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Description

＜分野＞
本発明は、新規に同定した核酸、それらによってコードされるポリペプチド、ならびにその産生および使用に関する。より詳細には、本発明の核酸およびポリペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ：G-protein coupled receptor）（以後、「ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ」と呼ぶ）およびＧＰＣＲのプリノセプターファミリー（purinoceptor family）のメンバーに関する。本発明はまた、このような核酸およびポリペプチドの作用の阻害または活性化に関する。
＜背景＞
多くの医学的に有意な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および／またはセカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ）に関与するシグナル伝達経路に関連するタンパク質によって媒介されることが十分に確立されている（Lefkowitz、Nature、1991、351:353-354）。これらのタンパク質は、経路でＧタンパク質と関連するタンパク質（proteins participating in pathways with G-proteins）または「ＰＰＧタンパク質」として言及される。これらのタンパク質のいくつかの例には、アドレナリン作動薬およびドーパミン用の受容体などのＧＰＣ受容体（Kobilka、B.K.ら、Proc.Natl Acad.Sci.、USA、1987、84:46-50;Kobilka B.K.ら、Science、1987、238:650-656;Bunzow、J.R.ら、Nature、1988、336:783-787）、Ｇタンパク質自体、エフェクタータンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、およびアクチュエータータンパク質（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）（Simon、M.I.ら、Science、1991、252:802-8）が含まれる。
例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモン結合の効果として、細胞内の酵素アデニレートシクラーゼが活性化する。ホルモンによる酵素活性化は、ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存する。ＧＴＰはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質は、ホルモン受容体をアデニレートシクラーゼに連結させる。Ｇタンパク質は、ホルモン受容体によって活性化された場合にＧＴＰを結合ＧＤＰに交換することが示される。次いで、ＧＴＰ輸送形態は活性化アデニレートシクラーゼに結合する。Ｇタンパク自体によって触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解により、Ｇタンパク質はその基底の不活性形態に戻る。したがって、Ｇタンパク質は、受容体からエフェクターへシグナルを中継する中間体として、およびシグナルの持続を調節するクロックとしての二重の役割を果たす。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定膜貫通ドメインを有すると特徴付けられている。ドメインは、細胞外または細胞質ループによって連結された膜貫通αヘリックスを示すと考えられている。Ｇタンパク質共役受容体には、ホルモン、ウイルス、成長因子、および神経受容体などの広範な生物学的に活性な受容体が含まれる。
Ｇタンパク質共役受容体（７ＴＭ受容体としても公知）は、少なくとも８個の分岐した親水性ループに連結した約２０〜３０個のアミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性ストレッチを含むことで特徴付けられている。共役受容体のＧタンパク質ファミリーには、精神障害および神経障害の治療に使用される神経弛緩薬に結合するドーパミン受容体が含まれる。このファミリーメンバーの他の例には、カルシトニン、アドレナリン作動薬、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン性受容体、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子１、ロドプシン、臭気物質、およびサイトメガロウイルスの受容体が含まれるが、これらに限定されない。
ほとんどのＧタンパク質共役受容体は、機能タンパク質の構造を安定化すると考えられるジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ループ中のそれぞれに１つの保存されたシステイン残基を有する。７回膜貫通領域（transmembrane regions）をＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と呼ぶ。ＴＭ３は、シグナル伝達に関与している。
システイン残基のリン酸化および脂質付加（パルミチル化またはファルネシル化）は、いくつかのＧタンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を与え得る。ほとんどのＧタンパク質共役受容体は、第３の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内に潜在的なリン酸化部位を含む。β−アドレナリン作動性受容体などのいくつかのＧタンパク質共役受容体について、プロテインキナーゼＡおよび／または特定の受容体キナーゼによるリン酸化は、受容体の脱感作を媒介する。いくつかの受容体について、Ｇタンパク質共役受容体のリガンド結合部位は、いくつかのＧタンパク質共役受容体膜貫通ドメインによって形成された疎水性ソケットを含むと考えられ、このソケットは、Ｇタンパク質共役受容体の疎水性残基に取り囲まれている。各Ｇタンパク質共役受容体膜貫通ヘリックスの親水性部位は、内部に面して極性リガンド結合部位を形成すると考えられる。ＴＭ３は、ＴＭ３アスパラギン酸残基などのリガンド結合部位を有するものとしていくつかのＧタンパク質共役受容体に関与する。ＴＭ５セリン、ＴＭ６アスパラギン、およびＴＭ６またはＴＭ７フェニルアラニンまたはチロシンは、リガンド結合にも関与する。
Ｇタンパク質共役受容体を、ヘテロ三量体Ｇタンパク質によって、種々の細胞内酵素、イオンチャネル、および輸送体に細胞内で結合させることができる（Johnsonら、Endoc.Rev.、1989、10:317-331を参照のこと）。異なるＧタンパク質αサブユニットは、細胞内の種々の生体機能を調整するように特定のエフェクターを刺激することが好ましい。Ｇタンパク質共役受容体の細胞質残基のリン酸化は、いくつかのＧタンパク質共役受容体のＧタンパク質結合の制御のための重要な機構として同定されている。Ｇタンパク質共役受容体は、哺乳動物宿主内の多数の部位で見出されている。過去１５年間にわたり、７回膜貫通（７ＴＭ）受容体を標的化する約３５０種の治療薬が、首尾よく市場に導入されている。
したがって、Ｇタンパク質共役受容体は、治療標的として確立され、証明された歴史を有する。細菌、真菌、原生動物、およびウイルス感染などの感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）；痛み；癌；糖尿病；肥満症；食欲不振；過食症；喘息；パーキンソン病；血栓症；急性心不全；低血圧症；高血圧症；勃起機能障害；尿閉；骨粗鬆症および大理石骨病などの代謝性骨疾患；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；慢性関節リウマチ；炎症性腸疾患；過敏性腸症候群；良性前立腺肥大；不安、神経分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆、重症精神沈滞を含む精神および神経障害；ならびにハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群などのジスキネジーが含まれるが、これらに限定されない機能障害または疾患の予防、緩和、または治療で役割を果たすことができるさらなる受容体の同定および特徴付けが必要であることは明白である。
＜要約＞
本発明の第１の態様によれば、本発明者らは、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体を含むＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドを提供する。
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドをコードすることができる核酸を提供する。好ましくは、核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号１０に示す核酸配列、またはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体を含む。
本発明者らは、本発明の第３の態様によれば、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドのフラグメントを含むポリペプチドを提供する。
好ましくは、ポリペプチドを含むこのようなフラグメントは、配列番号３と配列番号５との間でホモロガス（homologous）な１つまたは複数の領域を含むか、配列番号３と配列番号５との間でヘテロロガス（heterologous）な１つまたは複数の領域を含む。
本発明の第４の態様として、本発明の第３の態様によるポリペプチドをコードすることができる核酸を提供する。
本発明者らは、本発明の第５の態様によれば、本発明の第２または第４に記載の態様による核酸を含むベクターを提供する。
本発明は、第６の態様では、本発明の第２もしくは第４の態様による核酸、または本発明の第５の態様によるベクターを有する宿主細胞を提供する。
本発明の第７の態様では、本発明の第２もしくは第４の態様による核酸、または本発明の第５の態様に記載のベクターを有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物はマウスである。
本発明の第８の態様によれば、本発明者らは、Ｇタンパク質共役受容体と特異的に相互作用することができる化合物を同定する方法における、本発明の第１または第３の態様によるポリペプチドの使用を提供する。
本発明者らは、本発明の第９の態様によれば、Ｇタンパク質共役受容体と特異的に相互作用することができる化合物を同定する方法における、本発明の第７の態様に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用を提供する。
本発明の第１０の態様では、ＢＡＣＨ受容体を発現する細胞に候補化合物を接触させるステップと、前記接触の結果として細胞中のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルが低下するかどうかを決定するステップとを含む、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲのアンタゴニストを同定する方法を提供する。
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを発現する細胞に候補化合物を接触させるステップと、前記接触の結果として前記細胞中のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルが低下するかどうかを決定するステップとを含む、細胞中のサイクリックＡＭＰの内因性レベルを低下することができる化合物の同定方法を提供する。
本発明の第１２の態様によれば、本発明者らは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドに候補化合物を接触させるステップと、前記候補化合物が前記ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドに結合するかどうかを決定するステップとを含む、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドに結合することができる化合物の同定方法を提供する。
本発明者らは、本発明の第１３の態様によれば、本発明の第８〜第１２の態様のいずれかに記載の方法によって同定された化合物を提供する。
本発明の第１４の態様によれば、本発明者らは、本発明の第１または第３の態様に記載のポリペプチドと特異的に結合することができる化合物を提供する。
本発明の第１５の態様によれば、抗体を産生する方法における、本発明の第１もしくは第３の態様に記載のポリペプチドまたはその一部；または本発明の第２もしくは第４の態様に記載の核酸またはその一部の使用を提供する。
本発明者らは、本発明の第１６の態様によれば、本発明の第１もしくは第３の態様に記載のポリペプチドまたはその一部；または本発明の第２もしくは第４の態様に記載の核酸またはその一部に特異的に結合することができる抗体を提供する。
本発明の第１７の態様として、本発明の第１もしくは第３の態様に記載のポリペプチドまたはその一部；本発明の第２もしくは第４の態様に記載の核酸またはその一部によってコードされるポリペプチド；本発明の第５の態様に記載のベクター；本発明の第６の態様に記載の細胞；本発明の第１３または第１４の態様に記載の化合物；および本発明の第１６の態様に記載の抗体の任意の１つまたは複数を薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と共に含む医薬組成物を提供する。
本発明者らは、本発明の第１８の態様によれば、本発明の第１もしくは第３の態様に記載のポリペプチドまたはその一部；本発明の第２もしくは第４の態様に記載の核酸またはその一部によってコードされるポリペプチド；本発明の第５の態様に記載のベクター；本発明の第６の態様に記載の細胞；本発明の第１３または第１４の態様に記載の化合物；および本発明の第１６の態様に記載の抗体の任意の１つまたは複数を含むワクチン組成物を提供する。
本発明の第１９の態様によれば、本発明者らは、本発明の第１もしくは第３の態様に記載のポリペプチドまたはその一部；本発明の第２もしくは第４の態様に記載の核酸またはその一部によってコードされるポリペプチド；本発明の第５の態様に記載のベクター；本発明の第６の態様に記載の細胞；本発明の第１３または第１４の態様に記載の化合物；および本発明の第１６の態様に記載の抗体の任意の１つまたは複数を含む疾患または疾患に対する感受性の診断キットを提供する。
本発明者らは、本発明の第２０の態様によれば、患者にＢＡＣＨ ＧＰＣＲのアンタゴニストを投与するステップを含む、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ活性の上昇に関連する疾患を罹患した患者の治療方法を提供する。
本発明の第２１の態様によれば、患者にＢＡＣＨ ＧＰＣＲのアゴニストを投与するステップを含む、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ活性の減少に関連する疾患を罹患した患者の治療方法を提供する。
好ましくは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲは、配列番号３または配列番号５に示す配列を有するポリペプチドを含む。
本発明の第２２の態様によれば、本発明者らは、本発明の第１もしくは第３の態様に記載のポリペプチドまたはその一部；本発明の第２もしくは第４の態様に記載の核酸またはその一部によってコードされるポリペプチド；本発明の第５の態様に記載のベクター；本発明の第６の態様に記載の細胞；本発明の第１３または第１４の態様に記載の化合物；本発明の第１６の態様に記載の抗体；本発明の第１７の態様に記載の医薬組成物；および本発明の第１８の態様、主題に記載のワクチンの任意の１つまたは複数を患者に投与するステップを含む、患者の疾患を治療および／または予防する方法を提供する。
本発明の第２３の態様によれば、本発明の第１もしくは第３の態様に記載のポリペプチドまたはその一部；本発明の第２もしくは第４の態様に記載の核酸またはその一部によってコードされるポリペプチド；本発明の第５の態様に記載のベクター；本発明の第６の態様に記載の細胞；本発明の第１３または第１４の態様に記載の化合物；および本発明の第１６の態様に記載の抗体を含む、疾患の治療方法または予防方法において使用される薬剤を提供する。
本発明の第２４の態様によれば、本発明者らは、本発明の第１もしくは第３の態様に記載のポリペプチドまたはその一部；本発明の第２もしくは第４の態様に記載の核酸またはその一部によってコードされるポリペプチド；本発明の第５の態様に記載のベクター；本発明の第６の態様に記載の細胞；本発明の第１３または第１４の態様に記載の化合物；および本発明の第１６の態様に記載の抗体の、疾患の治療または予防用の医薬組成物を調製するための使用を提供する。
本発明の第２５の態様として、変化したＢＡＣＨ遺伝子を含むことを特徴とする、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。好ましくは、この変化は、ＢＡＣＨの欠失、機能喪失を招くＢＡＣＨの変異、標的化された変異またはランダムな変異を有するヌクレオチド配列を有する外因性遺伝子のＢＡＣＨへの移入、別の種由来の外因性遺伝子のＢＡＣＨへの移入、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
本発明者らは、本発明の第２６の態様によれば、異種ＢＡＣＨタンパク質をコードする導入遺伝子をゲノム中に含み、発現する、外因性ＢＡＣＨ遺伝子の機能が破壊された非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
本発明は、第２７の態様では、（ａ）非相同性置換部分と、（ｂ）前記非相同性置換部分の上流に存在する第１の相同領域であって、前記第１の相同領域は第１のＢＡＣＨ遺伝子配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する第１の相同領域と、（ｃ）前記非相同性置換部分の下流に存在する第２の相同領域であって、前記第２の相同領域は第２のＢＡＣＨ遺伝子配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、前記第２のＢＡＣＨ遺伝子配列が天然に存在する内因性ＢＡＣＨ遺伝子中の前記第１のＢＡＣＨ遺伝子配列の下流に存在する第２の相同領域とを含む、宿主細胞中のＢＡＣＨ遺伝子の機能を破壊するための核酸構築物を提供する。
本発明の第２８の態様によれば、本発明者らは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸が発現する条件下で本発明の第６の態様に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドを産生するプロセスを提供する。
本発明の第２９の態様によれば、サンプル中における本発明の第２または第４の態様に記載の核酸の存在を検出する方法であって、前記サンプルに、前記核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブを接触させるステップと、前記核酸の存在について前記サンプルをモニタリングするステップとを含む方法を提供する。
本発明者らは、本発明の第３０の態様によれば、サンプルに本発明の第１６の態様に記載の抗体を接触させるステップと、前記ポリペプチドの存在について前記サンプルをモニタリングするステップとを含む、サンプル中の本発明の第１または第３の態様に記載のポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。
本発明の第３１の態様として、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ発現の増加、減少、もしくは異常により引き起こされる、またはこれらに関連する疾患もしくは症候群の診断方法であって、前記方法が、（ａ）このような疾患を罹患している動物、または罹患している疑いがある動物におけるＢＡＣＨ ＧＰＣＲの発現レベルまたはパターンを検出するステップと、（ｂ）前記発現レベルまたはパターンと正常な動物における発現レベルまたはパターンを比較するステップとを含む方法を提供する。
１つの実施形態では、疾患は、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用（nerve transaction）、または外傷（trauma）のいずれかに起因する）、神経圧迫症（nerve compression）（腫瘍、拘扼（entrapment）、または打撲（crush）のいずれかによる）、および脊髄または脳の損傷による痛みからなる群から選択される。
別の実施形態では、疾患は、例えば、脳卒中（stroke）、外傷、変性（degeneration）または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムスからなる群から選択される。
さらなる実施形態では、疾患は、眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症（hypercholesterolaemia）、異常脂質血症（dislipdaemias）、および肥満症からなる群から選択される。
本発明のこれらおよび他の実施形態を、以下にさらに詳述する。
（配列表）
配列番号１は、ヒトＢＡＣＨのｃＤＮＡ配列を示す。配列番号２は、配列番号１由来のオープンリーディングフレームを示す。配列番号３は、ヒトＢＡＣＨのアミノ酸配列を示す。配列番号４は、マウスＢＡＣＨのｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを示す。配列番号５は、マウスＢＡＣＨのアミノ酸配列を示す。配列番号６は、発現構築物を産生するためにｐＴＯＰＯ−Ｅｃｈｏドナーベクターにクローン化されたＢＡＣＨフラグメントの核酸配列を示す。発現構築物により、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが産生される。配列番号８は、発現構築物を産生するためにｐｃＤＮＡ３．１Ａ Ｍｙｃ／Ｈｉｓベクターにクローン化されたＢＡＣＨフラグメントの核酸配列を示す。発現構築物により、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが産生される。
マウスＢＡＣＨのゲノム配列を、「ＢＡＣＨゲノム配列」（配列番号１０）というタイトルで示す。以下および実施例に記載のように、このような配列を使用して、ＢＡＣＨノックアウトマウスを調製することができる。
＜詳細な説明＞
〔ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ〕
本発明者らの発明は、一般に、新規のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、特に、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲと呼ばれるオーファンプリノセプター型Ｇタンパク質共役受容体、ならびにそのホモログ、変異型、または誘導体に関する。
ヒトＢＡＣＨをコードする増幅ｃＤＮＡ産物を配列決定した結果によって示されるように、ＢＡＣＨは、構造的にＧタンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク質に関連する。配列番号１のｃＤＮＡ配列は、配列番号３に示す３７２アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２、ヌクレオチド番号２３〜８００）を含む。ヒトＢＡＣＨは、ホモサピエンス染色体１２ｐ１３．３にマッピングすることが見出された。
（ＢＡＣＨとの同一性および類似性）
ＢＡＣＨのアミノ酸配列は、ヒトP2Y PURINOCEPTOR 9（P2Y9）（アクセッション番号U90322.1、Bohm,S.K.、Khitin,L.M.、Payan,D.P.and Bunnett,N.W.、Direct Submission 21-FEB-1997；関連アクセッション番号：NP_005287.1、AAC51301、U66578、AAB62087、U90323、およびAAB62088）を有する３０９個のアミノ酸残基中、約３５％が同一であり、５７％が類似している（BLASTを使用）。
ＢＡＣＨのヌクレオチド配列（配列番号１）は、（Ottenwaelderらによって2000年2月29日にGenbankに提出されたアクセッション番号AL042117）由来の匿名のホモサピエンスＥＳＴ精巣ｃＤＮＡを有する６７２個のヌクレオチド残基中、約９９％が同一である（BLASTを使用）。さらに、ＢＡＣＨ（配列番号１）は、匿名のホモサピエンスＥＳＴ胚中心Ｂ細胞ｃＤＮＡクローン（アクセッション番号AA769338 NCI-CGAP NO:1）の４２０個のヌクレオチド残基中、約９９％が同一であり、匿名ホモサピエンスＥＳＴ Ｂ細胞慢性リンパ性白血病ｃＤＮＡクローン（アクセッション番号AI492234 NCI-CGAP e BACHポリペプチド（配列番号３））の１５９個のヌクレオチド中、約９８％が同一であり、ｐｆａｍのＨＭＭ構造推定ソフトウェア（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml）を使用することで、ＢＡＣＨペプチドが７ＴＭ−１構造クラスのＧＰＣＲであることが確認される（図１を参照のこと）。
ヒトＢＡＣＨ ＧＰＣＲのマウスホモログがクローン化された。その核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４および配列番号５に示す。配列番号４のマウスＢＡＣＨ ＧＰＣＲ ｃＤＮＡは、ヒトＢＡＣＨ ＧＰＣＲ（配列番号２）と８４％同一を示し、マウスＢＡＣＨ ＧＰＣＲのアミノ酸配列（配列番号５）は、ヒトＢＡＣＨ ＧＰＣＲ（配列番号３）と８０％同一を示し、８５％類似している。マウスＢＡＣＨのゲノム配列もまた開示する（配列番号１０）。
したがって、ヒトおよびマウスＢＡＣＨ ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の大きなファミリーメンバーである。
（ＢＡＣＨの発現プロフィール）
ＢＡＣＨ ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、ヒト脾臓、心臓、脳、および肝臓におけるＢＡＣＨの発現の変化が検出される。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲの発現プロフィールを、図２に示す。ＢＬＡＳＴＮによるヒトＥＳＴデータソースを検索するために配列番号１のＢＡＣＨ ｃＤＮＡを使用することで、慢性リンパ急性白血病（アクセッション番号ＡＩ４９２２３４）、胚中心Ｂ細胞（アクセッション番号ＡＡ７６９３３８）、および精巣（アクセッション番号ＡＬ０４２１１７）を起源とするライブラリー由来のｃＤＮＡ中に同一性が見出される。これは、ＢＡＣＨがこれらの正常または異常な組織中で発現することを示す。したがって、ＢＡＣＨポリペプチド、核酸、プローブ、抗体、発現ベクター、およびリガンドが、これらおよび他の組織中のＢＡＣＨ ＧＰＣＲの過剰発現、過少発現、および異常発現に関連する疾患の検出、診断、治療、および他のアッセイに有用である。
実施例に示すように、ＢＡＣＨの発現データを、ｌａｃＺレポーター遺伝子が内因性ＢＡＣＨ遺伝子に組み込まれた、およびβガラクトシターゼの発現を染色するＢＡＣＨのノックアウトマウスの使用によって得ることもできる。内因性ＢＡＣＨプロモーター活性がレポーターの発現を駆動し、例えば組織化学的に視覚化されて、発現部位が青色細胞となる。このパターンは、内因性ＢＡＣＨ転写物の発現パターンを正確に示す。ＢＡＣＨの発現を示すｌａｃＺの染色パターンを、図に示す。
上記のｌａｃＺレポーター染色、ノーザンブロット分析、およびＲＴ−ＰＣＲ実験は、以下の組織中にＢＡＣＨが発現することを示す。脳（より詳細には小脳表面）；脊柱（より詳細には、膠様質（尾側／仙髄領域））；後根神経節（より詳細には、Ａ−σ線維およびＣ線維クラスのニューロン）；三叉神経節および三叉核および第８脳神経；眼（より詳細には、結膜細胞）；膀胱；胆嚢；舌；皮膚（特に、毛包周囲および鼻腔領域）；胸膜および肺表面；唾液腺（顎下腺領域）；消化管（より詳細には、食道、胃、小腸の絨毛、結腸、および直腸（肛門））；および心臓周囲の脂肪および心膜。
〔使用した方法〕
本発明の実施には、別記しない限り、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献で説明されている。例えば、J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis、1989、「分子クローニング：実験マニュアル」第2版、第1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel,F.M.ら、(1995および定期増補版;「現代の分子生物学プロトコール」、第9、13、および16章、John Wiley & Sons、New York、N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996、「DNAの単離および配列決定:基本的技術」、John Wiley & Sons;J.M.Polak and James O'D.McGee、1990、「インサイチューハイブリッド形成:原理と実践」;Oxford University Press;M.J.Gait(編者)1984、「オリゴヌクレオチド合成：実践アプローチ」、Irl Press;およびD.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg、1992、「酵素学方法論：ＤＮＡ構造パートＡ：ＤＮＡの合成および物理的分析」、Methods in Enzymology、Academic Pressを参照のこと。これらの一般的なテキストは、それぞれ本明細書中で参照として組み込まれる。
〔ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチド〕
本明細書中で使用される、用語「ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチド」は、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体をいうことを意図する。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号３に示す配列のホモログ、変異型、もしくは誘導体を含む、またはこれら自体である。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または改変ペプチド結合（すなわちペプチドイソステア）によって互いに結合した２つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」は、短鎖（一般にペプチドという）、オリゴペプチドまたはオリゴマー、および長鎖（一般に、タンパク質という）をいう。ポリペプチドは、２０個の遺伝子によってコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。
