JP4358521B2 - 細胞デリバリーのためのコンジュゲートおよび組成物 - Google Patents

細胞デリバリーのためのコンジュゲートおよび組成物 Download PDF

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Description

本出願は，いずれも’ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＤＥＬＩＶＥＲＹ’と題するＡｄａｍｉｃらの米国特許出願（６０／２９２，２１７，２００１年５月１８日出願），およびＡｄａｍｉｃらの米国特許出願（６０／３６２，０１６，２００２年３月６日出願）に基づく優先権を主張する。本出願はまた，Ｖａｒｇｅｅｓｅらの米国特許出願（６０／３０６，８８３，２００１年６月２０日出願，表題"ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＲＡＮＳＰＯＲＴ ＡＣＲＯＳＳ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＭＥＭＢＲＡＮＥＳ"），およびＶａｒｇｅｅｓｅらの米国特許出願（６０／３１１，８６５，２００１年８月１３日出願，表題"ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＤＥＬＩＶＥＲＹ"）に基づく優先権を主張する。これらの出願は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
本発明は，コンジュゲート，組成物，その合成方法および応用に関する。議論は，以下の本発明の理解のためにのみ提供される。この概要は，以下に記載される研究のいずれかが本発明に対する先行技術であると認めるものではない。
種々の治療用化合物，例えば，抗ウイルス剤および化学療法剤の細胞デリバリーは，通常２つの制限による妥協が必要である。第１に，化学療法剤の選択性はしばしば低く，このため正常組織に対して毒性が高くなる。第２に，生きている細胞内への多くの化合物の輸送は，細胞の複雑な膜系により高度に制限されている。特異的なトランスポーターが栄養または制御分子を選択的に侵入させ，ほとんどの外的分子，例えば核酸および蛋白質は排除される。脂質担体および種々のコンジュゲートシステム等を使用するなどの種々の戦略を用いて，化合物の細胞内への輸送を改良することができる。コンジュゲートは，しばしば，ある種の分子を，例えば，レセプター媒介性エンドサイトーシスにより特定の細胞内に選択的に輸送する能力に基づいて選択される。目的とする化合物を，細胞膜を超えて能動的に輸送される分子に結合させることにより，その化合物の細胞内または特定の細胞オルガネラへの有効な輸送を実現することができる。あるいは，能動輸送メカニズムなしで細胞膜を通ることができる分子，例えば，種々の親油性分子を用いて，目的とする化合物をデリバリーすることができる。コンジュゲートとして利用することができる分子の例には，限定されないが，ペプチド，ホルモン，脂肪酸，ビタミン，フラボノイド，糖，レポーター分子，レポーター酵素，キレーター，ポルフィリン，インターカレーター，および能動輸送または受動輸送のいずれかにより細胞膜を通ることができる他の分子が含まれる。
特定の種類の細胞，例えば，癌細胞への化合物のデリバリーは，特定の種類の細胞に関連するレセプターを用いることにより行うことができる。特殊なレセプター，例えば高親和性葉酸レセプターは，ある種の癌性細胞において過剰発現されている。例えば，高親和性葉酸レセプターは，種々の新生物組織，例えば，乳，卵巣，子宮頚部，結腸直腸，腎臓および鼻咽頭腫瘍において過剰発現されているが，正常組織においては非常に限定された程度で発現されている腫瘍マーカーである。葉酸に基づくコンジュゲートを用いて外的化合物を細胞膜を超えて輸送することは，疾病の治療および診断に標的化デリバリー法を提供することができ，治療用化合物の必要な用量を減少させることができる。さらに，治療薬の生物利用性，薬力学，および薬物動態学的パラメータは，バイオコンジュゲート，例えば葉酸バイオコンジュゲートを用いることにより調節することができる。Ｇｏｄｗｉｎら（１９７２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，２２６６−２２７１）は，生物学的に活性なプテロイルオリゴ−Ｌ−グルタメートの合成を報告する。Ｈａｂｕｓら（１９９８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９，２８３−２９１）は，ある種のオリゴヌクレオチド−葉酸コンジュゲートの固相合成の方法を記載する。Ｃｏｏｋ（米国特許６，７２１，２０８）は，特定のコンジュゲート基で修飾したある種のオリゴヌクレオチドを記載する。ビオチンおよび葉酸コンジュゲートを用いて外的分子，例えば特定のオリゴヌクレオチドの貫膜輸送を促進することは，Ｌｏｗら（米国特許５，４１６，０１６，５，１０８，９２１および国際公開ＷＯ９０／１２０９６）に記載されている。Ｍａｎｏｈａｒａｎら（国際公開ＷＯ９９／６６０６３）は，ある種の葉酸コンジュゲート，例えばコンジュゲートの核酸成分に結合したホスホルアミダイト成分を有する特定の核酸葉酸コンジュゲート，およびこれらの葉酸コンジュゲートを合成する方法を記載する。Ｎｏｍｕｒａら（２０００，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６５，５０１６−５０２１）は，ある種の葉酸−ヌクレオシドコンジュゲートの合成に有用な中間体であるアルファ−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル］葉酸の合成を記載する。Ｇｕｚａｅｖら（米国特許６，３３５，４３４）は，ある種の葉酸オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成を記載する。
他の種類の細胞への化合物のデリバリーは，ある種の細胞，例えば肝細胞と関連するレセプターを用いることにより達成される。例えば，レセプター媒介性エンドサイトーシスを用いる薬剤デリバリーシステムは，薬剤ターゲティングならびに薬剤取り込みを増強させるために用いられている。アシアロ糖蛋白質レセプター（ＡＳＧＰｒ）（例えば，Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２を参照）は，肝細胞に独特であり，分枝鎖ガラクトース末端糖蛋白質，例えばアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）に結合する。そのような糖蛋白質または合成グリココンジュゲートのレセプターへの結合は，多糖類鎖の分枝の程度に強く依存する親和性をもって生じ，例えば，三触角構造は，二触角または一触角鎖より高い親和性をもって結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５）。ＬｅｅおよびＬｅｅ（１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，４，３１７−３２８）は，ガラクトースと比較してレセプターに対してより高い親和性を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンを炭水化物成分として用いることにより，この高い特異性を得た。この"クラスタリング効果"はまた，マンノシル末端糖蛋白質または糖コンジュゲートの結合および取り込みについても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４，１３８８−１３９５）。ガラクトースおよびガラクトースアミンに基づくコンジュゲートを用いて外的化合物を細胞膜を超えて輸送することにより，肝臓疾病，例えばＨＢＶおよびＨＣＶ感染または肝細胞癌の治療に標的化デリバリー方法を提供することができる。バイオコンジュゲートの使用により，治療に必要な治療用化合物の用量を減少させることもできる。さらに，バイオコンジュゲートを用いることにより，治療薬の生物利用性，薬力学，および薬物動態学パラメータを調節することができる。
いくつかの研究グループにより，ペプチドに基づく多くの細胞トランスポーターが開発されている。これらのペプチドは，インビトロおよびインビボで高い効率で細胞膜を横切ることができる。そのような融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ペプチドの例には，ショウジョウバエ転写因子であるアンテナペディアのホメオドメインの１６−アミノ酸フラグメント（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，３３１８−３３２２）；カポジ線維芽細胞成長因子のシグナル配列の疎水性領域である１７−ｍｅｒフラグメント（ＮＬＳドメインを含むかまたは含まない）（Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１０，５９８−６０６）；ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓのＩｇ（５）軽鎖の１７−ｍｅｒシグナルペプチド配列（Ｃｈａｌｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４３，６０１−６０８）；ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１１４の１７−アミノ酸融合配列（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，２７３０−２７３６）；ＨＩＶ−１Ｔａｔの４９−５７フラグメント（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１５６９−１５７２）；ニューロペプチドであるガラニンのＮ末端フラグメントと膜相互作用性スズメバチ毒ペプチドであるマストポランとから構成されるトランスポルタンＡ−非キメラ２７−ｍｅｒ（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１１，６１９−６２６）；およびインフルエンザウイルスのヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質に由来する２４−ｍｅｒ（Ｂｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，４６８１−４６８８）が含まれる。
これらのペプチドは，脂質を用いない細胞培養トランスフェクションのためのアンチセンスオリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートの一部として首尾よく用いられた。多くの場合において，そのようなコンジュゲートは，脂質デリバリーを用いてトランスフェクトされた親オリゴヌクレオチドより優れた細胞培養効率を示した。さらに，ファージディスプレイ手法を用いて，インビボでいくつかの臓器ターゲティングペプチドおよび腫瘍ターゲティングペプチドが同定された（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２，６９７−７１５）。腫瘍ターゲティングペプチドのドキソルビシンへのコンジュゲートは，毒性プロファイルを顕著に改良することが示され，ネズミ癌モデルであるＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌腫において，インビボでドキソルビシンの増強された効力が示された（Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，３７７−３８０）。
Ｈｕｄｓｏｎら（１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１８２，４９−５８）は，トランスフェリンレセプター抗体とコンジュゲート化した特定のハンマーヘッドリボザイムの細胞デリバリーを記載する。Ｊａｎｊｉｃら（米国特許６，１６８，７７８）は，標的化薬剤デリバリーのための特定のＶＥＧＦ核酸リガンド複合体を記載する。Ｂｏｎｏｒａら（１９９９，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８，１７２３−１７２５）は，ある種のポリエチレングリコールにコンジュゲート化した特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的特性を記載する。ＤａｖｉｓおよびＢｉｓｈｏｐ（国際公開ＷＯ９９／１７１２０）およびＪａｅｓｃｈｋｅら（１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３４，３０１−４）は，ポリエチレングリコールコンジュゲートを製造する特定の方法を記載する。Ｔｕｌｌｉｓ（国際公開ＷＯ８８／０９８１０）；Ｊａｓｃｈｋｅ（１９９７，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｌ Ｓｅｒ．，６８０，２６５−２８３）；Ｊａｓｃｈｋｅら（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，４８１０−１７）；Ｅｆｉｍｏｖら（１９９３，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，１９，８００−４）；およびＢｏｎｏｒａら（１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８，７９３−７９７）は，特定のオリゴヌクレオチド−ポリエチレングリコールコンジュゲートを記載する。Ｍａｎｏｈａｒａｎ（国際公開ＷＯ００／７６５５４）は，ある種の細胞，血清，または血管蛋白質との特定のリガンドコンジュゲート化オリゴデオキシリボヌクレオチドの製造を記載する。ＤｅｆｒａｎｃｑおよびＬｈｏｍｍｅ（２００１，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．，１１，９３１−９３３）；Ｃｅｂｏｎら（２０００，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，５３，３３３−３３９）；およびＳａｌｏら（１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，８１５−８２３）は，特定のアミノオキシペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートを記載する。
発明の概要
本発明は，生物学的システム，例えば細胞内への分子のデリバリーを容易にするための組成物およびコンジュゲートを特徴とする。本発明により提供されるコンジュゲートは，治療用化合物を細胞膜を横切って輸送することにより，治療上の作用を与えることができる。本発明は，分子，例えば，限定されないが，小分子，脂質，ヌクレオシド，ヌクレオチド，核酸，抗体，トキシン，負に荷電したポリマーおよび他のポリマー，例えば，蛋白質，ペプチド，ホルモン，炭水化物，またはポリアミンを，細胞膜を超えてデリバリーするための新規薬剤の設計および合成を包含する。一般に，本明細書に記載されるトランスポーターは，分解性リンカーとともにまたはなしで，独立してまたは多成分系の一部としてのいずれかで用いるよう設計される。以下の式で一般に示される本発明の化合物は，血清の存在下または非存在下で，異なる組織に由来する多くの細胞タイプへの分子のデリバリーを改良すると予測される。
本発明は，式１：
［式中，各Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7およびＲ8は，独立して，水素，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，または保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，およびＲ2は，リン含有基，ヌクレオシド，ヌクレオチド，小分子，核酸，またはリンカーを含む固体支持体である］を有する化合物を特徴とする。
本発明は，式２：
［式中，各Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，または保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，およびＲ2は，リン含有基，ヌクレオシド，ヌクレオチド，小分子，核酸，またはリンカーを含む固体支持体である］
を有する化合物を特徴とする。
本発明は，式３：
［式中，各Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，または保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，およびＲ2は，リン含有基，ヌクレオシド，ヌクレオチド，小分子，または核酸である］
を有する化合物を特徴とする。
本発明は，式４：
［式中，各Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，または保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ2は，リン含有基，ヌクレオシド，ヌクレオチド，小分子，核酸，またはリンカーを含む固体支持体であり，およびＲ13はアミノ酸側鎖である］
を有する化合物を特徴とする。
本発明は，式５：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，各Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7およびＲ8は，独立して，水素，アルキルまたは窒素保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，および各Ｒ9およびＲ10は，独立して，窒素含有基，シアノアルコキシ，アルコキシ，アリールオキシ，またはアルキル基である］
を有する化合物を特徴とする。
本発明は，式６：
［式中，各Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，または保護基であり，Ｒ2は，リン含有基，ヌクレオシド，ヌクレオチド，小分子，核酸，またはリンカーを含む固体支持体であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，およびＬは分解性リンカーである］
を有する化合物を特徴とする。
本発明は，式７：
［式中，各Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，または保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，およびＲ2は，リン含有基，ヌクレオシド，ヌクレオチド，小分子，核酸，またはリンカーを含む固体支持体である］
を有する化合物を特徴とする。
本発明は，式８：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，各Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキルまたは窒素保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，および各Ｒ9およびＲ10は，独立して，窒素含有基，シアノアルコキシ，アルコキシ，アリールオキシ，またはアルキル基である］
を有する化合物を特徴とする。
本発明は，式５：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，各Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキルまたは窒素保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，および各Ｒ9およびＲ10は，独立して，窒素含有基，シアノアルコキシ，アルコキシ，アリールオキシ，またはアルキル基である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
ビス−ヒドロキシアミノアルキル誘導体，例えば，Ｄ−トレオニノールを，Ｎ保護アミノアルカン酸とカップリングさせて，式９；
［式中，Ｒ11はアミノ保護基であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，および各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数である］
の化合物を得；
一級ヒドロキシ保護Ｒ1を導入し，次にＲ1のアミノを脱保護して，式１０：
［式中，Ｒ1は保護基であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，および各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数である］
の化合物を得；
式１０の脱保護したアミンを保護されたアミノ酸，例えばグルタミン酸とカップリングさせて，式１１：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ11はアミノ保護基であり，およびＲ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールである］
の化合物を得；
式ＸＩのコンジュゲート化グルタミン酸のアミンＲ11を脱保護して，式１２：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ11はアミノ保護基であり，およびＲ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールである］
の化合物を得；
式１２の脱保護したアミンをアミノ保護プテロイン酸とカップリングさせて，式１３：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，各Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキルまたは窒素保護基であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，および各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数である］
の化合物を得；そして
式１３の二級ヒドロキシルにリン含有基を導入して式５の化合物を得る，
の各工程を含む。
