JP4355287B2 - ホッコクアカエビ由来の新規なカテプシンｌ様システインプロテアーゼ - Google Patents

Description

【０００１】
[技術分野]
本発明はホッコクアカエビより抽出した新規カテプシンＬ様酵素、その精製方法、ホッコクアカエビより新たに同定された新規プロテアーゼであるカテプシンＬ様システインプロテアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
[背景技術]
プロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合を加水分解する酵素の総称で、微生物、植物および動物に広く分布しており、触媒基や基質特異性の異なるプロテアーゼが数多く単離されている。その応用範囲も多岐にわたっており、例えば、食品の改質剤用、洗剤用、化粧品原料用、ビールの清澄剤用、皮革なめし剤用、医薬用などに利用されている。
【０００３】
プロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合を加水分解する最も重要な酵素群の一つで、微生物、植物および動物に広く分布しており、多種多様な生物学的プロセスに関与する。また、プロテアーゼは、触媒基に基づいて、アスパラギン酸−、システイン−、セリン−、メタロ−プロテアーゼの大きく４つのファミリーに分類されている。これらの酵素の分子的作用機序は広く研究されている。活性中心にＳＨ基を有するＳＨプロテアーゼ（システインプロテアーゼ）には、ブロメライン等の酵素が含まれている。このシステインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーに属するカテプシンは、カテプシンＬサブファミリーとカテプシンＢサブファミリーに分けられる。カテプシンＬサブファミリーは、カテプシンＨ，Ｌ，Ｓ，Ｆ，Ｖ，及びＷが含まれ、２つの重要なモチーフ、散在するモチーフであるＥＲ（Ｆ／Ｗ）ＮＩＮモチーフと、ＧＮＦＤモチーフで、前者のＥＲ（Ｆ／Ｗ）ＮＩＮモチーフは、カテプシンＢファミリー並びにカテプシンＣ，Ｏ、及びＸには存在しない。
【０００４】
カテプシンＬは、哺乳類ではリソゾームに存在し、強力なエンドプロテアーゼ活性があるが、エキソ型活性は示さないという特徴がある。現在までのところ、カテプシンＬ及びカテプシンＬ様システインプロテアーゼは数種類の動物から同定され、配列が決定されている。以下にそれを列挙する。
【０００５】
Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｓｉｌｋｗｏｒｍ）
Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ．，Ｔａｋｉｍｏｔｏ Ｋ．，Ｉｚｕｍｉ Ｓ．，Ｔｏｒｉｙａｍａ−Ｓａｋｕｒａｉ Ｍ．，Ｋａｇｅｙａｍａ Ｔ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．Ｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅｓ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｇｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｌｋｍｏｔｈ，Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６（６）：１３３０−１３３５（１９９４）．
Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ｃｏｗ）
Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ．
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ｆｒｕｉｔ ｆｌｙ）
Ｔｒｙｓｅｌｉｕｓ Ｙ．，Ｈｕｌｔｍａｒｋ Ｄ．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １（ＣＰ１），ａ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ−ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｈａｅｍｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｍｂｎ−２．Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６（２）：１７３−１８１（１９９７）．
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ｈｕｍａｎ）
Ｊｏｓｅｐｈ Ｌ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇ Ｌ．Ｃ．，Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃｈ Ｄ．，Ｓｕｋｈａｔｍｅ Ｖ．Ｐ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｐｒｅｐｒｏｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ．Ａｎａｂｕｎｄａｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１（５）：１６２１−１６２９（１９８８）．
Ｈｏｍａｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｌｏｂｓｔｅｒ）
Ｌａｙｃｏｃｋ Ｍ．Ｖ．，ＭａｃＫａｙ Ｒ．Ｍ．，Ｄｉ Ｆｒｕｓｃｉｏ Ｍ．，Ｇａｌｌａｎｔ Ｊ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃＤＮＡｓ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｇｌａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｌｏｂｓｔｅｒ（Ｈｏｍａｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２９２：１１５−１２０（１９９１）．Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｍｏｕｓｅ）
Ｐｏｒｔｎｏｙ Ｄ．Ａ．，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ Ａ．Ｈ．，Ｋｏｃｈａｎ Ｊ．，Ｒａｖｅｔｃｈ Ｊ．Ｖ．，Ｕｎｋｅｌｅｓｓ Ｊ．Ｃ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｏｕｓｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１４６９７−１４７０３（１９８６）．
Ｎｅｐｈｒｏｐｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｎｏｒｗａｙ ｌｏｂｓｔｅｒ）
Ｌｅ Ｂｏｕｌａｙ Ｃ．，Ｖａｎ Ｗｏｒｍｈｏｕｄｔ Ａ．，Ｓｅｌｌｏｓ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｏｍａｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｒｗａｙ ｌｏｂｓｔｅｒ（Ｎｅｐｈｒｏｐｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：３５３−３５９（１９９５）．
Ｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ（Ｐａｃｉｆｉｃ ｗｈｉｔｅ ｓｈｒｉｍｐ）
Ｌｅ Ｂｏｕｌａｙ Ｃ．，Ｖａｎ Ｗｏｒｍｈｏｕｄｔ Ａ．，Ｓｅｌｌｏｓ Ｄ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｃｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｒｉｍｐ ｐｅｎａｃｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｍｏｌｔｃｙｃｌｅ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ １６６：３１０−３１８（１９９６）．
Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｎｏｒｗａｙ ｒａｔ）
Ｉｓｈｉｄｏｈ Ｋ．，Ｔｏｗａｔａｒｉ Ｔ．，Ｉｍａｊｏｈ Ｓ．，Ｋａｗａｓａｋｉ Ｈ．，Ｋｏｍｉｎａｍｉ Ｅ．，Ｋａｔｕｎｕｍａ Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｒａｔ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２３：６９−７３（１９８７）．
【０００６】
カテプシンＬのコラーゲン分解活性については、ラットのカテプシンＬが酸性条件下、３７℃でコラーゲンを分解するという報告がある。Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｋｉｒｓｃｈｋｅ，Ｈ．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｈ，ａｎｄ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８０，５３５−５６１．（１９８１）
【０００７】
[発明の開示]
上記に示したカテプシンＬは、酸性条件下に至適ｐＨがあり、至適温度が５０〜７０℃である。上記文献の報告の内には、遺伝子のクローニングのみで酵素が特定されず性状が調べられていないものもある。いずれにせよ、中性からアルカリ性条件下、低温領域においても高い活性を保持するカテプシンＬは現在まで知られていない。もし、中性からアルカリ性条件下、低温領域においても高い活性を保持するカテプシンＬを見出すことができれば、蛋白質の変性による特性の悪化を避けて蛋白質材料の性質を改変することが可能となり、食品の改質剤用、洗剤用、化粧品原料用、医薬用などに応用する際に、非常に有用な酵素を提供できることとなる。
【０００８】
本発明者等は、低温領域においてもコラーゲンを分解するようなプロテアーゼを自然界に求め、鋭意スクリーニングを重ねた結果、偶然にも、日本産ホッコクアカエビを用いることで、その肝膵臓中に低温領域においても活性を保持する新規プロテアーゼを見出すことに成功した。本プロテアーゼは、カテプシンＬ様システインプロテアーゼである。
【０００９】
ホッコクアカエビは、北太平洋、北大西洋に分布し、通常、−１．６〜５℃の低温環境下に生息する低温適応種である。低温適応種の酵素はそれらに対応する哺乳類の酵素より、実質的に高い触媒効率を示すことがいくつか報告されている。例えば、プロテアーゼの中でも特によく研究されているセリンプロテアーゼのトリプシンでは、ウシトリプシンと比較してサケトリプシンの触媒効率は４０倍高いことが報告されている。
【００１０】
