JP4349660B2 - ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する変異体 - Google Patents
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Description
本発明は、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＵＰＲＴアーゼ)活性を有し且つ上記ＵＰＲＴアーゼの１又はそれ以上の残基が変異されることによって天然ＵＰＲＴアーゼから誘導されるポリペプチドに関する。本発明はまた、この変異体ＵＰＴＲＴアーゼをコードするヌクレオチド配列、この後者の変異体を発現するためのベクター、ウイルス粒子と宿主細胞、及びそれを含む組成物にも関する。最後に、本発明はまた、それの治療的使用、及びそれの手段を提供する治療方法をも導く。本発明は、特に増殖性の及び感染性の疾患に関しての適用のための自殺遺伝子治療(suicide gene therapy)の状況において特に有用である。
遺伝子治療は、宿主細胞又は生体への遺伝的情報の転移であると定義される。ヒトに適用された最初のプロトコルは、アデニンデアミナーゼ(ADA)をコードしている遺伝子が冒された変異のために遺伝的な免疫不全となった患者について、1990年9月に米国で始められた。この最初の実験の相対的な成功は、遺伝的な病気(不完全遺伝子の機能不全を治す目的を持つ)と、後天的疾患(癌、ＡＩＤＳなどのような感染性疾患)の両方を含む、各種の疾患のためのこのアプローチの発展に希望を与えた。この技術は、発現産物が不活性物質(プロドラッグ)の細胞毒性物質への形質転換、それによって細胞死を生起することができる遺伝子を用いる「自殺遺伝子(suicide gene)」治療を含むことから、非常に多数の開発が試みられている。1992年に、幾つかのグループが、腫瘍を治療するための及びＡＩＤＳに応答可能である、ＨＩＶウイルスの播種性を抑制するためのこの新規のアプローチの関連性を実証した。
この関係において、単純ヘルペス１型ウイルスチミジンキナーゼをコードしている遺伝子(ＨＳＢ−１ ＴＫ)が自殺遺伝子の原型を構成する(Caruso等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7024-7028；Culver等,1992,Science 256,1550-1552；Ram等,1997,Nat.Med.3,1354-1361)。そのＴＫポリペプチドがそのような毒性でない一方、アシクロビル又はガンシクロビル(ＧＣＶ)のようなヌクレオシド類似体の形質転換を触媒する。修飾されたヌクレオシドは、延長のプロセスにおいて、結果として細胞分裂を阻害するものとしてＤＮＡ鎖に取り込まれる。多数の自殺遺伝子／プロドラッグのペアが現在利用可能である。特に言及され得るそれらは、ラットシトクロムｐ４５０とシクロホスファミド[sic](Wei等,1994,Human Gene Therapy 5,969-978)、大腸菌(E.Coli)プリンヌクレオシドホスホリラーゼと６−メチルプリンデオキシリボヌクレオシド(Sorscher等,1994,Gene Therapy 1,223-238)、大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼと６−チオキサンチン(MzozとMoolten,1993,Human Gene Therapy 4,589-595)及びシトシンデアミナーゼ(ＣＤアーゼ)と５−フルオロシトシン(５ＦＣ)である。
ＣＤアーゼは、外来のシトシンが加水分解脱アミノ化によってウラシルに転換されることによってピリミジン代謝経路中に含まれる。ＣＤアーゼ活性は原核生物と下等な真核生物で示されている(JundとLacroute,1970,J.Bacteriol.102,607-615；Beck等,1972,J.Bacteriol.110,219-228；De Haan等,1972,Antonie van Leeuwenhoek 38,257-263；Hoeprich等,1974,J.Inf.Dis.130,112-118；EsdersとLynn,1985,J.Biol.Chem.260,3915-3922)一方で、それらは哺乳動物において存在していない(Koechlin等,1966,Biochem Pharmacol.15,435-446；Polak等,1976,Chemotherapy 22,137-153)。サッカロミセス セレビシエ(S.cerevisiae)ＦＣＹ１と大腸菌ｃｏｄＡ遺伝子、これら２つの生体のＣＤアーゼをそれぞれコードする、が知られ、且つその配列は公表されている(EP 402 108;Erbs等,1997,Curr.Genet.31,1-6;WO93/01281)。
ＣＤアーゼはまた、シトシンの類似体、即ち５−フルオロシトシン(５−ＦＣ)を脱アミノ化し、それによって、それが５−フルオロ−ＵＭＰ(５−ＦＵＭＰに変換される場合に高い細胞毒性となる化合物である５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)を形成する。その酵素をコードしている遺伝子を不活性化する変異のため又はそれが哺乳動物細胞のように、この酵素を自然に欠いているためのいずれか一方によって、ＣＤアーゼ活性を欠く細胞は、５−ＦＣに耐性である(JundとLacroute,1970,J.Bacteriol,102,607-615；Kilstrup等,1989,J.Bacteriol.1989 171,2124-2127)。反対に、転移されたＣＤアーゼ活性をコードしている配列を含む哺乳動物細胞は、５−ＦＣに感受性になる(Huber等,1993,Cancer Res.53,4619-4626；Mullen等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,33-37；WO 93/01281)。加えて、隣接した未形質転換細胞もまた、５−ＦＣに感受性になる(Huber等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,8302-8306)。バイスタンダー効果と称される、この現象は、５−ＦＵを分泌するＣＤアーゼ活性を発現し、そして原形質膜を横切って直進する拡散によって隣接する細胞を中毒させる細胞のためである。受動的拡散における５−ＦＵのこの性質は、そのバイスタンダー効果がｔｋを発現している細胞と接触させることを要する、ｔｋ／ＧＣＶ参照系と比較して有効性を表す(Mesnil等,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,1831-1835)。遺伝子治療の、特に抗癌遺伝子治療の状況の中でＣＤアーゼが提供する効果の全ては、従って容易に理解できる。
しかしながら、５−ＦＣへの感受性は、使用した細胞系に基づいて相当に変化する。例えば、低い度合の感受性が、大腸菌ｃｏｄＡ遺伝子を発現するレトロウイルスによって転移されているヒト腫瘍細胞系ＰＡＮＣ−１(膵臓癌)及びＳＫ−ＢＲ−３(胸腺癌)において観測される(Harris等,1994,Gene Therapy 1,170-175)。この望ましくない現象は、細胞毒性５−ＦＵＭＰに変換されないか、又は低いレベルでのみ変換されるいずれか一方のＣＤアーゼの酵素作用によって形成される５−ＦＵによって説明できる。オロチン酸ホスホリボシル[sic]トランスフェラーゼによって哺乳動物細胞において正常に生み出される(Peters等,1991,Cancer 68,1903-1909)この段階は、特別な腫瘍を不在として良く且つそれによってＣＤアーゼベースの遺伝子治療を無効にする。
原核生物及び下等な真核生物において、ウラシルは、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＵＰＲＴアーゼ)によってＵＭＰに転換される。この酵素はまた、５−ＦＵを５−ＦＵＭＰに変換する。かくして、酵母サッカロミセス セレビシエのｆｕｒ１変異体は、ＵＰＲＴアーゼ活性がないことによって、ＣＤアーゼによって５−ＦＣの脱アミノ化から生じる５−ＦＵが細胞毒性５−ＦＵＭＰに変換しないために、高濃度の５−ＦＵ(１０ｍＭ)及び５−ＦＣ(１０ｍＭ)に耐性である(JundとLacroute,1970,J.Bacteriol.102,607-615)。大腸菌とＳ．セレビシエＵＰＲＴアーゼをそれぞれコードするｕｐｐとＦＵＲ１遺伝子は、クローン化され且つ配列決定されている(Andersen等,1992,Eur.J.Biochem.204,51-56;Kern等,1990,Gene 88,149-157)。
これらの欠点を改善するために、従来技術の文献WO-A-96/16183は、ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性を持っている２のドメイン酵素をコードする融合タンパク質を用いることを推奨し、且つ発現プラスミドによって運ばれた、ハイブリッドｃｏｄＡ：：ｕｐｐ又はＦＣＹ１：：ＦＵＲ１遺伝子の転移が５−ＦＣにトランスフェクションされたＢ１６細胞の感受性を増すことをインビトロで示す。
本発明は、そのＮ末端部分で欠失されたＵＰＲＴアーゼをコードする変異したＦＵＲ１遺伝子を用いる従来技術の改良である。本発明は、開始ＡＴＧコドンの後に、ＦＵＲ１遺伝子が天然タンパク質の位置３６でメチオニンをコードしている第２のＡＴＧコドンを含むという観測から生じる。
ＦＵＲ１遺伝子は、そのコード化部分の５’末端で１０５ヌクレオチドを欠いて現に構成され、それによって最初の３５Ｎ末端残基が欠失されており、且つ天然タンパク質中の位置３６中でメチオニンで始まるＵＰＲＴアーゼを合成することを可能にする。ＦＵＲ１Δ１０５と定義した変異体遺伝子の発現生成物は、Ｓ．セレビシエｆｕｒ１変異体を補うことができることが示されており、それによって機能的であることを示している。驚くべきことに、その切り詰めた変異体は、一致する遺伝子を発現するプラスミドによってトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞で実行されている酵素アッセイにより試験される通り、天然酵素のそれよりもより大きいものであるＵＰＲＴアーゼ活性を呈する(野生型遺伝子と比較してのＦＵＲ１Δ１０５遺伝子)。それらが５−ＦＵ耐性であるために選択された３つのヒト腫瘍細胞系は、アデノウイルスベクターによって運ばれた変異体遺伝子によって形質導入され、インビトロで５−ＦＵに対する増加した感受性を呈する。５−ＦＣに対する感受性もまた、もしその細胞がＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５をそれぞれ発現するアデノウイルスと共感染されるなら、ＦＣＹ１を唯一発現するアデノウイルスによる感染と比較して、増加する。さらに驚くべきことには、ハイブリッドＦＣＹ１：：ＦＵＲ１Δ１０５遺伝子によって生産され、ＦＣＹ１と切り詰めたＦＵＲ１遺伝子のフレーム内融合で生じた融合タンパク質は、そのＵＰＲＴアーゼ活性を保持するが、しかし天然ＦＣＹ１生産物を用いて測定したそれと比較して１０から３０のファクターによって増加するＣＤアーゼ活性を示す。二官能タンパク質の高いＣＤアーゼ活性は、実質上バイスタンダー効果を生じる５−ＦＵのプールを形成することを可能にする。ＷＯ-Ａ-９６／１６１８３のＣＤアーゼ：：ＵＰＲＴアーゼ融合タンパク質のＣＤアーゼ活性が改善されることを示さない点が注目される。
本発明は、より有効な変異体を提供し、それによって５−ＦＣに対する細胞の感受性を増加すること及び自殺遺伝子を用いる遺伝子治療の見通しを改善することを可能にする。この変異体は、非常に多くの適用、特に抗癌及び抗ウイルス適用、及び細胞死を要する全ての適用のために使用できる。
この理由のために、本発明は、少なくともＵＰＲＴアーゼの１又はそれ以上の残基の変異によって天然ＵＰＲＴアーゼから得られたことを特徴とするウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＵＰＲＴアーゼ)を持つポリペプチドに関する。
本発明の意味する範囲内で、ＵＰＲＴアーゼ活性を持つポリペプチドは、ウラシルを、又はその誘導体の一つを、モノホスファート類似体に、特に５−ＦＵを５−ＦＵＭＰに変換することができるポリペプチドに関する。「変異」は、上記ポリペプチド中の何れかのサイトで１又はそれ以上の残基の付加、欠失及び／又は置換をなすことと解される。
本発明に従うポリペプチドが得られる天然ＵＰＲＴアーゼは、いずれの起源とすることもでき、特に原核生物、真菌又は酵母起源とすることができる。説明のために、大腸菌からの(Anderson等,1992,Eur.J.Biochem 204,51-56)、ラクトコッカス ラクチスからの(MartinussenとHammer,1994,J.Bacteriol.176,6457-6463)、マイコバクテリウム ボビスからの(Kim等,1997,Biochem Mol.Biol.Int 41,1117-1124)及びバチルス ズブチルスからの(Martinussen等,1995,J.Bacteriol.177,271-274)からのＵＰＲＴアーゼが本発明の状況の中で使用することができる。しかしながら、特に好適なものは、酵母ＵＰＲＴアーゼ、特にKern等(1990,Gene 88,149-157)において配列が開示されるＳ．セレビシエＦＵＲ１遺伝子によってコードされたそれを用いることにより与えられる。情報のために、その遺伝子の情報、及び一致するＵＰＲＴアーゼのそれは、文献において及び特殊化されたデータベース(SWISSPROT,EMBL,Genbank,Medline,etc.)において見出すことができる。
一つの特有の有利な実施態様に従い、本発明に従うポリペプチドは、天然ＵＰＲＴアーゼの欠失変異体である。その欠失は、元のＵＰＲＴアーゼのＮ末端領域中に好ましくは設けられる。その欠失は、全体的(上記Ｎ末端領域の全ての残基に影響する)又は部分的(最初の構造に連なり得る又は得ない１又はそれ以上の残基に影響する)とすることができる。一般的な手法において、ポリペプチドは、Ｎ末端部、中央部及びＣ末端部からなり、それぞれの部分が分子のほぼ３分の１を表している。例えば、２５１アミノ酸を含むＳ．セレビシエＵＰＲＴアーゼのケースにおいて、そのＮ末端部分は最初の８３残基からなり、天然型の最初の位置に設けられる、開始メチオニンと称したそれによって始まる。大腸菌ＵＰＲＴアーゼのケースにおいて、Ｎ末端部分は位置１から６９をカバーする。
この好適な実施態様は、該分子の何れかのサイトで１又はそれ以上の付加変異と勿論結合できる。好ましくは、その付加の修飾は、本発明に従うポリペプチドのＵＰＲＴアーゼ酵素特性に顕著な影響を及ぼさない。該変異体の生物学的活性が、特に以下の実施例中に記載される技術を用いて試験できる点が注目される。
非常に好ましくは、本発明に従うポリペプチドは、上記天然ＵＰＲＴアーゼの第２ＡＴＧコドンのＮ末端領域上流の全部又は一部を少なくとも欠失することによって、天然ＵＰＲＴアーゼから得られる。前述の領域の全体的欠失が好ましい。例えば、ＦＵＲ１遺伝子によってコードされたＵＰＲＴアーゼは、位置＋３６中の第２に続き位置＋１で最初のＡＴＧコドン(開始ＡＴＧコドン)を含む。かくして、それは本発明の状況の中で残基＋１から３５の欠失を考察することが可能であり、それによって天然型の位置＋３６において通常見出されるメチオニンで始まるポリペプチドを与える。
本発明に従う好適なポリペプチドは、位置１のＭｅｔ残基で始まり、位置２１６のＶａｌ残基で終わる、配列番号：１で実質上表されるアミノ酸配列を含む。用語「実質上」は、７０％より高い、有利には８０％より高い、好ましくは９０％より高い、特に好ましくは９５％より高い配列番号：１との同一性の度合に関する。更により好ましくは、該ポリペプチドは配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む。上述した通り、それは付加の変異体を含むことができる。アラニン残基による位置２(天然ＵＰＲＴアーゼにおいて位置３７)でのセリン残基の置換が特に言及され得る。
有利には、本発明に従うポリペプチドは、上記天然ＵＰＲＴアーゼによって示されるそれよりも容易に判断可能なより高いＵＰＲＴアーゼ活性を示す。後述する実施例で提供される結果は、５−ＦＵから５−ＦＵＭＰへの変換がより急速に及び／より効率的であることが明瞭に示され、トランスフェクションした又は形質導入した細胞に関する細胞毒性のより高い度合でそれ自身を証明している。有利には、本発明に従うポリペプチドのＵＰＲＴアーゼ活性は、２から１００までの、好ましくは５から７５まで、及び非常に好ましくは１０から５０までのファクターによって天然ＵＰＲＴアーゼによって示されたそれよりもより大きい。
別の実施態様に従い、本発明に従うポリペプチドは、少なくとも第２のポリペプチドとフレーム内で融合される融合ポリペプチドである。該融合が第１のポリペプチド中の何れかのサイトで実行されるとしても、そのＮ又はＣ末端、特にＮ末端が好適とされる。有利には、該フレーム内融合は、本発明に従う融合タンパク質がＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性を呈するように、シトシンデアミナーゼ(ＣＤアーゼ)活性を示し且つ天然シトシンデアミナーゼから得られる第２のポリペプチドを用いる。ＦＣＹ１：：ＦＵＲ１融合(以下、ＦＣＵ１と定義した)が好適である。そのような二官能性ポリペプチドは、５−ＦＣと５−ＦＵに対する標的細胞の感受性を改善することを可能にする。「シトシンデアミナーゼ活性」は、シトシン又はその類似体の一つの脱アミノ化をカバーするとして解される。好ましくは、本発明に従う該第２のポリペプチドは、５−ＦＣを５−ＦＵに代謝することができる。
原核生物の又は下等な真核生物起源のＣＤアーゼが、本発明の状況の中で使用される。更により好ましくは、ＣＤアーゼは、酵母ＣＤアーゼ、特にサッカロミセス セレビシエＦＣＹ１遺伝子によってコードされたそれである。異なる起源のＣＤアーゼをコードする遺伝子のクローン化と配列は、文献中及び特殊化されたデータベースで利用可能である。情報のため、ＦＣＹ１遺伝子の配列は、Erbs等(1997,Curr.Genet.31,1-6)中に開示される。天然酵素のそれに匹敵する又は優る変換能力を持つＣＤアーゼ変異体を使用することも勿論可能である。当業者であれば、公表されたデータの基礎の上にＣＤアーゼをクローン化すること、何れかの変異を実行すること、当該分野の技術に従って無細胞又は細胞系において変異型の酵素活性を試験すること、又は後述で与えられるプロトコルに続いて、及びフレーム内ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性を有するポリペプチドを融合することができる。
好ましい実施例は、位置１のＭｅｔ残基で始まり、位置３７３のＶａｌ残基で終わる配列番号：２で実質上表されるアミノ酸配列を含む。用語「実質上」は、前記の通り定義される。配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明を実行するために特に適切である。
有利な実施態様に従い、本発明の二官能ポリペプチドは、上記天然のＣＤアーゼのそれよりも容易に検知可能なより高いＣＤアーゼ活性を示す。かくして、二つの酵素を結合することを次に示す実施例は、５−ＦＣに対する標的細胞の感受性を増加することができる。感受性が増加されることによってそのファクターは、有利には少なくとも２、好ましくは少なくとも５、及び、特に好ましくは１０又はそれ以上である。
一般的な手法において、本発明に従うポリペプチドは、化学合成の通常の方法によって又は組換えＤＮＡ技術(例えばManiatis等,1989,Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYを参照)のいずれか一方で生産することができる。この理由のため、本発明はまた、形質転換細胞を生成するために細胞内に導入される上記ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の製造方法をも含み、上記形質転換細胞は、上記ポリペプチドを製造することができる適切な条件下で培養され、且つ上記ポリペプチドは細胞培養物から収穫される。その生産細胞は、制限されることなしに、考慮の下にそのヌクレオチド配列がそのゲノム内に統合され又は複製することができる適切な発現ベクター内に統合されるいずれか一方とされる程度に、細菌、酵母又は哺乳動物細胞の何れかの起源のものとすることができる。自然には、該ヌクレオチド配列は、生産細胞中でそれが発現できるように転写及び翻訳シグナルの制御の下に設けられる。発現ベクターと制御シグナルは、当業者に周知である。該ポリペプチドは、培地又は細胞(それが溶解された後で)から回収することができ、通常の精製工程(クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、免疫精製などによって)にかけられる。
本発明はまた、本発明に従うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にも関する。該ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムの配列とすること又は混合したタイプとすることができる。適切な場合、それは宿主細胞における発現を増加するため、天然、異種(例えばウサギβ-グロブリン遺伝子など)、又は合成起源とされるこれらと共に一又はそれ以上のイントロンを含むことができる。既に記載されている通り、上記配列は、天然酵素から誘導されるポリペプチド、或いは匹敵する又は優る活性を示す変異体をコードすることができる。本発明の状況の中で使用される配列は、分子生物学の通常の技術によって、例えば特異的なプローブによるライブラリーのスクリーニングによって、発現ライブラリーの免疫スクリーニングによって又は適当なプライマーを用いたＰＣＲによって、又は化学合成によって得ることができる。該変異体は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、制限酵素と結紮酵素による消化の技術を用いて一又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加によって、又はその他の化学合成によって天然配列から生産することができる。該変異体の能力と機能に対する構成は、酵素活性を測定することによって又は５−ＦＣ及び／又は５−ＦＵに対する標的細胞の感受性を測定することによって証明することができる。
本発明はまた、宿主細胞においてその発現のために要求される要素(elements)の制御下に設けられる本発明に従うヌクレオチド配列を運ぶ組換えベクターにも関する。該組換えベクターは、プラスミド又はウイルス起源とすることができ、適切な場合、該ベクターの転移有効性及び／又は安定性を改善する一又はそれ以上の物質と組み合わせることができる。これらの物質は、当業者に利用可能である文献中に広範に記載される(例えば、Felgner等,1987,Proc.West.Pharmacol.Soc.32,115-121;HodgsonとSolaiman,1996,Nature Biotechnology 14,339-342;Remy等,1994,Bioconjugate Chemistry,5,647-654)。非制限的な説明のため、その物質は、ポリマー、脂質、特にカチオン性脂質、リポソーム、核タンパク質又は中性脂質とすることができる。これらの物質は、単独で又は組み合わせて使用することができる。考察され得る組合せは、カチオン性脂質(ＤＯＧＳ、ＤＣ−ＣＨＯＬ、スペリミン-コール、スペリミジン-コールなど)又は中性脂質(ＤＯＰＥ)と結合した組換えプラスミドベクターのそれである。
本発明の状況の中で使用することができるプラスミドの選択は、非常に多数である。それはクローン化ベクター及び／又は発現ベクターとすることができる。一般的な手法において、それらは当業者に知られており、その幾つかは商業的に利用可能であると同時に、それはまた遺伝子操作の技術を用いてそれを構築する又はそれを修飾することも可能である。言及され得る実例は、ｐＢＲ３２２(Gibco BRL)、ｐＵＣ(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogene)又はｐ Poly(Lathe等,1987,Gene 57,193-201)である。好ましくは、本発明の状況において使用されるプラスミドは、複製が生産細胞及び／又は宿主中で開始されることが保証される複製の起源を含む(例えば、そのＣｏ１Ｅ１起源は、大腸菌中で生産されることが意図されるプラスミド用に選択されるであろうし、且つｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１系は哺乳動物宿主細胞において該プラスミドが自己複製化されるであろうことが望まれるならば選択されるであろう、LuptonとLevine,1985,Mol.Cell.Biol.5,2533-2542;Yates等,Nature 313,812-815)。該プラスミドは、トランスフェクションした細胞を選択又は同定することができる選択遺伝子を更に含むことができる(栄養要求性変異の相補性、抗生物質に対する耐性をコードしている遺伝子など)。勿論、該プラスミドは、与えられた細胞においてその維持性及び／又はその安定性を改善する補足の要素を含むことができる(モノマー形態でプラスミドの維持を促進するｃｅｒ配列(SummersとSherrat,1984,Cell 36,1097-1103,細胞ゲノムへの統合のための配列)。
