JP4097687B2 - 核酸の回収方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸を含有する物質からの核酸の回収方法に関する。更に詳しくは、核酸の検査による遺伝子診断のための体液成分からの内因性、或いは、外来性の遺伝子として存在する核酸成分の自動回収装置、或いは、核酸の塩基配列決定のための遺伝子組換え大腸菌等からのプラスミドＤＮＡの自動回収装置に適した核酸の回収方法に関する。

分子生物学の進歩によって、遺伝子に関する数々の技術が開発され、また、それらの技術により、多くの疾患性の遺伝子が分離・同定された。その結果、医療の分野でも、診断、或いは、検査法に分子生物学的な技法が取り入れられ、従来不可能であった診断が可能となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつある。

この急激な進歩は、主として、核酸増幅法、特に、ＰＣＲ法（非特許文献１）に依るところが大きい。

ＰＣＲ法は、溶液中の核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、例えば、血清中に極微量しか存在しないウイルスを、そのウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検出することにより、間接的にそのウイルスの存在を証明することができる。

しかし、このＰＣＲ法を臨床の場で日常検査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その中でも、特に、前処理における核酸の抽出、精製工程の困難性が問題であり、これら核酸の抽出、精製工程は、重要であることが指摘されている（非特許文献２）。

これは、核酸精製時に除去し得なかった阻害因子の影響により困難性が生じるものであり、阻害因子としては、血液中のヘモグロビン、抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。

また、抽出工程に関しては、煩雑な操作と熟練者による多大な労力とが必要とされる。そのため、病院の検査室へ新規に遺伝子検査を導入する際の障害となっており、この工程の自動化が熱望されている。

また、分子生物学的な研究を行う機関では、遺伝子組換え操作を行うための材料として、プラスミドＤＮＡが頻繁に使用されているが、省力化の点等から、検査室の場合と同様に、核酸を抽出し精製する工程の自動化が望まれている。

また、核酸を回収する他の方法としては、上記の水相・有機相分離を利用した方法以外にも、カオトロピック物質の存在下でガラス表面に核酸が結合する性質を利用して、アガロースゲルからＤＮＡを回収する方法（非特許文献３）、或いは、大腸菌からプラスミドＤＮＡを回収する為の方法（非特許文献４）が報告されている。

さらに、生物材料からの核酸の回収を目的とし、より操作を簡便にした方法が、特許文献１に記載されている。

従来においては、室温で固相の洗浄のための操作を効率的に行うには、少なくとも７５％濃度のエタノール使用が推奨されてる（非特許文献５）
特開平２−２８９５９６号公報 ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１（１９８８） 大島ほか，ＪＪＣＬＡ，２２（２），１４５−１５０（１９９７） Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６（２），６１５−６１９（１９７９） Ｍ．Ａ．Ｍａｒｋｏ，Ｒ．Ｃｈｉｐｐｅｒｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２１，３８２−３８７（１９８２） Ｃ．Ｗ．Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｃ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｊｒ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３３９−３４１（１９８０）

ところで、核酸を含有する生物試料から阻害因子を含まない精製度の高い状態で核酸を回収するための既知の方法としては、タンパク質分解酵素の存在下で、生物試料に界面活性剤を作用させ、核酸を遊離状とし、フェノール（及び、クロロフォルム）と混合し、遠心分離器による水相・有機相分離を数回行った後、水相からアルコールにより沈殿物の形で核酸を回収する方法が知られている。

しかし、この調製方法は、工程内に有毒物質であるフェノール等の有機溶媒を使用することに伴う問題が存在する。つまり、フェノール等の有機溶媒は、核酸回収に使用する装置のプラスチック部分を溶かす恐れがあり、装置を劣化させてしまう可能性がある。

さらに、フェノール等の有機溶媒を使用した後、その廃棄に必要な処理が煩雑である。

特許文献１記載の方法では、生物試料を十分大きい量のカオトロピック物質（例えばグアニジン塩）及びシリカ粒子と混合し、遊離した核酸を固相へ結合させることにより迅速に核酸の回収が行える。

しかし、精製された状態の核酸を得るには、固相に結合した状態を保持したまま、核酸の結合した固相からグアニジン塩を除去する操作が必要であるが、その適切な除去操作については、示されてはいなかった。

また、非特許文献５記載の技術においては、エタノールは揮発性成分であるため、装置化に際して、蒸発防止のための蓋の開閉機構や冷却機構が必要となり、装置の大型化や信頼性の低下を招く。

さらに、７０％エタノールやアセトンでの洗浄が必要とされ、このため、乾燥によるアセトンの除去作業が必要とされる。しかし、７０％以上のエタノール、及び、アセトンは揮発性であるため、上述したように、自動装置上に実装した際には、気密性の高い容器と蓋の開閉機構、或いは／及び、揮発を防ぐための冷却機構が必要とされる。

