JP4220557B2

JP4220557B2 - タンパク質融合による切頭型耐熱性ｄｎａポリメラーゼの過発現及び精製

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Publication number: JP4220557B2
Application number: JP2007064495A
Authority: JP
Inventors: ヒユーミン・コン; ジヨン・ジエイ・ペルチヤー; ジエイスン・エム・アリオツタ
Original assignee: ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1995-08-02
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2009-02-04
Anticipated expiration: 2016-08-02
Also published as: JP2007143566A; EP0757100B1; DE69627080T2; JPH09224681A; DE69627080D1; JP4446498B2; EP0757100A1; US5814506A

Description

本発明は、耐熱性ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ、及び切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを組換えＤＮＡ技術やタンパク質融合技術を用いて商業的に有用な量製造する方法に関する。

ＤＮＡは大半の生物の遺伝物質である。ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの複製や修復に関与する酵素である。細菌、酵母及びヒトを含む種々の生物に由来するＤＮＡポリメラーゼの単離や特性分析に関しては広範な研究が行われている。

ＤＮＡポリメラーゼは、基本的な重合機能の他に、そのポリペプチドのＮ末端ドメインに５’→３’又は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含み得る。両方のエキソヌクレアーゼが存在する場合、５’→３’エキソヌクレアーゼドメインがＮ末端に存在し、その次に３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン及びＣ末端ポリメラーゼドメインが来る。ニックトランスレーションや修復のためには、進行する（ａｄｖａｎｃｉｎｇ）ＤＮＡポリメラーゼの経路内にあるＤＮＡを５’→３’方向に切り出しする５’→３’エキソヌクレアーゼが必要である。ミスマッチのヌクレオチドを３’→５’方向に切り出しして正しく修復するには３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が必要である。配列の比較により３種の３’→５’エキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）が同定された（Ｂｌａｎｃｏ等，（１９９１）Ｇｅｎｅ，１００，２７−３８）。

耐熱性真正細菌や耐熱性古細菌から幾つかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが単離された。これらのポリメラーゼは、その耐熱性を基準にして３つのグループに分けることができる。高度好熱菌から単離されたＤＮＡポリメラーゼは１００℃で安定である。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼは１００℃で２時間の半減期を有し、このことは１００℃で２時間インキュベートした後に、Ｖｅｎｔポリメラーゼの重合活性の半分が保持されることを意味している（Ｋｏｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９３），同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。超耐熱性のＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓから単離されたＴａｑＤＮＡポリメラーゼは９５℃で１．６時間の半減期を有する（Ｋｏｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，上掲（１９９３），同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩは第３のグループである中度好熱菌に属し、６５℃で安定である。

ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは最初Ｓｔｅｎｅｓｈ及びＲｏｅ（Ｓｔｅｎｅｓｈ及びＲｏｅＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２７２：１５６−６（１９７２））によって単離され、Ｋａｂｏｅｖ等（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４５：２１−６（１９８１））は更にＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを精製し、このポリメラーゼが分子量７６ｋＤａで、５’→３’及び３’→５’の両方のエキソヌクレアーゼ活性を有すると結論付けた（上記文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。ポリメラーゼに対するエキソヌクレアーゼの相対活性は非常に低く、Ｋａｂｏｅｖはそれが汚染によるものであり得るとコメントとした。Ｓｅｌｌｍａｎ等（Ｓｅｌｌｍａｎｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：４３５０−４３５５（１９９２），同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）は、エキソヌクレアーゼ活性を持たない９５ｋＤａのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを精製した。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼはクローニングされたように思えるが（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのカタログ）、クローニング手順や配列情報に関する刊行物は入手できない。ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、５’→３’及び３’→５’の両方のエキソヌクレアーゼ活性がｒＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ中に存在すると報告している。

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは分子生物学や医薬研究で非常に有用である。例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの耐熱性は、ＤＮＡ増幅（Ｌａｗｙｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：６４２７−６４３７（１９８９），同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）のためのポリメラーゼ連鎖反応法（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号）の収率、特異性、自動化及び有用性に大きく寄与した。他の具体例は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの大断片（ＢｓｔＬ．Ｆ．）のＤＮＡ配列決定のための使用である（Ｙｅ，ＳｃｉｅｎｔｉａＳｉｎｉｃａ，３０：５０３−５０６（１９８７）；ＭｃＣｌａｒｙ，ＤＮＡＳＥＱ．１：１７３−１８０（１９９１）、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。耐熱性Ｂｓｔポリメラーゼを用いることにより、配列決定反応を高温（６５℃）で行って二次構造を壊し、オートラジオグラム上で均一なバンド強さと低いバックグラウンドを得ることができる。ＢｓｔＬ．Ｆ．は、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＧ．ＴｅｒｒａｎｃｅＷａｌｋｅｒ等によって開発された等温指数的ＤＮＡ増幅技術である鎖置換増幅法（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）でも使用され得る。例えば、Ｗａｌｋｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３９２−３９６（１９９２）（同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）を参照されたい。

ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ドメインをズブチリシン（プロテイナーゼ）による部分消化によって重合ドメインから分離して、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩのクレノー断片に類似する７５ｋＤａＤＮＡポリメラーゼドメイン（「大断片」と称する）を産生することができる（Ｙｅ，ＳｃｉｅｎｔｉａＳｉｎｉｃａ，上掲（１９８７）、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。ズブチリシンを使用してＢｓｔＬ．Ｆ．を産生することができるが、ズブチリシンによってＢｓｔポリメラーゼが非特異的分解を起こすため、その有効性は低い。

従って、これまでに産生されたもので見られる欠点や無効性を克服するＢｓｔＩＤＮＡポリメラーゼ（その大断片を含む）の新規製造方法が必要となる。

本発明は、耐熱性ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ、及び切頭型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを組換えＤＮＡ技術やタンパク質融合技術を用いて商業的に有用な量製造する方法に関する。

