JP4312403B2 - （ポリ）ペプチド／タンパク質を、ジスルフィド結合を介してバクテリオファージ粒子に表示させる新規方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、（ポリ）ペプチド／タンパク質をジスルフィド結合を介して結合させることによって、この（ポリ）ペプチド／タンパク質をバクテリオファージ粒子の表面に表示させる方法に関する。
【０００２】
本出願は、引用によりその全体が本明細書中に包含される欧州特許出願ＥＰ ９９ １１ ４０７２．４およびＥＰ ００ １０ ３５５１．８を基礎とし、これらに対して優先権を主張する。本明細書中を通して、多数の文献が引用されている。これらの文献の開示内容は引用によりその全体が本明細書中に包含される。
【０００３】
Smithは、１９８５年に、繊維状ファージが、その遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）内に挿入された外来のタンパク質断片を寛容することを最初に示し、そのタンパク質断片がファージ表面に表されることを示すことができた(Smith, 1985)。Landerは、その概念をファージ表面に表示された（ポリ）ペプチドおよび／またはタンパク質のレパートリーのスクリーニングに拡大し、それ以後、ファージディスプレーは劇的な進歩を経験し、実質的に達成された。
【０００４】
（ポリ）ペプチド／タンパク質ファージディスプレーライブラリーを構築し、スクリーニングする種々の形式が開発され、多数の総括論文および研究論文がこれらの発達を報告し、要約している（例えば、Kay et al., 1996; Dunn, 1996; McGregor, 1996）。
【０００５】
最もよく用いられてきたのは、繊維状ファージに基づく系である。
【０００６】
この方法は、最初は、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の表示を計画され(WO 88/06630; さらにWO 92/01047を参照)、その後Ｆａｂ断片のような多量体タンパク質のディスプレー(WO 91/17271; WO 92/01047)を含む、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）(WO 90/02809)、ペプチドライブラリー(WO 91/19818)、ヒト成長ホルモン(WO 92/09690)および種々の他のタンパク質のディスプレーに急速に拡大された。
【０００７】
ペプチドまたはタンパク質を繊維状バクテリオファージ表面にアンカーするためには、ほとんどの場合、ファージコートタンパク質に対する遺伝的融合物が用いられる。好ましいのは、遺伝子ＩＩＩタンパク質(Parmley & Smith, 1988)またはその断片(Bass et al., 1990)および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質(Greenwood et al., 1991)に対する融合物である。１つの例では遺伝子ＶＩが用いられ(Jespers et al., 1995)、また最近では遺伝子ＶＩＩと遺伝子ＩＸの組み合わせがＦｖ断片の表示用に用いられた(Gao et al., 1999)。
【０００８】
さらに、ファージラムダに対するファージディスプレーも達成された。この場合、遺伝子Ｖタンパク質(Maruyama et al., 1994)、遺伝子Ｊタンパク質および遺伝子Ｄタンパク質(Sternberg & Hoess, 1995; Mikawa et al., 1996)が用いられた。
【０００９】
遺伝的融合物を用いる以外に、外来ペプチドまたはタンパク質が結合ドメインを介してファージ表面に結合された。WO 91/17271では、ファージ表面に表示されたタグおよび、表示されるべきペプチド／タンパク質に融合されたタグ結合リガンドを用いて非共有的表示を達成することが示された。
【００１０】
ｃＤＮＡライブラリーの表示ために同様の概念が追求された(Crameri & Suter, 1993)。ここでは、ｊｕｎ／ｆｏｓ相互作用を用いて、ｃＤＮＡ断片の表示が媒介された。その構築体中、ｊｕｎならびにｆｏｓの両端に隣接するさらなるシステイン残基が、２つのジスルフィド結合の形成によってその相互作用をさらに安定化した。
【００１１】
バイオパニング（biopanning）においてファージディスプレーライブラリーをスクリーニングする場合、所望の標的と結合したファージをどのように最良に回収するかという問題が残っている。通常、これは、ｐＨ勾配または塩濃度勾配の使用または、可溶性標的を用いる特異的溶出による、適当なバッファーでの溶出によって達成される。しかし、標的に高い親和性（アフィニティー）で結合する最も関心ある結合物がこのアプローチによって失われることもある。この問題を克服するために、表示される（ポリ）ペプチド／タンパク質とその融合パートナー間、または目的の標的と固形表面に標的をアンカーするその担体間の開裂シグナルを提供することによる、いくつかの別の方法が工夫された。
【００１２】
さらに、本明細書中に示すすべてのアプローチは、少なくともファージコートタンパク質の部分と外来（ポリ）ペプチド／タンパク質を含む融合タンパク質の使用を必要とする。特に、表示されるべきペプチド／タンパク質に対するパートナーとして遺伝子ＩＩＩを用いる場合、このことはいくつかの問題を生じさせる。第一に、遺伝子ＩＩＩの発現産物は宿主細胞に対して有毒であり、遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質の厳重な調節が必要とされる。第二に、遺伝子ＩＩＩ産物の発現は、子孫のファージ粒子の生産に必要とされるヘルパーファージの感染に対して宿主細胞を耐性にし得る。そして最後に、遺伝子ＩＩＩ融合構築体と遺伝子ＩＩＩの野生型コピー間の組換えイベントは望ましくない人工産物を生じさせる。さらに、融合タンパク質をファージコート内へ包含させるために、少なくとも、約１９０アミノ酸を含む遺伝子ＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインを用いなければならないので、この核酸配列を含むベクターのサイズは大きくなり、形質転換効率の減少を生じさせる。しかし、形質転換効率は非常に大きなライブラリーの生産に決定的な要因である。さらに、ファージディスプレーライブラリーからの選択後に得られた（ポリ）ペプチド／タンパク質の特徴付けに関して、ファージコートタンパク質融合パートナーを除去するためか、あるいは、例えば検出用酵素または多量体化ドメイン（multimerisation domains）との融合によって新たな融合タンパク質を作成するために、その（ポリ）ペプチド／タンパク質を通常、発現ベクターに再クローニングする。再クローニングなしに直接発現し、（ポリ）ペプチド／タンパク質を他の部分と直接カップリングさせることを可能にする系が有益である。
【００１３】
さらに、これらのアプローチのほとんど（Jespers et al. (1995), WO 91/17271および本明細書中、上に記載されるCrameri & Suter (1993)の実験を除く）は、（ポリ）ペプチド／タンパク質のＣ末端をファージコートタンパク質と融合させなければならないため、遊離のＮ末端を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質の提示に限定される。特に、ｃＤＮＡライブラリーの場合、または機能的であるために遊離のＣ末端が必要とされるタンパク質の場合、Ｃ末端融合物の作成を必要としない単純な方法が非常に望ましい。
【００１４】
したがって、本発明の基礎となる技術的な課題は、ファージコートタンパク質との融合タンパク質を用いる必要なしに、（ポリ）ペプチド／タンパク質をファージ粒子上に提示することを可能にする単純な信頼できる系を開発することである。さらに、より信頼できる様式で、厳重に結合した（ポリ）ペプチド／タンパク質を回収することを可能にする方法が必要とされる。
【００１５】
この技術的課題は、請求の範囲に特徴付けられる態様を提供することによって解決される。したがって、本発明は、バクテリオファージ粒子表面に表示された（ポリ）ペプチド／タンパク質の大きなライブラリーを容易に作成し、スクリーニングすることを可能にする。（ポリ）ペプチド／タンパク質をジスルフィド結合によってファージ粒子表面に連結する、本発明の技術的アプローチは先行技術によって開示も示唆もされていない。
【００１６】
したがって、本発明は（ポリ）ペプチド／タンパク質をバクテリオファージ粒子表面に表示させる方法であって：
該（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイン残基とタンパク質コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成させることにより、発現後の該（ポリ）ペプチド／タンパク質と該バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーとを結合させるか、あるいはその結合を可能にすることを含む方法に関する。
【００１７】
本発明の記載では、用語「バクテリオファージ」とは、ファージの複製に必要とされる核酸を含むタンパク質コートからなるパッケージを形成する細菌のウイルスに関する。この核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、二本鎖または一本鎖、直鎖状または環状であり得る。ファージラムダまたは繊維状ファージ（例えばＭ１３、ｆｄまたはｆ１）のようなバクテリオファージは当業者に周知である。本発明の記載では、用語「バクテリオファージ粒子」は本発明に記載の粒子、すなわちジスルフィド結合を介して（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する粒子を表す。バクテリオファージの組み立て中、コートタンパク質は、パッケージングシグナルを含んでいる種々の核酸配列をパッケージングすることができる。本発明の記載中、バクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子に含まれる「核酸配列」という用語は、バクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子の組み立て時に、バクテリオファージコートタンパク質によってパッケージングされる核酸配列またはベクターに関する。好ましくは、該核酸配列またはベクターは天然に存在するバクテリオファージゲノムから誘導され、例えば繊維状ファージの場合、ファージおよびファージミドベクターを含む。後者は、プラスミドの特徴に加えてパッケージングシグナルおよびファージの複製起点を含むプラスミドである。
【００１８】
用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチド結合を介して連結された複数、すなわち２つまたはそれ以上のアミノ酸の１つまたはそれ以上の鎖からなる分子に関する。
【００１９】
用語「タンパク質」は、少なくとも（ポリ）ペプチドの一部が、その（ポリ）ペプチド鎖（群）内および／または間の、二次、三次または四次構造の形成によって規定の三次元配置を獲得しているか、あるいはその獲得能を有する（ポリ）ペプチドを表す。この定義には、天然に存在するか、あるいは少なくとも部分的に人工的なタンパク質、ならびに、上に記載される規定の三次元配置を獲得可能である完全長タンパク質の断片またはドメインが含まれる。
【００２０】
一本鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例には、単一鎖Ｆｖ抗体断片があり、複数の鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例には、Ｆａｂ抗体断片がある。
【００２１】
第一のシステイン残基が、（ポリ）ペプチド／タンパク質のＣ末端に位置する場合、表示形式は、Ｃ末端がファージコートタンパク質のメンバーに遺伝子融合されている慣用の表示機構に対応する。しかし、（ポリ）ペプチド／タンパク質のＮ末端を用いることによって、表示形式は上記のCrameri & SuterのｐＪｕＦＯ系におけるように逆転させることができる。
【００２２】
用語「バクテリオファージ粒子の表面」とは、バクテリオファージ粒子の部分であって、この粒子が含有される媒体と接触し、接近可能な部分を意味する。この表面は、適当な宿主細胞内でのファージ生産時に組み立てられるファージコートの部分であるタンパク質（粒子のタンパク質コートのメンバー）によって決定される。
【００２３】
用語「発現後」とは、バクテリオファージコートタンパク質との融合タンパク質をコードしている核酸が発現されるアプローチとは対照的に、該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸が、該コートとの結合前に宿主細胞内で発現される状況を表す。該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードしている核酸の発現および、結合を生じさせるか、あるいは可能にする工程を、分離された工程および／または環境において行うことができる。しかし、発現および、結合を生じさせるか、あるいは可能にする工程は、適当な宿主細胞内で順に行われるのが好ましい。用語「（該結合が）ジスルフィド結合の形成によって生じる（ジスルフィド結合を形成させることにより）」とは、例えばｐＪｕＦｏ系の場合(Crameri & Suter, 1993)のように、ジスルフィド結合が結合に寄与し、また（ポリ）ペプチド／タンパク質に存在する第二のドメインと相互作用するための相互作用ドメインが、タンパク質コートの該メンバーと組換え的に融合されていない状況を表す。
【００２４】
好ましい態様では、（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示するバクテリオファージ粒子は（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００２５】
本発明に記載の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸分子の構築方法、該核酸分子を含むベクターの構築方法、該ベクターを適当に選択された宿主細胞へ導入する方法、該（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現させるか、あるいはその発現を可能にする方法は当分野に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999; Ge et al, 1995を参照）。さらに、適当な宿主細胞内での子孫のバクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子の生産に必要とされる遺伝物質の導入方法、および該子孫のバクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子を生産させるか、あるいはその生産を可能にする方法は周知である（例えば、Kay et al., 1996を参照）。
【００２６】
さらに好ましい態様では、本発明は、該第二のシステイン残基がバクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在する方法に関する。
【００２７】
さらに好ましい態様では、本発明は、タンパク質コートの該メンバーがバクテリオファージの野生型コートタンパク質である方法に関する。
【００２８】