また、アセトンの使用は、その強力な有機溶剤としての性質から、上述したように、核酸回収に使用する装置のプラスチック部分を溶かす恐れがあり、装置を劣化させてしまう可能性がある。

したがって、使用する装置や容器、及び、分注器等の材質が著しく限定されてしまう。しかも、急性毒性物質で、且つ、引火性物質であるため、蒸発操作に伴う環境中へのアセトンの放出を充分に防止する必要がある。

本発明の目的は、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で、精製度の高い核酸の収量を低下させずに回収し得る核酸の回収方法及び装置を実現することである。

また、本発明の他の目的は、生物試料中に存在する核酸成分を自動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法を実現することである。

さらに、本発明の他の目的は、大腸菌からのプラスミドＤＮＡを自動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法を実現することである。

上記目的を達成するため、本発明は以下のように構成される。
（１）核酸含有材料からの核酸回収方法であって、カオトロピック物質と核酸含有材料とを含む混合液と、酸化ケイ素含有固相とを接触させ、酸化ケイ素含有固相と混合液とを分離し、酸化ケイ素含有固相を、カオトロピック物質を含む溶液により洗浄し、その後、塩化物を含み、アルコールを含まない水溶液により洗浄し、酸化ケイ素含有固相から核酸を溶離する。

（２）好ましくは、上記（１）において、上記塩化物が、塩化ナトリウムである。

（３）また、好ましくは、上記（２）において、上記塩化ナトリウムの濃度が、０．２〜１モル／リットルである。

（４）また、好ましくは、上記（１）において、上記塩化物が、塩化カリウムである。

（５）また、好ましくは、上記（４）において、上記塩化カリウムの濃度が、０．２〜１モル／リットルである。

（６）また、好ましくは、上記（１）において、混合液と酸化ケイ素含有固相とを室温中で攪拌し、混合液と酸化ケイ素含有固相とを接触させる。

（７）また、好ましくは、上記（１）において、酸化ケイ素含有固相が、ガラス粒子、酸化ケイ素パウダー、石英濾紙、石英ウール、あるいは、それらの破砕物、ケイソウ土である。

（８）また、好ましくは、上記（１）において、洗浄の際に、酸化ケイ素含有固相から核酸が溶離しない。

（９）また、好ましくは、上記（１）において、酸化ケイ素含有固相が、１〜１００μｍ程度の粒径の粒子である。

本発明によれば、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で、精製度の高い核酸を、収量を低下させずに回収し得る核酸の回収方法を実現することができる。つまり、遺伝子検査、或いは、遺伝子解析に好適な純度の核酸を迅速、且つ、簡便に、危険性のある物質を使用することなく回収することができる。

また、生物試料中に存在する核酸成分を自動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法を実現することができる。

さらに、大腸菌からのプラスミドＤＮＡを自動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法を実現することができる。

（実施形態１）
１モル／リットル塩水溶液を利用した洗浄工程を採用した際の核酸の回収
図１のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの核酸の回収を行った。核酸含有材料としては、市販精製品のｐＢＲ３２２ＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）により希釈した。

この場合、核酸含有材料中で既に核酸は遊離の状態であるため、核酸含有材料から核酸の遊離を促す工程である第１工程はスキップした。なお、この第１の工程において、通常、使用する遊離材料としては、界面活性剤や酵素等がある。また、核酸含有材料から核酸の遊離を促進する手段としては、熱を加える手段や、超音波等を加える手段等がある。

第２工程は、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進する物質とを混合する工程であり、１．５ｍリットル容量の反応容器内で、上記核酸水溶液１００μリットルに対して６モル／リットルＧｕＨＣｌ溶液９００μリットルを添加し攪拌を行った。

第３工程は、混合液と核酸結合性固相とを接触させる工程であり、核酸結合性固相としてガラス粒子を１００ｍｇ添加し、室温中でロータリーミキサーにより、溶液を攪拌する事により固相と液体の接触を行った。

第４工程は、核酸が結合した固相と液体を分離する工程であり、このために、遠心分離器を使用し、１５０００ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄した。

第５工程は、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する工程であり、１モル／リットルの塩水溶液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

第６工程は、核酸が結合した固相から核酸を溶離する工程であり、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。そして、この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出した。

結果を表１に示す。塩化物、酢酸塩を使用することにより洗浄時に効果的に核酸を保持することができる。

以上のように、本発明の実施形態１は、核酸含有材料から核酸の遊離を促すための第１工程と、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進する物質を混合する第２工程と、混合液と核酸結合性固相とを接触させる第３工程と、固相と液体とを分離する第４工程と、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する第５工程と、核酸を固相から溶離する第６工程とを備える。