具体的には、好ましい一実施態様では、３’→５’エキソヌクレアーゼを含まず、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含んでいる点で、これまでに報告されたＢｓｔポリメラーゼとは異なるＢｓｔＩＤＮＡポリメラーゼを提供する。他の好ましい実施態様では、５’→３’エキソヌクレアーゼを不活化してもよい。本発明は更に、組換えＤＮＡ技術やタンパク質融合技術を用いたＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩの大断片の独特の製造方法を提供する。タンパク質融合系では、クローニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードするｍａｌＥ遺伝子の下流のｐＭＡＬベクター内に挿入すると、ＭＢＰ融合タンパク質が発現される（Ｇｕａｎ，Ｃ等，（１９８７）Ｇｅｎｅ６７，２１−３０；Ｍａｉｎａ，Ｃ．Ｖ．等，（１９８８）Ｇｅｎｅ７４，３６５−３７３，同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。この技術は、多量の融合タンパク質を発現するために強いＰｔａｃプロモーターとＭＢＰ翻訳開始シグナルを使用する。次いで、ＭＢＰの一ステップ親和性精製により融合タンパク質を精製することができる（Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ及びＦｅｒｅｎｃｉ（１９８２）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．９０，４５９−４６３，同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。

１つの好ましいアプローチによれば、本発明のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩをＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからほぼ均質になるまで精製し、そのＮ末端の最初の２１アミノ酸残基の配列を決定した。このアミノ酸配列に基づいて、縮重オリゴヌクレオチドを作製した。ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子の３’末端ヌクレオチド配列を決定するために逆ＰＣＲを実施した。Ｂｓｔ染色体ＤＮＡをＮｇｏＭＩ又はＳａｕ３ＡＩで消化し、次いでＴ４リガーゼを用いて連結して環を形成した。使用する２個のプライマーは、遺伝子の３’末端付近の６４２ｂｐＤＮＡ断片の配列データを用いて設計した。この断片を、ＰｏｌＩ様ＤＮＡポリメラーゼ中に保存されたアミノ酸配列モチーフの存在に基づいてクローニングした。ＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を決定し、ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子の３’末端を同定した。５’末端及び３’末端両方のヌクレオチド配列を決定した後に、全ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、これをｐＥＴ２１ａ発現ベクター内にクローニングした。耐熱性ＢｓｔＰｏｌＩを組換えプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ中で産生し、その後全ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼをズブチリシンで部分消化して、ＢｓｔポリメラーゼＩの大断片を生成した。ズブチリシンで部分消化した断片を生成し、この大断片のＮ末端アミノ酸配列を決定した。その後、切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ内に発現させようとしたが失敗した。切頭型ｍＲＮＡ又はタンパク質はｉｎｖｉｖｏで不安定であると考えられる。更には、Ｂｓｔ大断片はホロ酵素に比べてＥ．ｃｏｌｉ宿主に対して致死的であり、クローニングに際し問題となった。このような問題を克服し、更には精製ステップを簡略化するために、ＭＢＰ融合タンパク質を産生することによって転写ｍＲＮＡを安定化させるか又はより安定したもしくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質を製造することを期待して、５’末切頭型ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子をｐＭＡＬ−ｃ２ベクター内にクローニングした。実際、融合タンパク質及び大きな切断Ｂｓｔ断片は共に６５℃で活性を有した。

ＢｓｔＰｏｌＩ大断片の製造について本明細書に記載する好ましい方法は以下のステップからなる：
１．ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩをＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから精製する。この生物は好熱菌であって、増殖温度範囲は４５℃〜７０℃である。細胞増殖後、以下のような複数ステッププロセスを用いてＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩを精製する。まず、細胞を緩衝液Ａ（２０ｍＭＫＰＯ_４緩衝液，ｐＨ６．５；１ｍＭＥＤＴＡ；１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）中に懸濁させ、超音波処理し、遠心分離にかける。ＫＰＯ_４濃度は上清中２００ｍＭに調整し、次いで上清を、ＤＥＡＥセファロースカラムのような核酸に対して高い親和性を示すカラムに通す。上清溶液中に存在する核酸はＤＥＡＥに結合するため、核酸はＫＰＯ_４塩濃度２００ｍＭでカラムを素通りするタンパク質と分離される。素通りしたタンパク質をヘパリンセファロースカラムに添加する。カラムを洗浄し、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性を緩衝液Ａ中０→０．７ＭＫＣｌのような直線勾配で溶離する。緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；０．５ｍＭＥＤＴＡ；１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）中でピークＤＮＡポリメラーゼ活性を透析し、Ｑ−セファロースカラムに添加する。酵素活性を緩衝液Ｂ中０．０２５→１ＭＫＣｌのような直線勾配で溶離する。再度、ＤＮＡポリメラーゼのピーク活性を透析し、ヘパリンＴｓｋ１カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ）に添加する。酵素を、緩衝液Ｂ中０．０２５→１ＭＫＣｌ直線勾配で溶離する。この段階での酵素純度は約９５％である（図１）。
２．ステップ１で得たＢｓｔＰｏｌＩ酵素を、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１００３５−１００３８（１９８７）の手順に従って電気泳動及びエレクトロブロッティングに付す。上記文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、９０ｋＤａの主タンパク質バンドを切り出し、Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３：５２０７−５２１９（１９９１）の手順に従って連続的に分解させた。上記文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする。９０ｋＤａタンパク質の最初の２１残基はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３）である。ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ内へのクローニング及び発現を行うために、制限酵素（ＸｂａＩ）クローニング部位及びリボソーム結合部位を含む縮重プライマー（プライマーＡ）をアミノ酸配列に基づいて作製する。
３．ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子がＰＣＲによって直接クローニングされ得るように３’末端ヌクレオチド配列を決定するために、ＮｇｏＭＩ及びＳａｕ３ＡＩで切断／自己連結したＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡ鋳型から逆ＰＣＲ産物を増幅させる。ＮｇｏＭＩで消化、自己連結したＢｓｔＤＮＡを鋳型として使用した反応では、寸法が約０．９５ｋｂの断片が得られる。Ｓａｕ３ＡＩで消化、自己連結したＢｓｔＤＮＡを鋳型として使用した反応では、寸法が約１．５ｋｂの断片が得られる。０．９５ｋｂ及び１．５ｋｂの２つの増幅ＤＮＡバンドをアガロースゲルから切り出し、直接ＤＮＡの配列決定に付す。終結コドン（ＴＡＡ）がＮｇｏＭＩで消化／自己連結した配列中１８０塩基対に見出され、これはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の終結コドンであると考えられる。ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子の３’末端にアニーリングする、ＮｏｔＩクローニング部位を含む他のプライマー（プライマーＢ）を作製する。
４．ＰＣＲ反応を実施すると、予測される２．６ｋｂバンドがアガロースゲル上で観察される。ゲルから２．６ｋｂ断片を精製し、次いでＮｏｔＩ及びＸｂａＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＸｂａＩで消化したｐＥＴ−２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）内にクローニングする。ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子を含む組換えプラスミドをＥＲ２１６９コンピテント細胞（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）内に形質転換する。６５℃で耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ活性（約３０，０００ｕ／ｇ宿主細胞）が中温好性Ｅ．ｃｏｌｉ宿主で観察され、このことはＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子のクローニング及び発現に成功したことを示している。中断のない２６３１ｂｐの読み取り枠（ＯＲＦ）に相当する全ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子のヌクレオチド配列を決定する（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。２６３１ｂｐ遺伝子は分子量計算値９９，００７．６７の８７６アミノ酸タンパク質をコードし、この分子量は１０→２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル上で観察された約９７ｋＤａの分子量と一致する（図１）。
５．ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩをプロテアーゼズブチリシンで消化すると、Ｂｓｔ大断片（ＢｓｔＬ．Ｆ．）が産生されることが観察された。ＢｓｔＬ．Ｆ．は５’→３’エキソヌクレアーゼドメインの欠如した切頭型ポリメラーゼであり、ＤＮＡの配列分析で非常に有用な酵素である（Ｙｅ及びＨｏｎｇ，ＳｃｉｅｎｔｉａＳｉｎｉｃａ，３０：５０３−５０６（１９８７）、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。ズブチリシンを使用してＢｓｔＬ．Ｆ．を産生することができるが、ズブチリシンによってＢｓｔポリメラーゼの非特異的分解が生じるために有効性は低い。本発明によれば、ＢｓｔＬ．Ｆ．を５’末端に欠失を有するＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子から直接産生する方がズブチリシン消化よりも効果的であり、これによりＤＮＡの配列決定や鎖置換増幅法（Ｗａｌｋｅｒ等、上掲）のような用途でのＢｓｔＬ．Ｆ．の実用性が高くなる。しかしながら、ＢｓｔＬ．Ｆ．のクローニング及び発現のための独創的な実験は失敗した。転写されるｍＲＮＡ、又は切頭型遺伝子から翻訳されるタンパク質はｉｎｖｉｖｏで不安定であると考えられる。更には、Ｂｓｔ大断片はＥ．ｃｏｌｉ宿主に対して非常に致死的であり、ポリメラーゼ活性が低いか又はポリメラーゼ活性を持たない変異体だけが選択されたと考えられる。このような問題を克服するために、ＭＢＰ−ＢｓｔＬ．Ｆ．融合タンパク質を産生することによって転写ｍＲＮＡを安定化させるか又はより安定したもしくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質を製造することを期待して、５’末端切頭型ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子をｐＭＡＬ−ｃ２ベクター内にクローニングした。