用語「野生型コートタンパク質」とは、天然に存在するバクテリオファージのファージコートを形成するタンパク質を表す。繊維状バクテリオファージの場合、該野生型タンパク質は遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）、遺伝子ＶＩタンパク質（ｐＶＩ）、遺伝子ＶＩＩタンパク質（ｐＶＩＩ）、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）および遺伝子ＩＸタンパク質（ｐＩＸ）である。繊維状バクテリオファージの密接に関係するメンバー、例えばｆ１、ｆｄおよびＭ１３間の相違を含むこれらの配列は当業者に周知である（例えば、Kay et al., 1996を参照）。
【００２９】
さらに好ましい態様では、タンパク質の該メンバーは、バクテリオファージ野生型コートタンパク質の断頭された変異体であり、該断頭された変異体は少なくとも、該コートタンパク質をバクテリオ粒子タンパク質コート内へ包含させる、該野生型コートタンパク質の部分を含む。
【００３０】
用語「断頭された変異体」とは、野生型配列の少なくとも部分の欠失させることによって修飾された上記野生型タンパク質由来のタンパク質を表す。これには、バクテリオファージ突然変異体において発見された断頭された遺伝子ＩＩＩタンパク質変異体のような変異体(Crissman & Smith, 1984)または標準的ファージディスプレー法の工程で生産された変異体（例えば、Bass et al., 1990; Krebber, 1996）が含まれる。例えば、断頭された変異体は、遺伝子ＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインからなるか、あるいはこれを含み得る。本発明に記載の断頭された変異体を同定するために、この変異体に検出タグを融合させることができ、この変異体が、変異体の存在下で形成されたバクテリオファージ粒子のファージコート内に包含されているか否かを測定するアッセイを構成することができる。野生型タンパク質の部分を欠失させることによって野生型タンパク質を断頭させる方法により、野生型タンパク質中で、欠失された部分に含まれる第二のシステインとジスルフィド結合を形成するシステイン残基を利用可能にすることができる。
【００３１】
さらに好ましい態様では、タンパク質コートの該メンバーは、バクテリオファージ粒子のタンパク質コート内に包含され得る、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体である。
【００３２】
本発明に記載の野生型タンパク質を修飾する方法は当業者に周知であり、これには標準的クローニングおよび／または突然変異誘発技術が含まれる。本発明に記載の方法において用いられる野生型タンパク質の修飾された変異体をコードする核酸分子の構築方法、ファージおよび／またはファージミドベクターの構築を含む、該核酸分子を含むベクターの構築方法、該ベクターを適当に選択された宿主細胞へ導入する方法、該修飾されたタンパク質を発現させるか、あるいはその発現を可能にする方法は当分野に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999; Kay et al., 1996を参照）。本発明に記載の修飾された変異体を同定するために、変異体に検出タグを融合させることができ、この変異体を、変異体の存在下で形成されたバクテリオファージ粒子のファージコート内へ包含させることができるか否か、あるいは包含されているか否かを測定するためにアッセイを構成することができる。
【００３３】
最も好ましい態様では、該第二のシステイン残基はバクテリオファージの野生型コートタンパク質内の対応するアミノ酸位置に存在しない。
【００３４】
好ましい態様では、該第二のシステインはバクテリオファージの野生型コートタンパク質内へ人工的に導入されたものである。本明細書の記載では、用語「人工的に導入された」とは、野生型コートタンパク質が例えば組換え法によって修飾された状況を表す。例えば、野生型コートタンパク質をコードする核酸を標準的手法によって操作し、システインコドンを導入して、修飾されたコートタンパク質をコードする核酸配列を作成する。ここにシステイン残基は、該野生型または修飾されたコートタンパク質の少なくとも部分に挿入、あるいは該システイン残基を付加することによって、あるいは該野生型または修飾されたタンパク質の少なくとも部分に含まれるアミノ酸残基を該システイン残基で置換することによって、あるいは野生型または修飾されたコートタンパク質の少なくとも部分を、該第二のシステイン残基を含む（ポリ）ペプチド／タンパク質と融合することによって、あるいはこれらの挿入、付加、置換または融合の任意の組み合わせによって人工的に導入される。このような組換え的に導入されたシステインコドンを含む核酸を発現すると、システイン残基を含む野生型タンパク質の変異体が形成される。
【００３５】
さらに最も好ましい態様では、該第二のシステインは、バクテリオファージ野生型コートタンパク質の断頭された変異体に人工的に導入されたものである。
【００３６】
さらに好ましい態様では、該第二のシステインは、バクテリオファージ野生型コートタンパク質の修飾された変異体に人工的に導入されたものである。
【００３７】
本発明に記載の人工的導入の達成方法は当業者に周知であり、これには標準的クローニングおよび／または突然変異誘発技術が含まれる。本発明に記載の方法において用いられる野生型タンパク質の修飾された変異体をコードする核酸分子の構築方法、該核酸分子を含むベクターの構築方法、該ベクターを適当に選択された宿主細胞へ導入する方法、該融合タンパク質を発現させるか、あるいはその発現を達成する方法は当分野に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999を参照）。
【００３８】
別の態様では、本発明は、該第二のシステインが、該バクテリオファージ粒子のファージコートの該メンバーのＣ末端またはＮ末端か、あるいはその近くに存在する方法に関する。
【００３９】
用語「の近く」とは、バクテリオファージの外側に位置する、該（ポリ）ペプチド／タンパク質のＮまたはＣ末端どちらかから数えて、１５アミノ酸まで、より好ましくは１０アミノ酸までの範囲を表す。
【００４０】
さらに好ましいのは、該バクテリオファージが繊維状バクテリオファージである方法である。繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆｄまたはｆ１は当業者に周知である。
【００４１】
繊維状バクテリオファージの場合では、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの該メンバーが野生型コートタンパク質ｐＩＩＩであるか、あるいはそれから誘導されたものである方法が特に好ましい。
【００４２】
さらに好ましいのは、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの該メンバーが野生型コートタンパク質ｐＩＸであるか、あるいはそれから誘導されたものである方法である。本明細書の記載では、用語「誘導された」とは、修飾されたタンパク質がバクテリオファージ粒子のタンパク質コートに包含され得るものである修飾を表す。修飾されたタンパク質の野生型タンパク質に対応する部分は、対応する野生型配列と比較して約７０％、好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％を超えるアミノ酸同一性を示すのが好ましい。
【００４３】
本発明のさらに好ましい態様では、
（ａ）該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列を含有する宿主細胞を入手し；
（ｂ）該核酸配列を発現させるか、あるいはその発現を可能にし；
（ｃ）該宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生（生産）させるか、あるいはその産生を可能にすることを含む方法に関する。
【００４４】
本発明の記載中、用語「発現させるか、あるいはその発現を可能にする」とは、核酸配列を発現させる条件下で宿主細胞を培養することを表す。本発明に記載の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸分子を構築する方法、該核酸分子を含むベクターを構築する方法、該ベクターを適当に選択された宿主細胞に導入する方法、（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現させるか、あるいはその発現を可能にする方法は当分野に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999を参照）。さらに、適当な宿主細胞内における子孫のバクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子の生産に必要とされる遺伝物質を導入する方法、および該子孫のバクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子を生産させるか、あるいはその生産を可能にする方法は周知である（例えば、Kay et al., 1996を参照）。バクテリオファージ粒子を生産させるか、あるいはその生産を可能にする工程は、例えばファージミドを用いる操作の場合、適当なヘルパーファージの使用を必要とすることもある。工程（ｂ）と（ｃ）はいずれかの順序で行ってもよいし、あるいは同時に行ってよい。
【００４５】
さらなる態様では、該（ポリ）ペプチド／タンパク質は免疫グロブリンまたはその機能的断片を含む。
【００４６】
本明細書の記載では、「免疫グロブリン」は「抗体」の類義語として用いられる。用語「機能的断片」とは、免疫グロブリンの抗原結合部分を保持している免疫グロブリンの断片を表す。本発明に記載の機能的免疫グロブリン断片とは、Fv (Skerra & Plueckthun, 1988), scFv (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988), ジスルフィド連結された Fv (Glockshuber et al., 1992; Brinkmann et al., 1993), Fab, F(ab')₂ 断片または当業者に周知の他の断片であって、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変ドメインを含むものであってよい。特に好ましいのは、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片である。
【００４７】
好ましい態様では、本発明は、
（ａ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の、１個またはそれ以上の部分であって、そのうち１個が少なくとも、該コートタンパク質をファージコート内へ包含させるか、あるいはその包含を可能にする部分を含むもの；および、（ｂ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在しない１〜６個の範囲の追加のアミノ酸残基であって、そのうち１個がシステイン残基であるもの；
からなるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体をコードする核酸配列に関する。
【００４８】
本発明の記載では、野生型コートタンパク質配列内のアミノ酸残基をシステイン残基で置換することによって得られる修飾された変異体は、追加のシステイン残基によって連結された該野生型タンパク質の２つの部分から構成される変異体とみなすことができる。これに対応して、野生型配列と比較していくつかの突然変異を含む野生型コートタンパク質の変異体はいくつかの野生型部分から構成され、個々の部分は突然変異残基によって連結されているとみなすことができる。しかし、該変異体は、システイン残基を含む６個までの残基を野生型コートタンパク質のＣ末端またはＮ末端に追加することによって得られたものであってもよい。
【００４９】
さらに好ましいのは、
（ａ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の１個またはそれ以上の部分であって、そのうち１個が少なくとも、該コートタンパク質をファージコート内へ包含させるか、あるいはその包含を可能にする部分を含むもの；
（ｂ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在しない１〜６個の範囲の追加のアミノ酸残基であって、そのうち１個がシステイン残基であるもの；および、
（ｃ）精製および／または検出目的の１個またはそれ以上のペプチド配列；
からなるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体をコードする核酸配列である。
【００５０】
特に好ましいのは、金属イオンと結合でき、したがって、それらが融合されるタンパク質の精製に用いることができる(Lindner et al., 1992)、少なくとも５個のヒスチジン残基を含むペプチド（Hochuli et al., 1988）である。また本発明によって、一般に用いられるｃ−ｍｙｃおよびＦＬＡＧタグ(Hopp et al., 1988; Knappik & Plueckthun, 1994)またはＳｔｒｅｐタグ(Schmidt & Skerra, 1994; Schmidt et al., 1996)のような追加の部分が提供される。
【００５１】
この修飾された変異体はさらに、クローニング、発現またはタンパク質輸送に必要とされるアミノ酸残基を含む。クローニングに必要とされるアミノ酸残基には、核酸配列の適当なベクター内へのクローニングを可能にするために包含される制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含む核酸配列によってコードされる残基が含まれる。発現に必要とされるアミノ酸残基には、（ポリ）ペプチド／タンパク質の可溶性または安定性を増加させる残基が含まれる。タンパク質輸送に必要とされるアミノ酸残基には、修飾された変異体の大腸菌周辺質への輸送を担うシグナル配列および／または該シグナル配列の効率的開裂を促進するアミノ酸残基が含まれる。上記のクローニング、発現、タンパク質輸送、精製および／または検出目的で必要とされるさらなるアミノ酸残基は、当業者に周知の多数のものである。
【００５２】
別の態様では、本発明は、本発明に記載の核酸配列を含むベクターに関する。
【００５３】
好ましい態様では、このベクターは、第二のシステイン残基を含む（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする１個またはそれ以上の核酸配列をさらに含む。
【００５４】
最も好ましい態様では、該（ポリ）ペプチド／タンパク質は免疫グロブリンまたはその機能的断片を含む。
【００５５】
本明細書中、上に記載される単一鎖Ｆｖ抗体断片の場合には、このベクターは、ポリペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードする１個の核酸配列を含み、Ｆａｂ抗体断片の場合には、このベクターはＶＨ−ＣＨおよびＶＬ−ＣＬ鎖をコードする２個の核酸配列を含む。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、本発明に記載の核酸配列または本発明に記載のベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５７】
本発明の記載では、用語「宿主細胞」は、例えば大腸菌(Ge et al., 1995)または枯草菌（Bacillus subtilis, Wu et al., 1993）のような細菌、酵母(Horwitz et al., 1988; Ridder et al., 1995)または糸状菌(Nyyssoenen et al., 1993)のような真菌、植物細胞(Hiatt & Ma, 1993; Whitelam et al., 1994)、昆虫細胞(Potter et al., 1993; Ward et al., 1995)または哺乳類細胞(Trill et al., 1995)を含むがこれらに限定されない、異種タンパク質の生産に一般に用いられる多数のもののうちのいずれかであってよい。