本発明者等は、スクリーニングに際し、冷凍されていない生のホッコクアカエビから肝膵臓を取り出すことにより、肝膵臓の細胞が冷凍により破壊されることを防ぎ、肝膵細胞中の酵素が分解を受けることなく抽出できるように工夫をした。更に、本発明者らは、急速凍結した肝膵臓から、本発明のカテプシンＬ様システインプロテアーゼを精製する方法もみいだした。
【００１１】
本カテプシンＬ様蛋白質は、ホッコクアカエビから、イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、吸着カラム、塩析、透析、限外ろ過、遠心分離等、を適宜組み合わせることにより、精製できる。例えば、生のホッコクアカエビから肝膵臓を摘出し、ホモジェナイズし、脱脂処理後、蛋白質を硫安沈殿させた後、再度溶解し、上清を陰イオン交換カラムで精製、吸着クロマトグラフィーで分離し、再度イオン交換クロマトグラフィーで精製して調製できる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、例えば、Ｑセファロース、ＭｏｎｏＱが、吸着クロマトグラフィーとしては、例えば、ハイドロキシアパタイトを用いることができる。解凍したホッコクアカエビの肝膵臓からも、同様に、ホモジェナイズし、脱脂処理後、遠心分離し蛋白質を沈殿させた後、再度溶解し、透析後、透析物を陰イオン交換カラムで精製、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離し、吸着クロマトグラフィーで精製して調製できる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、例えば、Ｑセファロース、ＭｏｎｏＱが、ゲルろ過クロマトグラフィーとしては、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘが、吸着クロマトグラフィーとしては、例えば、ハイドロキシアパタイトを用いることができる。
【００１２】
こうして精製されたホッコクアカエビ カテプシンＬ様システインプロテアーゼは、（１）分子量は、約３０ＫＤａ、（２）至適ＰＨは、約７〜８、（３）至適温度は、約３５℃、（４）コラーゲン分解性を示す、及び（５）カテプシンＬ様活性を示ことが分かった。
【００１３】
さらに、遺伝子工学的手法を駆使して種々研究した結果、この酵素をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、遺伝子の塩基配列および演繹アミノ酸配列のすべてを明らかにし、本発明を完成させるに至った。また、本酵素と同様の立体構造を持つことが予想されるアイソフォームをコードする遺伝子のクローニングにも成功し、酵母を用いた系で発現させることで性状を明らかにした。
【００１４】
発現されたホッコクアカエビ カテプシンＬ様システインプロテアーゼのアイソフォームは、（１）分子量は、約３０ＫＤａ、（２）至適ＰＨは、約６〜８、（３）至適温度は、約４０℃（２０℃でも活性を有していた）、（４）コラーゲン分解性を示す、及び（５）カテプシンＬ様活性を示していた。
【００１５】
これらのホッコクアカエビ由来新規カテプシンＬ様システインプロテアーゼをそれぞれホッコクアカエビ・カテプシンＬ１およびホッコクアカエビ・カテプシンＬ２と命名した。なお、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１は、ＮＳＬ１又はＮｓＣｔＬと、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２はＮＳＬ２、ホッコクアカエビ・システインプロテアーゼ、ＮｓＣｙｓ、又はＣｒｕｓｔａｐａｉｎと呼ぶこともある。
【００１６】
ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１及びＬ２をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み換え、該組み換え発現ベクターを適切な宿主に導入することにより、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１又はＬ２を遺伝子組み換え法により生産することができる。発現ベクターとしては、周知の種々のベクターを用いることができるが、例えば、宿主を大腸菌とする場合には、一連のｐＵＲベクター、ｐＡＴＨベクター、ｐＧＥＸベクター等が挙げられ、ＣＯＳやＣＨＯ等動物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＸＭ、ｐＤＣ２０１等のベクターを用いることができる。
【００１７】
例えば、大腸菌を用いた系では、発現ベクターｐＧＥＸ（アマシャムファルマシア）、ｐＥＴ３９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）、に本発明の遺伝子を挿入し、大腸菌に導入して、発現誘導することができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、目的の分子量を持つ遺伝子が発現されたことを確認した。また、酵母を用いた系では、本遺伝子を挿入した酵母発現ベクターｐＰＩＣＺαをエレクトロポレーション法により、宿主酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＸ−３３株又はＫＭ７１Ｈ株に導入し、高濃度（２０００μｇ／ｍｌ）のｚｅｏｃｉｎを含む培地で生える形質転換体を選別した。ゼラチンザイモグラフィーで活性を確認したところ、目的の酵素に相当するサイズのバンドが検出された。
【００１８】
本発明は、上記単離された２つのカテプシンＬ様プロテアーゼ及びその天然に存在する変異体を包含するものである。更に、本発明には、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１又はＬ２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質を包含する。また、本発明は、これらのカテプシンＬ様酵素のプレプロ体をも包含する。また、これらカテプシンＬ１又はＬ２とアミノ酸配列の全部または１部と８０％以上同一であるポリペプチドをも包含する。更に、本発明は、これらカテプシンＬ様酵素のシグナルペプチド及びプロペプチドをも包含する。これらプロペプチドは本件カテプシン様酵素の阻害剤としても有用である。そして、本発明は、これら酵素、そのシグナルペプチド、及びプロペプチドをコードするＤＮＡも包含する。
【００１９】
例えば、本発明には、上記ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２、又はそれぞれのプレプロ体の相補鎖からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを包含する。
【００２０】
なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば、１２０℃で２０分間処理してＤＮＡを結合させたＨｙｂｏｎｄ Ｎ^＋ナイロンメンブレン（アマシャムファルマシア）をチャーチリン酸塩緩衝液（０．５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１ｍＭ ＥＤＴＡ、７％ＳＤＳ）中、６５℃で５分間処理し、プレハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは同緩衝液中、後述の操作で得られたプローブを加え、６５℃で１７時間行う。ハイブリダーゼーション後のメンブレンは室温で２０分間、０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｌｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ；１ｘＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ７．０）で処理下後、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＣ中６５℃で２０分間の洗浄を２回行う。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣ、６５℃で２０分間処理し洗浄を完了する。Ｘ線フィルムへの感光は−８０℃で２４時間行う。
【００２１】
プローブの作成では、例えば、ＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡ断片を、Ｔａｋａｒａ ｒａｎｄａｍ ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて、［α^３２Ｐ］−ｄＣＴＰによるプローブの標識を行う。その後、遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて未反応のアイソトープを除去する。
【００２２】
更に、本発明には、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１，ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２，そのプレプロ体のアミノ酸配列に対し１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、カテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質のプレプロ体をコードするＤＮＡも包含される。
【００２３】
又、本発明には、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１，ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２、そのプレプロ体をコードするＤＮＡに対して、１〜１００個，好ましくは１〜１０個，更に好ましくは１〜数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加したＤＮＡであって、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１又はＬ２の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを包含するものである。
【００２４】
また、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１又はＬ２のアミノ酸配列の全部または１部と８０％以上、好適には９０％以上、特に好適には９５％以上同一であるポリペプチドの産生能を有するＤＮＡを包含する。更にこれらのカテプシンＬ又はプレプロカテプシンＬをコードするＤＮＡ配列に対し、相同性が８０％以上、好適には、９０％以上、特に好適には９５％以上となるカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質又はプレプロカテプシンＬ様酵素として機能する蛋白質をコードするＤＮＡを包含する。
【００２５】
本発明は、これら遺伝子を検出するためのプライマー、例えば、Ｌ１又はＬ２の塩基配列中の連続する１５塩基以上の配列又は当該配列に１又数個の欠失、置換、付加がなされた塩基配列を包含する。
【００２６】