ＢｓｔＬ．Ｆ．のＮ末端境界部分を解明するために、精製したＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ（図１）を適量のズブチリシンで消化し、次いでズブチリシンで消化した大きな断片を、トリス−トリシン１０→２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上の電気泳動に付し、次いでエレクトロブロッティングした（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６２：１００３５−１００３８（１９８７）、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする）。ＢｓｔＬ．Ｆ．に相当する約６７ｋＤａのタンパク質バンドを切り出し、Ｎ末端タンパク質の配列決定に付した（Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等，上掲）。６７ｋＤａタンパク質の最初の７残基はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号４）に相当し、これはズブチリシン切断部位がＡｌａ２８９〜Ａｌａ２９０の間に位置することを示している（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。大断片のＮ末端アミノ酸配列は、クローニングしたＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子から推定されるアミノ酸配列に適合する（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。

この配列に基づいて、ＦｓｐＩ制限酵素部位を含むプライマー（プライマーＣ）を、ＢｓｔＬ．Ｆ．の開始部に相当する８６８〜８９０位の部位でＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子にアニーリングするように設計する（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。ＸｂａＩ部位を有する他のプライマー（プライマーＤ）を、前記遺伝子の３’末端にアニーリングするように設計する。ＰＣＲを実施して、Ｂｓｔ大断片をコードする５’末端−切頭型ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子を増幅させる。Ｂｓｔ大断片の予想される寸法に相当する１．８ｋｂのＤＮＡ断片を増幅させる。１．８ｋｂの断片をＦｓｐＩ（ブラント末端）及びＸｂａＩによって切断し、次いでＸｍｎＩ（ブラント末端）及びＸｂａＩで切断したｐＭＡＬ−ｃ２ベクター（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）内にクローニングする。クローニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする（Ｅ．ｃｏｌｉ由来の）ｐＭＡＬ−ｃ２ｍａｌＥ遺伝子のすぐ下流に導入すると、ＭＢＰ−ＢｓｔＬ．Ｆ．融合タンパク質が発現される（図３）。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＲＲＩ細胞（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）内に形質転換する。このプラスミドを含む細胞を超音波処理し、遠心分離にかける。ここでも６５℃で好熱性のＤＮＡポリメラーゼ活性（約１３０，０００ｕ／ｇ宿主細胞）が中温好性宿主で観察され、このことはＭＢＰ−Ｂｓｔ融合タンパク質が６５℃で活性を有することを示している。
７．ステップ６の上清を（実施例ＶＩで詳述する）アミロース親和性カラムに添加する。核酸及び他の全ての宿主細胞タンパク質（ＭＢＰ−Ｂｓｔ融合タンパク質は除く）をカラムに通し、カラムをカラム容量の数倍の緩衝液Ｃ（２００ｍＭＮａＣｌ；２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；１ｍＭＥＤＴＡ；１ｍＭＤＴＴ）で洗浄して除去する。ＭＢＰ−ＢｓｔＬ．Ｆ．融合タンパク質を緩衝液Ｃ中の１０ｍＭマルトースで溶離する。溶離した融合タンパク質をＳ−１００サイズ排除カラムで更に精製して、遊離ＭＢＰを排除する。
８．精製したＭＢＰ−Ｂｓｔ融合タンパク質を因子Ｘａプロテアーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ＃８００−１０）で切断することができる。因子Ｘａの切断後、１１０ｋＤａのＭＢＰ−ＢｓｔＬ．Ｆ．融合タンパク質が分解し、予想される６７ｋＤａのＢｓｔＬ．Ｆ．及び４０ｋＤａのＭＢＰが得られた（図３）。ＭＢＰ−ＢｓｔＬ．Ｆ．融合タンパク質及び因子Ｘａで切断したＢｓｔＬ．Ｆ．は共に活性を有するが、因子Ｘａで切断したＢｓｔＬ．Ｆ．（４５，３００ｕ／ｍｇ）は融合タンパク質（６，３００ｕ／ｍｇ）の約７倍の比活性を有する。融合体の比活性が低いために、ＭＢＰ−Ｂｓｔ融合タンパク質中の耐中温性ＭＢＰが６５℃で熱変性を起こし得る。切断したＢｓｔＬ．Ｆ．は耐熱性があり比活性もより高いので、産生のための好ましい酵素となるはずである。
９．因子Ｘａ及び切断した遊離ＭＢＰを除去するために、６５℃で２０分間インキュベートして因子Ｘａ消化体に熱負荷を加え、次いで緩衝液Ｅ（５０ｍＭＮａＣｌ；２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．８；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１ｍＭＤＴＴ）に平衡化したＳｏｕｒｃｅ−Ｑ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）カラムに添加する。酵素を緩衝液Ｄ中５０ｍＭ→６００ｍＭＮａＣｌの直線勾配で溶離する。ＢｓｔＬ．Ｆ．を７倍容量の緩衝液Ｆ（２０ｍＭＫＰＯ_４，ｐＨ６．９；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１ｍＭＤＴＴ）で希釈し、緩衝液Ｇ（５０ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＫＰＯ_４，ｐＨ６．９；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１ｍＭＤＴＴ）に平衡化した１ｃｍ×１０ｃｍのヘパリン−ＴＳＫ５ＰＷガード樹脂カラムに添加する。酵素を緩衝液Ｆ中５０ｍＭ→６００ｍＭＮａＣｌの直線勾配で溶離する。酵素含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べると、予想分子量が６７，０００で純度が９０％以上であることが判明した（図４）。この組換えＢｓｔＬ．Ｆ．の比活性は１００，８００ｕ／ｍｇである。