「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスまたは当該分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。このような修飾は、基本的テキストおよびより詳細な小研究論文ならびに多数の著者による研究論文に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドのいたるところで起こり得る。所与のポリペプチド中のいくつかの部位で同一または種々の程度で同一の型の修飾が存在し得る。また、所与のポリペプチドは、多数の型の修飾を含み得る。
ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐することができ、ポリペプチドは、分岐するか分岐しない環状であり得る。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセシングに起因し得るか、合成法によって作製することができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アミノ酸のタンパク質への運搬ＲＮＡ媒介付加（アルギニル化ユビキチン化など）が含まれる。例えば、「タンパク質−構造および分子の性質」、第2版、T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York,1993およびWold,F.、「翻訳後タンパク質修飾：見込みと予想」、1-12、「タンパク質の翻訳後共有結合修飾」、B.C.Johnson編、Academic Press,New York,1983;Seifterら、「タンパク質修飾および非タンパク質補因子の分析」、Meth Enzymol(1990)182:626-646 and Rattanら、「タンパク質合成：翻訳後修飾および加齢」、Ann NY Acad Sci(1992)663:48-62を参照のこと。
本発明に関連する用語「変異型」、「ホモログ」、「誘導体」、または「フラグメント」には、配列からまたは配列への１つ（または複数）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加が含まれる。文脈上他を認めない限り、「ＢＡＣＨ」および「ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ」の引例には、ＢＡＣＨのこのような変異型、ホモログ、誘導体、およびフラグメントの引例が含まれる。
好ましくは、ＢＡＣＨに適用する場合、得られたアミノ酸配列は、ＧＰＣＲ活性、より詳細には、少なくとも配列番号３または配列番号５に示すＢＡＣＨ ＧＰＣＲの活性を有する。特に、用語「ホモログ」は、得られたアミノ酸配列がＧＰＣＲ活性を有する場合に構造および／または機能に関する同一性を対象とする。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の配列が同一である。より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列が同一である。これらの用語は、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ核酸配列の対立遺伝子変異であるアミノ酸由来のポリペプチドも含まれる。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲなどの受容体の「受容体活性」または「生物活性」に合わせて引例が作製されている場合、これらの用語は、ＢＡＣＨ受容体の代謝機能もしくは生理学的機能（類似の活性または改良された活性）または望ましくない副作用が減少したこれらの活性をいう。ＢＡＣＨ受容体の抗原活性および免疫原活性もまた含まれる。ＧＰＣＲ活性ならびにこれらの活性のアッセイ法および定量法は当該分野で公知であり、本明細書中に詳細に記載されている。
本明細書中で使用される、「欠失」は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸残基がそれぞれ存在しないヌクレオチドまたはアミノ酸配列のいずれかの変化をいう。本明細書中で使用される、「挿入」または「付加」は、天然に存在する物質と比較して１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が付加されたヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。本明細書中で使用される、「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換に起因する。
本発明のＢＡＣＨポリペプチドはまた、サイレントな変化を引き起こして機能的に等価なアミノ酸配列が得られるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有し得る。残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似に基づいて意図的にアミノ酸を置換することができる。例えば、負電荷のアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正電荷のアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、類似の親水性値を有する無電荷極性末端基を含むアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
例えば、以下の表にしたがって保存性置換を行うことができる。第２のカラム中の同一のブロック、好ましくは第３のカラム中の同一のライン中のアミノ酸を、互いに置換することができる。
Figure 0004178028
本発明のＢＡＣＨポリペプチドは、典型的にはＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端に外因性アミノ酸配列をさらに含み得る。外因性配列は、細胞内または細胞外タンパク質標的化に影響を与える配列（リーダー配列など）を含み得る。外因性配列はまた、本発明のポリペプチドの免疫原性を増加させ、そして／またはポリペプチドの同定、抽出、および／または精製を容易にする配列を含み得る。特に好ましい別の外因性配列は、好ましくはＮ末端のポリヒスチジンなどのポリアミノ酸配列である。少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１７個のアミノ酸であるが５０個より少ないアミノ酸のポリヒスチジン配列が特に好ましい。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であるか、融合タンパク質などの巨大タンパク質の一部であり得る。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する配列（多数のヒスチジン残基など）、または組換え産生の際の安定性のためのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことがしばしば有利である。
本発明のＢＡＣＨポリペプチドを、公知の技術を使用した組換え手段によって有利に作製する。しかし、固相合成などの当業者に周知の技術を使用した合成手段によってもこれらを作製することができる。本発明のポリペプチドを、例えば抽出および精製を補助するために融合タンパク質として産生することもできる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）、およびβガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質配列を除去するために融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位（トロンビン切断部位など）を含むことも便利であり得る。好ましくは、融合タンパク質は、目的の配列のタンパク質機能を妨げない。
本発明のＢＡＣＨポリペプチドは、実施的に単離された形態であり得る。この用語は、ヒトの手による天然状態からの変更をいうことを意図する。「単離」組成物または物質が天然に存在する場合、その元の環境が変化しているか、それから取り出されているか、その両方である。例えば、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチド、核酸、またはポリペプチドは、「単離」されていないが、この用語が本明細書中で使用されるように、その天然状態共存する物質から分離された同一のポリヌクレオチド、核酸、またはポリペプチドは、「単離」されている。
しかし、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲタンパク質を、タンパク質の意図する目的を妨害しないキャリアまたは希釈剤と混合することができ、依然として実質的に単離されたとみなすことができると理解される。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製された形態で存在することができ、この場合、一般に、調製物中のタンパク質の９０％を超える、例えば、９５％、９８％、または９９％の本発明のＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドであるように調製物中にタンパク質を含む。
本発明はまた、本発明によるＢＡＣＨポリペプチドの一部を含むペプチドに関する。したがって、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲのフラグメント、およびそのホモログ、変異型、または誘導体が含まれる。本発明のペプチドは、２個と２００個との間、好ましくは４個と４０個との間のアミノ酸長であり得る。本明細書中に開示のように、ペプチドは、トリプシンなどの適切な酵素を用いた消化によってＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチド由来であり得る。あるいは、ペプチド、フラグメントなどを、組換え手段によって作製するか、合成することができる。
用語「ペプチド」には、レトロインベルソＤペプチドなどの当該分野で公知の種々の合成ペプチドバリエーションが含まれる。ペプチドは、抗原決定基および／またはＴ細胞エピトープであり得る。ペプチドは、インビボで免疫原性であり得る。好ましくは、ペプチドは、インビボでの抗体の中和を誘導することができる。
異なる種由来のＢＡＣＨ ＧＰＣＲ配列のアラインメントによって、異なる種間でどの領域のアミノ酸配列が保存されているのか（「相同領域」）および異なる種間でどの領域が変化しているのか（「非相同領域」）を決定することが可能である。
したがって、本発明のＢＡＣＨポリペプチドは、相同領域の少なくとも一部に対応する配列を含み得る。相同領域は、少なくとも２つの種間で高い相同性を示す。例えば、相同領域は、上記の試験を使用して、アミノ酸レベルで少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を示し得る。以下でさらに詳しく説明するように、相同領域に対応する配列を含むペプチドを、治療ストラテジーで使用することができる。あるいは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲペプチドは、非相同領域の少なくとも一部に対応する配列を含み得る。非相同領域は、少なくとも２種間で相同性が低い。
〔ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリヌクレオチドおよび核酸〕
本発明は、本明細書中にさらに詳述のように、ＢＡＣＨポリヌクレオチド、ＢＡＣＨヌクレオチド、およびＢＡＣＨ核酸、これらの産生方法、使用などを含む。
用語「ＢＡＣＨポリヌクレオチド」、「ＢＡＣＨヌクレオチド」、および「ＢＡＣＨ核酸」を、交換可能に使用することができ、これらは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号１０に示す核酸配列、またはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体を含むポリヌクレオチド／核酸をいうことを意図する。好ましくは、ポリヌクレオチド／核酸は、配列番号１または配列番号２、最も好ましくは配列番号２の核酸のホモログ、変異型、または誘導体を含むか、それ自体である。用語「ＢＡＣＨポリヌクレオチド」、「ＢＡＣＨヌクレオチド」、および「ＢＡＣＨ核酸」を、特にｃＤＮＡおよびゲノムＢＡＣＨ配列（例えば、下記のマウスＢＡＣＨゲノム配列（配列番号１０））の両方を含むと理解すべきである。
これらの用語はまた、本発明のポリペプチドおよび／またはペプチド（すなわち、ＢＡＣＨポリペプチド）をコードすることができる核酸配列を含むことを意図する。従ってＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリヌクレオチドおよび核酸は、配列番号３もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体を含むポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリヌクレオチドおよび核酸は、配列番号３に示すアミノ酸配列、またはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体を含むポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列を含む。
「ポリヌクレオチド」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡに限定されない一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、より典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。用語「ポリヌクレオチド」は、１つまたは複数の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性または他の理由のために修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの特異的塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに種々の改変を行うことができるので、「ポリヌクレオチド」には、自然界で典型的に見出される化学的、酵素、または代謝で修飾された形態のポリヌクレオチドならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態が含まれる。「ポリヌクレオチド」には、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも含まれる。
遺伝コードの縮重の結果として多数のヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコードすることができることが当業者に理解される。
本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ならびにその変異型、ホモログ、フラグメント、および誘導体（タンパク質など）をいう。ヌクレオチド配列は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖またはその組み合わせのいずれかを示す二本鎖または一本鎖であり得るゲノム、合成、または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。この用語「ヌクレオチド配列」を、組換えＤＮＡ技術の（例えば、組換えＤＮＡ）使用によって調製することができる。
好ましくは、用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡを意味する。
本発明に関連する用語「変異型」、「ホモログ」、「誘導体」、または「フラグメント」には、ＢＡＣＨヌクレオチド配列から、または配列への、１つ（または複数）の核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加が含まれる。文脈上他を認めない限り、「ＢＡＣＨ」および「ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ」の引例には、ＢＡＣＨのこのような変異型、ホモログ、誘導体、およびフラグメントの引例が含まれる。
好ましくは、得られたヌクレオチド配列は、ＧＰＣＲの活性を有するポリペプチド、好ましくは少なくとも配列番号３または配列番号５に示すＧＰＣＲと同一の活性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、用語「ホモログ」は、得られたヌクレオチド配列がＧＰＣＲ活性を有するポリペプチドをコードするように構造および／または機能に関する同一性を対象とすることを意図する。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の配列が同一である。より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列が同一である。これらの用語は、配列の対立遺伝子変異も含まれる。
（ＢＡＣＨ調節領域）
いくつかの目的のために、ＢＡＣＨの調節領域を利用または調査する必要があり得る。このような調節領域には、プロモーター、エンハンサー、および遺伝子座調節領域が含まれる。調節領域は、これに作動可能に連結されたコード配列の発現を調整することができる核酸の配列または構造を意味する。
例えば、調節領域は、ＢＡＣＨを発現するトランスジェニック動物の作製に有用である。さらに、調節領域を使用して、ＢＡＣＨの発現構築物を作製することができる。集団中の異なる個体由来の調節領域を配列決定して、ＢＡＣＨの発現レベルに影響を与え得る非コード多型を同定することができる。これを、以下でさらに詳述する。
ＢＡＣＨの調節領域の同定は明白であり、多数の方法で行うことができる。例えば、ＢＡＣＨのコード配列を、プローブとしてヒトまたはマウスＢＡＣＨ ｃＤＮＡ配列を使用したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって生物から得ることができる。５’配列を、適切なゲノムライブラリーのスクリーニングまたは当該分野で公知のプライマー伸長によって得ることができる。ゲノムデータベースのデータベース検索を使用することもできる。特に目的とするこのような５’配列には、非コード領域が含まれる。５’領域を、目視またはコンピュータプログラムで試験して、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の存在を示す配列モチーフを同定することができる。
さらに、２つまたはそれ以上の生物由来のＢＡＣＨ核酸配列の配列アラインメントを行うことができる。異なる種由来のＢＡＣＨ ＧＰＣＲ配列のアラインメントにより、異なる種間でアミノ酸配列が保存された領域を決定することが可能である。このような保存領域は、目的の遺伝子（すなわち、ＢＡＣＨ）の調節領域を含むであろう。本明細書中に開示されるマウスおよびヒトゲノム配列（例えば、ＢＡＣＨゲノム配列（配列番号１０））を、この目的に使用することができる。さらに、他の生物由来のＢＡＣＨホモログを、マウスおよびヒトＢＡＣＨ配列から作製した適切なプローブを使用した標準的なスクリーニング法を使用して得ることができる。フグ（Takifugu rubripes）のゲノムをスクリーニングしてＢＡＣＨホモログを同定することもでき、フグＢＡＣＨ遺伝子の５’非コード領域のマウスまたはヒトＢＡＣＨ配列（例えば、配列番号１０、マウスＢＡＣＨゲノム配列）との比較を使用して、調節領域を含む保存領域を同定することができる。
欠失研究を行って、ＢＡＣＨのプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を同定することもできる。
推定調節領域の同定を分子生物学実験によって確認することができ、これにより候補配列がレポーター遺伝子に作動可能に連結され、レポーターの発現が検出される。
〔ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ関連疾患〕
本明細書中に記載の方法および組成物によれば、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲは、疾患範囲の治療および診断に有用である。
本発明者らは、本明細書中で、ヒトＢＡＣＨはホモサピエンス染色体１２ｐ１３．３にマッピングされることを証明する。したがって、特定の実施形態では、ＢＡＣＨおよびＢＡＣＨに結合するか、これらを作動するか拮抗する薬剤を使用して、この遺伝子座、染色体バンド、領域、アーム、または染色体自体にマッピングされる疾患を治療または診断することができる。
さらに、本発明者らは、トランスジェニックマウスにおけるＢＡＣＨの発現パターンを証明し、このようなマウスの表現型を同定する。これらにより、痛みの感知、平衡の維持、および分泌におけるＢＡＣＨの役割が示される。ＢＡＣＨおよびＢＡＣＨに結合するか、これらを作動するか拮抗する薬剤を使用して、これらのいずれかにおいて障害が存在する疾患を治療または診断することができる。
したがって、本発明の１つの実施形態では、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを使用し、本明細書中に記載の任意の手段によって、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、および脊髄または脳の損傷による痛みを診断または治療することができる。
別の実施形態では、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを使用し、本明細書中に記載の任意の手段によって、例えば脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムスを診断または治療することができる。
さらなる実施形態では、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを使用し、本明細書中に記載の任意の手段によって、眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症を診断または治療することができる。
上記のように、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを使用し、本明細書中に記載の任意の方法および組成物を使用して、任意のこれらの特定の疾患（「ＢＡＣＨ関連疾患」）を診断および／または治療することができる。
特に、本発明者らは、上記の特定の疾患の治療または診断のための、核酸、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ核酸を含むベクター、ポリペプチド（そのホモログ、変異型、または誘導体を含む）、医薬組成物、宿主細胞、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ核酸および／またはポリペプチドを含むトランスジェニック動物の使用を特に認識する。さらに、本発明者らは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ、好ましくはＢＡＣＨ ＧＰＣＲのアンタゴニストと相互作用するか結合することができる化合物、好ましくは、細胞中のサイクリックＡＭＰの内因性レベルを低下させることができる化合物、抗体ＢＡＣＨ ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ、ならびに上記の特異的疾患の診断または治療におけるこれらの作製方法もしくは同定方法の使用を認識する。特に、特定の疾患の治療または予防のためのワクチン産生におけるこれらの任意の化合物、組成物、分子の使用が含まれる。本発明者らはまた、個体の特定の疾患を検出するための診断キットを開示する。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲの使用によって治療または診断可能なこのような特定の疾患またはさらなる疾患を同定するための連鎖マッピング法が当該分野で公知であり、本明細書中も記載されている。
本発明の広範な態様では、ＢＡＣＨ関連疾患には、任意の細菌、真菌、原生動物、およびウイルス感染などの感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）；痛み；癌；糖尿病；肥満症；食欲不振；過食症；喘息；パーキンソン病；血栓症；急性心不全；低血圧症；高血圧症；勃起機能障害；尿閉；骨粗鬆症および大理石骨病などの代謝性骨疾患；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；慢性関節リウマチ；炎症性腸疾患；過敏性腸症候群；良性前立腺肥大；および不安、神経分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆、重症精神沈滞を含む精神および神経障害、ならびにハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群などのジスキネジーが含まれる。
〔痛みおよび感受性〕
実施例および図に示すように、ＢＡＣＨは、マウスの神経系に発現する。概して、後根神経質、脊髄、三叉神経節、および三叉神経核中のＬａｃＺ染色の存在は、痛みおよび感受性におけるＢＡＣＨの役割の非常に強い潜在性を示す（Julius and Basbaum、20011）。
これは、足圧迫試験に対するＢＡＣＨ変異体のより低い応答（テールフリック試験などの他の試験で認められる低疼痛応答）と一致する。同様に、消化器系の管（食道、腸、胃）などの内臓および膀胱および胆嚢などの嚢、胚、唾液腺、および眼における発現は、これらの器官における「収縮」痛または内臓痛の感受性ならびに神経障害性／炎症性の痛みに関与するＰ２Ｘ３の発現パターンを強く暗示する（Burnstock、2001;Cockayneら、2000;Souslovaら、2000）。
したがって、ＢＡＣＨを欠く変異マウスの発現パターンおよび痛覚脱失表現型データの試験は、ＢＡＣＨが三叉神経痛および片頭痛の潜在的治療の標的であることを示す。したがって、本明細書中に記載の方法および組成物を使用して開発した治療薬を、鎮痛薬として使用することができる。このような治療薬は、ＢＡＣＨのアゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはＢＡＣＨのアンタゴニストを含み得る。
同定された薬剤を、神経障害性、炎症性、および内臓の痛みの治療および管理で使用することができる。これらの鎮痛型治療薬を他の条件下で使用して、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、および脊髄または脳の損傷による痛みを治療することができる。
口顔痛は、発作性の痛みが三叉神経の１つまたは２つの部分に広がる三叉神経痛の結果である。視神経に影響を与えるのは稀である。通常薬物治療が有効であるが、これが失敗した場合は手術によって治療する。これらの手術による治療は満足に治療される証拠はない。特定の薬物も未だ開発されていない。
皮膚感受性は、片頭痛患者の大多数で起こる。Bursteinらは、４４人の片頭痛患者の７９％が強い皮膚感受性を示すという研究を発表した。Bursteinは、強い片頭痛の影響により、髪のブラッシング、着替えもしくは眼鏡のかけはずし、または髭剃りなどの日常的な作業を行うことができないと記載している。
片頭痛では、一連の神経クラスター（知覚神経節、脳幹、視床）は、一種のドミノ効果で感受性が増す。クラスター（コンピュータネットワークのハブのように作用する神経群）の感受性が増すと、皮膚への連携が起こり、その結果皮膚が感受性を示すようになり得る。硬膜、血管、および脳内の神経末端からの炎症性物質の放出から問題が発生する。これにより、三叉神経質が過剰に感受性を示す。過剰に感受性を示した場合、神経節は、片頭痛のずきずきする痛みを頭蓋内の正常圧と解釈する。三叉神経節が片頭痛の主な痛みを引き起こすと考えられるので、三叉神経節が硬膜に接続された感覚神経におけるセロトニン受容体を遮断する片頭痛薬の標的である。薬物は有効な場合があるが、これは頭痛直後に投与した場合のみである。
次いで、過剰に感受性を示す三叉神経節は、脊髄上部の尾状核に信号を送る。三叉神経節と異なり、この神経群は、特に、片頭痛患者で最も劇的な皮膚感受性が見出される眼付近の皮膚に接続している。ラットでは、一旦三叉神経節が尾状核を活性化させると、三叉神経節が薬物によって鎮静されたとしても尾状核は興奮したままであり、これは既存の片頭痛治療でしばしば起こり得る。実験は、尾状核の高感受性ニューロンが皮膚の穏やかな接触を痛みと解釈することも示す。現在の片頭痛薬は頭痛発症直後に迅速に投与した場合作用するが、薬物を手元に置いていないか就寝中に頭痛を発症した患者には不可能である。Burnsteinによれば、これにより、最初のクラスターに作用する現在の片頭痛治療がなぜ片頭痛開始から１時間以内に投与した場合のみに有効であるのかを説明することができる。したがって、重要な標的は、二次ニューロン（secondary neurons）を含む。
したがって、Bursteinの研究は、皮膚の感受性は、過剰な感受性を示す神経細胞の高覚醒を明白な起源とすることを示す（Burstein,Rら、2000a1およびb1）。
〔運動関連障害および痴呆〕
本発明の実施形態によれば、ＢＡＣＨは、平衡の調節に関与する。実施例に示すように、ＢＡＣＨは、第８脳神経（内耳神経）および小脳で発現する。ＢＡＣＨ陰性マウスは、平衡障害および運動障害を有する様である。したがって、本明細書中に記載の方法および組成物を使用して、運動障害、運動関連障害、および平衡障害を治療するために使用することができるＢＡＣＨのアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。
さらに、本明細書中に記載の方法および組成物を使用して、痴呆関連障害の治療および管理で使用することができるＢＡＣＨのアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。このような障害には、例えば、脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムスが含まれる。
この結果に由来するようにＢＡＣＨが関連し得る他の疾患は、平衡、振せん、癲癇であり、これらは全て小腸で発現する遺伝子の欠陥によって引き起こされ得る。
