニュアルに見ることができる。適切なレトロウイルスの例には、当分野ではよく知られているpＬＪ、pＺＩＰ、pＷＥおよびpＥＭがある。同種指向性および両種指向性レトロウイルス系の両方を製造するのに適切なパッケージングウイルス系列の例には、ΨＣrip、ΨＣre、Ψ２およびΨＡmがある。
更に、ウイルス粒子表面のウイルスパッケージングタンパク質を修飾してレトロウイルスの感染スペクトル、更にレトロウイルス基盤のベクターの感染スペクトルを制限することが可能であることが示されている（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／２５２３４およびＷＯ９４／０６９２０参照）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルの修飾法は、細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスのenvタンパク質に結合させる（Roux等(1989)PNAS 86:9079-9083;Julan等(1992)J.Gen.Virol 73:3251-3255；およびGoud等(1983)Virology 163:251-254）；または細胞表面受容体リガンド類をウイルスenvタンパク質に結合させる（Neda等(1991)J.Biol.Chem.266:14143-14146）ことを含む。結合は、タンパク質またはその他の様々なもの（例えば、envタンパク質をアジアロ糖タンパク質に変換するラクトース）との化学的架橋形態であることができ、同じく、融合タンパク質（例えば、単鎖抗体／env融合タンパク質）を作成することによる。従って、本発明の具体的な実施態様では、適切な調節配列に作動可能に連結させた対象となる遺伝子を含む核酸分子を含有するウイルス粒子を、例えば、上記の方法に従い修飾することにより、それらはＴ細胞のサブセットを特異的に標的とすることができる。例えば、ウイルス粒子を、あるタイプのＴ細胞に特異的な、表面分子に対する抗体で被覆できる。特に、Ｔ細胞のＣＤ４分子を認識するウイルス粒子抗体に連結させることにより選択的にＣＤ４+Ｔ細胞を標的とすることが可能である。そのため、ＣＤ４+Ｔ細胞の感染は、ＣＤ８+Ｔ細胞の感染よりも優先的に起こるであろう。この方法は、特に、Ｔ細胞の特定のサブセットのみをトランスフェクションさせたい場合に有用である。一次Ｔ細胞を含むＴ細胞に対象となる遺伝子を含む核酸分子を導入し、かつ発現させるための更なるレトロウイルス系は、Kasid,A.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,473;Morecki,S.等(1991)Cancer Immunol.Immunother.32,342;Culver,K.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,88,3155；およびFiner,M.H.等(1994)Blood,83,43に記載されている。
本発明の有用なその他のウイルス遺伝子運搬システムは、アデノウイルス由来ベクターである。アデノウイルスのゲノムは、それが対象となる遺伝子産物をコードし発現するが、正常な細胞溶解ウイルス生活環で見られる複製能力については不活性化されているように、操作することができる。例えば、Berkner等(1988)Bio Techniques 6:616；Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434；およびRosenfeld等(1992)Cell 68:143-155参照。アデノウイルス株Ａdタイプ５ dl３２４またはその他のアデノウイルス株（例えば、Ａd２、Ａd３、Ａd７等）に由来する適切なアデノウイルスベクターは当業者にはよく知られている。組換えアデノウイルスは、細胞分裂していない細胞には感染する能力がない点である環境では有利であり得る。更に、ウイルス粒子は、精製および濃縮に対して相対的に安定かつ従順であり、また上記のように、感染スペクトルに作用するように修飾することもできる。更に、導入したアデノウイルスＤＮＡ（およびそれに含有される外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組込まれないが、エピソームの状態であり、よって、導入したＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）に組込まれるに至る状況で挿入突然変異誘発の結果として発生し得る潜在的な問題を回避できる。更に、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ収容力は、その他の遺伝子運搬ベクターと比べて大きい（８キロベースまで）（Berkner等、前掲、Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57:267）。現在使用されており、故に本発明でも好ましい多くの複製欠損性アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または部分を欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％ほどを保持している（例えば、Jones等(1979)Cell 16:683;Berkner等、前掲；およびGraham等, in Methods inMolecular Biology,E.J.Murray,Ed.(Humana,Clifton,NJ,1991)vol7,pp.109-127）。核酸分子に含まれる対象となる遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連リーダー配列、Ｅ３プロモーター、または外来的に付加したプロモーター配列の制御下にあり得る。
対象となる遺伝子を含む核酸分子の運搬に有用な更に別のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなど、効率良い複製および生産性生活環のためにヘルパーウイルスなどのその他のウイルスを必要とする天然の欠損ウイルスである（例えば、Muzyczka等、Curr.Topics in Micro. and Immunol.(1992)158:97-129参照）。アデノ随伴ウイルスは、高頻度の安定な組込み（インテグレーション）を示す（例えば、Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell,Mol.Biol.7:349-356;Samulski等(1989)J.Virol.63:3822-3828；およびMcLaughlin等(1989)J.Virol.62:1963-1973）。ＡＡＶの３００塩基対程を含むベクターをパッケージすることもでき、組込むことができる。外来ＤＮＡのためのスペースは、約４．５kbに限られている。Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260に記載されているようにＡＡＶベクターを用いてＤＮＡをＴ細胞中に導入できる。様々な核酸がＡＡＶベクターを用いて異なる細胞タイプに導入されている（例えば、Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.4:2072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51:611-619；およびFlotte等(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790参照）。遺伝子治療に応用できるその他のウイルスベクターシステムは、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、および数種のＲＮＡウイルスから誘導されている。
本発明のその他の実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子を、当分野ではよく知られている非ウイルス媒介トランスフェクション法によりＴ細胞に導入する。これらの方法には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、およびＤＥＡＥデキストラントランスフェクションがある。
更にその他の実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子を細胞運搬ベヒクルに載せてＴ細胞に輸送する。このようなベヒクルには、例えば、カチオン性リポソーム類（Lipofection（登録商標））または誘導体化（例えば、抗体コンジュゲート化）ポリリジンコンジュゲート類、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ類がある。これらのベヒクルは、プラスミド、ベクター、またはウイルスＤＮＡ中に取り込まれた核酸を運搬できる。具体的な実施態様では、Philip,R.等(1994)Mol.Cell.Biol.14,2411に記載のように、一次Ｔリンパ球を、カチオン性リポソームと複合体形成させたアデノ随伴ウイルスプラスミドＤＮＡでトランスフェクションさせることにより、一次Ｔリンパ球に核酸分子を効果的に導入できる。
本発明のその他の実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子を可溶性分子複合体の形態で特定の細胞中に運搬する。この複合体は、核酸結合剤および特異的Ｔ細胞の表面分子に結合する細胞特異的結合剤からなるキャリアーに解離可能に結合した核酸を含有し、続いて細胞にインターナリゼーションされ得るサイズのものである。このような複合体類は、米国特許第５，１６６，３２０号に記載されている。