本明細書に記載する組換えＢｓｔＬ．Ｆ．は複製中に鎖置換することが可能で、５’→３’及び３’→５’のいずれのエキソヌクレアーゼ活性も有さない（図６）。これは、ＢｓｔＰｏｌＩが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有することを示すＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のカタログに記載のものとは異なる。
１０．エキソヌクレアーゼ活性アッセイを実施して、本発明のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩと関連するエキソヌクレアーゼ活性の方向性を決定する。５’−^３２Ｐ及び３’−^３Ｈ末端ラベルを用いて線状ＰＵＣ１９ＤＮＡ基質を調製し、ＢｓｔポリメラーゼＩと共に、また対照としてＶｅｎｔ、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてインキュベートする間の２つのラベルの可溶化を監視する。Ｖｅｎｔは３’→５’エキソヌクレアーゼを有し、結果として^３Ｈラベルを可溶化する。Ｔａｑは５’→３’エキソヌクレアーゼを有し、従って^３２Ｐラベルを可溶化する。Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌＩは５’→３’及び３’→５’の両方のエキソヌクレアーゼを有し、従ってＥ．ｃｏｌｉＰｏｌＩと共にインキュベートする間に^３２Ｐ及び^３Ｈの両方のラベルが可溶化する。ＢｓｔＰｏｌＩと共にインキュベートすると、Ｔａｑと同様に^３２Ｐラベルだけが可溶化し、このことはＢｓｔＰｏｌＩが５’→３’エキソヌクレアーゼを有するが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は欠如していることを示している（図５）。配列データは、ＢｓｔＰｏｌＩが３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン中に「ＤＸＥ」ｅｘｏＩモチーフを持たないことを示しており、これは本発明のエキソヌクレアーゼアッセイデータと一致していた。

ＢｓｔＰｏｌＩには３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如していることを更に確かめるために、３’末端にＧ：Ａミスマッチを含むプライマーでアニーリングしたＭ１３ｓｓＤＮＡを用いて、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼアッセイを実施する。３’→５’エキソヌクレアーゼを有するＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼはミスマッチのＧを効果的に除去し、次いでプライマーを伸長して、より高い相対的ポリメラーゼ活性を得ることができる（図６、Ｖｅｎｔｅｘｏ^＋）。Ｔａｑポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼを持たず、従ってミスマッチを修正することができず、相対的ポリメラーゼ活性は５分の１である（図６、Ｔａｑ）。Ｔａｑと同様に、Ｂｓｔの相対的ポリメラーゼ活性も低く、このことはＢｓｔにはミスマッチのＧの除去に必要な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如しており、このため３’末端が、伸長されたＤＮＡポリメラーゼとなり得ることを示している。

実施することが好ましい本発明の実施態様を以下の実施例で説明する。本実施例は例示的であり、本発明は特許請求の範囲に記載する範囲を除いて以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１
Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子のクローニング
１．逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲを用いてのＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子の３′末端の決定
１反応当たり１．２μｇのＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡを用いて、複数の個別管内で制限消化を行なった。前記ＤＮＡを４５μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒＳａｕ３ＡＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮＥＢｕｆｆｅｒＳａｕ３ＡＩ＝１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭビストリスプロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオトレイトール；ｐＨ７．０＠２５℃）に加えた混合物に、５０ＵのＳａｕ３ＡＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，＃１６９）を添加した。前記ＤＮＡを４５μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ４（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮＥＢｕｆｆｅｒ４＝５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール；ｐＨ７．９＠２５℃）に加えた混合物には、５０ＵのＮｇｏＭＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，＃５６４）を添加した。Ｓａｕ３ＡＩ反応混合物には１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有させた。いずれの反応混合物も最終体積を５０μｌとした。両消化物を３７℃で１時間インキュベートした。消化物から制限酵素を、フェノール（１回）及びクロロホルム（２回）での抽出によって除去した。各消化物に５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び１００μｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールを添加することによってＤＮＡを沈澱させ、これを遠心によって回収した。ＤＮＡを個別管内で５００μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液＝５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．８、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／μｌＢＳＡ）中に再懸濁させ、３，０００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，＃２０２）を添加した。両連結反応混合物を１６℃で一晩、次いで７２℃で２０分間インキュベートした。