本発明は，式８：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，各Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキルまたは窒素保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，各Ｒ9およびＲ10は，独立して，窒素含有基，シアノアルコキシ，アルコキシ，アリールオキシ，またはアルキル基であり，およびＲ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールである］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
ビス−ヒドロキシアミノアルキル誘導体，例えば，Ｄ−トレオニノールを，保護されたアミノ酸，例えばグルタミン酸とカップリングさせて，式１４：
［式中，Ｒ11はアミノ保護基であり，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数であり，Ｒ4は，独立して，保護基であり，およびＲ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールである］
の化合物を得；
一級ヒドロキシ保護Ｒ1を導入し，次に式１４のＲ11のアミノを脱保護して，式１５：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，および各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数である］
の化合物を得；
式１５の脱保護したアミンをアミノ保護プテロイン酸とカップリングさせて，式１６：
［式中，各Ｒ1およびＲ4は，独立して，保護基または水素であり，各Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキルまたは窒素保護基であり，Ｒ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールであり，および各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数である］
の化合物を得；そして
式１６の二級ヒドロキシルにリン含有基を導入して，式８の化合物を得る，
の各工程を含む。
１つの態様においては，本発明の化合物のＲ2は，リン含有基を含む。
別の態様においては，本発明の化合物のＲ2は，ヌクレオシド，例えば，抗癌または抗ウイルス活性等の有益な活性を有するヌクレオシドを含む。
さらに別の態様においては，本発明の化合物のＲ2は，ヌクレオチド，例えば，抗癌または抗ウイルス活性等の有益な活性を有するヌクレオチドを含む。
さらに別の態様においては，，本発明の化合物のＲ2は，小分子，例えば，抗癌または抗ウイルス活性等の有益な活性を有する小分子を含む。
別の態様においては，本発明の化合物のＲ2は，核酸，例えば，抗癌または抗ウイルス活性等の有益な活性を有する核酸を含む。
１つの態様においては，本発明の化合物のＲ2は，リンカーを含む固体支持体を含む。
別の態様においては，本発明のヌクレオシド（Ｒ2）は，抗癌活性を有するヌクレオシドを含む。
別の態様においては，本発明のヌクレオシド（Ｒ2）は，抗ウイルス活性を有するヌクレオシドを含む。
別の態様においては，本発明のヌクレオシド（Ｒ2）は，フルダラビン，ラミブジン（３ＴＣ），５−フルオロウリジン，ＡＺＴ，アラ−アデノシン，アラ−アデノシン一リン酸，ジデオキシヌクレオシド類似体，カルボデオキシグアノシン，リバビリン，フィアルウリジン，ロブカビル，ピロリン酸ヌクレオシド類似体，非環状ヌクレオシド類似体，アシクロビル，ガンシクロビル，ペンシクロビル，ファムシクロビル，Ｌ−ヌクレオシド類似体，ＦＴＣ，Ｌ−ＦＭＡＵ，Ｌ−ｄｄＣ，Ｌ−ＦｄｄＣ，Ｌ−ｄ４Ｃ，Ｌ−Ｆｄ４Ｃ，Ｌ−ジデオキシプリンヌクレオシド類似体，シタレン，ビス−ＰＯＭＰＭＥＡ（ＧＳ−８４０），ＢＭＳ−２００，４７５，カルボビルまたはアバカビルを含む。
１つの態様においては，本発明の化合物のＲ13は，アルキルアミノまたはアルコキシ基，例えば，−ＣＨ2Ｏ−または−ＣＨ（ＣＨ2）ＣＨ2Ｏ−を含む。
別の態様においては，本発明の化合物のＲ12は，アルキルヒドロキシル，例えば，−（ＣＨ2）nＯＨ（ここで，ｎは，約１−約１０の整数である）である。
別の態様においては，本発明の式６のＬは，セリン，トレオニン，または光不安定性結合を含む。
１つの態様においては，本発明の化合物のＲ9は，リン保護基，例えば，−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ（オキシエチルシアノ）を含む。
１つの態様においては，本発明の化合物のＲ10は，窒素含有基，例えば，−Ｎ（Ｒ14）（ここで，Ｒ14は，約１−約１０個の炭素を有する直鎖または分枝鎖のアルキルである）を含む。
別の態様においては，本発明の化合物のＲ10は，約４−約７個の原子，および酸素，窒素，またはイオウを含む約１−約３個の複素原子を含有するヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル環を含む。
別の態様においては，本発明の化合物のＲ1は，酸不安定性保護基，例えば，トリチルまたは置換トリチル基，例えば，ジメトキシトリチルまたはモノメトキシトリチル基を含む。
別の態様においては，本発明の化合物のＲ4は，ｔｅｒｔ−ブチル，Ｆｍ（フルオレニル−メトキシ），またはアリル基を含む。
１つの態様においては，本発明の化合物のＲ6は，ＴＦＡ（トリフルオロアセチル）基を含む。
別の態様においては，本発明の化合物のＲ3，Ｒ5，Ｒ7およびＲ8は，独立して，水素である。
１つの態様においては，本発明の化合物のＲ7は，独立して，イソブチリル，ジメチルホルムアミド，または水素である。
別の態様においては，本発明の化合物のＲ12は，メチル基またはエチル基を含む。
１つの態様においては，本発明の核酸は，酵素的核酸，例えば，ハンマーヘッド，イノザイム，ＤＮＡザイム，Ｇ切断剤，チンザイム，アンバーザイム，またはアロザイムを含む。
別の態様においては，本発明の核酸は，アンチセンス核酸，２−５Ａ核酸キメラ，またはデコイ核酸を含む。
別の態様においては，本発明のリンカーを有する固体支持体は，式１７：
［式中，ＳＳは固体支持体であり，および各"ｎ"は，独立して，約１−約２００の整数である］
の構造を含む。
別の態様においては，本発明の固体支持体は，調整多孔ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレンであり，核酸の合成において用いることができる。
１つの態様においては，本発明は，本発明の化合物および薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，患者の細胞を治療に適した条件下で本発明の医薬組成物と接触させることを含む，癌患者を治療する方法を特徴とする。この治療は，１またはそれ以上の他の薬剤療法を治療に適した条件下で使用することを含むことができる。本発明により企図される癌には，限定されないが，乳癌，肺癌，結腸直腸癌，脳癌，食道癌，胃癌，膀胱癌，膵臓癌，子宮頚癌，頭頚部癌，卵巣癌，黒色腫，リンパ腫，神経膠腫，または多剤耐性癌が含まれる。
１つの態様においては，本発明は，患者の細胞を治療に適した条件下で本発明の医薬組成物と接触させることを含む，ウイルスに感染した患者を治療する方法を特徴とする。この治療は，１またはそれ以上の他の薬剤療法を治療に適した条件下で使用することを含むことができる。本発明により企図されるウイルスとしては，限定されないが，ＨＩＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＣＭＶ，ＲＳＶ，ＨＳＶ，ポリオウイルス，インフルエンザ，ライノウイルス，西ナイル熱ウイルス，エボラウイルス，口蹄疫ウイルス，およびパピローマウイルスが挙げられる。
１つの態様においては，本発明は，本発明の化合物を含む，サンプル中の核酸分子または他の標的分子，例えば，癌細胞中の遺伝子の存在を検出するためのキットを特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，本発明の化合物を含む，サンプル中の核酸分子，または他の標的分子，例えば，ウイルス感染細胞中の遺伝子の存在を検出するためのキットを特徴とする。
別の態様においては，本発明は，修飾リン酸基，例えば，ホスホルアミダイト，ホスホジエステル，ホスホルアミデート，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，アルキルホスホネート，アリールホスホネート，一リン酸，二リン酸，三リン酸，またはピロリン酸を含む本発明の化合物を特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，式１８：
［式中，各Ｒ6およびＲ7は，独立して，水素，アルキルまたは窒素保護基である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
葉酸をカルボキシペプチダーゼと反応させて，式１９：
の化合物を得；
式１９の二級アミンに保護基Ｒ6を導入して，式２０：
［式中，Ｒ6は窒素保護基である］
の化合物を得；そして
式２０の一級アミンに保護基Ｒ7を導入して，式１８の化合物を得る，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明のアミノ保護プテロイン酸は，式１８の化合物である。
１つの態様においては，本発明は，式２１：
［式中，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数である］
を有する式１の化合物を包含する。
別の態様においては，本発明は，式２２：
［式中，各"ｎ"は，独立して，０−約２００の整数である］
を有する式７の化合物を包含する。
別の態様においては，本発明は，式２３：
［式中，"ｎ"は，０−約２００の整数である］
を有する式４の化合物を包含する。
別の態様においては，本発明は，式２４：
［式中，"ｎ"は０−約２００の整数である］
を有する式４の化合物を包含する。
別の態様においては，本発明は，式２５：
［式中，各Ｒ5およびＲ7は，独立して，水素，アルキルまたは窒素保護基であり，各Ｒ15，Ｒ16，Ｒ17，およびＲ18は，独立して，Ｏ，Ｓ，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，またはハロゲンであり，Ｘ1は−ＣＨ（Ｘ1'）または式３８：
［式中，Ｒ4は保護基であり，および"ｎ"は０−約２００の整数である］
の基であり；Ｘ1'は，天然に生ずるまたは天然に生じないアミノ酸の保護されたまたは保護されていない側鎖であり，Ｘ2は，アミド，アルキル，またはカルボニル含有リンカーまたは結合であり，およびＸ3は，分解性リンカーであり，これは任意に存在しなくてもよい］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，式２５のＸ3基は，式２６：
［式中，Ｒ4は水素または保護基であり，"ｎ"は０−約２００の整数であり，およびＲ12は，直鎖または分枝鎖のアルキル，置換アルキル，アリール，または置換アリールである］
の基を含む。
さらに別の態様においては，式２６のＲ4は水素であり，およびＲ12はメチルまたは水素である。
さらに別の態様においては，，本発明は，式２７：
［式中，"ｎ"は約０−約２０の整数であり，Ｒ4は，Ｈまたはカチオン性塩であり，およびＲ24は，イオウ含有脱離基，例えば，以下のいずれかの基：
を含む基である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式２７を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）システアミンのチオールを，式２８：
［式中，"ｎ"は，約０−約２０の整数であり，Ｒ19はチオール保護基である］
を有する化合物を得るのに適した条件下で選択的にトリチル化し；
（ｂ）（ａ）の生成物を，式２９：
［式中，Ｒ20はカルボン酸保護基であり，およびＲ21はアミノ保護基である］
を有する化合物と，式３０：
［式中，"ｎ"は，約０−約２０の整数であり，Ｒ19はチオール保護基であり，Ｒ20はカルボン酸保護基であり，およびＲ21はアミノ保護基である］
を有する化合物を得るのに適した条件下でペプチドカップリングさせ；
（ｃ）（ｂ）の生成物のアミノ保護基Ｒ21を，式３１：
［式中，"ｎ"は約０−約２０の整数であり，Ｒ19およびＲ20は，（ｂ）において定義したとおりである］
を有する化合物を得るのに適した条件下で除去し；
（ｄ）（ｃ）の生成物を，式３２：
［式中，Ｒ22はアミノ保護基である］
を有する化合物と，式３３：
［式中，"ｎ"は約０−約２０の整数であり，Ｒ19およびＲ20は（ｂ）で定義したとおりであり，およびＲ22は（ｄ）で定義したとおりである］
を有する化合物を得るのに適した条件下で縮合させ；
（ｅ）（ｄ）の生成物から，式３４：
［式中，"ｎ"は，約０−約２０の整数であり，Ｒ19およびＲ20は，（ｂ）において定義したとおりである］
を有する化合物を得るのに適した条件下でＲ22を選択的に切断し；
（ｆ）（ｅ）の生成物を，式３５：
［式中，Ｒ23はアミノ保護基である］
を有する化合物と，式３６：
［式中，Ｒ23はアミノ保護基であり，"ｎ"は約０−約２０の整数であり，Ｒ19およびＲ20は，（ｂ）において定義したとおりである］
を有する化合物を得るのに適した条件下でカップリングさせ；
（ｇ）（ｆ）の生成物を，式３７：
［式中，"ｎ"は約０−約２０の整数である］
を有する化合物を得るのに適した条件下で脱保護し；そして
（ｈ）（ｇ）の生成物に，式２７を有する化合物を得るのに適した条件下でジスルフィド系脱離基を導入する，
の各工程を含む。
１つの態様においては，本発明は，式３９：
［式中，"ｎ"は約０−約２０の整数であり，Ｘは，核酸，ポリヌクレオチド，またはオリゴヌクレオチドであり，およびＰはリン含有基である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式３９を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）チオール含有リンカーを，と，式４０：
［式中，"ｎ"は，約０−約２０の整数であり，Ｘは，核酸，ポリヌクレオチド，またはオリゴヌクレオチドであり，およびＰはリン含有基である］
を有する化合物を得るのに適した条件下で，核酸，ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとカップリングさせ；そして
（ｂ）（ａ）の生成物を，式３９を有する化合物を得るのに適した条件下で，式３７を有する化合物とカップリングさせる，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明のチオール含有リンカーは，式４１：
［式中，"ｎ"は約０−約２０の整数であり，Ｐは，リン含有基，例えば，ホスフィン，ホスファイト，またはリン酸であり，およびＲ24は，任意のアルキル，置換アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，アルケニル，置換アルケニル，アルキニル，または置換アルキニル基であり，追加の保護基を有していても有していなくてもよい］
を有する化合物である。
別の態様においては，式４０を有する化合物を得るのに適した条件は，例えば，ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または任意の同等なジスルフィド還元剤を用いて，式４２：
［式中，"ｎ"は，約０−約２０の整数であり，Ｘは，核酸，ポリヌクレオチド，またはオリゴヌクレオチドであり，Ｐはリン含有基であり，およびＲ24は，任意のアルキル，置換アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，アルケニル，置換アルケニル，アルキニル，または置換アルキニル基であり，追加の保護基を有していても有していなくてもよい］
を有する化合物のジスルフィド結合を還元することを含む。
１つの態様においては，本発明は，式４３：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，分解性核酸リンカーを含み；Ｙは，リンカー分子またはアミノ酸を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；ｎは約１−約１００の整数であり；およびＮ’は約１−約２０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式４４：
［式中，Ｘは生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；ｎは約１−約５０の整数であり，およびＰＥＧは，式４５：
［式中，Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；およびｎは，約１−約１００の整数である］
を有する化合物を表す］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式４６：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；およびＰＥＧは式４５：
［式中，Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；およびｎは約１−約１００の整数である］
を有する化合物を表す］
を有する化合物を特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，式４７：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは同じであっても異なっていてもよく，存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｑは，独立して，疎水性基またはリン脂質を含み；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，およびｎは約１−約１０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式４８：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，およびＢは，親油性基，例えば，飽和または不飽和の直鎖，分枝鎖，または環状アルキル基を表す］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式４９：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，およびＢは，親油性基，例えば，飽和または不飽和の直鎖，分枝鎖，または環状アルキル基を表す］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式５０：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；および各Ｑは，独立して，疎水性基またはリン脂質を含む］
を有する化合物を特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，式５１：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｙは，リンカー分子またはアミノ酸を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，およびｎは約１−約２０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式５２：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｙはリンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み；Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，ｎは約１−約２０の整数であり；およびＮ’は約１−約２０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式５３：
［式中，Ｂは，Ｈ，ヌクレオシド塩基，または非ヌクレオシド性塩基を含み，保護基を有していても有していなくてもよく；各Ｒ1は，独立して，Ｏ，Ｎ，Ｓ，アルキル，または置換Ｎを含み；各Ｒ2は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；各Ｒ3は，独立して，ＮまたはＯ−Ｎを含み，各Ｒ4は，独立して，Ｏ，ＣＨ2，Ｓ，スルホン，またはスルホキシを含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチルガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，各ｎは，独立して，約１−約５０の整数であり；およびＮ’は約１−約１０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式５４：
［式中，Ｂは，Ｈ，ヌクレオシド塩基，または非ヌクレオシド性塩基を含み，保護基を有していても有していなくてもよく；各Ｒ1は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；およびＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含む］
を有する化合物を特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，式５５：
［式中，各Ｒ1は，独立して，Ｏ，Ｎ，Ｓ，アルキル，または置換Ｎを含み；各Ｒ2は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；各Ｒ3は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，またはハロを含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，生物学的に活性な分子または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチルガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，各ｎは，独立して，約１−約５０の整数であり；およびＮ’は約１−約１００の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式５６：