【００５８】
さらに好ましい態様では、本発明は、本発明に記載の核酸配列、本発明に記載のベクターによってコードされるか、あるいは本発明に記載の宿主細胞によって生産される野生型バクテリオファージのコートタンパク質の修飾された変異体に関する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイン残基とタンパク質コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成させることにより、発現後の該（ポリ）ペプチド／タンパク質とバクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーとを結合させるか、あるいはその結合を可能にすることを含む方法によって得られる（ポリ）ペプチド／タンパク質をその表面に表示するバクテリオファージ粒子に関する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイン残基とバクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基のジスルフィド結合の形成によって生じる結合により、その表面に結合された（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示するバクテリオファージ粒子に関する。
【００６１】
好ましい態様では、バクテリオファージ粒子はさらに、該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする１個またはそれ以上の核酸配列を含むベクターを含む。
【００６２】
本発明の最も好ましい態様では、バクテリオファージ粒子は、修飾された野生型バクテリオファージコートタンパク質をコードする核酸配列およびさらに、（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードし、そして最も好ましくは、少なくとも免疫グロブリンの機能的ドメインを含むものをコードする、１個またはそれ以上の核酸配列を含む本発明に記載のベクターを含む。
【００６３】
本明細書中、上に記載される本発明の方法の好ましい態様は、必要な変更を加えて本発明のバクテリオファージに適用される。
【００６４】
さらなる態様では、本発明は、各バクテリオファージ粒子が（ポリ）ペプチド／タンパク質の種々の集団由来の（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する本発明に記載のバクテリオファージ粒子の種々の集団に関する。「バクテリオファージ粒子の種々の集団」はまた、「ライブラリー」または「多数のバクテリオファージ粒子」として表すことができる。このようなライブラリーのメンバーはそれぞれ、ライブラリーの別のメンバーを表示する。
【００６５】
本発明の記載中、用語「種々の集団（diverse collection）」とは、その組成、性質および／または配列が少なくとも部分的に異なっている少なくとも２個の粒子または分子の集団を表す。例えば、（ポリ）ペプチド／タンパク質の種々の集団とは、その配列の少なくとも１個のアミノ酸位置が異なっている一組の（ポリ）ペプチド／タンパク質である。このような（ポリ）ペプチド／タンパク質の種々の集団は種々の方法、例えば出発（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１個のコドンをランダムに突然変異誘発させることによって、誤りがちなＰＣＲを用いて出発（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を増幅することによって、あるいは本発明の方法において変異誘発株を宿主細胞として用いることによって得られる。（ポリ）ペプチド／タンパク質の種々の集団を作成するための、これらの方法、さらなる方法または別の方法は当業者に周知である。「バクテリオファージ粒子の種々の集団」はまた、ライブラリーまたは多数のバクテリオファージ粒子として表されることもある。このようなライブラリーのメンバーはそれぞれ、ライブラリーの別のメンバーを表示する。
【００６６】
別の態様では、本発明は、
（ａ）本発明に記載のバクテリオファージ粒子の種々の集団を提供し；
（ｂ）所望の性質を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する少なくとも１個のバクテリオファージ粒子を得るために該種々の集団をスクリーニングし、ならびに／あるいは該種々の集団から選択することを含む、所望の性質を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法に関する。
【００６７】
本発明の記載中、用語「所望の性質」とは、（ポリ）ペプチド／タンパク質の種々の集団由来の１個の（ポリ）ペプチド／タンパク質が有するべきであり、この種々の集団のスクリーニングおよび／または選択の基礎を形成する、あらかじめ決められた性質を意味する。このような性質は、標的に対する結合、標的のブロック、標的が媒介する反応の活性化、酵素活性および、当業者に既知のさらなる性質のような性質を含む。当業者であれば、所望の性質のタイプに依存してスクリーニングおよび／または選択を行う形式および必要な工程を同定できるであろう。
【００６８】
最も好ましいのは、該所望の性質が目的の標的に対する結合である方法である。
【００６９】
該目的の標的は、例えば固相バイオパニング用の表面にコーティングし、溶液中のバイオパニング用に磁気ビーズのような粒子に連結し、あるいは全細胞バイオパニングまたは組織セクションバイオパニング用の細胞表面に表示させるような当業者に周知の種々の方法でバクテリオファージ粒子の該種々の集団に対して提示することができる。該標的と結合したバクテリオファージ粒子は、例えば適当なバッファーで溶出させること、ｐＨ勾配または塩濃度勾配を用いること、または可溶性標的を用いる特異的溶出のような当業者に既知の種々の方法によって回収できる。
【００７０】
好ましい態様では、（ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法はさらに：
（ｂａ）バクテリオファージ粒子の該種々の集団を目的の標的と接触させ；
（ｂｂ）目的の標的と結合しないバクテリオファージ粒子を溶出させ；
（ｂｃ）工程（ｂａ）で形成された目的の標的および該目的の標的と結合したバクテリオファージの複合体を還元条件下で処理することによって、目的の標的と結合したバクテリオファージ粒子を溶出させることを含む。
【００７１】
例えばＤＴＴとインキュベートすることによる、還元条件下では、ジスルフィド結合は開裂し、これにより、バイオパニングのさらなるラウンドおよび／または該標的と特異的に結合する（ポリ）ペプチド／タンパク質の同定用の、特異的バクテリオファージ粒子を回収することが可能になる。
【００７２】
実施例は、本発明を説明するものである。
実施例１：ジスルフィド結合の形成による、非操作繊維状バクテリオファージ粒子表面における（ポリ）ペプチド／タンパク質のディスプレイ
以下の実施例において、すべての分子バイオプシー実験は、標準的プロトコル（Ausubel et al., 1999）にしたがって行なった。
【００７３】
ｓｃＦｖを発現するベクターの構築
使用したベクターはすべて、高コピーファージミドpMorphX7-LHの誘導体（図1a+b）、pCALベクターシリーズの誘導体（WO97／08320；Knappik et al., 2000）である。発現カセットには、phoA シグナル配列、モノクローナル抗体（mab）抗−FLAG M1（Sigma ＃F-3040）（Knappik and Plueckthun, 1994）に対する最小結合部位、一本鎖断片（ｓｃＦｖ）、短いリンカー（PGGSG）および6ｘヒスチジンタグ（6His; Hochuli et al., 1988）（図1a）を含んでいる。pMorphX7-LCHおよびpMorphX7-LHCは、Cys-6Hisおよび6His-Cysをコードするオリゴヌクレオチドカセットをそれぞれ、pMorphX7-LHの固有のAscIおよびHindIII 部位の間に挿入することによって作製されている（図１ａ, 表１）。すべてのベクターは、いずれのファージコートタンパク質とも遺伝子的に融合していない可溶性ｓｃＦｖを発現する。WO97／08320に記載されたpCAL4ベクターに基づいておりファージタンパク質pＩＩＩのＣ末端部分へのｓｃＦｖの融合物を発現する、慣用的なファージディスプレイベクターpMorph13を、ポシティブコントロールとして使用した。ｓｃＦｖは、固有のXbaIおよびEcoRI部位（c.f. 図1a）によって、それぞれのベクター間で交換されている。
【００７４】
ｓｃＦｖの説明−抗原相互作用
すべてのｓｃＦｖは、ヒトのコンビナトリアル抗体ライブラリー（HuCAL; WO97／08320; Knappik et al., 2000）から得られる。HuCAL VHおよびVLコンセンサス遺伝子（WO97／08320に記載）およびｓｃＦｖのCDR３配列を表２に示す。クローンhag2をインフルエンザウイルス赤血球凝集素由来のペプチド（赤血球凝集素由来のアミノ酸９９〜１１０＋更なるフランキングアミノ酸（イタリックで示す（訳者注：本明細書翻訳文では下線で示す）、CAGPYDVPDYASLRSHH）に対して選択し、クローンMacI-5をヒトCR-3α鎖の断片（MacI）（SWISS-PROT entry P11215、６×ヒスチジンタグを含むC末端配列に融合したヒトCR-3αのアミノ酸１４９〜３５３）に対して選択した。ELISAおよびドープ化ライブラリー実験のための対応する抗原を以下のようにして得た。hag2特異的抗原N1-hagを、ベクターpTFT74の誘導体である、発現ベクターpTFT74-N1-hag-HIPM（Freund et al., 1993）（図2）を用いて調製した。N1-hagは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素由来のアミノ酸９９〜１１０および６×ヒスチジンタグ（（イタリック（訳者注：本明細書翻訳文では下線で示す））を含んでなるアミノ酸配列PYDVPDYASLRSHHHHHH（hag）に融合したN末端（N1）に更なるメチオニン残基を含んでいるファージM13の成熟遺伝子ＩＩＩタンパク質のアミノ酸１〜８２を含んでなる。Ｎ１−hagの発現、精製および再折り畳みは、記載されている通りに行なった（Krebber, 1996; Krebber et al., 1997）。MacI-5の抗原として、Ｃ末端６×ヒスチジンタグに融合したヒトＣＲ−３α鎖の精製断片（MacI）（SWISS-PROT entry P11215）を使用した。詳細には、発現カセットは、Ｎ末端のメチオニン、ヒトＣＲ−３α鎖のアミノ酸１４９〜３５３およびアミノ酸IEGRHHHHHHをコードする。このカセットを固有の制限部位BspHIおよびHindIIIによってつなぎ、例えば、pQE-60（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）の固有NcoIおよびHindIII部位ヘ導入して、発現ベクター pQE60-MacIを得ることができる（図３）。発現および精製は、標準的な方法を用いて行なった（The QIAexpressionist^TM 3rd edition：A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged protein（July 1998）. QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）。ウシ血清アルブミン（BSA, Sigma ＃A7906）をネガティブコントロール抗原として使用した。
【００７５】
非操作ファージ上にディスプレイされたｓｃＦｖの機能性
ディスプレイされたｓｃＦｖが特異的抗原の認識に関して機能的であることを示すため、ファージＥＬＩＳＡを行なった。HuCAL ｓｃＦｖ hag2およびMacI-5の２つについて分析を行なった。ｓｃＦｖのＣ末端に融合したモジュールが異なる３つの発現系、pMorphX7-LH、pMorphX7-LHCおよびpMorphX7-LCHを分析した。
【００７６】
ファージは、ヘルパーファージVCSM13を用いる標準的手法（Kay et al., 1996）にしたがって調製した。特異的抗原または対照抗原（BSA, Sigma ＃A7906）を、ＰＢＳ中５μｇ／ウェルの濃度で、４℃にて、Nunc Maxisorp マイクロタイタープレート（＃442404）に１２時間コーティングする。ファージをPBSTM（5％脱脂粉乳および0.1％ツイーン20を含むPBS）中、5 mM DTT有りまたはなしで、室温にて２時間プレインキュベーションした後、それを、抗原でコーテイングしたELISAウェルに、１×１０^１０ファージ／ウェルの濃度で加える（pMorph13については３×１０^７ファージ／ウェルの濃度で用いる）。室温で１時間結合させた後、非特異的に結合したファージを0.05％ツイーン２０を含むPBSで洗い流し、結合したファージを抗-M13-HRPコンジュゲート（Amersham Pharmacia Biotech ＃27-9421-01）およびBM blue soluble（Boehringer Mannheim ＃1484281）を用いるELISAで検出した。３７０nmでの吸光度を測定した。特異的抗原により得られたELISAシグナルを対照抗原のものと比較した。ｓｃＦｖをディスプレイしているファージの抗原に対する特異的結合を示すことができた。ｓｃＦｖs hag2およびMacI-5のこのような２つのＥＬＩＳＡの例を、図４および図５にそれぞれ示した。pMorphX7-LCHおよびpMorphX7-LHC由来のファージは、シグナルがバックグラウンドの１．９〜５．８倍に達した。プレインキュベーション工程中、抗原結合の前に５ｍＭＤＤＴを加えた場合、ＥＬＩＳＡシグナルはバックグラウンドレベルまでほぼ減少したが、慣用のディスプレイファージ（pMorph13）については、DTTの影響はあまりなかった。
【００７７】
ｓｃＦｖをディスプレイする非操作ファージの富化
ｓｃＦｖをディスプレイする非操作ファージを特異的抗原に対して富化できることを証明するため、いわゆるドープ化ライブラリー（doped library）実験を行なった。特異的ファージを大過剰の非特異的ファージと混合し、特異的抗原に対する３ラウンドのパニングを行なった。各ラウンド後に特異的ファージの富化を測定した。pMorphX7-LHCベクターにおいてHuCAL ｓｃＦｖs hag2およびMacI-5に関して分析を行なった。
【００７８】
pMorphX7-hag2-LHCおよびpMorphX7-MacI-5-LHC誘導化ファージを１：１０^５（pMorphX7-hag2-LHCパニング）および１０^５：１（pMorphX7-MacI-5-LHCパニング）の割合で混合した。それぞれhag2およびMacI-5特異的抗原に対して３ラウンドのパニングを行なった。標準的手順によってファージを調製し、ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳、０．１％ツイーン２０）と１：１混合することによってプレブロックし、室温で２時間インキュベーションした。Nunc Maxisorp マイクロタイタープレート（＃442404）のウェルを、４℃で一晩、ＰＢＳ中５μｇ／ウェルの濃度の特異的抗原Ｎ１-hag（およびＢＳＡ）でコーティングし、次いでＰＢＳＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳）４００μＬで室温にて２時間ブロックした。最初のラウンドでは、ウェル当たり１０^１１のプレブロックされたファージをウェルに加え、マイクロタイタープレートシェーカー上で、室温にて１時間インキュベーションした。ファージ溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０）で３回、ＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを標準的なプロトコルにしたがって１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させ、ＴＧ１細胞の感染に用いた。さらに、ウェルに加えたＴＧ１の直接感染によって、残りのファージを溶出させた。特異的抗原に対するパニングの各ラウンド後、少なくとも４６個の独立した感染細胞をＰＣＲによって分析することにより、非特異的ファージに対する特異的ファージの割合を測定した。標準的なプロトコルにしたがい、鋳型のソースとして単一のコロニーを用い、プライマーとして各ｓｃＦｖのＶＨ ＣＤＲ３およびＶＬ ＣＤＲ３に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。３ラウンドのパニング後、特異的クローンは、pMorphX7-hag2-LHCパニングに関しては約４％（分析された９３クローンのうち４個）に富化され、pMorphX7-MacI-5-LHCパニングに関しては約９０％（分析された９１クローンのうち８２個）に富化された。