本発明のその他の実施態様では、Yang,N.S.およびSun,W.H.(1995)Nature Medicine 1,481に記載のように粒子ボンバードメントにより核酸をＴ細胞に導入する。
５．対象となる遺伝子を含む核酸分子
本発明は、遺伝子を含む核酸分子をＴ細胞に導入する改良法に関する。用語“核酸分子”は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むこと、および一本鎖または二本鎖であり得ることを意図する。用語“遺伝子”は、ＲＮＡに転写され得るＤＮＡヌクレオチド配列、あるいは、少なくとも１つのタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ分子を含むことを意図する。
本発明の具体的な実施態様では、本発明の方法によりＴ細胞にトランスフェクションした際に、少なくとも１つのタンパク質がＴ細胞中で合成されるように、その遺伝子は、１またはそれ以上のオープン・リーディング・フレーム（転写解読枠）を含有するヌクレオチド配列、即ち、ペプチドをコードする配列からなる。少なくとも１つのタンパク質をコードするその遺伝子は、サイトカインをコードする遺伝子のようなあらゆる遺伝子であることができる。その遺伝子は１つのペプチドをコードしていてもよく、また数種のペプチド類をコードすることもできる。
本発明の別の実施態様では、その遺伝子は、本発明方法に従いＴ細胞に導入した際に１またはそれ以上の機能性ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子）中で発現される、ヌクレオチド配列である。本発明の好ましい実施態様では、機能性ＲＮＡ分子は、１またはそれ以上の外来遺伝子のＴ細胞中での発現を阻害または少なくとも低減する。そのため、本発明の方法は、選択した遺伝子のＴ細胞中での発現を低減するのに有用である。例えば、外来ＲＮＡの翻訳を低減させるために、Ｔ細胞をアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子を含む核酸分子でトランスフェクションさせる。“アンチセンス”核酸は、ワトソンおよびクリックの塩基対形成規則に従い構築される“センス”核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、タンパク質をコードするmＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合し得る。mＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、mＲＮＡのコード領域にみられる配列に相補的であることができるか、またはmＲＮＡの５’または３’非翻訳領域に相補的であることができる。好ましくは、アンチセンス核酸は、開始コドンの前にあるかまたは開始コドンにまたがる領域に、またはmＲＮＡの３’非翻訳領域内の領域に相補的である。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節については、Weintraub,H等, Antisense RNA as amolecular tool for genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986参照。
本発明のその他の実施態様では、本発明の方法に従い、Ｔ細胞にリボザイムをコードする核酸を導入することにより、外来遺伝子のＴ細胞中での発現を低減させる。リボザイムは、mＲＮＡなどの一本鎖核酸に対する相補的領域を有し、その一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。対象となる核酸に対する特異性を有するリボザイムは、核酸のヌクレオチド配列に基づき設計できる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を、その活性部位の塩基配列が対象となるmＲＮＡ中の切断される塩基配列と相補的であるように構築することができる。例えば、Cech等、米国特許第４，９８７，０７１号；およびCech等、米国特許第５，１１６，７４２号参照。
遺伝子を含む“核酸分子”は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であることができる。その核酸分子は、天然核酸分子の一部であってもよく、また合成的に作成したものであってもよい。核酸分子は、典型的には、その遺伝子を作動可能に連結させた調節配列を含有する。“作動可能に連結させた”とは、遺伝子のヌクレオチド配列を、Ｔ細胞中で遺伝子が発現（即ち、転写）できるような手段で、少なくとも１つの調節配列に連結させたという意味を意図する。調節配列は、当分野では認められており、適切なＴ細胞中での遺伝子の発現を目的として選択される。従って、調節配列の用語は、プロモーター類、エンハンサー類、およびその他の発現制御配列類を包含する。このような調節配列は、当業者には知られており、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press,San Diego,CA(1990)にも記載されている。
これらの調節配列には、遺伝子の転写および翻訳に必要とされるものがあり、プロモーター類、エンハンサー類、ポリアデニル化シグナル、および適切な細胞コンパートメントに分子を輸送するのに必要な配列があり得る。核酸が組換え発現ベクター中のｃＤＮＡであるとき、ｃＤＮＡの転写および／または翻訳を担う調節機能は、ウイルス配列により与えられることが多い。通常使用されるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０、およびレトロウイルスＬＴＲsに由来するものがある。
ｃＤＮＡに連結させる調節配列を選択して、例えば、誘導性エンハンサーの使用により構成的または誘導的転写を与えることができる。そのため、本発明の具体的な実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子は誘導性制御配列の制御下にあり、そうして、その核酸を含有するＴ細胞をその誘導性制御配列に影響を与える作用物質と接触させるか、または接触させないことにより、それぞれ、遺伝子の発現をオンまたはオフにすることができる。
具体的な実施態様では、核酸分子は、誘導性制御配列の制御下にある。哺乳動物細胞に使用する誘導性調節システムは、当分野では知られており、例えば、遺伝子発現を重金属イオン（Mayo等(1982)Cell 29:99-108;Brinster等(1982)Nature 296:39-43；Searle等(1985)Mol.Cel..Biol.5:1480-1489）、熱ショック（Nouer等(1991)in Heat Shock Response,e.d.Nouer,L.,CRC,Boca Raton,FL,pp167-220）、ホルモン（Lee等(1981)Nature 294:228-232;Hynes等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2038-2042；Klock等(1987)Nature 329:734-736;Israel & Kaufman(1989)Nucl.Acids Res.17:2589-2604およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９３／２３４３１）、テトラサイクリン（Gossen,M.およびBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／２９４４２）またはＦＫ５０６関連分子（ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／１８３１７）により調節するシステムがある。
誘導性制御配列は、全てのＴ細胞において、あるいは、Ｔ細胞の特定のサブセットにおいてのみ、例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、Ｔヘルパー２（Ｔh２）細胞において誘導性であることができる。誘導性制御配列は、１タイプのＴ細胞（例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞）中の一要因によって誘導可能であり、かつその他のタイプのＴ細胞（例えば、ＣＤ８+Ｔ細胞）中の他の要因によって誘導可能である配列であることもできる。
本発明のその他の実施態様では、対象となる遺伝子を含む核酸分子は、核酸分子の発現を構成的に起こす調節配列の制御下にある。核酸分子の構成的発現を起こすために核酸分子に作動可能に連結させた調節配列は、ウイルスの配列であり得る（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、またはレトロウイルスに由来する）。あるいは、Ｔ細胞受容体エンハンサーなどの構成性Ｔ細胞エンハンサーを使用できる（例えば、WinotoおよびBaltimore(1989)EMBO J.8:729-733）。
調節配列に作動可能に連結させた対象となる遺伝子を含む核酸分子は、典型的には、細菌中でのベクターのインビトロ選択および増幅に必要な配列を含むベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスＤＮＡ）内にある。そのベクターに乗せた遺伝子を発現させることができるベクターを本明細書では“発現ベクター”と称する。
６．本発明方法の応用性