［式中，Ｒ1は，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｒ2は，Ｈ，Ｏ，ＯＨ，アルキル，アルキルハロ，ハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，生物学的に活性な分子または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，および各ｎは，独立して，約０−約２０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式５７：
［式中，Ｒ1は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＴｒは，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチルであり；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，およびｎは約１−約２０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
１つの態様においては，式５２，５３，５４，５５，５６，および５７を有する化合物は，カルボニルに隣接するそれぞれの窒素が，独立して，窒素に隣接するカルボニルと置き換えられることができるか，または窒素に隣接するそれぞれのカルボニルが，カルボニルに隣接する窒素と置き換えられることができることを特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式５８：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｙは，リンカー分子またはアミノ酸を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｖは，蛋白質またはペプチド，例えば，ヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチドを含み；各ｎは，独立して，約１−約５０の整数であり；およびＮ’は，約１−約１００の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式５９：
［式中，各Ｒ1は，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；各Ｒ2は，独立して，Ｏ，Ｓ，またはＮを含み；Ｘは，Ｈ，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，または酵素的核酸または他の生物学的に活性な分子を含み；ｎは約１−約５０の整数であり，Ｑは，Ｈまたは除去可能な保護基を含み，これは任意に存在しても存在しなくてもよく，各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，およびＶは，蛋白質またはペプチド，例えば，ヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチド，または式４５：
［式中，Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；およびｎは約１−約１００の整数である］
を有する化合物を含む］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式６０：
［式中，Ｒ1は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＴｒは，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチルであり；ｎは約１−約５０の整数であり；およびＲ8は，窒素保護基，例えば，フタロイル，トリフルオロアセチル，ＦＭＯＣ，またはモノメトキシトリチル基である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式６１：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは同一であっても異なっていてもよく，存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子であり，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｓは，独立して，蛋白質またはペプチド，例えば，ヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチドを含み；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，およびｎは約１−約１０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式６２：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｖは，独立して，蛋白質またはペプチド，例えば，ヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチドを含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，および各ｎは，独立して，約１−約１０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式６３：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｖは，蛋白質またはペプチド，例えば，ヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチドを含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，Ｒ4は，エステル，アミド，または保護基を表し，および各ｎは，独立して，約１−約１０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式６４：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，Ａは窒素含有基を含み，およびＢは親油性基を含む］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式６５：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，ＲＶは，式４７−５０のいずれかの脂質またはリン脂質成分を含み，およびＲ6は，窒素含有基を含む］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式９２：
［式中，Ｂは，Ｈ，ヌクレオシド塩基，または非ヌクレオシド性塩基を含み，保護基を有していても有していなくてもよく；各Ｒ1は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，生物学的に活性な分子または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｒ2は，Ｏ，ＮＨ，Ｓ，ＣＯ，ＣＯＯ，ＯＮ＝Ｃ，またはアルキルを含み；Ｒ3は，アルキル，アルコキシ，またはアミノアシル側鎖を含み；およびＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含む］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式８６：
［式中，Ｒ1は，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｒ2は，Ｈ，Ｏ，ＯＨ，アルキル，アルキルハロ，ハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，生物学的に活性な分子または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｒ3は，Ｏ，ＮＨ，Ｓ，ＣＯ，ＣＯＯ，ＯＮ＝Ｃ，またはアルキルを含み；Ｒ4は，アルキル，アルコキシ，またはアミノアシル側鎖を含み；およびＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，および各ｎは，独立して，約０−約２０の整数である］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式８７：
［式中，Ｘは，蛋白質，ペプチド，抗体，脂質，リン脂質，多糖類，標識，生物学的に活性な分子，例えば，ビタミン，例えば，葉酸，ビタミンＡ，Ｅ，Ｂ６，Ｂ１２，補酵素，抗生物質，抗ウイルス，核酸，ヌクレオチド，ヌクレオシド，またはオリゴヌクレオチド，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，またはポリマー，例えば，ポリエチレングリコールを含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；およびＹは，生物学的に活性な分子，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，ペプチド，蛋白質，または抗体を含み；Ｒ1は，Ｈ，アルキル，または置換アルキルを含む］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，本発明は，式８８：
［式中，Ｘは，蛋白質，ペプチド，抗体，脂質，リン脂質，多糖類，標識，生物学的に活性な分子，例えば，ビタミン，例えば，葉酸，ビタミンＡ，Ｅ，Ｂ６，Ｂ１２，補酵素，抗生物質，抗ウイルス，核酸，ヌクレオチド，ヌクレオシド，またはオリゴヌクレオチド，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，またはポリマー，例えば，ポリエチレングリコールを含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，およびＹは，生物学的に活性な分子，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，ペプチド，蛋白質，または抗体を含む］
を有する化合物を特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，式４８：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み；および各Ｂは，独立して，親油性基，例えば，飽和または不飽和の，直鎖，分枝鎖，または環状アルキル基を表す］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式６６：
［式中，Ｒ1は，式４８において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は，式４８において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，および各Ｒ5は，独立して，Ｏ，Ｎ，またはＳを含み，および各Ｒ6は，独立して，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチル基を含む］
を有する化合物を，式６７：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，およびＹはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物に，式６８：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；および各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，各Ｒ5は，独立して，Ｏ，Ｓ，またはＮを含み；および各Ｒ6は，独立して，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチル基を含む］
を有する化合物の形成に適した条件下で導入し；
（ｂ）式２６を有する化合物からＲ6を除去し；そして
（ｃ）式６９：
［式中，Ｒ1は，式４８において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は，式４８において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＷおよびＢは，式４８において定義したとおりである］
を有する化合物を，式４８を有する化合物の形成に適した条件下で，式６８を有する化合物に導入する，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式４９：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み；各Ｒ5は，独立して，Ｏ，Ｓ，またはＮを含み；および各Ｂは，独立して，親油性基，例えば，飽和または不飽和の直鎖，分枝鎖，または環状アルキル基を含む］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式７０：
［式中，Ｒ1は，式４９において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は，式４９において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，および各Ｒ5は，独立して，Ｏ，Ｓ，またはＮを含み，および各Ｂは，独立して，親油性基，例えば，飽和または不飽和の，直鎖，分枝鎖，または環状アルキル基を含む］
を有する化合物を，式６７：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，およびＹはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物と，式４９を有する化合物の形成に適した条件下でカップリングさせる工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式５２：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｙはリンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み；Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，ｎは約１−約２０の整数であり；およびＮ’は，約１−約２０の整数である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式７１：
［式中，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ5，ＳＧ，およびｎは，式５２において定義したとおりであり，およびＲ1は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ6は，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチル基を含む］
を有する化合物を，式７２：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み，およびＹはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物と，式９５：
を有する化合物の形成に適した条件下でカップリングさせ；
（ｂ）式９５を有する化合物からＲ6を除去し；そして，
（ｃ）式５２を有する化合物の形成に適した条件下で，任意に，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識をカップリングさせ，または任意に，式７１を有する化合物をカップリングさせ，および任意に，（ｂ）および（ｃ）を繰り返す，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式５３：
［式中，Ｂは，Ｈ，ヌクレオシド塩基，または非ヌクレオシド性塩基を含み，保護基を有していても有していなくてもよく；各Ｒ1は，独立して，Ｏ，Ｎ，Ｓ，アルキル，または置換Ｎを含み；各Ｒ2は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；各Ｒ3は，独立して，ＮまたはＯ−Ｎを含み，各Ｒ4は，独立して，Ｏ，ＣＨ2，Ｓ，スルホン，またはスルホキシを含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，各ｎは，独立して，約１−約５０の整数であり；およびＮ’は，約１−約１０の整数である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
式７３：
［式中，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｘ，Ｗ，Ｂ，Ｎ’およびｎは，式５３において定義したとおりである］
を有する化合物を，糖，例えば，式７４：
［式中，Ｙはリンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｌは，反応性化学基，例えば，ＮＨＳエステルを表し，および各Ｒ7は，独立して，アシル基，例えば，アセチル基を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物と，式５３を有する化合物の形成に適した条件下でカップリングする工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式５４：
［式中，Ｂは，Ｈ，ヌクレオシド塩基，または非ヌクレオシド性塩基を含み，保護基を有していても有していなくてもよく；各Ｒ1は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，生物学的に活性な分子または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含む］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式７５：
［式中，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｘ，Ｗ，およびＢは，式５３において定義したとおりである］
を有する化合物を，糖，例えば，式７４．
［式中，Ｙは，Ｃ１１アルキルリンカー分子を含み；Ｌは，反応性化学基，例えば，ＮＨＳエステルを表し，および各Ｒ7は，独立して，アシル基，例えば，アセチル基を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物と，式５４を有する化合物の形成に適した条件下でカップリングさせる工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式５５：
［式中，各Ｒ1は，独立して，Ｏ，Ｎ，Ｓ，アルキル，または置換Ｎを含み；各Ｒ2は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；各Ｒ3は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，またはハロを含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，または酵素的核酸または生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，各ｎは，独立して，約１−約５０の整数であり；およびＮ’は，約１−約１００の整数である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式７６：
［式中，Ｒ1は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は以下のいずれかの基：
を含むことができ，および各Ｒ3は，独立して，Ｈ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，またはハロを含み；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチルガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，およびｎは約１−約２０の整数である］
を有する化合物を，化合物
Ｘ−Ｗ
［式中，Ｘは，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，生物学的に活性な分子または標識を含み，およびＷはリンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
とカップリングさせ；そして
（ｂ）任意に，式５５を有する化合物の形成に適した条件下で工程（ａ）を繰り返す，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式５６：
［式中，Ｒ1は，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｒ2は，Ｈ，Ｏ，ＯＨ，アルキル，アルキルハロ，ハロ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；Ｘは，Ｈ，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，生物学的に活性な分子または標識を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，および各ｎは，独立して，約０−約２０の整数である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式７７：
［式中，各Ｒ1，Ｘ，Ｗ，およびｎは，式５６において定義したとおりである］
を有する化合物を，糖，例えば，式７４：
［式中，Ｙは，長さｎのアルキルリンカー分子を含み，ここで，ｎは約１−約２０の整数であり；Ｌは，反応性化学基，例えば，ＮＨＳエステルを表し，および各Ｒ7は，独立して，アシル基，例えば，アセチル基を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物にカップリングさせ；そして
（ｂ）任意に，
Ｘ−Ｗ
［式中，Ｘは，除去可能な保護基，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み，およびＷはリンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物を，式５６を有する化合物の形成に適した条件下でカップリングさせる，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式５７：