ウイルスベクターに関して、ポックスウイルスから(ワクシニアウイルス、特にＭＶＡ、カナリーポックスウイルスなど)、アデノウイルスから、レトロウイルスから、ヘルペスウイルスから、アルファウイルスから、フォーミー(foamy)ウイルスから、又はアデノウイルス関連ウイルスから得られるベクターを意図することができる。好ましくは、複製されない及び統合されないベクターを用いることで与えられるであろう。この関係において、アデノウイルスベクターが、本発明の実施のために特に好適である。
レトロウイルスは感染する特性を有し、多くのケースにおいて分割細胞に統合化を生じ、且つこれに関連して癌への関連における使用のために特に適切である。本発明に従う組換えレトロウイルスは一般に、後述したそれらのようなレトロウイルスＬＴＲの又は内部プロモーターの制御の下に設けられる、ＬＴＲ配列、被包領域及び本発明に従うヌクレオチド配列を含む。該組換えレトロウイルスは、何れかの起源(ネズミ、霊長類、ネコ科動物、ヒトなど)のレトロウイルスから、特にＭｏＭｕＬＶ(Moloneyネズミ白血病ウイルス)、ＭＶＳ(ネズミ肉腫ウイルス)又はFriendネズミレトロウイルス(Ｆｂ２９)から得ることができる。それは、ウイルス粒子を構成するために要求されるウイルスポリペプチドｇａｇ，ｐｏｌ及び／又はｅｎｖの途中で供給できる被包細胞系において増殖される。そのような細胞系は、文献中に記載される(PA317,Psi CRIP GP+Am-12など)。本発明に従うレトロウイルスベクターは、特にＬＴＲｓ(真核生物プロモーターの持つプロモーター領域の置換)又は被包領域(異種被包領域、例えばＶＬ３０タイプによる置換)における置換を含む(フランス出願94 08300と97 05203を参照)。
好ましくは、複製のために必須であり且つ宿主生物又は環境の中で増殖しているベクターを避けるためＥ１，Ｅ２，Ｅ４，及びＬ１−Ｌ５領域から選択される少なくとも１の領域の全て又は一部を欠くアデノウイルスベクターを用いることで与えられるであろう。Ｅ１領域の欠失が好適である。しかしながら、それは、特に不完全な必須の機能が補足細胞系及び／又はヘルパーウイルスによって途中で補われる程度にＥ２，Ｅ４及び／又はＬ１−Ｌ５領域の全部又は一部に影響を及ぼす他の修飾／欠失と組み合わせることができる。これに関して、それは当該技術の状態の二次生成ベクターを使用することが可能である(例えば、国際出願WO-A-94/28152とWO-A-97/04119を参照)。説明のために、Ｅ１領域とＥ４転写ユニットの主要な部分の欠失は、特に有利である。クローン化能力の増加の目的のため、アデノウイルスベクターは、必須でないＥ３領域の全部又は一部を更に欠くことができる。別な改変に従い、５’と３’ＩＴＲｓ(変換した末端繰り返し)と称す被包のために必須とされる、及び被包領域の配列を保持する最小アデノウイルスを使用することができる。該ウイルスのアデノウイルスベクター、及びその製造のための技術は知られる(例えば、GrahamとPrevect,1991,in Methods in Molecular Biology,Vol 7,p 109-128;Ed:E.J.Murey,The Human Press Inc)。
さらに、本発明に従うアデノウイルスベクターの起源は、種の観点から及び血清型の観点からの両方で変更できる。該ベクターは、ヒト又は動物(イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、類人猿など)起源のアデノウイルスのゲノムから又は少なくとも２の異なる起源のアデノウイルスゲノムフラグメントを含むハイブリッドから得ることができる。特に挙げられるものは、イヌ起源のＣＡＶ−１又はＣＡＶ−２アデノウイルス、トリ起源のＤＡＶアデノウイルス又はウシ起源のＢａｄタイプ３アデノウイルスである(Zakharchuk等,Arch.Virol.,1993,128:171-176;SpibeyとCavanagh,J.Gen.Virol.1989,70:165-172;Jouvenne等,Gene,1987,60:21-28;Mittal等,J.Gen.Virol.,1995,76:93-102)。しかしながら、好ましくは血清型Ｃアデノウイルス、特にタイプ２又は５血清型Ｃアデノウイルスから好適に得られるヒト起源のアデノウイルスベクターに対し与えられるであろう。
本発明に従うアデノウイルスベクターは、結紮又は同種組換え(例えば、国際出願WO-A-96/17070を参照)によって又は相補細胞系での組換えによって大腸菌(E.coli)においてインビトロで生産できる。
発現のため要求される要素は、ヌクレオチド配列からポリペプチドへの翻訳を可能にする全ての要素からなる。これらの要素は、特に、調節可能な又は構成され得るプロモーターを含む。勿論、該プロモーターは、選択したベクターと宿主細胞に好適である。言及され得る実例は、ＰＧＫ(ホスホグリセレートキナーゼ)の真核性プロモーター、ＭＴ(メタロチオネイン；McIvor等,1987,Mol.Cell Biol.7,838-848)、α−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、界面活性剤、免疫グロブリン、β−アクチン(Tabin等,1982,Mol.Cell Biol.2,426-436)及びＳＲα(Takebe等,1988,Mol.Cell Biol.8,466-472)遺伝子、ＳＶ４０ウイルス(シミアンウイルス)の早期プロモーター、ＲＳＶのＬＴＲ(ラウス肉腫ウイルス)、ＨＳＶ−１ ＴＫプロモーター、ＣＭＶウイルス(サイトメガロウイルス)の早期プロモーター、ｐ７．５ｋ ｐＨ５Ｒ、ｐＫ１Ｌ、ワクシニアウイルスのｐ２８とｐ１１プロモーター、及びＥ１ＡとＭＬＰアデノウイルスプロモーターである。プロモーターはまた、腫瘍又は癌細胞中で発現を刺激するプロモーターとすることができる。特に挙げられるものは、乳癌と前立腺癌で過剰発現されるＭＵＣ−１遺伝子の(Chenら,1995,J.Clin.Invest.96,2775-2782)、結腸癌で過剰発現される(Schrewe等,1990,Mol.Cell.Biol.10,2738-2748)ＣＥＡ(癌胚芽抗原を表す)遺伝子の、黒色腫で過剰発現されるチロシナーゼ遺伝子の(Vile等,1993,Cancer Res.53,3860-3864)、乳癌と膵臓癌で過剰発現するＥＲＢＢ−２遺伝子の(Harris等,1994,Gene Therapy 1,170-175)及び肝臓癌で過剰発現されるα−フェトプロテイン遺伝子(Kanai等,1997,Cancer Res.57,461-465)のプロモーターから作られ得る。サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)早期プロモーターが特に好ましい。
必要な要素は、本発明に従うヌクレオチド配列の発現を又は宿主細胞中でのそれの維持を改善する付加の要素を更に含むことができる。イントロン配列、分泌シグナル配列、核限局化配列、ＩＲＥＳタイプの翻訳の再開用内部サイト、転写終止ポリＡ配列、トリパーチットリーダー(tripertite leaders)及び複製の起点が特に挙げられ得る。これらの要素は当業者に周知である。
本発明に従う組換えベクターはまた、同じ調節要素(ポリシストロンのカセット)の又は独立要素の制御の下にこれら遺伝子を配置することができることによって、興味ある１又はそれ以上の付加の遺伝子をも含むことができる。特に挙げることができる遺伝子は、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０とＩＬ−１２、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、特にＧＭ−ＣＳＦ、及び新脈管形成で作用する因子(例えばＰＡＩ−１、プラスミノーゲン活性化インヒビターを表す)をコードしている遺伝子である。一つの特有の実施態様において、本発明に従う組換えベクターは、ＩＬ−２をコードする又はインターフェロンγ(INFγ)をコードする興味ある遺伝子を含む。それはまた、ＨＳＶ−１ ＴＫ遺伝子、リシン遺伝子、コレラ毒遺伝子などのような他の自殺遺伝子と、本発明に従うヌクレオチド配列との組み合わせを意図することも可能である。
本発明はまた、本発明に従う組換えベクターを含むウイルス粒子にも関する。そのようなウイルス粒子は、当該技術分野で普通であるいずれかの技術を用いてウイルスベクターから作製できる。該ウイルス粒子は、該ベクターの欠失に適した補体化細胞中で増殖される。アデノウイルスベクターに関して、使用は例えば、ヒト胎児腎臓細胞を用いて確立された及びＡ５４９−Ｅ１細胞系の(Imler等,1996,Gene Therapy 3,75-84)又は二重相補性を容認する細胞系の(Yeh等,1996,J.Virol.70,559-565;KrougliakとGraham,1995,Human Gene Therapy 6,1575-1586;Wang等,1995 Gene Therapy 2,775-783;国際出願WO 97/04119)の、Ｅ１機能(Graham等,1977,J.Gen.Virol.36,59-72)を効果的に補う、２９３細胞系をもたらすであろう。それはまた、欠点のある機能を少なくとも部分的に補うためのヘルパーウイルスの利用を可能にする。補体化細胞は、組換えベクターを含むウイルス粒子を生成するためのウイルスカプシド中にウイルスゲノムを被包するために要求される早期の及び／又は後の因子を介して供給できる細胞であると解される。上記細胞は、それ自身のベクターの欠点のある機能の全てを補足することができないであろうし、このケースにおいて、付加の機能を供給するベクター／ヘルパーウイルスとトランスフェクション／形質導入できる。
本発明はまた、
（ｉ） 本発明に従う組換えベクターが、トランスフェクションした補体細胞を得るために途中で上記ベクターを補うことができる補体細胞内に導入され、
（ｉｉ）上記トランスフェクションした補体細胞が、ウイルス粒子が生産できるのに適切とされる条件下で培養され、及び
（ｉｉｉ）上記ウイルス粒子が細胞培養物から回収される、ウイルス粒子の製造方法に関する。
該ウイルス粒子が細胞上清から勿論回収できると同時に、該細胞からもまた回収できる。普通に用いられる方法は、細胞溶解上清中のビリオンを採集するために、連続した凍結／解凍サイクルによる該細胞の溶解を含む。該ビリオンは、当該分野の技術を用いて増幅し且つ精製することができる(クロマトグラフィー法、超遠心分離法、特に塩化セシウム密度勾配を通して、など)。
本発明はまた、本発明に従うヌクレオチド配列又は組換えベクターを含む、又は本発明に従うウイルス粒子で感染した、宿主細胞にも関する。本発明の目的のために、宿主細胞は、上述したような、組換えベクターによりトランスフェクトすることができる、又はウイルス粒子によって感染することができる何れかの細胞からなる。哺乳動物細胞、特にヒト細胞が特に好適である。該細胞はゲノムに統合された又はされない(エピソーム)形態で上記ベクターを含むことができる。該細胞は、何れかの生物の最初の又は腫瘍細胞、特に造血細胞(全能幹細胞、白血球、リンパ球、単球又はマクロファージなど)、筋細胞(サテライト細胞、ミオサイト、筋芽細胞、平滑筋細胞、など)、心臓細胞、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞又は線維芽細胞とすることができる。
本発明はまた、薬学上許容される賦形剤と組合せて、本発明に従うポリペプチド、ヌクレオチド配列、組換えベクター、ウイルス粒子又は宿主細胞を含む組成物にも関する。
本発明はまた、ＵＰＲＴアーゼ活性を示す本発明に従うポリペプチドと、興味ある別なポリペプチド、特にＣＤアーゼ活性を示す従来技術のポリペプチドを含む組成物にも関する。
本発明はさらに、本発明に従うポリペプチドと、興味のある先に記載した遺伝子の一つによりコードされる興味あるポリペプチドを含む組成物に関する。興味あるこれらポリペプチドで特に言及され得るものは、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、特にＧＭ−ＣＳＦ、及び新脈管形成について作用する因子(例えばＰＡＩ−１、プラスミノーゲン活性化インヒビターを表している)である。ＩＬ−２又はＩＮＦγが、特に挙げられる。
該組成物はまた、宿主細胞の中で上記ポリペプチドを発現することを可能にするヌクレオチド配列にも基づくことができる。該ヌクレオチド配列は、一つの又は同じ発現ベクターによって二つの独立のベクターによって運ばれ得る。上記組成物は、上記ヌクレオチド配列を発現しているウイルスベクターから作製されるウイルス粒子を勿論含むことができる。
この理由のために、本発明はまた、ＵＲＰＴアーゼ活性を示すポリペプチドをコードする本発明に従うヌクレオチド配列と、特にＣＤアーゼ活性を示すポリペプチドをコードする、興味ある第２のヌクレオチド配列を含む組成物にも関する。
本発明はさらに、本発明に従うヌクレオチド配列と、ＩＬ−２とＩＮＦγから選択されるポリペプチドをコードする興味ある第２のヌクレオチド配列を含む組成物にも関する。
本発明に従う組成物は、遺伝子治療によって疾患の予防的な又は治癒的な治療をとりわけ意図し、且つ増殖性疾患(癌、腫瘍、再狭窄など)を、及び感染の起源の、特にウイルス(Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ヘルペス、レトロウイルスなど)起源の疾患を、特にねらったものである。
本発明に従う組成物は、それを局所的に、非経口的に又は消化ルートによって投与することに鑑みて、通常は作製できる。特に、治療薬又は予防薬の治療的有効量が薬学的に許容される賦形剤と結合される。非常に多くの投与のルートを意図することが可能になる。実例は、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腫瘍内、鼻内、肺内及び気管内ルートが挙げられる。これら３つの後の実施態様のケースにおいて、それはエアゾルによって又は吸入によって行う投与のために有効とされる。その投与は、単一投薬量として、又は特定の時間の間隔後に１又はそれ以上の機会で繰り返される投薬として実施できる。投与の適当なルートと投薬量は、各種のパラメーター、例えば個体、治療すべき疾患又は転移するべき興味ある遺伝子に基づき変更する。本発明に従うウイルス粒子に基づく調製物は、１０4と１０14ｐｆｕ(プラーク形成単位)、有利には１０5と１０13ｐｆｕ、好ましくは１０6と１０12ｐｆｕの間の投薬量の形で調剤できる。本発明に従う組換えベクターが関係する限り、ＤＮＡの０．０１から１００ｍｇまで、好ましくは０．０５から１０ｍｇまで、特に好ましくは０．５から５ｍｇまでを含む投薬量を意図することが可能である。ポリペプチドに基づいた組成物は、上記ポリペプチドの０．０５から１０ｇまで、特に好ましくは０．０５から５ｇまでを含む。勿論、その投薬量は臨床医によって調整され得る。
該製剤はまた、薬学的な見地から許容される、希釈剤、アジュバント又は賦形剤を、同じく可溶化、安定化及び保存剤をも含むことができる。注射可能なケースにおいて、好適には水性、非水性又は等張性溶液が与えられる。それは、液体又は、適当な希釈剤を用いる使用の時点で再構成することができる乾燥(粉末、凍結乾燥物など)の形態で、単一投薬又は複数投薬として提供することができる。該製剤はまた、プロドラッグの適切な量を含む。
本発明はまた、遺伝子治療によって又は組換えルートによって生産されているタンパク質を投与することによってヒト又は動物体を治療するために意図される医薬を製造するために、本発明に従うポリペプチドの、組換えベクターの、ウイルス粒子の、又は宿主細胞の治療的又は予防的な使用にも関する。最初の可能性に従い、その医薬はインビボで直接投与できる(例えば、接触可能な腫瘍に静脈内注射によって、エアゾルによって肺に、適当なカテーテルを用いて血管系内に、など)。それはまた、患者から細胞(骨髄幹細胞、末梢血液リンパ球、筋肉細胞など)を取り出すことを含むエクスビボアプローチ、従来技術に従いインビトロでそれのトランスフェクション又は感染及び次いで患者にそれを再投与すること、に適合することも可能となる。好ましい使用は、望ましくない細胞増殖を生じる結果となる癌、腫瘍及び疾患を治療すること又は予防することを含む。言及され得る想像できる適用は、胸部の、子宮の(特にパピローマウイルスによって誘発されたそれら)、前立腺の、肺の、膀胱の、肝臓の、結腸の、膵臓の、胃の、食道の、咽頭の、中枢神経系の及び血液(リンパ腫、白血病など)の癌である。それはまた、心臓血管の病気の状況において、例えば血管壁の平滑筋細胞の増殖(再閉塞)を阻止する又は遅延するためにも使用できる。最後に、感染疾患のケースにおいて、ＡＩＤＳに適用させる医薬を意図することも可能である。
本発明はまた、本発明に従うヌクレオチド配列、組換えベクター、ウイルス粒子又は宿主細胞を、その治療を必要とする宿主生物又は細胞に投与することを特徴とする遺伝子治療によって病気を治療するための方法にも及ぶ。
該治療方法が、ＵＰＲＴアーゼ活性を与える、本発明に従うポリペプチドの発現を可能にするヌクレオチド配列、組換えベクター又はウイルス粒子の使用を行う場合、上記組換えベクター又はウイルス粒子によって又は別個のベクター又はウイルス粒子によって運ばれる第２のヌクレオチド配列によって、ＣＤアーゼ活性を示す第２のポリペプチドをコードする第２のポリペプチド配列を付加して投与することを有効にすることができる。後者のケースにおいて、ＵＰＲＴアーゼとＣＤアーゼ配列は、重要ではない投与の順序によって、同時に又は連続的に投与できる。
有利な実施態様に従い、その治療的使用又は治療方法はまた、プロドラッグのの薬学上許容される量を投与する工程をも含み、有利にはシトシンの類似体、特に５−ＦＣが宿主生物又は細胞に投与される。説明のために、それは、５０から５００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で、好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で使用することが可能である。本発明の状況の範囲内で、該プロドラッグは、本発明に従う治療薬の投与の前に、随伴して、さもなければ続けて実行する投与により、標準慣行に従って投与される。経口ルートが好ましい。それは、プロドラッグの単一投薬又は、宿主生物又は細胞内で毒性の代謝産物の生産を可能にするために十分に長い時間繰り返し投薬を投与することが可能である。
さらに、本発明に従う組成物又は方法は、５−ＦＵの細胞毒性作用を有力にする１又はそれ以上の物質と結合できる。ピリミジンのデノボ生合成のための経路の酵素を阻害する医薬の製造に特に言及され得る(例えば後述するそれら)、５−ＦＵ(5-FdUMP)の代謝の生産物の存在において、ロイコボリン(Waxman等,1982,Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18,685-692)のような医薬は、ＰＲＰＰ(ホスホリボシルピロホスファート)のプールを増加することによって、複製のために要求されるｄＴＭＰのプールの減少に帰結する、チミジル酸シンターゼの阻害を増加し、且つメトトレキサート(Cadman等,1979,Science 250,1135-1137)のような最終的な薬剤は、ジヒドロ葉酸還元酵素を阻害する及び細胞のＲＮＡへの５−ＦＵの取込みの増加をもたらす。
本発明はまた、哺乳動物細胞中のポジティブ選択標識として、本発明に従う配列又は組換えベクターを用いることにも向けられる。有利には、該細胞はトランスフェクションされ、そして該細胞混合物は、ＰＡＬＡ(Ｎ-(ホスホノアセチル)-Ｌ-アスパルタート)のようなピリミジンのデノボ生合成のための経路のインヒビターの存在中において培養される；Moore等,1982,Biochem.Pharmacol.31,3317-3321),A77 1726(レフルノミドの活性代謝物；Davis等,1996,Biochem.35,1270-1273)及びBrequinar(Chen等,1992,Cancer Res.52,3251-3257)。そのようなインヒビターの存在は、ＲＮＡとＤＮＡを合成するために要求されるＵＭＰのデノボ合成をブロックし、それによって細胞死に帰結する。この細胞毒性作用は、ウラシルの存在においてＵＰＲＴアーゼ活性をコードしている本発明に従うヌクレオチド配列を発現することによって又はシトシンの存在においてＣＤアーゼ活性をコードしているこの後者の配列を共発現することによって(融合した形態が適する場合)、避けることができる。結果として、トランスフェクションした細胞のみが(ＵＰＲＴアーゼ／ＣＤアーゼ配列を組み込んである細胞)、ピリミジン合成経路のインヒビターの存在中で増殖できるだろう。かくして、本発明に従う使用は、細胞混合物中でトランスフェクションした細胞を効果的に同定すること及び／又はそれから単離することを可能にする。
本発明はまた、基礎とされるトランスジェニック動物の作製方法が遮断されること(ノックアウトした)における、胚の幹細胞の遺伝子における実験中のネガティブ選択標識として本発明に従う配列又は組換えベクターの使用にも関する(例えば、Capecchi,1989,Science 244,1288-1292;Reid等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4299-4303を参照)。そのような使用、例えばネオマイシンに耐性な遺伝子との結合で、相同組換え事象を受けている及びゲネチシン及び一致するフッ素化ピリミジン(もし本発明に従うヌクレオチド配列がＵＰＲＴアーゼ活性をコードすることに用いられるなら５−ＦＵ、ＣＤアーゼ活性をコードしているヌクレオチド配列も又用いられる場合、５−ＦＣ)の存在においてのみ増殖できるであろう細胞を選択する可能性をつくることができる。非標的化組換え事象を受けていない細胞は、ゲネチシンの存在中で増殖するが、しかしフッ素化ピリミジンの存在中ではできない。ネガティブ選択標識として別の潜在的な使用は、ちょうど哺乳動物細胞のように、植物が何れかの内因性ＣＤアーゼ活性を所有していないことから、植物において見出される。それは、外因的にＣＤアーゼの発現を可能にする本発明に従うヌクレオチド配列をトランスフェクションすることによって５−ＦＣに感受性にできる(例えば、Perera等,1993,Plant.Mol.Biol.23,797-799)。
実施例
本発明は、全てが制限するものではなく、以下の実施例によって説明され、ここで：
− 図１はＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を移植しているＢ６Ｄ２マウスの生存率を表す。マウスの異なる群(群当たり１０匹のマウス)は、次の組成物で処理した：
●ビヒクル／生理食塩水；＋ビヒクル／５−ＦＣ；★Ａｄ ｎｕｌｌ／生理食塩水；−Ａｄ ｎｕｌｌ／５−ＦＣ；×ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；◆ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ
− 図２はＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を移植しているＢ６Ｄ２マウスの生存率を表す。マウスの異なる群(群当たり１０匹のマウス)は、次の組成物で処理した：
●ビヒクル／生理食塩水；＋ビヒクル／ＧＣＶ；★Ａｄ ｎｕｌｌ／生理食塩水；−Ａｄ ｎｕｌｌ／ＧＣＶ；×ＡｄＴＫ／生理食塩水；◆ＡｄＴＫ／ＧＣＶ
図３はＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を移植しているＢ６Ｄ２マウスの生存率を示す。マウスの異なる群(群当たり１３マウス)は、次の組成物で処理した：
●ビヒクル／生理食塩水；＋ビヒクル／５−ＦＣ；★Ａｄ ｎｕｌｌ／生理食塩水；−Ａｄ ｎｕｌｌ／５−ＦＣ；×Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；◆Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ；▼Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄｍｕＩＦＮｇ／生理食塩水；△Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄｍｕＩＦＮｇ／５−ＦＣ；ｏ ＡｄｍｕＩＦＮｇ＋ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；Ｏ ＡｄｍｕＩＦＮｇ＋ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ
− 図４はＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を移植しているＢ６Ｄ２マウスの生存率を示す。マウスの異なる群(群当たり１３マウス)は、次の組成物で処理した：
●ビヒクル／生理食塩水；＋ビヒクル／５−ＦＣ；★Ａｄ ｎｕｌｌ／生理食塩水；−Ａｄ ｎｕｌｌ／５−ＦＣ；×Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；◆Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ；▼Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄｈｕＩＬ−２／生理食塩水；△Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄｈｕＩＬ−２／５−ＦＣ；ｏ ＡｄｈｕＩＬ−２＋ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；Ｏ ＡｄｈｕＩＬ−２＋ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ
後述した構築は、Maniatis等(1989,Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中に記載されたような遺伝的エンジニアリングと分子クローン化の一般的技法を用いて又は市販キットを用いた場合製造者の推奨に従い調製した。相同組換え工程は、好ましくは大腸菌ＢＪ５１８３株(Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166,557-580)において実施される。制限サイトの再生に関して、利用したその技術は、５’突出末端において満たすための大腸菌ポリメラーゼＩのラージフラグメント(クレノーフラグメント)を用いることを含む。加えて、後述した異なる構築において利用したアデノウイルスゲノムフラグメントは、レファレンスＭ７３２６０の下にGenebankデータベース中に開示された通りのＡｄ５ゲノムのヌクレオチド配列中のそれの位置に従って正確に示される。
細胞生物学に関して、その細胞はトランスフェクションされ又は形質導入され、当業者に良く知られた標準の技術に従い培養される。酵母の株に関して、使用したものは、特に、GuthrieとFink(1991,Methods in Enzymology,Vol.194,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Academic Press Inc)中に記載される通常の技術で作られる。
実施例１： 端切りＦＵＲ１Δ１０５遺伝子の構築
野生型ＦＵＲ１遺伝子を運ぶＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、プラスミドｐＨＸ(Kern等,1990,Gene 88,149-157)から単離し、プラスミドｐＲＳ３０６ＦＵＲ１を形成するために、これらの同じ酵素で消化されている統合化酵母プラスミドｐＲＳ３０６(SikorskiとHieter,1989,Genetics 122,19-27)中に挿入した。この後者のプラスミドにより開始する、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩによって処理されている、酵母セントロメトリックプラスミドｐＲＳ３１４(SikorskiとHieter,1989,Genetics 122,19-27)内に、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で、ＦＵＲ１遺伝子を再クローン化した。これは、大腸菌ＣＪ２３６株(dut,ung,thi,relA,pCJ105(CmR))中で作製したウラシル含有一本鎖から、ファージミドｐＲＳ３１４ＦＵＲ１を生じた；部位特異的変異誘発は、Kunkel法(Muta-Gene phagemid kit,In vitro Mutagenesis Version 2;Biorad)を用いてこの鎖上で実行した。その変異誘発のねらいは、ＦＵＲ１遺伝子の、開始ＡＴＧの５’と停止コドンの３′それぞれにＥｃｏＲＩとＭｌｕＩ制限サイトを導入することと、Aspに変わっている第２ Asnコドンを伴う、Kozak則に従って開始ＡＴＧの状況を変更することである。配列番号：３と配列番号：４中に記載したオリゴヌクレオチドが、これをなすために用いられた。それにより生じたプラスミド、即ちｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１は、野生型ＵＰＲＴアーゼ活性用のコントロールとして用いた。
同じく、ＦＵＲ１コード化配列の最初の１０５ｎｔは、配列番号：５と配列番号：４中に記載したオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドｐＲＳ３１４ＦＵＲ１を変異誘発することによって欠失した。得られたプラスミド、即ちｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１０６は、Serコドンの次にAla、及び停止コドンのＭｌｕＩサイト３′への変更と一緒に、この位置でKozakコンセンサス、いわゆるＡＴＧコドン(天然タンパク質のMet+36に相当する)のＥｃｏＲＩサイト５’にそれの完全に同等な変更を含む。ｐＲＳ３１４ＦＵＲＩ＋１０６からのＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩフラグメントは、最初の３５ Ｎ末端残基が欠失されているタンパク質を発現するＦＵＲ１遺伝子を運ぶプラスミドｐＲＳ３１４ＦＵＲ１Δ１０５を形成するため、ＥｃｏＲ１とＳａｃＩで切断されている、プラスミドｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１に再クローン化した。
実施例２： Ｓ．セレビシエのｆｕｒ１変異体の相補性
上記構築物から得られたＦＵＲ１発現生産物の機能的能力を、ｐＲＳ３１４型の異なるプラスミドによって形質転換されているＳ．セレビシエのｆｕｒ１−８ｔｒｐ１−４変異体(JundとLacroute,1970,J.Bacteriol.102,607-615)の相補性によって評価した。その形質転換体は、通常の手法(最少ＹＮＢ培地)中又は5mM ５−ＦＵの存在中のいずれかで培養し、３０℃及び３７℃でのそれの増殖能力を評価した。その結果は表１中に表され、ここで、＋は、５−ＦＵに対する感受性を、且つそれ故にＵＰＲＴアーゼ活性を試験している、増殖の欠如を表す。
形質転換体の全ては、通常のＹＮＢ培地において勿論増殖できる。一方、ＦＵＲ１配列を含んでいない「空の」ｐＲＳ３１４プラスミドを含む形質転換体のみは、天然ＦＵＲ１配列(ｐＲＳ３１４ＦＵＲ１)を含むプラスミドが与えられているそれらに対して、５−ＦＵの存在中で増殖でき、第１ＡＴＧコドンのレベルで変異されているＦＵＲ１配列(ｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１)、第２ＡＴＧコドンのレベルで変異されているＦＵＲ１配列(ｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１０６)又は端切りしたＦＵＲ１配列(ｐＲＳ３１４ＦＵＲ１Δ１０５)は、５−ＦＵの存在に対して感受性である。これらの相補性試験は、異なる構築生産物、機能的ＵＰＲＴアーゼ酵素と３５ Ｎ末端残基を欠失しているそれは、酵素の活性に関して何れかのネガティブな作用を有さないことを示す。
実施例３： 哺乳動物細胞中のＦＵＲ１とＦＵＲ１Δ１０５の発現。
ＦＵＲ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を運ぶ、ｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１とｐＲＳ３１４ＦＵＲ１Δ１０５のＥｃｏＲＩ／ＭｌｕＩフラグメントは、プラスミドｐＣＩ-ｎｅｏＦＵＲ１＋１とｐＣＩ-ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５のそれぞれを形成するために、真核生物発現プラスミドｐＣＩ-ｎｅｏ(Promega)に導入した。ＣＯＳ７細胞(ATCC CRL-1651)は、これらのプラスミドによって一時的にトランスフェクションされ、ＵＰＲＴアーゼ酵素活性は細胞抽出物中で測定した。
より正確には、５×１０5ＣＯＳ７細胞を、１０％胎児ウシ血清(ＦＣＳ)を補充したＤＭＥＭ培地の５ｍｌを含む６０ｍｍ培養皿中、３７℃で植種した。次の日、その細胞を、プラスミドの５μｇの存在又は不在中、リポフェクチン(Gibco BRL)の２０μｌで処理し、ＤＭＥＭ培地の２ｍｌ中で培養を継続した。３７℃で１６時間のインキュベーション後、その細胞をほぼ４８時間、ＤＭＥＭ-１０％ＦＣＳの５ｍｌ中に移し替えた。次いでその細胞を洗浄し、４℃で３０分間、溶解緩衝液(50mMトリス塩酸，ｐＨ７．５／150mM ＮａＣｌ／5mM ＥＤＴＡ／1mM ＤＴＴ／1%triton X-100)の３０μｌ中に再懸濁した。その細胞溶解物を採集し、遠心分離し、そのＵＰＲＴアーゼ酵素活性を得られた上清について測定した。これをなすために、溶解物の４μｌを、ＵＰＲＴアーゼ反応緩衝液(100mMトリス塩酸ｐＨ７．５／10mM ＭｇＣｌ2／10mM ５−ＰＲＰＰ(５-ホスホリボシルピロホスファート)／0.02μCi/μl(NEN)を有する3mM[C14]ウラシル)の２μｌの存在中で１０分間、３７℃でインキュベーションした。その酵素反応は、１分間１００℃で加熱することによって停止した。１μｌアリコートを、ポリエチレンイミン-セルロースＴＬＣプレート(Merck)上にロードした。そのウラシルは、移動溶媒として水を用いることによってＵＭＰから分離した。移動の後、そのＴＬＣ板を、PhosphorImager(445 SI;Molecular Dynamics)によりスキャンした。そのタンパク質濃度は、ブラッドフォード法(protein Assay;Biorad)で測定した。ＵＰＲＴアーゼ活性は、３つの個別の形質転換体を基礎として測定し、その結果を表２に示した。
ＵＭＰへのウラシルの形質転換は、完全なＦＵＲ１遺伝子(PCI-noeFUR1+1)又は端切りＦＵＲ１遺伝子(PCI-noeFUR1Δ105)を発現するプラスミドがトランスフェクションされている細胞においてのみ観測された。それはまた、端切りした遺伝子によってコードされたＵＰＲＴアーゼ活性が、３０のファクターによって完全な遺伝子によってコードされたそれよりもより高かったことが注目される。
実施例４： 端切りＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を翻訳するためのアデノウイルスの構築とヒト腫瘍細胞感染。
１． ＦＵＲ１Δ１０５発現用のｐＴＧ６２８９の構築
端切りした遺伝子を包含する、ｐＣＩ-ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５からＥｃｏＲＩ／ＭｌｕＩフラグメントを分離し、翻訳ベクターｐＴＧ６２８８を形成するために、同じ酵素で切断されている、ベクターｐＴＧ６６００の中に導入した。情報のために、ｐＴＧ６６００は、p polyIIベクター(Lathe等,1987,Gene 57,193-201)であり、Ａｄ５ １から４５８配列、早期ＣＭＶプロモーター、ハイブリッドスプライシング配列はプラスミドｐＣＩ(Promega社、ヒトβ-グロブリン遺伝子のイントロン１のスプライシングドナーサイトとマウス免疫グロブリン遺伝子のスプライシングアクセプターサイトを含む)中に見出され、ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化配列とＡｄ５ 3328-5788配列が挿入されている。その構築物の達成化は、当業者の能力の範囲内である、特に文献FR-A-2 763 959に基づく。そのアデノウイルスベクターｐＴＧ６２８９は、ｐＴＧ６２８８からのPacI/BstEIIフラグメントと、ＣｌａＩ-直線化したベクターｐＴＧ６６２４の間で大腸菌ＢＪ５１８３株中、組換えによって再構築した。情報のために、ｐＴＧ６６２４は、Ｅ１(nt 459から3327)とＥ３(nt 28592から30470)領域は、Ｅ１の代わりに挿入される発現カセットと一緒に欠失されているものから、Ａｄ５ゲノムを搬送しているプラスミドp poly IIに一致する。
最後のｐＴＧ６２８９構築物は、Ｅ１(nt 459から3328)とＥ３(nt 28249から30758)領域のバルクが欠失されているものからのＡｄ５ゲノム、及びＥ１の代わりに、早期ＣＭＶプロモーターの制御下に配されるＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を発現するカセット及びハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列を含む。該アデノウイルス粒子は、Ｅ１機能を補う、例えば従来技術(Graham and Prevec,1991,Methods in Molecular Biology Vol.7,Gene Transfer and Expression Protocols;Ed.E.J.Murray,The Human Press Inc,Clinton,NJ)に従う２９３細胞系(ATCC CRL1573)のような細胞系をトランスフェクションすることによって作製される。
２．ＦＣＹ１遺伝子を発現するためのベクターの構築。
ウラシル含有一本鎖は、部位特異的変異誘発によって(Muta-gene Phagemid kit,In vitro Mutagenesis version2;Biorad)鎖が変更される発現ファージミドｐＲＳ３１５ＦＣＹ１(Erbs等,1997,Curr.Genet.31,1-6)から単離した。配列番号：６と番号：７のオリゴヌクレオチドを用いるその変異誘発は、開始ＡＴＧのＨｉｎｄＩＩＩサイト５’及びＦＣＹ１遺伝子の停止コドンのＥｃｏＲ１サイト３’を導入すること及びKozak則に従って翻訳状況を変更することを可能にする。この手法において変更されているHindIII/EcoR1フラグメントは、ｐＲＳ３０６ＦＣＹ１を形成するために、同じ酵素によって消化されているプラスミドｐＲＳ３０６(SikorskiとHieter,1989,Genetics 122,19-27)に挿入した。ｐＲＳ３０６ＦＣＹ１からのXhoI/XbaIフラグメントは、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断されているベクターｐＣＩ−ｎｅｏ(Promega)にサブクローンした。これはその開始ＡＴＧのレベルでKozakコンセンサス配列を有するＦＣＹ１遺伝子を含むｐｃＩ-ｎｅｏＦＣＹ１に帰結する。
酵素ＣＤアーゼをコードしているＳ．セレビシエＦＣＹ１遺伝子を発現するためのアデノウイルスベクターを作製した。ＦＣＹ１遺伝子を囲む、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＹ１からのXhoI/XbaIフラグメントは、ｐＴＧ６２８６を形成するためにXhoI-XbaI-消化したベクターｐＴＧ６６００中に導入した。先の通り、ＦＣＹ１を搬送する且つｐＴＧ６２８６から分離したPacI/BstEIIフラグメントと、Ｅ１とＥ３領域を欠失し且つＥ１に代えてＦＣＹ１遺伝子を含む、アデノウイルスベクターｐＴＧ６２８７を作製するClaI-直線化したベクターｐＴＧ６６２４との間の相同組換えは、ＣＭＶプロモーターとハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列の制御下に設けた。該ウイルス粒子(ＡｄＴＧ６２８７)は、２９３細胞のトランスフェクションにより得られた。
３．酵素活性の測定
アデノウイルスの構築物は３つのヒト腫瘍細胞系：ＰＡＮＣ−１(膵臓肉腫／ATCC CRL-1469)、ＳＫ−ＢＲ−３(胸腺癌／ATCC HTB-30)及びＳＷ４８０(結腸腺癌／ATCC CCL-228)について試験した。これらの細胞は、それが５−ＦＵに対し抵抗性であり、それによってＦＵＲ１Δ１０５遺伝子の効力を測定することが可能であるために選択した。
より正確には、ＰＢＳ−２％ＦＣＳの１００μｌ中に懸濁した５×１０6細胞を、２０のＭＯＩ(感染多重度)で試験するべきアデノウイルス(Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１とＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１、又はその２つの混合物)の存在中、３０分間３７℃でインキュベーションした。ネガティブコントロールとして、模擬感染を実施した又は感染が興味ある遺伝子を欠く最初に作製したアデノウイルス(Ａｄ ｎｕｌｌ)により実行された、のいずれか一方で行った。感染した細胞は、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳの５００μｌに入れ、皿当たり１×１０6細胞の率で３５ｍｍ培養皿中に配した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、基質として５−ＦＣ又は５−ＦＵを用い、酵素活性の相違を、細胞溶解物について測定した。ＵＰＲＴアーゼ活性は、先に記載されたプロトコルに従い、ＵＰＲＴアーゼ反応緩衝液([Ｃ14]５−ＦＵ，Sigma)の２μｌの存在中、３７℃で２０分間インキュベーションされる、細胞溶解物の４μｌについて測定した。ＣＤアーゼ活性の場合、ＣＤアーゼ反応緩衝液(100mMトリス塩酸,pH7.5／0.25μCi/μlを有する3mM[H3]5-FC)の２μｌと一緒に２０分間３７℃でインキュベーションされる、細胞溶解物の４μｌを使用し行った。５−ＦＣの５−ＦＵＭＰ(ＣＤアーゼ／ＵＰＲＴアーゼ活性)への変換は、ＣＤアーゼ／ＵＰＲＴアーゼ反応緩衝液(100mMトリス塩酸,pH7.5／10mM ＭｇＣｌ2／10mM ５−ＰＲＰＰ／0.25μCi/μlを有する3mM[H3]5-FC)の２μｌの存在中、２０分間３７℃でインキュベーションされる、細胞溶解物の４μｌについて測定した。１μｌアリコートをＰＥＩセルロースＴＬＣ板上にロードした。その５−ＦＵは溶媒として水を用いることによって５−ＦＵＭＰから分離し、その５−ＦＵＭＰは溶媒として水／１−ブタノール(14%/86%)混合液を用いることによって５−ＦＵから分離した。
３つの細胞型において、ＣＤアーゼ活性はＦＣＹ１遺伝子を発現するアデノウイルスで感染した細胞(Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１)から、及び２つのウイルス、即ちＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１とＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５で共感染した細胞から得られた抽出物において観測された。その酵素アッセイは、ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ３とＳＷ４８０細胞において約８０から１００転換した５−ＦＣのｐモル／分／タンパク質のｍｇまでの変化に富んだ活性を示した。５−ＦＵの転換に関する限り(ＵＰＲＴアーゼ活性)、ほぼ数百の転換した５−ＦＣのｐモル／分／タンパク質のｍｇの内因活性を観測した。その活性は、その感染をそれ自身についてＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５によって実行した場合又はその細胞を共感染した場合に７から８のファクターによって増幅される。最後に、５−ＦＣの５−ＦＵＭＰへの変換は、Ａｄ−ＣＭＶ−ＦＣＹ１によって感染されている(内因性ＵＰＲＴアーゼ活性のために)、及び該細胞が共感染される場合、抽出物で検出された。
加えて、５−ＦＣと５−ＦＵのＬＤ50(５０％致死量)値(μＭ)を、上記ウイルスで感染した(Mock感染、Ａｄ ｎｕｌｌ感染、Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１感染及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５感染)又はＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を発現するアデノウイルスで共感染した、３つのヒト腫瘍細胞系に関して測定した。その細胞は、２０のＭＯＩで感染し次いで各種濃度の薬剤(５−ＦＣ又は５−ＦＵ)の存在又は不在中で培養した。トリパンブルーを、Ｄ＋６でのトリプシン化後に加えた。生存細胞はトリパンブルーを取り込まず、一方死滅細胞は染色される。死亡率％を顕微鏡下に評価した。以下に報告した値は、４回の計測後に得た平均値である。
５−ＦＣに関しての感染細胞系のＬＤ50は、２つのＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子が共発現された場合、５と１０μＭの間であり(細胞系に基づいて)、一方ＦＣＹ１遺伝子がそれ自身で発現される場合１００から５００μＭであり、且つネガティブコントロールのケースにおいて(Mock感染とＡｄ ｎｕｌｌ感染)及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５の場合において、５０００から１００００μＭまでであった。同様に、５−ＦＵに関するＬＤ50は、そのその感染がＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を発現するウイルスを用いた場合、ネガティブコントロール及びそれ自身についてＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１を用いた感染における、に対してかなり低かった。これらの結果は、５−ＦＣプロドラッグの、細胞毒性５−ＦＵＭＰへの転換を改善するための「自殺」遺伝子アプローチにおけるＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子の相乗効果を用いることの重要性を示す。
実施例５： ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼを運ぶ融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子の構築
１．遺伝子融合の構築
ｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５からのEcoR1/NotIフラグメントは、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＹ１＋ＦＵＲ１Δ１０５を与えるために、EcoR1/NotI切断プラスミドｐＣＩ−ｎｏｅＦＣＹ１中に挿入した。開始点としてこのウラシル含有一本差プラスミドを用い、ＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５を、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１６１５(配列番号：８)を用いた部位特異的変異誘発の手段によって融合した。その変更は、ＦＣＹ１の停止コドンとＦＵＲ１の開始Ｍｅｔコドンを欠失すること、それによっていずれかのスペーサーなしに相中でＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５配列を融合することを可能にすることを含む(この融合体は以下にＦＣＵ１と定義した)。
２．二官能性ＦＣＵ１タンパク質の酵素的な特徴。
予め記載された技術は：
− トランスフェクションしない
− ｐＣＩ−ｎｅｏ(空のプラスミド)の１０μｇをトランスフェクショシした
− ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＹ１の５μｇ＋ｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５の５μｇをトランスフェクションした
− ｐＣＩ−ｎｅｏの５μｇ＋ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１の５μｇをトランスフェクションした
ＣＯＳ７細胞からの細胞溶解物中、ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性(３７℃で１０分間反応)を測定するために使用した。
得られた値を以下の表３中に３回の酵素測定の平均を記した。