したがって、本発明の実施形態１によれば、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で、精製度の高い核酸を、収量を低下させずに回収し得る核酸の回収方法を実現することができる。つまり、遺伝子検査、或いは、遺伝子解析に好適な純度の核酸を迅速、且つ、簡便に、危険性のある物質を使用することなく回収することができる。

また、生物試料中に存在する核酸成分を自動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法を実現することができる。

さらに、大腸菌からのプラスミドＤＮＡを自動回収し得る装置に好適な核酸の回収方法を実現することができる。

（実施形態２）
塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムを含む溶液を利用した洗浄工程を採用した際の核酸の回収
図２のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの核酸の回収を行った。なお、この図２のフローチャートにおいて、第１、第２、第３、第４及び第６工程は、図１のフローチャートと同様であり、図１の第５工程が、図２においては、第５ａ工程と第５ｂ工程とに分かれている。

また、この実施形態２においては、実施形態１と同様に、核酸含有材料としては、市販精製品のｐＢＲ３２２ＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）により希釈した。

第１工程から第４工程までは、図１の工程と同様であるので、説明は省略する。

第５ａ工程は、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄し、固相から非核酸成分を洗浄する工程であり、６モル／リットルのＧｕＨＣｌ（塩酸グアニジン）溶液１０００μリットルにより固相を懸濁し、１５０００ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄する操作により、固相の洗浄を行った。

第５ｂ工程は、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄し、固相から核酸の固相への結合を促進する物質を洗浄する工程であって、濃度の異なるＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＯＡｃ、ＫＯＡｃ水溶液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得、この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出した。

結果を図６に示す。ＮａＣｌ、ＫＯＡｃでは５００ｍモル／リットル以上の濃度で５０％以上の回収率となり、Ｋｃｌでは２００ｍモル／リットル以上の濃度で５０％以上の回収率となって、効果的に核酸の回収が行われていることが分かる。

以上のように、本発明の実施形態２においても、上述した実施形態１と同様な効果を得ることができる。

（実施形態３）
酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムを含む溶液を利用した洗浄工程を採用した際の核酸の回収
図３のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの核酸の回収を行った。なお、この図３のフローチャートにおいて、第１、第２、第３、第４、第５ａ及び第６工程は、図２のフローチャートと同様である。したがって、第１工程から第５ａ工程までは、説明は省略する。

第５ｂ工程では、濃度の異なるＫＯＡｃ、ＮａＣｌと４０％エタノール水溶液により固相を懸濁し、上清を廃棄した。第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。第７工程は、アルコールを除去する工程であり、６０℃の加熱、加温によりエタノールを除去し、精製状態の核酸水溶液を得た。

この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出した。

結果を図７に示す。４０％エタノールと組み合わせることにより、１０ｍモル／リットル以上のＫＯＡｃ、或いは、２５ｍモル／リットル以上のＮａＣｌ濃度で効果的に核酸の回収を行うことができる。

以上のように、本発明の実施形態３においても、上述した実施形態１と同様な効果を得ることができる。
（実施形態４）
エタロールと酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム溶液を組み合わせて洗浄工程に利用した際にエタノール濃度が変化したときの核酸の回収
図３のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの核酸の回収を行った。なお、この図３のフローチャートにおいて、第１、第２、第３、第４、第５ａ及び第６工程は、図２のフローチャートと同様である。したがって、第１工程から第５ａ工程までは、その説明は省略する。

第５ｂ工程は、核酸が結合した固相を塩を含む溶液とアルコールとの混合液により洗浄し、固相から核酸の固相への結合を促進する物質を洗浄する工程である。この第５ｂ工程において、２５ｍモル／リットル、或いは５０ｍモル／リットル、或いは、１００ｍモル／リットルのＮａＣｌと濃度の異なるエタノール水溶液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。第７工程は、アルコールを除去する工程であり、６０℃の加温によりエタノールを除去し、精製状態の核酸水溶液を得た。

この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出した。

結果を図８に示す。５０ｍモル／リットル以上のＫＯＡｃ、或いは、１００ｍモル／リットル以上のＮａＣｌとエタノールを組み合わせる事で、エタノール濃度が変動した際の回収率が低下することを効果的に抑制することができる。

以上のように、本発明の実施形態４においても、上述した実施形態１と同様な効果を得ることができる。なお、この実施形態４において、エタノールを使用しているが、２５ｍモル／リットル、或いは５０ｍモル／リットル、或いは、１００ｍモル／リットルのＮａＣｌと濃度の異なるエタノールとの水溶液であるので、従来技術のような問題は生じない。
（実施形態５）
血清へ添加したＤＮＡの回収
図３のフローチャートに従い、血清へ添加した核酸の回収を行った。

ヒトの血清に対し、市販精製品のｐＢＲ３２２ＤＮＡを添加したものを試料とした。核酸は既に遊離状であるが、ヌクレアーゼ対策のために、第１工程でドデシル硫酸ナトリウムを添加した。