本発明は、核酸分子中に含まれる遺伝子をＴ細胞に導入し発現させる改良法に関する。本発明の好ましい実施態様では、Ｔ細胞は、一次Ｔ細胞である。従って、本発明の方法により、従来の一次Ｔ細胞トランスフェクション法に比べて、一次Ｔ細胞に導入した遺伝子を高レベルで発現させることが可能である。遺伝子を含む核酸分子で一次Ｔ細胞をトランスフェクションさせて、その遺伝子をＴ細胞中で発現させる能力は、特に遺伝子治療において、多大の応用性を有する。
具体的な実施態様では、末梢血Ｔ細胞を、対象から入手し、対象となるタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸分子でエクスビボでトランスフェクションさせ、そのタンパク質をＴ細胞中で合成させる。そのＴ細胞を更に、対象に再投与してもよい。具体的な実施態様では、Ｔ細胞中で合成させた外来タンパク質をＴ細胞により分泌させる。従って、本発明は、個体中で分泌可能タンパク質を産生する方法を提供するものである。本発明の範囲内のタンパク質は、例えば、サイトカイン類、リンホカイン類、成長因子類がある。そのため、トランスフェクション化Ｔ細胞により産生されるタンパク質は、Ｔリンパ球自身よりも他の細胞を優先的に標的とすることができる。
あるいは、トランスフェクション化Ｔ細胞により産生されるタンパク質は、細胞内タンパク質または膜タンパク質である。具体的な実施態様では、外来タンパク質は、例えばウイルスにより感染からＴ細胞を防御するタンパク質である。かかる方法は、その一部がウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染してるいＴ細胞集団を拡張（イクスパンド）するのに有用である。そのため、Ｔ細胞集団を、全ての細胞に感染を付随蔓延させることなく、展開させることができる。
その他の実施態様では、外来タンパク質は、毒素などの特定のＴ細胞サブセットを殺すタンパク質である。そのタンパク質は、特定のＴ細胞サブセットに特異的な調節制御配列の制御下で遺伝子を持つことにより、選択的にそのＴ細胞サブセットを標的とすることができる。また、あるＴ細胞サブセットの選択的トランスフェクションを可能にするトランスフェクション法を用いることにより、外来遺伝子は特異的にあるタイプのＴ細胞を標的とすることも可能である。例えば、その膜上にＴ細胞サブセット特異的分子のリガンドを含有するリポソームでＴ細胞をトランスフェクションさせることができる。本発明方法によりＴ細胞に導入された遺伝子は、アデニンデアミナーゼ欠損に起因する深刻な複合免疫不全症などの遺伝子疾患を処置するために遺伝子設計することもできる。例えば、アデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子は、本発明の方法を用いて、一次Ｔリンパ球に導入し、そこで発現させることができる。本発明のその他の実施態様は、Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド（gp３９）の突然変異を特徴とし、かつヘルパーＴ細胞依存性抗体応答の欠如を特徴とする遺伝子疾患である、高ＩgＭ症候群の処置に関する。高ＩgＭ症候群の患者由来のＴ細胞を、gp３９をコードする核酸で、好ましくはそれ自身のプロモーターの制御下、エクスビボでトランスフェクションさせ、その後、患者にそのＴ細胞を投与できる。Ｔ細胞中の機能不全遺伝子、例えばＴ細胞シグナル伝達経路に関連するタンパク質をコードする遺伝子、に起因するその他の遺伝子疾患も、本発明の方法により処置できる。
続く発明は、下記実施例により更に例示説明するが、これは、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本出願に引用した全ての文献、継続中特許出願、および公開特許の内容は、出典明示により本明細書の一部とする。
実施例
実施例１−ＣＤ２８ + 末梢血Ｔリンパ球のインビトロ長期培養
直接的トランスフェクション実験は、生体内の推定上の調節配列の機能的重要性を証明することがしばしば要求される。この種の研究は、典型的には形質転換もしくは不滅化した細胞系を使用する。しかしながら、対象とする一次細胞の調節ＤＮＡ配列を検討するのが好ましい。細胞サイクル調節、特にＧ０−特異的遺伝子発現の予測的研究のためには、生理学的背景の維持が要求される。これらの実施例は、一次Ｔ細胞にトランスフェクションされた外来ＤＮＡの発現を促す条件の開発を行うようにデザインされている。
末梢血Ｔ細胞は、次のようにして調製した。軟膜を、２１−３１才の健康なドナーの白血球フォレシスによりまたは赤十字から入手した。末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、Ｆicoll−Ｈypaque（Ｐharmacia）クッションによる密度勾配遠心分離または白血球分離培地（Ｌitton Ｂionetics）で取得した。Ｔ細胞のＣＤ２８+サブセットは、文献（Ｊune, Ｃ.Ｈ., Ｌedbetter, Ｊ.Ａ., Ｇillespic, Ｍ.Ｍ., Ｌindste, Ｔ., and Ｔyhompson, Ｃ.Ｂ.(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol. 11:5435-5445）のヤギ抗マウスＩｇをコートした磁気粒子（Ｄynal Ｉnc）による免疫吸着を利用するネガティブ分離によって、PBMCsから単離した。細胞精製は、流速血球計および組織化学により、機械的に監視した。得られた細胞群は、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）をコンジュゲイトしたｍＡｂｓを用いる蛍光活性化細胞ソーター（FACS）分析によれば、＞９９％ＣＤ２+で、＞９８％ＣＤ２８+であった。単球、Ｂ細胞および大顆粒白血球は免疫蛍光分析では検出できなかった。別法としては、休止Ｔ細胞を、文献（Ｔhompson, Ｃ.Ｂ., Ｒyan, Ｊ.Ｊ., Ｓieckmann, Ｄ.Ｇ., Ｆinkelman, Ｆ.Ｄ., Ｍond, Ｊ.Ｊ. and Ｓcher, Ｉ.(1983)Ｊ. Ｉmmunol. Ｍethods 63:299-307）の遠心溶出法により単核細胞画分から調製した。これらの細胞は、流速血球計の測定では、＞９５％ＣＤ２+であった。両方法とも、細胞生存率は、トリパン・ブルー・エクスクルージョンによる測定では、＞９９％であった。
上記のようにして得られたヒト末梢血Ｔ細胞は、＞９９％ＣＤ２+、＞９８％ＣＤ２８+であり、休止期にあることが示された。この研究に使用された精製Ｔ細胞は、アクセサリー細胞を含まず、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、フォルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）またはイオノマイシン単独で刺激しても、試験管内で増殖しなかった。しかしながら、これらのＴ細胞は、固定化モノクローナル抗体（mAb）でTCK-CD3架橋させることにより、また適量のPMAとイオノマイシン（Ｌindsten, Ｔ., Ｊune, Ｃ.Ｈ., and Ｔhompson, Ｃ.Ｂ.(1988)ＥＭＢＯ Ｊ.,7:2787-2794）により刺激されて分裂し得た。この条件下で、休止Ｔ細胞の＞９０％が活性化され、細胞の大多数が同期的に細胞分裂の１回を行った。
休止Ｔ細胞を活性化し、培養による長期拡張（long-term expansion）を促進するには、上記のようにして新たに単離した休止Ｔ細胞を２×１０6個／mlの濃度で、完全培地（RPMI 1640(GIBCO)に１０％加熱不活化ウシ胎児血清(GIBCO)、2mML−グルタミン、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００mg／ml）および１５ml Ｈepes（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸；ｐＨ７．４；GIBCO）を添加し、３７℃で５％ＣＯ2とともに１夜静置したもの）中で培養した。１夜培養後、拡張プロトコールの第１日に、休止Ｔ細胞を、Ｊune et al.,(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.11；5433-5445に記載の可溶化抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８）ｍＡｂ ９．３（１μg/ml）の存在下にＣＤ３ε鎖に対する固定化抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）ｍＡｂＧ１９−４の飽和量で刺激した。CD3mAbG19-4(IgG1)は、文献（Ｌedbettger, Ｊ.Ａ., Ｍartin, Ｐ.Ｊ., Ｓpooner, Ｃ.Ｅ., Ｗofsy, Ｄ., Ｔsu, Ｔ.Ｔ., Ｂeatty, Ｐ.Ｇ. and Ｇladstone, Ｐ.(1985)Ｊ. Ｉmmunol.135:2331-2336）の方法で調製され、精製された。mAbG19-4は、文献（Ｇeppert, Ｔ.Ｄ., and Ｌipsky, Ｐ.Ｆ.,(1987)Ｊ. Ｉmmunol. 138:1660-1666）の記載によってプラスチック組織培養フラスコ／プレートの表面に増殖に適当な量を吸着させた。これを実施したのは、架橋（Ｗilliams, Ｊ.Ｍ., Ｒansil, Ｂ.Ｊ., Ｓhapiro, Ｈ.Ｍ., and Ｓtrom, Ｔ.Ｂ.(1984)Ｊ. Ｉmmunol. 133;2986-2995）が必要とされるからであり、ＣＤ３複合体のインターナリゼーション（Ｌebetter, Ｊ.Ａ., Ｈune, Ｃ.Ｈ., Ｍartin, Ｐ.Ｊ., Ｓpooner, Ｃ.Ｅ., Ｈansen, Ｊ.Ａ. and Ｍeier, Ｋ.Ｅ.(1986)Ｊ. Ｉmmunol. 136:3945-3952）を阻止するためであった。CD28mAb9.3(IgG2a)はプロテインＡ−セファローズで精製し、PBSに対して透析し、０．２２μm滅菌フィルターで濾過し、遠心分離（１００，０００×ｇ、４５分間）で凝集物を除き、１μg／mlで使用した（Ｌedbetter, Ｊ.Ａ., Ｍartin, Ｐ.Ｊ., Ｓpooner, Ｃ.Ｅ., Ｗofsy, Ｄ., Ｔsu, Ｔ.Ｔ., Ｂeaty, Ｐ.Ｇ. and Ｇladstone, Ｏ.(1985)Ｊ. Ｉmmunol., 135:2331-2336）。