本発明のホッコクアカエビ・カテプシンＬ１又はＬ２のＳ２ポケット（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｉ．ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．（１９６７）Ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，Ｉ．Ｐａｐａｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７，１５７−１６２の表記に従う）は、主として疎水性で、成熟型パパインのアミノ酸配列の番号で６７，６８，１５７，１６０，及び２０５からなっており、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１については、成熟型パパインのアミノ酸配列の番号６７及び６８がＶａｌ、同１３３がＣｙｓ、１５７がＩｌｅ、１６０がＡｌａ、２０５がＧｌｎであり、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２については、同６７がＴｒｐ、同６８がＰｒｏ、同１３３がＣｙｓ、同１５７がＡｌａ、同１６０がＡｌａ、同２０５がＴｙｒである。
【００２７】
本発明には、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１又はＬ２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホッコクアカエビ・カテプシンＬ１又はＬ２と基質特異性を同じくするカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質であって、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１又はＬ２のＳ２ポケットを保持するように、成熟型パパインのアミノ酸配列番号で（１）同６７及び同６８がＶａｌ、同１３３がＣｙｓ、同１５７がＩｌｅ、同１６０がＡｌａ、及び同２０５がＧｌｎであるか、又は、（２）同６７がＴｒｐ、同６８がＰｒｏ、同１３３がＣｙｓ、同１５７がＡｌａ、同１６０がＡｌａ、及び同２０５がＴｙｒ、であることを特徴とするタンパク質を包含する。
【００２８】
[発明を実施するための最良の形態]
実施例は例示であって、本発明を限定するものではない。
【００２９】
［実施例１］ ホッコクアカエビからカテプシンＬ様酵素の分離・精製
＜ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１の精製＞
漁協より生きたホッコクアカエビを購入し、解剖して肝膵臓を採取した。この肝膵臓に２倍量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、ホモジェナイズした。次に、１／５量のテトラクロロメタンを加え、４℃で１時間、攪拌して脱脂した後、遠心分離（１８，０００ｇ、４℃、３０分間）して、得られた上清を硫安分画に供した。１７．６〜４７．２％（ｗ／ｖ）硫安を、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０２％ＮａＮ_３を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（Ｂｕｆｆｅｒ Ａ）に再溶解して、透析した後、Ｂｕｆｆｅｒ Ａで平衡化したＱセファロースカラム（アマシャムファルマシア）に供した。Ｂｕｆｆｅｒ Ａで非吸着画分を洗浄後、Ｂｕｆｆｅｒ Ａと０．６Ｍ ＮａＣｌを含むＢｕｆｆｅｒ Ａとの直線的勾配で溶出した。
【００３０】
活性画分を回収して、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．９）に対して透析後、同緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイト（バイオラッド）のカラムに添加し、同緩衝液と４００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．９）との直線的勾配で溶出した。さらに、活性画分をＭｏｎｏＱカラムに供した。溶出はＢｕｆｆｅｒ Ａと１Ｍ ＮａＣｌを含むＢｕｆｆｅｒ Ａとの直線的勾配で行った。以上の方法で、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１を精製した。合成基質を用いて測定した各精製段階の比活性を表１および表２に示した。
【００３１】
＜酵素活性測定法＞
各精製段階の画分および精製した酵素のコラーゲン分解活性は、酸可溶性Ｉ型コラーゲン（和光純薬）を基質として、ｐＨ７．５、２５℃で３０分間反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認した（図４）。
また、以下に示す合成基質を用いた方法で精製過程の酵素活性を定量的にモニタリングした。
【００３２】
コラゲナーゼ様酵素の活性を測定する基質として、ＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇ（以下、ＤＮＰ−ペプチドと記す）（ペプチド研究所）を用いた。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に１ｍＭの濃度でＤＮＰ−ペプチドを溶解して基質溶液とした。この基質溶液１００ｍｌに各画分の酵素溶液を等量加え、２５℃で、１０分間反応させた。１Ｎ ＨＣｌを０．５ｍｌ加えて反応を停止させ、酢酸エチルとｎ−ブタノールの混液（１：０．１５）を加えた後、激しく振盪した。次いで、遠心分離後、上清の吸光度を３６５ｎｍで測定した。１分間に１μｍｏｌの基質を加水分解するときの酵素量を１ｕｎｉｔとした。
【００３３】
トリプシン様酵素およびエラスターゼ様酵素の活性を測定する基質として、Ｂｚ−ＤＬ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ＢＡＰＡ）、Ｓｕｃ−（Ａｌａ）３−ｐＮＡ（ＳＴＡＮＡ）（ペプチド研究所）、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ＡＡＰＲ）、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（ＡＡＰＬ）（ＢＡＣＨＥＭ）（なお、ＢｚはＢｅｎｚｏｙｌを、ｐＮＡはｐ−Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅを、ＳｕｃはＳｕｃｃｉｎｙｌをそれぞれ表す。）を用いた。ＢＡＰＡの分解性によりトリプシン様酵素活性の有無が、ＳＴＡＮＡの分解性によりエラスターゼ様酵素活性の有無が確認できる。また、ＡＡＰＬ及びＡＡＰＲは、カニ由来のセリンコラゲナーゼが作用する基質である。ジメチルスルホキシドを用いて、５０ｍＭの濃度で基質溶液を調製した。各画分の酵素溶液を１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に加えてプレインキュベート後、基質溶液を終濃度０．５ｍＭになるように添加して２５℃で、５分間反応させ、遊離したｐ−ニトロアニリンを４０５ｎｍで比色定量した。１分間に１μｍｏｌの基質を加水分解するときの酵素量を１ｕｎｉｔとした。
各画分の蛋白質量は、ＢＳＡを標準試料としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量した。
【００３４】
【表１】

【００３５】
【表２】

【００３６】
精製したホッコクアカエビ・カテプシンＬ１はコラゲナーゼの合成基質に対してよく作用した（表１）。また、ＢＡＰＡに対しては全く作用せず、Ｐ２部位にプロリンが配置する基質（ＡＡＰＬ、ＡＡＰＲ）に対して、よく作用した（表２）。
【００３７】
更に、カテプシンＬ様活性の確認のために、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質として用い活性を測定した。ジメチルスルホキシドを用いて２０ｍＭの濃度で基質溶液を調製した。酵素溶液を１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に加えてプレインキュベート後、基質溶液を最終濃度５０μＭとなるように、添加して２５℃で、５分間反応させ、遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定した。ＡＭＣ（ペプチド研究所）を用いて標準曲線を作成して定量し、１分間に１μｍｏｌの基質を加水分解するときの酵素量を１Ｕとした。精製の最終段階で、１０．２Ｕ／ｍｇの活性が認められた。
【００３８】
ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１によるコラーゲンの分解パターンを図４に示した。図に示したように、本酵素は、２５℃、３０分間の反応でコラーゲンをよく分解した。
ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを図３に示した。約３０ｋＤａ付近に単一のバンドとして得られた。
【００３９】
また、ＰＡＳ染色は次のようにして行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、１２．５％トリクロロ酢酸に３０分間浸漬し、蒸留水で３０秒洗浄、０．５％過よう素酸溶液（ＰＡＳ染色用）（和光純薬）に５０分浸漬し、蒸留水で１０分６回よく洗浄し、Ｃｏｌｄ Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（和光純薬）で５０分処理し０．５％亜硫酸水素ナトリウムを含む０．０５ＮＨＣｌで１０分３回、蒸留水で洗浄し、５％酢酸に浸漬した。これにより、糖鎖を持つことが示唆された。（図１０）
【００４０】
＜至適ｐＨ＞
活性の測定は、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液（ｐＨ４−１３）中で、ＤＮＰ−ペプチドを用いて２５℃で行った。最終的な反応液は、２００μｌ、ＤＮＰ−ペプチドの終濃度は０．５ｍＭ、酵素の終濃度は、１．５μｇ／ｍｌであった。本酵素の至適ｐＨは、約７〜８であった（図５）。
【００４１】
＜至適温度＞
１ｍＭ ＤＮＰ−ペプチド、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を各温度で５分間プレインキュベートした後、酵素を加えて活性を測定した。最終的な反応液は、２００μｌ、ＤＮＰ−ペプチドの終濃度は０．５ｍＭ、酵素の終濃度は、１．５μｇ／ｍｌであった。本酵素の至適温度は、約３５℃であった（図６）。
【００４２】
＜温度安定性＞
１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に本酵素（３００ｎｇ）を加え、各温度（２０℃〜７０℃）で３０分間及び６０分間インキュベーションした後、直ちに氷冷した。ＤＮＰ−ペプチドを基質として、２５℃で残存活性を測定した。最終的な反応液は、２００μｌ、ＤＮＰ−ペプチドの終濃度は０．５ｍＭ、酵素の終濃度は、１．５μｇ／ｍｌであった。本酵素は２５℃、１時間および３０℃、３０分間まで安定であり、５０℃、１時間および６０℃、３０分間で失活した（図７）。
【００４３】
［実施例２］
＜Ｎ末端アミノ酸配列の解析＞
精製したホッコクアカエビ・カテプシンＬ１を電気泳動後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜に転写し、対応するバンドを切出して、プロテインシークエンサーに供した。本酵素のＮ末端アミノ酸配列は、ＤＴＶＤＷＲＤＫＧＡＶＴＰＶＫＤＱＧＱであった。相同性検索を行った結果、活性型システインプロテアーゼのＮ末端近傍に対応していた。