失読症は、（数ある要因の中で）失読症患者に新規の技術の学習および自律神経の過剰学習技能に悪影響を与える小脳の欠損を引き起こすように小脳が異常に処理を行うことが示されている（Nicolsonら、19991）。脳の他の領域では、プリンがドーパミンレベルを増加させて、それに起因する挙動が増加する。一般に、プリノセプターは興奮性を示すが、ＣＮＳ中の主な興奮性神経伝達物質（グルタミン酸）の放出を阻害することが示されている（Mendoza-Fernandezら、20001）。
〔分泌関連障害〕
ＢＡＣＨに対して開発された良薬を、眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症の治療で使用することができる。
〔配列相同性の計算〕
本明細書中に記載の任意の配列に関する配列同一性を、任意の１つまたは複数の配列と別の配列との簡単な「視認」比較（すなわち、厳密な比較）によって同定して、例えば、他の配列がその配列と少なくとも７０％同一であるかどうかを調査することができる。
相対的な配列同一性を、例えばデフォルトパラメーターを使用した同一性同定用の任意の適切なアルゴリズムを使用した２つまたはそれ以上の配列の間の同一性％を計算することができる市販のコンピュータプログラムによって決定することもできる。このようなコンピュータプログラムの典型的な例は、CLUSTALである。２配列間の同一性および類似性を同定するための他のコンピュータプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereuxら、1984、Nucleic Acids Research、12、387）およびFASTA〔Atschulら、1990、J.Molec.Biol.、403-410）が含まれるが、これらに限定されない。
連続した配列の相同性％を計算することができる（すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ比較する）。これを、「非ギャップ」アラインメントと呼ぶ。典型的には、このような非ギャップアラインメントを、比較的少数の残基でのみ行う。
これは非常に簡単で一貫した方法であるにもかかわらず、例えば、別の同一の配列対では、１つの挿入または欠失によりその後のアミノ酸残基がアラインメントから排除され、それにより全体のアラインメントを行った場合に相補性％が非常に減少することを考慮することができない。その結果、ほとんどの配列比較法は、相同性スコア全体に過度のペナルティーを与えることなく挿入および欠失の可能性を考慮した最適なアラインメントが得られるようにデザインされている。これを、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入して局所相同性を最大にするようにすることによって行う。
しかし、これらのより複雑な方法では、同数の同一のアミノ酸について可能な限り少数のギャップ（２つの比較配列間でより高い関連性を反映する）を含む配列アラインメントが多数のギャップを含む配列アラインメントよりも高いスコアが得られるようにアラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てる。典型的には、ギャップの存在に比較的高いコストをかけ、ギャップ中のその後の各残基のペナルティーをより小さくする「アフィンギャップコスト」を使用する。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。勿論、高いギャップペナルティーにより、より少ないギャップを含む最適化アラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを修正可能である。しかし、このような配列比較ソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを使用した場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについては−１２であり、各伸長については−４である。
したがって、最大相同性％の計算には、最初にギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの作製が必要である。このようなアラインメントを実行するための適切なコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（ウィスコンシン大学、U.S.A.;Devereuxら、1984、Nucleic Acids Research、12:387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、BLASTパッケージ（Ausubelら、1999、前出、第18章）、FASTA（Atschulら、1990、J.Mol.Biol.、403-410）、および比較ツールのGENEWORKSスーツが含まれるが、これらに限定されない。BLASTおよびFASTAは共にオフラインおよびオンライン検索で利用可能である（Ausubelら、1999、前出、7-58-7-60）。
最終的な相同性％を同一性に関して測定することができるにもかかわらず、典型的には、アラインメントプロセス自体が、全か無かの測定に基づいていない。その代わり、一般に、化学的類似性または進化距離に基づいて各対にスコアを割り当てる目盛りをつけた類似性スコア行列を使用する。一般的に使用されるこのような行列の例は、BLOSUM62行列（プログラムのBLASTスーツ用のデフォルト行列）である。GCG Wisconsinプログラムは、一般に、公開されたデフォルト値または共有される場合は注文品の記号比較表のいずれかを使用する。ＧＣＧパッケージ用の公開デフォルト値、または他のソフトウェアの場合、BLOSUM62などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
有利には、デフォルト値に対してパラメータが設定されたBLASTアルゴリズムを使用する。BLASTアルゴリズムは、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html（本明細書中で参照として組み込まれる）に詳述されている。検索パラメータを以下に定義し、定義されたデフォルトパラメーターを有利に設定することができる。
有利には、「実質的な同一性」は、BLASTによって評価する場合、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０またはそれ以上のEXPECT値で適合する配列に匹敵する。BLAST検索におけるEXPECTのデフォルト閾値は、通常１０である。
BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxによって使用される機能的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、有意性を少し充実させたKarlin and Altschulの統計学的方法を使用した所見に帰する（Karlin and Altschul、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68;Karlin and Altschul、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-7;http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlを参照のこと）。BLASTプログラムは、例えば、クエリー配列に対する相同性を同定するために配列類似性検索に合わせられている。配列データベースの類似性検索における基本的問題の考察については、Altschulら、1994、Nature Genetics、6、119-129を参照のこと。
http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能な５つのBLASTプログラムは以下の作業を行う。blastp−タンパク質配列データベースに対するアミノ酸クエリー配列を比較する;blastn−ヌクレオチドデータベースに対するヌクレオチドクエリー配列を比較する;blastx−タンパク質配列データベースに対するヌクレオチドクエリー配列（両方の鎖）の６フレームの概念的翻訳産物を比較する;tblastn−6つ全てのオープンリーディングフレーム（両方の鎖）で動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対するタンパク質クエリー配列を比較する;tblastx−ヌクレオチド配列データベースの６フレームの翻訳物に対するヌクレオチドクエリー配列の６フレームの翻訳物を比較する。
BLASTは、以下の検索パラメータを使用する。
HISTOGRAM−各検索のスコアをヒストグラムで表示する。デフォルトはyesである（BLASTマニュアルのパラメータＨを参照のこと）。
DESCRIPTIONS−報告された適合配列の短い記載の数を、特定の数に制限する。デフォルト限度は、１００の記載である（マニュアルページのパラメータＶを参照のこと）。
EXPECT−データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値。デフォルト値は１０である（Karlin and Altschul(1990)によれば、１０の適合は偶然ではほとんど見出されてないと予想される）。適合に帰する統計的有意性がEXPECT閾値よりも大きい場合、適合は報告されない。より低いEXPECT閾値はよりストリンジェントであり、適合が報告される機会はより少ない。分数値が許容される（BLASTマニュアルのパラメータＥを参照のこと）。
CUTOFF−高スコアのセグメント対を報告するためのCutoffスコア。デフォルト値を、EXPECT値（上記を参照のこと）から計算する。ＨＳＰに帰する統計的有意性が、少なくともCUTOFF値と等しいスコアを有する１のＨＳＰに帰するほど高い場合に限り、データベース配列についてのＨＳＰが報告される。CUTOFF値が高いほどよりストリンジェントであり、適合が報告される機会がより少ない（BLASTマニュアルのパラメータＳを参照のこと）。典型的には、EXPECTを使用して有意性の閾値をより直感的に管理することができる。
ALIGNMENTS−高スコアセグメント対（ＨＳＰ：high-scoring segment pairs）を報告するための特定の数にデータベース配列を制限する。デフォルト限度は５０である。これよりも多数のデータベース配列が報告のための統計的有意性の閾値を満たす場合（以下のEXPECTおよびCUTOFFを参照のこと）、最も高い統計的有意性に帰する適合のみが報告される（BLASTマニュアル中のパラメータＢを参照のこと）。
MATRIX−BLASTP、BLASTX、TBLASTN、およびTBLASTXのスコア行列の変化を特定する。デフォルト行列は、BLOSUM62である（Henikoff & Henikoff、1992）。有効な別の選択には、PAM40、PAM120、PAM250、およびIDENTITYが含まれる。BLASTNには代わりのスコア行列は利用不可能である；BLASTNリクエストにおいてMATRIX命令を特定すると、エラーが返ってくる。
STRAND−データベース配列の先頭または末尾の鎖のみにTBLASTN検索を限定するか、クエリー配列の先頭または末尾の鎖上のオープンリーディングフレームのみにBLASTN、BLASTX、またはTBLASTX検索を制限する。
FILTER-Wootton & Federhen、1993、Computers and Chemistry、17、149-163のＳＥＧプログラムで決定したところの組成が複雑ではないクエリー配列のセグメント、またはClaverie & States、1993、Computers and Chemistry、17、191-201のXNUプログラムまたはBLASTN用のTatusov and LipmanのDUSTプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）によって決定したところの短い周期の内部反復からなるセグメントを遮蔽する。フィルタリングにより、blast出力由来の統計学的に有意であるが生物学的に関心のないレポート（例えば、共通の酸性、塩基性、またはプロリンリッチな領域に対するヒット）が排除され、データベース配列に対する特定の適合に利用可能なクエリー配列のより生物学的に興味のある領域が残る。
フィルタープログラムによって見出された複雑でない配列を、ヌクレオチド配列中では文字「Ｎ」を使用し（例えば、「NNNNNNNNNNNNN」）、タンパク質配列中では文字「Ｘ」を使用して（例えば、XXXXXXXXX）置換する。
フィルタリングは、クエリー配列（またはその翻訳産物）のみに適用し、データベース配列には適用しない。デフォルトフィルタリングは、BLASTNではDUST、他のプログラムではSEGである。
SWISS-PROTの配列に適用した場合に、ＳＥＧ、ＸＮＵ、またはその両方によって全くマスクされないことは珍しいことではないので、フィルタリングによって常に結果が得られると予想すべきではない。さらに、いくつかの場合、配列全体がマスクされる場合があるが、これはフィルタリングされたクエリー配列に対して報告された任意の適合の統計的有意性に疑いがあることを示す。
ＮＣＢＩ−ｇｉ−アクセッションおよび／または遺伝子座の名称に加えて、ＮＣＢＩ ｇｉ識別名を出力中に示す。
最も好ましくは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTで提供されている簡単なBLAST検索アルゴリズムを使用して配列比較を行う。本発明のいくつかの実施形態では、配列同一性を同定する場合にはギャップペナルティーを使用しない。
〔ハイブリッド形成〕
本発明はまた、本明細書中に記載の配列、またはその任意のフラグメントもしくは誘導体、または上記の任意の相補物とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を含む。
ハイブリッド形成は、「核酸の鎖が塩基の対合を介して相補鎖とハイブリッド形成するプロセス」（Coombs J(1994)Dictionary of Biotechnology、Stockton Press、New York NY）およびDieffenbach CW and GS Dveksler（1995、「ＰＣＲプライマー：実験マニュアル」、Cold Spring Harbor Press、Plainview NY）に記載のポリメラーゼ連鎖反応テクノロジーで行われる増幅プロセスを意味する。
ハイブリッド形成条件は、Berger and Kimmel（1987、「分子クローニング技術ガイド」、Methods in Enzymology、152、Academic Press、San Diego CA）が教示されている核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明されるように定義された「ストリンジェンシー」が付与されている。
本明細書中に記載のヌクレオチド配列またはその相補物と選択的にハイブリッド形成することができる本発明のヌクレオチドは、対応するヌクレオチド配列と、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５または３０、例えば、少なくとも４０、６０、または１００またはそれ以上の連続するヌクレオチドについて、一般に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５または９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％または９８％相補的である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１、２、４または１０に相補的な領域を含み、好ましくは、これらの配列の１つと好ましくは７０％、８０％、または９０％、より好ましくは少なくとも９５％相補的な領域を含む。
用語「選択的にハイブリッド形成可能な」は、プローブとして使用されるヌクレオチド配列を、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドを有意に超えるレベルでプローブとハイブリッド形成することが見出される条件下で使用することを意味する。例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する他のヌクレオチド配列のために、バックグラウンドハイブリッド形成が起こり得る。この事象では、バックグラウンドは、標的ＤＮＡで認められる特異的相互作用の１／１０未満、好ましくは１／１００未満の強度の、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって得られるシグナルレベルを意味する。相互作用の強度を、例えば、プローブの放射性標識（例えば、32Ｐを使用する）によって測定することができる。
中程度から最大のストリンジェンシー条件下で本明細書中に記載のヌクレオチドとハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列もまた本発明の範囲内に含まれる。ハイブリッド形成条件は、Berger and Kimmel(1987、「分子クローニング技術ガイド」、Methods in Enzymology、152、Academic Press、San Diego CA）に教示されている核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明されるように定義された「ストリンジェンシー」が付与されている。
典型的には、最大ストリンジェンシーは、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）であり、高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低く、中程度のストリンジェンシーはＴｍより１０℃〜２０℃低く、低ストリンジェンシーは、Ｔｍより約２０℃〜２５℃低い。当業者に理解されるように、最大ストリンジェンシーのハイブリッド形成を使用して同一のヌクレオチド配列を同定または検出することができ、中程度（または低い）ストリンジェンシーのハイブリッド形成を使用して類似するか関連するヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
好ましい実施形態では、本発明は、ストリンジェントな条件下〔例えば、６５℃で０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）｝〕で本発明の１つまたは複数のＢＡＣＨ ＧＰＣＲヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を対象とする。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合、個別または組み合わせた二重らせんの両方の鎖も本発明に含まれる。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、このヌクレオチド配列の相補鎖も本発明の範囲内に含まれる。
本発明はまた、本明細書中に記載の配列またはその任意のフラグメントもしくは誘導体に相補的な配列とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を含む。同様に、本発明は、本発明の配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列のこれらの型は、変異ヌクレオチド配列の例である。これに関して、用語「変異型」は、本明細書中に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的な配列を含む。しかし、好ましくは、用語「変異型」は、ストリンジェントな条件下〔例えば、６５℃で０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）｝〕で本明細書中に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的な配列を含む。
〔ＢＡＣＨ ＧＰＣＲおよびホモログのクローニング〕
本発明はまた、本明細書中に記載の配列、またはその任意のフラグメントもしくは誘導体に相補的なヌクレオチド配列を含む。この配列がそのフラグメントに相補的である場合、この配列をプローブとして使用して他の生物などにおける類似のＧＰＣＲ配列を同定およびクローン化することができる。
したがって、本発明により、ヒトおよびマウス、ブタ、ヒツジなどの他の種由来のＢＡＣＨ ＧＰＣＲ、そのホモログおよび他の構造的または機能的に関連する遺伝子をクローン化することができる。配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくはマウスＢＡＣＨゲノム配列（配列番号１０）またはそのフラグメント中に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に同一である本発明のポリヌクレオチドを、ｃＤＮＡおよび適切ならばゲノムＤＮＡのハイブリッド形成プローブとして使用して、適切なライブラリーから部分的または全長ｃＤＮＡおよびＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードするゲノムクローンを単離することができる。このようなプローブを使用して、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ遺伝子と類似の配列、好ましくは配列類似性が高い他の遺伝子（ヒト以外の種由来のホモログおよびオーソログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することもできる。ハイブリッド形成スクリーニング、クローニング、および配列決定の技術は当業者に公知であり、例えば、Sambrookら（前出）に記載されている。
典型的には、プローブとして使用する適切なヌクレオチド配列は、関連配列と７０％同一、好ましくは８０％同一、より好ましくは９０％同一、さらにより好ましくは９５％同一である。プローブは、一般に、少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。好ましくは、このようなプローブは、少なくとも３０個のヌクレオチドを含み、少なくとも５０個のヌクレオチドを有し得る。特に好ましいプローブは、１５０個と５００個の間のヌクレオチド、より詳細には約３００個のヌクレオチドの範囲である。
１つの実施形態では、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチド（ヒト以外の種由来のホモログおよびオーソログを含む）をコードするポリヌクレオチドを得るために、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１、配列番号２、配列番号４、もしくはマウスＢＡＣＨゲノム配列（配列番号１０）またはそのフラグメントを有する標識プローブで適切なライブラリーをスクリーニングするステップと、前記部分的または全長ｃＤＮＡおよびポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを単離するステップとを含む。このようなハイブリッド形成技術は当業者に周知である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は上記定義のものであるか、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの超音波処理サケ変性精子ＤＮＡを含む４２℃の溶液中で一晩のインキュベートし、その後の約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でのフィルターを洗浄する条件である。
（ＢＡＣＨ ＧＰＣＲの機能アッセイ）
クローン化推定ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリヌクレオチドを、配列分析または機能アッセイによって評価することができる。例えば、推定ＢＡＣＨ ＧＰＣＲまたはホモログを、以下のように受容体活性についてアッセイすることができる。本発明のＢＡＣＨ受容体ｃＤＮＡをコードする線状化プラスミドテンプレート由来のキャップＲＮＡ転写物を、標準的に手順によってＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで合成する。インビトロ転写物を水で最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌに懸濁する。卵巣の葉（lobes）を、成体メスヒキガエルから取り出し、第５段階の脱濾胞卵母細胞を獲得し、ＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を、微量注入装置を使用して５０ｎｌボーラスで注入する。２つの電極電圧クランプを使用して、曝露に応答した各アフリカツメガエル卵母細胞由来の電流を測定する。室温の無Ｃａ2+Ｂａｒｔｈ培地中で読み取る。以下にさらに詳述するように、活性化リガンドについてアフリカツメガエル系を使用して既知のリガンドおよび組織／細胞抽出物をスクリーニングすることもできる。
（ＢＡＣＨ ＧＰＣＲの発現アッセイ）
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ関連疾患の治療に有用な療法をデザインするためには、ＢＡＣＨ（野生型または特定の変異体のいずれか）の発現プロフィールを決定することが有用である。したがって、当該分野で公知の方法を使用して、ＢＡＣＨが発現される器官、組織、および細胞型（ならびに発生段階）を決定することができる。例えば、伝統的または「電子工学的」ノーザンを行うことができる。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ＢＡＣＨ遺伝子または変異体の発現をアッセイすることもできる。ＢＡＣＨの発現プロフィールのより感度の高い決定方法には、当該分野で公知のＲＮＡアーゼ保護アッセイが含まれる。
ノーザン分析は、遺伝子転写物の存在を検出するために使用される実験技術であり、特定の細胞型または組織由来のＲＮＡが結合した膜への標識ヌクレオチド配列のハイブリッド形成を含む（Sambrook、前出、第7章およびAusubel,F.Mら、前出、第4章および第16章）。BLASTを適用する類似のコンピュータ技術（「電子的ノーザン」）を使用して、GenBankまたはLIFESEQデータベース（Incyte Pharmaceuticals）などのヌクレオチドデータベース中の同一または関連分子を検索することができる。この型の分析は、複数の膜をベースとしたハイブリッド形成よりも迅速であり得るという点で有利である。さらに、コンピュータ検索の感度を修正して任意の特定の適合を厳密または相同に分類されるかどうかを決定することができる。
本明細書中でさらに詳しく説明されるように、上記のプローブを含む本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、動物およびヒトの疾患の治療および診断の発見のための検索試薬および材料として使用することができる。
〔ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドの発現〕
生物学的に活性なＢＡＣＨ ＧＰＣＲを発現するために、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲまたはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター（すなわち、挿入コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入する。
当業者に周知の方法を使用して、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築する。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。このような技術は、Sambrook,J.ら、（1989、「分子クローニング：実験マニュアル」、第4、8、16-17章、Cold Spring Harbor Press、Plainview,、N.Y.）およびAusubel,F.M.ら（1995および定期増補版、「現代の分子生物学プロトコール」、第9、13、および16章、John Wiley & Sons、New York、N.Y.）に記載されている。
種々の発現ベクター／宿主系を使用して、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列を収納する、または発現することができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、使用した宿主細胞に制限されない。
「調節エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳するために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（すなわち、エンハンサー、プロモーター、ならびに５’および３’非翻訳領域）である。このようなエレメントは、その強度および特異性が様々である。使用したベクター系および宿主に依存して、任意の数の適切な転写および翻訳エレメント（構成性および誘導性プロモーターを含む）を使用することができる。例えば、細菌系でクローニングする場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミドのハイブリッドｌａｃＺプロモーター（Stratagene、La Jolla、Calif.）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）などの誘導性プロモーターを使用することができる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを、昆虫細胞で使用することができる。植物細胞（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルス（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）由来のプロモーターまたはエンハンサーをベクターにクローン化することができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を作製する必要がある場合、ベクターベースのＳＶ４０またはＥＢＶを、適切な選択マーカーと共に使用することができる。