２日後、つまり第３日目に、活性化Ｔ細胞を計数し、サイジングし、新しい完全培地で０．５×１０6個／mlの濃度に希釈した。サイズの分布が休止細胞のプロフィールに近くなるまで、細胞の計数、サイジング、希釈を２日毎に繰返した。そこで、Ｔ細胞を２×１０6個／mlの濃度で完全培地に再懸濁し、上記のようにして再刺激する（第１回の再刺激は通常第１０日頃）。
細胞は、コールターＺＭカウンター（Ｃoulter Ｅlectronics）を用いて計数した。細胞は、円筒状の７０μmアパーチャーを備えたコールター・計数器ＺＭモデルとＩＢＭのＰＣコンピューター接続したチャネライザーＣ−２５６モデルで、直線目盛り上にサイジングした。細胞はイソトンに懸濁し、一定の径を持つラテックス・ビーズを用いてキャリブレイションした。
マイトジェンまたは抗Ｔ細胞レセプター（抗ＴＣＲ）刺激Ｔ細胞をαＣＤ２８で処理するとＴ細胞増殖の相乗的増加を誘発した。休止Ｔ細胞をαＣＤ３およびαＣＤ２８で共刺激（コスティミュレーション）すると、初期に激しい指数的増殖が起り、細胞の肥大、集合および培地の酸性化によって特徴づけられる代謝が生じる。細胞は、培養の初期７−８日に数回の細胞分裂を行い、細胞数は６−８培となった。この時点で、細胞の増殖率は低下した。培養第１０−１１日には細胞分裂は停止し、細胞はそのサイズについて休止細胞に類似してきた（図１）。拡張プロトコールのこの点で細胞はαＣＤ２８の存在下に固定化したαＣＤ３で再刺激し、細胞の集合と肥大で特徴づけられる再度の指数増殖期を経過した。
図２はこの方法で培養した細胞の増殖特性を示している。ここに示されているように、細胞はαＣＤ３／αＣＤ２８共刺激の繰返しによって多週にわたって（３か月以上）指数的状態に維持され、増殖した。流速血球計分析を種々の時点で行い、これらの細胞の表現型進化を追跡した。時間とともに、こうして拡張された細胞は、表現型におけるナイーブなＴヘルパー（Ｔｈ）細胞から記憶細胞への転換を反映して、次第に、よりＣＤ４+４５ＲＯ+となった。これは、αＣＤ３／αＣＤ２８共刺激の後に外来ＩＬ−２の存在下に増殖させた細胞と直接対照的である。これらの細胞は、時間と共に次第によりＣＤ８+となり、最終的には培地中で増殖できなくなった。これらの観察は、ＣＤ４+細胞によって生産される何らかの因子が連続的なＴ細胞の増殖に必要とされることを示している。
実施例２ 細胞増殖は外来ＤＮＡの発現に充分ではない。
一次Ｔ細胞の長期クローン拡張のための反復αＣＤ３／αＣＤ２８共刺激を確立し、このプロトコールを用いて増殖させた細胞について、ノーザン・ブロット分析により、内生ets−１ ｍＲＮＡの発現を分析した。
ＲＮＡの抽出のために、細胞を遠心分離により採取し、グアニジン・イソチオシアネート（Ｃhirgwin et al, 1979）を用いて総細胞ＲＮＡを抽出した。試料をｒＲＮＡに関して均等化し、均等化を、文献（Ｊune, Ｃ.Ｈ., Ｌedbetter, Ｊ.Ａ., Ｇillespie, Ｍ.Ｍ., Ｌindsten, Ｔ., and Ｔhompson, Ｃ.Ｂ.(1987)Ｍol.Ｃell.Ｂiol. 11:5435-5445）の記載により、非変性１％アガロース・ゲル上で分離したＲＮＡ試料の均等量のエチジウム・ブロミド染色によって確認した。これらの均等化したＲＮＡ試料（５−１０μg）を１％アガローズ／フォルムアルデヒド・ゲル上で分離し、ニトロセルロースに移した。ＤＮＡプローブは、３−９×１０8cpm／μgの比活性にニック・トランスレーションで標識した。ＩＬ−２特異的プローブは、ｐＴＣＧＦ５プラスミド（Ｃlark, Ｓ.Ｃ., Ｗong−Ｓtaal, Ｆ., Ｍatsumoto−Ｋobayashi, Ｍ., Ｋay,Ｒ.Ｍ., Ｋaufman, Ｒ.Ｊ., Ｂrown, Ｅ.Ｌ., Ｓhoemaker, Ｃ., Ｃopeland, Ｔ., and Ｏroszian, Ｓ. et al,(1984)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 81:2543-2547）由来の１．０kb ＰstＩcＤＮＡインサートであった。ＨＬＡＢ７プローブはｐＨＬＡ−Ｂ７から単離された１．４kb ＰstＬフラグメントであった（Ｓood, Ａ.Ｋ., Ｐereira, Ｄ., and Ｗeissman, Ｓ.Ｍ.(1981)Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ 78;616-620）。est−１ＤＮＡプローブは、１．９kb est−１ ｃＤＮＡからの４４２塩基対ＥcoＲＩ／ＸbaＩフラグメントからなるものであった（Ｈo, Ｉ−Ｃ., Ｂhat, Ｎ.Ｋ. Ｇottschalk, Ｌ.Ｒ., Ｌindsten, Ｔ., Ｔhompson, Ｃ.Ｂ., Ｐapas, Ｔ.Ｓ. and Ｌeiden, Ｊ.Ｍ.(1990)Ｓcience 250:814-817）。膜は洗浄後、Ｘ線フィルム（Ｋodak ＸＡＲ−２またはＸＡＲ-5）に、増感スクリーンを使用して、−７０℃で４時間ないし７日間暴露した。
ノーザン・ブロット作成のために、ＲＮＡは、第１日のαＣＤ３／αＣＤ２８共刺激の後または第８日の再刺激の後の種々の時点で、上記の一次Ｔ細胞の長期クローン拡張のプロトコールに従って培養された末梢血Ｔ細胞から抽出された。ノーザン・ブロット分析の結果は図３に示されている。休止ヒトＴ細胞はest−１ ｍＲＮＡおよびタンパクを高度に発現している。休止Ｔ細胞および第８日の“活性化”細胞は、est−１ ｍＲＮＡを高度に発現した。αＣＤ２８の存在下に抗原レセプター架橋を行った後は、est−１ ｍＲＮＡは６時間で検出できない程に減少した。第１日および第８日の細胞は両方共にest−１ ｍＲＮＡを再発現し、刺激後２４ないし７２時間維持された。
どのシス作用性調節配列がest−１遺伝子の発現を調節しているかを決定するために、対数生育期にある一次細胞を、ＣＡＴ遺伝子に結合したest−１プロモーター（EST−１-CAT-2）を含むプラスミドで、長期培養プロトコールの第６日にトランスフェクションした。この構成はジャーカットＴ細胞で強力なレポーター活性を発揮した。一次Ｔ細胞の、いずれかのＤＥＡＥ−デキストランによる１μg ＤＮＡのトランスフェクション後に（Ｈo, Ｉ−Ｃ., Ｂhat, Ｎ.Ｋ., Ｇottschalk, Ｌ.Ｒ., Ｌindsten, Ｔ., Ｔhompson, Ｃ.Ｂ., Ｐapas, Ｔ.Ｓ., and Ｌeiden, Ｊ.Ｍ.(1990)Ｓcience 250:814-817）、細胞を反復して洗浄し、完全培地に再懸濁した。トランスフェクションの４０時間後に、細胞を採取し、ＣＡＴ活性を測定した。
ＤＥＡＥ−デキストランでのトランスフェクション・プロトコールでは、細胞はＰＢＳで１回、ＴＳ緩衝液ｐＨ７．４で１回洗浄した。２度目の洗浄の後、細胞はＤＥＡＥ−デキストラン（分子量５００，０００）５００μgとスーパーコイル状プラスミド１−１０μgを含むＴＳ緩衝液中に１０7／mlで再懸濁させた。この混合物を、時々かき混ぜながら室温で１２−１５分間放置した。ＲＰＭＩ１６４０ １０mlに２０％熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミンおよび１５ｍＭＨepesを添加して（ＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈ）、細胞に加えた。細胞を組織培養フラスコに移し、５％ＣＯ2中３７℃で３０分間培養した。細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈで１回洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈ １０ml中に３７℃、５％ＣＯ2で再懸濁した。
ここに記載した他の例では、一次Ｔ細胞をエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。エレクトロポレーションプロトコールでは、細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、氷冷したＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈ中に、２０×１０6細胞／mlで再懸濁した。３００μl中に６×１０6細胞を含む懸濁液を滅菌した０．４cmのエレクトロポレーション用キュベット（ＢioＲad）に移した。レポーター・プラスミド１−１０μgを加え、ジーン・パルサー（ＢioＲad）を使用して２５０Ｖ、９６０マイクロファラッドで細胞にエレクトロポレーションを行った。細胞を氷上で１０分間培養し、ＲＰＭＩ １６４０／２０％ＦＣＳ／Ｇ／Ｈ １０mlで希釈し、５％ＣＯ2中３７℃に保持した。