次に、自己連結したＢｓｔゲノムＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３′末端を位置決めする逆ＰＣＲ反応において鋳型として用いた。上述のように消化し、かつ自己連結させたＤＮＡ各１０ｎｇ、２００μＭｄＮＴＰ、５０ｎｇの順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー［５′ＧＡＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡ３′（配列番号５）］及び５０ｎｇの逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー［５′ＣＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＣＧＧＡＣＧＴＴＧＡ３′（配列番号６）］を４９．５μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液＝１０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．８＠２５℃、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２ｍＭＭｇＳＯ_４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に加えたものを用いて、個別管内でＰＣＲ反応を生起させた。順方向及び逆方向プライマーはＢｓｔゲノムＤＮＡに、互いから５５塩基対離隔してアニールし、これらのプライマーはＤＮＡを反対方向へ伸長させるように設計してある。

プライマー設計の基としたＤＮＡ配列はＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の、予めｐＧＥＭ−Ｔベクター［Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ａ３６２Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）］中へクローニングし、かつ配列決定した（Ｓａｎｇｅｒ等，ＰＮＡＳ７４，ｐｐ．５４６３−５４６７，１９７７；この開示は本明細書中に参考として含まれる）６４２塩基対断片に由来した。各反応混合物に２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ［ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｎ８０１−００４６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）］を添加し、最終体積を５０μｌとした。上述のものと同じ反応混合物中に各鋳型を１０ｎｇずつ用いて、付加的な４種のＰＣＲ反応も生起させた。しかし、これらの反応では、２種のプライマーの各一方を２種のＤＮＡ鋳型のそれぞれと共にインキュベートした（４種の反応）。これらの反応の生成物は、２箇所における同一プライマーアニーリング及び前記２箇所の間の領域の増幅によって創出されるバックグラウンドを表わす。

いずれのＰＣＲ反応でも、最初のセグメントは９４℃で２分間のサイクル１回から成った。後続ＰＣＲセグメントはそれぞれ、９４℃で０．５分間、６２℃で１分間及び７２℃で２分間のサイクル２０回、並びに９４℃で０．５分間、６２℃で１分間及び７２℃で４分間のサイクル１０回から成った。最後のセグメントは、７２℃で２分間及び２５℃で１０分間のサイクル１回から成った。各５０μｌ反応混合物から２０μｌを取り分け、エチジウムブロミド存在下でのアガロースゲル電気泳動に掛けて増幅が生起したかどうかを判定した。Ｓａｕ３ＡＩで消化し、かつ自己連結させたＢｓｔＤＮＡを鋳型として用いた反応混合物では、約１．５ｋｂの大きさの増幅断片が得られた。ＮｇｏＭＩで消化し、かつ自己連結させたＢｓｔＤＮＡを鋳型として用いた反応混合物では、約０．９５ｋｂの大きさの増幅断片が得られた。これら二つの断片は、４種のバックグラウンド反応で創出されたいずれの断片にも対応しなかった。

順方向プライマーと逆方向プライマーとの両方を用いて２種の鋳型を別個に増幅するＰＣＲ反応を繰り返した。前回と同じＰＣＲ条件を用いたが、いずれの反応も８個の個別管内で、体積５０μｌの反応混合物中に同等の試薬を用いて生起させた。総量４００μｌの各反応混合物を、エチジウムブロミド存在下にＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ）中の１％低温融解アガロースゲル上で行なうアガロースゲル電気泳動に掛けた。適当なバンド（Ｓａｕ３ＡＩの場合１．５ｋｂ、ＮｇｏＭＩの場合０．９５ｋｂ）を切り取り、別個の管内で６５℃に加熱した。アガロースが融解した後、５０μｌのβ−アガロースＩ緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ β−アガロースＩ緩衝液＝１０ｍＭビストリス−ＨＣｌｐＨ６．５、１ｍＭＮａ_２ＥＤＴＡ）を添加し、管を４０℃に冷却した。各反応混合物に４Ｕのβ−アガロースＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，＃３９２）を添加した。β−アガロースＩ処理は４０℃で１時間行なった。β−アガロース及びＤＮＡポリメラーゼをフェノール（１回）及びクロロホルム（２回）での抽出によって除去した。５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び１，０００μｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールを添加することによってＤＮＡを沈澱させ、これを遠心によって回収した。各ＤＮＡペレットを５０μｌの１×ＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、１μｌ試料をアガロースゲル電気泳動に掛けてＤＮＡ濃度を測定した。両ＤＮＡ断片を、ＤＮＡをポリメラーゼ遺伝子の３′末端方向へ伸長させると考えられる順方向プライマーを用いて配列決定した（Ｓａｎｇｅｒ等，ＰＮＡＳ７４，ｐｐ．５４６３−５４６７，１９７７；この開示は本明細書中に参考として含まれる）。ＮｇｏＭＩで消化し、かつ自己連結させた配列中の１８０塩基対の位置に終結コドン（ＴＡＡ）を見出した。