同等のＵＰＲＴアーゼは、該遺伝子が融合した形(ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１)においてか又は非融合形(ｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５)のどちらかで観測された。驚くべきことに、そのＣＤアーゼ活性は、その遺伝子が融合した形態である場合、融合していないＦＣＹ１遺伝子に対して、１０のファクターで増加した。かくてその融合形は、それが集合ＣＤアーゼ-ＵＰＲＴアーゼ活性の増加を生じ、従って５−ＦＣから５−ＦＵＭＰの形成を増加することから有益となる。
ＦＣＵ１によりコードした融合タンパク質のＵＰＲＴアーゼ活性は、ＣＤアーゼ活性に相関して制限される；３０００ウラシルｐモル／分／タンパク質のｍｇのオーダーのウラシルのプールの形成が、ＣＤアーゼ-ＵＰＲＴアーゼ反応の間にインビトロで検出された。このウラシルのプールは、該反応がＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５タンパク質の使用を行う場合、同じ条件下で存続しない。
３．Ｂ１６(Ｆ０)細胞系におけるプラスミドｐＣＩ−ｎｅｏにクローン化されているＦＣＹ１、ＦＵＲ１Δ１０５及びＦＣＵ１遺伝子の発現。
ＦＣＵ１遺伝子融合の効率は、Ｂ１６(Ｆ０)マウスメラノーマ細胞系(ATCC CRL-6322)のトランスフェクションによって評価した。これをなすために、２．５×１０5Ｂ１６(Ｆ０)細胞を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地の５ｍｌを含む６．０ｍｍの皿中、３７℃で植種した。インキュベーションの４８時間後、その細胞を、プラスミドの５μｇの存在中、リポフェクチン(Gibco BRL)の２０μｌで処理し、次いで培養をＤＭＥＭ培地２ｍｌ中、３７℃で１６時間継続した。その４８時間後、細胞をＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳの５ｍｌ中に配し、次いで１０ｃｍペトリ皿中で、１ｍｇのＧ４１８／ｍｌを含むＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地中で希釈した。Ｇ４１８に耐性のクローンは、２０日後に生存可能である。それぞれの構築物で得られたクローンを採集し、Ｔ１５０フラスコ中に移し、選択培地中で培養した。ＣＤアーゼ、ＵＰＲＴアーゼ及びＣＤアーゼ−ＵＰＲＴアーゼ活性は、基質として５−ＦＣ又は５−ＦＵの存在中、３７℃で測定した。示した値は、３回の酵素測定後に得られた平均値である(表４参照)。
その酵素結果は、トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞を用いて測定したそれらを確証する、即ち、ＵＰＲＴアーゼ活性を保持するが、しかしＣＤアーゼ活性が天然ＦＣＹ１タンパク質を用いて測定したそれと比較して融合タンパク質のケースにおいて強力に増加している。ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１でトランスフェクションしたＢ１６クローンの場合、ＣＤアーゼ活性の増加の結果である５−ＦＵのプール(120pモル/分/タンパク質mg)もまたインビトロで現れた。
５−ＦＣと５−ＦＵに対する異なるクローンの感受性もまた、６日間薬剤の存在中でインキュベートした後に試験した。以下の値は、細胞死亡率の４回の計測(トリパンブルーを用いた)の平均である。５−ＦＣのＬＤ50は、ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＹ１を用いた場合の１００μＭ及びネガティブコントロール(未トランスフェクション細胞とｐＣＩ−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞)を用いた場合及びｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５を用いた場合の１０００μＭと比較して、(ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１)遺伝子融合を運ぶプラスミドでトランスフェクションした細胞のケースにおいて１０μＭである。５−ＦＵのＬＤ50は、他の全てのケースにおける０．０５μＭに対して、ｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５又はｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１を用いてトランスフェクションを実施した場合、０．０３μＭである。
これらの結果は、ＦＣＵ１遺伝子の発現が、ＦＣＹ１遺伝子の発現でなされたよりもより強力に５−ＦＣに対して細胞を感作する。５−ＦＣに対する感作のこの相違は、より高いＣＤアーゼ活性を有する融合タンパク質のためであり且つＵＰＲＴアーゼ活性の存在のためではない；Ｓ．セレビシエ遺伝子によってコードされるこのＵＰＲＴアーゼ活性は、５−ＦＵに対して生来非常に感受性であり且つかなりの内因性ＵＰＲＴアーゼ活性を示すＢ１６(Ｆ０)細胞の５−ＦＵの毒性において少しの効果を有する。
４．ＦＣＵ１遺伝子によってトランスフェクションされたＢ１６(Ｆ０)細胞がバイスタンダー効果を示すことの実証。
ＦＣＵ１トランスフェクションしたＢ１６(Ｆ０)細胞のＣＤアーゼ-ＵＰＲＴアーゼ活性のインビトロアッセイにおける５−ＦＵのプールの出現は、バイスタンダー効果を高める有効性、priori、がある：この細胞内プールの非常に大きなサイズ、その大きさは、培地中の５−ＦＵの受動的拡散であろうし且つその大きさは非トランスフェクション細胞の死亡率となるであろう。
このバイスタンダー効果を実証するために、非トランスフェクションＢ１６(Ｆ０)クローンを、ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１によってトランスフェクションされたＢ１６(Ｆ０)クローンと、異なる割合で混合した。これらのクローン混合物は、次いで５−ＦＣの異なる濃度の存在中で試験した。細胞死亡率(トリパンブルーを用いた)は、５−ＦＣの存在中で４日間の培養後に評価した。その結果を以下の表５中に示した。
５−ＦＣのＬＤ50は、該細胞混合物がＦＣＵ１-トランスフェクションした細胞の５％を含むとすぐに、１０のファクターによって低下し、それによってバイスタンダー効果の存在の証拠となることが明らかになった。そのＬＤ50投薬量は勿論、トランスフェクションした細胞の比率が増加した場合、減少を続ける。
このバイスタンダー効果が、ｔｋ／ガンシクロビル系に対して、細胞間の何れかの接触が要求されないことを実証する目的に関し、培地への５−ＦＵの拡散のために、(トランスフェクションしない)Ｂ１６細胞を、５−ＦＣの異なる濃度の存在中４８時間インキュベーションされているＢ１６(ネガティブコントロール)又はＢ１６ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１クローンからの培養上清から得られた培地(新たな培地中で４対１に希釈した)中で４日間インキュベーションし、Ｂ１６細胞の死亡率をトリパンブルーを用いて評価した。その結果は、ＬＤ50についての強烈な効果を実証し且つ５−ＦＵが、高いＣＤアーゼ活性を有するＦＣＵ１遺伝子によりコードされたタンパク質融合の結果としてその培地中に存在することを示した。
実施例６ ＦＣＵ１遺伝子を転移するための及び腫瘍細胞に感染するためのアデノウイルスの構築。
１． ＦＣＵ１を発現するためのｐＴＧ１３０６０の構築。
ＦＣＵ１遺伝子融合を包含する、ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１からのXhoI/MluIフラグメントを単離し、転移ベクターｐＴＧ１３０５９を形成するためにXhoI/MluI−線状化ベクターｐＴＧ６６００に導入した。ＦＣＵ１を運ぶ且つｐＴＧ１３０５９から分離したPacI/BstEIIフラグメントと、Ｅ１とＥ３領域を欠失し且つＥ１に代えてＦＣＵ１遺伝子を含むアデノウイルスベクターｐＴＧ１３０６０を生成するＣｌａＩ−線状化ベクターｐＴＧ６６２４との間の相同組換えは、ＣＭＶプロモーターとハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列の制御下で行った。そのウイルス粒子(Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１)は、２９３細胞をトランスフェクションすることによって得た。
２． 腫瘍細胞においてアデノウイルスベクター中にクローン化されるＦＣＵ１遺伝子の発現。
新たなアデノウイルス構築物は、３つのヒト腫瘍細胞系：ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ−３及びＳＷ４８０について試験した。上述した技術は、２０のＭＯＩで感染したヒト細胞から得られた細胞溶解物において、ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性(基質として５−ＦＣ又は５−ＦＵを用い)を測定するために使用した。ＵＰＲＴアーゼ活性(７００から８００の変換５−ＦＵｐモル／分／タンパク質ｍｇ)が、ＦＵＲ１Δ１０５遺伝子によって発現したＵＰＲＴアーゼ活性に同等であるＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１によって感染した３つの細胞系で観測された。その３つの細胞形において、ＣＤアーゼ活性は、Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１によって感染した場合の細胞の活性との比較として、該遺伝子が融合形(ＦＣＵ１)で発現される場合、１００のファクターで(１００００から１２０００転換５−ＦＣｐモル／分／タンパク質ｍｇ)増加した。
アデノウイルスベクターから発現した場合、その融合タンパク質は、実施例５と同様に、ＣＤアーゼ活性に相関して制限される、及びＣＤアーゼ−ＵＰＲＴアーゼ反応の間に１００００転換５−ＦＣｐモル／分／タンパク質ｍｇのオーダーの５−ＦＵの相当なプールの形成に至る、ＵＰＲＴアーゼ活性を示す。この５−ＦＵの蓄積は、バイスタンダー効果を高める。
５−ＦＣと５−ＦＵのＬＤ50値は、異なるウイルス(Ａｄ ｎｕｌｌ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１)又はＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を発現するアデノウイルスによって共感染した、３つのヒト腫瘍細胞系と比較して測定した。その細胞は、５のＭＯＩで感染し、５−ＦＣと５−ＦＵの異なる濃度の存在中で培養した、培養６日後、細胞の生存能を、トリパンブルーを用いて測定した。以下の表６中に掲載したそのＬＤ50値は４回の計数の平均値である。
これらの結果は、アデノウイルスベクターからのＦＣＵ１遺伝子の発現が、ＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子の共発現をなしたものよりも、より強い５−ＦＣへの感作を生じた。５−ＦＣに対するこの大きな感作は、ＦＣＵ１遺伝子融合によってコードしたＣＤアーゼ活性の増加をもたらす。
３．異なるアデノウイルスによって感染したヒト腫瘍細胞がバイスタンダー効果を示すことの実証。
ヒト腫瘍細胞ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ−３及びＳＷ４８０は、２０のＭＯＩで感染させた(Ａｄ ｎｕｌｌ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１)。３７℃でのインキュベーションの４８時間後、その細胞をＰＢＳで二度濯ぎ、トリプシン処理し、異なる比率で未感染細胞の存在中に植種した。1mM ５−ＦＣの存在中で六日間培養後、細胞死亡率をトリパンブルーを用いて評価した。その結果(４回の測定の平均)は、３つの腫瘍株のケースにおいて、Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１によって感染した細胞１０％と未感染細胞の９０％の混合物は１００％死亡率に至ることを示した。その細胞をＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１で感染した場合、感染細胞の１％は１００％死亡率に至るに十分であった。この実験は、融合タンパク質を発現する細胞中の５−ＦＵのプールの増加をもたらす、かなりのバイスタンダー効果の存在を実証する。
５−ＦＣの存在中、ＦＣＹ１とＦＣＵ１を発現する細胞によって培地への５−ＦＵの分泌を実証する目的に関して、１０6ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ−３及びＳＷ４８０細胞を、２０のＭＯＩで感染した(Ａｄ ｎｕｌｌ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１)。その細胞は、０．２５μＣｉ／μｌを与える１ｍＭ[3Ｈ]５−ＦＣの存在中で培養した。培養４８時間後、培地の２μｌアリコートをセルロースＴＬＣ板にロードした。その５−ＦＵを、溶媒として水／１-ブタノール(14%/86%)混合液を用いることによって５−ＦＣから分離した。３つの細胞形において、その細胞がＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１で感染した場合、５−ＦＣのほぼ２０％が５−ＦＵに転換した。その細胞がＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１で感染した場合、５−ＦＣの９０％以上が５−ＦＵに転換された。
４．ＦＣＵ１／５−ＦＣとＴＫ／ＧＣＶ系の効力の比較。
ＴＫ／ＧＣＶ系との相関においてＦＣＵ１／５−ＦＣ系の有効性を比較する目的に関し、アデノウイルスベクターを、単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子(ＨＳＶ−１ ＴＫ)を発現するために作製した。ＨＩＶ−１ ＴＫ ｃＤＮＡを包含するｐＴＧ４０４３からEcoRI/XbaIフラグメントを単離し、転移ベクターｐＴＧ６２２２を形成するために、EcoRI/XbaI-線状化したベクターｐＴＧ６６００に導入した。ＨＳＶ−１ ＴＫを運ぶ且つｐＴＧ６２２２から分離したPacI/BstEIIフラグメントと、Ｅ１とＥ３領域を欠失し且つＥ１に代えてＨＳＶ−１ ＴＫ遺伝子を含むアデノウイルスベクターｐＴＧ１３０１９を生成するＣｌａＩ-線状化ベクターｐＴＧ６６２４との間の相同組換えは、ＣＭＶプロモーターとハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列の制御下で行った。そのウイルス粒子(Ａｄ．ＣＭＶ−ＴＫ)は、２９３細胞をトランスフェクションすることによって得た。
ヒト細胞ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ−３及びＳＷ４８０、及びネズミ細胞系Ｂ１６(Ｆ０)及びRENCA(腎臓癌、Murphy等J.Natl Cancer Inst.,1973,50(4):1013-25)は、Ａｄ ｎｕｌｌ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１又はＡｄ．ＣＭＶ−ＴＫにより感染した。その細胞は、５−ＦＣ又はＧＣＶの異なる濃度の存在中で培養した。培養１０日後、細胞の生存能をトリパンブルーを用い測定した。治療指数(表７中)は、未感染細胞(又はＡｄ ｎｕｌｌで感染した細胞のＬＤ50)のＬＤ50／Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１又はＡｄ．ＣＭＶ−ＴＫで感染した細胞のＬＤ50の比率と一致する。ＦＣＵ１／５−ＦＣ系の治療指数は、ＦＣＵ１／５−ＦＣ組合せに基づく自殺遺伝子計画がより治療的に有効であることを示すように、ＴＫ／ＧＣＶ系のそれよりも一般的により高かった。
５．インビボ実験
インビボでの腫瘍の増殖を阻害するＦＣＵ１／５−ＦＣとＴＫ／ＧＣＶ系の能力を評価するために、３×１０5Ｂ１６(Ｆ０)細胞を、ｎ＝１０の免疫応答性Ｂ６Ｄ２マウスの６群に皮下的に注射した(＝ＤＯ)。その腫瘍が触知可能(Ｄ＋８)となったらすぐに、「ビヒクル」緩衝液(10mMトリス,pH8、1mM ＭｇＣｌ2)又は、この同じ緩衝液中に懸濁したアデノウイルス(図１の凡例を参照)を、３つの場合について(Ｄ＋８，Ｄ＋９とＤ＋１０)、腫瘍ルートによって５×１０8ＩＵの投薬量で注射した。Ｄ＋８から先に、０．９％生理食塩水の１ｍｌ、又は５−ＦＣの１％溶液の１ｍｌ又はＧＣＶの０．１％溶液の１ｍｌを、Ｄ＋４３まで日に２回、腹腔内に注射した。その結果(図１と図２)は、Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１を注射し且つ５−ＦＣで処理した群において、ＧＣＶで治療したＡｄ．ＣＭＶ−ＴＫ群及びコントロール群と比較して生存率増加を示した。これらの結果は、ＦＣＵ１遺伝子と５−ＦＣプロドラッグの結合の、特に抗腫瘍性治療を実行する場合の価値を確証する。
実施例７ ＦＣＵ１自殺遺伝子とサイトカインをコードする遺伝子の結合。
ＦＣＵ１とサイトカイン(ＩＦＮγとＩＬ−２)の組合せを、Ｂ１６(Ｆ０)細胞が免疫応答性Ｂ６Ｄ２マウスに移植されたネズミ腫瘍モデルにおいてインビボで試験した。サイトカインをコードするアデノウイルスは、ネズミＩＦＮγを発現するＡｄ．ＣＭＶ−ｍｕＩＦＮγ(ＡｄＴＧ１３０４８)、及びヒトＩＬ−２を発現するＡｄ．ＣＭＶ−ＨｕＩＬ−２(ＡｄＴＧ６６２４)とした。
ネズミＩＦＮγを発現するためのベクターｐＴＧ１３０４８は、以下の手法で構築した：ネズミＩＮＦγ(ｍｕＩＦＮγ)のためのｃＤＮＡを包含するｐＴＧ８３９０からSalI/NotIフラグメントを単離し、転移ベクターｐＴＧ１３０４７を形成するために、XhoI/NotI-線状化したベクターｐＴＧ６６００に導入した。ｍｕＩＦＮγを運ぶ且つｐＴＧ１３０４７から分離したPacI/BstEIIフラグメントと、Ｅ１とＥ３領域を欠失し且つＥ１に代えてｍｕＩＦＮγ遺伝子を含むアデノウイルスベクターｐＴＧ１３０４８を生成するＣｌａＩ-線状化ベクターｐＴＧ６６２４との間の相同組換えは、ＣＭＶプロモーターとハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列の制御下で行った。そのウイルス粒子(Ａｄ．ＣＭＶ−ｍｕＩＦＮγ)は、２９３細胞をトランスフェクションすることによって得た。ヒトＩＬ−２を発現する、ｐＴＧ６６２４ベクターは、文献ＦＲ−Ａ−２７６３９５９中に記載される。
３×１０5Ｂ１６(Ｆ０)細胞を、１３の免疫応答性Ｂ６Ｄ２マウスの１０群に皮下的に注射した(＝ＤＯ)。その腫瘍が触知可能(Ｄ＝７)となったらすぐに、「ビヒクル」緩衝液(10mMトリス,pH8、1mM ＭｇＣｌ2)又は、この同じ緩衝液中に懸濁したアデノウイルス(図３と４の凡例を参照)の組合せを、３つの場合について(Ｄ＋７，Ｄ＋８とＤ＋９)、腫瘍ルートによってアデノウイルス当たり２×１０8ＩＵ(トータルで４×１０8ＩＵ)の投薬量で注射した。Ｄ＋７から先に、０．９％生理食塩水の１ｍｌ、又は５−ＦＣの１％溶液の１ｍｌを、日に２回、腹腔内に注射した。その生存率曲線(図３と図４)は、自殺遺伝子と、本発明の組成物に含まれたサイトカインとの間に相乗効果の存在を示した。この相乗効果は、自殺遺伝子をコードするアデノウイルスを用いることそれ自身又はサイトカインを用いることそれ自身を含むアプローチと比較して、ＦＣＵ１／サイトカイン結合の場合におけるより高い生存率によって示される。
配列表
（１）一般情報
(i)出願人：
(A)名称：トランジェーヌ ソシエテ アノニム
(B)ストリート：１１ リュ ドゥ モルシャイム
(c)市：ストラスブール
(E)国：フランス
(F)郵便番号：６７０００
(G)電話： （0）3 88 27 91 00
(H)テレファックス： （0）3 88 27 91 41
(ii)発明の名称：ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する変異体
(iii)配列の数：８
(iv)コンピュータ読取可能形態：
(A)媒体型：テープ
(B)コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ コンパーチブル
(C)操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,Version #1.25(EPO)
（２）配列番号：１の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２１６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：タンパク質
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：デルタ３５変異体ＵＰＲＴアーゼ
(xi)配列の詳細：配列番号：１：
（２）配列番号：２の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３７３アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：タンパク質
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：なし
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：fcy1::fur1デルタ３５融合タンパク質(FCU1)
(xi)配列の詳細：配列番号：２：
（２）配列番号：３の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：あり
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：３：
（２）配列番号：４の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：なし
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：４：
（２）配列番号：５の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：あり
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：５：
（２）配列番号：６の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：あり
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：６：
（２）配列番号：７の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：なし
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：７：
（２）配列番号：８の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：あり
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：８：
遺伝子治療は、宿主細胞又は生体への遺伝的情報の転移であると定義される。ヒトに適用された最初のプロトコルは、アデニンデアミナーゼ(ADA)をコードしている遺伝子が冒された変異のために遺伝的な免疫不全となった患者について、1990年9月に米国で始められた。この最初の実験の相対的な成功は、遺伝的な病気(不完全遺伝子の機能不全を治す目的を持つ)と、後天的疾患(癌、ＡＩＤＳなどのような感染性疾患)の両方を含む、各種の疾患のためのこのアプローチの発展に希望を与えた。この技術は、発現産物が不活性物質(プロドラッグ)の細胞毒性物質への形質転換、それによって細胞死を生起することができる遺伝子を用いる「自殺遺伝子(suicide gene)」治療を含むことから、非常に多数の開発が試みられている。1992年に、幾つかのグループが、腫瘍を治療するための及びＡＩＤＳに応答可能である、ＨＩＶウイルスの播種性を抑制するためのこの新規のアプローチの関連性を実証した。
この関係において、単純ヘルペス１型ウイルスチミジンキナーゼをコードしている遺伝子(ＨＳＢ−１ ＴＫ)が自殺遺伝子の原型を構成する(Caruso等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7024-7028；Culver等,1992,Science 256,1550-1552；Ram等,1997,Nat.Med.3,1354-1361)。そのＴＫポリペプチドがそのような毒性でない一方、アシクロビル又はガンシクロビル(ＧＣＶ)のようなヌクレオシド類似体の形質転換を触媒する。修飾されたヌクレオシドは、延長のプロセスにおいて、結果として細胞分裂を阻害するものとしてＤＮＡ鎖に取り込まれる。多数の自殺遺伝子／プロドラッグのペアが現在利用可能である。特に言及され得るそれらは、ラットシトクロムｐ４５０とシクロホスファミド[sic](Wei等,1994,Human Gene Therapy 5,969-978)、大腸菌(E.Coli)プリンヌクレオシドホスホリラーゼと６−メチルプリンデオキシリボヌクレオシド(Sorscher等,1994,Gene Therapy 1,223-238)、大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼと６−チオキサンチン(MzozとMoolten,1993,Human Gene Therapy 4,589-595)及びシトシンデアミナーゼ(ＣＤアーゼ)と５−フルオロシトシン(５ＦＣ)である。