【００４４】
［実施例３］
＜カテプシンＬのクローニング＞
決定したＮ末端アミノ酸配列の一部分であるＤＷＲＤＫＧＡを参考にして、オリゴヌクレオチドを作製した。作製したプライマーは、５’−ＧＡＹ ＴＧＧ ＣＧＮ ＧＡＹ ＡＡＲ ＧＧＮ ＧＣ−３’（Ｒ：Ａ／Ｇ、Ｙ：Ｃ／Ｔ、Ｎ：Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）である。
【００４５】
ホッコクアカエビの肝膵臓よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製後、３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。その１本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして前述のプライマーと３’ＲＡＣＥ ＳｙｓｔｅｍのＡＵＡＰを用いてＰＣＲ（３０サイクル、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、１分）を行った。約９００ｂｐのＰＣＲ産物が得られ、この断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入して、サブクローニングし、３’末端側の塩基配列を決定した。その結果、２種類の配列が得られた。これらの配列を基に、表３に示したアンチセンス鎖のプライマーを作製し、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて得られたＰＣＲ断片を、同様にサブクローニングし、５’末端側の塩基配列を決定した。
【００４６】
【表３】

【００４７】
さらに、５’末端より表４に示したプライマーを作製して、上述の１本鎖ｃＤＮＡからホッコクアカエビ・カテプシンＬ１およびＬ２をコードする全長のｃＤＮＡを単離した。
【００４８】
【表４】

【００４９】
決定したホッコクアカエビ・カテプシンＬ１及びＬ２の塩基配列と演繹アミノ酸配列をそれぞれ図１（配列番号１及び２）および図２（配列番号３及び４）に示した。ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１の推定されるシグナル配列（１〜１５残基：Ｍｅｔ〜Ａｌａ）とプロ配列（１６〜１０５：Ｓｅｒ〜Ａｌａ）を除いたＮ末端部分は精製した酵素のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致した。ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１のシグナル配列をコードする塩基は、配列番号１の第２９塩基から７３塩基であり、プロ配列をコードする塩基は同じく配列番号１及び図１中の第７４塩基から３４３塩基である。又、カテプシンＬ２の推定されるシグナル配列は１〜１４残基のＭｅｔ〜Ｖａｌで、プロ配列は１５から１０６残基のＳｅｒ〜Ｍｅｔで、それぞれをコードする塩基は、配列番号３の第１３から５４塩基、及び第５５から３３０塩基である。
【００５０】
ホッコクアカエビ・プロカテプシンＬ１およびＬ２と他生物のプロカテプシンＬとのアミノ酸配列の相同性を表５に示す。
【００５１】
図８から明らかなように、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１及びＬ２は、触媒基のＣｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎが保存されており、パパインスーパーファミリーに属するシステインプロテアーゼである。更に、Ｓ−Ｓ結合位置も保存されている。そして、近隣結合法により系統樹を作成すること（図９）により、Ｌ１及びＬ２は、いずれもカテプシンＬ様酵素であることが分かる。
【００５２】
【表５】

【００５３】
ホッコクアカエビ・プロカテプシンＬ１は、アメリカンロブスターのＣｙｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ２との相同性が５７％で最も高かった（表５）。ホッコクアカエビ・プロカテプシンＬ２はアメリカンロブスターのＣｙｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ １との相同性が５７％で最も高かった（表５）。
【００５４】
［実施例４］
ホッコクアカエビの凍結試料からのカテプシンＬ様酵素の分離・精製
＜ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１の粗抽出物＞
全ての精製工程は４℃で行われた。−８０℃で凍結された肝膵臓が部分的に解凍され２倍量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＮａＮ_３含有）を加え、ポリトロンホモゲナイザーで５分間ホモジェナイズした。次に、１／５量のテトラクロロメタンをゆっくりと攪拌しながら加え、遠心分離（１９，０００ｇ、３０分間）して、脂質を下層のテトラクロロメタンに抽出した。脱脂された上清は、粗抽出物として用いられた。
【００５５】
＜ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１様プロテアーゼの精製＞
粗抽出物は２５〜７０％（ｖ／ｖ）の冷アセトンで分画され、１９，０００ｘｇで１５分間遠心分離された。得られた沈殿は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）（緩衝液１）に再溶解して、同じ緩衝液１で１晩透析した。透析した溶液は、０．４５μｍフィルターで濾過した後、同じ緩衝液１で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラム（１．６Ｘ４０ｃｍ アマシャムファルマシアバイオテック）に供した。同じ緩衝液でカラムを洗浄後、結合したタンパク質を０から０．５Ｍの範囲のＮａＣｌの直線的勾配で溶出した。
【００５６】
分画は、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、及びゼラチンチモグラフィーを用いて蛋白質分解活性を測定した。
【００５７】
Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対して高い活性を示すが，Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対してはほとんど活性を示さない画分を回収して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）（緩衝液２）に対して透析後、Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により濃縮した。濃縮して回収された画分は、緩衝液２で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇゲル濾過カラム（１．６Ｘ１００ｃｍ アマシャムファルマシアバイオテック）に添加し、同カラムは０．４ｍｌ／ｍｉｎの流速で、流出させた。
【００５８】
Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対して活性のある画分を回収し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に対し透析した。透析した溶液は、同緩衝液で平衡化したＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ１０−Ｉ ハイドロキシアパタイト（１．２Ｘ８．８ｃｍ バイオラッド）のカラムに添加した。非特異的結合タンパク質を洗浄除去し、結合タンパク質は、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）の１０〜４００ｍＭの直線的勾配で溶出した。
Ｎ末のアミノ酸配列を確認したところ、Ｌ１であることが確認された。
【００５９】
＜カテプシンＬ様酵素活性測定＞
酵素活性測定は、２５℃で、分子内で蛍光が消失されたＭＣＡ（メチルクマリルアミド）基質を用い、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ６．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭ ＥＤＴＡ ａｎｄ ０．０１％Ｂｒｉｊ−３５の緩衝液中で行った。基質溶液は、ジメチルスルホキシド中で２０ｍＭの濃度で調製された。加水分解反応は、同じ緩衝液で薄められた酵素を添加することにより開始し、酵素活性は、遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定した。
【００６０】
＜基質特異性の検定＞
Ｓ２サブサイトの特異性は、種々のジペプチドＭＣＡ又はトリペプチドＭＣＡ基質を用いて、偽１次反応条件で行われた（ここで偽１次条件とは、初速度ｖ_０がｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍに直接比例する、推定Ｋ_ｍ値よりはるかに低い基質濃度を用いる条件を意味する）。結果は、図１１に示される。
【００６１】
基質として、次の蛍光ペプチド基質を用いた。Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，Ｚ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，Ｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，Ｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，Ｈ−Ａｒｇ−ＭＣＡ及びＺ−Ａｒｇ−ＭＣＡ。
【００６２】
図１１より、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１は、Ｐ２の位置（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，１９６７ Ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，Ｉ．Ｐａｐａｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７，１５７−１６２の表記法）に非芳香属性の疎水性残基がある合成基質を高い特異性で切断することが分かる。この特異性パターンは、カテプシンＫ及びＳに類似していおり、両者とも、この位置でＰｈｅよりＬｅｕに特異性が高い。他方、カテプシンＬは、逆の順序の特異性である。
【００６３】
しかしながら、カテプシンＫ及びＳとは異なり、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１は、Ｐ２の位置でＰｈｅよりもＶａｌを選択的に受容する。
【００６４】
＜阻害剤の影響＞