第２工程から第５ａ工程までは、実施形態４と同様となるので、説明は省略する。

第５ｂ工程では、５０ｍモル／リットルのＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。第７工程で、６０℃の加温によりエタノールを除去し、精製状態の核酸水溶液を得た。

この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出した。回収率は７０％であり、Ａ２６０／Ａ２８０は１．９０であった。また、第１〜第７行程を処理するための時間は約３０分であった。

この実施形態５においても、上述した実施形態１と同様な効果を得ることができる。なお、この実施形態５において、エタノールを使用しているが、５０ｍモル／リットルのＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液であるので、従来技術のような問題は生じない。

（実施形態６）
培養した遺伝子組換え大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収
図３のフローチャートに従い、培養した遺伝子組換え大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収を行った。大腸菌ＨＢ１０１株に対して、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを遺伝子工学的に組み込んだ大腸菌を試料とした。大腸菌をＬＢ培地１ｍリットル中で、３７℃で一晩培養した物を遠心分離により集菌し、１００μリットルの０．１５モル／リットルのＮａＣｌに懸濁させた物を試料とした。

第１工程では、大腸菌の細胞壁中のペプチドグリカンを破壊するために、５０ｍモル／リットルのグルコース、１０ｍモル／リットルのＥＤＴＡ、２５ｍモル／リットルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に８ｍｇ／ｍリットルとなるようにリゾチームを加えた溶液を添加、混合した。

更に、０．２モル／リットルのＮａＯＨ、１％ＳＤＳ溶液を添加し、核酸を遊離状とした。この溶液に５モル／リットルの酢酸カリウムを添加した。

第２工程では、上記核酸含有水溶液に対して６モル／リットルのＧｕＨＣｌ溶液１０００μリットルを添加し攪拌を行った。

第３工程で、核酸結合性固相としてガラス粒子を１５０ｍｇ添加し、室温中でロータリーミキサーにより、溶液を攪拌する事で固相と液体の接触を行った。

第４工程では、核酸が結合した固相と液体を分離するために、遠心分離器を使用し、１５０００ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄した。

第５ａ工程では、６モル／リットルのＧｕＨＣｌ溶液１０００μリットルにより固相を懸濁し、１５０００ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄する操作により、固相の洗浄を行った。

第５ｂ工程では、５０ｍモル／リットルのＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液により固相を懸濁し、上清を破棄した。

第６工程では、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。第７工程で、６０℃の加温によりエタノールを除去し、精製状態の核酸水溶液を得た。この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色により、核酸の電気泳動バンドを得、同時に流した移動量マーカーから、プラスミドＤＮＡとｒＲＮＡのバンドが確認された。

この状態で、Ａ２６０／Ａ２８０は１．９６であった。また、リオボヌクレアーゼ処理、及び、エタノール沈殿処理後のＡ２６０吸光度からの算出により、得られたプラスミドＤＮＡの収量は４．５μｇであった。また、第１〜第７行程を処理するための時間は約４５分であった。

この実施形態６においても、上述した実施形態１と同様な効果を得ることができる。なお、この実施形態６において、エタノールを使用しているが、５０ｍモル／リットルのＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液であるので、従来技術のような問題は生じない。

（実施形態７）
自動装置である核酸の回収装置による血清へ添加したＤＮＡの回収
図９に本発明の実施形態７である核酸の回収装置（自動装置）の平面レイアウトを示す。

図９において、撹拌装置１０１は、機械制御により円周方向と上下方向への移動が可能で、粒子吸入口１０７と洗浄場所１０８との間を移動することができる。ピペッタＡ１０２とピペッタＢ１０３とは機械制御により円周方向と上下方向への移動が可能で、それぞれ使い捨てチップを設置するためのノズル１１８とノズル１１９とを有する。

反応容器移送機構１０４は、機械制御により反応容器１２０を、Ａ、Ｂ、Ｃの位置へ移送することができ、位置Ｃの両側には永久磁石１２２が反応容器１２０の大きさに合わせて設置されている。精製品収納容器移送機構１０５は機械制御により精製品収納容器１２１を、Ｄ、Ｅの位置へ移送することができる。

図３のフローチャートに従い、図９に示した装置により血清へ添加した核酸の回収を行った。

ヒトの血清に対し、市販精製品のｐＢＲ３２２ＤＮＡを添加したものを試料とし、反応容器１２０に所定量分注し、Ａの位置へ設置した。核酸は既に遊離状であるが、ヌクレアーゼ対策のために、第１工程でＳＤＳを添加した。