［式中，Ｒ1は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＴｒは，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチルであり；ＳＧは糖，例えば，ガラクトース，ガラクトースアミン，Ｎ−アセチル−ガラクトースアミン，グルコース，マンノース，フルクトース，またはフコースおよびそれぞれのＤまたはＬ，アルファまたはベータ異性体を含み，およびｎは約１−約２０の整数である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式７７：
［式中，Ｒ1およびＸはＨを含む］
を有する化合物を，糖，例えば，式７４：
［式中，Ｙは，長さｎのアルキルリンカー分子を含み，ここでｎは約１−約２０の整数であり；Ｌは，反応性化学基，例えば，ＮＨＳエステルを表し，および各Ｒ7は，独立して，アシル基，例えばアセチル基を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物とカップリングさせ；そして
（ｂ）トリチル基，例えば，ジメトキシトリチル，モノメトキシトリチル，またはトリチル基を（ａ）の生成物の一級ヒドロキシルに導入し；そして
（ｃ）式７８：
［式中，Ｒ1は以下のいずれかの基：
を含むことができ，および各Ｒ2およびＲ3は，独立して，以下のいずれかの基：
を含むことができる］
を有するリン含有基を，式５７を有する化合物の形成に適した条件下で，（ｂ）の生成物の二級ヒドロキシルに導入する，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式６０：
［式中，Ｒ1は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＴｒは，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチルであり；ｎは約１−約５０の整数であり；およびＲ8は，窒素保護基，例えば，フタロイル，トリフルオロアセチル，ＦＭＯＣ，またはモノメトキシトリチル基である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式７９：
［式中，ｎは約１−約５０の整数である］
を有する化合物に，式８０：
［式中，ｎは約１−約５０の整数であり，およびＲ7は，カルボン酸保護基，例えば，ベンジル基である］
を有する化合物の形成に適した条件下で，カルボキシ保護を導入し；
（ｂ）窒素含有基を，式８１：
［式中，ｎおよびＲ7は，式８０において定義したとおりであり，およびＲ8は，窒素保護基，例えば，フタロイル，トリフルオロアセチル，ＦＭＯＣ，またはモノメトキシトリチル基である］
を有する化合物の形成に適した条件下で，（ａ）の生成物に導入し；
（ｃ）（ｂ）の生成物からカルボン酸保護基を除去し，および式８２：
［式中，ｎおよびＲ8は，式８１において定義したとおりである］
を有する化合物の形成に適した条件下で，アミノプロパンジオールを導入し；
（ｄ）除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチルを，式８３：
［式中，Ｔｒ，ｎおよびＲ8は，式６０において定義したとおりである］
を有する化合物の形成に適した条件下で，（ｃ）の生成物に導入し；そして
（ｅ）式７８：
［式中，Ｒ1は以下のいずれかの基：
を含むことができ，および各Ｒ2およびＲ3は，独立して，以下のいずれかの基：
を含むことができる］
を有するリン含有基を，式６０を有する化合物の形成に適した条件下で，（ｄ）の生成物に導入する，
の各工程を含む方法。
別の態様においては，本発明は，式５９：
［式中，各Ｒ1は，独立して，Ｏ，Ｓ，Ｎ，置換Ｎ，またはリン含有基を含み；各Ｒ2は，独立して，Ｏ，Ｓ，またはＮを含み；Ｘは，Ｈ，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸または生物学的に活性な分子を含み；ｎは，約１−約５０の整数であり，Ｑは，Ｈまたは除去可能な保護基を含み，これは任意に存在していなくてもよく，各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，およびＶは，蛋白質またはペプチド，例えばヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチド，または式４５：
［式中，Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；およびｎは約１−約１００の整数である］
を有する化合物を含む］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式８４：
［式中，Ｑ，Ｘ，Ｗ，Ｒ1，Ｒ2，およびｎは，式５９において定義したとおりであり，およびＲ8は，窒素保護基，例えば，フタロイル，トリフルオロアセチル，ＦＭＯＣ，またはモノメトキシトリチル基である］
を有する化合物から，式８５：
［式中，Ｑ，Ｘ，Ｗ，Ｒ1，Ｒ2，およびｎは，式５９において定義したとおりである］
を有する化合物の形成に適した条件下でＲ8を除去し；
（ｂ）基Ｖ（ここで，Ｖは，蛋白質またはペプチド，例えば，ヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチド，または式４５：
［式中，Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；およびｎは約１−約１００の整数である］
を有する化合物を含む）
を，式５９を有する化合物の形成に適した条件下で，オキシム結合の形成により（ａ）の生成物に導入する，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式６４：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；各Ｗは，独立して，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，Ａは窒素含有基を含み，およびＢは親油性基を含む］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式６６：
［式中，Ｒ1は，式６４において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は，式６４において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，および各Ｒ5は，独立して，Ｏ，Ｎ，またはＳを含み，および各Ｒ6は，独立して，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチル基を含む］
を有する化合物を，式６７：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，およびＹはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよい］
を有する化合物に，式６８：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，Ｙはリンカー分子を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；および各Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，各Ｒ5は，独立して，Ｏ，Ｓ，またはＮを含み；および各Ｒ6は，独立して，除去可能な保護基，例えば，トリチル，モノメトキシトリチル，またはジメトキシトリチル基を含む］
を有する化合物の形成に適した条件下で導入し；
（ｂ）式６８を有する化合物からＲ6を除去し；そして
（ｃ）式６９：
［式中，Ｒ1は，式６４において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は，式６４において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ3，ＷおよびＢは，式６４において定義したとおりである］
を有する化合物を導入し；および式６９’：
［式中，Ｒ1は，式６４において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ2は，式４８において定義したとおりであり，以下のいずれかの基：
を含むことができ，およびＲ3，ＷおよびＡは，式６４において定義したとおりである］
を有する化合物を，式６４を有する化合物の形成に適した条件下で，式６８を有する化合物に導入する，
の各工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式６２：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗはリンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；各Ｒ5は，独立して，蛋白質またはペプチド，例えば，ヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチドを含み；各Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，および各ｎは，独立して，約１−約１０の整数である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式９３：
［式中，Ｖおよびｎは，式６２において定義したとおりである］
を有する化合物を，式８６：
［式中，Ｘ，Ｗ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびｎは，式６２において定義したとおりである］
を有する化合物に，式６２を有する化合物の形成に適した条件下で導入する工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式６３：
［式中，Ｘは，生物学的に活性な分子を含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｖは，蛋白質またはペプチド，例えば，ヒト血清アルブミン蛋白質，アンテナペディアペプチド，．カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド，Ｃａｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ Ｉｇ（５）軽鎖ペプチド，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１ペプチド，ＨＩＶ−１Ｔａｔペプチド，インフルエンザヘマグルチニンエンベロープ糖蛋白質ペプチド，またはトランスポータンＡペプチドを含み；各Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は，独立して，Ｏ，ＯＨ，Ｈ，アルキル，アルキルハロ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アルキルシアノ，Ｓ，Ｓ−アルキル，Ｓ−アルキルシアノ，Ｎまたは置換Ｎを含み，Ｒ4は，エステル，アミド，または保護基を表し，および各ｎは，独立して，約１−約１０の整数である］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式９６：
［式中，ＶおよびＲ4は，式６３において定義したとおりである］
を有する化合物を，式８６：
［式中，Ｘ，Ｗ，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，およびｎは，式６３において定義したとおりである］
を有する化合物に，式６３を有する化合物の形成に適した条件下で導入する工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式８７：
［式中，Ｘは，蛋白質，ペプチド，抗体，脂質，リン脂質，多糖類，標識，生物学的に活性な分子，例えば，ビタミン，例えば，葉酸，ビタミンＡ，Ｅ，Ｂ６，Ｂ１２，補酵素，抗生物質，抗ウイルス，核酸，ヌクレオチド，ヌクレオシド，またはオリゴヌクレオチド，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，またはポリマー，例えば，ポリエチレングリコールを含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；およびＹは，生物学的に活性な分子，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，ペプチド，蛋白質，または抗体を含み；Ｒ1は，Ｈ，アルキル，または置換アルキルを含む］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式８９：
［式中，Ｙ，ＷおよびＲは，式８７において定義したとおりである］
を有する化合物を，式９０：
［式中，Ｘは，式８７において定義したとおりである］
を有する化合物と，式８７を有する化合物の形成に適した条件下で，例えば，式８９を有する化合物を式９０を有する化合物（ここで，化合物９０のＸは酵素的核酸分子を含み，および式８９のＹはペプチドを含む）と，合成後コンジュゲーションすることにより，カップリングさせる工程を含む。
別の態様においては，本発明は，式８８：
［式中，Ｘは，蛋白質，ペプチド，抗体，脂質，リン脂質，多糖類，標識，生物学的に活性な分子，例えば，ビタミン，例えば，葉酸，ビタミンＡ，Ｅ，Ｂ６，Ｂ１２，補酵素，抗生物質，抗ウイルス，核酸，ヌクレオチド，ヌクレオシド，またはオリゴヌクレオチド，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，またはポリマー，例えば，ポリエチレングリコールを含み；Ｗは，リンカー分子または化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく，およびＹは，生物学的に活性な分子，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，ペプチド，蛋白質，または抗体を含む］
を有する化合物を合成する方法を特徴とし，該方法は，
（ａ）式９１：
［式中，ＹおよびＷは，式８８において定義したとおりである］
を有する化合物を，式９０：
［式中，Ｘは，式８８において定義したとおりである］
を有する化合物と，式８８を有する化合物の形成に適した条件下で，例えば，式９１を有する化合物と式９０を有する化合物（式中，化合物９０のＸは酵素的核酸分子を含み，および式９１のＹはペプチドを含む）とを合成後コンジュゲーションすることにより，カップリングさせる工程を含む。
１つの態様においては，本発明は，式９４：
［式中，Ｘは，蛋白質，ペプチド，抗体，脂質，リン脂質，多糖類，標識，生物学的に活性な分子，例えば，ビタミン，例えば，葉酸，ビタミンＡ，Ｅ，Ｂ６，Ｂ１２，補酵素，抗生物質，抗ウイルス，核酸，ヌクレオチド，ヌクレオシド，またはオリゴヌクレオチド，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，またはポリマー，例えば，ポリエチレングリコールを含み；各Ｙは，独立して，リンカーまたは化学結合を含み，これは存在しても存在しなくてもよく；Ｗは，生物分解性核酸リンカー分子を含み，およびＺは，生物学的に活性な分子，例えば，酵素的核酸，アロザイム，アンチセンス核酸，ｓｉＲＮＡ，２，５−Ａキメラ，デコイ，アプタマーまたはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド，ペプチド，蛋白質，または抗体を含む］
を有する化合物を特徴とする。
別の態様においては，式９４を有する本発明の化合物のＷは，５’−シチジン−デオキシチミジン−３’，５’−デオキシチミジン−シチジン−３’，５’−シチジンデオキシウリジン−３’，５’−デオキシウリジン−シチジン−３’，５’−ウリジン−デオキシチミジン−３’，または５’−デオキシチミジン−ウリジン−３’を含む。
さらに別の態様においては，式９４を有する本発明の化合物のＷは，５’−アデノシン−デオキシチミジン−３’，５’−デオキシチミジン−アデノシン−３’，５’−アデノシン−デオキシウリジン−３’，または５’−デオキシウリジン−アデノシン−３’を含む。
別の態様においては，式９４を有する本発明の化合物のＹは，リン含有結合，ホスホルアミデート結合，ホスホジエステル結合，ホスホロチオエート結合，アミド結合，エステル結合，カルバメート結合，ジスルフィド結合，オキシム結合，またはモルホリノ結合を含む。
別の態様においては，式８９および９１を有する本発明の化合物は，ペプチドまたは蛋白質のＮ末端セリンまたはトレオニン残基の過ヨウ素酸酸化により合成される。
１つの態様においては，式４３，４４，４６−５２，５８，６１−６５，８５−８８，９２，９４，および９５を有する本発明の化合物のＸは酵素的核酸を含む。
別の態様においては，式４３，４４，４６−５２，５８，６１−６５，８５−８８，９２，９４，および９５を有する本発明の化合物のＸは抗体を含む。さらに別の態様においては，式４３，４４，４６−５２，５８，６１−６５，８５−８８，９２，９４，および９５を有する本発明の化合物のＸはインターフェロンを含む。
別の態様においては，式４３，４４，４６−５２，５８，６１−６５，８５−８８，９２，９４，および９５を有する本発明の化合物のＸは，アンチセンス核酸，ｄｓＲＮＡ，ｓｓＲＮＡ，デコイ，トリプレックスオリゴヌクレオチド，アプタマー，または２，５−Ａキメラを含む。
１つの態様においては，式４３，４４，４６−５６，５８−５９，６１−６５，６７，６８，６９，７２，７３，７５，７７，８４−８９，９１−９２，９４，および９５を有する本発明の化合物のＷおよび／またはＹは，分解性または切断性リンカー，例えば，リボヌクレオチドおよび／またはデオキシヌクレオチドを含む核酸配列，例えば，ダイマー，トリマー，またはテトラマーを含む。核酸切断可能リンカーの非限定的例は，アデノシン−デオキシチミジン（Ａ−ｄＴ）ダイマーまたはシチジン−デオキシチミジン（Ｃ−ｄＴ）ダイマーである。さらに別の態様においては，式４３，４４，４８−５１，５８，６３−６５，および９６を有する本発明の化合物のＷおよび／またはＶは，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル結合，オキシム結合，ジスルフィド結合，ホスホルアミデート，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，ホスホジエステル結合，またはＮＨＣ（Ｏ），ＣＨ３ＮＣ（Ｏ），ＣＯＮＨ，Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３，Ｓ，ＳＯ，Ｓ０２，Ｏ，ＮＨ，ＮＣＨ３基を含む。別の態様においては，式４３，４４，４６−５６，５８−５９，６１−６５，６７，６８，６９，７２，７３，７５，７７，８４８９，９１−９２，９４，および９５を有する本発明の化合物の分解性リンカー，Ｗおよび／またはＹは，カルボキシペプチダーゼ活性による切断に感受性のリンカーを含む。
別の態様においては，式４３，４４，４６−５６，５８−５９，６１−６５，６７，６８，６９，７２，７３，７５，７７，８４−８９，９１−９２，９４，および９５のＷおよび／またはＹは，式４５：
［式中，Ｚは，Ｈ，ＯＨ，Ｏ−アルキル，ＳＨ，Ｓ−アルキル，アルキル，置換アルキル，アリール，置換アリール，アミノ，置換アミノ，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，オリゴヌクレオチド，アミノ酸，ペプチド，蛋白質，脂質，リン脂質，または標識を含み；およびｎは約１−約１００の整数である］
を有するポリエチレングリコールリンカーを含む。
１つの態様においては，本発明の核酸コンジュゲートは，例えば，自動化ペプチド合成機，例えば，Ｍｉｌｉｇｅｎ ９０５０合成機で，および／または自動化オリゴヌクレオチド合成機，例えば，ＡＢＩ ３９４，３９０Ｚ，またはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ，Ｏｌｉｇｏ Ｍａｘ，またはＡＫＴＡ合成機で，固相合成により組み立てる。別の態様においては，本発明の核酸コンジュゲートは，合成後に，例えば，固相オリゴヌクレオチド合成後に組み立てる（例えば，図１５を参照）。
別の態様においては，式５８−６３および９６を有する化合物のＶは，配列番号１４−２３（表３）を有するペプチドを含む。
１つの態様においては，本発明の核酸コンジュゲートは，合成後に，例えば，固相オリゴヌクレオチド合成後に組み立てる。
本発明は，ヌクレオシド性および非ヌクレオシド性誘導体を含む組成物およびコンジュゲートを提供する。本発明はまた，核酸，ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体，例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡ，およびＰＮＡに基づくコンジュゲートを提供する。本発明の化合物の，ヌクレオシド，ヌクレオチド，非ヌクレオシド，および核酸分子への結合は，分子中の任意の位置で，例えば，ヌクレオチド間結合，ヌクレオシド性糖ヒドロキシル基，例えば５’，３’，および２’−ヒドロキシル，および／または核酸塩基の位置，例えばアミノおよびカルボニル基において行うことができる。
本発明の例示的コンジュゲートは本明細書に記載される式の化合物として記述されるが，他のペプチド，蛋白質，リン脂質，およびポリアルキルグリコール誘導体が本発明により提供され，これには例えば，式１−９６の化合物の種々の類似体，例えば，限定されないが，本明細書に記載される化合物の別の異性体が含まれる。
１つの態様においては，本発明は，例えば，非ヌクレオシド性小分子，ヌクレオシド，ヌクレオチド，および核酸分子，例えば，酵素的核酸分子，アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレックスオリゴヌクレオチド，デコイ，ｓｉＲＮＡ，アロザイム，アプタマー，およびＲＮＡ切断化学基を含有するアンチセンス核酸の，分子，組成物およびコンジュゲートを特徴とする。
本発明の例示的葉酸コンジュゲートは，本明細書に記載される式により示される化合物として記述されるが，他の葉酸および葉酸拮抗剤誘導体が本発明により提供され，これには例えば，本発明の式の種々の葉酸類似体，例えば，ジヒドロ葉酸，テトラヒドロ葉酸，テトラヒドロプテリン，葉酸，プテロポリグルタミン酸，１−デアザ，３−デアザ，５−デアザ，８−デアザ，１０−デアザ，１，５−デアザ，５，１０−ジデアザ，８，１０−ジデアザ，および５，８−ジデアザ葉酸，葉酸拮抗剤，およびプテロイン酸が含まれる。本明細書において用いる場合，"葉酸"との用語は，葉酸および葉酸誘導体，例えば，プテロイン酸誘導体および類似体を表すことを意味する。