酵素溶液は、Ｅ６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｙｌ−ａｇｍａｔｉｎｅ）、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＣＨＮ_２、及びＺ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＣＨＮ_２、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ａｎｔｉｐａｉｎ、ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、及び１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅのいずれかの阻害剤と、緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０，０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有）中で前処理した後、蛍光基質Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡにより残存酵素活性を測定した。酵素と基質の最終濃度は、それぞれ、１ｎＭ及び１００μＭで、残存酵素活性を上述の方法で測定した。
結果は表６に示す。
【００６５】
【表６】

【００６６】
表６に示されるように、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１は、典型的なシステインプロテアーゼの阻害プロファイルを示す。ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１は、システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ６４により０．１μＭの濃度でも強く阻害される。Ｌ１は、システインプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼの両者に対する阻害剤であるｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，及びａｎｔｉｐａｉｎにも強く阻害される。
【００６７】
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＣＨＮ_２は、カテプシンＬの有効な阻害剤であるが、カテプシンＢ及びＳもわずかに阻害することが知られている。また、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＣＨＮ_２は、カテプシンＬに特異的阻害剤である。
【００６８】
しかしながら、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＣＨＮ_２、及びＺ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＣＨＮ_２は、本酵素活性をほとんど阻害しなかった。また、セリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼ群に特異的である阻害剤には阻害作用はなかった。
【００６９】
以上から、本ホッコク・アカエビカテプシンＬ１は、従来公知のカテプシンＬ様蛋白質分解酵素とは、その特異性、阻害剤による阻害いずれも相違し、全く新しい酵素であると結論づけることができる。
【００７０】
［実施例５］
ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２の発現
ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ホッコクアカエビ・システインプロテアーゼ：ＮｓＣｙｓ）をコードする遺伝子が、メタノール資化酵母であるピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔＴＭ Ｅｃｈｏ−ＡｄａｐｔｅｄＴＭ Ｐｉｃｈｉａ発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて異種発現させられた。
【００７１】
ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）のシグナルペプチドを除く完全長の前駆体をコードする９２４塩基のｃＤＮＡがＰＣＲで増幅され、キットのプロトコールに従って、キットに付属のｐＵｎｉＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターにサブクローンされた。得られたベクターは、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）のｃＤＮＡが酵母のα−接合因子分泌シグナルの下流におかれるようにピキア パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）シャトルベクターであるｐＰＩＣＺα−ＥにＣｒｅリコンビナーゼを介するプラスミド融合により組み換えられた。
【００７２】
融合されたプラスミドベクターが制限酵素ＰｍｅＩで直鎖化された後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１Ｈ株（ａｒｇ４ ａｏｘ１：：ＡＲＧ４）をエレクトロポレーション法（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ バイオラッド）により形質転換した。ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）が複数コピー組み込まれた陽性の形質転換体は、酵母エキス、ペプトンエキスおよびソルビトールを含む培地（ＹＰＤＳ）中のゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）の濃度２０００μｇ／ｍｌまで上げることで選択された。単一コロニーの高生産性クローンを組換えタンパク質の大量生産のために選択し、濃縮培地からゲルろ過クロマトグラフィーによる１段階の精製のみで、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ホッコクアカエビ・システインプロテアーゼ：ＮｓＣｙｓ）の純粋な調製物を得た。
【００７３】
ピキア パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）クローンは、発現誘導前に１リットルのＧＣＭ（グリセロール複合培地）に接種され、通気条件下、３０℃で、４日間前培養した。細胞は、室温で３０００Ｘｇ、５分間遠心分離して、回収され、１００ｍｌのＢＭＭ（ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｍｅｔｈａｎｏｌ ｍｅｄｉｕｍ）又はＭＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｍｅｔｈａｎｏｌ ｍｅｄｉｕｍ）培地で発現が誘導された。メタノールは、培地からの蒸発損失を補うため、毎日最終濃度が０．７５％になるように添加された。発現を確認するために、サンプルは毎日採取され、４℃で１２０００Ｘｇ、２０分間遠心分離され、上清は、４−２０％の勾配のポリアクリルアミドスラブゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された。
【００７４】
＜組み換えタンパク質の精製＞
無細胞培地上精は、ＹＭ−１０膜（アミコン）を用いた限外ろ過により、４℃で約１０ｍｌまで濃縮された。濃縮物は、５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ（１５０ｍＭＮａＣｌ含有）に対して、透析された。透析されたものは、同じ緩衝液で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇカラム（１．６ｘ１００ｃｍ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーに供され、タンパク質は、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎでＦＰＬＣシステムを用いて、溶出された。分画は、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて、酵素活性を測定し、最も高い活性を示す分画が更にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びザイモグラフィーで分析され、精製度の均一性が確認された。ゼラチンザイモグラフィーは、Ｈｅｕｓｓｅｎ及びＤｏｗｄｌｅらの方法を若干修正して用いた。
【００７５】
電気泳動は、４℃で、０．１％ゼラチン含有１５％ポリアクリルアミドスラブゲルで行われた。電気泳動後、ＳＤＳは３０分間２．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中で２回洗浄することで除去された。ゲルは、室温で３時間酵素反応溶液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０１％Ｂｒｉｊ）中でインキュベートし、コマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色され、１０％酢酸で脱色された。
【００７６】
結果を図１２（文献１図５）に示す。
なお、図１２Ａの（レーン２）３０ＫＤａのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、塩基配列から演繹されたホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）成熟型のＮ末端アミノ酸配列と一致した。
【００７７】
＜タンパク質濃度の決定＞
精製された組み換えホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）の濃度は、牛血清アルブミンを標準として用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法により測定された。エビプロテアーゼの速度論研究のため、酵素のモル量がＢａｒｒｅｔｔ及びＫｉｒｓｃｈｋｅの方法で、Ｅ−６４で活性部位を滴定することにより測定された。
【００７８】
＜酵素活性＞
実施例４と同様になされた。
【００７９】
＜活性及び安定性のｐＨ及び温度依存性＞
組換えホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）のｐＨ活性プロファイルは、上述の偽１次条件下で、１０μＭ基質濃度で測定された。
【００８０】
次の緩衝液が用いられた。：ｐＨ３．０−６．０については１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０−８．０については１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、及びｐＨ８．０−１１．０については１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液。それぞれのｐＨ緩衝液は更に、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び３００ｍＭＮａＣｌを含む。
ｐＨ安定性を決定するために、酵素はこれらの緩衝液中で２５℃、３０分間インキュベートされた。残存活性が上述の蛍光基質を用いて測定された。
【００８１】
結果は、図１３に示される。哺乳類のカテプシンＬは、アルカリ側では完全に不活性又は非常に活性が低いが、本ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）は、ｐＨ８．５でさえも、約８０％の活性を有している。