ＣＤアーゼは、外来のシトシンが加水分解脱アミノ化によってウラシルに転換されることによってピリミジン代謝経路中に含まれる。ＣＤアーゼ活性は原核生物と下等な真核生物で示されている(JundとLacroute,1970,J.Bacteriol.102,607-615；Beck等,1972,J.Bacteriol.110,219-228；De Haan等,1972,Antonie van Leeuwenhoek 38,257-263；Hoeprich等,1974,J.Inf.Dis.130,112-118；EsdersとLynn,1985,J.Biol.Chem.260,3915-3922)一方で、それらは哺乳動物において存在していない(Koechlin等,1966,Biochem Pharmacol.15,435-446；Polak等,1976,Chemotherapy 22,137-153)。サッカロミセス セレビシエ(S.cerevisiae)ＦＣＹ１と大腸菌ｃｏｄＡ遺伝子、これら２つの生体のＣＤアーゼをそれぞれコードする、が知られ、且つその配列は公表されている(EP 402 108;Erbs等,1997,Curr.Genet.31,1-6;WO93/01281)。
ＣＤアーゼはまた、シトシンの類似体、即ち５−フルオロシトシン(５−ＦＣ)を脱アミノ化し、それによって、それが５−フルオロ−ＵＭＰ(５−ＦＵＭＰに変換される場合に高い細胞毒性となる化合物である５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)を形成する。その酵素をコードしている遺伝子を不活性化する変異のため又はそれが哺乳動物細胞のように、この酵素を自然に欠いているためのいずれか一方によって、ＣＤアーゼ活性を欠く細胞は、５−ＦＣに耐性である(JundとLacroute,1970,J.Bacteriol,102,607-615；Kilstrup等,1989,J.Bacteriol.1989 171,2124-2127)。反対に、転移されたＣＤアーゼ活性をコードしている配列を含む哺乳動物細胞は、５−ＦＣに感受性になる(Huber等,1993,Cancer Res.53,4619-4626；Mullen等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,33-37；WO 93/01281)。加えて、隣接した未形質転換細胞もまた、５−ＦＣに感受性になる(Huber等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,8302-8306)。バイスタンダー効果と称される、この現象は、５−ＦＵを分泌するＣＤアーゼ活性を発現し、そして原形質膜を横切って直進する拡散によって隣接する細胞を中毒させる細胞のためである。受動的拡散における５−ＦＵのこの性質は、そのバイスタンダー効果がｔｋを発現している細胞と接触させることを要する、ｔｋ／ＧＣＶ参照系と比較して有効性を表す(Mesnil等,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,1831-1835)。遺伝子治療の、特に抗癌遺伝子治療の状況の中でＣＤアーゼが提供する効果の全ては、従って容易に理解できる。
しかしながら、５−ＦＣへの感受性は、使用した細胞系に基づいて相当に変化する。例えば、低い度合の感受性が、大腸菌ｃｏｄＡ遺伝子を発現するレトロウイルスによって転移されているヒト腫瘍細胞系ＰＡＮＣ−１(膵臓癌)及びＳＫ−ＢＲ−３(胸腺癌)において観測される(Harris等,1994,Gene Therapy 1,170-175)。この望ましくない現象は、細胞毒性５−ＦＵＭＰに変換されないか、又は低いレベルでのみ変換されるいずれか一方のＣＤアーゼの酵素作用によって形成される５−ＦＵによって説明できる。オロチン酸ホスホリボシル[sic]トランスフェラーゼによって哺乳動物細胞において正常に生み出される(Peters等,1991,Cancer 68,1903-1909)この段階は、特別な腫瘍を不在として良く且つそれによってＣＤアーゼベースの遺伝子治療を無効にする。
原核生物及び下等な真核生物において、ウラシルは、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＵＰＲＴアーゼ)によってＵＭＰに転換される。この酵素はまた、５−ＦＵを５−ＦＵＭＰに変換する。かくして、酵母サッカロミセス セレビシエのｆｕｒ１変異体は、ＵＰＲＴアーゼ活性がないことによって、ＣＤアーゼによって５−ＦＣの脱アミノ化から生じる５−ＦＵが細胞毒性５−ＦＵＭＰに変換しないために、高濃度の５−ＦＵ(１０ｍＭ)及び５−ＦＣ(１０ｍＭ)に耐性である(JundとLacroute,1970,J.Bacteriol.102,607-615)。大腸菌とＳ．セレビシエＵＰＲＴアーゼをそれぞれコードするｕｐｐとＦＵＲ１遺伝子は、クローン化され且つ配列決定されている(Andersen等,1992,Eur.J.Biochem.204,51-56;Kern等,1990,Gene 88,149-157)。
これらの欠点を改善するために、従来技術の文献WO-A-96/16183は、ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性を持っている２のドメイン酵素をコードする融合タンパク質を用いることを推奨し、且つ発現プラスミドによって運ばれた、ハイブリッドｃｏｄＡ：：ｕｐｐ又はＦＣＹ１：：ＦＵＲ１遺伝子の転移が５−ＦＣにトランスフェクションされたＢ１６細胞の感受性を増すことをインビトロで示す。
本発明は、そのＮ末端部分で欠失されたＵＰＲＴアーゼをコードする変異したＦＵＲ１遺伝子を用いる従来技術の改良である。本発明は、開始ＡＴＧコドンの後に、ＦＵＲ１遺伝子が天然タンパク質の位置３６でメチオニンをコードしている第２のＡＴＧコドンを含むという観測から生じる。
ＦＵＲ１遺伝子は、そのコード化部分の５’末端で１０５ヌクレオチドを欠いて現に構成され、それによって最初の３５Ｎ末端残基が欠失されており、且つ天然タンパク質中の位置３６中でメチオニンで始まるＵＰＲＴアーゼを合成することを可能にする。ＦＵＲ１Δ１０５と定義した変異体遺伝子の発現生成物は、Ｓ．セレビシエｆｕｒ１変異体を補うことができることが示されており、それによって機能的であることを示している。驚くべきことに、その切り詰めた変異体は、一致する遺伝子を発現するプラスミドによってトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞で実行されている酵素アッセイにより試験される通り、天然酵素のそれよりもより大きいものであるＵＰＲＴアーゼ活性を呈する(野生型遺伝子と比較してのＦＵＲ１Δ１０５遺伝子)。それらが５−ＦＵ耐性であるために選択された３つのヒト腫瘍細胞系は、アデノウイルスベクターによって運ばれた変異体遺伝子によって形質導入され、インビトロで５−ＦＵに対する増加した感受性を呈する。５−ＦＣに対する感受性もまた、もしその細胞がＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５をそれぞれ発現するアデノウイルスと共感染されるなら、ＦＣＹ１を唯一発現するアデノウイルスによる感染と比較して、増加する。さらに驚くべきことには、ハイブリッドＦＣＹ１：：ＦＵＲ１Δ１０５遺伝子によって生産され、ＦＣＹ１と切り詰めたＦＵＲ１遺伝子のフレーム内融合で生じた融合タンパク質は、そのＵＰＲＴアーゼ活性を保持するが、しかし天然ＦＣＹ１生産物を用いて測定したそれと比較して１０から３０のファクターによって増加するＣＤアーゼ活性を示す。二官能タンパク質の高いＣＤアーゼ活性は、実質上バイスタンダー効果を生じる５−ＦＵのプールを形成することを可能にする。ＷＯ-Ａ-９６／１６１８３のＣＤアーゼ：：ＵＰＲＴアーゼ融合タンパク質のＣＤアーゼ活性が改善されることを示さない点が注目される。
本発明は、より有効な変異体を提供し、それによって５−ＦＣに対する細胞の感受性を増加すること及び自殺遺伝子を用いる遺伝子治療の見通しを改善することを可能にする。この変異体は、非常に多くの適用、特に抗癌及び抗ウイルス適用、及び細胞死を要する全ての適用のために使用できる。
この理由のために、本発明は、少なくともＵＰＲＴアーゼの１又はそれ以上の残基の変異によって天然ＵＰＲＴアーゼから得られたことを特徴とするウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＵＰＲＴアーゼ)を持つポリペプチドに関する。
本発明の意味する範囲内で、ＵＰＲＴアーゼ活性を持つポリペプチドは、ウラシルを、又はその誘導体の一つを、モノホスファート類似体に、特に５−ＦＵを５−ＦＵＭＰに変換することができるポリペプチドに関する。「変異」は、上記ポリペプチド中の何れかのサイトで１又はそれ以上の残基の付加、欠失及び／又は置換をなすことと解される。
本発明に従うポリペプチドが得られる天然ＵＰＲＴアーゼは、いずれの起源とすることもでき、特に原核生物、真菌又は酵母起源とすることができる。説明のために、大腸菌からの(Anderson等,1992,Eur.J.Biochem 204,51-56)、ラクトコッカス ラクチスからの(MartinussenとHammer,1994,J.Bacteriol.176,6457-6463)、マイコバクテリウム ボビスからの(Kim等,1997,Biochem Mol.Biol.Int 41,1117-1124)及びバチルス ズブチルスからの(Martinussen等,1995,J.Bacteriol.177,271-274)からのＵＰＲＴアーゼが本発明の状況の中で使用することができる。しかしながら、特に好適なものは、酵母ＵＰＲＴアーゼ、特にKern等(1990,Gene 88,149-157)において配列が開示されるＳ．セレビシエＦＵＲ１遺伝子によってコードされたそれを用いることにより与えられる。情報のために、その遺伝子の情報、及び一致するＵＰＲＴアーゼのそれは、文献において及び特殊化されたデータベース(SWISSPROT,EMBL,Genbank,Medline,etc.)において見出すことができる。
一つの特有の有利な実施態様に従い、本発明に従うポリペプチドは、天然ＵＰＲＴアーゼの欠失変異体である。その欠失は、元のＵＰＲＴアーゼのＮ末端領域中に好ましくは設けられる。その欠失は、全体的(上記Ｎ末端領域の全ての残基に影響する)又は部分的(最初の構造に連なり得る又は得ない１又はそれ以上の残基に影響する)とすることができる。一般的な手法において、ポリペプチドは、Ｎ末端部、中央部及びＣ末端部からなり、それぞれの部分が分子のほぼ３分の１を表している。例えば、２５１アミノ酸を含むＳ．セレビシエＵＰＲＴアーゼのケースにおいて、そのＮ末端部分は最初の８３残基からなり、天然型の最初の位置に設けられる、開始メチオニンと称したそれによって始まる。大腸菌ＵＰＲＴアーゼのケースにおいて、Ｎ末端部分は位置１から６９をカバーする。
この好適な実施態様は、該分子の何れかのサイトで１又はそれ以上の付加変異と勿論結合できる。好ましくは、その付加の修飾は、本発明に従うポリペプチドのＵＰＲＴアーゼ酵素特性に顕著な影響を及ぼさない。該変異体の生物学的活性が、特に以下の実施例中に記載される技術を用いて試験できる点が注目される。
非常に好ましくは、本発明に従うポリペプチドは、上記天然ＵＰＲＴアーゼの第２ＡＴＧコドンのＮ末端領域上流の全部又は一部を少なくとも欠失することによって、天然ＵＰＲＴアーゼから得られる。前述の領域の全体的欠失が好ましい。例えば、ＦＵＲ１遺伝子によってコードされたＵＰＲＴアーゼは、位置＋３６中の第２に続き位置＋１で最初のＡＴＧコドン(開始ＡＴＧコドン)を含む。かくして、それは本発明の状況の中で残基＋１から３５の欠失を考察することが可能であり、それによって天然型の位置＋３６において通常見出されるメチオニンで始まるポリペプチドを与える。
本発明に従う好適なポリペプチドは、位置１のＭｅｔ残基で始まり、位置２１６のＶａｌ残基で終わる、配列番号：１で実質上表されるアミノ酸配列を含む。用語「実質上」は、７０％より高い、有利には８０％より高い、好ましくは９０％より高い、特に好ましくは９５％より高い配列番号：１との同一性の度合に関する。更により好ましくは、該ポリペプチドは配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む。上述した通り、それは付加の変異体を含むことができる。アラニン残基による位置２(天然ＵＰＲＴアーゼにおいて位置３７)でのセリン残基の置換が特に言及され得る。
有利には、本発明に従うポリペプチドは、上記天然ＵＰＲＴアーゼによって示されるそれよりも容易に判断可能なより高いＵＰＲＴアーゼ活性を示す。後述する実施例で提供される結果は、５−ＦＵから５−ＦＵＭＰへの変換がより急速に及び／より効率的であることが明瞭に示され、トランスフェクションした又は形質導入した細胞に関する細胞毒性のより高い度合でそれ自身を証明している。有利には、本発明に従うポリペプチドのＵＰＲＴアーゼ活性は、２から１００までの、好ましくは５から７５まで、及び非常に好ましくは１０から５０までのファクターによって天然ＵＰＲＴアーゼによって示されたそれよりもより大きい。
別の実施態様に従い、本発明に従うポリペプチドは、少なくとも第２のポリペプチドとフレーム内で融合される融合ポリペプチドである。該融合が第１のポリペプチド中の何れかのサイトで実行されるとしても、そのＮ又はＣ末端、特にＮ末端が好適とされる。有利には、該フレーム内融合は、本発明に従う融合タンパク質がＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性を呈するように、シトシンデアミナーゼ(ＣＤアーゼ)活性を示し且つ天然シトシンデアミナーゼから得られる第２のポリペプチドを用いる。ＦＣＹ１：：ＦＵＲ１融合(以下、ＦＣＵ１と定義した)が好適である。そのような二官能性ポリペプチドは、５−ＦＣと５−ＦＵに対する標的細胞の感受性を改善することを可能にする。「シトシンデアミナーゼ活性」は、シトシン又はその類似体の一つの脱アミノ化をカバーするとして解される。好ましくは、本発明に従う該第２のポリペプチドは、５−ＦＣを５−ＦＵに代謝することができる。
原核生物の又は下等な真核生物起源のＣＤアーゼが、本発明の状況の中で使用される。更により好ましくは、ＣＤアーゼは、酵母ＣＤアーゼ、特にサッカロミセス セレビシエＦＣＹ１遺伝子によってコードされたそれである。異なる起源のＣＤアーゼをコードする遺伝子のクローン化と配列は、文献中及び特殊化されたデータベースで利用可能である。情報のため、ＦＣＹ１遺伝子の配列は、Erbs等(1997,Curr.Genet.31,1-6)中に開示される。天然酵素のそれに匹敵する又は優る変換能力を持つＣＤアーゼ変異体を使用することも勿論可能である。当業者であれば、公表されたデータの基礎の上にＣＤアーゼをクローン化すること、何れかの変異を実行すること、当該分野の技術に従って無細胞又は細胞系において変異型の酵素活性を試験すること、又は後述で与えられるプロトコルに続いて、及びフレーム内ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性を有するポリペプチドを融合することができる。
好ましい実施例は、位置１のＭｅｔ残基で始まり、位置３７３のＶａｌ残基で終わる配列番号：２で実質上表されるアミノ酸配列を含む。用語「実質上」は、前記の通り定義される。配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明を実行するために特に適切である。
有利な実施態様に従い、本発明の二官能ポリペプチドは、上記天然のＣＤアーゼのそれよりも容易に検知可能なより高いＣＤアーゼ活性を示す。かくして、二つの酵素を結合することを次に示す実施例は、５−ＦＣに対する標的細胞の感受性を増加することができる。感受性が増加されることによってそのファクターは、有利には少なくとも２、好ましくは少なくとも５、及び、特に好ましくは１０又はそれ以上である。
一般的な手法において、本発明に従うポリペプチドは、化学合成の通常の方法によって又は組換えＤＮＡ技術(例えばManiatis等,1989,Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYを参照)のいずれか一方で生産することができる。この理由のため、本発明はまた、形質転換細胞を生成するために細胞内に導入される上記ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の製造方法をも含み、上記形質転換細胞は、上記ポリペプチドを製造することができる適切な条件下で培養され、且つ上記ポリペプチドは細胞培養物から収穫される。その生産細胞は、制限されることなしに、考慮の下にそのヌクレオチド配列がそのゲノム内に統合され又は複製することができる適切な発現ベクター内に統合されるいずれか一方とされる程度に、細菌、酵母又は哺乳動物細胞の何れかの起源のものとすることができる。自然には、該ヌクレオチド配列は、生産細胞中でそれが発現できるように転写及び翻訳シグナルの制御の下に設けられる。発現ベクターと制御シグナルは、当業者に周知である。該ポリペプチドは、培地又は細胞(それが溶解された後で)から回収することができ、通常の精製工程(クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、免疫精製などによって)にかけられる。
本発明はまた、本発明に従うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にも関する。該ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムの配列とすること又は混合したタイプとすることができる。適切な場合、それは宿主細胞における発現を増加するため、天然、異種(例えばウサギβ-グロブリン遺伝子など)、又は合成起源とされるこれらと共に一又はそれ以上のイントロンを含むことができる。既に記載されている通り、上記配列は、天然酵素から誘導されるポリペプチド、或いは匹敵する又は優る活性を示す変異体をコードすることができる。本発明の状況の中で使用される配列は、分子生物学の通常の技術によって、例えば特異的なプローブによるライブラリーのスクリーニングによって、発現ライブラリーの免疫スクリーニングによって又は適当なプライマーを用いたＰＣＲによって、又は化学合成によって得ることができる。該変異体は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、制限酵素と結紮酵素による消化の技術を用いて一又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加によって、又はその他の化学合成によって天然配列から生産することができる。該変異体の能力と機能に対する構成は、酵素活性を測定することによって又は５−ＦＣ及び／又は５−ＦＵに対する標的細胞の感受性を測定することによって証明することができる。
本発明はまた、宿主細胞においてその発現のために要求される要素(elements)の制御下に設けられる本発明に従うヌクレオチド配列を運ぶ組換えベクターにも関する。該組換えベクターは、プラスミド又はウイルス起源とすることができ、適切な場合、該ベクターの転移有効性及び／又は安定性を改善する一又はそれ以上の物質と組み合わせることができる。これらの物質は、当業者に利用可能である文献中に広範に記載される(例えば、Felgner等,1987,Proc.West.Pharmacol.Soc.32,115-121;HodgsonとSolaiman,1996,Nature Biotechnology 14,339-342;Remy等,1994,Bioconjugate Chemistry,5,647-654)。非制限的な説明のため、その物質は、ポリマー、脂質、特にカチオン性脂質、リポソーム、核タンパク質又は中性脂質とすることができる。これらの物質は、単独で又は組み合わせて使用することができる。考察され得る組合せは、カチオン性脂質(ＤＯＧＳ、ＤＣ−ＣＨＯＬ、スペリミン-コール、スペリミジン-コールなど)又は中性脂質(ＤＯＰＥ)と結合した組換えプラスミドベクターのそれである。
本発明の状況の中で使用することができるプラスミドの選択は、非常に多数である。それはクローン化ベクター及び／又は発現ベクターとすることができる。一般的な手法において、それらは当業者に知られており、その幾つかは商業的に利用可能であると同時に、それはまた遺伝子操作の技術を用いてそれを構築する又はそれを修飾することも可能である。言及され得る実例は、ｐＢＲ３２２(Gibco BRL)、ｐＵＣ(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogene)又はｐ Poly(Lathe等,1987,Gene 57,193-201)である。好ましくは、本発明の状況において使用されるプラスミドは、複製が生産細胞及び／又は宿主中で開始されることが保証される複製の起源を含む(例えば、そのＣｏ１Ｅ１起源は、大腸菌中で生産されることが意図されるプラスミド用に選択されるであろうし、且つｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１系は哺乳動物宿主細胞において該プラスミドが自己複製化されるであろうことが望まれるならば選択されるであろう、LuptonとLevine,1985,Mol.Cell.Biol.5,2533-2542;Yates等,Nature 313,812-815)。該プラスミドは、トランスフェクションした細胞を選択又は同定することができる選択遺伝子を更に含むことができる(栄養要求性変異の相補性、抗生物質に対する耐性をコードしている遺伝子など)。勿論、該プラスミドは、与えられた細胞においてその維持性及び／又はその安定性を改善する補足の要素を含むことができる(モノマー形態でプラスミドの維持を促進するｃｅｒ配列(SummersとSherrat,1984,Cell 36,1097-1103,細胞ゲノムへの統合のための配列)。
ウイルスベクターに関して、ポックスウイルスから(ワクシニアウイルス、特にＭＶＡ、カナリーポックスウイルスなど)、アデノウイルスから、レトロウイルスから、ヘルペスウイルスから、アルファウイルスから、フォーミー(foamy)ウイルスから、又はアデノウイルス関連ウイルスから得られるベクターを意図することができる。好ましくは、複製されない及び統合されないベクターを用いることで与えられるであろう。この関係において、アデノウイルスベクターが、本発明の実施のために特に好適である。
レトロウイルスは感染する特性を有し、多くのケースにおいて分割細胞に統合化を生じ、且つこれに関連して癌への関連における使用のために特に適切である。本発明に従う組換えレトロウイルスは一般に、後述したそれらのようなレトロウイルスＬＴＲの又は内部プロモーターの制御の下に設けられる、ＬＴＲ配列、被包領域及び本発明に従うヌクレオチド配列を含む。該組換えレトロウイルスは、何れかの起源(ネズミ、霊長類、ネコ科動物、ヒトなど)のレトロウイルスから、特にＭｏＭｕＬＶ(Moloneyネズミ白血病ウイルス)、ＭＶＳ(ネズミ肉腫ウイルス)又はFriendネズミレトロウイルス(Ｆｂ２９)から得ることができる。それは、ウイルス粒子を構成するために要求されるウイルスポリペプチドｇａｇ，ｐｏｌ及び／又はｅｎｖの途中で供給できる被包細胞系において増殖される。そのような細胞系は、文献中に記載される(PA317,Psi CRIP GP+Am-12など)。本発明に従うレトロウイルスベクターは、特にＬＴＲｓ(真核生物プロモーターの持つプロモーター領域の置換)又は被包領域(異種被包領域、例えばＶＬ３０タイプによる置換)における置換を含む(フランス出願94 08300と97 05203を参照)。
好ましくは、複製のために必須であり且つ宿主生物又は環境の中で増殖しているベクターを避けるためＥ１，Ｅ２，Ｅ４，及びＬ１−Ｌ５領域から選択される少なくとも１の領域の全て又は一部を欠くアデノウイルスベクターを用いることで与えられるであろう。Ｅ１領域の欠失が好適である。しかしながら、それは、特に不完全な必須の機能が補足細胞系及び／又はヘルパーウイルスによって途中で補われる程度にＥ２，Ｅ４及び／又はＬ１−Ｌ５領域の全部又は一部に影響を及ぼす他の修飾／欠失と組み合わせることができる。これに関して、それは当該技術の状態の二次生成ベクターを使用することが可能である(例えば、国際出願WO-A-94/28152とWO-A-97/04119を参照)。説明のために、Ｅ１領域とＥ４転写ユニットの主要な部分の欠失は、特に有利である。クローン化能力の増加の目的のため、アデノウイルスベクターは、必須でないＥ３領域の全部又は一部を更に欠くことができる。別な改変に従い、５’と３’ＩＴＲｓ(変換した末端繰り返し)と称す被包のために必須とされる、及び被包領域の配列を保持する最小アデノウイルスを使用することができる。該ウイルスのアデノウイルスベクター、及びその製造のための技術は知られる(例えば、GrahamとPrevect,1991,in Methods in Molecular Biology,Vol 7,p 109-128;Ed:E.J.Murey,The Human Press Inc)。