本発明は，生物学的システム，例えば細胞内に分子をデリバリーすることを容易にするための組成物およびコンジュゲートを特徴とする。本発明により提供されるコンジュゲートは，治療用化合物を細胞膜を超えて輸送することにより，治療的活性を付与することができる。本発明は，分子，例えば，限定されないが，小分子，脂質，ヌクレオシド，ヌクレオチド，核酸，負に荷電したポリマーおよび他のポリマー，例えば，蛋白質，ペプチド，炭水化物，またはポリアミン等をデリバリーするための，新規薬剤の設計および合成を包含する。一般に，本明細書に記載されるトランスポーターは，独立して，または多成分系の一部として用いるよう設計される。本明細書の式により一般的に示される本発明の化合物は，血清の存在下または非存在下で，異なる組織に由来する多くの種類の細胞内への分子のデリバリーを改良すると予測される。
別の態様においては，本発明は，遺伝子，例えば，癌の進行および／または維持，あるいはウイルス感染に関与する遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。例えば，１つの態様においては，本発明は，１またはそれ以上の核酸に基づく分子および方法を，独立してまたは組み合わせて用いて，癌性状態に関連する蛋白質をコードする遺伝子，例えば，乳癌，肺癌，結腸直腸癌，脳癌，食道癌，胃癌，膀胱癌，膵臓癌，子宮頚癌，頭頚部癌，卵巣癌，黒色腫，リンパ腫，神経膠腫，または多剤耐性癌に関連する遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。
別の態様においては，本発明は，核酸に基づく１またはそれ以上の分子および方法を，独立してまたは組み合わせて用いて，ウイルス蛋白質をコードする遺伝子，例えば，ＨＩＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＣＭＶ，ＲＳＶ，ＨＳＶ，ポリオウイルス，インフルエンザ，ライノウイルス，西ナイル熱ウイルス，エボラウイルス，口蹄疫ウイルス，およびパピローマウイルスに関連する遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。
１つの態様においては，本発明は，式１−９６の化合物を含む酵素的核酸分子コンジュゲートを，好ましくはハンマーヘッド，ＮＣＨ，Ｇ切断剤，アンバーザイム，チンザイムおよび／またはＤＮＡザイムモチーフの形で用いて，癌およびウイルスに関連する遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。
別の態様においては，本発明は，酵素的核酸分子をコンジュゲートとして用いることを特徴とする。これらの酵素的核酸は，生理学的条件下で，ＲＮＡのホスホジエステル結合をトランスで加水分解することを触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しうる）。表Ｉは，これらの酵素的核酸の特性のいくつかをまとめたものである。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが，一般に，酵素的核酸は，まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接して保持された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核酸は，まず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いったん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そのＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断することができる。すなわち，１つの酵素的核酸分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらに，酵素的核酸は，高度に特異的な遺伝子発現の阻害剤であり，その阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマッチまたは塩基置換は，酵素的核酸の触媒活性を完全に排除することができる。
本明細書に記載される本発明の好ましい態様の１つにおいては，コンジュゲートの酵素的核酸分子成分はハンマーヘッドまたはヘアピンのモチーフで形成されるが，デルタ肝炎ウイルス，グループＩイントロン，グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列を伴う），Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ，ＤＮＡザイム，ＮＣＨ切断モチーフ，またはＧ切断剤のモチーフで形成してもよい。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は，Ｄｒｅｙｆｕｓ，（上掲），Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８，１８３に記載されている。ヘアピンモチーフの例は，Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，１９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，４９２９，Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ８２，５３，Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３，Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，２９９，Ｃｈｏｗｒｉｒａ ＆ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，米国特許５，６３１，３５９に記載されている。デルタ肝炎ウイルスモチーフは，Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３１，１６により；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は，Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｃｅｌｌ ３５，８４９；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，７８３；Ｌｉ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，１９９６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，８３５に記載されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは，Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０ Ｃｅｌｌ ６１，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８，８８２６−８８３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，１９９３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３２，２７９５−２７９９；Ｇｕｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６３）に記載されている。グループＩＩイントロンは，Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，７６１；Ｍｉｃｈｅｌｓ ａｎｄ Ｐｙｌｅ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，２９６５；Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／２２６８９に記載されている。グループＩイントロンは，Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１に記載されている。ＤＮＡザイムは，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１３０４；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＮＡＲ ２３，４０９２；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２，６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ９４，４２６２，およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／５５８５７に記載されている。ＮＣＨ切断モチーフの例は，Ｌｕｄｗｉｇ＆Ｓｐｒｏａｔ，国際公開ＷＯ９８／５８０５８に記載され，およびＧ切断剤の例は，Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６，４１１６−４１２０，およびＥｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／１６８７１に記載されている。さらに別のモチーフには，アプタザイム（Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／４３９９３），アンバーザイム（クラスＩモチーフ；図３；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願０９／３０１，５１１）およびチンザイム（図４；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願０９／３０１，５１１）が含まれる。これらの文献はすべて，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用し，本発明において用いることができる。これらの特定のモチーフは本発明において限定的なものではなく，当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，それが標的遺伝子のＲＮＡ領域の１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつその基質結合部位の中または周辺に，分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することのみであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ，米国特許４，９８７，０７１）。
本発明の１つの態様においては，本発明のコンジュゲートの核酸分子成分は，１２−１００ヌクレオチドの長さでありうる。例えば，本発明の酵素的核酸分子は，好ましくは１５−５０ヌクレオチドの長さであり，より好ましくは２５−４０ヌクレオチドの長さ，例えば，３４，３６，または３８ヌクレオチドの長さである（例えば，Ｊａｒｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９１０７−２９１１２を参照）。本発明の例示的ＤＮＡザイムは，好ましくは１５−４０ヌクレオチドの長さであり，より好ましくは２５−３５ヌクレオチドの長さ，例えば，２９，３０，３１，または３２ヌクレオチドの長さである（例えば，Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１３３３０−１３３４２；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，４０９２−４０９６を参照）。本発明の例示的アンチセンス分子は，好ましくは１５−７５ヌクレオチドの長さであり，より好ましくは２０−３５ヌクレオチドの長さ，例えば，２５，２６，２７，または２８ヌクレオチドの長さである（例えば，Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ．，８９，７３０５−７３０９；Ｍｉｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，５３７−５４１を参照）。本発明の例示的トリプレックス形成オリゴヌクレオチド分子は，好ましくは１０−４０ヌクレオチドの長さであり，より好ましくは１２−２５ヌクレオチドの長さ，例えば，１８，１９，２０，または２１ヌクレオチドの長さである（例えば，Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，８８２０−８８２６；Ｓｔｒｏｂｅｌ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７３−７５を参照）。当業者は，核酸分子について必要なことは，核酸分子が本明細書において企図される反応を触媒するのに十分な長さおよび適したコンフォメーションであることのみであることを理解するであろう。本明細書に記載され例示される核酸分子の長さは，記載される一般的サイズの範囲内に限定されない。
本発明のコンジュゲートは，直接加えてもよく，またはカチオン性脂質と複合体化して，リポソーム中に封入して，または他の方法により，標的細胞または組織にデリバリーすることができる。コンジュゲートおよび／またはコンジュゲート複合体は，関連する組織にエクスビボで，または注射，注入ポンプまたはステントを用いてインビボで，バイオポリマー中に取り込ませてまたは取り込ませずに，局所的に投与することができる。本発明の組成物およびコジュゲートは，独立して，または他の薬剤と組み合わせてもしくは一緒に，上述した疾病または状態の治療に用いることができる。例えば，病原性蛋白質のレベルに関連する疾病または状態を治療するために，当業者には明らかなように，独立して，または治療に適した条件下で１またはそれ以上の薬剤と組み合わせて，患者を治療してもよく，または他の適当な細胞を処理してもよい。
さらに別の態様においては，本明細書に記載される分子は，他の既知の治療と組み合わせて，上述した状態または疾病の治療に用いることができる。例えば，本明細書に記載される分子は，１またはそれ以上の既知の治療薬と組み合わせて，乳，肺，前立腺，結腸直腸，脳，食道，膀胱，膵臓，子宮頚部，頭頚部，および卵巣癌，黒色腫，リンパ腫，神経膠腫，多剤耐性癌，および／またはＨＩＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＣＭＶ，ＲＳＶ，ＨＳＶ，ポリオウイルス，インフルエンザ，ライノウイルス，西ナイル熱ウイルス，エボラウイルス，口蹄疫ウイルス，およびパピローマウイルス感染の治療に用いることができる。
別の態様に含まれるものは，種々の細胞タイプにおける負に荷電した分子の細胞への取り込みおよび貫膜透過性を増強する，１またはそれ以上の本発明の式１−９６の化合物を含む一連のマルチドメイン細胞輸送ベヒクル（ＭＣＴＶ）である。本発明の化合物を，単独で，または中性または負の荷電を有する他の化合物，例えば，限定されないが，中性脂質および／またはターゲティング成分との組み合わせで用いて，処方またはコンジュゲートが予め決められた化合物または分子を細胞にデリバリーしターゲティングする効率を改良することができる。本発明の別の態様は，他の非透過性および／または親油性化合物の細胞内への輸送を増加させるためのこれらの化合物の用途を包含する。ターゲティング成分には，細胞表面レセプターに対するリガンド，例えば，ペプチドおよび蛋白質，糖脂質，脂質，炭水化物，およびこれらの合成版，例えば葉酸レセプターが含まれる。
別の態様においては，本発明の化合物は，脂質凝集物，例えば，デリバリーされるべき所定の分子を封入したリポソームの表面成分として提供される。リポソームは，一層でも多層でもよく，封入された物質を種々のメカニズムにより細胞内に導入することができる。例えば，リポソームは細胞膜と融合することにより，その中に封入された物質を細胞の細胞質内に直接導入することができる。あるいは，リポソームは，酸性小胞（すなわちエンドソーム）中にコンパートメント化されることができ，その内容物はリポソームから放出され，酸性小胞から細胞の細胞質内に放出される。
１つの態様においては本発明は，本明細書に記載される化合物の脂質凝集物処方，例えば，ホスファチジルコリン（種々の鎖長のもの；例えば，卵黄ホスファチジルコリン），コレステロール，カチオン性脂質，および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を特徴とする。この脂質凝集物のカチオン性脂質成分は，当該技術分野において知られるカチオン性脂質，例えば，ジオレオイル−１，２，−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）であることができる。別の態様においては，このカチオン性脂質凝集物は，本明細書の式のいずれかにより記載される共有結合した化合物を含む。
別の態様においては，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を本発明の化合物に共有結合で結合させる。結合させるＰＥＧは任意の分子量でありうるが，好ましくは，２０００−５０，０００ダルトンである。
本発明の化合物および方法は，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸分子，脂質，ペプチド，蛋白質，および／または非ヌクレオシド性小分子を細胞内に導入するのに有用である。例えば，本発明は，対応する作用の標的部位が細胞内に存在する場合に，ヌクレオチド，ヌクレオシド，核酸，脂質，ペプチド，蛋白質，および／または非ヌクレオシド性小分子デリバリーを導入するのに有用である。
１つの態様においては，本発明の化合物は，細胞レセプター，例えば高親和性葉酸レセプターおよびＡＳＧＰｒレセプターと相互作用することができる分子のコンジュゲートを提供し，コンジュゲート化化合物の生物学的膜を超えた有効なデリバリーおよび続く放出を可能とする多くの特徴を提供する。化合物は，細胞レセプターと優先的に相互作用しうる長さの，レセプターリガンドとデリバリーすべき化合物との間の化学結合を利用する。さらに，リガンドとデリバリーすべき化合物との間の化学結合は，例えば，ヒドロキシル基等の求核基に近接したリン酸結合を用いることにより，分解性結合であるように設計することができる。ｐＨまたはヌクレアーゼとの相互作用の結果としてのヒドロキシル基または同等の基の脱保護により，リン酸の求核性攻撃が生じ，環状リン酸中間体が生じ，これを加水分解することができる。この切断メカニズムは，塩基またはＲＮＡヌクレアーゼの存在下におけるＲＮＡ切断と類似する。あるいは，種々の因子，例えばＵＶ照射，細胞ヌクレアーゼ，ｐＨ，温度等に応答する他の分解性結合を選択することができる。分解性結合を使用することにより，デリバリーされた化合物を所定の系で，例えば，細胞の細胞質または特定の細胞オルガネラにで放出することが可能となる。
本発明はまた，目的とする化合物および分子に容易にコンジュゲートすることができるリガンド誘導化ホスホルアミダイトを提供する。本発明のホスホルアミダイト化合物を用いることにより，核酸ホスホルアミダイト種を足場として用いずに，コンジュゲートを目的とする分子に直接結合させることができる。このように，ホスホルアミダイト化学を用いて，他の縮合反応，例えば，核酸のアミノ基，例えば，アデノシンのＮ６位または２’−デオキシ−２’−アミノ官能基へのリガンドの縮合を必要とすることなく，本発明の化合物を目的とする化合物に直接カップリングさせることができる。さらに，本発明の化合物は，非核酸系のコンジュゲート化した結合をオリゴヌクレオチド内に導入するために用いることができ，これは，オリゴヌクレオチド合成の間に，核酸に基づくホスホルアミダイトを使用することにより，効率的なカップリングを行うことができる。この改良されたカップリングは，ペンダントアルキル結合を有する無塩基または非ヌクレオシド性足場の改良された立体的要件を考慮することができる。
三リン酸基を利用する本発明の化合物は，コンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド内への酵素的取込に用いることができる。そのような酵素的取込は，コンジュゲートが合成後酵素的コンジュゲーションまたは選択反応において用いられる場合に有用である（例えば，Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１０，１２９９−１３０２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＮＡＲ．，２９，１５６５−１５７３；Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，４２６２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ３，９１４；Ｎａｋａｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，（上掲）；Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，６４９５；Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４，６６９を参照）。
本発明の化合物は，生物系，例えば，組織，細胞または細胞溶解物中における標的分子の存在を検出するために用いることができる。標的分子の例には，核酸，蛋白質，ペプチド，抗体，多糖類，脂質，ホルモン，糖，金属，微生物または細胞代謝産物，被検体，医薬品，およびサンプル中の他の有機および無機分子または他の生物分子が含まれる。本発明の化合物は，系において標的分子と相互作用し，検出可能なシグナルまたは応答を生ずることができる所定の化合物または分子とコンジュゲート化することができる。これらの用途に用いることができる，当該技術分野において知られる種々の化合物および分子には，限定されないが，抗体，標識抗体，アロザイム，アプタマー，標識核酸プローブ，分子ビーコン，蛍光分子，放射性同位体，多糖類，および標的分子と相互作用して，標的相互作用に際して検出可能なシグナルを生成する任意の他の化合物が含まれる。例えば，そのような化合物は，Ｎａｓｓｉｍ ＵｓｍａｎおよびＪａｍｅｓ Ａ．ＭｃＳｗｉｇｇｅｎを発明者とする米国特許出願０９／８００，５９４（表題"ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＮＳＯＲ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ"，２００１年３月６日出願；未譲渡；代理人書類番号ＭＢＨＢ００−８１６−Ａ７００．００１）（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