【００７９】
実施例２：ジスルフィド結合の形成による操作された繊維状バクテリオファージ粒子の表面上における（ポリ）ペプチド／タンパク質の表示
実施例２．１：ｓｃＦｖのディスプレー
上記実施例１は、機能的ｓｃＦｖがジスルフィド結合により非操作ファージ上にディスプレーされ得ることを示す。この系を、例えばファージコートタンパク質上の露出したシステインを操作することにより、さらに改良することができる。１つの候補となるファージコートタンパク質は、プロテインＩＩＩ（ｐＩＩＩ）であり、これはＮ１、Ｎ２およびｐＩＩＩＣＴの３つのドメインからなる。不対のシステイン残基が位置する可能性のある部位は、ドメイン間のリンカー領域か、そのドメインまたは先端欠失型のｐＩＩＩであるｐＩＩＩＣＴの暴露したＮ末端である。更なる例は、システインが例えば全長タンパク質のＮ末端に連結し得るファージコートタンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）である。原則として、そのような操作されたタンパク質の発現のためのカセットを、ｓｃＦｖを生じるベクター上（１−ベクター系）か、または別のベクター上（２−ベクター系）に配置することができる。
【００８０】
以下に、我々が全長型および先端欠失型ｐＩＩＩの両方およびｐＩＸを操作した実験を記載する。これらのタンパク質を同じ細菌細胞において、ファージミド（pMorph18-C-gIII-scFv-LHC誘導体；１−ベクター系）または別のプラスミド（pBR322-C-gIIIまたはpUC19-C-gIIIおよび誘導体；２−ベクター系）から、ｓｃＦｖとともに同時発現させた。
【００８１】
ｓｃＦｖおよび操作されたファージコートタンパク質を発現するベクターの構築
２−ベクター系のためのファージコートタンパク質発現カセットを以下のとおり構築した：末端に固有ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりつないだ２つの異なる発現カセットを作製し、完全長の成熟ｐＩＩＩ（Ｃ−ｇＩＩＩ）のＮ１ドメインの暴露したＮ末端または先端欠失型タンパク質のｐＩＩＩＣＴドメインのＮ末端（タンパク質ｐＩＩＩのアミノ酸２１６〜４０６；Ｃ−ｇＩＩＩＣＴ）（図６ｂ＋ｃ））で不対のシステイン残基を位置させた。両方の発現カセットをｌａｃプロモーター／オペレーター領域の制御下にあり、シグナル配列ｏｍｐＡ、アミノ酸ＤＹＣＤＩＥＦおよびｐＩＩＩまたはｐＩＩＩＣＴ ＯＲＦ（表３に示された完全アミノ酸配列を含む）を含んでなる。修飾されたｐＩＩＩタンパク質を発現するプラスミドは、これらＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩカセットをプラスミドｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９へ、それぞれ固有ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位により挿入することによって得た。一例として、ｐＢＲ−Ｃ−ｇＩＩＩのベクターマップを図６ａに示す。得られたプラスミド、ｐＢＲ−Ｃ−ｇＩＩＩ、ｐＢＲ−Ｃ−ｇＩＩＩＣＴ、ｐＵＣ−Ｃ−ｇＩＩＩおよびｐＵＣ−Ｃ−ｇＩＩＩＣＴを、修飾されたｓｃＦｖを発現するpMorphX7-LHCファージミド（実施例１）によりE. coli TG1へ同時トランスフェクションし、両抗生物質マーカーについて選択した。
【００８２】
１−ベクター系において、両方の修飾されたファージコートタンパク質並びに修飾されたscFvを、ｌａｃプロモーター／オペレーター領域の制御下でジシストロン（dicistronic）ファージミドから発現させた。第１の発現カセットは、シグナル配列ｏｍｐＡ、アミノ酸ＤＹＣＤＩＥＦおよび各ファージコートタンパク質のＯＲＦまたはその一部を含んでなる。不対のシステイン残基を完全長の成熟ｐＩＩＩ（Ｃ−ｇＩＩＩ）のＮ１ドメインの露出したＮ末端、先端欠失型のプロテインＩＩＩ（タンパク質ｐＩＩＩのアミノ酸２１６〜４０６；Ｃ−ｇＩＩＩＣＴ）のＮ末端およびタンパク質ＩＸのＮ末端（Ｃ−ｇＩＸ）のそれぞれに連結した（アミン酸配列を表４に示す）。第２の発現カセットは、ｐｈｏＡシグナル配列、各ｓｃＦｖのＯＲＦ、短いリンカー（ＰＧＧＳＧ）、６×ヒスチジンタグ（６His; Hochuli et al., 1988）および１個のシステイン残基（pMorphX7-LHC、表１参照）を含む。修飾された完全長のｐＩＩＩ並びに修飾されたｓｃＦｖｈａｇ２をコードするpMorph18-C-gIII-hag2-LHCの完全なベクター配列並びに各ベクターマップを図７ａ＋ｂに示す。異なるファージコートタンパク質は、、ｓｃＦｖの３’末端に存在する第２のＥｃｏＲＩ部位のために、３フラグメント法においてＥｃｏＲＩおよびＳｔｕＩにより交換することができる。異なる操作されたｓｃＦｖを固有ＭｆｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位によりクローニングすることができる。このベクターの誘導体pMorph20-C-gIII-hag2-LHCは、固有EcoRI 部位をscFvの３’末端に含んでいるが、第２の部位（ompA シグナル配列とgIII ORFの間）がサイレントなPCR突然変異誘発により削除されている。この構築物は、固有SphIおよびEcoRI部位によりｓｃＦｖまたはｓｃＦｖプールのクローニングを可能にする。
【００８３】
ジスルフィド結合によるｓｃＦｖのファージコートタンパク質への結合
バイオパニング法に利用するファージは、ヘルパーファージVCSM13を用いて標準的なプロトコル（Kay et al., 1996）にしたがって調製することができる。ヘルパーファージタンパク質に加え、操作したファージコートタンパク質および可溶性の修飾されたｓｃＦｖを、上記の１−ベクター系または２−ベクター系から同時発現させた。ジスルフィド結合によりscFvsが操作したファージコートタンパク質に結合し、ファージ粒子に取りこまれることを実証するために、scFvをディスプレイしているファージを、非還元的および還元的条件下でSDS PAGEに付した。ウェスタンブロット分析を抗-pIIIおよび抗-Flag M1抗血清に対して行なった。
【００８４】
ファージを標準的な手法にしたがって、ヘルパーファージVCSM13（Kay et al., 1996）を用いて調製した。５mM DTT添加またはDTT無添加のPBS中（それぞれ還元的および非還元的条件）でファージを室温にて３０分間プレインキュベーションした後、DTTまたはβ−メルカプトエタノールのような還元剤を含まないSDS添加緩衝液を加えた。レーンあたり、１〜５×１０^１０のファージ４〜１５％ SDS PAGE（BioRad）に付し、PVDFメンブランにブロットした。抗-pIIIウェスタンブロットについては、メンブランをMPBST（PBS buffer containing 5％ milk powderおよび0.05％ Tween20）中でブロックし、１次抗体としてマウス抗-pIII（１：２５０希釈；Mobitec）、２次抗体として抗マウス-IgG-APコンジュゲート（１：１００００希釈；SIGMA）および基質としてBCIP／NPT タブレット（SIGMA）を用いて発色させた。抗-Flag M1ウェスタンブロットについては、メンブランをMTBST-CaCl₂（５％ミルク粉末、０.０５％ツイーン２０および１mM CaCl₂を含むTBS緩衝液）中でブロックし、１次抗体としてマウス抗-Flag M1（１：５０００希釈；Sigma）、２次抗体として抗マウス-IgG-APコンジュゲート（１：１００００希釈；SIGMA）および基質としてBCIP／NPT タブレット（SIGMA）を用いて発色させた。
【００８５】
完全長のｐＩＩＩに連結したｓｃＦｖについて予想された高さに移動した特異的バンドを、１−ベクター系および２−ベクター系の両方について示すことができた。このシグナルは、非還元的条件下でのみ認められ、ＤＴＴ下では現れず、ｐＩＩＩおよびｓｃＦｖがジスルフィド結合（ｓｃＦｖ−Ｓ−Ｓ−ｐＩＩＩ）によって結合していることを示すものである。２−ベクター系の一例として、scFv MacI−5についての抗-Flag M1および抗-pIII ウェスタンブロットを図８に示す。更なるシステインを有しないｓｃＦｖ（pMorph7x-MacI-5-LH）を発現するとき、ファージを通過する遊離のscFvのみを抗-Flag M1ウェスタンブロットにおいて検出することができる（レーン８、図８A）。更なるシステインがscFvに付加されているとき（pMorphX7-MacI-5-LHC）、それらのバンドはほとんど認めることができず、scFvダイマー（scFv-S-S-scFvおよび／または（scFv-SH）₂）（および未知のさらなるバンド（scFv-S-SX））の高さに移動するバンドが現れる（レーン７、図８A）。操作したｓｃＦｖが操作したさらなるシステインをＮ末端に含むpIII（pMorphX7-MacI-5-LHCおよびpBR-C-gIII）とともに同時発現するとき、シグナルはｓｃＦｖ−ｐＩＩＩヘテロ二量体（scFv-S-S-pIII）に対応する分子量へシフトする（レーン６、図８A）。予想通り、同様の数のファージ粒子を各レーンに加えたにもかかわらず、非操作のscFvが操作されたpIIIとともに同時発現したとき（pMorphX7-MacI-5-LHおよびpBR-C-gIII）、このscFv-S-S-pIIIシグナルは認められなかった（レーン５、図８A）。還元剤の存在下では、支配的なシグナルは、すべての発現系について、遊離のｓｃＦｖからのものであった（レーン１〜４、図８Ａ）。抗-pIII ウェスタンブロットでは、還元的および非還元的条件下の両方で、すべての発現系について、遊離のプロテインＩＩＩ（pIII-SH および／またはpIII）が認められた（レーン１〜８、図８Ｂ）。ジスルフィド結合したプロテインＩＩＩ二量体（pIII-S-S-pIII）について予想された高さに移動する特異的なバンドは、操作したプロテインＩＩＩが発現したとき、非還元的条件下でのみ検出できた（図８Ｂのレーン５および６）。操作されたｓｃＦｖおよび操作されたプロテインＩＩＩが同時発現したときのみ、ジスルフィド結合したプロテインＩＩＩ二量体に加え、ジスルフィド結合したｓｃＦｖおよびプロテインＩＩＩ（scFv-S-S-pIII）の高さに移動した更なるバンドが現れた（レーン６、図８Ｂ）。このバンドは、抗-Flag M1ウェスタンで検出され（レーン６、図８Ａ参照）、DTT感受性である（レーン２、図８Ａ参照）scFv-S-S-pIIIシグナルのサイズに対応する。ジスルフィド結合したｓｃＦｖおよびプロテインＩＩＩの高さに移動し、抗-Flag M1および抗-pIII抗血清の両方により検出されたＤＴＴ感受性のバンドも、操作されたｓｃＦｖおよび操作されたｐＩＩＩが同じファージミド（pMorph18-C-pIII-scFv-LHC）から同時発現したときに観察された。この１−ベクター系の一例として、scFv hag2については抗-Flag M1および抗-pIIIウェスタンブロットを、およびscFvs AB1.1およびMacI−5については抗-pIIIウェスタンブロットを、図９Ａおよび９Ｂにそれぞれ示す。
【００８６】
操作されたファージ（engineered phages）に表示されたｓｃＦｖの機能性
表示されたｓｃＦｖが特異的抗原の認識に関して機能的であることを示すため、ファージＥＬＩＳＡを行った。HuCAL scFv MacI-5 および hag2 に関して分析を行った。２ベクター系では、pMorphX7-LHC をそれぞれ pBR-C-gIII, pBR-C-gIIICT, pUC-C-gIII および pUC-C-gIIICT とともに同時トランスフォームした。３個の異なる１ベクター構築体、すなわち pMorph18-C-gIII-scFv-LHC, pMorph18-C-gIIICT-scFv-LHC および pMorph18-C-gIX-scFv-LHC を分析した。ｓｃＦｖがジスルフィド結合によって、操作されたファージコートタンパク質に結合することを示すため、非還元条件および還元条件下の両方でファージＥＬＩＳＡを行った。
【００８７】
ヘルパーファージ VCSM13 を用いる標準的手法にしたがってファージを生産し、ファージ力価を測定した(Kay et al., 1996)。ＰＢＳ中５μｇ／ウェル量の特異的抗原またはコントロール抗原(BSA, Sigma #A7906)を、４℃で１２時間、Nunc Maxisorp ミクロタイタープレート (# 442404) にコーティングし、５％脱脂粉乳を含むＰＢＳで２時間ブロックした。可能であれば、ファージを２．５％脱脂粉乳、０．０５％ツイーン２０および５ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳ中、室温で２時間プレインキュベートし、その後、抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡウェルにウェル当たり６．４×１０^６〜１×１０^１１ファージの濃度範囲で適用した。室温（ＲＴ）で１時間結合させた後、非特異的に結合したファージを、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄して除き、結合したファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート(Amersham Pharmacia Biotech #27-9421-01)とＢＭブルー可溶性物質(BM blue soluble、Boehringer Mannheim #1484281)を用いるＥＬＩＳＡにおいて検出した。３７０ｎｍでの吸光度を測定した。特異的抗原を用いて得られたＥＬＩＳＡシグナルをコントロール抗原を用いて得られたシグナルと比較した。ｓｃＦｖを表示しているファージの抗原への特異的結合は１ベクター形式における C-gIII, C-gIIICT および C-gIX 構築体に関して示された。また、C-gIII および C-gIIICT を試験し、両２ベクター系において働くことが示された。このようなｓｃＦｖに関する４つのＥＬＩＳＡの例としてＭａｃＩ−５を図１０〜１３に示す。ファージコートタンパク質がシステイン残基の追加によって操作されているすべての場合で、ＥＬＩＳＡシグナルは、ｓｃＦｖのみが追加のシステインを保持している pMorphX7-LHC シグナルと比べて有意に増加している。プレインキュベーション時、抗原結合前に５ｍＭ ＤＴＴをファージに加えると、全３個の操作されたファージコート構築体および未操作（non-engineered）pMorphX7-LHC ファージに関してＥＬＩＳＡシグナルはほとんどバックグラウンドレベルにまで減少したが、ＤＴＴは慣用的ディスプレーファージ（pMorph13；図１３）に対しては重大な影響を与えなかった。このことは、未操作および操作されたファージの両方に関して、ジスルフィド結合は、ファージに対するｓｃＦｖの機能的表示に本質的であり、したがってｓｃＦｖを表示しているファージが抗原と特異的に結合するのに本質的であることを示す。