第２工程では、反応容器１２０を反応容器移送機構１０４によりＢの位置へ移動し、ピペッタＡ１１８を円周方向の回転によりチップ取り付け位置１０６でノズル１０２にチップに取り付けた後、ピペッタ１１８をＧｕＨＣｌ吸入口１０９へ移動し、核酸水溶液１００μリットルに対して８モル／リットルＧｕＨＣｌ溶液９００μリットルを吸引する。

更に、ピペッタＡ１１８をＢの位置へ移動し、反応容器１２０内へＧｕＨＣｌを吐出し、更に吸引・吐出動作を複数回行い撹拌を行った。その後、ピペットＡ１０２をチップ廃棄位置１１６へ移動し、ノズル１１８からチップを廃棄した。

第３工程では、核酸結合性固相として磁性粒子溶液を使用し、撹拌機構１０１により磁性粒子吸入部１０７から内容物を撹拌し、ピペッタＡ１０２のノズル１１８へチップ取り付け位置１０６で新規に取り付けたチップにより所定の量を吸引する。その後、Ｂの位置へピペットＡ１０２を移動し、反応容器１２０へチップ内容物を吐出し、更に、吸引・吐出を行い撹拌を行った。撹拌機構１０１は洗浄部１０８へ移動し、洗浄を行い、ピペッタＡ１０２はチップ廃棄位置１１６へ移動し、ノズル１１８からチップを廃棄した。

第４工程では、核酸が結合した固相と液体とを分離するために、反応容器移送機構１０４により反応容器１２０をＢの位置からＣの位置へ移動し、永久磁石１２２により反応容器１２０内の磁性粒子を容器側壁に捕捉する。そして、ピペッタＢ１０３を回転によりチップ取り付け位置１１３へ移動し、ノズル１１９へチップを取り付けた後、Ｃの位置へ移動し、反応容器１２０内の液相を吸引する。さらに、溶液廃棄位置１１４へ移動し、チップ内の溶液を廃棄し、チップ廃棄位置１１５へ移動して、ノズル１１９からチップを廃棄した。

第５ａ工程では、反応容器移送機構１０４により反応容器１２０をＣからＢの位置へ移動し、ピペットＡ１０２をチップ取り付け位置１０６へ移動し、ノズル１１８へチップを取り付ける。その後、ＧｕＨＣｌ吸入口１１１へ移動し、所定の量を吸引した後、Ｂの位置へ移動し、反応容器１２０内へＧｕＨＣｌを吐出する。この吸引・吐出動作により撹拌した後、チップ廃棄位置１１６へ移動し、ノズル１１８からチップを廃棄した。

さらに、反応容器移送機構１０４により反応容器１２０をＢからＣの位置へ移動し、永久磁石１２２により反応容器１２０内の磁性粒子を容器側壁に捕捉する。そして、ピペッタＢ１０３を回転によりチップ取り付け位置１１３へ移動し、ノズル１１９へチップを取り付けた後に、Ｃの位置へ移動し、反応容器１２０内の液相を吸引する。次に、溶液廃棄位置１１４へ移動し、チップ内の溶液を廃棄し、更に、チップ廃棄位置１１５へ移動して、ノズル１１９からチップを廃棄した。

第５ｂ工程では、反応容器移送機構１０４により反応容器１２０をＣからＢの位置へ移動する。次に、ピペットＡ１０２をチップ取り付け位置１０６へ移動し、ノズル１１８へチップを取り付けた後、５０ｍモル／リットルＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液吸入口１１０へ移動し、所定の量を吸引する。その後、Ｂの位置へ移動し、反応容器１２０内へ５０ｍモル／リットルＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液を吐出し、吸引・吐出動作により撹拌した後、チップ廃棄位置１１６へ移動し、ノズル１１８からチップを廃棄した。

さらに、反応容器移送機構１０４により反応容器１２０をＢからＣの位置へ移動し、永久磁石１２２により反応容器１２０内の磁性粒子を容器側壁に捕捉する。次に、ピペッタＢ１０３を回転によりチップ取り付け位置１１３へ移動し、ノズル１１９へチップを取り付けた後、Ｃの位置へ移動し、反応容器１２０内の液相を吸引し、溶液廃棄位置１１４へ移動しチップ内の溶液を廃棄する。さらに、チップ廃棄位置１１５へ移動し、ノズル１１９からチップを廃棄した。この工程を、さらに所定の回数繰り返した。

第６工程では、反応容器移送機構１０４により反応容器１２０をＣからＢの位置へ移動し、ピペットＡ１０２をチップ取り付け位置１０６へ移動し、ノズル１１８へチップを取り付けた後、６０°Ｃ加温ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）吸引口１０９へ移動し、所定の量を吸引した後、Ｂの位置へ移動する。そして、反応容器１２０内へ６０°Ｃに加温したＴＥ緩衝液を吐出し、吸引・吐出動作により撹拌した後、チップ廃棄位置１１６へ移動し、ノズル１１８からチップを廃棄した。