２．ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子の増幅
２μｇのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩをトリス−トリシン１０→２０％勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上での電気泳動に掛け、電気ブロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）した（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，ｐｐ．１００３５−１００３８，１９８７；この開示は本明細書中に参考として含まれる）。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、約９７ｋＤａのタンパク質のバンドを切り取り、連続的に分解（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）した（Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３，ｐｐ．５２０７−５２１９，１９９２；この開示は本明細書中に参考として含まれる）。９７ｋＤａタンパク質の最初の７残基はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号７）に対応した。プライマーは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端アミノ酸配列［５′ＷＴＧＡＡＲＡＡＲＡＡＲＣＴＮＧＴＮＹＴ３′（配列番号８）］と、逆ＰＣＲから得られた遺伝子の３′末端の配列［５′ＴＣＴＴＡＴＴＴＮＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号９）］とに基づき設計した。１５０ｎｇのＢｓｔゲノムＤＮＡと、１００ｐｍｏｌの各プライマーと、２００μＭｄＮＴＰとを９８μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液に添加した。１μｌ（５Ｕ）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び１μｌ（０．０５Ｕ）のＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，＃２５８）を添加してＰＣＲ反応（９４℃で０．５分間、４５℃で１分間及び７２℃で３分間のサイクル３５回）を開始させた。１５μｌを取り分け、エチジウムブロミド存在下でのアガロースゲル電気泳動に掛けた。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の予測される大きさに対応する２．６ｋｂの断片が増幅された。残りの８５μｌを、エチジウムブロミド存在下にＴＡＥ緩衝液中の１％低温融解アガロースゲル上で行なうゲル電気泳動に掛け、２．６ｋｂ断片を切り取った。ＤＮＡを含有する切片をβ−アガロースＩで処理し、フェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール及び酢酸ナトリウムで沈澱させ、これらの操作はいずれも先に述べたように行なった。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。２．６ｋｂ断片の制限マッピングを行なって、完全な断片のベクター中へのクローニングを可能にするプライマーの設計がそれによって可能となる単一の制限部位の存在を確認した。ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ及びＸｂａＩがＤＮＡ断片を切断しなかったので、断片の３′末端にアニールする、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位を有する第一のプライマー［５′ＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＮＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号１０）］と、断片の５′末端にアニールする、ＸｂａＩ部位を有する第二のプライマー［５′ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＷＴＧＡＡＲＡＡＲＡＡＲＣＴＮＧＴＮＹＴ３′（配列番号１１）］との二つのプライマーを設計した。２．６ｋｂ断片の増幅に用いたのとまさに同じ条件下に、ただし本来のプライマーを上記制限酵素部位を有するプライマーに置き換えてＰＣＲ反応を生起させた。総量６００μｌのＰＣＲ反応混合物を収容した同等の管を６本用いた。

総ての６００μｌ混合物を１％低温融解アガロースゲル上でのゲル電気泳動に掛け、２．６ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をゲルから切り取った。アガロース中に埋まったＤＮＡを１ｍｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮＥＢｕｆｆｅｒ２＝１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ；ｐＨ７．９＠２５℃）に対し、４℃で４５分間透析した。次に、アガロースを新しい管に入れ、６５℃で１０分間融解させた。融解したアガロースゲルを３７℃に冷却し、７μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、３．５Ｕのβ−アガロースＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１００ＵのＸｂａＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、ｐＨ８．０の５ＭＮａＣｌ及び１Ｍトリスを添加して、ＮａＣｌ及びトリスの最終濃度をそれぞれ１００ｍＭ及び５０ｍＭとした。その後、ＸｂａＩ消化物に１００ＵのＮｏｔＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を添加し、３７℃で更に１時間インキュベートした。Ｔ７プロモーターを含有するｐＥＴ−２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）１μｇを４５μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で３７℃で１時間、２５ＵのＮｏｔＩ及び５０ＵのＸｂａＩで消化した。先に述べたのと同様に、反応混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈澱させ、６０μｌの１×ＴＥ中に再懸濁させた。４００ｎｇのＸｂａＩ／ＮｏｔＩ消化ＰＣＲ生成物を４５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で１００ｎｇのＸｂａＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＥＴ−２１ａに連結させた。５，０００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加して最終体積を５０μｌとし、反応混合物を１６℃で４時間インキュベートした。

１００μｌのＣａＣｌ_２コンピテント（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８２；この開示は本明細書中に参考として含まれる）ＲＲＩ細胞（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を１０μｌの連結混合物で形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ（ルリアブロス；１ｌ；トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、１７０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭグルコース、０．５ｍＭＭｇＣｌ_２；ｐＨ７．２）プレート上で３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを採取し、２．６ｋｂ挿入物に関してミニプラスミド調製物（ＷｉｚａｒｄＭｉｎｉｐｒｅｐｓ；ＤＮＡ精製系；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）でスクリーニングした。スクリーニングした３８個の形質転換体中５個が適正な挿入物を有し、これら適正な挿入物を有する形質転換体のうちの１個から得た１μｌのミニプレップＤＮＡを用いて、ＩＰＴＧで誘導されるとＴ７ＲＮＡポリメラーゼを産生し得るＣａＣｌ_２コンピテントＥＲ２１６９細胞（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）５０μｌを形質転換した。細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢプレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。一つのコロニーを採取し、２０ｍｌのアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ中でＫｌｅｔｔ２００の読み取りができるまで３７℃で増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、細胞を３７℃で更に２時間増殖させた。細胞を遠心によって回収し、１０ｍｌの音波処理緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール）中に再懸濁させ、音波処理によって溶解させた。溶解物を遠心によって分離し、かつ６５℃で２０分間インキュベートして、大腸菌宿主細胞に由来するＤＮＡポリメラーゼを変性させた。変性タンパク質を遠心によってペレット化し、上清をＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ活性に関して、プライミングされた（ｐｒｉｍｅｄ）Ｍ１３ｍｐ１８（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の一本鎖ＤＮＡ中への^３ＨｄＴＴＰの取り込みを定量することによってアッセイした。５μｌの上清を、２．８６ｍＭの、プライマー＃１２２４（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）をアニールされたＭ１３一本鎖ＤＮＡ、２００μＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、１００μＭ ^３ＨｄＴＴＰ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、２０ｍＭトリスｐＨ８．８、５０ｍＭＫＣｌ及び１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含有するＢｓｔポリメラーゼアッセイ混合物４５μｌと共に６５℃で５分間インキュベートした。４０μｌの反応混合物を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ，０２４−１０３０）にスポットし、濾紙を１０％トリクロロ酢酸で３回、１００％イソプロパノールで１回洗浄した。濾紙を乾燥し、^３ＨｄＴＴＰの取り込みを液体シンチレーション計数によって定量した。１ｇの誘導ＥＲ２１６９細胞が約３０，０００ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩを産生することが確認された。