【００８８】
「ドープ化ライブラリー（doped library）」実験におけるｓｃＦｖを表示する操作されたファージの富化(enrichment)
ｓｃＦｖを表示する操作されたファージを特異的抗原に対して富化できることを証明するため、「ドープ化ライブラリー」実験を行った：特異的ファージを大過剰の非特異的ファージと混合し、特異的抗原に対する３ラウンドのパニングを行った。各ラウンド後に特異的ファージの富化を測定した。pMorph18-C-gIII-scFv-LHC １ベクター系において２個の HuCAL scFv hag2 および MacI-5 に関して分析を行った。
【００８９】
pMorph18-C-gIII-hag2-LHC および pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC 誘導化ファージを１：１０^５(pMorph18-C-gIII-hag2-LHC パニング)および１０^５：１(pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC パニング)の割合で混合した。それぞれｈａｇ２およびＭａｃＩ−５特異的抗原に対して３ラウンドのパニングを行った。標準的手順によってファージを製造し、ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳、０．１％ツイーン２０）と１：１混合することによってプレブロックし、室温で２時間インキュベートした。Nunc Maxisorp プレート (#442404)のウェルを、４℃で一晩、ＰＢＳ中５μｇ／ウェルの濃度の特異的抗原（およびＢＳＡ）でコーティングし、次いで室温で２時間、ＰＢＳＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳）４００μＬでブロックした。第一ラウンドでは、ウェル当たり１０^１０のプレブロックされたファージを適用し、ミクロタイタープレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。ファージ溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０）で３回、ＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを標準的プロトコルにしたがって１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させ、ＴＧ１細胞の感染に用いた。さらに、ウェルに加えられたＴＧ１細胞の直接感染によって、残りのファージを溶出させた。特異的抗原に対するパニングの各ラウンド後、少なくとも９１個の独立した感染細胞をＰＣＲによって分析し、非特異的ファージに対する特異的ファージの割合を測定した。標準的プロトコルにしたがい、鋳型のソースとして単一のコロニーを用い、プライマーとして各ｓｃＦｖのＶＨ ＣＤＲ３およびＶＬ ＣＤＲ３に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。２ラウンドのパニング後、pMorph18-C-gIII-hag2-LHC パニングに関しては約０％（分析された９３クローンのうち０個）の陽性クローンが得られ、pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC パニングに関しては約３％（分析された９１クローンのうち３個）の陽性クローンが得られた。３ラウンドのパニング後、特異的クローンは、pMorph18-C-gIII-hag2-LHC パニングに関しては約７９％（分析された１１７クローンのうち９２個）に富化され、pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC パニングに関しては約１００％（分析された２２９クローンのうち２２９個）に富化された。
【００９０】
プレ選択されたプールのパニングにおけるｓｃＦｖを表示する操作されたファージの富化
ｓｃＦｖを表示する操作されたファージを種々のプール（diverse pool）から選択できることを証明するため、プレ選択されたライブラリーのパニングを行った。１ラウンドの慣用的パニング後のプールを操作された１ベクター形式へサブクローニングし、さらに３ラウンドまでパニングを継続した（ｃｙｓ−ディスプレーパニング）。
【００９１】
以下の抗原に対してパニングを行った：（ｉ）成熟ＩＣＡＭ１の細胞外部分（アミノ酸１〜４５４）＋Ｍ２−Ｆｌａｇおよび６×ヒスチジンタグを含むアミノ酸 CGRDYKDDDKHHHHHHを含むＩＣＡＭ１、（ｉｉ）Ｎ末端に追加のメチオニン残基＋Ｃ末端に短いリンカー（Ｎ１）を有するファージＭ１３の成熟遺伝子ＩＩＩタンパク質のａａ１〜８２を含み、ヒトＣＲ−３α鎖（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリーＰ１１２１５）のアミノ酸１４９〜３５３を含むポリペプチド＋６×ヒスチジンタグを含むＣ末端配列 IEGRHHHHHH と融合されたＮ１−ＭａｃＩ、（ｉｉｉ）ヒトＮＦκＢ ｐ５０のアミノ酸２〜３６６＋６×ヒスチジンタグを含むアミノ酸 EFSHHHHHH と融合された、Ｎ１を含むＮ１−Ｎｐ５０。Ｎ１−ＭａｃＩおよびＮ１−Ｎｐ５０用の発現ベクターはベクターｐＴＦＴ７４(Freund et al., 1993) に基づくものである(pTFT74-N1-hag-HIPM の完全ベクター配列を図２に示す)。発現、精製および再フォールディングは Krebber, 1996; Krebber ら, 1997 に記載されるように行った。
【００９２】
最初に、標準的プロトコルにしたがって、１ラウンドの、抗体ライブラリー HuCAL-scFv (WO 97/08320; Knappik et al., 2000)の慣用的パニングを行った。簡単には、Maxisorp ミクロタイタープレート(Nunc; #442404)のウェルを、ＰＢＳに溶解したそれぞれの抗原でコーティングし、ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロックした。１〜５×１０^１２ HuCAL-scFv ファージを２０℃で１時間加えた。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０）およびＰＢＳで数回洗浄する工程後、結合したファージを１００ｍＭ トリエチルアミンまたは１００ｍＭグリシンｐＨ２．２で溶出させ、すぐに１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．０で中和し、ＴＧ１細胞の感染に用いた。さらに、残りのファージを、ウェルに加えられたＴＧ１細胞の直接感染によって溶出させた。Ｎ１−Ｎｐ５０に対するパニングは完全 HuCAL-scFv ライブラリー（組み合わせられたκおよびλプール）を用い、Ｎ１−ＭａｃＩに対するパニングでは、κおよびλ軽鎖プールは分離されたままであった。ＩＣＡＭ１に対して、HuCAL-scFv のλ軽鎖部分の１ラウンドの慣用的パニングを行い、次いで選択された重鎖をλ軽鎖の完全ライブラリーと再び組み合わせた。得られた軽鎖の最適化ライブラリーは１．４×１０^７の多様性（diversity）を有していた。
【００９３】
それぞれのプールのｓｃＦｖを、唯一のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩ部位を介してベクター pMorph20-C-gIII-scFv-LHC（１ベクター形式）にサブクローニングした。次いで、３ラウンドのｃｙｓ−ディスプレーパニングを行った。ファージを標準的手法によって調製し、ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳、０．１％ツイーン２０）と１：１混合してプレブロックし、室温で２時間インキュベートした。Nunc Maxisorp プレート (#442404) のウェルを、４℃で一晩、ＰＢＳ中５μｇ／ウェルの濃度の特異的抗原でコーティングし、次いで室温で２時間、ＰＢＳＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳）４００μＬでブロックした。ｃｙｓ−ディスプレーパニングの各ラウンドでは、ウェル当たり１×１０^１０〜４．５×１０^１１の範囲の、プレブロックされたファージを適用し、ミクロタイタープレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。ファージ溶液を除去し、ウェルを高ストリンジェンシーのＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０）およびＰＢＳで洗浄した。第一ラウンドは、ＰＢＳＴおよびＰＢＳでそれぞれ、３×すばやく、２×５分間洗浄し、第二ラウンドは、ＰＢＳＴおよびＰＢＳでそれぞれ、１×すばやく、４×５分間洗浄し、第三ラウンドは、ＰＢＳＴおよびＰＢＳでそれぞれ、１０×すばやく、５×５分間洗浄した。標準的プロトコルにしたがって、結合したファージを１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させ、ＴＧ１細胞の感染に用いた。さらに、残りのファージを、ウェルに加えられたＴＧ１細胞の直接感染によって溶出（eluted）させた。
【００９４】
パニングの各ラウンド後に、抗原特異的ファージの数をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｎ１−ＭａｃＩ、Ｎ１−Ｎｐ５０およびＩＣＡＭ−Ｓｔｒｅｐ（成熟ＩＣＡＭ１のアミノ酸１〜４５５＋ＳｔｒｅｐタグＩＩを含有する SAWSHPQFEK を含む）をそれぞれ抗原として用いた。大量（高速）発現を確実にするために、選択されたｓｃＦｖを発現ベクター pMorphX7-FS（表１）にサブクローニングした。サブクローニングは二工程で行った。第一に、pMorph20-C-gIII-scFv-LHC からＡｆｌＩＩとＥｃｏＲＩを介してｓｃＦｖ断片を単離し、次いでこの断片をＳｐｈＩで再消化し、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩで消化された pMorphX7-FS ベクターにクローニングした。この手法により、ベクター pMorph20-C-gIII-scFv-LHC 由来のｓｃＦｖのみがサブクローニングされ、慣用のディスプレーまたは発現ベクター由来のｓｃＦｖの混入が確実に排除される。標準的手法にしたがい、ｓｃＦｖの発現およびその、それぞれの抗原に対するＥＬＩＳＡにおける試験を行った。ＥＬＩＳＡにおいてバックグラウンドに対し、少なくとも３倍高いシグナルを示したクローンを陽性であると考えた。この結果を表５にまとめる。選択されたｓｃＦｖがその抗原に強く、特異的に結合することを証明するために、２ラウンドのｃｙｓ−ディスプレーパニング後のいくつかの陽性クローンを選択し、６個の種々の抗原に対する特異性ＥＬＩＳＡにおいて４回再試験した（図１４および１５）。抗原特異的結合物の富化が明らかに示された。Ｎ１−ＭａｃＩ、Ｎ１−Ｎｐ５０およびＩＣＡＭ１に対する、プレ選択されたプールの２ラウンドのｃｙｓ−ディスプレーパニング後には、試験されたクローンの８０％〜９７％がＥＬＩＳＡにおいて陽性であった。いくつかの選択されたｓｃＦｖの親和性をＢｉａｃｏｒｅにおいて測定し、１ｎＭ〜２．２μＭの範囲のＫｄ値が測定された。これらの結果は、並行して行われたそれぞれのプールの慣用的パニングにおいて得られた富化率および親和性と同様であった。いくつかのｓｃＦｖはｃｙｓ−ディスプレーおよび慣用のパニングを介して独立して選択された。
【００９５】
還元剤を用いる、ｓｃＦｖを表示する操作されたファージの溶出
バイオパニングにおいてファージディスプレーライブラリーをスクリーニングする場合、所望の標的と結合したファージをどのように最良に回収するかという課題が残っている。通常、これは、ｐＨ勾配または塩濃度勾配を用いるか、あるいは可溶性標的を用いて特異的に溶出させることによる、適当なバッファーでの溶出によって達成される。しかし、標的に対して高い親和性で結合する最も興味深い結合物はこのアプローチによって失われるかもしれない。操作されたｃｙｓ−ディスプレーファージを用いる場合、標的と特異的バクテリオファージの複合体を還元剤で処理、例えばＤＴＴとインキュベートし、ｓｃＦｖとファージコートタンパク質のジスルフィド結合を開裂させ、特異的バクテリオファージ粒子を回収できる。
【００９６】
上記プロトコルにしたがって、Ｎ１−ＭａｃＩに対して、プレ選択されたプールのパニングを行った。１００ｍＭ トリエチルアミンを用いる標準的プロトコルにしたがい、そして残りのファージによってＴＧ１細胞を直接感染させるか、あるいはウェルをｐＨ８．０のトリスバッファー中、２０ｍＭ ＤＴＴと１０分間インキュベートすることによってファージを溶出させた。パニングの各ラウンド後に、上記の二工程手法にしたがって、選択されたｓｃＦｖのプールを発現ベクター pMorphX7-FS にサブクローニングし、Ｎ１−ＭａｃＩ特異的ｓｃＦｖの数をＥＬＩＳＡにおいて測定した。選択されたｓｃＦｖがその抗原に強く、特異的に結合することを証明するために、いくつかの陽性クローンを選択し、特異性ＥＬＩＳＡにおいて３回再試験した。両溶出手法に関して、抗原特異的結合物の富化が明らかに示された。ＭａｃＩκ−プールおよびＭａｃＩλ−プールの２ラウンドのパニング後、慣用の溶出と比べて、それぞれ２倍および５倍多くのＥＬＩＳＡ陽性クローンが還元剤での溶出時に得られた。
【００９７】
実施例２．２：Ｆａｂの表示（ディスプレー）
実施例２．１は、機能的単一鎖断片が、ジスルフィド結合を介して、操作されたファージに表示され得ることを示す。以下では、Ｆａｂに関しても同じこと真実であることを示す実験を記載する。システインをＦａｂ抗体断片の種々の位置において操作した。これらのＦａｂは、２ベクター系に基づく、操作された完全長ｐＩＩＩとともに同一細菌細胞内で発現された。
【００９８】
Ｆａｂおよび操作されたｐＩＩＩを発現するベクターの構築
Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖をｌａｃプロモーター／オペレーター領域の制御下、ジシストロンファージミド（dicistronic phagemid）から発現した。第一の発現カセットはシグナル配列ｏｍｐＡおよび軽鎖の可変および不変ドメインを含み、第二の発現カセットはシグナル配列ｐｈｏＡおよび重鎖の可変および不変ドメインを含む。重鎖および軽鎖はジスルフィド結合によって連結されていない。操作されたシステインを含むモジュールは軽鎖または重鎖のＣ末端に位置していた。モジュールのアミノ酸組成が異なるいくつかの構築体を比較し、これを表６にまとめる。例として、修飾されたＦａｂ ＭａｃＩ−５をコードする pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS の完全ベクター配列およびそのベクターマップを図１６ａ＋ｂに示す。
【００９９】
２個の異なるプラスミドを完全長ｐＩＩＩの発現に用いた。プラスミド pBR-C-gIII はすでに上に記載した。その発現カセットは、ラクトースプロモーター／オペレーター領域の制御下にシグナル配列ｏｍｐＡ、アミノ酸 DYCDIEF およびｐＩＩＩ ＯＲＦを含む（表３、図６）。別法では、プラスミド pBAD-SS-C-gIII を用いた。ここにその発現カセットは、アラビノースプロモーター／オペレーター領域の制御下にｐＩＩＩのシグナル配列、アミノ酸 TMACDIEF およびｐＩＩＩ ＯＲＦを含んでいる（表３）。pBAD-SS-C-gIII 構築時に、操作されたシステイン＋ｐＩＩＩをコードする断片を pUC-C-gIII からＰＣＲによって増幅し、制限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを導入し、市販のベクター pBAD/gIII A (Invitrogen) にクローニングした。プラスミド pBR-C-gIII または pBAD-SS-C-gIII を、修飾されたＦａｂを発現するそれぞれの pMorphX10-Fab ファージミドとともに、両抗生物質マーカーに関して選択された大腸菌ＴＧ１内へトランスフォームした。