さらに、反応容器移送機構１０４により反応容器１２０をＢからＣの位置へ移動し、永久磁石１２２により反応容器１２０内の磁性粒子を容器側壁に捕捉し、ピペッタＢ１０３を回転によりチップ取り付け位置１１３へ移動する。次に、ノズル１１９へチップを取り付けた後、Ｃの位置へ移動し、反応容器１２０内の液相を吸引した後、位置Ｄへ移動する。そして、精製品収納容器１２１へ溶液を吐出し、さらに、この工程を所定の回数だけ繰り返した。

第７工程で、精製品収納容器移送機構１０５により精製品収納容器１２１を６０°Ｃのヒートブロック１１２上の位置Ｅへ移動し、所定の時間加熱し、精製状態の核酸水溶液を得た。

この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後に、各バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、第１工程での核酸量に基づき、回収率を算出した。その結果、回収率は６５％であった。また、第１〜第７工程を処理するための時間は、約３０分であった。
以上のように、本発明の実施形態７によれば、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で精製度の高い核酸を収量を低下させずに回収する核酸の回収装置を実現することができる。なお、この実施形態７において、エタノールを使用しているが、５０ｍモル／リットルＫＯＡｃを含む５０％エタノール水溶液であるので、従来技術のような問題は生じない。

次に、本発明と従来技術とを比較するための比較例について説明する。

（比較例）
従来例と同様に、エタノール水溶液のみによる洗浄工程を使用した際の核酸の回収
図４のフローチャートに従い、核酸を含む水溶液からの核酸の回収を行った。核酸含有材料としては、市販精製品のｐＢＲ３２２ＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）により希釈した。

この場合、核酸含有材料中で既に核酸は遊離の状態であるため、核酸含有材料から核酸の遊離を促す工程である第１工程はスキップした。第２工程は、遊離した核酸と核酸の固相への結合を促進する物質とを混合する工程であって、１．５ｍリットル容量の反応容器内で、核酸水溶液１００μリットルに対して６モル／リットルＧｕＨＣｌ溶液９００μリットルを添加し攪拌を行った。

第３工程は、混合液と核酸結合性固相とを接触する工程であり、核酸結合性固相としてガラス粒子を１００ｍｇ添加し、室温中でロータリーミキサーにより、溶液を攪拌する事により固相と液体の接触を行った。

第４工程は、核酸が結合した固相と液体とを分離する工程であって、核酸が結合した固相と液体とを分離するために、遠心分離器を使用し、１５０００ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄した。

第５工程は、核酸が結合した固相をエタノール水溶液により洗浄する工程であって、濃度の異なる各種エタノール水溶液により固相を懸濁し、１５０００ｇ、１分の遠心により固相の沈殿を得、上清を破棄する操作により、固相の洗浄を行った。

第６工程は、核酸が結合した固相から核酸を遊離する工程であって、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を固相へ添加し、６０℃、１分の加温により溶離を行い、１５０００ｇ、１分の遠心により上清を得た。そして、この一部分を試料とし、０．８％アガロースゲルを支持体として電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色を行った。その後、各バンドの強度をデンシトグラフにより数値化し、第１工程での核酸量に基づき回収率を算出した。

結果を図５に示す。エタノール濃度８０％付近を境に回収率が低下する事が確認された。つまり、エタノール濃度８０％で、核酸の回収率は最も高い率となるが、高濃度のエタノールを使用しなければならず、上述したように、７０％以上のエタノールは揮発性であるため自動装置上に実装した際には、気密性の高い容器と蓋の開閉機構、或いは／及び、揮発を防ぐための冷却機構が必要とされ、装置構成が複雑となってしまう。

これに対して、上述した本発明の実施形態１〜７は、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で、精製度の高い核酸の収量を低下させずに回収し得る核酸の回収方法及び装置を実現することができる。
なお、本発明は、核酸を含有する材料であれば適応可能であるが、特に、全血、血清、喀痰、尿等の臨床検体、或いは、培養細胞、培養細菌等の生物学的な試料、或いは、電気泳動後のゲルに保持された状態の核酸、等が好適である。

また、本発明の方法は、ＤＮＡ増幅酵素等の反応産物や素精製状態の核酸を含む材料に対しても有効である。なお、ここでいう核酸は、２本鎖、１本鎖、或いは、部分的に２本鎖、もしくは、１本鎖構造を採るＤＮＡ、或いは、ＲＮＡである。

また、本発明の第１工程における、核酸含有材料から核酸の遊離を促すための方法は、乳鉢、超音波、マイクロウエーブなどによる物理的な方法、或いは、界面活性剤、変性剤などによる化学的な方法、或いは、タンパク質分解酵素などによる生化学的な方法、及び、それらを組み合わせた方法などが使用できる。