細菌系では、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを意図する使用に依存して多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、大量のＢＡＣＨ ＧＰＣＲが抗体の誘導に必要である場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指示するベクターを使用することができる。このようなベクターには、ｐＩＮベクター（Van Heeke,G.and S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264:5503-5509）などのハイブリッドタンパク質が産生されるようにアミノ末端Ｍｅｔおよびその後のβガラクトシダーゼの７残基の配列と共にＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列をベクターにライゲートすることができるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene）などの多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクター（Promega、Madison、Wis.）を使用して、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現することもできる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着および遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。このような系で作製されたタンパク質を、目的のクローン化ポリペプチドをＧＳＴから任意に放出することができるようにヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインすることができる。
酵母サッカロミセス−セレビジエでは、構成性または誘導性プロモーターを含む多数のベクター（α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなど）を使用することができる。概説については、Ausubel｛前出｝およびGrantら｛1987、Methods Enzymol.、153、516-544）を参照のこと。
植物発現ベクターを使用する場合、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列の発現を、任意の多数のプロモーターによって駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独かＴＭＶ由来のωリーダー配列と組み合わせて使用することができる（Takamatsu,N.,1987、EMBO J.、6、307-311）。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを使用することができる（Coruzzi,Gら、1984、EMBO J.、3、1671-1680;Broglie,R.ら、1984、Science、224、838-843;Winter,J.ら、1991、Results Probl.Cell Differ.、17、85-105）。これらの構築物を、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションによって植物細胞に移入することができる。このような技術は、一般的に利用可能な多数の概説に記載されている（例えば、Hobbs,S or Murry,L.E.、「マグロヒル科学技術年鑑」、1992、McGraw Hill、New York、N.Y.、191-196を参照のこと）。
昆虫系を使用して、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを発現することもできる。例えば、このような系の１つでは、ベクターとしてAutographa californicaの核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用して、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫に外来遺伝子を発現させる。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列を、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域にクローン化し、ポリへドロンプロモーターの調節下におくことができる。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲの首尾のよい挿入によりポリヘドリン遺伝子が不活化され、組換えウイルス欠失被覆タンパク質が産生される。ついで、組換えウイルスを使用して、例えば、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを発現することができるS.frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫に感染させることができる（Engelhard,E.K.ら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.、91、3224-3227）。
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を使用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列を、後期プロモーターおよび三連のリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートすることができる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入を使用して、感染宿主中にＢＡＣＨ ＧＰＣＲを発現することができる価値のあるウイルスを得ることができる（Logan,J.and T.Shenk、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.、81、3655-3659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞中の発現を増加させることができる。
したがって、例えば、本発明のＢＡＣＨ受容体は、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞または接着ｄｈｆｒＣＨＯ細胞のいずれかで発現する。受容体発現を最大にするために、典型的には、すべての５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を受容体ｃＤＮＡから除去し、その後ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入する。リポフェクチンによって細胞を個々の受容体ｃＤＮＡでトランスフェクトし、４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択する。選択から３週間後、個々のクローンを選択し、更なる分析のために拡大する。ベクターのみでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞を、負のコントロールとして使用する。個々の受容体を安定に発現する細胞株を単離するために、典型的には約２４個のクローンを選択し、ノーザンブロット分析によって分析する。一般に、分析したＧ４１８耐性クローンの約５０％の受容体ｍＲＮＡを検出可能である。
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を使用して、プラスミド中に含むことができ且つ発現することができるフラグメントよりも大きなＤＮＡフラグメントを送達することもできる。治療のために、約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣを構築し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、または小胞）によって送達させる。
特異的開始シグナルを使用して、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列のより有効な翻訳を達成することもできる。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列ならびにその開始コドンおよび上流配列を適切な発現ベクターに挿入する場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ではない。しかし、コード配列またはそのフラグメントのみを挿入する場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルを使用しなければならない。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を確実にするために、正確なオープンリーディングフレームで存在しなければならない。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源に由来し得る（天然および合成の両方）。文献に記載のように（Scharf,Dら、1994、Results Probl.Cell Differ.、20、125-162）、発現効率を、使用した特定の細胞に適切なエンハンサーを含めることによって増強することができる。
さらに、挿入配列の発現調節能力または所望の様式で発現されたタンパク質をプロセシングする能力について宿主細胞株を選択することができる。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングを使用して、正確な挿入、折りたたみ、および／または機能を促進することもできる。翻訳後活性についての特定の細胞機構および特異的機構を有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、Bethesda、Md.）から利用可能であり、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。
長期間の組換えタンパク質の高収率産生および安定な発現が好ましい。例えば、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲを安定に発現することができる細胞株を、同一または異なるベクター上にウイルス複製起点および／または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含み得る発現ベクターを使用して形質転換することができる。ベクターの移入後、富化培地中で約１〜２日間細胞を成長させ、その後選択培地と交換することができる。選択マーカーの目的は選択性に対する耐性を扶養することであり、その存在により移入配列が首尾よく発現する細胞を成長および回収することが可能である。安定に形質転換された細胞の耐性クローンを、細胞株に適切な組織培養技術を使用して増幅することができる。
任意の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収することができる。これらには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler,M.ら、1977、Cell、11、223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy,Iら、1980、Cell、22、817-23）（それぞれｔｋ-またはａｐｒ-細胞中で使用することができる）が含まれるが、これらに限定されない。また、選択の基本として代謝拮抗薬、抗生物質、または除草薬耐性を使用することができる。例えば、ｄｈｆｒメトトレキセート耐性を付与し（Wigler,M.ら、1980、Proc.Natl.Acad.Sci.、77、3567-70）、ｎｐｔはアミノグリコシド類（ネオマイシンおよびＧ−４１８）耐性を付与し（Colbere-Garapin,F.ら、1981、J.Mol.Biol.、150、1-14）、ａｌｓまたはｐａｔはクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ耐性を付与する（Murry、前出）。さらに、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用可能なｔｒｐＢまたは細胞がヒスチジンの代わりにヒストールを利用可能なｈｉｓＤの、選択遺伝子が記載されている（Hartman,S.C.and R.C.Mulligan、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.、85、8047-51）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーとともに視覚可能なマーカーの使用が増加している。これらのマーカーを、形質転換体の同定だけでなく、特定のベクター系に寄与し得る一過性または安定なタンパク質発現の量の定量にも使用することができる（Rhodes,C.A.ら、1995、Methods Mol.Biol.、55、121-131）。
マーカー遺伝子発現の存在／非存在により、目的の遺伝子も存在することが示唆されるにもかかわらず、遺伝子の存在および発現を確認する必要があり得る。例えば、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列をマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列を含む形質転換細胞を、マーカー遺伝子が機能しないことによって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子を、１つのプロモーターの調節下でＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列とともに縦列に置くことができる。誘導または選択に応答するマーカー遺伝子の発現も、通常、縦列遺伝子の発現を示す。
あるいは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする核酸配列を含み、かつＢＡＣＨ ＧＰＣＲを発現する宿主細胞を、当業者に公知の種々の手順によって同定することができる。これらの手順には、ＤＮＡ−−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成およびタンパク質バイオアッセイまたは膜、溶液、または核酸またはタンパク質配列の検出および／または定量のためのチップベースのテクノロジーを含む免疫アッセイ技術が含まれるが、これらに限定されない。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列の存在を、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドのプローブまたはフラグメントを使用したＤＮＡ−−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成または増幅によって検出することができる。核酸増幅ベースのアッセイは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む形質転換体を検出するためのＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用したＢＡＣＨ ＧＰＣＲの発現の種々の検出および測定プロトコールは、当該分野で公知である。このような技術の例には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）が含まれる。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ上の妨害エピトープに応答するモノクローナル抗体を使用した２部位モノクローナルベースの免疫アッセイが好ましいが、競合結合アッセイを使用することができる。これらおよび他のアッセイが当該分野で十分に記載されている（例えば、Hampton,R.ら(1990、「血清学的方法：実験マニュアル」、第IV節、APS Press、St.Paul、Minn.）およびMaddox,D.E.ら(1983、J.Exp.Med.、158、1211-1216)）。
広範な種々の標識および結合技術が当業者に公知であり、種々の核酸およびアミノ酸アッセイで使用することができる。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリッド形成またはＰＣＲプローブの産生手段には、標識ヌクレオチドを使用したオリゴ標識、ニック翻訳、末端標識、またはＰＣＲ増幅が含まれる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のためにＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列またはそのフラグメントをクローン化することができる。このようなベクターは当該分野で公知であり、市販されており、これを使用してＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＰＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によってインビトロでＲＮＡプローブを合成することができる。これらの手順を、Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo、Mich.)、Promega(Madison、Wis.)、およびU.S.Biochemical Corp.(Cleveland,Ohio)などから販売されている種々の市販のキットを使用して行うことができる。検出を容易にするために使用することができる適切なレポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、発色剤、ならびに基質、補因子、インヒビター、磁性粒子などが含まれる。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に適切な条件下で培養することができる。使用した配列および／またはベクターに依存して、形質転換細胞によって産生されたタンパク質を、細胞膜に配置させ、分泌させ、または細胞内に含めることができる。当業者によって理解されるように、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核細胞膜を介してＢＡＣＨ ＧＰＣＲの分泌を指示するシグナル配列を含むようにデザインすることができる。他の構築を使用して、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列にＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする配列を結合させることができる。このような精製促進ドメインには、固定化金属上で精製可能なヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製可能なプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Immunex Corp.、Seattlw、Wash.）で使用可能なドメインが含まれるが、これらに限定されない。精製ドメインとＢＡＣＨ ＧＰＣＲコード配列との間に第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen、San Diego、Calif.）に特異的な配列などの切断可能なリンカー配列を含めて、精製を容易にすることができる。１つのこのような発現ベクターにより、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前にＢＡＣＨ ＧＰＣＲおよび６個のヒスチジン残基を含む融合タンパク視が発現される。ヒスチジン残基は、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（Porath,Jら、1992、Prot.Exp.Purif.、3、263-281に記載のIMIAC）での精製を容易にし、エンテロキナーゼ切断部位により、融合タンパクからのＢＡＣＨ ＧＰＣＲの精製手段が得られる。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Kroll,D.J.ら、1993、DNA Cell Biol.、12、441-453で得られる。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲのフラグメントを、組換え産生だけでなく、固相技術を使用した直接ペプチド合成によっても得ることができる（Merrifield J.、1963、J.Am.Chem.Soc.、85、2149-2154）。手動による技術または自動によってタンパク質合成を行うことができる。自動化合成を、例えば、Applied Biosystems 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を使用して行うことができる。種々のＢＡＣＨ ＧＰＣＲフラグメントを個別に合成し、その後、合わせて全長分子を産生することができる。
〔バイオセンサー〕
ＢＡＣＨポリペプチド、核酸、プローブ、抗体、発現ベクター、およびリガンドは、バイオセンサーとして（またはその産生に）有用である。
Aizawa、1998、Anal.Chem.Symp.、17、683によれば、バイオセンサーは、分子認識のための受容体（例えば、固定化抗体を含む選択層）またはＢＡＣＨ Ｇタンパク質共役受容体などの受容体、および測定値を送信する変換器の固有の組み合わせと定義される。このようなバイオセンサーの１つの群により、受容体の周囲の媒体との相互作用による、表面層の光学特性における変化を検出される。このような技術のうち、偏光解析法および表面プラズモン共鳴が特に挙げられる。ＢＡＣＨを組み込んだバイオセンサーを使用して、ＢＡＣＨリガンド（例えば、プリンもしくはプリンアナログまたはこれらのリガンドのアナログ）の存在またはレベルを検出することができる。このようなバイオセンサーの構築は、当該分野で周知である。
したがって、ＢＡＣＨ受容体を発現する細胞株を、［３Ｈ］リン酸イノシトールまたは他のセカンドメッセンジャーを介したＡＴＰなどのリガンドの検出用のレポーター系として使用することができる（Wattら、1998、J.Biol.Chem.、5月29日、273、22、14053-8）。受容体−リガンドバイオセンサーもまた、Hoffmanら、2000、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、10月10日、97(21)、11215-20に記載されている。ＢＡＣＨを含む光学バイオセンサーおよび他のバイオセンサーを使用して、Ｇタンパク質および例えばFiglerら、1997、Biochemistry、12月23日、36(51)、16288-99よびSarrioら、2000、Mol.Cell Biol.、2000年7月、20(14)、5164~74に記載の他のタンパク質との相互作用のレベルまたは存在を検出することもできる。バイオセンサーのセンサーユニットは、例えば、米国特許第５，４９２，８４０号に記載されている。
〔スクリーニングアッセイ〕
ホモログ、変異型、および誘導体を含む天然または組換えの本発明のＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドを、受容体に結合してＢＡＣＨを活性化する（アゴニスト）、またはその活性化を阻害する（アンタゴニスト）受容体に結合する化合物のスクリーニングプロセスで使用することができる。したがって、本発明のポリペプチドを使用して、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、および天然産物の混合物中の小分子基質およびリガンドの結合を評価することもできる。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドであるか、構造的または機能的な模倣物であり得る。Coliganら、「現代の免疫学プロトコール」、1(2)、第5章、1991を参照のこと。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドは、多数の病理を含む多くの生物学的機能を担う。したがって、一方でＢＡＣＨ ＧＰＣＲを刺激し、他方でＢＡＣＨ ＧＰＣＲ機能を阻害することができる化合物および薬物を見出すことが望ましい。一般に、アゴニストおよびアンタゴニストを、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、脊髄または脳の損傷による痛み、例えば、脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムス、眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症などの病態の治療および予防目的で使用する。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲタンパク質と相互作用することができる可能性がある候補化合物の合理的デザインは、本発明のポリペプチド分子の形状の構造研究に基づき得る。との部位が特定の他のタンパク質と相互作用するのかを決定する１つの手段は、物理的構造決定（例えば、Ｘ線結晶学または二次元ＮＭＲ技術）である。これらにより、アミノ酸残基が分子接触領域を形成するかに関するガイダンスが得られる。タンパク質構造決定の詳細な説明については、例えば、Blundell and Johnson、1976、Protein Crystallography、Academic Press、New Yorkを参照のこと。
合理的デザインの代替法は、一般に表面上で本発明のＢＡＣＨ受容体ポリペプチドを発現する適切な細胞の産生に関与するスクリーニング手順を使用する。このような細胞には、動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌が含まれる。ついで、受容体を発現する細胞（または発現した受容体を含む細胞膜）を、試験化合物に接触させて、機能的応答の結合、刺激、または阻害を観察する。例えば、本明細書中にさらに詳述するように、アフリカツメガエルの卵母細胞を、ＢＡＣＨ ｍＲＮＡまたはポリペプチドと共に注射し、試験化合物への曝露によって誘導された電流を測定した電圧クランプの使用によって測定する。
さらに、微量生理測定アッセイを使用して、ＢＡＣＨ受容体活性をアッセイすることができる。広範な種々のセカンドメッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が排出される。形成した酸は、主に細胞内シグナル伝達プロセスの促進に必要な代謝活性の増加の結果である。細胞周囲の培地のｐＨ変化は非常に小さいが、例えば、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ微量生理測定器（Molecular Devices Ltd.、Menlo Park、Calif.）によって検出可能である。したがって、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、本発明のＧタンパク質共役受容体などの細胞内シグナル伝達経路を利用するエネルギーと共役する受容体の活性化を検出することができる。
ＢＡＣＨ受容体を使用した各候補化合物の個別の試験の代わりに、候補リガンドのライブラリーまたはバンクを有利に産生してスクリーニングすることができる。したがって、例えば、２００個を超える受容体リガンドのバンクをスクリーニング用に構築した。バンクは、送信機、ヒト７回膜貫通（７ＴＭ）受容体を介して作用することが公知のホルモンおよびケモカイン；ヒト７ＴＭ受容体の推定アゴニストであり得る天然に存在する化合物；哺乳動物相対物が依然として同定されていない非ヒト生物活性ペプチド；および自然界で見出されないが既知の天然リガンドと共に７ＴＭ受容体を活性化する化合物を含む。このバンクを使用して、機能的アッセイ（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、微量生理測定器、卵母細胞電子生理学など、他を参照のこと）および本明細書中にさらに詳述されている結合アッセイを使用して既知のリガンドの受容体をスクリーニングする。しかし、現在のところ多数の哺乳動物受容体が同系の活性化リガンド（アゴニスト）または不活化リガンド（アンタゴニスト）ではないまま存在する。したがって、これらの状態の活性リガンドを、現在同定されているリガンド範囲内に含めることができない。したがって、本発明のＢＡＣＨ受容体を組織抽出物に対する機能的にスクリーニングして（カルシウム、ｃＡＭＰ、微量生理測定器、卵母細胞電子生理学など、機能的スクリーニング）、天然のリガンドも同定する。正の機能的応答を起こす抽出物を連続的にさらに分画し、活性化リガンドが単離および同定されるまで画分を本明細書中に記載のようにアッセイすることができる。
ＨＥＫ２９３細胞で発現する７ＴＭ受容体は、ＰＣＬの活性化およびカルシウム代謝および／またはｃＡＭＰ刺激または阻害と機能的に共役することが示されている。したがって、１つのスクリーニング技術は、受容体の活性化によって引き起こされる細胞外ｐＨまたは細胞内カルシウムの変化を測定する系において本発明のＢＡＣＨ ＧＰＣＲ受容体を発現する細胞（例えば、トランスフェクトしたアフリカツメガエル卵母細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３細胞）の使用を含む。この技術では、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させることができる。セカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達、ｐＨの変化、またはカルシウムレベルの変化）を測定して、潜在的な化合物が受容体を活性化または阻害するかどうかを決定する。
このような実験では、受容体トランスフェクト細胞またはベクター調節細胞におけるＨＥＫ２９３細胞中の基本的なカルシウムレベルは正常な１００ｎＭ〜２００ｎＭの範囲であることが認められる。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲまたは組換えＢＡＣＨ ＧＰＣＲを発現するＨＥＫ２９３細胞をフラ（fura）−２と共にロードし、その日の内に１５０個を超える選択リガンドまたは組織／細胞抽出物を、アゴニスト誘導カルシウム代謝について評価する。同様に、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲまたは組換えＢＡＣＨ ＧＰＣＲを発現するＨＥＫ２９３細胞を、標準的なｃＡＭＰ定量アッセイを使用してｃＡＭＰ産生の刺激または阻害について評価する。カルシウム一過性変動またはｃＡＭＰの変動を示すアゴニストをベクターコントロール細胞で試験して、応答が受容体を発現するトランスフェクト細胞に固有のものであるかどうかを決定する。
別の方法は、ＢＡＣＨ受容体媒介ｃＡＭＰの阻害または刺激および／またはアデニル酸シクラーゼ蓄積の決定による受容体インヒビターのスクリーニングを含む。このような方法は、細胞表面上で受容体を発現させるための、本発明の受容体での真核細胞のトランスフェクションを含む。ついで、細胞を本発明の受容体の存在下で潜在的アンタゴニストに曝露する。次いで、ｃＡＭＰの蓄積量を測定する。潜在的アンタゴニストが受容体に結合し、受容体結合を阻害した場合、受容体媒介ｃＡＭＰのレベル、またはアデニル酸シクラーゼ活性は減少する、または増加する。