等容積の細胞抽出液を１６時間の反応でＣＡＴ活性を測定した。ＥＤＴＡを最終濃度が５ｍＭになるように添加し、抽出液は６５℃で１０分間アセチルＣｏ−Ａの加水分解とクロラムフェニコールの脱アセチル化を阻害するように加熱した（Ｃrabb, Ｄ.Ｗ., and Ｄixon, Ｊ.Ｅ.(1987)Ａnal. Ｂiochem. 163:88-92）。ＣＡＴ測定の薄層クロマトグラフィー上でのオートラジオグラフィーの前に、［14Ｃ］クロラムフェニコールおよびそのアセチル化誘導体のスポットをベータスコープ（Ｂetagen）またはフォスフォリメイオジャー（Ｍolecular Ｄynamics）をもちいて定量した。アセチル化のパーセントは、アセチル化および非アセチル化の実験値からバックグラウンド値を差し引いて計算した。もし、トランスフェクションの与えられた一つのセットについてのアセチル化のパーセントが測定の直線領域を超えたときは、等容量の細胞抽出液を希釈して、ＣＡＴ測定を再試行した。ＣＡＴ活性は、結いで反応中のタンパク量に対して正規化した。正規化したＣＡＴ活性は（パーセント・アセチル化／mgタンパク）×５０として表す。すべてのレポーター活性の比較は、同時に、かつ同一の試薬により刺激され、トランスフェクションさせ、採取され、測定された細胞について行う。
本方法でトランスフェクションさせた一次細胞には、EST-1-CAT-2レポーター活性は検出されなかった。内生のest−１ ｍＲＮＡは休止細胞で優先的に発現し、Ｔ細胞刺激の約２−３日後に再誘発されるので、EST-1-CAT-2レポーター発現は、Ｔ細胞が休止期に再度入ったかどうかに係わりなく期待された。驚くべきことに、RSV-CAT、HIV-1-CATおよびHILV-1-CATのような陽性対照による細胞のトランスフェクションもまた証明できるようなレポーター活性を与えなかった。細胞数の増加により、長期培養プロトコールの第６日での細胞は対数増殖期にあった（図２）。しかしながら、構成的レポーター構築物のこれら細胞へのトランスフェクションは検出可能なレポーター活性を与えず、効率的な導入遺伝子の発現には、増殖だけでは不十分であるのとを示唆した。
“活性な”シグナル伝達がレポーター遺伝子の発現に必要かどうかを決定するために、培養プロトコールの第５日の対数増殖期にある一次Ｔ細胞を、フォルボール・エステル（ＰＤＢＵ）とカルシウム・イオノホア（イオノマイシン）でトランスフェクションの１０時間前に刺激した。
図４はこの、そしてその後のトランスフェクションに用いた時刻表を示している。休止しているＴ細胞を、飽和量の固定化した抗ＣＤ３抗体と１μg／mlの抗ＣＤ２８とともに培養して増殖するように刺激した。２日後、第３日に活性化されたＴ細胞を計数し、サイズ分けし、新鮮な完全培地で０．５×１０6細胞／mlの濃度に希釈した。第５日に、細胞をホルボール・１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ、ＬＣ Ｓervices Ｃorp.）１０ng／mlとイオノマイシン（Ｃalbiochem）０．４μg／mlで刺激した。第６日、刺激後１０時間で、細胞は、実質的に文献（Ｈo, Ｉ−Ｃ., Ｂhat, Ｎ.Ｋ., Ｇottschalk, Ｌ.Ｒ., Ｌindsten, Ｔ., Ｔhompson, Ｃ.Ｂ., Ｐapas, Ｔ.Ｓ. and Ｌeiden, Ｊ.Ｍ.(1990)Ｓcience 250:814-817）に記載されているように、ＤＥＡＥ−デキストランを使用し、構成的発現レポーター構築物RSV-CAT １０μgでトランスフェクトした。pRSV-CAT(RSV-CAT)は、CATをコードする配列の５’末端にRSVLTRが融合している構成である（Ｇorman, Ｃ.Ｍ., Ｍerlino, Ｇ.Ｔ., Ｗillingham, Ｍ.Ｃ., Ｐastan, Ｉ., and Ｈpward, Ｂ.Ｈ.(1982)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ 79:6777-6781）。細胞を４０時間後に採取し、ＣＡＴ活性を測定した。
結果は、図５に示されている。増殖中の一次細胞のＰＤＢＵ＋イオノマイシンによる前刺激は、ならし培地のみで処理した細胞に比して、ＲＳＶ−ＣＡＴレポーターの発現が６７倍増大した。このＲＳＶ−ＣＡＴレポーター活性の劇的な相異が、刺激された細胞と刺激されていない細胞との増殖能力の違いによるものかどうかを決めるために、これらの細胞の増殖状態を次の方法で調べた：１）細胞周期の分析のためのアクリジン・オレンジ染色、２）ＤＮＡ合成の指標としてのトリチル化チミジン［3Ｈ］ＴｄＲの取り込み、および３）細胞活性化の一般的指標としての細胞のサイジング。自家休止の一次細胞と長期培養プロトコールの第３日のαＣＤ３／αＣＤ２８刺激細胞とを、静止期（Ｇ０／Ｇ１境界）と旺盛な増殖期のコントロールとして同時に測定した。
精製した休止Ｔ細胞（第１日）は、αＣＤ２８ｍＡｂ ９．３（１μg/ml）の存在下にαＣＤ３ ｍＡｂ Ｇ１９−４の飽和量で刺激した。第３日に活性化Ｔ細胞は新鮮な完全培地で０．５×１０6／mlの濃度に希釈し、ｍＡｂ ９．３を最終濃度０．５μg／mlとなるように加えた。第６日に、指数増殖期の細胞をホルボール１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ、ＬＣ Ｓervices Ｃorp.）１０ng／mlとイオノマイシン（Ｃalbiochem）０．４μg／mlまたはならし培地のみで１０時間処理した。第３日および第６日の細胞を、下記のようにして細胞周期分析のためにアクリジン・オレンジで染色した。非刺激の細胞（第１日）は、同時にＧ０／Ｇ１境界の決定のために分析した。
細胞は、文献（Ｄarzynkiewicz(1990)Ｍethods Ｃell Ｂiol. 33:285-298）の方法によりアクリジン・オレンジ（Ｐolyscience）で染色した後ＦＡＣスキャン流速血球計（Ｂecton−Ｄickinson）でＲＮＡおよびＲＮＡ含量を分析した。１−５×１０6個の細胞をPBSで２回洗浄し、７０％冷エタノール中に２×１０6／mlの濃度に固定した。細胞を遠心分離し、洗浄し、２×１０6／ml以下の濃度で完全培地に再懸濁した。この細胞懸濁液０．２mlをアクリジン・オレンジで染色し、ＦＡＣスキャンによって分析した。増量したＲＮＡ含量と変化のないＤＮＡ含量を示す細胞はＧ１期の細胞と考えられた。増量したＲＮＡおよびＤＮＡ含量の細胞はＳまたはＧ２Ｍ期と考えられた。
第１、３および６日のＴ細胞のトリチル化チミジン［3Ｈ］ＴｄＲの取り込みを決定するために、細胞は、平底９６穴マイクロタイター・プレート（Ｃostar）上、５×１０5細胞／ウェルで、４重試料として培養した。１μＣiのトリチル化チミジン［3Ｈ］ＴｄＲ（ＩＣＮ）を各ウェルに加え、５％ＣＯ2中３７℃で６時間培養した。６時間後、細胞は、ＰＨＤ細胞採取器（Ｃambridge Ｔechnologies）を使用してガラスのマイクロフィルター・ストリップ（Ｗhatman）上に採取し、液体シンチレーション・カウンター（ＬＫＢ）で計測した。全ての数値は、４重試料について平均cpm±標準偏差として表される。
図６に示すように、αＣＤ３／αＣＤ２８による休止Ｔ細胞の刺激は、細胞の拡張の第３日までに９２％以上の細胞が細胞周期のＧ０からＧ１もしくはＳ／Ｇ２Ｍ相に進んでいた。これはトリチル化チミジンの２０７倍の増加および平均細胞容積の増加に対応していた。培養第６日までに、ならし培地のみに培養した９１％以上の細胞が細胞周期のＧ１またはＳ／Ｇ２Ｍ相にあった。ＰＤＢＵ＋イオノマイシン処理し、刺激の１０時間後にＲＮＡおよびＤＮＡの含量の測定に供した細胞の９２％以上が、細胞周期のＧ１またはＳ／Ｇ２Ｍ相にあることが見出された。これらのデータは、トランスフェクション時の細胞の活性な周期性とＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激細胞と無刺激細胞との同等の増殖性を示している。事実、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激細胞は、非刺激の対応細胞と比べたとき、ＤＮＡ合成率（［3Ｈ］ＴｄＲの取り込みで３５×１０3cpm対５２×１０3cpm）および平均細胞容積において如何なる増加も示さなかった。従って、これら二つの細胞群でトランスフェクション時には増殖力に差はなく、これはRSV-CATレポーター遺伝子の発現の差を説明している。
ラウス肉腫ウイルスＬＴＲは、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣaＭ−kinase）応答要素を含んでおり、これは増量したカルシウム・イオンの存在下に、活性化されたＣaＭ−kinaseによる転写の選択的誘導を付与することができる（Ｋaipiloff., Ｍ.Ｓ., Ｍathis, Ｊ.Ｍ., Ｎelson., Ｃ.Ａ., Ｌin, Ｃ.Ｒ., and Ｒosenfeld,Ｍ.Ｇ.(1991)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 88:3710-3714）。ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激細胞と非刺激細胞との間のＲＳＶ−ＣＡＴ発現の差異が、刺激後のＲＳＶ ＬＴＲの特異的トランス活性化から生じるかどうかを決定するために、細胞をＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激するかならし培地のみで処理するか、トランスフェクションし、次いでならし培地または完全培地中で培養した。トランスフェクションの３０時間後完全培地で培養した細胞をＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するか、単に培地で処理した。１０時間後に、ＣＡＴ活性を見るために細胞を採取した。もしシグナル伝達の唯一の役割がＲＳＶ ＬＴＲからの転写の活性化であれば、トランスフェクション後に刺激された細胞は増加したレポーター活性をも示さなければならない。図７に示すように、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激した細胞は、非刺激の増殖中のコントロールに比してＲＳＶ−ＣＡＴレポーター活性に関し３４５倍の増加が生じた。トランスフェクション３０時間後にαＣＤ３／αＣＤ２８またはＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで刺激した細胞は、ＲＳＶ−ＣＡＴレポーター活性に関し僅か３倍または３．５倍の増加をそれぞれ示した。トランスフェクションさせた細胞を成長コンピーテントならし培地で培養するとＣＡＴ活性が２．５倍増加した。さらに、トランスフェクションの直後にＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激した細胞はＲＳＶ−ＣＡＴ活性を僅か４−５倍増加させた。これらのデータは、トランスフェクション前の刺激はＲＳＶ−ＣＡＴ活性に必要であり、トランスフェクション時のシグナル形質導入は、トランスフェクションの効率を上げるか、導入遺伝子を発現可能にすることにより、レポーター遺伝子の発現を促進することを示唆している。このレポーター構築物を用いて、トランスフェクション後に細胞を刺激しても、レポーター遺伝子の発現の明らかな増加は起らなかった。