さらに、本発明に従うアデノウイルスベクターの起源は、種の観点から及び血清型の観点からの両方で変更できる。該ベクターは、ヒト又は動物(イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、類人猿など)起源のアデノウイルスのゲノムから又は少なくとも２の異なる起源のアデノウイルスゲノムフラグメントを含むハイブリッドから得ることができる。特に挙げられるものは、イヌ起源のＣＡＶ−１又はＣＡＶ−２アデノウイルス、トリ起源のＤＡＶアデノウイルス又はウシ起源のＢａｄタイプ３アデノウイルスである(Zakharchuk等,Arch.Virol.,1993,128:171-176;SpibeyとCavanagh,J.Gen.Virol.1989,70:165-172;Jouvenne等,Gene,1987,60:21-28;Mittal等,J.Gen.Virol.,1995,76:93-102)。しかしながら、好ましくは血清型Ｃアデノウイルス、特にタイプ２又は５血清型Ｃアデノウイルスから好適に得られるヒト起源のアデノウイルスベクターに対し与えられるであろう。
本発明に従うアデノウイルスベクターは、結紮又は同種組換え(例えば、国際出願WO-A-96/17070を参照)によって又は相補細胞系での組換えによって大腸菌(E.coli)においてインビトロで生産できる。
発現のため要求される要素は、ヌクレオチド配列からポリペプチドへの翻訳を可能にする全ての要素からなる。これらの要素は、特に、調節可能な又は構成され得るプロモーターを含む。勿論、該プロモーターは、選択したベクターと宿主細胞に好適である。言及され得る実例は、ＰＧＫ(ホスホグリセレートキナーゼ)の真核性プロモーター、ＭＴ(メタロチオネイン；McIvor等,1987,Mol.Cell Biol.7,838-848)、α−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、界面活性剤、免疫グロブリン、β−アクチン(Tabin等,1982,Mol.Cell Biol.2,426-436)及びＳＲα(Takebe等,1988,Mol.Cell Biol.8,466-472)遺伝子、ＳＶ４０ウイルス(シミアンウイルス)の早期プロモーター、ＲＳＶのＬＴＲ(ラウス肉腫ウイルス)、ＨＳＶ−１ ＴＫプロモーター、ＣＭＶウイルス(サイトメガロウイルス)の早期プロモーター、ｐ７．５ｋ ｐＨ５Ｒ、ｐＫ１Ｌ、ワクシニアウイルスのｐ２８とｐ１１プロモーター、及びＥ１ＡとＭＬＰアデノウイルスプロモーターである。プロモーターはまた、腫瘍又は癌細胞中で発現を刺激するプロモーターとすることができる。特に挙げられるものは、乳癌と前立腺癌で過剰発現されるＭＵＣ−１遺伝子の(Chenら,1995,J.Clin.Invest.96,2775-2782)、結腸癌で過剰発現される(Schrewe等,1990,Mol.Cell.Biol.10,2738-2748)ＣＥＡ(癌胚芽抗原を表す)遺伝子の、黒色腫で過剰発現されるチロシナーゼ遺伝子の(Vile等,1993,Cancer Res.53,3860-3864)、乳癌と膵臓癌で過剰発現するＥＲＢＢ−２遺伝子の(Harris等,1994,Gene Therapy 1,170-175)及び肝臓癌で過剰発現されるα−フェトプロテイン遺伝子(Kanai等,1997,Cancer Res.57,461-465)のプロモーターから作られ得る。サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)早期プロモーターが特に好ましい。
必要な要素は、本発明に従うヌクレオチド配列の発現を又は宿主細胞中でのそれの維持を改善する付加の要素を更に含むことができる。イントロン配列、分泌シグナル配列、核限局化配列、ＩＲＥＳタイプの翻訳の再開用内部サイト、転写終止ポリＡ配列、トリパーチットリーダー(tripertite leaders)及び複製の起点が特に挙げられ得る。これらの要素は当業者に周知である。
本発明に従う組換えベクターはまた、同じ調節要素(ポリシストロンのカセット)の又は独立要素の制御の下にこれら遺伝子を配置することができることによって、興味ある１又はそれ以上の付加の遺伝子をも含むことができる。特に挙げることができる遺伝子は、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０とＩＬ−１２、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、特にＧＭ−ＣＳＦ、及び新脈管形成で作用する因子(例えばＰＡＩ−１、プラスミノーゲン活性化インヒビターを表す)をコードしている遺伝子である。一つの特有の実施態様において、本発明に従う組換えベクターは、ＩＬ−２をコードする又はインターフェロンγ(INFγ)をコードする興味ある遺伝子を含む。それはまた、ＨＳＶ−１ ＴＫ遺伝子、リシン遺伝子、コレラ毒遺伝子などのような他の自殺遺伝子と、本発明に従うヌクレオチド配列との組み合わせを意図することも可能である。
本発明はまた、本発明に従う組換えベクターを含むウイルス粒子にも関する。そのようなウイルス粒子は、当該技術分野で普通であるいずれかの技術を用いてウイルスベクターから作製できる。該ウイルス粒子は、該ベクターの欠失に適した補体化細胞中で増殖される。アデノウイルスベクターに関して、使用は例えば、ヒト胎児腎臓細胞を用いて確立された及びＡ５４９−Ｅ１細胞系の(Imler等,1996,Gene Therapy 3,75-84)又は二重相補性を容認する細胞系の(Yeh等,1996,J.Virol.70,559-565;KrougliakとGraham,1995,Human Gene Therapy 6,1575-1586;Wang等,1995 Gene Therapy 2,775-783;国際出願WO 97/04119)の、Ｅ１機能(Graham等,1977,J.Gen.Virol.36,59-72)を効果的に補う、２９３細胞系をもたらすであろう。それはまた、欠点のある機能を少なくとも部分的に補うためのヘルパーウイルスの利用を可能にする。補体化細胞は、組換えベクターを含むウイルス粒子を生成するためのウイルスカプシド中にウイルスゲノムを被包するために要求される早期の及び／又は後の因子を介して供給できる細胞であると解される。上記細胞は、それ自身のベクターの欠点のある機能の全てを補足することができないであろうし、このケースにおいて、付加の機能を供給するベクター／ヘルパーウイルスとトランスフェクション／形質導入できる。
本発明はまた、
（ｉ） 本発明に従う組換えベクターが、トランスフェクションした補体細胞を得るために途中で上記ベクターを補うことができる補体細胞内に導入され、
（ｉｉ）上記トランスフェクションした補体細胞が、ウイルス粒子が生産できるのに適切とされる条件下で培養され、及び
（ｉｉｉ）上記ウイルス粒子が細胞培養物から回収される、ウイルス粒子の製造方法に関する。
該ウイルス粒子が細胞上清から勿論回収できると同時に、該細胞からもまた回収できる。普通に用いられる方法は、細胞溶解上清中のビリオンを採集するために、連続した凍結／解凍サイクルによる該細胞の溶解を含む。該ビリオンは、当該分野の技術を用いて増幅し且つ精製することができる(クロマトグラフィー法、超遠心分離法、特に塩化セシウム密度勾配を通して、など)。
本発明はまた、本発明に従うヌクレオチド配列又は組換えベクターを含む、又は本発明に従うウイルス粒子で感染した、宿主細胞にも関する。本発明の目的のために、宿主細胞は、上述したような、組換えベクターによりトランスフェクトすることができる、又はウイルス粒子によって感染することができる何れかの細胞からなる。哺乳動物細胞、特にヒト細胞が特に好適である。該細胞はゲノムに統合された又はされない(エピソーム)形態で上記ベクターを含むことができる。該細胞は、何れかの生物の最初の又は腫瘍細胞、特に造血細胞(全能幹細胞、白血球、リンパ球、単球又はマクロファージなど)、筋細胞(サテライト細胞、ミオサイト、筋芽細胞、平滑筋細胞、など)、心臓細胞、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞又は線維芽細胞とすることができる。
本発明はまた、薬学上許容される賦形剤と組合せて、本発明に従うポリペプチド、ヌクレオチド配列、組換えベクター、ウイルス粒子又は宿主細胞を含む組成物にも関する。
本発明はまた、ＵＰＲＴアーゼ活性を示す本発明に従うポリペプチドと、興味ある別なポリペプチド、特にＣＤアーゼ活性を示す従来技術のポリペプチドを含む組成物にも関する。
本発明はさらに、本発明に従うポリペプチドと、興味のある先に記載した遺伝子の一つによりコードされる興味あるポリペプチドを含む組成物に関する。興味あるこれらポリペプチドで特に言及され得るものは、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、特にＧＭ−ＣＳＦ、及び新脈管形成について作用する因子(例えばＰＡＩ−１、プラスミノーゲン活性化インヒビターを表している)である。ＩＬ−２又はＩＮＦγが、特に挙げられる。
該組成物はまた、宿主細胞の中で上記ポリペプチドを発現することを可能にするヌクレオチド配列にも基づくことができる。該ヌクレオチド配列は、一つの又は同じ発現ベクターによって二つの独立のベクターによって運ばれ得る。上記組成物は、上記ヌクレオチド配列を発現しているウイルスベクターから作製されるウイルス粒子を勿論含むことができる。
この理由のために、本発明はまた、ＵＲＰＴアーゼ活性を示すポリペプチドをコードする本発明に従うヌクレオチド配列と、特にＣＤアーゼ活性を示すポリペプチドをコードする、興味ある第２のヌクレオチド配列を含む組成物にも関する。
本発明はさらに、本発明に従うヌクレオチド配列と、ＩＬ−２とＩＮＦγから選択されるポリペプチドをコードする興味ある第２のヌクレオチド配列を含む組成物にも関する。
本発明に従う組成物は、遺伝子治療によって疾患の予防的な又は治癒的な治療をとりわけ意図し、且つ増殖性疾患(癌、腫瘍、再狭窄など)を、及び感染の起源の、特にウイルス(Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ヘルペス、レトロウイルスなど)起源の疾患を、特にねらったものである。
本発明に従う組成物は、それを局所的に、非経口的に又は消化ルートによって投与することに鑑みて、通常は作製できる。特に、治療薬又は予防薬の治療的有効量が薬学的に許容される賦形剤と結合される。非常に多くの投与のルートを意図することが可能になる。実例は、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腫瘍内、鼻内、肺内及び気管内ルートが挙げられる。これら３つの後の実施態様のケースにおいて、それはエアゾルによって又は吸入によって行う投与のために有効とされる。その投与は、単一投薬量として、又は特定の時間の間隔後に１又はそれ以上の機会で繰り返される投薬として実施できる。投与の適当なルートと投薬量は、各種のパラメーター、例えば個体、治療すべき疾患又は転移するべき興味ある遺伝子に基づき変更する。本発明に従うウイルス粒子に基づく調製物は、１０4と１０14ｐｆｕ(プラーク形成単位)、有利には１０5と１０13ｐｆｕ、好ましくは１０6と１０12ｐｆｕの間の投薬量の形で調剤できる。本発明に従う組換えベクターが関係する限り、ＤＮＡの０．０１から１００ｍｇまで、好ましくは０．０５から１０ｍｇまで、特に好ましくは０．５から５ｍｇまでを含む投薬量を意図することが可能である。ポリペプチドに基づいた組成物は、上記ポリペプチドの０．０５から１０ｇまで、特に好ましくは０．０５から５ｇまでを含む。勿論、その投薬量は臨床医によって調整され得る。
該製剤はまた、薬学的な見地から許容される、希釈剤、アジュバント又は賦形剤を、同じく可溶化、安定化及び保存剤をも含むことができる。注射可能なケースにおいて、好適には水性、非水性又は等張性溶液が与えられる。それは、液体又は、適当な希釈剤を用いる使用の時点で再構成することができる乾燥(粉末、凍結乾燥物など)の形態で、単一投薬又は複数投薬として提供することができる。該製剤はまた、プロドラッグの適切な量を含む。
本発明はまた、遺伝子治療によって又は組換えルートによって生産されているタンパク質を投与することによってヒト又は動物体を治療するために意図される医薬を製造するために、本発明に従うポリペプチドの、組換えベクターの、ウイルス粒子の、又は宿主細胞の治療的又は予防的な使用にも関する。最初の可能性に従い、その医薬はインビボで直接投与できる(例えば、接触可能な腫瘍に静脈内注射によって、エアゾルによって肺に、適当なカテーテルを用いて血管系内に、など)。それはまた、患者から細胞(骨髄幹細胞、末梢血液リンパ球、筋肉細胞など)を取り出すことを含むエクスビボアプローチ、従来技術に従いインビトロでそれのトランスフェクション又は感染及び次いで患者にそれを再投与すること、に適合することも可能となる。好ましい使用は、望ましくない細胞増殖を生じる結果となる癌、腫瘍及び疾患を治療すること又は予防することを含む。言及され得る想像できる適用は、胸部の、子宮の(特にパピローマウイルスによって誘発されたそれら)、前立腺の、肺の、膀胱の、肝臓の、結腸の、膵臓の、胃の、食道の、咽頭の、中枢神経系の及び血液(リンパ腫、白血病など)の癌である。それはまた、心臓血管の病気の状況において、例えば血管壁の平滑筋細胞の増殖(再閉塞)を阻止する又は遅延するためにも使用できる。最後に、感染疾患のケースにおいて、ＡＩＤＳに適用させる医薬を意図することも可能である。
本発明はまた、本発明に従うヌクレオチド配列、組換えベクター、ウイルス粒子又は宿主細胞を、その治療を必要とする宿主生物又は細胞に投与することを特徴とする遺伝子治療によって病気を治療するための方法にも及ぶ。
該治療方法が、ＵＰＲＴアーゼ活性を与える、本発明に従うポリペプチドの発現を可能にするヌクレオチド配列、組換えベクター又はウイルス粒子の使用を行う場合、上記組換えベクター又はウイルス粒子によって又は別個のベクター又はウイルス粒子によって運ばれる第２のヌクレオチド配列によって、ＣＤアーゼ活性を示す第２のポリペプチドをコードする第２のポリペプチド配列を付加して投与することを有効にすることができる。後者のケースにおいて、ＵＰＲＴアーゼとＣＤアーゼ配列は、重要ではない投与の順序によって、同時に又は連続的に投与できる。
有利な実施態様に従い、その治療的使用又は治療方法はまた、プロドラッグのの薬学上許容される量を投与する工程をも含み、有利にはシトシンの類似体、特に５−ＦＣが宿主生物又は細胞に投与される。説明のために、それは、５０から５００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で、好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で使用することが可能である。本発明の状況の範囲内で、該プロドラッグは、本発明に従う治療薬の投与の前に、随伴して、さもなければ続けて実行する投与により、標準慣行に従って投与される。経口ルートが好ましい。それは、プロドラッグの単一投薬又は、宿主生物又は細胞内で毒性の代謝産物の生産を可能にするために十分に長い時間繰り返し投薬を投与することが可能である。
さらに、本発明に従う組成物又は方法は、５−ＦＵの細胞毒性作用を有力にする１又はそれ以上の物質と結合できる。ピリミジンのデノボ生合成のための経路の酵素を阻害する医薬の製造に特に言及され得る(例えば後述するそれら)、５−ＦＵ(5-FdUMP)の代謝の生産物の存在において、ロイコボリン(Waxman等,1982,Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18,685-692)のような医薬は、ＰＲＰＰ(ホスホリボシルピロホスファート)のプールを増加することによって、複製のために要求されるｄＴＭＰのプールの減少に帰結する、チミジル酸シンターゼの阻害を増加し、且つメトトレキサート(Cadman等,1979,Science 250,1135-1137)のような最終的な薬剤は、ジヒドロ葉酸還元酵素を阻害する及び細胞のＲＮＡへの５−ＦＵの取込みの増加をもたらす。
本発明はまた、哺乳動物細胞中のポジティブ選択標識として、本発明に従う配列又は組換えベクターを用いることにも向けられる。有利には、該細胞はトランスフェクションされ、そして該細胞混合物は、ＰＡＬＡ(Ｎ-(ホスホノアセチル)-Ｌ-アスパルタート)のようなピリミジンのデノボ生合成のための経路のインヒビターの存在中において培養される；Moore等,1982,Biochem.Pharmacol.31,3317-3321),A77 1726(レフルノミドの活性代謝物；Davis等,1996,Biochem.35,1270-1273)及びBrequinar(Chen等,1992,Cancer Res.52,3251-3257)。そのようなインヒビターの存在は、ＲＮＡとＤＮＡを合成するために要求されるＵＭＰのデノボ合成をブロックし、それによって細胞死に帰結する。この細胞毒性作用は、ウラシルの存在においてＵＰＲＴアーゼ活性をコードしている本発明に従うヌクレオチド配列を発現することによって又はシトシンの存在においてＣＤアーゼ活性をコードしているこの後者の配列を共発現することによって(融合した形態が適する場合)、避けることができる。結果として、トランスフェクションした細胞のみが(ＵＰＲＴアーゼ／ＣＤアーゼ配列を組み込んである細胞)、ピリミジン合成経路のインヒビターの存在中で増殖できるだろう。かくして、本発明に従う使用は、細胞混合物中でトランスフェクションした細胞を効果的に同定すること及び／又はそれから単離することを可能にする。
本発明はまた、基礎とされるトランスジェニック動物の作製方法が遮断されること(ノックアウトした)における、胚の幹細胞の遺伝子における実験中のネガティブ選択標識として本発明に従う配列又は組換えベクターの使用にも関する(例えば、Capecchi,1989,Science 244,1288-1292;Reid等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4299-4303を参照)。そのような使用、例えばネオマイシンに耐性な遺伝子との結合で、相同組換え事象を受けている及びゲネチシン及び一致するフッ素化ピリミジン(もし本発明に従うヌクレオチド配列がＵＰＲＴアーゼ活性をコードすることに用いられるなら５−ＦＵ、ＣＤアーゼ活性をコードしているヌクレオチド配列も又用いられる場合、５−ＦＣ)の存在においてのみ増殖できるであろう細胞を選択する可能性をつくることができる。非標的化組換え事象を受けていない細胞は、ゲネチシンの存在中で増殖するが、しかしフッ素化ピリミジンの存在中ではできない。ネガティブ選択標識として別の潜在的な使用は、ちょうど哺乳動物細胞のように、植物が何れかの内因性ＣＤアーゼ活性を所有していないことから、植物において見出される。それは、外因的にＣＤアーゼの発現を可能にする本発明に従うヌクレオチド配列をトランスフェクションすることによって５−ＦＣに感受性にできる(例えば、Perera等,1993,Plant.Mol.Biol.23,797-799)。
実施例
本発明は、全てが制限するものではなく、以下の実施例によって説明され、ここで：
− 図１はＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を移植しているＢ６Ｄ２マウスの生存率を表す。マウスの異なる群(群当たり１０匹のマウス)は、次の組成物で処理した：
●ビヒクル／生理食塩水；＋ビヒクル／５−ＦＣ；★Ａｄ ｎｕｌｌ／生理食塩水；−Ａｄ ｎｕｌｌ／５−ＦＣ；×ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；◆ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ
− 図２はＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を移植しているＢ６Ｄ２マウスの生存率を表す。マウスの異なる群(群当たり１０匹のマウス)は、次の組成物で処理した：
●ビヒクル／生理食塩水；＋ビヒクル／ＧＣＶ；★Ａｄ ｎｕｌｌ／生理食塩水；−Ａｄ ｎｕｌｌ／ＧＣＶ；×ＡｄＴＫ／生理食塩水；◆ＡｄＴＫ／ＧＣＶ
図３はＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を移植しているＢ６Ｄ２マウスの生存率を示す。マウスの異なる群(群当たり１３マウス)は、次の組成物で処理した：
●ビヒクル／生理食塩水；＋ビヒクル／５−ＦＣ；★Ａｄ ｎｕｌｌ／生理食塩水；−Ａｄ ｎｕｌｌ／５−ＦＣ；×Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；◆Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ；▼Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄｍｕＩＦＮｇ／生理食塩水；△Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄｍｕＩＦＮｇ／５−ＦＣ；ｏ ＡｄｍｕＩＦＮｇ＋ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；Ｏ ＡｄｍｕＩＦＮｇ＋ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ
− 図４はＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を移植しているＢ６Ｄ２マウスの生存率を示す。マウスの異なる群(群当たり１３マウス)は、次の組成物で処理した：
●ビヒクル／生理食塩水；＋ビヒクル／５−ＦＣ；★Ａｄ ｎｕｌｌ／生理食塩水；−Ａｄ ｎｕｌｌ／５−ＦＣ；×Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；◆Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ；▼Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄｈｕＩＬ−２／生理食塩水；△Ａｄｎｕｌｌ＋ＡｄｈｕＩＬ−２／５−ＦＣ；ｏ ＡｄｈｕＩＬ−２＋ＡｄＦＣＵ１／生理食塩水；Ｏ ＡｄｈｕＩＬ−２＋ＡｄＦＣＵ１／５−ＦＣ
後述した構築は、Maniatis等(1989,Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中に記載されたような遺伝的エンジニアリングと分子クローン化の一般的技法を用いて又は市販キットを用いた場合製造者の推奨に従い調製した。相同組換え工程は、好ましくは大腸菌ＢＪ５１８３株(Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166,557-580)において実施される。制限サイトの再生に関して、利用したその技術は、５’突出末端において満たすための大腸菌ポリメラーゼＩのラージフラグメント(クレノーフラグメント)を用いることを含む。加えて、後述した異なる構築において利用したアデノウイルスゲノムフラグメントは、レファレンスＭ７３２６０の下にGenebankデータベース中に開示された通りのＡｄ５ゲノムのヌクレオチド配列中のそれの位置に従って正確に示される。
細胞生物学に関して、その細胞はトランスフェクションされ又は形質導入され、当業者に良く知られた標準の技術に従い培養される。酵母の株に関して、使用したものは、特に、GuthrieとFink(1991,Methods in Enzymology,Vol.194,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Academic Press Inc)中に記載される通常の技術で作られる。
実施例１： 端切りＦＵＲ１Δ１０５遺伝子の構築