【００８２】
ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）がＺ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡを加水分解する活性に対する温度の影響を測定するために、基質を含む緩衝液を各温度で、１０分間プレインキュベートした後、酵素溶液を添加した。反応は５分間進行させられ、蛍光変化が上述のように記録された。熱安定性については、酵素溶液が３０〜６０℃で処理され、何度かの間隔で試料が採取され、直ちに氷上で冷却され、Ｚ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する残存活性を２５℃で測定した。
【００８３】
結果は、図１４に示される。
＜基質特異性の検定＞
基質特異性は、実施例４と同様にして測定された。
結果は、図１５に示される。
【００８４】
一般に、カテプシンＬ及びＳは、Ｐ２部位に小さなβ分岐鎖のＶａｌより疎水性の大きな側鎖を有するＰｈｅ及びＬｅｕのある基質をより選好する。ところがホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）は、ＶａｌとＬｅｕの選好性が逆となっている。また、他の既知のカテプシンとは異なり、ＰｒｏよりもＰｈｅに対する親和性が１０倍も低い。哺乳類のカテプシンＫもＰ２においてＰｒｏを選好するが、Ｐ２残基として同様にＬｅｕを受容しＰｈｅにも相当の親和性を有する点で異なる。
【００８５】
＜グルカゴンの分解＞
１μＭのグルカゴン試料が１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＤＴＴ、及び０．０１％Ｂｒｉｊ−３５を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２．５ｎＭの組換えホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）により２５℃、４時間分解された。そして、試料は１５％酢酸で酸性化され、得られたペプチド断片は、すぐに逆相ＨＰＬＣ（ＯＤＳ−１２０Ａカラム（２５Ｘ０．４ｃｍ トーソー））で分離された。カラムは、２１５ｎｍの吸収がベースラインに達するまで、０．１％トリフルオロ酢酸含有水で洗浄され、溶出は０．１％トリフルオロ酢酸を含む９５％アセトニトリルにより０−６０％直線勾配を用いて流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで行われた。
【００８６】
２１５ｎｍの吸収の各ピークに対応する溶出物が回収され、真空下で乾燥され、アプライドバイオシステム社タンパク質シークエンサーモデル４７６Ａに供された。
結果は図１６に示される。
【００８７】
グルカゴンには、Ｐｒｏは含まれないが、合成基質の分解結果と一致し、Ｐ２位置における残基の選好は、Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ａｌａの順で、Ｐ２にＬｅｕを持つ断片がないことは、Ｌｅｕには非常に親和性が低いことを示している。
【００８８】
＜コラーゲンの消化＞
Ｐｒｏを多量に含むタイプＩのコラーゲンの分解性を調べた。
豚皮膚の酸可溶性タイプＩコラーゲンが、２．５μＭの濃度となるように、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含有）に希釈され、１０μＭ Ｅ−６４の存在下又は不存在下で、１２５ｎＭのホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）を用いて処理された。
【００８９】
試料を予め決められた間隔で回収し、直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに添加し、５分間沸騰させた。コラーゲンの分解は、４−２０％の勾配ゲル（ＴＥＦＣＯ）を用いて、コマシーブルー染色により確認した。
【００９０】
結果は、図１７に示される。
結果は、既知のシステインプロテアーゼと比較し、タイプＩのコラーゲンの分解性が非常に高いことがわかった。
【００９１】
[産業上の利用の可能性]
本発明により、コラーゲンを分解するホッコクアカエビ由来新規カテプシンＬ様酵素が提供される。本酵素はホッコクアカエビ肝膵臓より、あるいは本酵素をコードする遺伝子を導入し、形質転換した宿主細胞を培養することにより得ることができ、食品分野、化粧品分野、医薬分野など幅広い分野において有用に利用することができる。
【００９２】
本件出願は、２００２年６月１７日に日本国特許庁になされた特願２００２−１７５７７３号、及び２００３年５月２０日付けで本件発明者らにより米国特許庁になされた仮出願（６０／４７１７３３）に基づく優先権を主張する出願であって、両出願の内容を引用により、取り込むものである。
【００９３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Nichirei Corporation
<120> New collagen-degrading cathepsin L like cysteine proteinase derived from Northern shrimp(Pandalus eous), process for producing the same
<130> PH-1804-PCT
<150> JP 2002-175773
<151> 2002-06-17
<150> US 60/471,733
<151> 2003-05-20
<160> 12
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1246
<212> DNA
<213> Northern shrimp(Pandalus eous)
<400> 1
tgagtcagtt ctgctcaact ctgatacgat gaaggttctt cttttcctgt gtggtctggc 60
catagtcgcc gctagtgaat gggaaaactt caagttgacc catgctaaag tttacaccca 120
tggcaaggaa gatctttaca ggaggtccat ctttgagaac aaccagaagg ttgtcgagga 180
acacaatgaa cgattccgtc agggacttgt caccttcgac ctcaagatga acagattcgg 240
agatatgacg acagaggagt ttgtatccca gatgaccggg ctcaacaaag tagagaggac 300
cgttggtaag gtgttcgctc actaccctga agtagaaagg gctgacactg ttgactggag 360
agacaaagga gctgtgaccc cagttaagga tcagggtcag tgtggatcat gctgggcctt 420
ctctaccact ggagctctgg aaggagcaca tttcctgaaa cacggcgatt tagtcagtct 480
gtccgaacaa aatctggtcg attgctcaac tgagaacagt ggctgtaacg gcggtgtggt 540
ccaatgggcc tacgactaca tcaagtccaa caacggaatt gatactgaat cttcataccc 600
ctacgaagct caagatttaa cttgtcgatt cgacgctgca cacgttggtg ctaccgttac 660
tggatacgca gatatccctt atgctgatga agtgacccag gcctcagctg tccatgatga 720
tggtccagtc agcgtctgta ttgatgctgg acacaattcc ttccagttgt acagctcagg 780
tgtgtactac gagcctaact gcaatcctag ctctatcaac cacgctgtgt tgcccgtagg 840
atacggaaca gaggaaggca gtgactactg gctcatcaag aactcttggg gaactggctg 900
gggtctgagt ggatacatga agctcacaag gaacaagagc aatcattgtg gtgtcgccac 960
ccaatcttgt taccctaatg tctaagagct caatttaaga catggttttc cacttaaaca 1020
acggaggtaa tgtttaacca tttcaaaaac acctcaggaa agccttatgg ataaaagtaa 1080
tggatatctt caaacaattt tccactgaat tttcttgtgt gacgataaaa catctacttc 1140
cgccatttta agattacacc tgactcaaac tatacatatt aatgtgtgta gcattctagt 1200
agaaaataaa gaaagcatta caaaataaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1246
<210> 2
<211> 318
<212> PRT
<213> Northern shrimp(Pandalus eous)
<400> 2
Met Lys Val Leu Leu Phe Leu Cys Gly Leu Ala Ile Val Ala Ala Ser
1 5 10 15
Glu Trp Glu Asn Phe Lys Leu Thr His Ala Lys Val Tyr Thr His Gly
20 25 30
Lys Glu Asp Leu Tyr Arg Arg Ser Ile Phe Glu Asn Asn Gln Lys Val
35 40 45
Val Glu Glu His Asn Glu Arg Phe Arg Gln Gly Leu Val Thr Phe Asp
50 55 60
Leu Lys Met Asn Arg Phe Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Phe Val Ser
65 70 75 80
Gln Met Thr Gly Leu Asn Lys Val Glu Arg Thr Val Gly Lys Val Phe
85 90 95
Ala His Tyr Pro Glu Val Glu Arg Ala Asp Thr Val Asp Trp Arg Asp
100 105 110
Lys Gly Ala Val Thr Pro Val Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys
115 120 125
Trp Ala Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Gly Ala His Phe Leu Lys
130 135 140
His Gly Asp Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser
145 150 155 160
Thr Glu Asn Ser Gly Cys Asn Gly Gly Val Val Gln Trp Ala Tyr Asp