本明細書において用いる場合，"生物分解性核酸リンカー分子"との用語は，１つの分子を別の分子，例えば，生物学的に活性な分子に接続するための生物分解性リンカーとして設計される核酸分子を表す。生物分解性核酸リンカー分子の安定性は，リボヌクレオチド，デオキシリボヌクレオチド，および化学的に修飾されたヌクレオチド，例えば，２’−Ｏ−メチル，２’−フルオロ，２’−アミノ，２’−Ｏ−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−Ｏ−アリル，および他の２’−修飾または塩基修飾ヌクレオチドの種々の組み合わせを用いることにより改変することができる。生物分解性核酸リンカー分子は，ダイマー，トリマー，テトラマー，またはより長い核酸分子，例えば，約２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，または２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであることができ，またはリンに基づく結合，例えば，ホスホルアミデートまたはホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含むことができる。生物分解性核酸リンカー分子はまた，核酸骨格，核酸糖，または核酸塩基修飾を含むことができる。
本明細書において用いる場合，"生物分解性"との用語は，生物系における分解，例えば酵素的分解または化学的分解を表す。
本明細書において用いる場合，"生物学的に活性な分子"との用語は，系において生物学的応答を導き出すかまたは調節することができる化合物または分子を表す。本発明により企図される生物学的に活性な分子の非限定的例としては，治療上活性な分子，例えば，抗体，ホルモン，抗ウイルス剤，ペプチド，蛋白質，化学療法剤，小分子，ビタミン，補因子，ヌクレオシド，ヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，酵素的核酸，アンチセンス核酸，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，２，５−Ａキメラ，ｓｉＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ，アロザイム，アプタマー，デコイおよびこれらの類似体が含まれる。本発明の生物学的に活性な分子には，他の生物学的に活性な分子の薬物動態学および／または薬力学を調節することができる分子，例えば，脂質およびポリマー，例えば，ポリアミン，ポリアミド，ポリエチレングリコールおよび他のポリエーテルも含まれる。
本明細書において用いる場合，"リン脂質"との用語は，少なくとも１つのリン基を含む疎水性分子を表す。例えば，リン脂質は，リン含有基および，ＯＨ，ＣＯＯＨ，オキソ，アミン，または置換もしくは未置換アリール基で任意に置換されていてもよい飽和または不飽和アルキル基を含むことができる。
本明細書において用いる場合，"窒素含有基"との用語は，窒素または置換窒素を含む任意の化学基または成分を表す。窒素含有基の非限定的例には，アミン，置換アミン，アミド，アルキルアミン，アミノ酸（例えばアルギニンまたはリジン），ポリアミン（例えばスペルミンまたはスペルミジン），環状アミン，例えばピリジン，ピリミジン（例えば，ウラシル，チミン，およびシトシン），モルホリン，フタルイミドおよび複素環アミン，例えばプリン（例えばグアニンおよびアデニン）が含まれる。
本明細書において用いる場合，"標的分子"との用語は，核酸分子，蛋白質，ペプチド，抗体，多糖類，脂質，糖，金属，微生物または細胞代謝産物，被検体，医薬品，および系に存在する他の有機および無機分子を表す。
"阻害する"または"ダウンレギュレートする"とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡまたは同等のＲＮＡのレベル，または１またはそれ以上の蛋白質サブユニット（例えば病原性蛋白質，ウイルス蛋白質または癌関連蛋白質サブユニット）の活性が，本発明の化合物または化合物の組み合わせの非存在下において観察されるものより減少していることを意味する。１つの態様においては，酵素的核酸分子による阻害またはダウンレギュレーションは，好ましくは，標的ＲＮＡの同じ部位に結合しうるがそのＲＮＡを切断することができない酵素的に不活性なまたは減弱化分子の存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害またはダウンレギュレーションは，好ましくは，例えば，スクランブル化配列またはミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，本発明の化合物によるウイルスまたは発癌性ＲＮＡ，蛋白質，または蛋白質サブユニットの阻害またはダウンレギュレーションは，化合物の存在下でその非存在下におけるより大きい。
"アップレギュレートする"とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡまたは同等のＲＮＡのレベル，またはウイルスまたは発癌性蛋白質サブユニット等の１またはそれ以上の蛋白質サブユニットの活性が，本発明の化合物または化合物の組み合わせの非存在下で観察されるより高いことを意味する。例えば，遺伝子発現の非存在または低いレベルにより引き起こされるかまたは悪化する病原性状態を治療，予防，軽減または改変するために，ウイルスまたは癌関連遺伝子等の遺伝子の発現を増加させることができる。
"調節する"とは，遺伝子の発現，または１またはそれ以上の蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡまたは同等のＲＮＡのレベル，または蛋白質（例えば，ウイルスまたは癌関連蛋白質）の１またはそれ以上の蛋白質サブユニットの活性が，本発明の化合物または化合物の組み合わせの非存在下で観察されるより，発現，レベル，または活性が高いかまたは低いように，アップレギュレートまたはダウンレギュレートされることを意味する。
本明細書において用いる場合，"酵素的核酸分子"との用語は，特定の遺伝子標的の基質結合領域において相補性を有し，かつ標的ＲＮＡを特異的に切断する作用をする酵素的活性を有する核酸分子を表す。すなわち，酵素的核酸分子は，分子間でＲＮＡを切断し，このことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。このような相補的領域は，酵素的核酸分子が標的ＲＮＡに十分にハイブリダイズし，したがって切断が起こることを可能にする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性もまた本発明において有用である（例えば，Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２０９２−２０９６；Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｉａｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５−３１を参照）。核酸は塩基，糖および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は，リボザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，アプタザイムまたはアプタマー結合リボザイム，制御可能リボザイム，触媒的オリゴヌクレオチド，ヌクレオザイム，ＤＮＡザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エンドヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素のような句と相互交換的に使用される。これらすべての用語は酵素的活性を有する核酸分子を記述する。本出願に記載されている特定の酵素的核酸分子は本発明において限定的なものではない。当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，１またはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつ分子に核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を基質結合部位内または周辺に有することであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１，Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＪＡＭＡ ２６０：２０ ３０３０）。
本明細書において用いる場合，"核酸分子"との用語は，ヌクレオチドを有する分子を表す。核酸は，一本鎖，二本鎖または多数の鎖であることができ，修飾または非修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはこれらの種々の混合物および組み合わせを含むことができる。
本明細書において用いる場合，"酵素的部分"または"触媒ドメイン"との用語は，その酵素的核酸分子の核酸基質の切断に必須の部分／領域を表す（例えば図１を参照）。
本明細書において用いる場合，”基質結合アーム”または”基質結合ドメイン”との用語は，その基質の一部分に相補的な（即ち，塩基対を形成できる）酵素的核酸の部分／領域を表す。好ましくは，そのような相補性は１００％であるが，所望の場合にはそれ未満でもよい。例えば，１４の内の１０程度でも塩基対を形成しうる（例えば，Ｗｅｍｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２０９２−２０９６；Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５−３１を参照）。そのようなアームの例は一般に図１−４に示される。すなわち，これらのアームは，相補的塩基対形成相互作用により酵素的核酸と標的ＲＮＡとを一緒にすることが意図される配列を酵素的核酸に含む。本発明の酵素的核酸は連続または非連続的な，種々の長さの結合アームを有していてもよい。結合アームの長さは，好ましくは４ヌクレオチド以上であり標的ＲＮＡと安定に相互作用するのに十分な長さであり，特に，１２−１００ヌクレオチド；より特別には１４−２４ヌクレオチドの長さである（例えば，Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，上掲，Ｈａｍｍａｎ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７；Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２，２５６７−７３を参照）。２つの結合アームが選択される場合，結合アームの長さは対称的（即ち，各々の結合アームは同じ長さである；例えば，５および５ヌクレオチド，６および６ヌクレオチドまたは７および７ヌクレオチド長）または非対称的（即ち，結合アームは異なった長さである；例えば，６および３ヌクレオチド；３および６ヌクレオチド長；４および５ヌクレオチド長；４および６ヌクレオチド長；４および７ヌクレオチド長など）であるように設計される。
本明細書において用いる場合，"イノザイム"または"ＮＣＨ"モチーフとの用語は，図１にＮＣＨＲｚとして一般的に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を表す。イノザイムは，切断トリプレットＮＣＨ／（式中，Ｎはヌクレオチドであり，Ｃはシチジンであり，Ｈはアデノシン，ウリジンまたはシチジンであり，／は切断部位を表す）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する。イノザイムはまた，切断トリプレットＮＣＮ／（式中，Ｎはヌクレオチドであり，Ｃはシチジンであり，／は切断部位を表す）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する。図２中の"Ｉ"は，イノシンヌクレオチドであり，好ましくはリボイノシンまたはキシロイノシンヌクレオシドである。
本明細書において用いる場合，"Ｇ切断剤"モチーフとの用語は，図１にＧ切断剤Ｒｚとして一般的に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を表す。Ｇ切断剤は，切断トリプレットＮＹＮ／（式中，Ｎはヌクレオチドであり，Ｙはウリジンまたはシチジンであり，／は切断部位を表す）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｇ切断剤は，図２に一般的に示されるように化学的に修飾することができる。
本明細書において用いる場合，"アンバーザイム"モチーフとの用語は，図２に一般的に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を表す。アンバーザイムは，切断トリプレットＮＧ／Ｎ（式中，Ｎはヌクレオチドであり，Ｇはグアノシンであり，／は切断部位を表す）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する。アンバーザイムは，図３に一般的に示されるように置換により化学的に修飾してヌクレアーゼ安定性を高めることができる。さらに，異なるヌクレオシドおよび／または非ヌクレオシドリンカーを用いて，モチーフの５’−ｇａａａ−３’ループを置き換えることができる。アンバーザイムは，活性のためにそれ自身の核酸配列の中にリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基を必要としない酵素的核酸分子の非限定的例である。
本明細書において用いる場合，"チンザイム"モチーフとの用語は，図３に一般的に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を表す。チンザイムは，切断トリプレット，例えば，限定されないが，ＹＧ／Ｙ（式中，Ｙはウリジンまたはシチジンであり，Ｇはグアノシンであり，／は切断部位を表す）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する。チンザイムは，図３に一般的に示されるように置換により化学的に修飾して，種々の置換，例えば，２’−Ｏ−メチルグアノシンヌクレオチドでグアノシンヌクレオチドを置き換えることにより，ヌクレアーゼ安定性を高めることができる。さらに，異なるヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーを用いて，図に示される５’−ｇａａａ−２’ループを置き換えることができる。チンザイムは，活性のためにそれ自身の核酸配列中にリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基を必要としない酵素的核酸分子の非限定的例である。
本明細書において用いる場合，’ＤＮＡザイム’との用語は，活性のためにそれ自身の核酸配列中に２’−ＯＨ基の存在を必要としない酵素的核酸分子を表す。特定の態様においては，酵素的核酸分子は，２’−ＯＨ基を有する１またはそれ以上のヌクレオチドを含む，結合したリンカーまたは他の結合または会合した基，成分，または鎖を有することができる。ＤＮＡザイムは，化学的に合成してもよく，一本鎖ＤＮＡベクターまたはその同等物によりインビボで外的に発現させてもよい。ＤＮＡザイムの例は図４に示され，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１３０４；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＮＡＲ ２３，４０９２；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２，６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ９４，４２６２；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４２２−４２３；およびＳａｎｔｏｒｏｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｊ；Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，２４３３−３９に一般的に概説されている。別のＤＮＡザイムモチーフは，これらの参考文献に記載される手法と類似する手法を用いて選択することができ，したがって，本発明の範囲内である。
本明細書において用いる場合，"十分な長さ"との用語は，予測される条件下で意図される機能を与えるのに十分な長さのオリゴヌクレオチド，すなわち，３またはそれ以上のヌクレオチドを表す。例えば，酵素的核酸の結合アームについては，"十分な長さ"とは，結合アーム配列が予測される結合条件下で標的部位と安定な結合を与えるのに充分に長いことを意味する。好ましくは，結合アームは，核酸分子の有用なターンオーバーを妨害するほど長くはない。
本明細書において用いる場合，"安定に相互作用する"との用語は，意図される目的（例えば，酵素による標的ＲＮＡの切断）に十分な，オリゴヌクレオチドと標的核酸との相互作用（例えば，生理学的条件下で標的中の相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することにより）を表す。
本明細書において用いる場合，"ホモロジー"との用語は，２またはそれ以上の核酸分子のヌクレオチド配列が部分的にまたは完全に同一であることを表す。
本明細書において用いる場合，"アンチセンス核酸"との用語は，ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｌ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５，５６６）相互作用により標的ＲＮＡに結合して，標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を表す（概説については，Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１００４および米国特許５，８４９，９０２を参照）。典型的には，アンチセンス分子は，アンチセンス分子の１つの連続する配列に沿って標的配列に相補的である。しかし，ある態様においては，アンチセンス分子は，基質分子がループを形成するように基質に結合することができ，および／またはアンチセンス分子はアンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。すなわち，アンチセンス分子が２つまたはそれ以上の非連続的基質配列に相補的であってもよく，またはアンチセンス分子の２つまたはそれ以上の非連続的配列部分が標的配列に相補的であってもよく，その両方でもよい。現在のアンチセンス戦略の概要については，Ｓｃｈｍａｊｕｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２１７８３−２１７８９，Ｄｅｌｉｈａｓ ｅ ｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，１５，７５１−７５３，Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，７，１５１，Ｃｒｏｏｋｅ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，３−４５，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ Ｒｅｖ．，１５，１２１−１５７，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７，Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，１−４９を参照。本発明のアンチセンス分子には，２−５Ａアンチセンスキメラ分子が含まれる。さらに，アンチセンスＤＮＡを用いてＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡをターゲティングし，このことによりＲＮａｓｅＨを活性化させ，これはデュープレックス中の標的ＲＮＡを切断することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅＨ切断を活性化しうる１またはそれ以上のＲＮＡｓｅＨ活性化領域を含むことができる。アンチセンスＤＮＡは，化学的に合成してもよく，一本鎖ＤＮＡ発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させてもよい。
本明細書において用いる場合，"ＲＮａｓｅＨ活性化領域"との用語は，標的ＲＮＡに結合して細胞性ＲＮａｓｅＨ酵素により認識される非共有結合性複合体を形成することができる核酸分子の領域（一般に４−２５ヌクレオチド以上の長さ，好ましくは５−１１ヌクレオチドの長さ）を表す（例えば，Ａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８４９，９０２；Ａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，９８９，９１２を参照）。ＲＮａｓｅＨ酵素は核酸分子−標的ＲＮＡ複合体に結合し，標的ＲＮＡ配列を切断する。ＲＮａｓｅＨ活性化領域は，例えば，ホスホジエステル，ホスホロチオエート（好ましくはヌクレオチドの少なくとも４個はホスホロチオエート置換であり；さらに詳細には，ヌクレオチドの４−１１個はホスホロチオエート置換である），ホスホロジチオエート，５’−チオリン酸，またはメチルホスホネート骨格化学またはこれらの組み合わせを含む。１またはそれ以上の上述の骨格化学に加えて，ＲＮａｓｅＨ活性化領域はまた，種々の糖化学を含むことができる。例えば，ＲＮａｓｅＨ活性化領域は，デオキシリボース，アラビノ，フルオロアラビノまたはこれらの組み合わせのヌクレオチド糖化学を含むことができる。当業者は，上述の記載は非限定的例であり，ＲＮａｓｅＨ酵素の活性を支持する核酸のリン酸，糖および塩基化学の任意の組み合わせはＲＮａｓｅＨ活性化領域の定義および本発明の範囲内であることを理解するであろう。
本明細書において用いる場合，"２−５Ａアンチセンスキメラ"との用語は，５’リン酸化２’−５’結合アデニレート部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを表す。これらのキメラは配列特異的様式で標的ＲＮＡに結合し，細胞性２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼを活性化し，それは次に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１３００；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，５２２−５３３；Ｐｌａｙｅｒ ａｎｄ Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７８，５５−１１３）。