野生型ＦＵＲ１遺伝子を運ぶＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、プラスミドｐＨＸ(Kern等,1990,Gene 88,149-157)から単離し、プラスミドｐＲＳ３０６ＦＵＲ１を形成するために、これらの同じ酵素で消化されている統合化酵母プラスミドｐＲＳ３０６(SikorskiとHieter,1989,Genetics 122,19-27)中に挿入した。この後者のプラスミドにより開始する、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩによって処理されている、酵母セントロメトリックプラスミドｐＲＳ３１４(SikorskiとHieter,1989,Genetics 122,19-27)内に、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で、ＦＵＲ１遺伝子を再クローン化した。これは、大腸菌ＣＪ２３６株(dut,ung,thi,relA,pCJ105(CmR))中で作製したウラシル含有一本鎖から、ファージミドｐＲＳ３１４ＦＵＲ１を生じた；部位特異的変異誘発は、Kunkel法(Muta-Gene phagemid kit,In vitro Mutagenesis Version 2;Biorad)を用いてこの鎖上で実行した。その変異誘発のねらいは、ＦＵＲ１遺伝子の、開始ＡＴＧの５’と停止コドンの３′それぞれにＥｃｏＲＩとＭｌｕＩ制限サイトを導入することと、Aspに変わっている第２ Asnコドンを伴う、Kozak則に従って開始ＡＴＧの状況を変更することである。配列番号：３と配列番号：４中に記載したオリゴヌクレオチドが、これをなすために用いられた。それにより生じたプラスミド、即ちｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１は、野生型ＵＰＲＴアーゼ活性用のコントロールとして用いた。
同じく、ＦＵＲ１コード化配列の最初の１０５ｎｔは、配列番号：５と配列番号：４中に記載したオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドｐＲＳ３１４ＦＵＲ１を変異誘発することによって欠失した。得られたプラスミド、即ちｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１０６は、Serコドンの次にAla、及び停止コドンのＭｌｕＩサイト３′への変更と一緒に、この位置でKozakコンセンサス、いわゆるＡＴＧコドン(天然タンパク質のMet+36に相当する)のＥｃｏＲＩサイト５’にそれの完全に同等な変更を含む。ｐＲＳ３１４ＦＵＲＩ＋１０６からのＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩフラグメントは、最初の３５ Ｎ末端残基が欠失されているタンパク質を発現するＦＵＲ１遺伝子を運ぶプラスミドｐＲＳ３１４ＦＵＲ１Δ１０５を形成するため、ＥｃｏＲ１とＳａｃＩで切断されている、プラスミドｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１に再クローン化した。
実施例２： Ｓ．セレビシエのｆｕｒ１変異体の相補性
上記構築物から得られたＦＵＲ１発現生産物の機能的能力を、ｐＲＳ３１４型の異なるプラスミドによって形質転換されているＳ．セレビシエのｆｕｒ１−８ｔｒｐ１−４変異体(JundとLacroute,1970,J.Bacteriol.102,607-615)の相補性によって評価した。その形質転換体は、通常の手法(最少ＹＮＢ培地)中又は5mM ５−ＦＵの存在中のいずれかで培養し、３０℃及び３７℃でのそれの増殖能力を評価した。その結果は表１中に表され、ここで、＋は、５−ＦＵに対する感受性を、且つそれ故にＵＰＲＴアーゼ活性を試験している、増殖の欠如を表す。
実施例３： 哺乳動物細胞中のＦＵＲ１とＦＵＲ１Δ１０５の発現。
ＦＵＲ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を運ぶ、ｐＲＳ３１４ＦＵＲ１＋１とｐＲＳ３１４ＦＵＲ１Δ１０５のＥｃｏＲＩ／ＭｌｕＩフラグメントは、プラスミドｐＣＩ-ｎｅｏＦＵＲ１＋１とｐＣＩ-ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５のそれぞれを形成するために、真核生物発現プラスミドｐＣＩ-ｎｅｏ(Promega)に導入した。ＣＯＳ７細胞(ATCC CRL-1651)は、これらのプラスミドによって一時的にトランスフェクションされ、ＵＰＲＴアーゼ酵素活性は細胞抽出物中で測定した。
より正確には、５×１０5ＣＯＳ７細胞を、１０％胎児ウシ血清(ＦＣＳ)を補充したＤＭＥＭ培地の５ｍｌを含む６０ｍｍ培養皿中、３７℃で植種した。次の日、その細胞を、プラスミドの５μｇの存在又は不在中、リポフェクチン(Gibco BRL)の２０μｌで処理し、ＤＭＥＭ培地の２ｍｌ中で培養を継続した。３７℃で１６時間のインキュベーション後、その細胞をほぼ４８時間、ＤＭＥＭ-１０％ＦＣＳの５ｍｌ中に移し替えた。次いでその細胞を洗浄し、４℃で３０分間、溶解緩衝液(50mMトリス塩酸，ｐＨ７．５／150mM ＮａＣｌ／5mM ＥＤＴＡ／1mM ＤＴＴ／1%triton X-100)の３０μｌ中に再懸濁した。その細胞溶解物を採集し、遠心分離し、そのＵＰＲＴアーゼ酵素活性を得られた上清について測定した。これをなすために、溶解物の４μｌを、ＵＰＲＴアーゼ反応緩衝液(100mMトリス塩酸ｐＨ７．５／10mM ＭｇＣｌ2／10mM ５−ＰＲＰＰ(５-ホスホリボシルピロホスファート)／0.02μCi/μl(NEN)を有する3mM[C14]ウラシル)の２μｌの存在中で１０分間、３７℃でインキュベーションした。その酵素反応は、１分間１００℃で加熱することによって停止した。１μｌアリコートを、ポリエチレンイミン-セルロースＴＬＣプレート(Merck)上にロードした。そのウラシルは、移動溶媒として水を用いることによってＵＭＰから分離した。移動の後、そのＴＬＣ板を、PhosphorImager(445 SI;Molecular Dynamics)によりスキャンした。そのタンパク質濃度は、ブラッドフォード法(protein Assay;Biorad)で測定した。ＵＰＲＴアーゼ活性は、３つの個別の形質転換体を基礎として測定し、その結果を表２に示した。
実施例４： 端切りＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を翻訳するためのアデノウイルスの構築とヒト腫瘍細胞感染。
１． ＦＵＲ１Δ１０５発現用のｐＴＧ６２８９の構築
端切りした遺伝子を包含する、ｐＣＩ-ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５からＥｃｏＲＩ／ＭｌｕＩフラグメントを分離し、翻訳ベクターｐＴＧ６２８８を形成するために、同じ酵素で切断されている、ベクターｐＴＧ６６００の中に導入した。情報のために、ｐＴＧ６６００は、p polyIIベクター(Lathe等,1987,Gene 57,193-201)であり、Ａｄ５ １から４５８配列、早期ＣＭＶプロモーター、ハイブリッドスプライシング配列はプラスミドｐＣＩ(Promega社、ヒトβ-グロブリン遺伝子のイントロン１のスプライシングドナーサイトとマウス免疫グロブリン遺伝子のスプライシングアクセプターサイトを含む)中に見出され、ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化配列とＡｄ５ 3328-5788配列が挿入されている。その構築物の達成化は、当業者の能力の範囲内である、特に文献FR-A-2 763 959に基づく。そのアデノウイルスベクターｐＴＧ６２８９は、ｐＴＧ６２８８からのPacI/BstEIIフラグメントと、ＣｌａＩ-直線化したベクターｐＴＧ６６２４の間で大腸菌ＢＪ５１８３株中、組換えによって再構築した。情報のために、ｐＴＧ６６２４は、Ｅ１(nt 459から3327)とＥ３(nt 28592から30470)領域は、Ｅ１の代わりに挿入される発現カセットと一緒に欠失されているものから、Ａｄ５ゲノムを搬送しているプラスミドp poly IIに一致する。
最後のｐＴＧ６２８９構築物は、Ｅ１(nt 459から3328)とＥ３(nt 28249から30758)領域のバルクが欠失されているものからのＡｄ５ゲノム、及びＥ１の代わりに、早期ＣＭＶプロモーターの制御下に配されるＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を発現するカセット及びハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列を含む。該アデノウイルス粒子は、Ｅ１機能を補う、例えば従来技術(Graham and Prevec,1991,Methods in Molecular Biology Vol.7,Gene Transfer and Expression Protocols;Ed.E.J.Murray,The Human Press Inc,Clinton,NJ)に従う２９３細胞系(ATCC CRL1573)のような細胞系をトランスフェクションすることによって作製される。
２．ＦＣＹ１遺伝子を発現するためのベクターの構築。
ウラシル含有一本鎖は、部位特異的変異誘発によって(Muta-gene Phagemid kit,In vitro Mutagenesis version2;Biorad)鎖が変更される発現ファージミドｐＲＳ３１５ＦＣＹ１(Erbs等,1997,Curr.Genet.31,1-6)から単離した。配列番号：６と番号：７のオリゴヌクレオチドを用いるその変異誘発は、開始ＡＴＧのＨｉｎｄＩＩＩサイト５’及びＦＣＹ１遺伝子の停止コドンのＥｃｏＲ１サイト３’を導入すること及びKozak則に従って翻訳状況を変更することを可能にする。この手法において変更されているHindIII/EcoR1フラグメントは、ｐＲＳ３０６ＦＣＹ１を形成するために、同じ酵素によって消化されているプラスミドｐＲＳ３０６(SikorskiとHieter,1989,Genetics 122,19-27)に挿入した。ｐＲＳ３０６ＦＣＹ１からのXhoI/XbaIフラグメントは、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断されているベクターｐＣＩ−ｎｅｏ(Promega)にサブクローンした。これはその開始ＡＴＧのレベルでKozakコンセンサス配列を有するＦＣＹ１遺伝子を含むｐｃＩ-ｎｅｏＦＣＹ１に帰結する。
酵素ＣＤアーゼをコードしているＳ．セレビシエＦＣＹ１遺伝子を発現するためのアデノウイルスベクターを作製した。ＦＣＹ１遺伝子を囲む、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＹ１からのXhoI/XbaIフラグメントは、ｐＴＧ６２８６を形成するためにXhoI-XbaI-消化したベクターｐＴＧ６６００中に導入した。先の通り、ＦＣＹ１を搬送する且つｐＴＧ６２８６から分離したPacI/BstEIIフラグメントと、Ｅ１とＥ３領域を欠失し且つＥ１に代えてＦＣＹ１遺伝子を含む、アデノウイルスベクターｐＴＧ６２８７を作製するClaI-直線化したベクターｐＴＧ６６２４との間の相同組換えは、ＣＭＶプロモーターとハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列の制御下に設けた。該ウイルス粒子(ＡｄＴＧ６２８７)は、２９３細胞のトランスフェクションにより得られた。
３．酵素活性の測定
アデノウイルスの構築物は３つのヒト腫瘍細胞系：ＰＡＮＣ−１(膵臓肉腫／ATCC CRL-1469)、ＳＫ−ＢＲ−３(胸腺癌／ATCC HTB-30)及びＳＷ４８０(結腸腺癌／ATCC CCL-228)について試験した。これらの細胞は、それが５−ＦＵに対し抵抗性であり、それによってＦＵＲ１Δ１０５遺伝子の効力を測定することが可能であるために選択した。
より正確には、ＰＢＳ−２％ＦＣＳの１００μｌ中に懸濁した５×１０6細胞を、２０のＭＯＩ(感染多重度)で試験するべきアデノウイルス(Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１とＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１、又はその２つの混合物)の存在中、３０分間３７℃でインキュベーションした。ネガティブコントロールとして、模擬感染を実施した又は感染が興味ある遺伝子を欠く最初に作製したアデノウイルス(Ａｄ ｎｕｌｌ)により実行された、のいずれか一方で行った。感染した細胞は、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳの５００μｌに入れ、皿当たり１×１０6細胞の率で３５ｍｍ培養皿中に配した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、基質として５−ＦＣ又は５−ＦＵを用い、酵素活性の相違を、細胞溶解物について測定した。ＵＰＲＴアーゼ活性は、先に記載されたプロトコルに従い、ＵＰＲＴアーゼ反応緩衝液([Ｃ14]５−ＦＵ，Sigma)の２μｌの存在中、３７℃で２０分間インキュベーションされる、細胞溶解物の４μｌについて測定した。ＣＤアーゼ活性の場合、ＣＤアーゼ反応緩衝液(100mMトリス塩酸,pH7.5／0.25μCi/μlを有する3mM[H3]5-FC)の２μｌと一緒に２０分間３７℃でインキュベーションされる、細胞溶解物の４μｌを使用し行った。５−ＦＣの５−ＦＵＭＰ(ＣＤアーゼ／ＵＰＲＴアーゼ活性)への変換は、ＣＤアーゼ／ＵＰＲＴアーゼ反応緩衝液(100mMトリス塩酸,pH7.5／10mM ＭｇＣｌ2／10mM ５−ＰＲＰＰ／0.25μCi/μlを有する3mM[H3]5-FC)の２μｌの存在中、２０分間３７℃でインキュベーションされる、細胞溶解物の４μｌについて測定した。１μｌアリコートをＰＥＩセルロースＴＬＣ板上にロードした。その５−ＦＵは溶媒として水を用いることによって５−ＦＵＭＰから分離し、その５−ＦＵＭＰは溶媒として水／１−ブタノール(14%/86%)混合液を用いることによって５−ＦＵから分離した。
３つの細胞型において、ＣＤアーゼ活性はＦＣＹ１遺伝子を発現するアデノウイルスで感染した細胞(Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１)から、及び２つのウイルス、即ちＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１とＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５で共感染した細胞から得られた抽出物において観測された。その酵素アッセイは、ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ３とＳＷ４８０細胞において約８０から１００転換した５−ＦＣのｐモル／分／タンパク質のｍｇまでの変化に富んだ活性を示した。５−ＦＵの転換に関する限り(ＵＰＲＴアーゼ活性)、ほぼ数百の転換した５−ＦＣのｐモル／分／タンパク質のｍｇの内因活性を観測した。その活性は、その感染をそれ自身についてＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５によって実行した場合又はその細胞を共感染した場合に７から８のファクターによって増幅される。最後に、５−ＦＣの５−ＦＵＭＰへの変換は、Ａｄ−ＣＭＶ−ＦＣＹ１によって感染されている(内因性ＵＰＲＴアーゼ活性のために)、及び該細胞が共感染される場合、抽出物で検出された。
加えて、５−ＦＣと５−ＦＵのＬＤ50(５０％致死量)値(μＭ)を、上記ウイルスで感染した(Mock感染、Ａｄ ｎｕｌｌ感染、Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１感染及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５感染)又はＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を発現するアデノウイルスで共感染した、３つのヒト腫瘍細胞系に関して測定した。その細胞は、２０のＭＯＩで感染し次いで各種濃度の薬剤(５−ＦＣ又は５−ＦＵ)の存在又は不在中で培養した。トリパンブルーを、Ｄ＋６でのトリプシン化後に加えた。生存細胞はトリパンブルーを取り込まず、一方死滅細胞は染色される。死亡率％を顕微鏡下に評価した。以下に報告した値は、４回の計測後に得た平均値である。
５−ＦＣに関しての感染細胞系のＬＤ50は、２つのＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子が共発現された場合、５と１０μＭの間であり(細胞系に基づいて)、一方ＦＣＹ１遺伝子がそれ自身で発現される場合１００から５００μＭであり、且つネガティブコントロールのケースにおいて(Mock感染とＡｄ ｎｕｌｌ感染)及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５の場合において、５０００から１００００μＭまでであった。同様に、５−ＦＵに関するＬＤ50は、そのその感染がＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を発現するウイルスを用いた場合、ネガティブコントロール及びそれ自身についてＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１を用いた感染における、に対してかなり低かった。これらの結果は、５−ＦＣプロドラッグの、細胞毒性５−ＦＵＭＰへの転換を改善するための「自殺」遺伝子アプローチにおけるＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子の相乗効果を用いることの重要性を示す。
実施例５： ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼを運ぶ融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子の構築
１．遺伝子融合の構築
ｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５からのEcoR1/NotIフラグメントは、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＹ１＋ＦＵＲ１Δ１０５を与えるために、EcoR1/NotI切断プラスミドｐＣＩ−ｎｏｅＦＣＹ１中に挿入した。開始点としてこのウラシル含有一本差プラスミドを用い、ＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５を、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１６１５(配列番号：８)を用いた部位特異的変異誘発の手段によって融合した。その変更は、ＦＣＹ１の停止コドンとＦＵＲ１の開始Ｍｅｔコドンを欠失すること、それによっていずれかのスペーサーなしに相中でＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５配列を融合することを可能にすることを含む(この融合体は以下にＦＣＵ１と定義した)。
２．二官能性ＦＣＵ１タンパク質の酵素的な特徴。
予め記載された技術は：
− トランスフェクションしない
− ｐＣＩ−ｎｅｏ(空のプラスミド)の１０μｇをトランスフェクショシした
− ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＹ１の５μｇ＋ｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５の５μｇをトランスフェクションした
− ｐＣＩ−ｎｅｏの５μｇ＋ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１の５μｇをトランスフェクションした
ＣＯＳ７細胞からの細胞溶解物中、ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性(３７℃で１０分間反応)を測定するために使用した。
得られた値を以下の表３中に３回の酵素測定の平均を記した。
ＦＣＵ１によりコードした融合タンパク質のＵＰＲＴアーゼ活性は、ＣＤアーゼ活性に相関して制限される；３０００ウラシルｐモル／分／タンパク質のｍｇのオーダーのウラシルのプールの形成が、ＣＤアーゼ-ＵＰＲＴアーゼ反応の間にインビトロで検出された。このウラシルのプールは、該反応がＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５タンパク質の使用を行う場合、同じ条件下で存続しない。
３．Ｂ１６(Ｆ０)細胞系におけるプラスミドｐＣＩ−ｎｅｏにクローン化されているＦＣＹ１、ＦＵＲ１Δ１０５及びＦＣＵ１遺伝子の発現。
ＦＣＵ１遺伝子融合の効率は、Ｂ１６(Ｆ０)マウスメラノーマ細胞系(ATCC CRL-6322)のトランスフェクションによって評価した。これをなすために、２．５×１０5Ｂ１６(Ｆ０)細胞を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地の５ｍｌを含む６．０ｍｍの皿中、３７℃で植種した。インキュベーションの４８時間後、その細胞を、プラスミドの５μｇの存在中、リポフェクチン(Gibco BRL)の２０μｌで処理し、次いで培養をＤＭＥＭ培地２ｍｌ中、３７℃で１６時間継続した。その４８時間後、細胞をＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳの５ｍｌ中に配し、次いで１０ｃｍペトリ皿中で、１ｍｇのＧ４１８／ｍｌを含むＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地中で希釈した。Ｇ４１８に耐性のクローンは、２０日後に生存可能である。それぞれの構築物で得られたクローンを採集し、Ｔ１５０フラスコ中に移し、選択培地中で培養した。ＣＤアーゼ、ＵＰＲＴアーゼ及びＣＤアーゼ−ＵＰＲＴアーゼ活性は、基質として５−ＦＣ又は５−ＦＵの存在中、３７℃で測定した。示した値は、３回の酵素測定後に得られた平均値である(表４参照)。
５−ＦＣと５−ＦＵに対する異なるクローンの感受性もまた、６日間薬剤の存在中でインキュベートした後に試験した。以下の値は、細胞死亡率の４回の計測(トリパンブルーを用いた)の平均である。５−ＦＣのＬＤ50は、ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＹ１を用いた場合の１００μＭ及びネガティブコントロール(未トランスフェクション細胞とｐＣＩ−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞)を用いた場合及びｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５を用いた場合の１０００μＭと比較して、(ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１)遺伝子融合を運ぶプラスミドでトランスフェクションした細胞のケースにおいて１０μＭである。５−ＦＵのＬＤ50は、他の全てのケースにおける０．０５μＭに対して、ｐＣＩ−ｎｅｏＦＵＲ１Δ１０５又はｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１を用いてトランスフェクションを実施した場合、０．０３μＭである。
これらの結果は、ＦＣＵ１遺伝子の発現が、ＦＣＹ１遺伝子の発現でなされたよりもより強力に５−ＦＣに対して細胞を感作する。５−ＦＣに対する感作のこの相違は、より高いＣＤアーゼ活性を有する融合タンパク質のためであり且つＵＰＲＴアーゼ活性の存在のためではない；Ｓ．セレビシエ遺伝子によってコードされるこのＵＰＲＴアーゼ活性は、５−ＦＵに対して生来非常に感受性であり且つかなりの内因性ＵＰＲＴアーゼ活性を示すＢ１６(Ｆ０)細胞の５−ＦＵの毒性において少しの効果を有する。
４．ＦＣＵ１遺伝子によってトランスフェクションされたＢ１６(Ｆ０)細胞がバイスタンダー効果を示すことの実証。
ＦＣＵ１トランスフェクションしたＢ１６(Ｆ０)細胞のＣＤアーゼ-ＵＰＲＴアーゼ活性のインビトロアッセイにおける５−ＦＵのプールの出現は、バイスタンダー効果を高める有効性、priori、がある：この細胞内プールの非常に大きなサイズ、その大きさは、培地中の５−ＦＵの受動的拡散であろうし且つその大きさは非トランスフェクション細胞の死亡率となるであろう。
このバイスタンダー効果を実証するために、非トランスフェクションＢ１６(Ｆ０)クローンを、ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１によってトランスフェクションされたＢ１６(Ｆ０)クローンと、異なる割合で混合した。これらのクローン混合物は、次いで５−ＦＣの異なる濃度の存在中で試験した。細胞死亡率(トリパンブルーを用いた)は、５−ＦＣの存在中で４日間の培養後に評価した。その結果を以下の表５中に示した。