次の例では、一次Ｔ細胞の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８による、トランスフェクション１０時間後の刺激もレポーター構築物の大幅に増加した発現を起こした。先に報告されているHIV-1-CAT（Ｎabel,Ｇ.,and Ｂaltimore,Ｄ.(1987)Ｎature 326:711-713）をこの例で使用した。増殖中のＴ細胞はＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するかならし培地のみで処理し、HIV-1-CATでトランスフェクトし、次いでならし培地中で直ちに培養するか、トランスフェクションの３０時間後にＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するか培地のみで処理した。１０時間後に細胞を採取し、ＣＡＴ活性を測定した。ＣＡＴ測定の結果は、図８に示されている。この結果は、トランスフェクションの１０時間前に一次Ｔ細胞を前刺激すると、前刺激なしにトランスフェクションしたのに比して、HIV-1-CATレポーター構築物の発現を大幅に増加させることを示している。従って、レポーター構築物の発現増加は、この構築物のプロモーターやエンハンサーのタイプに依存しない。さらに、これらの結果はトランスフェクションしたレポーター構築物の発現を増加させるための一次Ｔ細胞の前刺激は、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８の組み合わせ物によってもなされ得ることを示している。
実施例３ 外来ＤＮＡの発現はトランスフェクション時にＴＣＲ依存のシグナル伝達を必要とする。
一次Ｔ細胞における効果的な導入遺伝子の発現の要件をさらに吟味するために、広範に研究され、よく特性付けされている細胞性ＩＬ−２遺伝子のプロモーター／エンハンサーがトランスフェクションの実験に使用された。ノーザン・ブロット分析が、至適量の固定化αＣＤ３によるＴＣＲ−ＣＤ３複合体での刺激後のＩＬ−２遺伝子発現の速度論的検討に使用された。さらに、これらの培養物の上清でＩＬ−２含量を分析し、細胞で細胞周期進度を分析した。
結果は、図９に示されている。パネルＢは至適のαＣＤ３刺激により培養６時間でＩＬ−２ ｍＲＮＡの発現はピークに達し、培養１２時間までにＩＬ−２ ｍＲＮＡのレベルは検出不能なまでに低下した。この一過性のＩＬ−２ ｍＲＮＡの発現は、培地上清中の少量のＩＬ−２（２４時間で５Ｕ／ml）と活発な増殖（４８時間で４１％の細胞が細胞周期のＳ／Ｇ２Ｍ相）（パネルＤ）を伴っていた。要するに、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体での刺激は、６時間でピークに達し、刺激後１２時間で検出不能なまでに低下するＩＬ−２遺伝子転写の一過性の誘導を起こした。ＩＬ−２ ｍＲＮＡの転写が誘導性であり、一過性であるので、IL-2-CATレポーター遺伝子の発現のためのトランスフェクション時におけるシグナル伝達の必要性を調べた。IL-2-CATプラスミド（IL-2-CAT）は、文献（Ｂielinska, ＡＡ., Ｓhivdasani, Ｒ.Ａ., Ｚhang, Ｌ., and Ｎabel, Ｇ.Ｊ.(1990)Ｓcience 250:997-1000）に記載のように、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の５’に接してＩＬ−２プロモーター／エンハンサー（−５８５ないし＋１８）を含んでいる。拡張プロトコールの第５日、増殖中の一次Ｔ細胞はＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激されるか、ならし培地のみで処理され、ＩＬ−２−ＣＡＴレポータープラスミドでトランスフェクションさせ、直ちに増殖可能ならし培地または完全培地で培養した。トランスフェクションの３０時間後に、完全培地中で培養された細胞はＰＤＢＵ／ＩＯＮＯまたはαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するか、培地のみで処理した。１０時間後、細胞の数および生存能力をトリパン・ブルー・エクスクルージョンによって調べ、細胞をＣＡＴ活性測定のために採取した。
ＣＡＴの測定結果は図１０に示されており、その要点は次の通りである：１）前刺激をしない場合、増殖中の一次細胞は極低いレベルのＩＬ−２−ＣＡＴレポーターを発現した。２）トランスフェクション３０時間後の細胞の刺激はこの低レベルのＩＬ−２−ＣＡＴレポーター遺伝子発現を増加させなかった。３）ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激し、トランスフェクション後、細胞をリンフォカイン富化条件培地または完全培地に再懸濁した細胞もまた極低いレベルのＩＬ−２−ＣＡＴレポーターを発現した。４）ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで前刺激し、かつトランスフェクションの３０時間後にＴＣＲによる刺激を行うと、ＩＬ−２ＣＡＴレポーター活性は、前刺激のみの細胞に対して７９倍、無刺激増殖のコントロールに対して約２０倍に増加した。これらのデータは、ＩＬ−２ＣＡＴ ＤＮＡレポーター構築物の発現可能コンパートメントへの導入モデルまたはトランスフェクション前のＴＣＲ−依存的シグナル伝達を必要とする状態と一致する。しかしながら、ＩＬ−２ＣＡＴレポータープラスミドが発現と競合していも、最初のシグナル伝達がトランスフェクション１０時間前にされているため、ＩＬ−２ＣＡＴ転写が僅かに起こるか起こらず、上記ノーザン分析（図９）により、ＩＬ−２ｍＲＮＡ転写がこの時点までに低レベルに減少する。トランスフェクション後のＴＣＲ／ＣＤ３−依存性刺激は、発現成分ＩＬ−２プロモーター／エンハンサーおよびＣＡＴ ｍＲＮＡ転写を、得られるレポーター活性と共にもたらす。
実施例４ − 細胞性増殖はトランスジェニック発現に必要である
トランスジーン発現における細胞性増殖の役割に取り掛かるために、新たに単離した休止Ｔ細胞をαＣＤ２８（１μg／ml）、ＳＥＡ（１０ng／ml、Ｔoxin Ｔechnologies）、ＰＤＢＵ（１０ng／ml）／ＩＯＮＯ（０．４μg／ml）または培地単独で１０時間刺激した。これらの細胞をＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせ、４０時間後ＣＡＴ活性のために回収した。活性化Ｔ細胞はマイトジェン刺激２４−３６時間後に細胞分裂した。従って、トランスフェクションの時、非常にまれに、もしあれば、Ｔ細胞はＭ期を通して進行している。トランスフェクション４０時間後（刺激後約５０時間）、ＳＥＡまたはＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで刺激したＴ細胞は増殖に関して（細胞性拡大、凝集）、表現型の変化は示さなかった。しかしながら、これらの集団は細胞数は増加しなかった。図１１に示されるように、全てのこれらのトランスフェクション条件に関する正常化ＣＡＴ活性は、相対的に低かった（０．０７−０．２６）。ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで刺激した休止細胞は、休止対照と比較して、ＲＳＶ−ＣＡＴ活性において、少ない３．７倍の増加を示した。ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激および休止細胞の間の低いＣＡＴ活性の増加は、単に細胞性活性の効果およびＲＳＶ ＬＴＲ転写の増殖を単に反映し得、一度この受容体プラスミドが最初のシグナル伝達の結果発現可能である。注目すべきは、αＣＤ２８またはＳＥＡで刺激された細胞のＣＡＴ活性が休止細胞と異ならなかった。αＣＤ２８またはＳＥＡ単独で、完全なマイトジェン刺激は構築されなかった。ＳＥＡによるＴ細胞増殖の導入に、アクセサリー細胞（主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスII提示が必要）またはＣＤ２８のモノクローナル抗体の刺激により提供される第２のコスティミュラトリー・シグナルの添加が必要であった（Ｇreen, Ｊ.Ｍ., Ｔurka, Ｌ.Ａ., Ｊunc, Ｃ. Ｈ.,およびＴhompson, Ｃ.Ｂ.(1992)Ｃell. Ｉmmunol. 145(1):11-20）。休止Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスII（ＨＬＡ−Ｄｒ）をその表面に発現しない（Ｍayforth, Ｒ. Ｄ.(1991)Ｐh.Ｄ. Ｄissertation, Ｕniv. of Ｃhicago）。従って、増殖刺激非存在下で、休止Ｔ細胞は構成性活性受容体プラスミドＲＳＶ−ＣＡＴの発現を証明しない。