また、本発明の第２工程における、核酸の固相への結合を促進する物質としては、ＮａＩ（ヨウ化ナトリウム）、ＫＩ（ヨウ化カリウム）、ＮａＣｌＯ４、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＧｕＳＣＮ（チオシアン酸グアニジン）、などのカオトロピック剤が好適だが、これらの物質は核酸が吸収を持つ２６０ｎｍ付近にピークの裾野がかかるため、万が一、精製核酸溶液中に混入した際には、一般的に利用される、分光光度計を利用した核酸の純度や量の検定結果に対して悪影響を与える可能性がある。

また、チオシアン酸を含むＮａＳＣＮ、ＧｕＳＣＮは、酸と反応することにより致死性のＨＣＮ（シアン化水素）を発生するため、廃液の取り扱いに注意が要求される。

そのため、本発明においては、核酸の固相への結合を促進する物質としては、ＧｕＨＣｌ（塩酸グアニジン）の使用が望ましい。ＧｕＨＣｌは容易に入手可能で、且つ、上記カオトロピック剤に比し２６０ｎｍの吸光度への悪影響は著しく低い。また、致死性のガスを発生させる潜在的な危険性がない。

また、本発明においては、特異的に核酸成分を固相へ結合させるために、ＧｕＨＣｌの最終濃度を、４〜６モル／リットルとするのが望ましい。

本発明の第３工程における、核酸結合性固相は、ガラス粒子、シリカパウダー、石英濾紙、石英ウール、あるいは、それらの破砕物、ケイソウ土など、酸化ケイ素を含有する物質であれば使用することができるが、核酸とカオトロピック剤の混合液中で、核酸と固相の接触確率を高める事により、結合効率の向上、或いは、結合時間の短縮が可能であるため、粒径の小さい粒子の使用が望ましい。

本発明においては１〜１００μｍ程度の粒径が好適であった。また、核酸と固相の接触確率を高めるために、使用する粒子の比重に応じて、攪拌操作を行うことが望ましい。

また、本発明の第４工程における、固相と液体を分離する手段としては、遠心分離や濾過により分離可能であるが、自動化、及び、装置化に際しては、抗原抗体反応を利用した免疫分析装置で一般的に使用される、既知のＢ／Ｆ（ｂｏｎｄ ｆｏｒｍ／ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）分離技術を応用することができる。

また、本発明の第５工程における、核酸が結合した固相を塩を含む溶液により洗浄する手段は、第４工程終了後の固相に対して、核酸の固相への結合を保持しつつ、固相を洗浄するための塩を含む溶液を混合し、第４工程と同様、固相と液体の分離をすることにより洗浄を行うことができる。

また、第５工程は、固相に対して非特異的に結合している非核酸成分を固相から分離するための第５ａ工程、及び、固相から核酸の固相への結合を促進する物質を洗浄する第５ｂ工程に分割される。この際に、第５ａ、第５ｂ工程で固相の洗浄のために使用する液体は、固相に結合した核酸を溶離させないことが重要であり、これは最終的に得られる核酸の収率に影響を及ぼす。

また、本発明は、７５％以上の濃度のエタノールは、洗浄用の液体として使用用しないが、第５ａ工程で使用する洗浄用の液体としては、第４工程と同様に、ＧｕＨＣｌが好適である。これは、ＧｕＨＣｌが変性剤作用を持つためで、４〜６モル／リットルの濃度での使用により固相から非特異吸着物質を除去することが出来る。

また、第５ｂ工程で使用する洗浄用の液体としては、溶離した後の核酸の使用に対して悪影響を与えない塩で、且つ、中程度の濃度の水溶液を調製できるものが好適である。これは、固相の表面上で非溶液状となった核酸が、塩濃度が高い水溶液に対して溶けにくくなる性質を利用したものであり、例えば、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）を５００ｍＭ以上の濃度で使用することが望ましい。或いは、第５ｂ工程に塩を含む水溶液とアルコールとの混合液を使用することもできる。

この場合には、塩を単独で使用する場合よりも、更に、低い濃度にすることが可能であり、また、アルコール成分の揮発によるアルコール濃度変化に対しても寛容性を持つ。本発明においては、５０ｍモル／リットル以上のＮａＣｌを含む５０％エタノール水溶液の使用が有効であった。

また、第５ｂ工程において、アルコールを含む溶液を使用する際には、第６工程の後に、精製した核酸溶液中に混入する恐れのある微量のアルコール成分を除去するための第７工程を追加することが必要となる。この第７工程は、溶液の加温などにより達成することが出来る。

本発明の第６工程における、核酸を固相から溶離する手段は、洗浄後の固相に対して固相の体積以上の低塩濃度の水溶液、或いは、水を混合することにより達成される。この操作により核酸は固相から水相へと移行するため、第４工程と同様に固相と液体を分離することで精製状態の核酸水溶液が得られる。