実施例２
Ｂｓｔ大断片をコードする５′末端切頭型ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子のクローニング
１．ＢｓｔＬ．Ｆ．のＮ末端境界（ｂｏｒｄｅｒ）のズブチリシンでの解明
５０μｇのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩを、１４０ｍＭＫ_２ＰＯ_４、３ｍＭ β−メルカプトエタノール、３０ｍＭ硫酸アンモニウム、及び１２５μｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡの存在下に室温で５分間ズブチリシン（最終濃度７５ｎｇ／μｌ）で消化した。フェニルメチルスルホニルフルオリドを２．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加することによって消化を停止した。得られたズブチリシン消化ＢｓｔＬ．Ｆ．を４→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＤａｉｉｃｈｉＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）上での電気泳動によって定量した。２μｇのズブチリシン消化ＢｓｔポリメラーゼＩを、トリス−トリシン１０→２０％勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上での電気泳動に掛け、電気ブロットした（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，ｐｐ．１００３５−１００３８，１９８７；この開示は本明細書中に参考として含まれる）。この６７ｋＤａ大断片のＮ末端アミノ酸配列を先に述べたように決定した。６７ｋＤａタンパク質の最初の７残基はＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号１２）に対応し、このことはＢｓｔＬ．Ｆ．のＮ末端境界がＡｌａ２８９とＡｌａ２９０との間であることを示している（図２）。この情報に基づき、ＢｓｔＬ．Ｆ．の境界の下流にアニールするプライマー［５′ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＴＧＡ３′（配列番号１３）］を設計した。このプライマーはＦｓｐＩ切断部位を有するように設計したので、ＦｓｐＩで消化してｐＭＡＬ−ｃ２ベクターのＸｍｎＩ部位に連結させることができた。ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子の３′末端にアニールする、ＸｂａＩ切断部位を有する別のプライマー［５′ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴ３′（配列番号１４）］も設計した。

ＰＣＲを生起させて、Ｂｓｔ大断片遺伝子を増幅した。３９２μｌのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液に４００ｎｇの各プライマー及び２００μＭｄＮＴＰを加えたものに１．６μｇのＢｓｔゲノムＤＮＡを添加した。反応混合物に、４０ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）及び０．４ＵのＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を添加した。ＰＣＲは、９４℃で０．５分間、５０℃で１分間及び７２℃で３分間生起させるサイクルを１８回実施した。Ｂｓｔ大断片遺伝子の予測される大きさに対応する１．８ｋｂ断片が増幅された。残りのＰＣＲ生成物を精製し、ＦｓｐＩ及びＸｂａＩで切断した。１９５ｎｇのＦｓｐＩ／ＸｂａＩ消化ＰＣＲ生成物を４５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で７５ｎｇのＸｍｎＩ／ＸｂａＩ消化ｐＭＡＬ−ｃ２に連結させた。５，０００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、反応混合物を１６℃で４時間インキュベートした。１００μｌのＣａＣｌ_２コンピテント（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８２；この開示は本明細書中に参考として含まれる）ＲＲＩ細胞（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を１０μｌの連結混合物で形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上で３７℃で一晩インキュベートした。適正な挿入物をミニプラスミド調製物でスクリーニングした。スクリーニングした１６個の形質転換体中２個が予測された１．８ｋｂ挿入物を有した。クローニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードするｐＭＡＬ−ｃ２ｍａｌＥ遺伝子（大腸菌由来）の下流に直接挿入し、それによってＩＰＴＧで誘導すればＭＢＰ−ＢｓｔＬ．Ｆ．融合タンパク質が発現されるようにした。正しく構築した組み換えプラスミドを用いて、５０μｌのＣａＣｌ_２コンピテントＴＢ１細胞（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を形質転換した。形質転換プレートから得た単一コロニーを２０ｍｌのアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢに接種した。培養がＫｌｅｔｔ２００に到達した時ＩＰＴＧを濃度０．５ｍＭとなるように添加し、細胞を３７℃で更に２時間増殖させた。

細胞を遠心によって回収し、１０ｍｌの音波処理緩衝液中に再懸濁させ、音波処理によって溶解させた。溶解物を遠心によって分離し、かつ６５℃で２０分間インキュベートして、宿主細胞に由来するＤＮＡポリメラーゼを変性させた。変性タンパク質を遠心によってペレット化し、上清をＢｓｔポリメラーゼ活性に関して実施例１に述べたようにアッセイした。１ｇの形質転換ＴＢ１細胞が約１３０，０００ＵのＢｓｔ大断片を産生することが確認された。ＢｓｔＬ．Ｆ．を有する融合構築物のサンプルを、ブダペスト条約に基づき１９９５年８月２日付でＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ受託番号第６９８７７号を付与された。