本発明の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストの別の検出方法は、米国特許第5,482,835号（本明細書中で参照として組み込まれる）に記載の酵母ベースのテクノロジーである。
候補化合物がタンパク質、特に抗体またはペプチドである場合、候補化合物のライブラリーを、ファージディスプレイ技術を使用してスクリーニングすることができる。ファージディスプレイは、組換えバクテリオファージを使用した分子スクリーニングのプロトコールである。このテクノロジーは、各ファージまたはファージミドが特定の候補化合物を発現するように候補化合物のライブラリー由来の１つの化合物をコードする遺伝子でバクテリオファージを形質転換するステップを含む。形質転換バクテリオファージ（好ましくは固体支持体に固定されている）は、適切な候補化合物を発現し、そのファージコード上に表示される。本発明のポリペプチドまたはペプチドに結合することができる特定の候補化合物を、親和性相互作用に基づいた選択ストラテジーによって富化する。次いで、首尾のよい候補因子を特徴付ける。ファージディスプレイは、標準的な親和性リガンドスクリーニングテクノロジーよりも有利である。ファージ表面に三次元配置でより密接には天然に存在する高次構造に類似している候補因子が表示される。これにより、スクリーニングのための特異的且つより親和性の高い結合が得られる。
化合物ラブラリーの別のスクリーニング方法は、化合物ラブラリーを発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換された真核または原核宿主細胞を使用する。可変形態または固定された形態のこのような細胞を、標準的な結合パートナーアッセイに使用することができる。細胞応答の感度の高い検出方法が記載されている、Parceら、1989、Science、246、243-247およびOwickiら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87、4007-4011も参照のこと。競合アッセイは、化合物ラブラリーを発現する細胞を本発明のＢＡＣＨポリペプチドに結合することが公知の標識抗体（125Ｉ抗体）および結合組成物への結合親和性が測定された候補化合物などの試験サンプルと接触させるか、これらとインキュベートする場合に有用である。ポリペプチドの結合した遊離の標識結合パートナーを分離して、結合度を評価する。結合した試験サンプルの量は、ポリペプチドに結合した標識抗体の量に反比例する。
多数の技術のうちの任意の１つを使用して、結合した結合パートナーと遊離の結合パートナーを分離し、結合度を評価することができる。この分離ステップは、典型的には、フィルターへの接着後の洗浄、プラスチックへの接着後の洗浄、または細胞膜の遠心分離などの手順を含み得る。
さらに別のアプローチは、例えば、形質転換した真核または原核宿主細胞から抽出した可溶化、非精製、または可溶化精製ポリペプチドまたはペプチドを使用することである。これにより、特異性、自動化、高薬物処理の利点を有する「分子」結合アッセイが可能である。
候補化合物の別のスクリーニング技術は、例えば、本発明のポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する新規の化合物の高処理スクリーニングが得られるアプローチを含み、これは、1984年9月13日に公開された国際特許公開番号８４／０３５６４（Commonwealth Serum Labs.）で詳述されている。第１に、多数の異なる小さなペプチド試験化合物を、固体支持体（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の適切な表面）上で合成する（Fodorら、1991を参照のこと）。その後、全てのピンを、本発明の可溶化ポリペプチドと反応させ、洗浄する。次のステップは、結合したポリペプチドを検出するステップを含む。次いで、ポリペプチドと特異的に相互作用する化合物を同定する。
リガンド結合アッセイは、受容体の薬理学の直接的確認法を提供し、高処理形式に適用可能である。結合研究のために、受容体の精製リガンドを、高比活性（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放射性標識することができる。次いで、受容体に対するリガンド活性を減少させない放射性標識プロセスを決定する。膜および全細胞受容体の供給源の両方の実行可能なシグナル対ノイズ比を確立するために、緩衝液、イオン、ｐＨ、およびヌクレオチドなどの他のモジュレーターのアッセイ条件を至適化する。これらのアッセイでは、特異的受容体結合を、（全会合放射能−過剰な非標識競合リガンドの存在下で測定した放射能）と定義する。可能ならば、１以上の競合リガンドを使用して、残存する非特異的結合を定義する。
このアッセイは、候補化合物と直接または間接的に関連する標識の手段により受容体を保有する細胞への接着を検出されるところや、標識競合物とのアッセイに関連する競合において、候補化合物の結合を簡単に試験することができる。さらに、これらのアッセイは、受容体を保有する細胞表面での適切な検出系を使用して、候補化合物が受容体の活性化によってシグナルを発生させるかどうかを試験することができる。活性化のインヒビターを、一般に、既知のアゴニストの存在下でアッセイし、候補化合物の存在下でのアゴニストによる活性化を観察する。
さらに、このアッセイは、候補化合物をＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドを含む溶液と混合して混合物を形成させるステップと、混合物中のＢＡＣＨ ＧＰＣＲを測定するステップと、混合物のＢＡＣＨ ＧＰＣＲ活性を標準と比較するステップとを簡単に含むことができる。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ ｃＤＮＡ、タンパク質、およびタンパク質に対する抗体を使用して、細胞中のＢＡＣＨ ＧＰＣＲ ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加化合物の効果の検出アッセイを構成することもできる。例えば、当該分野で公知の標準的な方法によるモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用したＢＡＣＨ ＧＰＣＲタンパク質の分泌または細胞関連レベルの測定のためにＥＬＩＳＡを構築することができ、これを使用して安定に操作された細胞または組織からのＢＡＣＨ ＧＰＣＲを阻害または増強することができる薬剤（それぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストと呼ぶ）を発見することができる。スクリーニングアッセイを実施するための標準的な方法は、当該分野で周知である。
潜在的なＢＡＣＨ ＧＰＣＲアンタゴニストの例には、抗体、いくつかの場合、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲのリガンドに密接に関連するヌクレオチドおよびそのアナログ（プリンおよびプリンアナログを含む）、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質（例えば、リガンドのフラグメント）、または受容体の活性が阻害されるように応答を惹起しない受容体に結合する小分子が含まれる。
したがって、本発明はまた、本発明のＢＡＣＨポリペプチドおよび／またはペプチドに特異的に結合することができる化合物を提供する。
用語「化合物」は、生体高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、または有機分子）などの化合物（天然または合成）、細菌、植物、真菌、または動物（特に哺乳動物）の細胞もしくは組織などの生体物質から作製した抽出物、さらに無機元素または分子をいう。好ましくは、化合物は抗体である。
このようなスクリーニングの実施に必要な材料を、スクリーニングキットにパッケージングすることができる。このようなスクリーングキットは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチド産生を減少または増強するＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドまたは化合物のアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、酵素などの同定に有用である。スクリーニングキットは、（ａ）ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチド、（ｂ）ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドを発現する組換え細胞、（ｃ）ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞膜、または（ｄ）ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドに対する抗体を含む。スクリーニングキットは、任意選択的に使用説明書を含み得る。
〔トランスジェニック動物〕
本発明は、正常な発現レベルと比較して増加または減少したレベルで、天然もしくは組換えＢＡＣＨ ＧＰＣＲまたはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体を発現することができるトランスジェニック動物をさらに含む。機能的ＢＡＣＨ受容体を発現しないトランスジェニック動物（「ＢＡＣＨノックアウト」）も含まれる。ＢＡＣＨノックアウトは、ＢＡＣＨ遺伝子の１つまたは複数の機能的変異を含み、ＢＡＣＨ遺伝子が欠失または置換されたＢＡＣＨ遺伝子またはこの遺伝子の任意の部分の機能的破壊の結果をして得ることができる。変異には、１つの点変異が含まれ、ＢＡＣＨのコード領域または非コード領域を標的することができる。
好ましくは、このようなトランスジェニック動物は、ブタ、ヒツジ、またはげっ歯類などの非ヒト動物である。最も好ましくは、トランスジェニック動物は、マウスまたはラットである。このようなトランスジェニック動物をスクリーニング手順で使用して、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを同定し、インビボでの疾患治療としてその有効性を試験することができる。
ＢＡＣＨについて無効なマウスを、種々の目的で使用することができる。例えば、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ産生を欠失するように操作されたトランスジェニック動物をアッセイで使用して、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを同定することができる。１つのアッセイは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ受容体の非存在下で生理学的応答が得られるかどうかを決定することで、潜在的な薬物（候補リガンドまたは化合物）を評価するようにデザインされる。上記のトランスジェニック動物への薬物の投与および特定の応答についての動物のアッセイによってこれを行うことができる。このアッセイで任意の生理学的パラメータを測定することができるにもかかわらず、好ましい応答には、疾患耐性の変化；炎症反応の変化；腫瘍感受性の変化：血圧の変化；血管新生；摂食挙動の変化；体重の変化；骨密度の変化；体温の変化；インスリン分泌；ゴナドトロピン分泌；鼻腔および気管支分泌；血管収縮；記憶喪失；不安；反射低下または反射亢進；痛みまたはストレス反応の、１つまたは複数の応答が含まれる。
ＢＡＣＨノックアウト動物由来の組織を受容体結合アッセイで使用して、潜在的な薬物（候補リガンドまたは化合物）がＢＡＣＨ受容体に結合するかどうかを決定することができる。このようなアッセイを、ＢＡＣＨ受容体産生が欠失するように操作されたトランスジェニック動物由来の第１の受容体調製物、および任意の同定されたＢＡＣＨリガンドまたは化合物に結合することが公知の供給源由来の第２の受容体調製物を得ることによって行うことができる。一般に、第１および第２の受容体調製物は、これらが得られた供給源以外の全ての点で類似する。例えば、トランスジェニック動物（上記および下記）由来の脳組織をアッセイで使用する場合、正常な（野生型）動物由来の類似の脳組織を、第２の受容体調製の供給源として使用する。各受容体調製物を、ＢＡＣＨ受容体に結合することが公知のリガンドのみ、および候補リガンドまたは化合物の存在下の両方でインキュベートする。好ましくは、候補リガンドまたは化合物を、いくつかの異なる濃度で試験する。
公知のリガンドでの結合を試験化合物に置換した程度を、第１および第２の受容体調製物の両方について決定する。トランスジェニック動物由来の組織をアッセイで直接使用するか、組織を処理して膜または膜タンパク質を単離し、これら自体をアッセイで使用することができる。好ましいトランスジェニック動物は、マウスである。結合アッセイに適合する任意の手段を使用してリガンドを標識することができる。これには、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、または化学発光標識（および上記でさらに詳述されている他の標識技術）が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ受容体のアンタゴニストを、機能的ＢＡＣＨを発現する野生型動物およびＢＡＣＨ受容体機能の減少または消滅に関連する任意の表現型特性を示す動物への候補化合物などの投与によって同定することができる。
詳細な非ヒトトランスジェニック動物の作製方法を、以下にさらに詳述する。トランスジェニック遺伝子構築物を動物の生殖細胞系に移入して、トランスジェニック哺乳動物を作製することができる。例えば、１つまたはいくつかの構築物のコピーを、標準的なトランスジェニック技術によって哺乳動物の胚のゲノムに組み込むことができる。
実施形態の例では、非ヒト動物の生殖細胞系への導入遺伝子の移入によって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を産生する。種々の発生段階の胚標的細胞を使用して、導入遺伝子を移入することができる。胚標的細胞の発生段階によって異なる方法を使用する。本発明を実施するために使用した任意の動物の特定の株を、身体全体の健康状態の良さ、胚産生の良さ、胚内での前核の視認性の良さ、および再生適性の良さについて選択した。さらに、ハプロタイプは有意な因子である。
胚への導入遺伝子の移入を、当該分野で公知の任意の手段（例えば、微量注入、エレクトロポレーション、またはリポフェクション）によって行うことができる。例えば、哺乳動物受精卵の前核へ構築物を微量注入することで、ＢＡＣＨ受容体導入遺伝子を哺乳動物に移入して、発生した哺乳動物の細胞中に構築物の１つまたは複数のコピーを保持させることができる。受精卵への導入遺伝子構築物の移入後、卵を種々の時間インビトロでインキュベートするか代理宿主に再移植するかその両方を行うことができる。成熟までのインビトロインキュベーションは、本発明の範囲内である。１つの一般的な方法は、胚を種に依存して約１〜７日間インビトロでインキュベートし、その後代理宿主に再移植することである。
遺伝子導入操作を行った胚の子孫を、組織セグメントのサザンブロット分析によって構築物の存在について試験することができる。外因性クローン化構築物の１つまたは複数のコピーは、このようなトランスジェニック胚のゲノムに安定に組み込まれたままであり、遺伝子導入によって付加した構築物を保有する不変のトランスジェニック哺乳動物株を確立することが可能である。
遺伝子導入によって改変した哺乳動物の同腹子を、出生後に子孫のゲノムへの構築物の組み込みについてアッセイすることができる。好ましくは、所望の組換えタンパク質産物またはそのセグメントをコードするＤＮＡ配列に対応するプローブを、その子孫由来の染色体物質にハイブダイズさせることによって、このアッセイを行う。ゲノム中に少なくとも１つの構築物のコピーを含むことが見出された哺乳動物の子孫を、成熟するまで成長させる。
本発明の目的のために、接合子は、本質的に、完全な生物に成長させることができる二倍体細胞の形成である。一般に、接合子は、配偶子（単数または複数）由来の２つのハプロイド核の融合によって天然または人為的に形成された核を接触させた卵から構成される。したがって、配偶子の核は、天然に適合するもの（すなわち、分化して機能する生物に成長することができる生きた接合子が得られるもの）でなければならない。一般に、正倍数の接合子が好ましい。異数体の接合子が得られた場合、いずれかの配偶子を起源とする１つを超える正倍数の生物によって染色体数は変化しないはずである。
類似の生物学的検討材料に加えて、物理的検討材料はまた、接合子の核または接合子の核の一部を形成する遺伝子物質に添加することができる外因性遺伝物質の量（例えば、体積）を支配する。遺伝子物質が取り除かれない場合、添加することができる外因性遺伝物質の量は、物理的に破壊されること無く吸収される量によって制限される。一般に、挿入される外因性遺伝物質の体積は、約１０ピコリットルを超えない。添加の物理的効果は、接合子の生存能力を物理的破壊するほど高くてはならない。得られた接合子の遺伝物質（外因性遺伝物質を含む）が、接合子の機能的な生物への分化および発達を生物学的に開始および維持することができなければならないので、ＤＮＡ配列の数および多様性の生物学的限度は、特定の接合子および外因性遺伝物質によって変化し、この限度は当業者に容易に明白である。
接合子に添加される導入遺伝子構築物のコピー数は、添加した外因性遺伝物質の総量に依存し、遺伝子が形質転換可能な量である。理論的にはたった１つのコピーが必要であるが、一般に、１つのコピーが機能的であることを確実にするために多数のコピー（例えば、１，０００〜２０，０００コピーの導入遺伝子構築物）を使用する。本発明に関して、外因性ＤＮＡ配列の表現型発現の増強には、各挿入外因性ＤＮＡ配列の１つを超える機能性コピーを有することがしばしば有利である。
細胞、核膜、または他の既存の細胞構造もしくは遺伝子の構造を破壊しない限り、核の遺伝物質に外因性遺伝物質を付加する任意の技術を利用することができる。外因性遺伝物質を、微量注入によって核の遺伝子物質に挿入することが好ましい。細胞の微量注入および細胞の構造は公知であり、当該分野で使用されている。
標準的な方法を使用して、再移植を行う。通常、代理宿主を麻酔し、卵管に胚を挿入する。特定の宿主に移植した胚の数は種によって変化し、通常、種が天然に産生する子孫の数に匹敵する。
代理宿主のトランスジェニック子孫を、任意の適切な方法によって導入遺伝子の存在および／または発現についてスクリーニングすることができる。導入遺伝子の少なくとも一部に相補的なプローブを使用したサザンブロット分析またはノーザンブロット分析によってスクリーニングを行う場合がある。導入遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を使用したウェスタンブロット分析を、導入遺伝子産物の存在のスクリーニングのための代替法またはさらなる方法として使用することができる。典型的には、尾の組織からＤＮＡを調製し、導入遺伝子についてサザン分析またはＰＣＲによって分析する。あるいは、最も高いレベルで導入遺伝子を発現すると考えられる組織または細胞を、サザン分析またはＰＣＲを使用して導入遺伝子の存在および発現について試験するが、この分析に任意の組織または細胞型を使用することができる。
導入遺伝子の存在を評価するための代替法またはさらなる方法には、酵素などの適切な生化学的アッセイおよび／または免疫アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性の組織学的染色、フローサイトメトリー分析が含まれるが、これらに限定されない。血液分析はまた、血液中の導入遺伝子産物の存在の検出ならびに種々の型の血液細胞および他の血液成分に対する導入遺伝子の効果の評価に有用であり得る。
トランスジェニック動物の子孫を、トランスジェニック動物と適切なパートナーとの交配またはトランスジェニック動物から得た卵および／または精子のインビトロ受精によって得ることができる。パートナーとの交配が行われた場合、パートナーはトランスジェニックおよび／またはノックアウトであってもなくてもよく、トランスジェニックである場合、同一もしくは異なる導入遺伝子またはその両方を含み得る。あるいは、パートナーは、親の系列であり得る。インビトロ受精を使用した場合、受精した胚を、代理宿主に移植するか、インキュベートするか、その両方を行うことができる。いすれかの方法を使用して、子孫を、上記の方法または他の適切な方法によって導入遺伝子の存在について評価することができる。
本発明によって産生されたトランスジェニック動物は、外因性遺伝物質を含む。上記のように、一定の実施形態では、外因性遺伝物質は、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ受容体を産生するＤＮＡ配列である。さらに、このような実施形態では、配列は、好ましくは特定の細胞型で導入遺伝子産物を発現させる転写調節エレメント（例えば、プロモーター）に結合している。
レトロウイルス感染を使用して、非ヒト動物に導入遺伝子を移入することもできる。成長した非ヒト胚を、胚盤胞期までインビトロで培養することができる。この間、卵割球は、レトロウイルス感染の標的であり得る（Jaenich,R.、1976、PNAS、73、1260-1264）。透明帯を除去する酵素処理によって卵割球が有効に感染される（「マウス胚の操作」、Hogan編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、1986）。導入遺伝子を移入するために使用したウイルスベクター系は、典型的には、導入遺伝子を保有する複製欠損レトロウイルスである（Jahnerら、1985、PNAS、82、6927-6931;Van der Puttenら、1985、PNAS、82、6148-6152）。ウイルス産生細胞の単分子層上での卵割球の培養によって、容易且つ有効にトランスフェクションを行う（Van der Putten、前出;Stewartら、1987、EMBO J.6、383-388）。あるいは、後期に感染させることができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を、胞胚腔に注入することができる（Jahnerら、1982、Nature、298、623-628）。トランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞のサブセットにおいてのみ組み込まれるので、創始動物（founder）のほとんどは導入遺伝子についてモザイクである。さらに、創始動物は、一般に子孫で隔離されたゲノム中の異なる位置での導入遺伝子の種々のレトロウイルス挿入を含み得る。さらに、妊娠中期の子宮内レトロウイルス感染によって生殖細胞系に導入遺伝子を移入することが可能である（Jahnerら、1982、前出）。
導入遺伝子移入のための第３の標的細胞型は、胚幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養し胚と融合させた移植前の胚から得られる（Evansら、1981、Nature、292、154-156;Bradleyら、1984、Nature、309、255-258;Gosslerら、1986、PNAS、83、9065-9069;およびRobertsonら、1986、Nature、322、445-448）。ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介形質導入によって導入遺伝子を有効にＥＳ細胞に移入することができる。その後、このような形質転換ＥＳ細胞を、非ヒト動物由来の芽細胞と組み合わせることができる。その後、ＥＳ細胞は胚にコロニー形成し、得られたキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。概説については、Jaenisch,R.、1988、Science、240、1468-1474を参照のこと。
本発明者らはまた、好ましくは上記のようにＢＡＣＨ受容体機能についてのモデルとしてＢＡＣＨ遺伝子の変化によって特徴付けられる非ヒトトランスジェニック動物を提供する。遺伝子の代替物には、欠失もしくは機能変異の他の損失、標的変異またはランダム変異を含む核酸配列を有する外因性遺伝子の移入、別の種由来の外因性遺伝子の移入、またはその組み合わせが含まれる。トランスジェニック動物は、代替物についてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれでもよい。動物および動物由来の細胞は、ＢＡＣＨ受容体機能を調整することができる生物活性薬のスクリーニングに有用である。このスクリーニング法は、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、脊髄または脳の損傷による痛み；例えば、脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇またはバリスムス；眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症を含むＢＡＣＨ関連疾患の潜在的治療の特異性および作用の決定に特に有用である。動物は、正常な脳、心臓、脾臓、および肝臓の機能におけるＢＡＣＨ受容体の役割を調査するためのモデルとして有用である。
本発明の別の態様は、機能的に破壊された内因性ＢＡＣＨ遺伝子を有し、そのゲノム中に異種ＢＡＣＨ（すなわち、別の種由来のＢＡＣＨ）タンパク質をコードする導入遺伝子を有し、これを発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。好ましくは、動物はマウスであり、異種ＢＡＣＨはヒトＢＡＣＨである。ヒトＢＡＣＨを用いて再構築された本発明の動物またはこのような動物由来の細胞株を使用して、インビボおよびインビトロでヒトＢＡＣＨを阻害する薬剤を同定することができる。例えば、ヒトＢＡＣＨによってシグナル伝達を誘導する刺激を、試験すべき薬剤の存在下および非存在下で動物または細胞系列に与え、動物または細胞系列の反応を測定することができる。インビボまたはインビトロでヒトＢＡＣＨを阻害する薬剤を、薬剤の非存在下での反応と比較した薬剤の存在下での反応の減少に基づいて同定することができる。
本発明はまた、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ欠失トランスジェニック非ヒト動物（「ＢＡＣＨ ＧＰＣＲノックアウト」または「ＢＡＣＨヌル」）を提供する。このような動物は、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ活性が低いか全く発現しない動物であり、好ましくは結果としてＢＡＣＨ ＧＰＣＲゲノム配列が破壊または欠失している。内因性ＢＡＣＨ ＧＰＣＲゲノム配列を、野生型ＢＡＣＨ配列の非機能的部分を含み得るヌル対立遺伝子に置換することができる。例えば、内因性ＢＡＣＨ ＧＰＣＲゲノム配列を、外因性配列（例えば、受容体配列および／または選択マーカー）を含み得る破壊配列を含むＢＡＣＨの対立遺伝子に置換することができる。好ましくは、ＢＡＣＨノックアウトマウス中の内因性ＢＡＣＨ ＧＰＣＲゲノム配列を、１つまたは複数、好ましくは全ての膜貫通配列がこのような破壊配列、好ましくはｌａｃＺ配列およびネオマイシン耐性配列に置換されたＢＡＣＨの対立遺伝子と置換する。好ましくは、機能的に破壊されたゲノムＢＡＣＨ配列は、配列番号１０に示すマウスＢＡＣＨゲノム配列を含む。
好ましくは、このような動物配列は、ＧＰＣＲ活性を発現しない。より好ましくは、動物は、配列番号３または配列番号５に示すＢＡＣＨ ＧＰＣＲの活性を発現しない。以下でさらに詳述するように、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲノックアウトマウスを、当該分野で公知の種々の手段によって作製することができる。ＢＡＣＨノックアウトマウスの構築についての特定の記載を、以下の実施例２に開示する。
本発明はまた、宿主細胞中の機能的に破壊されたＢＡＣＨ遺伝子のための核酸構築物に関する。核酸構築物は、（ａ）非相同性置換部分と、（ｂ）前記非相同性置換部分の上流に存在する第１の相同領域であって、前記第１の相同領域は、第１のＢＡＣＨ遺伝子配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する第１の相同領域と、（ｃ）前記非相同性置換部分の下流に存在する第２の相同領域であって、前記第２の相同領域は第２のＢＡＣＨ遺伝子配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、前記第２のＢＡＣＨ遺伝子配列が天然に存在する内因性ＢＡＣＨ遺伝子中に前記第１のＢＡＣＨ遺伝子配列の下流に存在する第２の相同領域とを含む。さらに、第１および第２の相同領域は、核酸分子を宿主細胞に移入した場合に宿主細胞中で核酸構築物と内因性ＢＡＣＨ遺伝子との間の相同組換えに十分な長さである。このましい実施形態では、非相同置換部分は、好ましくはｌａｃＺおよび正の選択発現カセットを含み、好ましくは調節エレメントに作動可能に連結したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む発現レポーターを含む。
好ましくは、第１および第２のＢＡＣＨ遺伝子配列は、配列番号２、配列番号４もしくはマウスＢＡＣＨゲノム配列（配列番号１０）またはそのホモログ、変異型、もしくは誘導体に由来する。好ましくは、構築物は、図４に記載の構造を含む。
本発明の別の態様は、本発明の核酸構築物が組み込まれた組換えベクターに関する。本発明のさらに別の態様は、本発明の核酸構築物が移入されることにより核酸構築物と宿主細胞の内因性ＢＡＣＨ遺伝子との間で相同組換えが起こり、内因性ＢＡＣＨ遺伝子機能が破壊される宿主細胞に関する。宿主細胞は、通常、肝臓、脳、脾臓、もしくは心臓またはマウス胚幹細胞などの多能性細胞由来のＢＡＣＨを発現する哺乳動物細胞であり得る。核酸構築物が移入され、内因性ＢＡＣＨ遺伝子で相同組換えされた胚性幹細胞のさらなる成長により、胚性幹細胞の子孫であり、そのゲノム中に破壊されたＢＡＣＨ遺伝子を保有する細胞を有するトランスジェニック動物が産生される。次いで、その生殖細胞系中のＢＡＣＨ遺伝子が破壊された動物を選択し、交配して体細胞および胚細胞中のＢＡＣＨ遺伝子が破壊された動物を産生することができる。次いで、このようなマウスを、ＢＡＣＨ遺伝子破壊についてのホモ接合性と交配することができる。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ欠失トランスジェニック動物を以下のように作製することができる。
（ＢＡＣＨ遺伝子標的ベクターの構築）