165 170 175
Tyr Ile Lys Ser Asn Asn Gly Ile Asp Thr Glu Ser Ser Tyr Pro Tyr
180 185 190
Glu Ala Gln Asp Leu Thr Cys Arg Phe Asp Ala Ala His Val Gly Ala
195 200 205
Thr Val Thr Gly Tyr Ala Asp Ile Pro Tyr Ala Asp Glu Val Thr Gln
210 215 220
Ala Ser Ala Val His Asp Asp Gly Pro Val Ser Val Cys Ile Asp Ala
225 230 235 240
Gly His Asn Ser Phe Gln Leu Tyr Ser Ser Gly Val Tyr Tyr Glu Pro
245 250 255
Asn Cys Asn Pro Ser Ser Ile Asn His Ala Val Leu Pro Val Gly Tyr
260 265 270
Gly Thr Glu Glu Gly Ser Asp Tyr Trp Leu Ile Lys Asn Ser Trp Gly
275 280 285
Thr Gly Trp Gly Leu Ser Gly Tyr Met Lys Leu Thr Arg Asn Lys Ser
290 295 300
Asn His Cys Gly Val Ala Thr Gln Ser Cys Tyr Pro Asn Val
305 310 315
<210> 3
<211> 1242
<212> DNA
<213> Northern shrimp(Pandalus eous)
<400> 3
cactttagca agatgaggtc tctgtttctt atccttctcg ggctggctgc ggtctccgcc 60
attggagaat gggaaaactt caagacgaag tttggcaaga agtatgccaa ctcagaagag 120
gagagtcaca gaatgtctgt tttcatggac aaactgaagt tcattcagga gcacaatgaa 180
cgatacgata agggagaagt cacttattgg ctgaaaatca acaacttctc cgatttgacc 240
cacgaagagg tcttggccac caagactgga atgaccagga gacgacaccc tctttccgta 300
ttgcccaaat ctgccccaac cacaccaatg gccgcagacg ttgactggag gaataagggg 360
gctgtcaccc ccgtcaagga tcagggacaa tgcggatcat gctgggcttt ctcagctgtc 420
gccgccttgg aaggagcgca cttcctgaag accggagatt tggtcagcct gtctgaacag 480
aatttggttg actgctcttc gtcttacggt aaccaaggat gtaatggtgg atggccatac 540
caagcttatc aatacatcat tgccaatcgt ggcattgaca ccgaatcgtc atacccttac 600
aaggcaattg atgacaattg ccgatatgat gccggaaaca tcggcgccac cgtcagcagt 660
tatgtcgaac cagcttcagg agatgagtcc gcacttcagc atgctgtcca gaatgaagga 720
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tactatgaac caaactgcga ttcctggtac gccaaccatg ccgtgacagc cgtcggctac 840
ggcaccgacg ccaacggagg agattactgg atcgtcaaga actcgtgggg tgcatggtgg 900
ggagagagtg gctacatcaa gatggccaga aacagggaca acaactgtgc cattgctacc 960
tatagtgtct accctgttgt ttaagatctt ttattgacac tcacaatgat tttctttcca 1020
tcatttatca ttggggaact tttaatattc atttggggtt ttcatttgat attttgtgta 1080
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atcaaacact tttgtcaaat tacaatgaac acatccaaca gatgatgata catatgaaaa 1200
taaagataca acagataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1242
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<211> 323
<212> PRT
<213> Northern shrimp(Pandalus eous)
<400> 4
Met Arg Ser Leu Phe Leu Ile Leu Leu Gly Leu Ala Ala Val Ser Ala
1 5 10 15
Ile Gly Glu Trp Glu Asn Phe Lys Thr Lys Phe Gly Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Glu Ser His Arg Met Ser Val Phe Met Asp Lys Leu
35 40 45
Lys Phe Ile Gln Glu His Asn Glu Arg Tyr Asp Lys Gly Glu Val Thr
50 55 60
Tyr Trp Leu Lys Ile Asn Asn Phe Ser Asp Leu Thr His Glu Glu Val
65 70 75 80
Leu Ala Thr Lys Thr Gly Met Thr Arg Arg Arg His Pro Leu Ser Val
85 90 95
Leu Pro Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Met Ala Ala Asp Val Asp Trp
100 105 110
Arg Asn Lys Gly Ala Val Thr Pro Val Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly
115 120 125
Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Val Ala Ala Leu Glu Gly Ala His Phe
130 135 140
Leu Lys Thr Gly Asp Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp
145 150 155 160
Cys Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Gln Gly Cys Asn Gly Gly Trp Pro Tyr
165 170 175
Gln Ala Tyr Gln Tyr Ile Ile Ala Asn Arg Gly Ile Asp Thr Glu Ser
180 185 190
Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Ile Asp Asp Asn Cys Arg Tyr Asp Ala Gly
195 200 205
Asn Ile Gly Ala Thr Val Ser Ser Tyr Val Glu Pro Ala Ser Gly Asp
210 215 220
Glu Ser Ala Leu Gln His Ala Val Gln Asn Glu Gly Pro Val Ser Val
225 230 235 240
Cys Ile Asp Ala Gly Gln Ser Ser Phe Gly Ser Tyr Gly Gly Gly Val
245 250 255
Tyr Tyr Glu Pro Asn Cys Asp Ser Trp Tyr Ala Asn His Ala Val Thr
260 265 270
Ala Val Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Asn Gly Gly Asp Tyr Trp Ile Val
275 280 285
Lys Asn Ser Trp Gly Ala Trp Trp Gly Glu Ser Gly Tyr Ile Lys Met
290 295 300
Ala Arg Asn Arg Asp Asn Asn Cys Ala Ile Ala Thr Tyr Ser Val Tyr
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Pro Val Val
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gcatcaatac agacgctgac 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Primer
<400> 6
catcagcata agggatatct g 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Primer
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aacgtgtgca gcgtcgaatc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Primer
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<223> Primer
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Primer
<400> 12
cactttagca agatgaggtc tctg 24
【図面の簡単な説明】
図１は、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１の塩基配列及びアミノ酸配列
図２は、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２の塩基配列及びアミノ酸配列
図３は、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｌａｎｅ１：分子量マーカー、Ｌａｎｅ２：ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１（１０μｇ）
図４は、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１によるコラーゲンの分解パターン
Ｌａｎｅ１：分子量マーカー、Ｌａｎｅ２：コラーゲン、Ｌａｎｅ３：０時間反応、Ｌａｎｅ４：２５℃、３０分間反応