このバイスタンダー効果が、ｔｋ／ガンシクロビル系に対して、細胞間の何れかの接触が要求されないことを実証する目的に関し、培地への５−ＦＵの拡散のために、(トランスフェクションしない)Ｂ１６細胞を、５−ＦＣの異なる濃度の存在中４８時間インキュベーションされているＢ１６(ネガティブコントロール)又はＢ１６ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１クローンからの培養上清から得られた培地(新たな培地中で４対１に希釈した)中で４日間インキュベーションし、Ｂ１６細胞の死亡率をトリパンブルーを用いて評価した。その結果は、ＬＤ50についての強烈な効果を実証し且つ５−ＦＵが、高いＣＤアーゼ活性を有するＦＣＵ１遺伝子によりコードされたタンパク質融合の結果としてその培地中に存在することを示した。
実施例６ ＦＣＵ１遺伝子を転移するための及び腫瘍細胞に感染するためのアデノウイルスの構築。
１． ＦＣＵ１を発現するためのｐＴＧ１３０６０の構築。
ＦＣＵ１遺伝子融合を包含する、ｐＣＩ−ｎｅｏＦＣＵ１からのXhoI/MluIフラグメントを単離し、転移ベクターｐＴＧ１３０５９を形成するためにXhoI/MluI−線状化ベクターｐＴＧ６６００に導入した。ＦＣＵ１を運ぶ且つｐＴＧ１３０５９から分離したPacI/BstEIIフラグメントと、Ｅ１とＥ３領域を欠失し且つＥ１に代えてＦＣＵ１遺伝子を含むアデノウイルスベクターｐＴＧ１３０６０を生成するＣｌａＩ−線状化ベクターｐＴＧ６６２４との間の相同組換えは、ＣＭＶプロモーターとハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列の制御下で行った。そのウイルス粒子(Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１)は、２９３細胞をトランスフェクションすることによって得た。
２． 腫瘍細胞においてアデノウイルスベクター中にクローン化されるＦＣＵ１遺伝子の発現。
新たなアデノウイルス構築物は、３つのヒト腫瘍細胞系：ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ−３及びＳＷ４８０について試験した。上述した技術は、２０のＭＯＩで感染したヒト細胞から得られた細胞溶解物において、ＣＤアーゼとＵＰＲＴアーゼ活性(基質として５−ＦＣ又は５−ＦＵを用い)を測定するために使用した。ＵＰＲＴアーゼ活性(７００から８００の変換５−ＦＵｐモル／分／タンパク質ｍｇ)が、ＦＵＲ１Δ１０５遺伝子によって発現したＵＰＲＴアーゼ活性に同等であるＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１によって感染した３つの細胞系で観測された。その３つの細胞形において、ＣＤアーゼ活性は、Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１によって感染した場合の細胞の活性との比較として、該遺伝子が融合形(ＦＣＵ１)で発現される場合、１００のファクターで(１００００から１２０００転換５−ＦＣｐモル／分／タンパク質ｍｇ)増加した。
アデノウイルスベクターから発現した場合、その融合タンパク質は、実施例５と同様に、ＣＤアーゼ活性に相関して制限される、及びＣＤアーゼ−ＵＰＲＴアーゼ反応の間に１００００転換５−ＦＣｐモル／分／タンパク質ｍｇのオーダーの５−ＦＵの相当なプールの形成に至る、ＵＰＲＴアーゼ活性を示す。この５−ＦＵの蓄積は、バイスタンダー効果を高める。
５−ＦＣと５−ＦＵのＬＤ50値は、異なるウイルス(Ａｄ ｎｕｌｌ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１)又はＦＣＹ１とＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を発現するアデノウイルスによって共感染した、３つのヒト腫瘍細胞系と比較して測定した。その細胞は、５のＭＯＩで感染し、５−ＦＣと５−ＦＵの異なる濃度の存在中で培養した、培養６日後、細胞の生存能を、トリパンブルーを用いて測定した。以下の表６中に掲載したそのＬＤ50値は４回の計数の平均値である。
３．異なるアデノウイルスによって感染したヒト腫瘍細胞がバイスタンダー効果を示すことの実証。
ヒト腫瘍細胞ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ−３及びＳＷ４８０は、２０のＭＯＩで感染させた(Ａｄ ｎｕｌｌ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１)。３７℃でのインキュベーションの４８時間後、その細胞をＰＢＳで二度濯ぎ、トリプシン処理し、異なる比率で未感染細胞の存在中に植種した。1mM ５−ＦＣの存在中で六日間培養後、細胞死亡率をトリパンブルーを用いて評価した。その結果(４回の測定の平均)は、３つの腫瘍株のケースにおいて、Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１によって感染した細胞１０％と未感染細胞の９０％の混合物は１００％死亡率に至ることを示した。その細胞をＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１で感染した場合、感染細胞の１％は１００％死亡率に至るに十分であった。この実験は、融合タンパク質を発現する細胞中の５−ＦＵのプールの増加をもたらす、かなりのバイスタンダー効果の存在を実証する。
５−ＦＣの存在中、ＦＣＹ１とＦＣＵ１を発現する細胞によって培地への５−ＦＵの分泌を実証する目的に関して、１０6ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ−３及びＳＷ４８０細胞を、２０のＭＯＩで感染した(Ａｄ ｎｕｌｌ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＵＲ１Δ１０５及びＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１)。その細胞は、０．２５μＣｉ／μｌを与える１ｍＭ[3Ｈ]５−ＦＣの存在中で培養した。培養４８時間後、培地の２μｌアリコートをセルロースＴＬＣ板にロードした。その５−ＦＵを、溶媒として水／１-ブタノール(14%/86%)混合液を用いることによって５−ＦＣから分離した。３つの細胞形において、その細胞がＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＹ１で感染した場合、５−ＦＣのほぼ２０％が５−ＦＵに転換した。その細胞がＡｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１で感染した場合、５−ＦＣの９０％以上が５−ＦＵに転換された。
４．ＦＣＵ１／５−ＦＣとＴＫ／ＧＣＶ系の効力の比較。
ＴＫ／ＧＣＶ系との相関においてＦＣＵ１／５−ＦＣ系の有効性を比較する目的に関し、アデノウイルスベクターを、単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子(ＨＳＶ−１ ＴＫ)を発現するために作製した。ＨＩＶ−１ ＴＫ ｃＤＮＡを包含するｐＴＧ４０４３からEcoRI/XbaIフラグメントを単離し、転移ベクターｐＴＧ６２２２を形成するために、EcoRI/XbaI-線状化したベクターｐＴＧ６６００に導入した。ＨＳＶ−１ ＴＫを運ぶ且つｐＴＧ６２２２から分離したPacI/BstEIIフラグメントと、Ｅ１とＥ３領域を欠失し且つＥ１に代えてＨＳＶ−１ ＴＫ遺伝子を含むアデノウイルスベクターｐＴＧ１３０１９を生成するＣｌａＩ-線状化ベクターｐＴＧ６６２４との間の相同組換えは、ＣＭＶプロモーターとハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列の制御下で行った。そのウイルス粒子(Ａｄ．ＣＭＶ−ＴＫ)は、２９３細胞をトランスフェクションすることによって得た。
ヒト細胞ＰＡＮＣ−１，ＳＫ−ＢＲ−３及びＳＷ４８０、及びネズミ細胞系Ｂ１６(Ｆ０)及びRENCA(腎臓癌、Murphy等J.Natl Cancer Inst.,1973,50(4):1013-25)は、Ａｄ ｎｕｌｌ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１又はＡｄ．ＣＭＶ−ＴＫにより感染した。その細胞は、５−ＦＣ又はＧＣＶの異なる濃度の存在中で培養した。培養１０日後、細胞の生存能をトリパンブルーを用い測定した。治療指数(表７中)は、未感染細胞(又はＡｄ ｎｕｌｌで感染した細胞のＬＤ50)のＬＤ50／Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１又はＡｄ．ＣＭＶ−ＴＫで感染した細胞のＬＤ50の比率と一致する。ＦＣＵ１／５−ＦＣ系の治療指数は、ＦＣＵ１／５−ＦＣ組合せに基づく自殺遺伝子計画がより治療的に有効であることを示すように、ＴＫ／ＧＣＶ系のそれよりも一般的により高かった。
インビボでの腫瘍の増殖を阻害するＦＣＵ１／５−ＦＣとＴＫ／ＧＣＶ系の能力を評価するために、３×１０5Ｂ１６(Ｆ０)細胞を、ｎ＝１０の免疫応答性Ｂ６Ｄ２マウスの６群に皮下的に注射した(＝ＤＯ)。その腫瘍が触知可能(Ｄ＋８)となったらすぐに、「ビヒクル」緩衝液(10mMトリス,pH8、1mM ＭｇＣｌ2)又は、この同じ緩衝液中に懸濁したアデノウイルス(図１の凡例を参照)を、３つの場合について(Ｄ＋８，Ｄ＋９とＤ＋１０)、腫瘍ルートによって５×１０8ＩＵの投薬量で注射した。Ｄ＋８から先に、０．９％生理食塩水の１ｍｌ、又は５−ＦＣの１％溶液の１ｍｌ又はＧＣＶの０．１％溶液の１ｍｌを、Ｄ＋４３まで日に２回、腹腔内に注射した。その結果(図１と図２)は、Ａｄ．ＣＭＶ−ＦＣＵ１を注射し且つ５−ＦＣで処理した群において、ＧＣＶで治療したＡｄ．ＣＭＶ−ＴＫ群及びコントロール群と比較して生存率増加を示した。これらの結果は、ＦＣＵ１遺伝子と５−ＦＣプロドラッグの結合の、特に抗腫瘍性治療を実行する場合の価値を確証する。
実施例７ ＦＣＵ１自殺遺伝子とサイトカインをコードする遺伝子の結合。
ＦＣＵ１とサイトカイン(ＩＦＮγとＩＬ−２)の組合せを、Ｂ１６(Ｆ０)細胞が免疫応答性Ｂ６Ｄ２マウスに移植されたネズミ腫瘍モデルにおいてインビボで試験した。サイトカインをコードするアデノウイルスは、ネズミＩＦＮγを発現するＡｄ．ＣＭＶ−ｍｕＩＦＮγ(ＡｄＴＧ１３０４８)、及びヒトＩＬ−２を発現するＡｄ．ＣＭＶ−ＨｕＩＬ−２(ＡｄＴＧ６６２４)とした。
ネズミＩＦＮγを発現するためのベクターｐＴＧ１３０４８は、以下の手法で構築した：ネズミＩＮＦγ(ｍｕＩＦＮγ)のためのｃＤＮＡを包含するｐＴＧ８３９０からSalI/NotIフラグメントを単離し、転移ベクターｐＴＧ１３０４７を形成するために、XhoI/NotI-線状化したベクターｐＴＧ６６００に導入した。ｍｕＩＦＮγを運ぶ且つｐＴＧ１３０４７から分離したPacI/BstEIIフラグメントと、Ｅ１とＥ３領域を欠失し且つＥ１に代えてｍｕＩＦＮγ遺伝子を含むアデノウイルスベクターｐＴＧ１３０４８を生成するＣｌａＩ-線状化ベクターｐＴＧ６６２４との間の相同組換えは、ＣＭＶプロモーターとハイブリッドβ-グロブリン／Ｉｇスプライシング配列の制御下で行った。そのウイルス粒子(Ａｄ．ＣＭＶ−ｍｕＩＦＮγ)は、２９３細胞をトランスフェクションすることによって得た。ヒトＩＬ−２を発現する、ｐＴＧ６６２４ベクターは、文献ＦＲ−Ａ−２７６３９５９中に記載される。
３×１０5Ｂ１６(Ｆ０)細胞を、１３の免疫応答性Ｂ６Ｄ２マウスの１０群に皮下的に注射した(＝ＤＯ)。その腫瘍が触知可能(Ｄ＝７)となったらすぐに、「ビヒクル」緩衝液(10mMトリス,pH8、1mM ＭｇＣｌ2)又は、この同じ緩衝液中に懸濁したアデノウイルス(図３と４の凡例を参照)の組合せを、３つの場合について(Ｄ＋７，Ｄ＋８とＤ＋９)、腫瘍ルートによってアデノウイルス当たり２×１０8ＩＵ(トータルで４×１０8ＩＵ)の投薬量で注射した。Ｄ＋７から先に、０．９％生理食塩水の１ｍｌ、又は５−ＦＣの１％溶液の１ｍｌを、日に２回、腹腔内に注射した。その生存率曲線(図３と図４)は、自殺遺伝子と、本発明の組成物に含まれたサイトカインとの間に相乗効果の存在を示した。この相乗効果は、自殺遺伝子をコードするアデノウイルスを用いることそれ自身又はサイトカインを用いることそれ自身を含むアプローチと比較して、ＦＣＵ１／サイトカイン結合の場合におけるより高い生存率によって示される。
配列表
（１）一般情報
(i)出願人：
(A)名称：トランジェーヌ ソシエテ アノニム
(B)ストリート：１１ リュ ドゥ モルシャイム
(c)市：ストラスブール
(E)国：フランス
(F)郵便番号：６７０００
(G)電話： （0）3 88 27 91 00
(H)テレファックス： （0）3 88 27 91 41
(ii)発明の名称：ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する変異体
(iii)配列の数：８
(iv)コンピュータ読取可能形態：
(A)媒体型：テープ
(B)コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ コンパーチブル
(C)操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,Version #1.25(EPO)
（２）配列番号：１の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２１６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：タンパク質
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：デルタ３５変異体ＵＰＲＴアーゼ
(xi)配列の詳細：配列番号：１：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：３７３アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：タンパク質
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：なし
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：fcy1::fur1デルタ３５融合タンパク質(FCU1)
(xi)配列の詳細：配列番号：２：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：あり
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：３：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：１９塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：なし
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：４：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：あり
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：５：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２５塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：あり
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：６：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２１塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：なし
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：７：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：２６塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：線状
(ii)分子型：ＤＮＡ(ゲノム)
(iii)仮定的(HYPOTHETICAL)：なし
(iii)アンチセンス：あり
(vi)起源：
(A)生物：サッカロミセス セレビシエ
(vii)直接の源：
(B)クローン：合成オリゴヌクレオチド
(xi)配列の詳細：配列番号：８：
Claims (37)
- 天然ＵＰＲＴアーゼの第２ＡＴＧコドンの上流部のＮ末端領域を欠失することによって、上記天然ＵＰＲＴアーゼから得られたことを特徴とするウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＵＰＲＴアーゼ)活性を有するポリペプチド。
- 位置１においてＭｅｔ残基で始まり、位置２１６においてＶａｌ残基で終わる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
- 位置２においてセリン残基からアラニン残基への置換をさらに含むことを特徴とする請求項２記載のポリペプチド。
- 上記天然ＵＰＲＴアーゼによって示されるよりもより高いＵＰＲＴアーゼ活性を示すことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載のポリペプチド。
- 上記ポリペプチドがフレーム内で、シトシンデアミナーゼ(ＣＤアーゼ)活性を示し且つ天然シトシンデアミナーゼから得られる少なくとも第２のポリペプチドと融合される、融合ポリペプチドであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載のポリペプチド。
- 第２のポリペプチドとの融合が、上記ポリペプチドのＮ末端で実行されることを特徴とする請求項５記載のポリペプチド。
- 上記天然ＣＤアーゼが酵母ＣＤアーゼであることを特徴とする請求項５または６記載のポリペプチド。
- 上記酵母ＣＤアーゼがサッカロミセス セレビシエＦＣＹ１遺伝子によってコードされたものであることを特徴とする請求項７記載のポリペプチド。
- 位置１においてＭｅｔ残基で始まり位置３７３においてＶａｌ残基で終わる配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項７記載のポリペプチド。
- 上記天然ＣＤアーゼのそれよりもより高いＣＤアーゼ活性を示すことを特徴とする請求項５から９のいずれか１項記載のポリペプチド。
- 請求項１から１０のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 宿主細胞中のその発現に要求される要素の制御の下に配された請求項１１記載のポリヌクレオチドを運ぶ組換えベクター。
- 上記ベクターが、そのベクターのトランスフェクションの有効性及び／又は安定性を改善する１又はそれ以上の物質と適切に結合した、プラスミド及びウイルスベクターからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の組換えベクター。
- 上記ベクターが、ボックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス又はアデノウイルス関連ウイルスから得られるウイルスベクターであることを特徴とする請求項１３記載の組換えベクター。
- 上記ベクターが、複製のために必須であり且つＥ１，Ｅ２，Ｅ４及びＬ１−Ｌ５から選択される少なくとも１の領域の全部又は一部を欠くアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項１３又は１４記載のベクター。
- 上記ベクターが、非必須Ｅ３領域の全部又は一部を更に欠くアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項１５記載のベクター。
- 発現に要求される要素がプロモーターを含むことを特徴とする請求項１２から１６のいずれか１項記載の組換えベクター。
- 上記プロモーターがサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)早期プロモーターであることを特徴とする請求項１７記載の組換えベクター。
- インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０とＩＬ−１２、インターフェロン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)及び新脈管形成で作用する因子をコードしている遺伝子から選択される１又はそれ以上の興味ある遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１２から１８のいずれか１項記載の組換えベクター。
- 興味ある遺伝子が、ＩＬ−２とＩＮＦγから選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１９記載の組換えベクター。
- 上記ベクターが、ワクシニアウイルスから由来するポックスウイルスベクターであることを特徴とする請求項１４記載の組換えベクター。
- 上記ベクターが、ＭＶＡウイルスから由来するポックスウイルスベクターであることを特徴とする請求項１４記載の組換えベクター。
- （ｉ）請求項１２から２２のいずれか１項記載の組換えベクターが、トランスフェクションした細胞が得られるようにトランスで上記ベクターを補うことができる細胞内に導入され、
（ｉｉ）上記トランスフェクションした細胞が、ウイルス粒子が生産できるのに適切とされる条件下で培養され、及び
（ｉｉｉ）上記ウイルス粒子が細胞培養物から回収される、
ウイルス粒子の製造方法。 - 請求項１２から２２のいずれか１項記載の組換えベクターを含む、又は請求項２３記載の方法に従って得られたウイルス粒子。
- 請求項１１記載のポリヌクレオチド又は請求項１２から２２のいずれか１項記載の組換えベクターを含む、又は請求項２４記載のウイルス粒子で感染された、宿主細胞。
- 薬学的に許容される賦形剤と組合せて、請求項１から１０のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項１１記載のポリヌクレオチド、請求項１２から２２のいずれか１項記載の組換えベクター、請求項２４記載のウイルス粒子又は請求項２５記載の宿主細胞を含む組成物。
- 請求項１から４のいずれか１項記載のポリペプチドと、ＣＤアーゼ活性を示す興味ある第２のポリペプチドを含むことを特徴とする請求項２６記載の組成物。
- 請求項１から４のいずれか１項記載のポリペプチドをコードしている請求項１１記載のポリヌクレオチドと、ＣＤアーゼ活性を示すポリペプチドをコードする興味ある第２のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２６記載の組成物。
- 請求項１から１０のいずれか１項記載のポリペプチドと、ＩＬ−２とＩＮＦγから選択される興味ある第２のポリペプチドとを含むことを特徴とする請求項２６記載の組成物。
- 請求項１１記載のポリヌクレオチドと、ＩＬ−２とＩＮＦγから選択されるポリペプチドをコードする興味ある第２のポリヌクレオチドとを含むことを特徴とする請求項２６記載の組成物。
- 遺伝子治療によって又は組換えルートによって生産されているタンパク質を投与することによってヒト又は動物体を治療するために意図された薬剤の製造のための請求項１から１０のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項１１記載のポリヌクレオチド、請求項１２から２２のいずれか１項記載の組換えベクター、請求項２４記載のウイルス粒子又は請求項２５記載の宿主細胞の使用。
- 望ましくない細胞増殖から生じる癌、腫瘍及び疾患を治療することを意図した薬剤の製造のための請求項３１記載の使用。
- − 請求項１１記載のポリヌクレオチドが形質転換細胞を生成するために細胞中に導入され、
− 上記形質転換細胞が、ポリペプチドを生産するために適切とされる条件下で培養され、且つ
− 上記ポリペプチドが細胞培養物から収穫される、
請求項１から１０のいずれか１項記載のポリペプチドの製造方法。 - ５−フルオロシトシン（５−ＦＵ）の細胞毒性作用を有力にする１又はそれ以上の物質を更に含むことを特徴とする請求項２６から３０のいずれか１項記載の組成物。
- ５−フルオロシトシン（５−ＦＵ）の細胞毒性作用を有力にする物質が、ピリミジンのデノボ生合成のための経路の酵素を阻害する薬剤であることを特徴とする請求項３４記載の組成物。
- ５−フルオロシトシン（５−ＦＵ）の細胞毒性作用を有力にする物質が、ロイコボリン及びメトトレキサートから選択されることを特徴とする請求項３４に記載の組成物。
- ５−フルオロシトシン（５−ＦＵ）の細胞毒性作用を有力にする物質が、ＰＡＬＡ、レフルノミドの代謝活性物、及びブレキナール（Brequinar）から選択されることを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
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