【０１００】
Ｆａｂの説明−抗原相互作用
ヒト組み合わせ抗体ライブラリー(HuCAL; WO 97/08320; Knappik et al., 2000)由来の３個の異なるＦａｂすべてを用いて、操作されたファージへのＦａｂの表示を評価した。ＨｕＣＡＬ ＶＨおよびＶＬ共通（コンセンサス）遺伝子（WO 97/08320に記載されている）およびＦａｂのＣＤＲ３配列を表２に示す。Ｆａｂ ＭａｃＩ−５は、上記のｓｃＦｖ ＭａｃＩ−５から誘導され、Ｆａｂ形式に変換された（pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS の完全ベクターマップは図１６ａに示す）。Ｆａｂ ＭａｃＩ−Ａ８およびＩＣＡＭ１−Ｃ８は HuCAL-Fab ライブラリーの１つから直接単離した。Ｎ末端メチオニン、ヒトＣＲ−３α鎖（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリーＰ１１２１５）のアミノ酸１４９〜３５３および、ＳｔｒｅｐタグＩＩを含むアミノ酸 SAWSHPQFEK (Schmidt et al., 1996) を含む抗原ＭａｃＩ−Ｓｔｒｅｐに対してクローンＭａｃＩ−Ａ８を選択した。発現および精製は Schmidt & Skerra (1994) にしたがって行った。ＥＬＩＳＡ用の対応する抗原としてＮ１−ＭａｃＩを用いた。Ｎ１−ＭａｃＩは上に記載され、Ｎ−末端メチオニン、ファージＭ１３の成熟遺伝子ＩＩＩタンパク質のアミノ酸１〜８２＋短いリンカー（Ｎ１）、ヒトＣＲ−３α鎖（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリーＰ１１２１５）のアミノ酸１４９〜３５３および、６×ヒスチジンタグを含むアミノ酸 IEGRHHHHHH を含む。成熟ＩＣＡＭ１の細胞外部分（アミノ酸１〜４５４）＋Ｍ２−Ｆｌａｇおよび６×ヒスチジンタグを含有するアミノ酸 CGRDYKDDDKHHHHHH を含む上記抗原ＩＣＡＭ１に対してクローンＩＣＡＭ１−Ｃ８を選択した。同一の抗原をＥＬＩＳＡアッセイおよびドープ化ライブラリーの実験に用いた。
【０１０１】
ジスルフィド結合を介するＦａｂのファージコートタンパク質への結合
Ｆａｂがジスルフィド架橋を介してｐＩＩＩと結合し、ファージ粒子に包含されることを証明するために、それぞれのファージを、非還元および還元条件下、ＳＤＳ ＰＡＧＥで電気泳動した。それぞれｐＩＩＩ、重鎖、λ軽鎖およびκ軽鎖を検出する抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。表６に記載されるすべての構築体を分析し、例として pMorphX10-ICAM1C8-VL-LHC-VH-FS ＋ pBAD-SS-C-gIII および pMorphX10-MacIA8-VL-LHC-VH-MS ＋ pBAD-SS-C-gIII に関する結果を図１７および１８に示す。
【０１０２】
標準的プロトコル(Kay et al., 1996)にしたがい、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を用いてファージを生産した。ヘルパーファージタンパク質に加えて、操作されたファージコートタンパク質および可溶性修飾Ｆａｂを２ベクター系から同時に発現した。ファージを２０ｍＭ ＤＴＴを含むか、あるいは含まないＰＢＳ（それぞれ還元および非還元条件）中、室温で１時間プレインキュベートし、次いで還元剤、例えばＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールを欠いているＳＤＳ添加バッファーを加えた。レーン当たり１×１０^１０ファージを１２％ ＳＤＳ ＰＡＧＥ（BioRad）で電気泳動し、ニトロセルロース膜にブロットした(Schleicher & Schuell)。抗−ｐＩＩＩウエスタンブロットでは、この膜をＭＴＢＳＴ（５％粉乳および０．０５％ツイーン２０を含む５０ｍＭトリスバッファーｐＨ７．４）中でブロックし、一次抗体としてマウス抗−ｐＩＩＩ（１：２５０希釈；Mobitec）、二次抗体として抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（１：５０００希釈；SIGMA）および基質としてＢＭブルーＰＯＤ沈殿(Roche #1442066)を用いて展開した。重鎖、κ軽鎖およびλ軽鎖の検出では、一次抗体、抗−Ｆｄ（１：５０００希釈；The binding site PC075）、抗−ヒトκ（１：５０００希釈；Sigma K-4377）および抗−ヒトλ（１：５００希釈、Sigma L-6522）をそれぞれ用いた。
【０１０３】
抗−ｐＩＩＩウエスタンブロットでは、還元および非還元の両条件下のすべての発現系に対して遊離のタンパク質ＩＩＩ（ＳＨ−ｐＩＩＩおよび／またはｐＩＩＩ）を検出できる（図１７および１８）。操作されたＦａｂおよび操作されたタンパク質ＩＩＩの両方を同時発現させる場合、軽鎖とタンパク質ＩＩＩのヘテロ二量体(VL-CL-SS-pIII)のレベルでのシグナル移動は非還元条件下で出現した。さらに、ジスルフィド結合されたタンパク質ＩＩＩ二量体（ｐＩＩＩ−ＳＳ−ｐＩＩＩ）に関して予測されるレベルでのバンドの移動が見られる（レーン１１および１２、図１７、１８）。サンプルをＤＴＴで処理した場合（レーン５および６、図１７および１８）、または修飾されたＦａｂを未操作ＰＩＩＩと同時発現した場合（レーン３、４、９および１０、図１７および１８）、ヘテロおよびホモ二量体は両方とも消失した。軽鎖が完全長ｐＩＩＩと連結されている場合のヘテロ二量体は、非還元ゲル中、抗−軽鎖抗体を用いて検出できたが、還元条件下では不存在であった。さらに軽鎖のホモ二量体(VL-CL-SS-VL-CL)に関して予測されるレベルでのバンドの移動は検出可能であった（データは示していない）。表６に記載されるすべての構築体に関して同様の結果が得られ、操作されたｐＩＩＩを供給するベクター pBR-C-gIII と pBAD-SS-C-gIII 間の有意な相違点は検出できなかった（データは示していない）。
【０１０４】
操作されたファージに表示されたＦａｂの機能性
表示されたＦａｂが特異的抗原の認識に関して機能的であることを示すために、ファージＥＬＩＳＡを行った。分析は HuCAL Fab MacI-5, MacI-A8 および ICAM1-C8 に関して行った。Ｆａｂでのシステインの位置が異なっているすべての形式を比較した（表６）。Ｆａｂがジスルフィド結合を介して操作されたファージコートタンパク質に結合していることを示すために、非還元および還元の両条件下でファージＥＬＩＳＡを行った。
【０１０５】
修飾されたＦａｂを発現するそれぞれのファージミドを pBR-C-gIII とともに同時トランスフォーミングし、標準的条件(Kay et al., 1996)下でファージ生産を行った。慣用的Ｆａｂディスプレーファージ (pMorph18-Fab) を陽性コントロールとして用い、未操作Ｆａｂ発現用のファージミド発現ベクター(pMorphX9-Fab-FS)を陰性コントロールとして用いた。特異的抗原またはコントロール抗原(BSA, Sigma #A7906)を、４℃で１２時間、ＰＢＳ中５μｇ／ウェル量で Nunc Maxisorp ミクロタイタープレート (# 442404) にコーティングし、５％脱脂粉乳、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで１時間ブロックした。可能であれば、ファージを、室温で１時間、５％脱脂粉乳、０．０５％ツイーン２０および１０ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳ中でプレインキュベートし、その後、抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡウェルに、ウェル当たり１×１０^８〜１×１０^１０ファージの濃度範囲で適用した。室温で１時間結合した後、非特異的に結合したファージを０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳおよびＰＢＳで洗浄して除いた。抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート(Amersham Pharmacia Biotech #27-9421-01)およびＢＭブルー可溶性物質(Roche #1484281)を用いるＥＬＩＳＡによって結合したファージを検出した。３７０ｎｍでの吸光度を測定した。特異的抗原を用いて得られたＥＬＩＳＡシグナルをコントロールを用いて得られたシグナルと比較した。３個までの独立したファージ調製物を分析し、平均値を図１９〜２２に示す。
【０１０６】
すべての種々の２ベクター形式に関して、抗原に対するＦａｂ表示ファージの特異的結合を示すことができた（図１９〜２１、レーン１〜４）。Ｆａｂ ＭａｃＩ−５に関しては、４個の形式間に有意な相違は検出できず（図１９）、構築体 pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS は Fab MacI-A8 および ICAM1-C8 に対して最良の結果を再現的に示した（図２０および２１）。プレインキュベーション工程時、抗原結合前に１０ｍＭ ＤＴＴをファージに加えると、すべてのｃｙｓ−ディスプレーファージに関してＥＬＩＳＡシグナルはほとんどバックグラウンドレベルにまで減少したが、ＤＴＴは慣用的ディスプレーファージ(pMorph18-Fab)に対しては重大な影響を示さなかった（Fab MacI-5 に関して図２２に示す）。これはジスルフィド結合がファージへのＦａｂの機能的表示、つまりＦａｂを表示しているファージが抗原と特異的に結合するために本質的であることを示す。
【０１０７】
ドープ化ライブラリー実験におけるＦａｂを表示する操作されたファージの富化 Ｆａｂを表示する操作されたファージが特異的抗原に対して富化できることを示すために、「ドープ化ライブラリー」実験を行った：特異的ファージを大過剰の非特異的ファージと混合し、特異的抗原に対する３ラウンドのパニングを行った。特異的ファージに関する富化は各ラウンド後に測定した。分析は２ベクター系 pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS ＋ pBAD-SS-C-gIII において HuCAL Fab ICAM1-C8 に関して行った。
【０１０８】
ICAM1-C8 および MacI-A8 を表示する、操作されたファージを１：１０^５の割合で混合した。ＩＣＡＭ１抗原に対して３ラウンドのパニングを行った。ファージを標準的手法によって製造し、ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳、０．１％ツイーン２０）と１：１混合してプレブロックし、室温で２時間インキュベートした。Nunc Maxisorp プレート (#442404) のウェルを、４℃で一晩、ＰＢＳ中５μｇ／ウェルの濃度の特異的抗原でコーティングし、次いで室温で２時間、ＰＢＳＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳）４００μＬでブロックした。第一ラウンドでは、ウェル当たり、プレブロックされた１０^１１ファージを適用し、ミクロタイタープレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。ファージ溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴで３回（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０；１×すばやく、２× ５分間）、ＰＢＳで３回（１×すばやく、２× ５分間）洗浄した。標準的プロトコルにしたがい、結合したファージを１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させた。さらに、残りのファージを、ウェルに加えられた細胞の直接感染によって溶出させた。pBAD-SS-C-gIII を宿すＴＧ１細胞の直接感染は十分に効率的ではなかったので、溶出されたファージをＴＧ１細胞の感染に用い、増幅し、次いで pBAD-SS-C-gIII を宿すＴＧ１細胞の感染に用いた。したがって、２ベクター系を復帰（restore）させ、次のラウンドのパニングを行った。ファージＥＬＩＳＡおよびＷＢに関して、操作されたｐＩＩＩの発現用の２つのプラスミド(pBR-C-gIII および pBAD-SS-C-gIII)間の相違は観察されず、pBR-C-gIII を宿すＴＧ１細胞の感染は pBAD-SS-C-gIII を宿すＴＧ１細胞の感染ほど効率的ではなかった。パニングの各ラウンド後、少なくとも９２個の独立した感染細胞をＰＣＲによって分析し、非特異的ファージに対する特異的ファージの割合を測定した。標準的プロトコルにしたがい、単一のコロニーを鋳型のソースとして用い、λ軽鎖（フレームワーク４のプライム化）、κ軽鎖（フレームワーク３のプライム化）およびＦａｂ断片の上流のベクター配列（市販のＭ１３−ｒｅｖプライマー、ＮＥＢ）に対する特異的オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。λＦａｂ（ＩＣＡＭ１−Ｃ８）に対しては約４２０ｂｐ長の断片が予測され、κＦａｂ（ＭａｃＩ−Ａ８）に対しては２９０ｂｐが予測された。２ラウンドのパニング後には、６１％の陽性クローン（分析された９３クローンのうち５７）が得られ、第三ラウンド後には、これは１００％（分析された９２クローン中９２）に富化できた。
【０１０９】
参考文献
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【０１１０】
表１：ベクター pMorphX7-hag2-FS, pMorphX7-hag2-LH, pMorphX7-hag2-LCH および pMorphX7-hag2-LHC のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位間のＯＲＦモジュールのアミノ酸配列
【表１】

【０１１１】
表２：ＨｕＣＡＬ ｓｃＦｖおよびＨｕＣＡＬ Ｆａｂのアミノ酸配列*
【表２】

*詳細は実施例に記載する。
【０１１２】
表３：ベクター pBR-C-gIII および誘導体の操作されたファージコートタンパク質のアミノ酸配列
【表３】

操作されたＣｙｓ（訳者注：左から三列目の欄中のＣｙｓ）は太字（訳者注：本翻訳文中では下線）で示す。
野生型ファージコートタンパク質の配列は下線で示す。
【０１１３】
表４：ベクター pMorph18-C-gIII-scFv-LHC およびその誘導体の操作されたファージコートタンパク質のアミノ酸配列
【表４】

操作されたＣｙｓ（訳者注：左から三列目の欄中のＣｙｓ）は太字（訳者注：本翻訳文中では下線）で示す。
野生型ファージコートタンパク質の配列は下線で示す。
【０１１４】
表５：プレ選択されたプールのＣｙｓ−ディスプレーパニング
【表５】

nd: 測定せず。
^ａ N1-MacI, N1-Np50：１ラウンドの慣用的パニング後のクローン数；
ICAM1：軽鎖の最適化されたプールの多様性。
^ｂ それぞれのプレ選択されたプールのＥＬＩＳＡ陽性の数。
【０１１５】
表６：操作されたＦａｂ断片のモジュールのアミノ酸配列
【表６】