本発明において使用される、低塩濃度の水溶液、或いは、水は滅菌状態であることが好適で、或いは、必要に応じて、ＤＥＰＣ処理を行った物の使用が望まれる。

また、ここで使用される、低塩濃度の水溶液、或いは、水は、得られる核酸の収率を高めるために、５５〜６０℃に加温した状態で使用することが望ましいが、溶離を行う際に使用する容器を同様の温度に加温した場合でも同様の効果が得られる。

また、本発明において、核酸の収率を高めるためには、第６工程を少なくとも２回行うことが望ましい。

また、第５工程の洗浄は、酢酸塩又は塩化物を含む洗浄液により行うが、酢酸塩は、０．５モル／リットル以上の濃度を有する酢酸カリウム水溶液とすることができる。また、上記塩化物は、０．５モル／リットル以上の濃度を有する塩化ナトリウム、又は、０．２モル／リットル以上の濃度を有する塩化カリウムとすることができる。

また、第５ｂ工程で、洗浄するための溶液は、４０％エタノールと１０ｍモル／リットル以上の酢酸カリウムとを含む溶液とすることができる。

また、第５ｂ工程で、洗浄するための溶液は、４０％エタノールと２５ｍモル／リットル以上の塩化ナトリウムとを含む溶液とすることができる。

また、第３工程で使用する核酸結合性固相は、二酸化ケイ素を含有する物質とすることができる。

本発明の実施形態１における核酸の回収を行うための動作フローチャートである。 本発明の実施形態２における塩化ナトリウム等を含む溶液による洗浄工程を含む核酸の回収を行うための動作フローチャートである。 本発明の実施形態３、４、５、６における洗浄工程を含む核酸の回収を行うための動作フローチャートである。 従来技術の核酸の回収方法であり、エタノール水溶液のみによる洗浄工程を含む核酸の回収を行うための動作フローチャートである。 従来技術におけるエタノールによる洗浄工程の結果を表すグラフである。 本発明の実施形態２による洗浄工程の結果を表すグラフである。 本発明の実施形態３による洗浄工程の結果を表すグラフである。 本発明の実施形態４による洗浄工程の結果を表すグラフである。 本発明の実施形態７である核酸の回収装置の平面レイアウト図である。

符号の説明

１０１ 撹拌装置
１０２、１０３ ピペッタ
１０４ 反応容器移送機構
１０５ 精製品収納容器移送機構
１０６、１１３ チップ取り付け位置
１０７ 磁性粒子吸入部
１０８ 洗浄場所
１０９、１１１ ＧｕＨＣｌ吸入口
１１０ ５０％エタノール水溶液吸入口
１１２ ヒートブロック
１１４ 溶液廃棄位置
１１５、１１６ チップ廃棄位置
１１８、１１９ ノズル
１２０ 反応容器
１２１ 精製品収納容器
１２２ 永久磁石

Claims (9)

1. 核酸含有材料からの核酸回収方法であって、
   カオトロピック物質と核酸含有材料とを含む混合液と、酸化ケイ素含有固相とを接触させ、
   酸化ケイ素含有固相と混合液とを分離し、
   酸化ケイ素含有固相を、カオトロピック物質を含む溶液により洗浄し、その後、塩化物を含み、アルコールを含まない水溶液により洗浄し、
   酸化ケイ素含有固相から核酸を溶離することを特徴とする核酸回収方法。
2. 請求項１記載の核酸回収方法において、上記塩化物が、塩化ナトリウムであることを特徴とする核酸回収方法。
3. 請求項２記載の核酸回収方法において、上記塩化ナトリウムの濃度が、０．２〜１モル／リットルであることを特徴とする核酸回収方法。
4. 請求項１記載の核酸回収方法において、上記塩化物が、塩化カリウムであることを特徴とする核酸回収方法。
5. 請求項４記載の核酸回収方法において、上記塩化カリウムの濃度が、０．２〜１モル／リットルであることを特徴とする核酸回収方法。
6. 請求項１記載の核酸回収方法であって、混合液と酸化ケイ素含有固相とを室温中で攪拌し、混合液と酸化ケイ素含有固相とを接触させることを特徴とする核酸回収方法。
7. 請求項１記載の核酸回収方法であって、酸化ケイ素含有固相が、ガラス粒子、酸化ケイ素パウダー、石英濾紙、石英ウール、あるいは、それらの破砕物、ケイソウ土であることを特徴とする核酸回収方法。
8. 請求項１記載の核酸回収方法であって、洗浄の際に、酸化ケイ素含有固相から核酸が溶離しないことを特徴とする核酸回収方法。
9. 請求項１記載の核酸回収方法であって、酸化ケイ素含有固相が、１〜１００μｍ程度の粒径の粒子であることを特徴とする核酸回収方法。

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