標準的な技術により、プローブとしてヒトオープンリーディングフレームｃＤＮＡ配列（配列番号１）を使用して、マウスＢＡＣＨゲノムクローンを、ＨＧＭＰ（Hinxton、UK）から得たマウス巨大インサートＰＡＣライブラリーから単離する。単離したマウスＢＡＣＨゲノムクローンを、小さなオリゴヌクレオチドプローブおよび標準的技術を使用してＢＡＣＨ遺伝子領域中に制限マッピングする。マウスゲノムＢＡＣＨ配列を、配列番号１０に示す。
標的ベクターにクローン化するように相同アームをデザインすることができるようにマウスゲノム遺伝子座を部分的に配列決定する。マウスＢＡＣＨ遺伝子は、１つのエクソン遺伝子である。５’相同アームおよび３’相同アームをＰＣＲによって増幅し、フラグメントを標的ベクターにクローン化する。これらのアームが相同組換えできるような長さに任意の適切なサイズを選択することができる；例えば、５’アームは、１ｋｂと２ｋｂとの間であり（例えば、１．１５ｋｂ）、３’アームは、約４ｋｂのサイズであり得る。
これらのアームの位置を、７回膜貫通伸長領域の欠失によってＢＡＣＨ遺伝子を機能的に破壊するように選択する。欠失ＢＡＣＨ配列を、ＢＡＣＨ遺伝子と同一の方向で自己促進ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子から構成される選択カセットの上流の、内因性遺伝子発現レポーター（ｌａｃＺとインフレームで融合）から構成される非相同配列と置換した標的ベクターを調製する。
（胚性幹細胞のトランスフェクションおよび分析）
胚性幹細胞（Evans and Kaufman、1981）を、２０％のウシ胎児血清、１０％の新生ウシ血清、２ｍＭのグルタミン（非必須アミノ酸）、１００μＭの２−メルカプトエタノール、および５００ｕ／ｍｌの白血球阻害因子を補足したダルベッコ改変イーグル培地中で成長させたネオマイシン耐性胚性線維芽支持細胞膜上で培養する。培地を毎日交換し、ＥＳ細胞を３日毎に継代培養する。５×１０6個のＥＳ細胞を、エレクトロポレーション（静電容量２５μＦおよび４００ボルト）によって５μｇの線状化プラスミドでトランスフェクトする。２４時間のエレクトロポレーション後、トランスフェクトした細胞を、２００μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む培地中で９日間培養する。クローンを９６ウェルプレートに拾い、複製および拡大し、その後ＰＣＲでスクリーニングして、内因性ＢＡＣＨ遺伝子と標的構築物との間で相同組換えが起こったクローンを同定する。２００個の拾い上げたクローンから、７個の標的を同定する。全て標準的な手順を使用して（Russら、2000）、これらのクローンを拡大してレプリカを凍結させ、外部５’および３’プローブを使用した標的事象のサザンブロット確認に十分に高い質のＤＮＡを調製した。
（ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ欠失マウスの作製）
Ｃ５７ＢＬ／６雌および雄マウスを交配し、妊娠３．５日目に胚盤胞を単離する。胚盤胞あたり選択クローン由来の１０〜１２個のクローンを注射し、７〜８個の胚盤胞を偽妊娠Ｆ１雌の子宮に移植する。５匹のキメラの子が誕生し、そのうちの１匹の雄が１００％アグーチである（標的化クローン由来の細胞を示す）。この雄キメラを雌、ＭＦ１、および１２９マウスと交配し、生殖細胞系の伝達を、アグーチ被覆色およびＰＣＲ遺伝子分類によって決定する。
〔抗体〕
本発明は、さらに、ＢＡＣＨポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異型、もしくは誘導体に結合する抗体を提供する。特に、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ関連疾患の診断におけるＢＡＣＨ発現を提供する。他の好ましい抗体には、治療活性を有する（すなわち、治療様式で使用して任意のＢＡＣＨ ＧＰＣＲ関連疾患を治療、管理、または予防することができる）抗体が含まれる。
本発明の目的のために、用語「抗体」には、特記しない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。このようなフラグメントには、標的物質への結合活性が保持さ完全な抗体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質、および抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質が含まれる。抗体およびそのフラグメントは、例えば、ＥＡ−Ａ−２３９４００に記載のヒト化抗体であり得る。さらに、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号および同第６，０７５，１８１号に記載の完全なヒト可変領域（または他のフラグメント）を有する抗体を使用することもできる。中和抗体（すなわち、ＢＡＣＨの任意の生物活性を阻害する抗体）は、診断および治療に特に好ましい。
免疫化またはファージディスプレイライブラリーの使用などの標準的な技術によって抗体を産生することができる。
本発明のポリペプチドまたはペプチドを使用し、公知の技術によって、抗体を開発することができる。このような抗体は、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲタンパク質またはホモログ、フラグメントなどに特異的に結合することができる。
ポリクローナル抗体を所望する場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、本発明のポリペプチドまたはペプチドを含む免疫原性組成物で免疫化することができる。宿主の種に依存して、種々のアジュバントを使用して、免疫応答を増加させることができる。このようなアジュバントには、フロイントミネラルゲル（水酸化アンモニウムなど）および界面活性剤（リゾレシチン、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなど）が含まれるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（Bacilli Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウムーパルヴムは、精製された場合使用することができる潜在的に有用なヒトアジュバントであり、アミノ酸配列を刺激に対する全身防御の目的で抵抗力の弱い個体に免疫学的に投与する。
免疫化動物由来の血清を採取し、公知の手順で処理する。本発明のポリペプチドから得ることができるエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合、ポリクローナル抗体を、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清の産生および処理技術は、当該分野で公知である。このような抗体を作製することができるように、本発明はまた、動物またはヒトにおける免疫原として使用するために別のアミノ酸配列にハプテン化した本発明のアミノ酸配列またはそのフラグメントを提供する。
本発明のポリペプチドまたはペプチドから得ることができるエピトープに指向するモノクローナル抗体を、当業者は容易に産生することもできる。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の一般的な作製方法は、周知である。不死化抗体産生細胞株を、細胞融合、癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクションなどの他の技術によって作製することができる。オービット（orbit）エピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、種々の目的（すなわち、イソ型およびエピトープ親和性）についてスクリーニングすることができる。
培養中に連続細胞株によって抗体分子が産生される任意の技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる。これらには、Koehler and Milstein(1975、Nature、256、495-497)に最初に記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら、1983、Immunol.Today、4、72;Coteら、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.、80、2026-2030）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、77-96、Alan R.Liss、Inc.、1985）が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、「キメラ抗体」産生のために開発された技術（適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス九対遺伝子のスプライシング）を使用することができる（Morrisonら、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.、81、6851-6855;Neubergerら、1984、Nature、312、604-608;Takedaら、1985、Nature、314、452-454）。あるいは、一本鎖抗体の産生について記載した技術（米国特許第４，９４６，７７９号）を適用して、一本鎖抗体に特異的な物質を産生することができる。
本発明のポリペプチドまたはペプチドから得ることができるエピトープに指向する抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）は特に診断で有用であり、中和する抗体は、受動免疫治療で有用である。特にモノクローナル抗体を使用して、抗イディタイプ抗体を惹起することができる。抗イディオタイプ抗体は、保護が望まれる物質および／または薬剤の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を惹起する技術は、当該分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体もまた、治療で有用であり得る。
Orlandiら（1989、Proc.Natl.Acad.Sci.、86、3833-3837）およびWinter G and Milstein C(1991、349、293-299)に開示のように、リンパ球集団中のインビボ産生の誘導または高特異的結合試薬の組換え免疫グロブリンライブラリーもしくはパネルのスクリーニングによって、抗体を産生することもできる。
ポリペプチドまたはペプチドの特異的結合部位を含む抗体フラグメントを、作製することもできる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）2フラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド結合の還元によって作製することができるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速且つ容易に同定されるようにＦａｂ発現ライブラリーを構築することができる（Huse WDら、1989、Science、256、1275-1281）。
一本鎖抗体の産生技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体産生することもできる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物を使用して、ヒト化抗体を発現させることもできる。
上記の抗体を使用して、ポリペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定するか、親和性クロマトグラフィーによってポリペプチドを精製することができる。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドに対する抗体を使用して、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、脊髄または脳の損傷による痛み；例えば、脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムス；および眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症を含むＢＡＣＨ関連疾患を治療することもできる。
〔診断アッセイ〕
本発明はまた、診断試薬としての診断または遺伝子分析用のＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ならびにそのホモログ、変異型、および誘導体）の使用に関する。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ核酸（ホモログ、変異型、および誘導体を含む）と相補的かそれとハイブリッド形成することができる核酸ならびＢＡＣＨポリペプチドに対する抗体もまた、このようなアッセイで有用である。
本発明者らは、ＢＡＣＨポリペプチドまたは核酸の天然の変異型およびＢＡＣＨ関連疾患の診断におけるこのような天然の変異型の使用を提供する。ＢＡＣＨ多型には、核酸レベルでの相違を含むことができ、アミノ酸レベルで相違に影響を与えても与えなくてもよい。好ましくは、このようなＢＡＣＨ変異型または変異体は、アミノ酸レベルでの変化を含む。しかし、本発明はまた、非コード領域（例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの発現調節領域）中で起こるＢＡＣＨ多型を含む。
ＢＡＣＨの多型には、１つまたは複数の核酸の欠失、１つまたは複数の核酸の挿入、逆位などが含まれる。好ましくは、ＢＡＣＨ多型は、１つのヌクレオチド多型を含む。
ＢＡＣＨの多型を、集団中の個体間の適切なレベル（核酸またはタンパク質のいずれか）での配列の比較によって同定することができる。配列の相違は、異なる物理的性質を反映し、これらの検出技術は、物理的性質の変化の検出を信頼することができる。例えば、１つのヌクレオチド多型を、制限フラグメントの長さの多型（すなわち、制限酵素消化に対する感受性の相違）として検出することができる。さらに、ＳＮＰＳは、ゲル中の核酸フラグメントまたはタンパク質フラグメントの移動度または可動性に影響を与え得る。
ＢＡＣＨの非コード多型を、ＢＡＣＨの非コード領域の配列決定によって同定することができる。例えば、エンハンサーおよびプロモーターなどのＢＡＣＨ遺伝子の調節領域を配列決定して多型を同定することができる。ＢＡＣＨ発現レベルに対するこのような非コード多型の効果を、変異ＢＡＣＨ配列を含むトランスジェニックマウス（下記）の構築および細胞株へのトランスフェクションによって同定することができる。それぞれの場合、ＢＡＣＨの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲまたは抗体ウェスタン染色によって検出して、ＢＡＣＨ発現調節における変異の効果を同定する。有用なＢＡＣＨ多型は、ＢＡＣＨレベルの上方または下方制御のいずれかによって発現レベルを調整するものである。
したがって、本発明は、生物中でＢＡＣＨの発現レベルを調整することができるＢＡＣＨの非コード領域、好ましくはＢＡＣＨの調節領域、好ましくはＢＡＣＨのプロモーターおよび／またはエンハンサーの変異型または変異体を提供する。本発明はまた、２つまたはそれ以上のこのような変異体、変異型、または多型、好ましくは非コード多型の組を提供する。本発明はまた、このような位置の変化がＢＡＣＨの発現レベルに影響を与える核酸および／またはアミノ酸位置を同定するためのこのような変異型もしくは多型または変異型組の使用を提供する。本発明はまた、ＢＡＣＨの変異型もしくは変異体または多型、好ましくは非コード多型を含むトランスジェニック動物を提供する。
機能障害に関連するＢＡＣＨ ＧＰＣＲ遺伝子の変異形態の検出により、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲの過少発現、過剰発現、および発現の変化に起因する疾患または疾患に対する感受性の診断に加えるか定義することができる診断ツールが得られる。ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ遺伝子（調節配列を含む）が変異した個体を、種々の技術によってＤＮＡレベルで検出することができる。
例えば、ＤＮＡを患者から単離し、ＢＡＣＨのＤＮＡ多型パターンを同定することができる。同定したパターンを、ＢＡＣＨの過剰発現、過少発現、または異常発現に関連する疾患を罹患していることが公知の患者のコントロールと比較する。次いで、ＢＡＣＨ関連疾患に関連する遺伝子多型パターンを発現する患者を同定することができる。当該分野で公知の技術によって、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ遺伝子の遺伝子分析を行うことができる。例えば、ＢＡＣＨ対立遺伝子のＤＮＡ配列の決定、ＲＦＬＰもしくはＳＮＰ分析などによって個体をスクリーニングすることができる。ＢＡＣＨの遺伝子配列またはその発現を調節する任意の配列のＤＮＡ多型の存在の検出によってＢＡＣＨの過剰発現、過少発現、または異常発現に関連する疾患についての遺伝子素因を有する患者を同定することができる。
次いで、このようにして同定した患者を治療して、ＢＡＣＨ関連疾患の発症を予防するか、より積極的にはＢＡＣＨ関連疾患の初期段階で治療して疾患のさらなる発症または進行を予防することができる。ＢＡＣＨ関連疾患には、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、および脊髄または脳の損傷による痛み；例えば、脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムス；嚢胞性線維症および過活動性膀胱のいずれか１つが含まれる。
本発明は、さらに、ＢＡＣＨ関連疾患に関連する患者の遺伝子多型パターンの同定用キットを開示する。キットは、ＤＮＡサンプル採取手段およびコントロールサンプルと比較してＢＡＣＨ関連疾患に対する患者の感受性を同定する遺伝子多型パターン同定用手段を含む。ＢＡＣＨポリペプチドおよび／またはこのようなポリペプチド（またはそのフラグメント）に対する抗体を含むＢＡＣＨ関連疾患診断用キットもまた提供する。
診断用核酸を、血液、尿、唾液、組織生検、または盲検物質などの患者の細胞から得ることができる。好ましい実施形態では、吸収紙上で回収した血液を用いた患者のフィンガープリック試験から得た血球からＤＮＡを得る。さらに好ましい実施形態では、AmpliCard.TM（シェフィールド大学、薬学部、Royal Hallamshire Hospital、Sheffield、England、S10 2JF）で採血する。
検出にＤＮＡを直接使用するか、分析前にＰＣＲまたは他の増幅技術の使用によって酵素を使用して増幅することができる。標的配列のＰＣＲ反応増幅が行われるように、目的の遺伝子内の特異的多型ＤＮＡ領域を標的するオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを調製することができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを、類似の様式でテンプレートとして使用することもできる。次いで、制限酵素を使用してテンプレートＤＮＡから増幅されたＤＮＡ配列を分析して、増幅配列中に存在する遺伝子多型を決定し、それにより患者の遺伝子多型プロフィールを得ることができる。制限フラグメントの長さを、ゲル分析によって同定することができる。あるいは、それと共に、ＳＮＰ（一塩基多型）分析などの技術を使用することができる。
正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズ変化によって欠失および挿入を検出することができる。標識ＢＡＣＨ ＧＰＣＲヌクレオチド配列への増幅ＤＮＡのハイブリッド形成によって点変異を同定することができる。ＲＮアーゼ消化または融解温度の差によって、完全に適合した配列をミスマッチ二本鎖と区別することができる。変性剤を含むか含まないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化または直接ＤＮＡ配列決定によって、ＤＮＡ配列の相違を検出することもできる。例えば、Myersら、Science、1985、230、1242を参照のこと。特定の位置での配列の変化を、ＲＮアーゼおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学的切断法によって明らかにすることもできる。Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1985、4397-4401を参照のこと。別の実施形態では、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、例えば遺伝子変異の有効なスクリーニングを行えるように構築することができる。アレイテクノロジーは周知であり、一般的に適用されており、これを使用して遺伝子発現、遺伝子連鎖、および遺伝子変異性を含む分子遺伝学の種々の問題に取り組むことができる。例えば、M.Cheeら、Science、第274巻、610-613、1996を参照のこと）。
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体と野生型核酸との間の電気泳動移動度の相違を検出することができる（Oritaら、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、2766;Cotton、1993、Mutat Res.、285、125-144;およびHayashi、1992、Genet.Anal.Tech.Appl.、9、73-79もまた参照のこと）。サンプルおよびコントロールＢＡＣＨ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させて、復元することができる。一本鎖核酸の二次構造は配列によって変化し、得られた電気泳動移動度の変化により、１塩基の変化でさえも検出可能である。標識プローブを使用してＤＮＡフラグメントを標識および検出することができる。アッセイ感度を、（ＤＮＡよりもむしろ）ＲＮＡの使用によって増強することができる（二次構造は配列の変化に対する感度画より高い）。好ましい実施形態では、本発明の方法は、電気泳動移動度の変化に基づいてヘテロ二本鎖分子を分離するためにヘテロ二本鎖分析を使用する（Keenら、1991、Trends Genet.、7、5）。
診断アッセイは、ＢＡＣＨ関連疾患（例えば、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、および脊髄または脳の損傷による痛み；例えば、脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムス；眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症）に対する感受性の診断または同定プロセスを提供する。
サンプル中のＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドおよび核酸の存在を検出することができる。したがって、上記の感染症および疾患を、被験体由来のサンプル由来のＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドレベルまたはＢＡＣＨ ＧＰＣＲ ｍＲＮＡレベルの異常な減少または増加を同定するステップを含む方法によって診断することができる。サンプルは、発現レベルまたはパターンの空間的または一過性の変化を含むＢＡＣＨ ＧＰＣＲ発現の増加、減少、または異常発現に関連する疾患を罹患しているか罹患していると疑われる生物由来の細胞または組織を含み得る。疾患の診断手段として、このような疾患を罹患しているか罹患していると疑われる生物のＢＡＣＨ発現のレベルまたはパターンを、通常、正常な生物における発現のレベルまたはパターンと比較することができる。
したがって、一般に、本発明は、サンプルを核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブと接触させるステップと、核酸の存在について前記サンプルをモニターするステップとを含む、核酸の存在の検出方法を含む。例えば、核酸プローブは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ核酸またはその一部に特異的に結合することができ、二者間の結合を検出し、複合体自体の存在も検出することができる。さらに、本発明は、細胞サンプルとポリペプチドに結合することができる抗体との接触およびポリペプチドの存在についてのサンプルのモニタリングによる、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドの存在の検出方法を含む。抗体とポリペプチドとの間で形成した複合体の存在のモニタリングまたはポリペプチドと抗体との間の結合のモニタリングによってこれを都合よく行うことができる。２つの事象の間の結合の検出方法は、当該分野で公知であり、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴などが含まれる。
当該分野で周知の任意のポリヌクレオチド定量法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ、ノーザンブロッティング、および他のハイブリッド形成法）を使用して、ＲＮＡレベルで発現の減少または増加を測定することができる。宿主由来のサンプル中のＢＡＣＨ ＧＰＣＲなどのタンパク質のレベルを同定するために使用することができるアッセイ技術は当業者に周知である。このようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合血尾グアッセイ、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
本発明は、ＢＡＣＨ関連疾患（感染を含む）（例えば、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、および脊髄または脳の損傷による痛み；例えば、脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムス；眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症）の疾患または感受性の診断キットを提供する。
診断キットは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；相補ヌクレオチド配列；ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドまたはそのフラグメント；またはＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドに対する抗体を含む。
〔染色体アッセイ〕
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体同定に有利である。配列を特定に標的化し、各ヒト染色体上の特定の位置でハイブリッド形成することができる。上記のように、ヒトＢＡＣＨ ＧＰＣＲは、ホモサピエンス染色体１２ｐ１３．３をマッピングすることが見出されている。
本発明の染色体に対する関連配列のマッピングは、遺伝子関連疾患と相関する配列における重要な第１のステップである。一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的位置を、遺伝子地図データに相関させることができる。このようなデータは、例えば、V.McKusick、「ヒトのメンデル性遺伝」（ジョーンズホプキンス大学ウェルチ医学図書館をオンラインで利用可能）に見出される。同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関連を、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定する。
罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違も同定することができる。変異がいくつかまたは全ての罹患個体で認められるが、いかなる正常な個体では認められない場合、変異は疾患の原因の可能性がある。
〔予防方法および治療方法〕
本発明は、過剰量および不十分な量のＢＡＣＨ ＧＰＣＲ活性の両方に関連する異常な状態の治療方法を提供する。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ活性が過剰である場合、いくつかのアプローチを利用可能である。１つのアプローチは、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲへの結合の遮断または第２のシグナルの阻害によって活性化を阻害するのに十分な量の上記のインヒビター化合物（アンタゴニスト）を薬学的に許容可能なキャリアと共に被験体に投与して異常な病態を緩和するステップを含む。
別のアプローチでは、依然として内因性ＢＡＣＨ ＧＰＣＲと競合してリガンドに結合することができるＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドの可溶性形態を投与することができる。このような競合物質の典型的な実施形態は、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドのフラグメントを含む。
さらに別のアプローチでは、内因性ＢＡＣＨ ＧＰＣＲをコードする遺伝子の発現を、発現阻害技術を使用して阻害することができる。公知のこのような技術は、内部で作製されるか個別に投与されるアンチセンス配列の使用を含む。例えば、O’Connor、J.Neurochem.、191、56、560、「遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴでオキシヌクレオチド」、CRC Press、Boca Raton,Fla、1998を参照のこと。あるいは、遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを、供給することができる。例えば、Leeら、Nuleic Acid Res.、1979、6、3073;Cooneyら、Science、1988、241、456;Dervanら、Science、1991、251、1360を参照のこと。これらのオリゴマー自体を投与することができ、関連オリゴマーをインビボで発現することができる。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲの過少発現およびその活性に関連する異常な病体の治療のために、いくつかのアプローチも利用可能である。１つのアプローチは、薬学的有効量のＢＡＣＨ ＧＰＣＲを活性化する化合物（すなわち、上記のアゴニスト）を薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて被験体に投与して、異常な病体を緩和するステップを含む。あるは、遺伝子治療を使用して、被験体中の関連細胞によるＢＡＣＨ ＧＰＣＲの内因性産生を行うことができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを、上記の複製欠失レトロウイルスベクターでの発現用に操作することができる。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞が目的の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するように本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞に移入することができる。インビボでの操作およびインビボでのポリペプチドの発現のためにこれらの産生細胞を被験体に投与することができる。遺伝子治療の概説については、「遺伝子治療および他の分子遺伝学ベースの治療アプローチ」の第20章、Human Molecular Genetics、T.Strachan and A.P.Read、BIOS Scientific Publishers Ltd.、1996を参照のこと。