本明細書において用いる場合，"トリプレックス形成オリゴヌクレオチド"との用語は，二本鎖ＤＮＡに配列特異的様式で結合して，三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドを表す。そのような三重らせん構造の形成は，標的とする遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｃｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，５０４；Ｆｏｘ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７，１７−３７；Ｐｒａｓｅｕｔｈ ｅｔ．ａｌ．，２０００，
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９，１８１−２０６）。
本明細書において用いる場合，"遺伝子"との用語は，ＲＮＡをコードする核酸，例えば，限定されないが，ポリペプチドをコードする構造遺伝子等の核酸配列を表す。
本明細書において用いる場合，"病原性蛋白質"との用語は，疾病段階または状態，例えば特定の癌またはウイルス感染に伴う内因性または外因性蛋白質を表す。
"相補性"との用語は，核酸が，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプのいずれかにより，別のＲＮＡ配列と水素結合を形成することができることを表す。本発明の核酸分子に関して，核酸分子とその標的または相補的配列との結合自由エネルギーは，核酸の関連する機能，例えば，酵素的核酸切断，アンチセンスまたは三重らせん阻害が進行するのに十分である。核酸分子についての結合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。相補性のパーセンテージは，核酸分子中の，第２の核酸配列と水素結合（例えば，ワトソン−クリック塩基対形成）を形成しうる連続する残基のパーセンテージを示す（例えば，１０塩基中の５，６，７．８，９，１０塩基は，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，および１００％の相補性である）。"完全な相補性"とは，核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。
本明細書において用いる場合，"ＲＮＡ"との用語は，少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を表す。"リボヌクレオチド"または"２’−ＯＨ"とは，β−Ｄ−リボフラノース成分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。
本明細書において用いる場合，"デコイＲＮＡ"との用語は，所定のリガンドに優先的に結合するよう設計されたＲＮＡ分子またはアプタマーを表す。そのような結合により，標的分子は阻害または活性化されることができる。デコイＲＮＡまたはアプタマーは，特定のリガンドへの結合について天然に生ずる結合標的と競合することができる。例えば，ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現が"デコイ"として作用して，ＨＩＶｔａｔ蛋白質に有効に結合し，このことによりこれがＨＩＶ ＲＮＡ中にコードされるＴＡＲ配列に結合することを妨害することが示されている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，６３，６０１−６０８）。これは特定の例にすぎず，当業者は，当該技術分野において一般に知られる手法を用いて他の態様を容易に生成しうることを理解するであろう。例えば，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｙａｎｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照。同様に，デコイＲＮＡは，レセプターに結合してエフェクター分子の結合をブロックするよう設計することができ，またはデコイＲＮＡは，目的とするレセプターに結合してレセプターとの相互作用を防止するよう設計することができる。
本明細書において用いる場合，"一本鎖ＲＮＡ"（ｓｓＲＮＡ）との用語は，直鎖状の一本鎖を含む天然に生ずるかまたは合成のリボ核酸分子を表し，例えば，ｓｓＲＮＡは遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ），リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等でありうる。
本明細書において用いる場合，"一本鎖ＤＮＡ"（ｓｓＤＮＡ）との用語は，直鎖状の一本鎖を含む天然に生ずるかまたは合成のデオキシリボ核酸分子を表し，例えば，ｓｓＤＮＡはセンスまたはアンチセンス遺伝子配列またはＥＳＴ（発現配列タグ）でありうる。
本明細書において用いる場合，"二本鎖ＲＮＡ"または"ｄｓＲＮＡ"との用語は，ＲＮＡ干渉を行うことができる二本鎖ＲＮＡ分子を表し，例えば短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。
本明細書において用いる場合，"短干渉ＲＮＡ"または"ｓｉＲＮＡ"との用語は，ＲＮＡ干渉"ＲＮＡｉ"を行うことができる二本鎖核酸分子を表す。例えば，Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／０１８４６；Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際公開ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４９１４を参照。本明細書において用いる場合，ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく，化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをも包含する。
本明細書において用いる場合，"アロザイム"との用語は，アロステリック酵素的核酸分子を表す。例えば，Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８３４，１８６および５，７４１，６７９，Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５８９，３３２，Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８７１９１４，Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，国際公開ＷＯ００／２４９３１，Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／２６２２６および９８／２７１０４，およびＳｕｌｌｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／２９８４２を参照。
本明細書において用いる場合，"細胞"との用語は，その通常の生物学的意味を表し，多細胞生物全体を表さない。細胞は，例えば，インビトロで，例えば，細胞培養中であってもよく，または多細胞生物中で，例えば，例えば，鳥類，植物および哺乳動物，例えばヒト，ウシ，ヤギ，無尾サル，有尾サル，ブタ，イヌおよびネコ中で存在していてもよい。細胞は，原核生物（例えば細菌細胞）または真核生物（例えば哺乳動物または植物細胞）でありうる。
本明細書において用いる場合，"高度に保存された配列領域"との用語は，標的遺伝子中の１またはそれ以上の領域のヌクレオチド配列が，１つの世代と他の世代とで，または１つの生物学的システムと他の生物学的システムとで有意に相違しないことを表す。
本明細書において用いる場合，"非ヌクレオチド"との用語は，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖中に導入することができ，糖および／またはリン酸置換のいずれかを含み，残りの塩基がその酵素的活性を発揮することを可能とする任意の基または化合物を意味する。基または化合物は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えば，アデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まない場合，無塩基である。
本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"との用語は，リン酸化糖とＮ−グリコシル結合した複素環窒素塩基を表す。ヌクレオチドは，当該技術分野においては，天然塩基（標準的），および当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むと認識されている。そのような塩基は，一般にヌクレオチド糖成分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖，リン酸および／または塩基成分において修飾されていてもされていなくてもよい（互換的に，ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準的ヌクレオチド等とも称される。例えば，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）（すべて本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例があり，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸中に導入することができる化学的に修飾したおよび他の天然の核酸塩基のいくつかの非限定的例としては，例えば，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン），５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン），プロピン，ケソシン，２−チオウリジン，４−チオウリジン，ワイブトシン，ワイブトキソシン，４−アセチルシチジン，５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン，５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン，５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン，ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン，１−メチルアデノシン，１−メチルイノシン，２，２−ジメチルグアノシン，３−メチルシチジン，２メチルアデノシン，２−メチルグアノシン，Ｎ６−メチルアデノシン，７−メチルグアノシン，５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン，５−メチルアミノメチルウリジン，５−メチルカルボニルメチルウリジン，５−メチルオキシウリジン，５−メチル−２−チオウリジン，２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン，ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン，ウリジン−５−オキシ酢酸，２−チオシチジン，トレオニン誘導体およびその他のものが挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，上掲）。この観点において，"修飾塩基"とは，１’位におけるアデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはそれらの同等物を意味する。そのような塩基は，任意の位置で，例えば，酵素的核酸分子の触媒コア中でおよび／または核酸分子の基質結合領域中で用いることができる。
本明細書において用いる場合，"ヌクレオシド"との用語は，糖とＮ−グリコシル結合した複素環窒素性塩基を表す。当該技術分野においては，ヌクレオシドは，天然塩基（標準），および当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むと認識されている。そのような塩基は，一般に，ヌクレオシド糖成分の１’位に位置する。ヌクレオシドは，一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオシドは，糖，リン酸および／または塩基成分において，修飾されていても修飾されていなくてもよい（ヌクレオシド類似体，修飾ヌクレオシド，非天然ヌクレオシド，非標準的ヌクレオシドおよび他のものとして互換的に称される。例えば，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）を参照，すべて本明細書の一部としてここに引用する）。修飾核酸塩基のいくつかの例が当該技術分野において知られるており，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸中に導入することができる化学的に修飾された塩基および他の天然の核酸塩基の非限定的例には，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば，６−メチルウリジン），プロピン，ケソシン，２−チオウリジン，４−チオウリジン，ワイブトシン，ワイブトキソシン，４−アセチルシチジン，５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン，５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン，５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン，ベータ−Ｄ−ガラクトシルケソシン，１−メチルアデノシン，１−メチルイノシン，２，２−ジメチルグアノシン，３−メチルシチジン，２−メチルアデノシン，２−メチルグアノシン，Ｎ６−メチルアデノシン，７−メチルグアノシン，５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン，５−メチルアミノメチルウリジン，５−メチルカルボニルメチルウリジン，５−メチルオキシウリジン，５−メチル−２−チオウリジン，２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン，ベータ−Ｄ−マンノシルケソシン，ウリジン−５−オキシ酢酸，２−チオシチジン，トレオニン誘導体および他のものが含まれる（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲））。この観点において"修飾塩基"とは，１’位におけるアデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオシド塩基またはその同等物を意味する。このような塩基は，任意の位置で，例えば酵素的核酸分子の触媒コア中でおよび／または核酸分子の基質結合領域中で用いることができる。
本明細書において用いる場合，"キャップ構造"との用語は，オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学的修飾を表す（例えば，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９７／２６２７０（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，デリバリーおよび／または細胞中の局在化を助けるであろう。キャップは５’−末端（５’−キャップ）に存在してもよく，または３’−末端（３’−キャップ）に存在してもよく，両方の末端に存在してもよい。非限定的例においては，５’−キャップは，反転無塩基残基（成分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３’−３’−反転ヌクレオチド成分；３’−３’−反転無塩基成分；３’−２’−反転ヌクレオチド成分；３’−２’−反転無塩基成分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホネート成分からなる群より選択される（詳細には，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９７／２６２７０（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。
本明細書において用いる場合，"無塩基"との用語は，１’位において塩基を欠失しているか，または塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分，例えば，３’，３’−結合または５’，５’−結合デオキシ無塩基リボース誘導体を表す（詳細については，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，国際公開９７／２６２７０を参照）。
本明細書において用いる場合，"非修飾ヌクレオシド"との用語は，β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合した塩基，アデニン，シトシン，グアニン，チミン，ウラシルの１つを表す。
本明細書において用いる場合，"修飾ヌクレオシド"との用語は，非修飾ヌクレオチドの塩基，糖および／またはリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を表す。
本明細書において用いる場合，"本質的に・・・からなる"との用語は，本発明の活性な核酸分子，例えば酵素的核酸分子が，標的部位における切断が生ずるように，実施例に記載されるものと同等の酵素中心もしくはコア，およびＲＮＡに結合することができる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を有意に妨害しない他の配列が存在していてもよい。すなわち，コア領域は，例えば，酵素的活性を妨害しない１またはそれ以上のループ，ステム−ループ構造，またはリンカーを含んでいてもよい。例えば，ハンマーヘッド酵素的核酸のコア配列は，保存配列，例えば"Ｘ"により接続されている５’−ＣＵＧＡＵＧＡＧ−３’および５’−ＣＧＡＡ−３’（Ｘは５’−ＧＣＣＧＵＵＡＧＧＣ−３’（配列番号１），または当該技術分野において知られる他のステムＩＩ領域，またはヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーでありうる）を含むことができる。同様に，本発明の他の核酸分子，例えば，イノザイム，Ｇ切断剤，アンバーザイム，チンザイム，ＤＮＡザイム，アンチセンス，２−５Ａアンチセンス，トリプレックス形成核酸，およびデコイ核酸について，核酸分子の機能を妨害しない他の配列または非ヌクレオチドリンカーが存在していてもよい。
配列Ｘは，２ヌクレオチド以上の長さ，好ましくは３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２６，３０ヌクレオチドの長さのリンカーであってもよく，ここで，ヌクレオチドは，好ましくは２塩基対以上のステムを形成してもよい。さらに別の態様においては，ヌクレオチドリンカーＸは，核酸アプタマー，例えばＡＴＰアプタマー，ＨＩＶＲｅｖアプタマー（ＲＲＥ），ＨＩＶＴａｔアプタマー（ＴＡＲ）および他のものであってもよい（概説については，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；およびＳｚｏｓｔａｋ＆Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，１９９３，Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ，ｅｄ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓ，ｐｐ．５１１，ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。本明細書において用いる場合，"核酸アプタマー"とは，リガンドと相互作用しうる核酸配列を示すことを意味する。リガンドは，任意の天然または合成の分子であることができ，例えば，限定されないが，樹脂，代謝産物，ヌクレオシド，ヌクレオチド，薬剤，トキシン，遷移状態類似体，ペプチド，脂質，蛋白質，アミノ酸，核酸分子，ホルモン，炭水化物，レセプター，細胞，ウイルス，細菌および他のものであってもよい。
あるいは，または追加的に，配列Ｘは，非ヌクレオチドリンカーであってもよい。非ヌクレオチドには，無塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，またはポリ炭化水素化合物が含まれる。特定の例としては，Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７，１５：３１１３；Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１：２５８５およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１９１０およびＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００（すべて本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが挙げられる。"非ヌクレオチド"はさらに，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖中に導入することができ，糖および／またはリン酸置換のいずれかを含み，残りの塩基がその酵素的活性を発揮することを可能とする任意の基または化合物を意味する。基または化合物は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えば，アデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まない，無塩基であってもよい。すなわち，好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上の非ヌクレオチド成分を有し，ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断する酵素的活性を有する酵素的核酸分子を特徴とする。