これらの細胞がＲＳＶ−ＣＡＴを発現できることを証明するために、同じ細胞の他のアリコートをαＣＤ３／αＣＤ２８で刺激するか、またはならし培地単独で１０時間で処理し、ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションさせ、次いで４０時間後ＣＡＴ活性について回収した。ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ予備刺激有りまたは無しの一日目（休止細胞）または６日目（増殖細胞）の細胞の相対的ＣＡＴ活性の比較を図１１に示す。増殖細胞のＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ予備刺激は、増殖非刺激対照と比較して１３．４倍のおよびＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ刺激休止細胞より２３．７倍のＣＡＴ活性の増加をもたらした。従って、トランスフェクションの時の細胞性増殖は、ＲＳＶ−ＣＡＴレポーター発現を非常に促進する。上記のトランスフェクションの結果を一緒にして、これらのデータは、トランスジーン発現に増殖が必要であるが、十分ではないことを示す。
実施例５ − レポーター遺伝子活性の差はトランスフェクション効果の差によるものではない
上に証明するように、トランスフェクション時前のＴＣＲ−依存性シグナル伝達は、トランスジーン発現に必要である。トランスフェクション後の刺激は、殆どの場合、レポーター活性を明確に増加させない。シグナル伝達の多くの役割のいくつかが予測できる。最も単純なモデルにおいて、トランスフェクション時の増殖細胞のシグナル伝達は、トランスフェクション効果を増加でき、従って、核に到達するレポータープラスミドの量を増加できる。あるいは、シグナル伝達は、トランスフェクションＤＮＡの非転可能コンパートメントから転写可能コンパートメント、例えば、細胞質から核への移動を促進する。両方のシナリオは、シグナル伝達に続く核へのレポータープラスミドの増加の量に関して同じ結果をもたらす。これらの可能性の試験のために、ＤＮＡ侵入および局在化の動態を、トランスフェクション後の種々の時間の核および細胞質コンパートメント由来のトランスフェクトＤＮＡの救済および定量により試験した。
５日目の増殖した一次Ｔ細胞を、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯで刺激するかまたはならし培地単独で処理し、ＲＳＶ−ＣＡＴレポータープラスミドでトランスフェクトし、細胞数および生存能力をコウルター計数器およびトリパンブルー・エクスクルージョンでそれぞれ測定した。
Ｄounceホモジナイゼーションに続く核および細胞質への分画に続いて、ＤＮＡをこれらの二つのフラクションから、ＳＤＳ可溶化およびプロテイナーゼＫ消化後に連続酢酸アンモニア／イソプロパノール沈殿を使用して両方の分画から抽出した。ＤＮＡ単離プロトコールは、低および高分子量ＤＮＡの両方の回収に関して定量的である。トランスフェクション後の種々の時点の核および細胞質コンパートメントのトランスジーンの相対的複製数を評価するために、１０5全細胞相当物の核および細胞質ＤＮＡを、先に記載のように、１．０％アガロースゲルでサイズ分画し、ニトロセルロースに移した（Ｔhompson, Ｃ. Ｂ. およびＮeiman, Ｐ. Ｅ.(1987)Ｃell 48:369-378）。ブロットをｐＲＳＣ−ＣＡＴのＣＡＴコード領域のＥcoＲＩフラグメントまたはｐＩＬ２ＣＡＴのＣＡＴコード領域のＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントのいずれかとハイブリダイズした。
サザンブロット分析の結果を図１２に示す。プラスミド／細胞の約１０5コピーを、ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン複合体の暴露の最初の３０分以内に取り込んだ。これは、トランスフェクトした全ＤＮＡの約１０％に対応する。この量で、核画分に約９０％が局在化する。トランスジーンの同じかわずかに増加した量が、トランスフェクション６、２４および４８時間後に核および細胞質に存在した。明らかに、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激および非刺激細胞の間で、いかなる時点でも核または細胞質でＤＮＡの量に明白な差はなかった。要するに、サザン分析は、シグナル伝達および非シグナル伝達細胞の間で核区画に到達するＤＮＡの量に証明可能な差のないことを確認した。
これらの発見を確認するために、一次Ｔ細胞をＲＳＶ−ＣＡＴまたはＩＬ−２ＣＡＴ受容体プラスミドで、それぞれ図７および図１０に記載のようにトランスフェクトした。図１３および１４に示すように、トランスフェクション４０時間後、ＲＳＶ−ＣＡＴプラスミドの約１０5コピー／細胞が核に存在し、全トランスフェクトＤＮＡの１０％である。上記のように、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激細胞、刺激細胞の核、またはＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ、αＣＤ３／αＣＤ２８またはならし培地でトランスフェクションした後刺激した細胞の各に存在するＤＮＡの量に明確な差がない。注目すべきは、細胞の低張融解に続いて単離されたＤＮＡのサザン分析でトランスフェクション４０時間後のプラスミド分解の証拠は見られなかった。
二つの異なるＤＮＡ単離法を使用してこの発見を総括すると、依然としてプラスミドＤＮＡの回収が完全に定量的でなかった可能性を考えないわけにはゆかなかった。これらの結果を個別に確認するために、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激および非刺激細胞を32Ｐ放射標識化鎖状ＲＳＶ−ＣＡＴでトランスフェクションした。これらの細胞を次いで核および細胞質分画にトランスフェクション０、６、２４および４８時間後に分離した。次いで、分画を液体シンチレーションカウンターで計数した。
図１５に示す結果は、トランスフェクション３０分以内に、全cpmの１５．２％がＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激細胞に取り込まれることを示した。こでは標識刺激細胞の１１．９％と同等である。これらの計数で、前刺激細胞の核分画で９２％が、非刺激細胞で８４％が回収された。続く時点で、核分画から回収された全cpmの％は、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激細胞で０時間の１４．０から４８時間の１７．１％に、非刺激細胞で０時間の１０．０％から４８時間の１３．９％に増加した。この核計数における増加は、前刺激および非刺激細胞の両方の細胞質分画で回収された全cpmの割合の少しの減少と対応し、恐らく、ＤＮＡの細胞質から核への移動を反映する。しかしながら、非シグナル伝達およびＰＤＢＵ／ＩＯＮＯシグナル伝達細胞の各分画からの全cpmの回収の割合の少しの差は、これらの二つの集団の間でＲＳＣ−ＣＡＴレポーター遺伝子発現の劇的な６７から３４５倍増加を担わなかった。トランスフェクト放射標識ＤＮＡの計数結果は、細胞内に入った全プラスミド量および続くＤＮＡの核および細胞質区画への分散の両方でサザンブロット分析と非常に密接している。要約すると、細胞のＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激は、トランスフェクション効率の増加により、またはＤＮＡの細胞質から核への移動を促進することにより、レポーター遺伝子発現を増加するとは思えない。
実施例６ − スーパー抗原誘導ＴＣＲ活性化はレトロウイルスＬＴＲを含むＤＮＡの核破壊を変える
上記の実施例は、ＴＣＲ媒介シグナル伝達により抑制可能な細胞性機構の存在を示し、それはインビトロ外来ＤＮＡの暴露から、休止Ｔ細胞および非シグナル伝達増殖一次Ｔ細胞を防御する。レポーター遺伝子発現のためのＴＣＲ依存性シグナル伝達の必要性から、スーパー抗原がトランスジーン発現の十分な刺激物として働くかを調査した。
トランスフェクション１０時間前、指数増殖期の一次ヒトＴ細胞をならし培地単独、５×１０6放射自己単球、ＳＥＡ（１０ng／ml）またはＳＥＡ（１０ng／ml）＋５×１０6放射自己単球で処理した。細胞をＲＳＣ−ＣＡＴまたはIIIV−１−ＣＡＴでトンスフェクションさせ、トランスフェクション４０時間後に回収し、ＣＡＴ活性をアッセイした。
ＣＡＴアッセイの結果を図１６に示す。ＨＩＶ−１−ＣＡＴでのトランスフェクションにおいて、ＰＤＢＵ／ＩＯＮＯ前刺激は非刺激増殖コントロールと比較して、ＣＡＴ活性の１５倍の増加をもたらした。Ｔ細胞と５×１０6放射自己単球の組み合わせは、ＣＡＴ活性の２．３倍の増加をもたらした。ＳＥＡ １０ng／mlでの処置は、ＣＡＴ活性の３２倍の増加をもたらしたが、Ｔ細胞とＳＥＡ（１０ng／ml）＋５×１０6放射自己単球の組み合わせは、１６倍の増加をもたらした。従って、ＳＥＡは単独またはＭＨＣクラスII（ＨＬＡ−ＤＲ）との組み合わせのいずれでも、ＨＩＶ−１−ＣＡＴレポーター遺伝子発現増加をもたらす。完全に同様な結果がＲＳＣ−ＣＡＴでのトランスフェクションでも見られる（図１６）。ＳＥＡおよびＳＥＡ＋ＭＯＮＯ刺激細胞の増殖状態は、トリチル化チミジン取り込みおよび細胞サイジングで測定して、非刺激増殖細胞と測定可能には差がなかった。従って、ＨＩＶ−１−ＣＡＴおよびＲＳＣ−ＣＡＴレポーター発現は、シグナル伝達におけるスーパー抗原の作用からもたらされ、増殖それ自体からではない。