〔処方および投与〕
可溶性形態のＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドなどのペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小分子を、適切な薬学的キャリアと組み合わせて処方することができる。このような処方物は、治療有効量のポリペプチドまたは化合物および薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアには、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストラン、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。処方物は投与様式に適合すべきであり、これは十分に当業者の範囲内である。本発明は、さらに、本発明の上記の組成物の１つまたは複数の生物で満たされた１つまたは複数のコンテナを含むパックおよびキットに関する。
本発明のポリペプチドおよび他の化合物を、単独か治療化合物などの他の化合物と組み合わせて使用することができる。
医薬組成物の全身投与の好ましい形態には、注射、典型的には静脈内注射が含まれる。皮下、筋肉内、または腹腔内などの他の注射経路を使用することができる。全身投与の別の手段には、胆汁酸塩もしくはフシジン酸などの浸透剤または他の界面活性剤を使用した経粘膜および経皮投与が含まれる。さらに、腸溶性またはカプセル処方物に適切に処方された場合、経口投与も可能である。これらの化合物を、軟膏、ペースト、ゲルなどの形態で局所および／または局部投与することができる。
必要な投薬量の範囲は、ペプチドの選択、投与経路、処方物の性質、患者の病態の性質、および主治医の判断に依存する。しかし、適切な投薬量は、被験体１ｋｇあたり０．１〜１００μｇの範囲である。しかし、利用可能な種々の化合物および種々の投与経路の有効性の相違に照らして必要な投薬量は非常に変化すると予想される。例えば、経口投与には、静脈内注射での投与よりも多い投薬量が必要であると予想される。これらの投薬量レベルの変動を、当該分野で十分に理解されている標準的な経験的経路を使用して最適に調整することができる。
治療で使用されるポリペプチドを、上記でしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる治療様式で、被験体中で内因的に作製することもできる。したがって、例えば、被験体由来の細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏでポリペプチドをコードするようにＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドを使用するか、レトロウイルスプラスミドベクターの使用によって操作することができる。次いで、細胞を、被験体に移入する。
〔医薬組成物〕
本発明はまた、治療有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ベクター、または抗体および任意選択的に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤（その組み合わせを含む）を投与するステップを含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物はヒトおよび動物用の薬物としてヒトまたは動物に使用することができ、典型的には、１つまたは複数の薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤を含む。治療用の許容可能なキャリアまたは希釈剤は薬学分野で周知であり、例えば、「レミントンの薬学」、Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編、1985)に記載されている。薬学的キャリア、賦形剤、または希釈剤の選択を、意図する投与経路および標準的な薬学的実務に関して選択することができる。医薬組成物は、キャリア、賦形剤、希釈剤、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤を含み得るか添加することができる。
医薬組成物に防腐剤、安定剤、色素、さらに香料を含めることができる。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤および懸濁剤もまた使用することができる。
異なる送達系に依存して異なる組成／処方要件が存在し得る。例として、本発明の医薬組成物を、ミニポンプを使用するか粘膜経路（例えば、鼻腔用スプレーまたは吸引用エーロゾルまたは経口摂取用溶液など）または組成物を注射形態による送達のために処方した非経口経路（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下経路）によって送達させるように処方することができる。あるいは、処方物を、両経路によって送達されるようにデザインすることができる。
薬剤を、胃腸粘膜を介して粘膜送達させる場合、胃腸管を通過する間安定に維持することができなければならない。例えば、タンパク質分解耐性を示すか、酸性ｐＨで安定であるか、胆汁の界面活性効果に耐性を示すべきである。
適切ならば、医薬組成物を、吸入、座剤もしくはペッサリーの形態、典型的にはローション、溶液、クリーム、軟膏、または散布剤の形態、皮膚パッチの使用、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形態、単独もしくは賦形剤との混合物を含むカプセルもしくは小卵、または香料もしくは着色料を含むエリキシル、溶液もしくは懸濁液の形態によって投与するか、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下）で注射することができる。非経口投与のために、組成物を、他の物質（例えば、血液と等張の溶液の作製に十分な塩または単糖類）を含み得る滅菌水溶液の形態で最良に使用することができる。口内または舌下投与のために、組成物を、従来の様式で処方することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与することができる。
〔ワクチン〕
本発明の別の実施形態は、三叉神経痛、口腔顔面痛、歯痛に関する痛み、敏感性腸症候群、バレット食道、緑内障、癌に関連する痛み、糖尿病性神経障害、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、片頭痛および片頭痛に関連する皮膚過敏症、異痛症、歯痛、神経腫（切断、神経相互作用、または外傷のいずれかに起因する）、神経圧迫症（腫瘍、拘扼、または打撲のいずれかによる）、および脊髄または脳の損傷による痛み；例えば、脳卒中、外傷、変性、または悪性疾患から発症する痴呆、失読症、ジスキネジー、振せん、パーキンソン病、良性本態性振せん、舞踏病、癲癇およびバリスムス；眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症を含むＢＡＣＨ関連疾患から動物を保護するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答の産生に適切なＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドまたはそのフラグメントを哺乳動物に接種するステップを含む、免疫応答誘導方法に関する。
本発明のさらに別の実施形態は、免疫応答を誘導して疾患から動物を保護するためにインビボでＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現を指示するベクターを介してＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドを送達させるステップを含む、哺乳動物の免疫応答を誘導する方法に関する。
本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物宿主に移入した場合にその哺乳動物でＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドに対する免疫応答が誘導される、ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドまたはＢＡＣＨ ＧＰＣＲ遺伝子を含む免疫学的／ワクチン処方物（組成物）に関する。ワクチン処方物は、キャリアをさらに含み得る。
ＢＡＣＨ ＧＰＣＲポリペプチドは胃内で分解され得るので、非経口で投与することが好ましい（皮下、筋肉内、静脈内、皮内注射など）。非経口投与に適切な処方物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および処方物をレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤または増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。処方物は、単位用量または複数回用量のコンテナ（例えば、密封アンプルおよびバイアル）中に存在することができ、使用直前に滅菌液体キャリアのみの添加が必要な凍結乾燥条件で保存することができる。ワクチン処方物は、処方物の免疫原性の増強のためのアジュバント系（水中油型および当該分野で公知の他の系など）も含み得る。投薬量はワクチンの比活性に依存し、これを日常的な実験で容易に同定することができる。
本発明の１つまたは複数のポリペプチドまたはペプチドからワクチンを調製することができる。
有効成分として免疫学的ポリペプチドまたはペプチドを含むワクチンの調製は、当業者に公知である。典型的には、このようなワクチンを、注射用（液体溶液または懸濁液のいずれか）；注射前に液体に調製することができる溶液または懸濁液に適切な固体形態で調製する。調製物を、乳化するか、リポソーム中にタンパク質をカプセル化することもできる。免疫原性有効成分を、薬学的に許容可能で有効成分に適合する賦形剤と混合する場合もある。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストラン、グリセロール、エタノールなどおよびその組み合わせである。
さらに、所望ならば、ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の賦形剤および／またはワクチンの有効性を増強するアジュバントを含み得る。有効であり得るアジュバントの例には、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰと呼ばれるＣＧＰ１１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれるＣＧＰ１９８３５Ａ）、および細菌から抽出した３つの成分を含むＲＩＢＩ、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミオコラート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）の２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液が含まれるが、これらに限定されない。
アジュバントおよび他の薬剤のさらなる例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（alum）、リン酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型乳濁液、水中油型乳濁液、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、脂質Ｘ、コリネバクテリウムーパルヴム（Propionobacterium acnes）、Bordetella pertussis、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、遮断コポリマー、または他の合成アジュバントが含まれる。このようなアジュバントは、種々の販売者から市販されている（例えば、Merck Ajuvant65(Merck and Company,Inc.、Rahway、N.J.）またはフロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories、Detroit、Michigan)）。
典型的には、アンフィゲン（Amphigen）（水中油型）、アルヒドロゲル（Alhydrogel）（水酸化アルミニウム）、またはアンフィゲンとアルヒドロゲルとの混合物などのアジュバントを使用する。水酸化アルミニウムのみが、ヒトへの使用が許可されている。
免疫原とアジュバントとの比率は、両方が有効量で存在する限り広い範囲で変化し得る。例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物の約０．５％の量で存在し得る（Ａｌ2Ｏ3として）。免疫原の最終濃度が０．２〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１５μｇ／ｍｌの範囲で含まれるようにワクチンを処方することが都合がよい。
処方後、ワクチンを滅菌コンテナに組み込み、密封し、低温（例えば、４℃）で保存するか凍結乾燥することができる。凍結乾燥によって安定な形態で長期保存可能である。
ワクチンを、注射（例えば、皮下または筋肉内のいずれか）によって都合よく非経口投与する。他の投与様式に適切なさらなる処方物には、座剤、いくつかの場合、経口処方物が含まれる。座剤のために、伝統的な結合剤およびキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ、このような座剤を、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含む混合物から処方することができる。経口処方物は、例えば、薬物グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、または散剤の形態をとり、有効成分の１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含まれる。ワクチン組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥物を投与前に例えば懸濁液に再構成することができる。再構成は緩衝液中で行うことが好ましい。
患者へのカプセル、錠剤、および丸薬の投与を、例えば、オイドラギット（Eudragit）「S」、オイドラギット「L」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶性コーティングを使用して作製することができる。
本発明のポリペプチドを、中性または塩形態のワクチンに処方することができる。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成した）および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸など）または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびマレイン酸など）で形成した酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成した塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄など）および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなど）に由来し得る。
〔投与〕
典型的には、医師は、各被験体に最も適切な実際の投薬量を決定し、これは年齢および特定の患者の応答によって変化する。以下の投薬量は、平均的な症例の例である。勿論、より高いまたはより低い投薬量が有利である場合もあり得る。
本発明の医薬品およびワクチンを、注射によって直接投与することができる。組成物を、非経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、または経皮投与用に処方することができる。典型的には、各タンパク質を、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。
用語「投与した」には、ウイルスまたは非ウイルス技術による送達が含まれる。ウイルス送達機構には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。非ウイルス送達機構には、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、カチオン性表面両親媒性物質（ＣＦＡ）、およびその組み合わせが含まれる。このような機構のための経路には、粘膜、鼻腔内、経口、非経口、胃腸、局所、または舌下経路が含まれるが、これらに限定されない。
用語「投与した」には、粘膜経路（例えば、吸入用の鼻腔用スプレーもしくはエーロゾルまたは注射用溶液）；注射形態（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下経路など）による非経口経路が含まれるが、これらに限定されない。
用語「同時投与した」は、例えば、それぞれの本発明のポリペプチドおよびアジュバントなどのさらなる物質を必要な免疫系の調整が行われるような投与部位および時間で投与することを意味する。したがって、ポリペプチドおよびアジュバントを同時且つ同一部位に投与することができる一方で、アジュバントと異なる時間および異なる部位へのポリペプチドの投与に有利であり得る。ポリペプチドおよびアジュバントを、同一の送達賦形剤でさえも送達させることができ、ポリペプチドおよび抗原を結合および／もしくは非結合ならびに／または遺伝子を結合および／もしくは非結合することができる。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ヌクレオチド、抗体、および任意選択的にアジュバントを、単回用量または複数回用量で宿主被験体に個別または同時投与することができる。
本発明のワクチン組成物および医薬組成物を、注射（非経口、皮下、および筋肉内注射が含まれる）、鼻腔内、粘膜、経口、膣内、尿道、または眼内投与などの異なる多数の経路で投与することができる。
本発明のワクチンおよび医薬組成物を、非経口、注射（例えば、皮下または筋肉内）で都合よく投与することができる。他の投与様式に適切なさらなる処方物には、座剤、およびいくつかの場合経口処方物が含まれる。座剤のために、伝統的な結合剤およびキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ、このような座剤を、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含む混合物から処方することができる。経口処方物は、例えば、薬物グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、または散剤の形態をとり、有効成分の１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含まれる。ワクチン組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥物を投与前に例えば懸濁液に再構成することができる。再構成は緩衝液中で行うことが好ましい。
＜実施例＞
〔実施例１．トランスジェニックＢＡＣＨノックアウトマウス〕
（ＢＡＣＨ遺伝子標的ベクターの構築）
標準的な技術により、プローブとしてヒトオープンリーディングフレームｃＤＮＡ配列（配列番号１）を使用して、マウスＢＡＣＨゲノムクローンを、ＨＧＭＰ（Hinxton、UK）から得たマウス巨大インサートＰＡＣライブラリーから単離する。
マウスＢＡＣＨ ＧＰＣＲのゲノム配列を、配列番号１０に示す。
次いで、単離マウスＢＡＣＨゲノムクローンを、小さなヌクレオチドプローブおよび標準的技術を使用してＢＡＣＨ遺伝子領域に制限マッピングする。マウスゲノム遺伝子座を、標的ベクターにクローニングするために相同アームをデザインすることができるように部分的に配列決定する。マウスＢＡＣＨ遺伝子は、１つのエクソン遺伝子である。１．１５ｋｂの５’相同アームおよび約４ｋｂの３’相同アームをＰＣＲによって増幅し、フラグメントを標的ベクターにクローン化する。アームの増幅のために使用した各プライマーを、各オリゴヌクレオチドの５’末端に存在する稀有の切断をする制限酵素の認識部位を含むように合成する。ベクターが各酵素の相互に適合する固有の部位を含むので、ＰＣＲ増幅の間のアームへの制限部位の組み込みにより、得られたフラグメントの標準的な標的ベクターへのクローニングを容易にする。ＢＡＣＨの場合、以下の配列表に列挙のように、プライマーをデザインする。使用したクローニング酵素を以下に示す：５’アームＦｈｏＩ、５’アームＲ ＳｐｅＩ、３’アームＦ ＡｓｃＩ、および３’アームＲ ＦｓｅＩ。フラグメントを、図３に記載のｐＴＫ３ＩＢＬＭＮＬとして公知のベクターにクローン化する。
アームプライマー対（５’アームＦ／５’アームＲおよび３’アームＦ／３’アームＲ）に加えて、ＢＡＣＨ遺伝子座に特異的なプライマーもまた、単離推定標的クローン中で標的遺伝子座をサザン分析するための各アームの外側および各アームを超えて伸長する非反復ゲノムＤＮＡの２００〜３００ｂｐの小さなフラグメントを増幅するための５’および３’プローブプライマー対（５’ｐｒＦ／５’ｐｒＲおよび３’ｐｒＦ／３’ｐｒＲ）；野生型マウスと、ヘテロ接合体マウスと、ホモ接合体マウスとの間で分化可能なマウス遺伝子型分類プライマー対（＋／−Ｆおよび＋／−Ｒ）；最後に、５’アーム領域の最初の上流をアニーリングし、ベクターの５’末端に特異的なプライマーと対合した場合に１．２ｋｂの増幅物に特異的な標的事象を産生する標的スクリーニングプライマー（５’ｓｃｒ）の目的のためにデザインする。この増幅物は、所望のようにゲノムが変化し、無作為に組み込まれたベクターのコピーを含むクローンのバックグラウンドから正確に標的された細胞を同定することができる細胞由来のテンプレートＤＮＡのみに由来し得る。
Figure 0004178028
相同アームの位置を、７回膜貫通領域の欠失によってＢＡＣＨ遺伝子が機能的に破壊されるように選択する。欠失ＢＡＣＨ配列をＢＡＣＨ遺伝子と同一の方向でプロモートしたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）から構成される選択カセットの上流の内因性遺伝子発現レポーター（ｌａｃＺとのフレーム独立性融合）から構成される非相同配列で置換した標的ベクターを調製する。
正確な遺伝子座でのマウスゲノムへのベクターの組換えにより、図４に記載の構造を有するＢＡＣＨの対立遺伝子が得られる。比較のために、ＢＡＣＨの野生型対立遺伝子を図５に示す。トランスジェニックＢＡＣＨノックアウトマウスを調製するためにこのストラテジーで使用した全ゲノムコンティーグの配列を、以下の個別の節に記載する。プライマーに対応する領域に注釈をつけている。
ノックアウト対立遺伝子中の全７ｔｍ領域が除去されていることに留意すべきである（図４）。ＥｃｏＩ酵素を使用し、推定クローンのサザン分析を使用して標的構築物の正確な組み込みを確認するので、酵素ＥｃｏＲＩ部位を含む。
一旦５’および３’相同アームが標的ベクターにクローン化されると、標準的な分子生物学技術を使用して、大量の高純度ＤＮＡ調製物が作製される。２０μｇの新たに調製した無内毒素ＤＮＡを、アンピシリン耐性遺伝子と細菌の複製起点との間のベクター骨格中の固有の部位に存在する別の稀有の切断をする制限酵素で制限消化する。次いで、エレクトロポレーションのために、線状化ＤＮＡを沈殿させ、１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁する。
（胚性幹細胞のトランスフェクションおよび分析）
胚性幹細胞（Evans and Kaufman、1981）を、２０％のウシ胎児血清、１０％の新生ウシ血清、２ｍＭのグルタミン（非必須アミノ酸）、１００μＭの２−メルカプトエタノール、および５００ｕ／ｍｌの白血球阻害因子を補足したダルベッコ改変イーグル培地中で成長させたネオマイシン耐性胚性線維芽支持細胞膜上で培養する。培地を毎日交換し、ＥＳ細胞を３日毎に継代培養する。５×１０6個のＥＳ細胞を、エレクトロポレーション（静電容量２５μＦおよび４００ボルト）によって２０μｇの線状化プラスミドでトランスフェクトする。
２４時間のエレクトロポレーション後、トランスフェクトした細胞を、２００μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む培地中で９日間培養する。クローンを９６ウェルプレートに拾い、複製および拡大し、その後ＰＣＲ（上記のプライマー５’ｓｃｒおよびＤＲ１を使用）でスクリーニングして、内因性ＢＡＣＨ遺伝子と標的構築物との間で相同組換えが起こったクローンを同定する。２００個の拾い上げたクローンから、７個の標的を同定する。全て標準的な手順を使用して（Russら、2000）、これらのクローンを拡大してレプリカを凍結させ、上記のように調製した外部５’および３’プローブを使用した標的事象のサザンブロット確認に十分に高い質のＤＮＡを調製した。
（ＢＡＣＨ ＧＰＣＲ欠失マウスの作製）
Ｃ５７ＢＬ／６雌および雄マウスを交配し、妊娠３．５日目に胚盤胞を単離する。胚盤胞あたり選択クローン由来の１０〜１２個のクローンを注射し、７〜８個の胚盤胞を偽妊娠Ｆ１雌の子宮に移植する。５匹のキメラの子が誕生し、そのうちの１匹の雄が１０％アグーチである（標的化クローン由来の細胞を示す）。この雄キメラを雌、ＭＦ１、および１２９マウスと交配し、生殖細胞系の伝達を、アグーチ被覆色およびＰＣＲ遺伝子分類によって同定する。
第３のｎｅｏ特異的プライマー（neo240F GTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTG）と共にプライマー＋／−Ｆおよび＋／−Ｒを使用した溶解テールクリップにおけるＰＣＲによって遺伝子型分類を行う。この複合ＰＣＲにより、プライマー＋／−Ｆおよび＋／−Ｒ由来の野生型遺伝子座（存在する場合）から増幅されて２４３ｂｐのバンドが得られる。＋／−Ｆ部位がノックアウトマウスで検出されたので、この増幅は失敗である。しかし、３’アームのすぐ内側の領域にアニーリングする＋／−Ｒプライマーと組み合わせて、ｎｅｏ２４０Ｆプライマーにより標的遺伝子座から４０４ｂｐのバンドが増幅される。野生型サンプルは、１つの２４３ｂｐのバンドを示し、ヘテロ接合体ＤＮＡサンプルにより２４３ｂｐおよび４０４ｂｐの２つのバンドが得られ、ホモ接合体サンプルは標的に特異的な４０４ｂｐのバンドのみを示す。
（ｌａｃＺ染色）
以下の様式で切開組織のＸｇａｌ染色を行う。
代表的な組織スライスを、巨大器官から作製する。小器官および管全体をスライスして開き、固定液および色素を浸透させる。組織をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で完全にリンスして、血液または腸内容物を除去する。組織を、固定液（２％のホルムアルデヒド、０．２％のグルタルアルデヒド、０．０２％のＮＰ４０、１ｍＭのＭｇＣｌ2、デオキシコール酸ナトリウム０．２３ｍＭを含むＰＢＳ）に３０〜４５分間浸す。ＰＢＳで１回５分間の洗浄を３回行った後、組織をＸｇａｌ染色溶液（４ｍＭのＫフェロシアン化カリウム、４ｍＭのフェリシアン化カリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌのＰＢＳ溶液）中に３０℃で１８時間浸す。組織をＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで再度洗浄し、７０％エタノール中で保存する。
Ｘｇａｌ染色組織を同定するために、脱水組織をワックスに包埋し、７μｍの切片に切断し、０．０１％サフラニンで対比染色する（９〜１０分）。
（挙動および神経学的試験）
マウスを飼料および水を自由に与えた１２時間明所−１２時間暗所の光スケジュール（６ａｍで点灯）下に収容する。性を混合し、３〜４月齢のマウス（ｎ＝１２）を、試験結果がいかなる異なる日周期の影響を受けないように午前中の１０時と１３時との間に挙動試験を行った。
〔実施例２．組換えＢＡＣＨタンパク質の発現〕
組換えＢＡＣＨを発現させて精製する。発現には２つの系を使用する。
（ｐＴＯＰＯ−Ｅｃｈｏドナーベースの構築物）
配列番号６に記載の配列を有するポリヌクレオチドを、マウスＢＡＣＨ核酸配列（配列番号５）から得る。配列番号６のポリヌクレオチドを、ｐＴＯＰＯ−Ｅｃｈｏドナーベクターモジュール（Invtrofen pUniV5/His、カタログ番号ET001-10）にクローン化する。得られた構築物の宿主株へのトランスフェクションおよび発現の誘導により、配列番号７に記載の配列を有する融合タンパク質が得られる。
配列番号７の融合ポリペプチドは、検出および精製を補助するためにＣ末端Ｖ５タグ（残基３７９〜３９２）およびＨｉｓタグ（残基３９３〜３９８）を含む。
（ｐｃＤＮＡ３．１ＡＭｙｃ／Ｈｉｓベースの構築物）
配列番号８に記載の配列を有するポリヌクレオチドを、ＢＡＣＨの５−プライムおよび３−プライムで新規の制限部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを組み込むためのオリゴヌクレオチドプライマーAAATATAAGGATCCAGACGATGTTAGCCAACAGCTCCおよびTTCGTGAATTCGAGGGCGGAATCCTGGGGACACTGを使用したＰＣＲによって増幅する。次いで、これを消化して、消化ｐｃＤＮＡ３．１ＡＭｙｃ／Ｈｉｓ（Invitrogen、カタログ番号Ｖ８００−２０）に同様にライゲートして、５’末端に新規のコザックコンセンサス配列（配列番号８の残基１〜５）を組み込み、哺乳動物細胞中で発現レベルを改良する。