図５は、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１の至適ｐＨを示す図である。
図６は、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１の至適温度を示す図である。
図７は、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１の温度安定性を示す図である。
図８は、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１及びＬ２のアミノ酸配列と他の甲殻類のカテプシンＬ、ラットのカテプシンＬ及びパパインとの配列比較
位置番号はパパインの位置番号に基づき、同一の残基はドットで示され、マッチングが最大となるようにギャップが入れられている。３つのＳ−Ｓ結合を形成するシステインが灰色で、活性中心のＣｙｓ，Ｈｉｓ Ａｓｐが白抜きで示されている。なお、ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１及びＬ２は、それぞれ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｈｒｉｍｐ １及び２に相当する。
図９は、（Ａ）パパインスーパーファミリーに属するカテプシン類の系統樹及び（Ｂ）アミノ酸配列間の相同性
系統樹は成熟型酵素配列の並列アラインメントに基づく近隣結合法により作成された。図８に現れる配列は太字で記載されている。分岐脇の数字はブートストラップ値（％）を表す。ホッコクアカエビのカテプシンＬ様システインプロテアーゼＬ１及びＬ２（それぞれ、ＮＳＬ１及びＮＳＬ２と略す。）がパパイン、ラットカテプシン類Ｂ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、及びＬ（それぞれ、ＲＣＢ、ＲＣＨ、ＲＣＫ、ＲＣＬ及びＲＣＬと略す。）、アメリカンロブスター（Ｈｏｎｍａｒｕｓ ａｍｅｒｉｃａ）システインプロテアーゼ類１，２，及び３（それぞれ、ＬＣＰ１，ＬＣＰ２，及びＬＣＰ３と略す。）、ノルウエーロブスター（Ｎｅｐｈｒｏｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）神経系及び胃カテプシンＬ（それぞれ、ＮＣＰ１及びＮＣＰ２と略す。）並びにクルマエビ近縁種（Ｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｌ）カテプシンＬ１及びＬ２（それぞれ、ＰＣＰ１及びＰＣＰ２と略す。）と比較される。
図１０は、アクリルアミド中でのホッコクアカエビ・カテプシンＬ１のＰＡＳ（過よう素酸 シッフ）染色
第１レーン：分子量マーカー
第２レーン：ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１（１０μｇ）
第３レーン：トランスフェリン（１０μｇ）
図１１：（文献３図５）
「ホッコクアカエビ・カテプシンＬ１の基質特異性をジ又はトリペプチドの蛍光基質を用いた検定。Ｚ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｘａａはアミノ酸１文字表記で表される異なるアミノ酸を意味する）で示されるジ又はトリペプチド蛍光ＭＣＡ基質が用いられた。」
図中のＦＲはＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、ＲＲはＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，ＰＲはＺ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，ＶＶＲはＺ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，ＬＬＲはＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，そしてＦＶＲはＺ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡをそれぞれ表す。
図１２（文献１図５）酵母発現系により生産したホッコクアカエビ・カテプシンＬ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１２Ａ）およびゼラチンチモグラフィー（図１２Ｂ）を示す。
レーン１は、プロペプチドを含むホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）を、レーン２は、成熟型のホッコクアカエビ・カテプシンＬ２（ＮｓＣｙｓ）を示す。
図１３：（文献１図６）ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２の活性のｐＨプロファイル及びｐＨ安定性
Ａ：偽１次反応条件下で測定されたＺ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ及びＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡの加水分解についてホッコクアカエビ・カテプシンＬ（ＮｓＣｙｓ）のｐＨ−依存活性の２次速度定数（Ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ）が左及び右軸に示されている。
Ｂ：様々なｐＨの緩衝液中で３０分間処理した後、ｐＨ６．０でＺ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する残存活性を測定した。各ｐＨにおけるデータは、未処理試料に対する百分率で示された。
図１４：ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２の温度安定性
図１５：ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２の基質特異性
Ｚ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｘａａはアミノ酸１文字表記で表わされ異なるアミノ酸を意味する）で示されるジ又はトリペプチド蛍光ＭＣＡ基質が用いられた。
図１５中に記載のＦＲはＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、ＲＲはＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，ＰＲはＺ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，ＶＶＲはＺ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡ，そしてＬＬＲはＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＭＣＡをそれぞれ表す。
図１６：ホッコクアカエビ・カテプシンＬ２によるグルカゴンの分解
Ａ：グルカゴンをホッコクアカエビ・カテプシンＬ２で分解して生じた断片の逆相ＨＰＬＣによる分離の結果を示すピーク（番号で表示）
Ｂ：逆相ＨＰＬＣにより分離された断片（ピーク番号）のアミノ酸配列を決定した。
下にグルカゴンのアミノ酸配列が記載されている。各切断部位の感受性は、クロマトグラフィーのピークの高さから推定され、主要切断部位は太い矢印で、中程度の切断部位は、細い矢印で、あまり切断されない切断部位は破線で示され、ラットカテプシンＬによる切断部位とあわせて示されている。
他のカテプシンＬとの切断部位との違いがよく示された。
図１７：タイプＩコラーゲンのホッコクアカエビ・カテプシンＬ２による分解の結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ

Claims (13)

1. 以下の性状を有する精製したホッコクアカエビ由来のカテプシンＬ様システインプロテアーゼ
   （１）分子量は、約３０ＫＤａ、
   （２）至適ＰＨは、約７〜８、
   （３）至適温度は、約３５℃、
   （４）コラーゲン分解性を示す、及び
   （５）カテプシンＬ様活性を示す。
2. ＤＴＶＤＷＲＤＫＧＡＶＴＰＶＫＤＱＧＱで表されるＮ末端アミノ酸配列を有する請求項１記載のカテプシンＬ様蛋白質。
3. 以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質
   （ａ）配列番号２の位置番号１０６番以降のアミノ酸配列又は配列番号４の位置番号１０７番以降のアミノ酸配列を含む蛋白質
   （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつカテプシンＬ様システインプロテアーゼ酵素活性を有する蛋白質。
4. 以下の（ａ）又は（ｂ）である請求項３記載の蛋白質
   （ａ）配列番号２の位置番号１０６番以降のアミノ酸配列又は配列番号４の位置番号１０７番以降のアミノ酸配列からなる蛋白質
   （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＬ様システインプロテアーゼ酵素活性を有する蛋白質。
5. 請求項３又は４記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
6. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ
   （ａ）配列番号１の３４４塩基から９８２塩基を含むＤＮＡ又は配列番号３の３３１塩基から９８１塩基を含むＤＮＡ、
   （ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
7. 以下の（ａ）又は（ｂ）である請求項６記載のＤＮＡ
   （ａ）配列番号１の３４４塩基から９８２塩基からなるＤＮＡ又は配列番号３の３３１塩基から９８１塩基からなるＤＮＡ、
   （ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
8. 以下の（ａ）又は（ｂ）のプレプロ型カテプシンＬ様システインプロテアーゼ蛋白質
   （ａ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
   （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質のプレプロ体。
9. 請求項８記載のプレプロ型カテプシンＬ様システインプロテアーゼをコードするＤＮＡ。
10. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ
    （ａ）配列番号１又は３記載のＤＮＡ配列
    （ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＬ様酵素活性を有する蛋白質のプレプロ型をコードするＤＮＡ。
11. 請求項５、６、９、及び１０のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
12. 請求項１１記載のベクターで形質転換されたカテプシンＬ様システインプロテアーゼ酵素を発現することができる宿主細胞。
13. 請求項１２記載の宿主細胞を用いてカテプシンＬ様蛋白質を発現させ、回収することを含むカテプシンＬ様システインプロテアーゼ蛋白質の製造方法。

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