このような機構およびその発現は、レトロウイルス発現に関する事象に非常に重要であり得る。例えば、休止Ｔ細胞のＨＩＶ−１の感染後、続くＴ細胞活性化がＨＩＶ−１ゲノムの宿主ゲノムへの組込みおよび感染ウイルスの製造に必要である（Ｓtevenson, Ｍ., Ｓtanwick, Ｔ.Ｌ., Ｄempsey, Ｍ. Ｐ.およびＬamonica, Ｃ. Ａ.(1990)ＥＭＢＯ Ｊ. 9(5):1551-1560；Ｚack, Ｊ. Ａ., Ａrrigo, Ｓ. Ｊ., Ｗeitsman, Ｓ. Ｒ., Ｇo, Ａ. Ａ., Ｈaislip. Ａ.,およびＣhen, Ｉ. Ｓ. Ｙ.(1990)Ｃell 61:213-222:Ｂukrinsky, Ｍ. Ｌ., Ｓtanwick, Ｔ. Ｌ. Ｄempsey, Ｍ. Ｐ., およびＳtevenson, Ｍ.(1991)Ｓcience 254:423-427）。これは、ＨＩＶ−１が、休止Ｔ細胞が続く抗原またはマイトジェン誘発Ｔ細胞活性化まで、非製造的染色体外状態で存続するモデルで示される。最近、休止Ｔ細胞でのＨＩＶの複製に、ＨＩＶ−１マトリックスタンパク質のチロシンホスホリレーションが必要であることが報告されている（Ｇallay, Ｐ. et al.,(1995)Ｃell 80:379）。
ＭＨＣクラスIIおよびＴＣＲを架橋する特異的ＴＣＲ Ｖβ遺伝子産物を発現するＴ細胞により認識される分子であるスーパー抗原は、細胞活性化、枯渇またはアネルギーを種々に導く。このタンパク質抗原グループは、多数の末梢血Ｔ細胞を活性化できる能力により特徴付けられる。哺乳動物レトロウイルスは、細胞性免疫反応性を阻止するために、または直接細胞活性の結果の複製を容易にするために、スーパー抗原をコードし得る。最近の報告は、ＨＩＶ−１スーパー抗原がＨＩＶ−１感染に見られるＴ細胞枯渇を媒体し得ることを示している（Ｉmberti, Ｉ., Ｓottini, Ａ., Ｂettinardi, Ａ. Ｐouti, Ｍ., およびＰrimi, Ｄ.(1991)Ｓcience 254:860-862；Ｃameron, Ｐ. Ｕ., Ｆrudentlial, Ｐ. Ｓ., Ｂarker, Ｊ. Ｍ., Ｇezelter, Ｓ. Ｉnaba, Ｋ., およびＳteinman, Ｒ. Ｍ.(1992)Ｓcience 257:383-387；Ｌaurence, Ｊ., Ｈodtsev, Ａ. Ｓ., およびＰosnett, Ｄ. Ｎ.(1992)Ｉnt. Ｃonf. ＡＩＤＳ Ｊul 19-24;8(1):Ｔh72；Ｐantaleo, Ｇ., Ｒebai, Ｎ., Ｇraziosi, Ｃ., Ｌane, Ｈ. Ｃ., Ｓekaly, Ｒ. Ｐ., およびＦauci, Ａ. Ｓ.(1992)Ｉnt. Ｃonf. ＡＩＤＳ Ｊul 19-24;8(1):Ｔh71）。Ｔ細胞のスーパー抗原活性化により誘発されるシグナル伝達経路の性質はまだ議論の余地がある（Ｌiu, Ｈ. Ｌampe, Ｍ. Ａ., Ｉregui, Ｍ. Ｖ., およびＣantor, Ｈ.(1991)Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 88(19):8705-8709；Ｋanner, Ｓ. Ｂ., Ｏdum, Ｎ., Ｇrosmaire, Ｌ., Ｍascwicz, Ｓ., Ｓvejgaard, Ａ., およびＬedbetter, Ｊ. Ａ.(1992)Ｊ. Ｉmmunol. 149(11):3482-3488；Ｏyaizu, Ｎ., Ｃhirmule, Ｎ., Ｙagura, Ｈ., Ｐahwa, Ｒ. Ｇood, Ｒ. Ａ., およびＰahwa, Ｓ.(1992)Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 89(17):8035-8039）。
実施例は、静止および増殖Ｔリンパ球を外来ＤＮＡの暴露から防御する、ＴＣＲ−媒介シグナル伝達により抑制可能な活性化機構の存在を示す。Ｔ細胞は、トランスフェクション前のシグナル伝達に続いて、外来ＤＮＡのみを発現する。この発見は、細胞性増殖のみでは外来ＤＮＡの十分な発現をするのに不十分であり得るため、体細胞遺伝子治療の分野で意味を有する。従って、本発明は、増殖Ｔ細胞に導入された遺伝子の十分な発現の方法を提供する。本発明の一つの態様において、Ｔ細胞を個体から得、刺激してエクスビボで増殖させ、本発明の方法により遺伝子的に形質導入し、個体に再投与する。この具体的態様において、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体、ホルボールエステルとイオノマイシンの組み合わせのようなＴ細胞受容体媒体シグナル伝達を刺激する、抗ＣＤ３抗体のような作用物質、または作用物質の組み合わせまたはＴ細胞受容体を迂回する作用物質と接触させる。
本発明はまたウイルスＤＮＡのような外来ＤＮＡの発現を阻止または減少させる方法を提供する。従って、ウイルスＤＮＡのような外来ＤＮＡを含む一次Ｔ細胞は、刺激または増殖できるが、ウイルス複製は、例えば、Ｔ細胞の増殖を外来遺伝子発現に必要な機構を活性化しない本明細書に記載の作用物質で刺激することにより阻害する。
同等物
当業者は、慣用の実験のみを使用して、本明細書に記載の具体的態様の多くの同等物ができることを認識するか、気づく。このような同等物は以下の請求の範囲に含まれると意図する。
Claims (19)
- Ｔ細胞中で外来核酸分子の発現を増加させる方法であって：
（ａ）Ｔ細胞を少なくとも１つの刺激性作用物質とインビトロで接触させること（ここで、該刺激性作用物質は、スーパー抗原、ホルボールエステルとカルシウムイオノホアの組み合わせ、及び抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体の組み合わせからなる群から選択され、該Ｔ細胞は該少なくとも１つの刺激性作用物質と接触する前に増殖している）、及び
（ｂ）外来核酸分子を段階（ａ）由来のＴ細胞に、該Ｔ細胞を接触させてから２４時間以内にインビトロで導入すること、
を含み、それにより、Ｔ細胞における外来核酸分子の発現が、該少なくとも１つの刺激性作用物質と接触しないＴ細胞における発現と比較して増加する、方法。 - Ｔ細胞を少なくとも１つの刺激性作用物質と接触させる前に、Ｔ細胞の増殖を刺激する少なくとも１つの増殖作用物質とインビトロで接触させる、請求の範囲第１項に記載の方法であって、該増殖作用物質が、スーパー抗原、ホルボールエステルとカルシウムイオノホアの組み合わせ、及び抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体の組み合わせからなる群から選択される、方法。
- Ｔ細胞が一次Ｔ細胞である、請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
- 抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体がビーズ、組織培養皿または細胞表面に結合している、請求の範囲第１−３項のいずれかに記載の方法。
- Ｔ細胞が、該Ｔ細胞に核酸分子を導入する約１−２４時間前に、少なくとも１つの刺激性作用物質と接触する、請求の範囲第１−４項のいずれかに記載の方法。
- Ｔ細胞が、該Ｔ細胞に核酸分子を導入する約１０時間前に少なくとも１つの刺激性作用物質と接触する、請求の範囲第５項に記載の方法。
- Ｔ細胞がインビトロで更に刺激されその数が増加する、請求の範囲第１−６項のいずれかに記載の方法。
- 外来核酸分子を、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、細胞運搬ベヒクル、または可溶性分子複合体の形態によって、導入する、請求の範囲第１項に記載の方法。
- Ｔ細胞が、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４-ＣＤ８-Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、及びＴｈ２細胞からなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。
- Ｔ細胞が、一次Ｔ細胞、Ｔ細胞の純粋な集団、Ｔ細胞クローン、健常個体由来のＴ細胞、感染性疾患に罹患した個体由来のＴ細胞、及び自己免疫疾患に罹患しているまたは罹患しやすい患者由来のＴ細胞からなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。
- Ｔ細胞が、哺乳動物由来である、請求の範囲第１項に記載の方法。
- 外来核酸分子がＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、請求の範囲第１項に記載の方法。
- 外来核酸分子が、天然核酸分子または合成核酸分子である、請求の範囲第１項に記載の方法。
- 外来核酸分子が、少なくとも１つのタンパク質をコードする、請求の範囲第１項に記載の方法。
- タンパク質が、分泌可能タンパク質である、請求の範囲第１４項に記載の方法。
- 分泌可能タンパク質がサイトカイン、リンホカイン、または成長因子である、請求の範囲第１５項に記載の方法。
- 外来核酸分子が、アデノシンデアミナーゼまたはｇｐ３９をコードする、請求の範囲第１項に記載の方法。
- 外来核酸分子が、１またはそれ以上の機能性ＲＮＡ分子を発現する、請求の範囲第１項に記載の方法。
- 機能性ＲＮＡ分子が、アンチセンスＲＮＡ分子またはリボザイムである、請求の範囲第１８項に記載の方法。
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