得られた構築物を、検出および精製を補助するためのＣ末端Ｍｙｃタグ（１本の下線）およびＨｉｓタグ（二本の下線）との融合ポリペプチドを得るためのｃｍｖプロモーターの調節下でのＣＨＯ−Ｋ１細胞および他の哺乳動物細胞株での高レベル発現に使用する。得られた発現融合ポリペプチドは、配列番号９に記載の配列を有する。
（細胞への構築物の移入）
リポフェクション（Roche、カタログ番号１８１４４３３のFugene-6を使用）によって、発現ベクターを細胞に移入する。
これらの細胞の一過性および安定なトランスフェクションを行う。一過性発現では、短命のタンパク質が迅速に発現される大量のベクターを使用下リポフェクションによって細胞をトランスフェクトする。安定なトランスフェクションでは、ネオマイシン耐性の選択マーカーを含むベクターは宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれて、ＢＡＣＨの発現レベルが高い長寿の細胞株が得られる。
組換えＢＡＣＨを発現する細胞を、アッセイの開発、抗体産生、および記載の他の目的のために使用する。
（他の宿主細胞での発現）
Ｃｒｅ／Ｌｏｘ媒介組換え系を使用したａｒａＢＡＤプロモーターの調節下での高レベル細菌発現のために、組換え／融合クローン（配列番号６）をｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−Ｅ因子（Invtrogen、カタログ番号ＥＴ１００−０１）に組換える。
その後のバキュロウイルス発現系への組換えのために、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ媒介組換え系を使用して、組換え／融合クローン（配列番号６）をｐＢｌｕｅＢａｃ４．５Ｅ（Invtrogen、カタログ番号ＥＴ３１０−０１）に組換える。ＳＦ９および他の昆虫細胞株での高レベル発現のためのＭａｘＢａｃ（Invtrogen、カタログ番号Ｋ８７５−０２）への組換え。
ｃｍｖプロモーターの調節下でのＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣）細胞および他の哺乳動物細胞株での高レベル細菌発現のために、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ媒介組換え系を使用して、組換え／融合クローン（配列番号６）をｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ（Invtrogen、カタログ番号ＥＴ４００−０１）に組換える。
〔実施例３．抗ＢＡＣＨ抗体〕
ＢＡＣＨタンパク質に反応するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を産生する。
（抗ペプチド抗体）
全長ＢＡＣＨポリペプチドのアミノ酸１６５〜１７４に相当するペプチドＣＲＹＲＤＬＥＶＲＬを合成する。合成ペプチドをヤギに注射して、ポリクローナル抗ペプチド抗体を惹起する。抗体を標準的な方法で精製し、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいてＢＡＣＨタンパク質への結合が認められる。
ウサギへの注射によりウサギ抗ペプチド抗体が得られ、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいてＢＡＣＨタンパク質への結合が認められる。
（抗原としてのホールセル調製物）
上記のようにＢＡＣＨ融合タンパク質を発現する完全な細胞を、免疫化におけるＢＡＣＨエピトープの供給源として使用する。このような細胞のヤギへの注射により、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいてＢＡＣＨタンパク質への結合が認められる抗体が得られる。これらの生物から抗ＢＡＣＨ抗体を産生させるために、完全な細胞もマウスおよびウサギに注射する。
その天然の形態でＢＡＣＨタンパク質を発現する完全な細胞もポリクローナル抗体産生のためのヒツジ、マウス、およびウサギへの注射用の抗原として使用する。
（部分精製抗原）
天然または融合タンパク質としてＢＡＣＨを発現する細胞の粗画分を作製する。膜画分はＢＡＣＨタンパク質を含むことが認められ、抗ＢＡＣＨ抗体産生のためにこれを使用してヒツジに注射する。これらの抗体は、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイにおいてＢＡＣＨタンパク質への結合が認められる。同様に、マウスおよびウサギの注射により、ＢＡＣＨタンパク質に反応するＢＡＣＨ抗体が得られる。
（精製抗原）
上記の方法によって、天然の形態または融合物としてＢＡＣＪタンパク質が産生される。ＢＡＣＨタンパク質を、適切な精製手順を使用した親和性クロマトグラフィーによって精製する。例えば、ニッケルアガロース樹脂を使用して、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質を精製する。必要ならば、特定のプロテアーゼを使用して融合タンパク質を切断して、天然のタンパク質を得る。タグ化ポリペプチドおよび精製切断産物を使用して、ヒツジ、ウサギ、マウス、およびヤギを含む種々の種で抗体を惹起する。これらの抗体は、ＢＡＣＨタンパク質に反応することが見出される。
〔実施例４．後根神経節および三叉神経節におけるＢＡＣＨの発現〕
図６および図７に示すように、ＢＡＣＨ発現を、後根神経節および三叉神経節で検出する。
三叉神経は、顔、頭皮の大部分、歯、口腔および鼻腔、硬膜、および脳血管に感覚を与えている。
三叉神経は、咀嚼筋に運動性を与え、咀嚼筋ならびにおそらく外眼筋および筋膜からの固有受容線維を含む。ほとんどが染色される視神経は、全て感覚神経である。これにより、眼球、涙腺、および結膜、鼻粘膜および鼻の皮膚の一部、眼瞼、額、および頭皮の一部が得られる。顔面から三叉神経を連結している線維は、求心性であり、顔面の筋肉組織から発生し、少数が固有受容性であり、大部分が痛む。
神経節自体の背側表面（したがって、神経節の運動部分で認められない）上でｌａｃＺ発現が認められ、これは眼および下顎／上顎部分に向かって伸びている。眼、下顎、および上顎神経自体は染色されない。
舌、鼻の領域、結膜、ハーダー腺の染色は、その全てが三叉神経節の神経支配過程と一致する。これらはまた、顔面の痛み／感受性におけるＢＡＣＨの役割を支持する。したがって、ＢＡＣＨ変異体は、顔の感受性、嗅覚、味覚、または聴覚が改変している。
変異マウスの発現パターンおよび痛覚脱失表現型データの試験は、ＢＡＣＨが三叉神経痛およびいくつかの型の片頭痛の潜在的治療の標的であることを示す。口顔痛は、発作性の痛みが三叉神経の１つまたは２つの部分に広がる三叉神経痛の結果である。眼神経に影響を与えるのは稀である。通常薬物治療が有効であるが、これが失敗した場合は手術によって治療する。これらの手術による治療は満足に治療される証拠はない。特定の薬物も未だ開発されていない。
〔実施例５．内耳神経におけるＢＡＣＨ発現〕
第８脳神経（内耳神経）でも染色が認められる（頭蓋から出てくるので）。Ｐ２Ｘ受容体は、この神経での発現である（Xiang、19991）。
この神経は、内耳から脳へインパルスを伝達する２つの主要な求心性線維組を含む。この神経の病変によりバランスを失い得る。実際に数匹の交配変異マウスでワイヤーバランス運動試験が困難であることおよび異常な幻覚性挙動であるしり込み（マウスの逆行は、斜面の滑り落ちの明らかな幻覚に起因する）が認められ、これは視覚的断崖試験に供したマウスよりもさらに悪く、これはおそらく市松模様が幻覚を悪化させるためである。
〔実施例６．小脳におけるＢＡＣＨの発現〕
−／−マウスの小脳におけるＬａｃＺ染色が、小脳の個別の膜で検出された。小脳は、ＣＮＳのいくつかの主要な感覚野および運動野に連結している。実際、その主要な機能は、運動の学習および反射の変容である。小脳からのアウトプットは、運動を制御する脳の領域にほとんど全てが到達する。したがって、ロータロッド試験は、−／−マウスの運動学習が改善して小脳におけるシグナル伝達機能がほとんど確かに変化したことを示す。これは、小脳中のわずかな染色の所見によって支持される。マウスへのＰＰＡＤＳ（Ｐ２アゴニスト）の投与により、攻撃性、低反応性、および不動性を示し、これは、これらの受容体が年齢に関連する運動障害に関与し得ることを示す。しかし、Ｐ２Ｘもまた関連すると考えられる。
〔実施例７．ＢＡＣＨノックアウトマウス由来の血液サンプルの分析〕
変異ＢＡＣＨ動物から採取した血液サンプルの分析は、循環コレステロールレベルの増加を示す。これは、肝臓、胆嚢、および心臓周囲の脂肪で認められる発現に関連し、高コレステロール血症、異常脂質血症、肥満の治療法またはエネルギー制御に影響を与える薬物の開発におけるＢＡＣＨタンパク質の使用を意味し得る。
最後に、プリン受容体（例えば、Ｐ２Ｙ１２は結膜でのムチン発現を調節する）の役割および局在化との比較によって、ＢＡＣＨ受容体を眼乾燥障害、嚢胞性線維症、過活動性膀胱、高コレステロール血症、異常脂質血症、および肥満症に関連する薬物を開発するための潜在的標的として使用することもできる。
〔実施例８．ＢＡＣＨノックアウトマウスにおける運動調節およびバランス〕
ＢＡＣＨタンパク質は、Rotarod装置でのその動作によって示すことができる運動の共調およびバランスにおいて役割を果たす。
運動共調およびバランスを、ロータロッドでの動作によって測定することができる。本発明者らは、加速Rotarod（Ugo Basile、Linton Instruments、Jones and Roberts、19681）を使用する。
マウスを、４〜４０ｒｐｍの一定速度で加速するRotarod上に5分間置く。Rotarodがより速い速度に達したとき、マウスはRotarodをグリップし、全速回転（すなわち、受動回転）ではしがみつく。マウスが１回全速回転を行った時間を記録する。第１の受動回転後マウスをRotarodに放置し、ロッドから落下するまで残りの試験を行う。マウスを３日間連続して３回試験する。
Rotarod試験は、異系交配と同系交配バックグラウンドの両方において野生型動物よりも変異型動物でより良好な結果が得られる（ｐ＝０．０８）。この異系変異体は、より良好な運動学習能力も示す（図８Ａ）（ｐ＜０．００１）。しかし、これは、同系交配動物では認められなかった（図８Ｂ）。
〔実施例９．ＢＡＣＨノックアウトマウスの視力、不安、運動性〕
視覚的断崖試験を使用して、ＢＡＣＨノックアウトマウスの視力、不安、運動性についての試験を行った。
視覚的断崖は、Fox(19651)によって開発されており、全体的な視力を測定する。これは、マウスが水平表面の端からの落下物を目視する能力を評価する。断崖上のある場所から動物が移動する時間（潜伏時間）が不安の尺度である。
Perspexボックスは、垂直方向の高さの差が０．５ｍで接続されている水平面で構築されている。黒色および白色の市松模様が垂直方向の落下を強調している。透明なPerspexのシートを、上部の水平断崖を横切って置き、上部を超えて伸長しているので、視覚的には断崖が認められるが、実際はPerspexは固体水平表面を提供する。
各マウスについて視覚的断崖試験を１０回行う。試験は、中央の「リッジ」および何もない場所にマウスを置くことと、「リッジ」から移動するまでにかかった時間（潜伏期）と、マウスの歩行面を記録することからなる。動物については、市松模様の「安全な」面に移動して断崖を回避することを選択した場合に正の結果とし、逆を負の結果とする。５回の試験後、箱を１８０°回転させて、さらに５回試験する。これを行って観察者の位置のばらつきを無くす。各動物の間にプラットホームを洗浄する。
Figure 0004178028
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潜伏期間の範囲は、１秒〜７分間であり、変異体で潜伏期間がより長い傾向がある（Ｐ＝０．０５９）。野生型および変異動物は、比較的十分に課題を実行し、一貫して正の結果を示す。しかし、ヘテロ接合体動物では、正の結果は試験のわずか５５％であり、盲検マウス(Fox、19651)で認められた結果の種類と一致する（表２）。しかし、これについて少なくとも以下の２つの説明が得られる。第１に他の課題の失敗を回避するために、本発明者らはマウスの震毛を除去せず、マウスはこれらを歩行に使用することを知っていること。第２に、視覚的断崖試験の際に幾らか「神経質」になっているマウスもいるようであることが認められ、ぎこちない挙動または断崖とは無関係に観察者から逃れようとしたことのいずれかが示された一方でリッジ上にうずくまっていた。領域内で記録された運動挙動またはShirpaスクリーニングの間の苦闘において遺伝子型の間でいかなる有意な相違を認められず、これは反応に影響を与えた。
上記の表２および表３で認められるように、ＢＡＣＨ変異体は、野生型マウスと比較した場合に視覚的断崖試験において潜伏期間がより長く、これは病態のなかで運動関連障害を示す。
ＢＡＣＨ変異体はまた、後方突進（逆行）を示す。これは、視覚的断崖に置かれた場合に促進され、前方落下の幻覚によると考えられる。これは、機能的ＢＡＣＨの欠失により運動障害およびジスキネジーが発症したことを示す。
〔実施例１０：ＢＡＣＨノックアウトマウスにおける外部刺激および痛みに対する感受性試験（痛覚脱失試験）：足圧迫試験〕
各種の試験により、ＢＡＣＨ変異体は、接触および痛みの刺激に対する感受性が喪失していると考えられる。これにおける試験および以下の４つの実施例により、神経障害性および炎症性の痛みの両方を評価する。
尖らせただぼ（dowel rod）での後ろ足の圧迫によって皮膚感受性を評価する一方で、動物をグリッド上で休ませる。応答を以下のように分類する：０＝引っ込めなし、１＝低速の足の引っ込め、２＝中程度の足の引っ込め、３＝速い足の引っ込め。
図９は、足圧迫試験の結果を示す。足圧迫試験を使用して、ＢＡＣＨ変異体は、野生型相対動物よりも圧迫および痛みに対する感受性が低いようである。
〔実施例１１：ＢＡＣＨノックアウトマウスにおける外部刺激および痛みに対する感受性試験（痛覚脱失試験）：テールフリック試験〕
テールフリック痛覚脱失試験を、テールフリック痛覚脱失メーターを使用して行う。この装置により、げっ歯類における痛みの感受性を正確且つ再現可能に同定する方法を容易に使用できる（D’Amour and Smith、1941）。装置は、熱源としてシャッター制御のランプを有する。環境を制限しないようにするために、ランプは動物の下に存在する。自動検出回路によってテールフリックを検出し、ユーザーは動物を取り扱わなくてよい。動物を、換気用チューブ中に拘束し、そのテールを装置上部の検出溝に置く。
シャッターの開口によるテールへの強力な光線の活性化により、動物がビームからそのテールを振る場合いくつかの点で動物は不快である。自動モードでは、光検出器により、テールの動きが検出され、時計が止まり、シャッターが閉じる。シャッターの開口と動物の反応との間で全経過時間を記録する。
変異トランスジェニックマウスの応答を、年齢および性が適合した野生型マウスと比較する。１匹の動物を、異なる熱設定に供して、テールの温度を５５℃まで増加させることができる。
テールフリック試験を使用して、ＢＡＣＨ変異体は、その野生型相対動物よりも熱誘導した痛みに対する感受性が低く、熱源へのより長い曝露期間後、そのテールを引っ込める。
〔実施例１２：ＢＡＣＨノックアウトマウスにおける外部刺激および痛みに対する感受性試験（痛覚脱失試験）：ホルマリン試験〕
ホルマリン試験は、後ろ足に注射した有毒物質に対する応答を測定する。２０μｌの１％ホルマリン溶液を、小さなゲージのニードルに一方の後ろ足の背側表面に皮下注射する。後ろ足を舐めることおよび噛むことを、この挙動に関連する累積秒数として定量する。以下の評価スケールを使用する：１＝ホルマリン注射した足にあまり体重をかけないで床の上で休ませる、２＝注射した足を挙げる、３＝注射した足を舐め、噛み、振る。
ホルマリン試験では、２つの応答段階が認められる。第１段階は、痛みの線維由来の活性の急性群発を示し、注射直後から始まり、約１０分間続く。第２段階は、注射から約２０分後に始まり、約１時間持続する。この段階は、炎症性痛覚過敏を含む組織損傷に対する応答を示すようである。
ホルマリンを使用して、ＢＡＣＨ変異体は、野生型動物と比較した場合、炎症性の痛みに対する感受性が低く、且つホルマリン試験において応答の重症度が減少することを示す。
〔実施例１３：ＢＡＣＨノックアウトマウスにおける外部刺激および痛みに対する感受性試験（痛覚脱失試験）：Ｖｏｎ Ｆｒｅｙヘア試験〕
痛みの閾値を測定するために使用される接触試験は、ｖｏｎ Ｆｒｅｙヘアを使用する。これらのヘアは、一連の非常に小さなゲージの目盛り付きワイヤーである。機械的刺激に対する引っ込め閾値を測定する。動物を、表面が大きなゲージのワイヤーメッシュである持ち上げたプラットホームに立たせる。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙヘアを下から挿入し、これをメッシュ中の穴に合わせて持ち上げ、後ろ足の底面を突っ込む。閾値では、ヘアから離すように足を振るように応答し、一般に、その後足を挙げ、足を舐めるか発声する。機械的引っ込め閾値を、３つの連続的試験のうちの２つの試験において引っ込め反応を誘発した最小ゲージのワイヤーの刺激と定義する。
接触についてのＶｏｎ Ｆｒｅｙヘア試験では、変異ＢＡＣＨマウスは、機械的引っ込め閾値がより高いようであり、これは、刺激に対する感受性が低いことを示す。
〔実施例１４：ＢＡＣＨノックアウトマウスにおける外部刺激および痛みに対する感受性試験（痛覚脱失試験）：尿生殖器機能〕
ＢＡＣＨは、膀胱に発現し、排尿頻度および放出した流動物の耐性の測定によって得られる。ＢＡＣＨ変異体は、頻度が低く膀胱の活動が低い排尿であるが、尿を大量に放出し、尿が停滞する。ＢＡＣＨは勃起障害および前立腺の運動線維の調節において役割を果たす。
〔実施例１５：ＢＡＣＨ調節エレメントの同定〕
進化の際に、遺伝子の配列が変わる。遺伝子機能に影響を与える配列はより良好に保存される傾向があるが、これらには、コード配列だけでなく、プロモーター調節エレメントおよびエンハンサーも含まれる。多数の種におけるＢＡＣＨのホモログおよびオーソログの同定プロモーター領域比較により、このような調節エレメントおよびエンハンサーが位置付けられる。
ヒトＢＡＣＨ調節エレメントおよびエンハンサーを見出すために、本発明者らは、Blast型アラインメントを使用して、ヒトＢＡＣＨ由来のプロモーター領域とフグ（Takifugu rubripes）由来のＢＡＣＨのプロモーター領域とを比較する。配列の保存パッチは、ＢＡＣＨ遺伝子発現のレベル、タイミング、および位置を調節する重要なエレメントである。
次いで、ヒト集団および疾患コホートを、多型についておよびこの様式で同定した調節領域でスクリーニングする。これらの領域中のＳＮＰなどの変異体は、ＢＡＣＨ遺伝子発現の調節に影響を与え、ＢＡＣＨ関連疾患などの病態を引き起こす。プロモーター配列中で類似の変異体を作製し、これを使用して細胞株またはトランスジェニックマウスにおけるＢＡＣＨまたはレポーター遺伝子配列のいずれかに対する効果を評価する。次いで、機能的効果を有することが示されている多型を、概説されているＢＡＣＨ特異的疾患についての診断スクリーニングで使用する。
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本明細書中に記載の各出願および特許、ならびに上記の各出願および特許で引用または参照した各書類（各出願および特許の遂行を含む（「出願の引例」））、ならびに各出願および特許ならびに任意の出願の引例で引用または列挙した任意の製品についての任意の製造者の説明書またはカタログは、本明細書中で参照として組み込まれる。さらに、本明細書中で引用した全ての書類、本明細書中で引用した書類で引用または参照した全ての書類、本明細書中で引用または列挙した任意の製品についての製造者の説明書またはカタログは、本明細書中で参照として組み込まれる。
本発明の記載の方法および系の種々の修正形態および変形形態は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載しているが、特許請求の範囲に記載の本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に自明である本発明の実施のために記載した様式の種々の修正形態が、特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
（マウスＢＡＣＨゲノム配列（配列番号１０））
マウスＢＡＣＨのゲノム配列を以下に示す（配列番号１０）。これは、ＢＡＣＨノックアウトマウスの調製で使用した全ゲノムコンティーグに対応する。プライマー対応領域に注釈をつけている。
用語「マウスＢＡＣＨゲノム配列」を本明細書中で使用する場合、この配列の参照と理解すべきである。
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図１Ａは、ｐｆａｍ（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml）のＨＭＭ構造推定ソフトウェアを使用したヒトＢＡＣＨポリペプチド（配列番号３）の分析結果を示す図である。 図１Ｂは、ｐｆａｍ（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml）のＨＭＭ構造推定ソフトウェアを使用したヒトＢＡＣＨポリペプチド（配列番号３）の分析結果を示す図である。 図２は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって作製したヒトＢＡＣＨ ＧＰＣＲの発現プロフィールを示す図である。 図３は、トランスジェニックＢＡＣＨノックアウトマウスの構築で使用したベクターｐＴＫ３ＩＢＬＭＮＬの制限地図を示す。 図４は、膜貫通領域がｌａｃＺ受容体遺伝子および選択マーカーに置換されたＢＡＣＨの対立遺伝子の構造を示す。実施例に記載の方法を使用してこの対立遺伝子を含むＢＡＣＨノックアウトマウスを調製することができる。 図５は、ＢＡＣＨの野生型対立遺伝子の構造を示す図である。 図６は、ＢＡＣＨノックアウトマウスから採取した後根神経節の切片を示す図である。パネルＡ：１００倍；パネルＢ：２００倍；パネルＣ：４００倍。黒塗りの矢印は、ＬａｃＺ染色細胞を示し、白抜きの矢印はＬａｃＺを発現しない細胞を示す。 図７は、感覚ニューロンにけるＢＡＣＨ ＧＰＣＲ発現を示す。左側のパネル：後根神経節中のＢＡＣＨ発現；右側のパネル：三叉神経節におけるＢＡＣＨ発現。 図８は、ＢＡＣＨノックアウトマウスのRotarod試験結果を示す図である。パネルＡは、異系交配の遺伝的背景を有するマウスの結果を示し（３回の試験）、パネルＢは同系交配の遺伝的背景を有するマウスの結果を示す（４回の試験）。薄灰色のバー：−／−遺伝子型を有するマウス、暗白色のバー：＋／−の遺伝子型を有するマウス、白色のバー：＋／＋遺伝子型を有するマウス。Ｙ軸：時間（秒）。 図９は、足圧迫試験の結果を示す図である。Ｘ軸：−／−遺伝子型を有するマウス、＋／−の遺伝子型を有するマウス、バー：＋／＋遺伝子型を有するマウス。Ｙ軸：引っ込め反応（０＝引っ込めなし、１＝低速の足の引っ込め、２＝中程度の足の引っ込め、３＝速い足の引っ込め）
配列表
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Claims (24)

  1. 低活動性膀胱(hypoactive bladder)を治療するのに適した分子を同定する方法であって、候補分子が、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドのアゴニストであるか否か決定するステップを含む、方法。
  2. 過活動性膀胱を治療するのに適した分子を同定する方法であって、候補分子が、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドのアンタゴニストであるか否か決定するステップを含む、方法。
  3. 痛みを緩和するのに適した分子を同定する方法であって、候補分子が、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドのアンタゴニストであるか否か決定するステップを含む、方法。
  4. 候補分子がアゴニストであるか否か決定するために、候補分子がＢＡＣＨポリペプチドに暴露される、請求項１に記載の方法。
  5. 候補分子がアンタゴニストであるか否か決定するために、候補分子がＢＡＣＨポリペプチドに暴露される、請求項２または３に記載の方法。
  6. 候補分子が、ＢＡＣＨポリペプチドを発現する細胞に暴露される、請求項１〜５のいずれか一に記載の方法。
  7. 細胞中のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）またはカルシウムのレベルの変化が検出される、請求項６に記載の方法。
  8. ＢＡＣＨポリペプチドのアンタゴニストを同定するために、細胞中のサイクリックＡＭＰのレベルの減少が検出される、請求項７に記載の方法。
  9. ＢＡＣＨポリペプチドのアゴニストを同定するために、サイクリックＡＭＰのレベルの増加が検出される、請求項７に記載の方法。
  10. 配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、候補分子をヒトを除く動物に投与するステップと、前記ヒトを除く動物が、痛みの感受性の低下または低活動性膀胱もしくは過活動性膀胱を示すか否か決定するステップとを含む、方法。
  11. 前記ヒトを除く動物が、機能的なＢＡＣＨポリペプチドを発現する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ヒトを除く動物が野生型のヒトを除く動物である、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記ヒトを除く動物が齧歯類である、請求項１０〜１２のいずれか一に記載の方法。
  14. 前記ヒトを除く動物がマウスである、請求項１３に記載の方法。
  15. 足圧迫試験、テールフリック試験、ホルマリン試験またはVon Freyヘア試験により決定が行われる、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 低活動性膀胱に罹患している個体または罹患している疑いがある個体から採取した試料を解析する方法であって、前記試料における、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドの発現レベルが、正常な動物から採取した試料における前記ポリペプチドの発現レベルに比べて、減少していることを検出することを含む、方法。
  17. 過活動膀胱に罹患している個体または罹患している疑いがある個体から採取した試料を解析する方法であって、前記試料における、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドの発現レベルが、正常な動物から採取した試料における前記ポリペプチドの発現レベルに比べて、増加していることを検出することを含む、方法。
  18. 痛覚過敏に罹患している個体または罹患している疑いがある個体から採取した試料を解析する方法であって、前記試料における、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドの発現レベルが、正常な動物から採取した試料における前記ポリペプチドの発現レベルに比べて、増加していることを検出することを含む、方法。
  19. 前記アゴニストまたはアンタゴニストが、好ましくは配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドに特異的に結合できる、イムノグロブリン、好ましくは抗体を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  20. 正常個体と比較して低活動性膀胱を示すヒトを除く動物であって、前記ヒトを除く動物がトランスジェニック動物であり、配列番号１，２，４もしくは１０に示される核酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を有する内在性ＢＡＣＨ遺伝子が機能的に破壊されているヒトを除く動物を、低活動性膀胱のモデル動物として使用する方法。
  21. 正常個体と比較して痛みの感受性の低下を示すヒトを除く動物であって、前記ヒトを除く動物がトランスジェニック動物であり、配列番号１，２，４もしくは１０に示される核酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を有する内在性ＢＡＣＨ遺伝子が機能的に破壊されているヒトを除く動物を、痛覚不全のモデル動物として使用する方法。
  22. 低活動性膀胱を治療するための医薬組成物を製造するための、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドのアゴニスト抗体の使用。
  23. 過活動膀胱を治療するための医薬組成物を製造するための、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドのアンタゴニスト抗体の使用。
  24. 痛みを緩和する治療するための医薬組成物を製造するための、配列番号３，５，７もしくは９に示されるアミノ酸配列またはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＢＡＣＨポリペプチドのアンタゴニスト抗体の使用。
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GB0312844D0 (en) * 2003-06-04 2003-07-09 Paradigm Therapeutics Ltd Use of compounds in medicine
GB0312845D0 (en) * 2003-06-04 2003-07-09 Paradigm Therapeutics Ltd Use of componds in medicine
EP2374474A1 (en) * 2005-01-19 2011-10-12 Vaxinnate Corporation Compositions comprising pathogen-associated molecular patterns and antigens and their use to stimulate an immune response
US9733899B2 (en) * 2015-11-12 2017-08-15 Arm Limited Lane position information for processing of vector
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010080882A (ko) * 1998-10-13 2001-08-25 리처드 피. 버군 쥬니어 구성적으로 활성화된 비내생성 인간 ｇ 단백질 결합형수용체
WO2000023588A2 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. G-protein coupled receptors
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