操作されたシステインは太字（訳者注：本翻訳文中では下線）で示す。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 構築体 pMorphX7-hag2-LH のベクターマップ。
【図１ｂ】 pMorphX7-hag2-LH のベクター配列。
【図２】 pTFT74-N1-hag-HIPM のベクター配列。
【図３】 pQE60-MacI のベクター配列。
【図４】 未操作ファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合。
標準的手法によって構築体 pMorphX7-MacI5-LCH, pMorphX7-MacI5-LHC および pMorphX7-MacI5-LH 由来のファージを生産し、５ｍＭ ＤＴＴを含む（＋ＤＴＴ）か、あるいはＤＴＴを含まないＰＢＳＴＭ中でプレインキュベートした。５μｇ／ウェルの特異的抗原(MacI, 暗カラム)および非特異的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^１０ファージ／ウェルとインキュベートした。結合したファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶性基質によって検出した。慣用のファージディスプレーベクター pMorph13-MacI5 由来のファージをコントロールとして用いた（３×１０^７ファージ／ウェル）。実験の詳細は実施例１に記載する。
【図５】 未操作ファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合。
標準的手法により、構築体 pMorphX7-hag2-LCH, pMorphX7-hag2-LHC および pMorphX7-hag2-LH 由来のファージを生産し、５ｍＭ ＤＴＴを含む（＋ＤＴＴ）か、あるいはＤＴＴを含まないＰＢＳＴＭ中でプレインキュベートした。５μｇ／ウェルの特異的抗原(Ｎ１−ｈａｇ、 暗カラム)および非特異的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^１０ファージ／ウェルとインキュベートした。結合したファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶性基質によって検出した。慣用のファージディスプレーベクター pMorph13-hag2 由来のファージをコントロールとして用いた（３×１０^７ファージ／ウェル）。実験の詳細は実施例１に記載する。
【図６ａ】 構築体 pBR-C-gIII のベクターマップ。
【図６ｂ】 Ｎ末端にシステイン残基を有する完全長ｐＩＩＩの発現カセットの配列（Ｃ−ｇＩＩＩ）。
【図６ｃ】 Ｎ末端にシステイン残基を有する断頭されたｐＩＩＩの発現カセットの配列（Ｃ−ｇＩＩＩＣＴ）。
【図７ａ】 構築体 pMorph18-C-gIII- hag2-LHC のベクターマップ。
【図７ｂ】 pMorph18-C-gIII-hag2-LHC のベクター配列。
【図８】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖ ＭａｃＩ−５の検出−２ベクター系。
標準的手法により、構築体 pMorphX7-MacI-5-LH / pBR-C-gIII (レーン 1 および 5), pMorphX7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIII (レーン 2 および 6), pMorphX7-MacI-5-LHC (レーン 3 および 7) および pMorphX7-MacI-5-LH (レーン 4 および 8) 由来のファージを生産した。１〜５×１０^１０ファージを、ＤＴＴを含む（レーン１〜４）か、あるいはＤＴＴを含まない（レーン５〜８）ＰＢＳ中でプレインキュベートした。還元剤を欠いているＳＤＳ添加バッファーを加え、ファージを４〜１５％ ＳＤＳ ＰＡＡ Ｒｅａｄｙゲルにアプライし、免疫ブロットで分析した。ファージと結合したｓｃＦｖの検出は、抗−ＦＬＡＧ Ｍ１抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートおよびＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質（６Ａ）および抗−ｐＩＩＩ抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートおよびＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質（６Ｂ）によって行った。低域マーカー(low range marker, Amersham #RPN756)はＭと記す。実験の詳細は実施例２．１に示す。
【図９】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの検出−１ベクター系。
標準的手法により、構築体 pMorph18-C-gIII-hag2-LHC (レーン 1 〜 8; 7A), pMorph18-C-gIII-AB1.1-LHC (レーン 1, 2, 5 および 6; 7B) および pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (レーン 3, 4, 7 および 8; 7B) 由来のファージを生産した。１〜５×１０^１０ファージを、ＤＴＴを含む（レーン１、２、５および６；７Ａおよびレーン１〜４；７Ｂ）か、あるいはＤＴＴを含まない（レーン３、４、７および８；７Ａおよびレーン５〜８；７Ｂ）ＰＢＳ中でプレインキュベートした。還元剤を欠いているＳＤＳ添加バッファーを加え、ファージを４〜１５％ ＳＤＳ ＰＡＡ Ｒｅａｄｙゲルにアプライし、免疫ブロットで分析した。ファージと結合したｓｃＦｖの検出は、抗−ＦＬＡＧ Ｍ１抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートおよびＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質（レーン１〜４；７Ａ）および抗−ｐＩＩＩ抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートおよびＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質（レーン５〜８；７Ａおよびレーン１〜８；７Ｂ）によって行った。低域マーカー(Amersham #RPN756)はＭと記す。実験の詳細は実施例２．１に示す。
【図１０】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合−種々の２ベクター系の比較。
標準的手法により、構築体 pMorphX7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIII (1), pMorphX7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIIICT (2), pMorphX7-MacI-5-LHC / pUC-C-gIII (3), pMorphX7-MacI-5-LHC / pUC-C-gIIICT (4), pMorphX7-MacI-5-LHC (5), pMorphX7-MacI-5-LH (6) および慣用のファージディスプレーベクター pMorph13-MacI-5 (7) 由来のファージを生産した。５μｇの特異的抗原（ＭａｃＩ）および非特異的コントロール抗原（ＢＳＡ、データは示していない）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、ウェル当たり６．４×１０^６〜１×１０^１１の範囲のファージとインキュベートした。結合したファージを、抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー基質によって検出した。実験の詳細は実施例２．１に記載する。
【図１１】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合−１ベクター系と２ベクター系の比較。
標準的手法により、構築体 pMorphX7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIII (1), pMorphX7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIIICT (2), pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (3), pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC (4) および pMorphX7-MacI-5-LHC (5) 由来のファージを生産した。５μｇの特異的抗原（ＭａｃＩ、暗カラム）および非特異的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^１０と１×１０^９ファージとインキュベートした。結合したファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー基質によって検出した。実験の詳細は実施例２．１に示す。
【図１２】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合−１ベクター系における操作された遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＩＸタンパク質の比較。 標準的手法により、構築体 pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (1), pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC (2), pMorph18-C-gIX-MacI-5-LHC (3), pMorphX7-MacI-5-LHC (4) および慣用的ファージディスプレーベクター pMorph13-MacI-5 (5) 由来のファージを生産した。５μｇの特異的抗原（ＭａｃＩ、暗カラム）および非特異的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^１０、１×１０^９および１×１０^８ファージとインキュベートした。結合したファージは抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー基質によって検出した。実験の詳細は実施例２．１に示す。
【図１３】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合−ＤＴＴの影響。
標準的手法により、構築体 pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (1), pMorph18-C-gIIICT-MacI-5-LHC (2), pMorph18-C-gIX-MacI-5-LHC (3), pMorphX7-MacI-5-LHC (4) および慣用的ファージディスプレーベクター pMorph13-MacI-5 (5) 由来のファージを生産し、５ｍＭ ＤＴＴを含む（＋）か、あるいはＤＴＴを含まない（−）ＰＢＳＴＭ中でプレインキュベートした。５μｇの特異的抗原（ＭａｃＩ、暗カラム）および非特異的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^１０ファージとインキュベートした。結合したファージは、抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー基質によって検出した。実験の詳細は実施例２．１に示す。
【図１４】 選択されたｓｃＦｖの特異性−プレ選択されたプールのＮ１−ＭａｃＩに対するパニング。
κ鎖（１〜５）およびλ鎖プール（６〜８）から、抗原Ｎ１−ＭａｃＩに対する２ラウンドのｃｙｓ−ディスプレーパニング後に選択されたｓｃＦｖを標準的手法にしたがって発現させた。０．１μｇ／ウェルの粉乳（Ａ）、ＢＳＡ（Ｂ），ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（Ｃ、ＢＳＡとカップリングさせたＦＩＴＣ）、Ｎ１−ｈａｇ（Ｄ）、Ｎ１−Ｎｐ５０（Ｅ）およびＮ１−ＭａｃＩ（Ｎ１−ＭａｃＩ）を３８４ウェルプレート(Maxisorp; Nunc)にコーティングし、ぞれぞれｓｃＦｖ溶液１０μＬとインキュベートした。結合したｓｃＦｖを抗−Ｆｌａｇ Ｍ１、抗−Ｆｌａｇ Ｍ２および抗−マウスＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートの混合物ならびに AttoPhos 蛍光基質(Roche #1484281)によって検出した。各ｓｃＦｖを４回試験し、平均値を示す。
【図１５】 選択されたｓｃＦｖの特異性−プレ選択されたプールのＮ１−Ｎｐ５０に対するパニング。
抗原Ｎ１−Ｎｐ５０（１〜８）に対する２ラウンドのｃｙｓ−ディスプレーパニング後に選択されたｓｃＦｖを標準的手法にしたがって発現させた。０．１μｇ／ウェルの粉乳（Ａ）、ＢＳＡ（Ｂ），ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（Ｃ、ＢＳＡとカップリングさせたＦＩＴＣ）、Ｎ１−ｈａｇ（Ｄ）、Ｎ１−ＭａｃＩ（Ｅ）およびＮ１−Ｎｐ５０（Ｎ１−Ｎｐ５０）を３８４ウェルプレート(Maxisorp; Nunc)にコーティングし、ぞれぞれｓｃＦｖ溶液１０μＬとインキュベートした。結合したｓｃＦｖを抗−Ｆｌａｇ Ｍ１、抗−Ｆｌａｇ Ｍ２および抗−マウスＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートの混合物ならびに AttoPhos 蛍光基質(Roche #1484281)によって検出した。各ｓｃＦｖを４回試験し、平均値を示す。
【図１６ａ】 構築体 pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS のベクターマップ。
【図１６ｂ】 pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS の完全ベクター配列。
【図１７】 操作されたファージに表示されたＦａｂ ＩＣＡＭ１−Ｃ８の検出。
標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS / pBAD-SS-C-gIII (レーン 5,6,11,12), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS (レーン 3,4,9,10) および pMorph18-Fab-ICAM1C8 (レーン 1,2,7,8) 由来のファージを生産した。１×１０^１０ファージを、ＤＴＴを含む（レーン１〜６）か、あるいはＤＴＴを含まない（レーン７〜１２）ＰＢＳ中でプレインキュベートした。還元剤を欠いているＳＤＳ添加バッファーを加え、ファージを１２％ ＳＤＳ ＰＡＡ Ｒｅａｄｙゲルにアプライし、免疫ブロットで分析した。検出は抗−ｐＩＩＩ抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルーＰＯＤ沈殿基質（BM Blue POD precipitating substrate）によって行った。低域分子量マーカー(Amersham Life Science #RPN756)はＭと記す。実験の詳細は実施例２．２に示す。
【図１８】 操作されたファージに表示されたＦａｂ ＭａｃＩ−Ａ８の検出。