実施例３
ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ大断片の精製
ステップ５以外、いずれのステップも４℃で実施した。
ステップ１：粗抽出物の調製
６４ｇの酵素保持（ｂｅａｒｉｎｇ）細胞（ＮＥＢ＃９５６）を解凍し、緩衝液Ｃ（２００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ）中に再懸濁させた。細胞を８分間の音波処理によって破壊した。抽出物を４℃において、ＢｅｃｋｍａｎＪ２−２１遠心機で１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。デカンテーションによって上清を分離した。
ステップ２：アミロースアフィニティークロマトグラフィー
ステップ１で得た上清を、緩衝液Ｃで平衡させた２００ｍｌ容アミロース（ＮＥＢ＃８００−２１）カラムに添加した。カラムを２，２００ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄し、１０ｍＭのマルトースを含有する緩衝液Ｃ８００ｍｌで酵素を溶離した。タンパク質ピーク画分をプールし、緩衝液Ｄ（５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、５０％グリセロール）中への透析で濃縮した。
ステップ３：Ｓ−１００サイズ排除クロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Ｄで平衡させた５ｃｍ×９０ｃｍＳ−１００（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）カラムに添加した。２，０００ｍｌのＳ緩衝液の添加によって酵素を溶離した。酵素含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、プールし、緩衝液Ｅ（５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．８、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ）中へ透析した。
ステップ４：Ｘａ因子プロテアーゼによる融合タンパク質の切断
前ステップで得られた酵素２００ｍｇ（１５０ｍｌ中）を２ｍｇのＸａ因子（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ＃８００−１０）と共に４℃で２２時間インキュベートした。
ステップ５：Ｘａ因子への熱負荷付与（ｈｅａｔ−ｓｔｒｅｓｓｉｎｇ）
ステップ４で得られた切断生成物１５０ｍｌに、６５℃で２０分間のインキュベーションと、続く４℃への冷却とによって熱負荷を付与した。
ステップ６：Ｓｏｕｒｃｅ−Ｑイオン交換クロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Ｅで平衡させた１．６ｃｍ×１０ｃｍＳｏｕｒｃｅ−Ｑ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）カラムに添加した。上記と同じ緩衝液中で、１５０ｍｌの５０→６００ｍＭ直線勾配ＮａＣｌで酵素を溶離した。酵素含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、プールした。
ステップ７：ヘパリン−ＴＳＫ５ＰＷガードレジンカラムクロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を７倍容量の２０ｍＭＫＰＯ_４（ｐＨ６．９）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴで稀釈し、緩衝液Ｇ（５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＫＰＯ_４ｐＨ６．９、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ）で平衡させた１ｃｍ×１０ｃｍヘパリン−ＴＳＫ５ＰＷガードレジンカラムに添加した。Ｈ緩衝液中で、１００ｍｌの５０→６００ｍＭ直線勾配ＮａＣｌで酵素を溶離した。酵素含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４）で確認し、プールし、２０倍容量の貯蔵緩衝液（５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ）に対して透析した。５０μｌの反応混合物中の１，０００単位を最適反応条件下に４時間インキュベートして確認したところ、酵素調製物は実質的に純粋で、他の汚染酵素／タンパク質を含有せず、かつ検出可能なエキソヌクレアーゼ活性を有しなかった。

精製したＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩを分子量標準と共に示す１０→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す説明図である。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードするタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン切断部位を「^＊」によって示し、またＮ末端タンパク質配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示す。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードするタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン切断部位を「^＊」によって示し、またＮ末端タンパク質配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示す。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及び前記遺伝子がコードするタンパク質配列（配列番号２）を示す。ズブチリシン切断部位を「^＊」によって示し、またＮ末端タンパク質配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示す。Ｘａ因子によるＭＢＰ−ＢｓｔＬ．Ｆ．融合タンパク質の切断を示す説明図である。レーン１〜４は切断されていないＳ−１００貯溜物（それぞれ約２．７、５．４、１０．７及び２１．４μｇ）を示す。レーン５〜８は、Ｘａ因子プロテアーゼ（重量比１％）によって４℃で１８時間インキュベートして切断された同量の融合タンパク質を示す。レーンＭの分子量マーカーは、２１２、１５８、１１６、９７．２、６６．４、５５．６、４２．７、３６．５、２６．６、２０．０、１４．３及び６．５ｋＤａである。融合タンパク質は約１１０ｋＤａに対応する。Ｘａ因子プロテアーゼは約３９ｋＤａに対応する。Ｂｓｔポリメラーゼ大断片は約６７ｋＤａに対応し、ＭＢＰ部分は約４２．７ｋＤａに対応する。Ｘａ因子による切断後の精製ＢｓｔＬ．Ｆ．を示す１０→２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す説明図である。レーン１は約４μｇの最終精製Ｂｓｔポリメラーゼ大断片タンパク質を示す。レーン８の分子量マーカーは、２１２、１５８、１１６、９７．２、６６．４、５５．６、４２．７、３６．５、２６．６、２０．０、１４．３及び６．５ｋＤａである。Ｂｓｔポリメラーゼ大断片は約６７ｋＤａに対応する。ＢｓｔＰｏｌＩエキソヌクレアーゼの方向性を測定するエキソヌクレアーゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。５′→３′及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を、３′末端を^３Ｈで標識し、５′末端を^３２Ｐで標識したＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１９を用いて測定する。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化し、４塩基５′突出部を残す。クレノウ断片によって突出部に^３ＨｄＴＴＰを取り込ませ、即ち３′末端を^３Ｈで標識する。５′末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより^３２Ｐ−γＡＴＰでリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌａｔｅ）する。この二重標識基質を、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼそれぞれと共に６５℃で、また大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと共に３７℃で様々な時間インキュベートする。ＤＮＡを１０％ＴＣＡの添加によって沈澱させ、遠心によって回収する。上清中に存在する酸溶解性の放射能を液体シンチレーションによって定量する。３′末端からの^３Ｈの可溶化は３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の存在を示す。５′末端からの^３２Ｐの放出は５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の存在を示す。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（◇）は３′末端から^３Ｈを除去せず、従って３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠如するのでＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（○）に類似する。プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを、３′末端にＧ：Ａミスマッチを有するプライマーとアニールした。３′→５′エキソヌクレアーゼを有するＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼはミスマッチのＧを効率的に除去してプライマーを伸長させ得、その結果相対ポリメラーゼ活性が高くなる（図６の「Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ＋）」）。Ｔａｑポリメラーゼは３′→５′エキソヌクレアーゼを有せず、従ってミスマッチを修正できないので、１／５の低い相対ポリメラーゼ活性しか有しない（図６の「Ｔａｑ」）。Ｔａｑポリメラーゼ同様、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼも低い相対ポリメラーゼ活性しか有せず、このことは、３′末端が伸長したＤＮＡポリメラーゼであり得るように、ミスマッチのＧを除去するのに必要な３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有しないことを示している。

Claims

（ａ）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードするＤＮＡを含むクローニングベクターに、５’末端切頭型ＢｓｔＰｏｌＩ遺伝子を挿入し、ＭＢＰ融合遺伝子を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）のベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
（ｃ）発現されたＭＢＰに融合した切頭型ＢｓｔＩポリメラーゼを回収する工程、および、
（ｄ）プロテアーゼを用いてＢｓｔＩポリメラーゼからＭＢＰを切断して、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した６７ｋＤの活性型ＢｓｔＩポリメラーゼを得る工程、
を含む、ゲル電気泳動で測定された６７ｋＤの大きさを有する組換えＢｓｔＩＤＮＡポリメラーゼ大断片を製造する方法。