標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS / pBAD-SS-C-gIII (レーン 5,6,11,12), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS (レーン 3,4,9,10) および pMorph18-Fab-MacIA8 (レーン 1,2,7,8) 由来のファージを生産した。１×１０^１０ファージを、ＤＴＴを含む（レーン１〜６）か、あるいはＤＴＴを含まない（レーン７〜１２）ＰＢＳ中でプレインキュベートした。還元剤を欠いているＳＤＳ添加バッファーを加え、ファージを１２％ ＳＤＳ ＰＡＡ Ｒｅａｄｙゲルにアプライし、免疫ブロットで分析した。検出は抗−ｐＩＩＩ抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー沈殿基質によって行った。低域分子量マーカー(Amersham Life Science #RPN756)はＭと記す。実験の詳細は実施例２．２に示す。
【図１９】 操作されたファージに表示されたＦａｂの特異的結合−Ｆａｂ ＭａｃＩ−５。
標準的手法によって、構築体 pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS / pBR-C-gIII (1), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-C-VH-FS / pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-CFS / pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-LHC / pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-MacI5-FS (5), および慣用的ファージディスプレーベクター pMorph18-Fab-MacI5 (6) 由来のファージを生産した。５μｇ／ウェルの特異的抗原（Ｎ１−ＭａｃＩ）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、ウェル当たり１×１０^８（明カラム）および１×１０^９（暗カラム）ファージとインキュベートした。結合したファージは抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶性基質によって検出した。各カラムは２回試験された３個の独立したファージ調製物の平均値を表す。実験の詳細は実施例２．２に示す。
【図２０】 操作されたファージに表示されたＦａｂの特異的結合−Ｆａｂ ＭａｃＩ−Ａ８。
標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS / pBR-C-gIII (1), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-C-VH-FS / pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-VH-CFS / pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-VH-LHC / pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-MacIA8-FS (5), および慣用的ファージディスプレーベクター pMorph18-Fab-MacIA8 (6) 由来のファージを生産した。５μｇ／ウェルの特異的抗原（Ｎ１−ＭａｃＩ）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、ウェル当たり１×１０^９（明カラム）および１×１０^１０（暗カラム）ファージとインキュベートした。結合したファージは、抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶性基質によって検出した。各カラムは２回試験された３個の独立したファージ調製物の平均値を表す。実験の詳細は実施例２．２に示す。
【図２１】 操作されたファージに表示されたＦａｂの特異的結合−Ｆａｂ ＩＣＡＭ１−Ｃ８。
標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS / pBR-C-gIII (1), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-C-VH-MS / pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-CMS / pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-LHC / pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS (5), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS / pBR-C-gIII (6) 由来のファージを生産した。５μｇ／ウェルの特異的抗原（ＩＣＡＭ１、暗カラム）または非特異的抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、ウェル当たり１×１０^９ファージとインキュベートした。結合したファージは抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶性基質によって検出した。各カラムは２回試験された１個のファージ調製物の平均値を表す。実験の詳細は実施例２．２に示す。
【図２２】 操作されたファージに表示されたＦａｂの特異的結合−ＤＴＴの影響。
標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS / pBR-C-gIII (1), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-C-VH-FS / pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-CFS / pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-LHC / pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-MacI5-FS (5), および慣用的ファージディスプレーベクター pMorph18-Fab-MacI5 (6) 由来のファージを生産し、１０ｍＭ ＤＴＴを含む（＋）か、あるいはＤＴＴを含まない（−）ＰＢＳＴＭ中でプレインキュベートした。５μｇ／ウェルの特異的抗原（Ｎ１−ＭａｃＩ、暗カラム）および非特異的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^９ファージとインキュベートした。結合したファージは抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー基質によって検出した。各カラムは２回試験された１個のファージ調製物の平均値を表す。実験の詳細は実施例２．２に示す。

Claims (29)

1. （ポリ）ペプチド／タンパク質をバクテリオファージ粒子表面に表示させる方法であって：
   該（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイン残基とバクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成させることにより、適切な宿主細胞中で発現後の該（ポリ）ペプチド／タンパク質と該宿主細胞中で組み立てられている該バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーとを結合させるか、あるいはその結合を可能にすることを含む方法。
2. 該第二のシステイン残基がバクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在する、請求項１に記載の方法。
3. タンパク質コートの該メンバーがバクテリオファージの野生型コートタンパク質である、請求項２に記載の方法。
4. タンパク質コートの該メンバーがバクテリオファージの野生型コートタンパク質の断頭された変異体であり、この断頭された変異体が少なくとも、バクテリオファージ粒子のタンパク質コート内へのコートタンパク質の包含を生じさせる野生型コートタンパク質の部分を含むものである、請求項２に記載の方法。
5. タンパク質コートの該メンバーが、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体であり、この修飾された変異体がバクテリオファージ粒子のタンパク質コート内に包含され得るものである、請求項２に記載の方法。
6. 該第二のシステイン残基がバクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在しない、請求項１に記載の方法。
7. 該第二のシステインがバクテリオファージの野生型コートタンパク質に人工的に導入されたものである、請求項６に記載の方法。
8. 該第二のシステインがバクテリオファージの野生型コートタンパク質の断頭された変異体に人工的に導入されたものである、請求項６に記載の方法。
9. 該第二のシステインがバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体に人工的に導入されたものである、請求項６に記載の方法。
10. 該第二のシステインが該バクテリオファージ粒子のファージコートの該メンバーのＣ末端またはＮ末端か、あるいはその近く(ここで、その近くとは、バクテリオファージの外側に位置する、該（ポリ）ペプチド／タンパク質のＮまたはＣ末端どちらかから数えて、１５アミノ酸までの範囲を表す)に存在する、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
11. 該バクテリオファージが繊維状バクテリオファージである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの該メンバーが野生型コートタンパク質ｐＩＩＩであるか、あるいはそれから誘導されたものである、請求項１１に記載の方法。
13. バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの該メンバーが野生型コートタンパク質ｐＩＸであるか、あるいはそれから誘導されたものである、請求項１１に記載の方法。
14. （ａ）該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列を含有する宿主細胞を入手し；
    （ｂ）該核酸配列を発現させるか、あるいはその発現を可能にし；
    （ｃ）該宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるか、あるいはその産生を可能にすることを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
15. 該（ポリ）ペプチド／タンパク質が免疫グロブリンまたはその機能的断片を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 該機能的断片がｓｃＦｖまたはＦａｂ断片である、請求項１５に記載の方法。
17. （ａ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の、１つまたはそれ以上の部分であって、そのうち１個が少なくとも、該コートタンパク質をファージコート内へ包含させるか、あるいはその包含を可能にする部分を含むもの；および、
    （ｂ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在しない１〜６個の範囲の追加のアミノ酸残基であって、そのうち１個がシステイン残基であるもの；
    からなるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体をコードする核酸配列。
18. （ａ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の１個またはそれ以上の部分であって、そのうち１個が少なくとも、該コートタンパク質をファージコート内へ包含させるか、あるいはその包含を可能にする部分を含むもの；
    （ｂ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在しない１〜６個の範囲の追加のアミノ酸残基であって、そのうち１個がシステイン残基であるもの；および、
    （ｃ）精製および／または検出目的の１個またはそれ以上のペプチド配列；
    からなるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体をコードする核酸配列。
19. 請求項１７または１８に記載の核酸を含むベクター。
20. 第二のシステイン残基を含む（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列をさらに含む、請求項１９に記載のベクター。
21. 該（ポリ）ペプチド／タンパク質が免疫グロブリンまたはその機能的断片を含む、請求項２０に記載のベクター。
22. 請求項１７または１８に記載の核酸配列、請求項１９〜２１のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
23. 請求項１７または１８に記載の核酸配列、請求項１９〜２１のいずれかに記載のベクターによってコードされるか、あるいは請求項２２に記載の宿主細胞によって生産されるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体。
24. （ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイン残基とバクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基のジスルフィド結合の形成によって生じる結合により、その表面に結合された（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する、（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現するための核酸配列を含む該バクテリオファージ粒子。
25. 該核酸配列が請求項２０または２１に記載のベクターである、請求項２４に記載のバクテリオファージ粒子。
26. 該バクテリオファージ粒子のそれぞれが（ポリ）ペプチド／タンパク質の種々の集団由来の（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示している、請求項２４または２５に記載のバクテリオファージ粒子の種々の集団。
27. （ａ）請求項２６に記載のバクテリオファージ粒子の種々の集団を提供し；
    （ｂ）所望の性質を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する少なくとも１個のバクテリオファージ粒子を得るために該種々の集団をスクリーニングし、ならびに／あるいは該種々の集団から選択することを含む、所望の性質を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法。
28. 該所望の性質が目的の標的との結合である、請求項２７に記載の方法。
29. 工程（ｂ）が
    （ｂａ）バクテリオファージ粒子の該種々の集団を目的の標的と接触させ；
    （ｂｂ）目的の標的と結合しないバクテリオファージ粒子を溶出させ；
    （ｂｃ）工程（ｂａ）で形成された目的の標的および該目的の標的と結合したバクテリオファージの複合体を還元条件下で処理することによって、目的の標的と結合したバクテリオファージ粒子を溶出させることをさらに含む、請求項２８に記載の方法。

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