本明細書において用いる場合，"患者"との用語は，外植された細胞のドナーまたはレシピエントまたは細胞それ自身である生物を表す。"患者"とはまた，本発明の核酸分子を投与することができる生物を表す。好ましくは，患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好ましくは，患者はヒトまたはヒト細胞である。
本明細書において用いる場合，"増強された酵素的活性"との用語は，細胞および／またはインビボで測定される活性を含み，ここで，活性は本発明の核酸分子の触媒活性および安定性の両方が反映されたものである。本発明においては，全ＲＮＡ酵素的核酸または全ＤＮＡ酵素と比較して，これらの特性の積をインビボで増加させることができる。場合によっては，核酸分子の活性または安定性は減少する（すなわち１０倍以上低い）が，インビボで核酸分子の全体的活性が増強されることもありうる。
"・・を含む"とは，"・・を含む"の単語の前にあるものを含むがそれには限定されないことを意味する。すなわち，"・・を含む"との用語の使用は，挙げられる要素が必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，存在しても存在しなくてもよいことを示す。"・・からなる"とは，"・・からなる"の語句の前にあるものをすべて含みかつそれに限定されることを意味する。すなわち，"・・からなる"との語句は，挙げられる要素が必要または強制的なものであり，他の要素が存在しないことを示す。
本明細書において用いる場合，"負に荷電した分子"との用語は，本発明のカチオン性脂質の正に荷電したヘッドグループとイオン対を形成することができる負に荷電した基を有する，核酸分子（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡ，オリゴヌクレオチド，混合ポリマー，ペプチド核酸等），ペプチド（例えば，ポリアミノ酸，ポリペプチド，蛋白質等），ヌクレオチド，薬学的および生物学的組成物等の分子を表す。
本明細書において用いる場合，"カップリング"との用語は，１つの原子，成分，基，化合物または分子を別の原子，成分，基，化合物または分子と結合させる化学反応または酵素反応を表す。
本明細書において用いる場合，"脱保護"または"脱保護する"との用語は，保護基の除去を表す。
本明細書において用いる場合，"アルキル"との用語は，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖，分枝鎖の"イソアルキル"，および環状アルキル基が含まれる。"アルキル"との用語はまた，アルコキシ，アルキル−チオ，アルキル−チオ−アルキル，アルコキシアルキル，アルキルアミノ，アルケニル，アルキニル，アルコキシ，シクロアルケニル，シクロアルキル，シクロアルキルアルキル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロアリール，Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル，アリールまたは置換アリール基を含む。好ましくは，アルキル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは約１−７個の炭素，より好ましくは約１−４個の炭素を有する低級アルキルである。アルキル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシ，オキシ，チオ，アミノ，ニトロ，シアノ，アルコキシ，アルキル−チオ，アルキル−チオ−アルキル，アルコキシアルキル，アルキルアミノ，シリル，アルケニル，アルキニル，アルコキシ，シクロアルケニル，シクロアルキル，シクロアルキルアルキル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロアリール，Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル，アリールまたは置換アリール基を含む。"アルキル"との用語はまた，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含むアルケニル基を含み，これには直鎖，分枝鎖，および環状基が含まれる。好ましくは，アルケニル基は，約２−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは約２−７個の炭素，より好ましくは約２−４個の炭素を有する低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシ，オキシ，チオ，アミノ，ニトロ，シアノ，アルコキシ，アルキル−チオ，アルキル−チオアルキル，アルコキシアルキル，アルキルアミノ，シリル，アルケニル，アルキニル，アルコキシ，シクロアルケニル，シクロアルキル，シクロアルキルアルキル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロアリール，Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル，アリールまたは置換アリール基を含む。"アルキル"との用語はまた，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含むアルキニル基を含み，これには直鎖，分枝鎖，および環状基が含まれる。好ましくは，アルキニル基は約２−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは約２−７個の炭素，より好ましくは約２−４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシ，オキシ，チオ，アミノ，ニトロ，シアノ，アルコキシ，アルキル−チオ，アルキル−チオ−アルキル，アルコキシアルキル，アルキルアミノ，シリル，アルケニル，アルキニル，アルコキシ，シクロアルケニル，シクロアルキル，シクロアルキルアルキル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロアリール，Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル，アリールまたは置換アリール基を含む。本発明のアルキル基または成分はまた，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリール，複素環アリール，アミドおよびエステル基を含んでいてもよい。アリール基の好ましい置換基は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシル，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニル，およびアミノ基である。"アルキルアリール"基とは，アリール基（上で定義したとおりである）に共有結合しているアルキル基（上で定義したとおりである）を表す。炭素環式アリールは，芳香族環上の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は任意に置換されていてもよい。複素環式アリール基は，約１−３個の複素原子を芳香族環の環原子として有し，残りの環原子が炭素原子である基である。適当な複素原子には，酸素，イオウ，および窒素が含まれ，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリル等が含まれ，すべて任意に置換されていてもよい。"アミド"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（Ｒは，アルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素である）を表す。"エステル"とは，Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’（Ｒは，アルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素である）を表す。
本明細書において用いる場合，"アルコキシアルキル"との用語は，アルキル−Ｏ−アルキルエーテル，例えば，メトキシエチルまたはエトキシメチルを表す。
本明細書において用いる場合，"アルキル−チオ−アルキル"との用語は，アルキル−Ｓ−アルキルチオエーテル，例えば，メチルチオメチルまたはメチルチオエチルを表す。
本明細書において用いる場合，"アミノ"との用語は，当該技術分野において知られるように，１またはそれ以上の水素ラジカルが有機ラジカルにより置き換えられることによりアンモニアから誘導される窒素含有基を表す。例えば，"アミノアシル"および"アミノアルキル"との用語は，それぞれアシルおよびアルキル置換基を有する特定のＮ−置換有機ラジカルを表す。
本明細書において用いる場合，"アミノ化"との用語は，有機分子中にアミノ基または置換アミンを導入するプロセスを表す。
本明細書において用いる場合，"環外アミン保護成分"との用語は，オリゴヌクレオチド合成に適合した核酸塩基アミノ保護基，例えば，アシルまたはアミド基を表す。
本明細書において用いる場合，"アルケニル"との用語は，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む所定の数の炭素原子の直鎖または分枝鎖の炭化水素を表す。
"アルケニル"の例には，ビニル，アリル，および２−メチル−３−ヘプテンが含まれる。
本明細書において用いる場合，"アルコキシ"との用語は，酸素架橋を介して親分子成分に結合している所定の数の炭素原子のアルキル基を表す。アルコキシ基の例としては，例えば，メトキシ，エトキシ，プロポキシおよびイソプロポキシが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"アルキニル"との用語は，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む，所定の数の炭素原子の直鎖または分枝鎖の炭化水素を表す。
"アルキニル"の例としては，プロパルギル，プロピンおよび３−ヘキシンが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"アリール"との用語は，少なくとも１つの芳香族環を含む芳香族炭化水素環系を表す。芳香族環は，任意に他の芳香族炭化水素環または非芳香族環と縮合していてもよく，結合していてもよい。アリール基の例としては，例えば，フェニル，ナフチル，１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンおよびビフェニルが挙げられる。アリール基の好ましい例には，フェニルおよびナフチルが含まれる。
本明細書において用いる場合，"シクロアルケニル"との用語は，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含むＣ３−Ｃ８の環状炭化水素を表す。シクロアルケニルの例としては，シクロプロペニル，シクロブテニル，シクロペンテニル，シクロペンタジエン，シクロヘキセニル，１，３−シクロヘキサジエン，シクロヘプテニル，シクロペプタトリエニル，およびシクロオクテニルが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"シクロアルキル"との用語は，Ｃ３−Ｃ８の環状炭化水素を表す。シクロアルキルの例としては，シクロプロピル，シクロブチル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"シクロアルキルアルキル"との用語は，上で定義したアルキル基により親分子成分に結合したＣ３−Ｃ７のシクロアルキル基を表す。シクロアルキルアルキル基の例としては，シクロプロピルメチルおよびシクロペンチルエチルが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"ハロゲン"または"ハロ"との用語は，フッ素，塩素，臭素およびヨウ素を示すことを表す。
本明細書において用いる場合，"ヘテロシクロアルキル"との用語は，窒素，酸素，およびイオウから選択される少なくとも１つの複素原子を含有する非芳香族環系を表す。ヘテロシクロアルキル環は，任意に，他のヘテロシクロアルキル環および／または非芳香族性炭化水素環と縮合していてもよく，結合していてもよい。好ましいヘテロシクロアルキル基は，３−７員である。ヘテロシクロアルキル基の例としては，例えば，ピペラジン，モルホリン，ピペリジン，テトラヒドロフラン，ピロリジン，およびピラゾールが挙げられる。好ましいヘテロシクロアルキル基としては，ピペリジニル，ピペラジニル，モルホリニル，およびピロリジニルが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"ヘテロアリール"との用語は，窒素，酸素およびイオウから選択される少なくとも１つの複素原子を含有する芳香族環系を表す。ヘテロアリール環は，１またはそれ以上のヘテロアリール環，芳香族性または非芳香族性炭化水素環またはヘテロシクロアルキル環と縮合してもよく，あるいは結合していてもよい。ヘテロアリール基の例としては，例えば，ピリジン，フラン，チオフェン，５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリンおよびピリミジンが挙げられる。ヘテロアリール基の好ましい例としては，チエニル，ベンゾチエニル，ピリジル，キノリル，ピラジニル，ピリミジル，イミダゾリル，ベンゾイミダゾリル，フラニル，ベンゾフラニル，チアゾリル，ベンゾチアゾリル，イソキサゾリル，オキサジアゾリル，イソチアゾリル，ベンズイソチアゾリル，トリアゾリル，テトラゾリル，ピロリル，インドリル，ピラゾリル，およびベンゾピラゾリルが挙げられる。
本明細書において用いる場合，"Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル"との用語は，１−６個の炭素原子を有し，１またはそれ以上の炭素−炭素二重結合または三重結合を任意に有していてもよい直鎖，分枝鎖，または環状アルキル基を表す。ヒドロカルビル基の例としては，例えば，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ｎ−ブチル，ｓｅｃ−ブチル，ｔｅｒｔ−ブチル，ペンチル，２−ペンチル，イソペンチル，ネオペンチル，ヘキシル，２−ヘキシル，３−ヘキシル，３−メチルペンチル，ビニル，２−ペンテン，シクロプロピルメチル，シクロプロピル，シクロヘキシルメチル，シクロヘキシルおよびプロパルギルが挙げられる。本明細書において，１または２個の二重結合または三重結合を含有するＣ１−Ｃ６ヒドロカルビルと称する場合，これは，アルキル中に１つの二重結合または三重結合用に少なくとも２つの炭素が存在し，２つの二重結合または三重結合用に少なくとも４個の炭素が存在することであることが理解される。
本明細書において用いる場合，"保護基"との用語は，Ｏ，Ｎ，Ｐ，またはＳ等の原子に容易に導入し，それから容易に除去することができる，当該技術分野において知られる基を表す。保護基は，目的とする特定の化合物または中間体の形成と競合する可能性のある望ましくない反応が生ずることを防止するために用いられる。"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，３ｒｄ Ｅｄ．，１９９９，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．および関連する刊行物も参照されたい。
本明細書において用いる場合，"窒素保護基"との用語は，窒素に容易に導入し，それから容易に除去することができる，当該技術分野において知られる基を表す。窒素保護基の例には，Ｂｏｃ，Ｃｂｚ，ベンゾイル，およびベンジルが含まれる。また，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，３ｒｄ Ｅｄ．，１９９９，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．および関連する刊行物も参照されたい。
本明細書において用いる場合，"ヒドロキシ保護基，"または"ヒドロキシ保護"との用語は，酸素，特に−ＯＨ基に容易に導入し，それから容易に除去することができる，当該技術分野において知られる基を表す。ヒドロキシ保護基の例には，トリチルまたは置換トリチル基，例えば，モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチル，または置換シリル基，例えば，ｔｅｒｔ−ブチルジメチル，トリメチルシリル，またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基が含まれる。また，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，３ｒｄ Ｅｄ．，１９９９，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．および関連する刊行物も参照されたい。
本明細書において用いる場合，"アシル"との用語は，−Ｃ（Ｏ）Ｒ基（式中，Ｒはアルキルまたはアリールである）を表す。
本明細書において用いる場合，"リン含有基"との用語は，リン原子を含有する化学基を表す。リン原子は３価であっても５価であってもよく，Ｏ，Ｈ，Ｎ，Ｓ，Ｃまたはハロゲン原子で置換されていてもよい。本発明のリン含有基の例には，限定されないが，Ｏ，Ｈ，Ｎ，Ｓ，Ｃまたはハロゲン原子で置換されたリン原子が含まれ，例えば，ホスホネート基，アルキルホスホネート基，リン酸基，二リン酸基，三リン酸基，ピロリン酸基，ホスホロチオエート基，ホスホロジチオエート基，ホスホルアミデート基，ホスホルアミダイト基，ヌクレオチドおよび核酸分子である。
本明細書において用いる場合，"ホスフィン"または"ホスファイト"との用語は３価のリン種，例えば，式９７：
［式中，Ｒは以下のいずれかの基：
を含むことができ，ＳおよびＴは，独立して，以下のいずれかの基：
を含むことができる］
を有する化合物を表す。
本明細書において用いる場合，"リン酸"との用語は，５価のリン種，例えば，式９８：
［式中，Ｒは以下のいずれかの基：
を含むことができ，ＳおよびＴは，それぞれ独立して，イオウまたは酸素原子または以下のいずれかの基：
を含むことができる基であることができ，
Ｍは，イオウまたは酸素原子を含む］
を有する化合物を表す。本発明のリン酸は，式９８のいずれかのＲ，Ｓ，またはＴが核酸またはヌクレオシドへの結合を含むヌクレオチドリン酸を含むことができる。
本明細書において用いる場合，"カチオン性塩"との用語は，正味正の電荷を有する任意の有機または無機塩，例えば，トリエチルアンモニウム（ＴＥＡ）塩を表す。
本明細書において用いる場合，"分解性リンカー"との用語は，種々の条件下で切断が可能なリンカー成分を表す。切断に適した条件には，限定されないが，ｐＨ，ＵＶ照射，酵素的活性，温度，加水分解，除去および置換反応，および結合の熱力学的特性が含まれる。
本明細書において用いる場合，"光不安定性リンカー"との用語は，当該技術分野において知られるように，特定のＵＶ波長で選択的に切断されるリンカー成分を表す。光不安定性リンカーを含む本発明の化合物は，化合物を目的とする標的細胞または組織にデリバリーし，次にＵＶ光源の存在下で放出させるために用いることができる。
本明細書において用いる場合，"核酸コンジュゲート"との用語は，ヌクレオシド，ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドコンジュゲートを表す。
本明細書において用いる場合，"葉酸"との用語は，葉酸の類似体および誘導体，例えば，葉酸拮抗剤，ジヒドロ葉酸，テトラヒドロ葉酸，テトラヒドロプテリン，葉酸，プテロポリグルタミン酸，１−デアザ，３−デアザ，５−デアザ，８−デアザ，１０−デアザ，１，５−デアザ，５，１０ジデアザ，８，１０−ジデアザ，および５，８−ジデアザ葉酸，葉酸拮抗剤，およびプテロイン酸誘導体を表す。
本明細書において用いる場合，"中性の電荷を有する化合物"との用語は，中性または生理学的ｐＨにおいて中性であるかまたは荷電していない組成物を表す。そのような化合物の例には，コレステロールおよび他のステロイド，コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ），ジオレオイルホスファチジルコリン，ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），脂肪酸，例えば，オレイン酸，ホスファチジン酸およびその誘導体，ホスファチジルセリン，ポリエチレングリコールコンジュゲート化ホスファチジルアミン，ホスファチジルコリン，ホスファチジルエタノールアミンおよび関連する変種，プレニル化化合物，例えば，ファルネゾル，ポリプレノール，トコフェロールおよびそれらの改変型，ジアシルスクシニルグリセロール，融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）または孔形成性ペプチド，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ），セラミド等が含まれる。
本明細書において用いる場合，"脂質凝集物"との用語は，脂質がリポソーム，ミセル（非層状相）または１またはそれ以上の脂質を有する他の凝集物の形である，脂質含有組成物を表す。
本明細書において用いる場合，"生物学的系"との用語は，真核生物系または原核生物系を表し，細菌細胞，植物細胞または哺乳動物細胞であってもよく，または植物起源，哺乳動物起源，酵母起源，ショウジョウバエ起源，または古細菌起源のものであってもよい。
本明細書において用いる場合，"全身投与"との用語は，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の後に全身に分配されることを表す。全身的吸収をもたらす投与経路には，静脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれるが，これらに限定されない。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例えば核酸）をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイプの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることが可能である。薬剤と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易にすることができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファージおよび白血球による異常な細胞（例えば癌細胞）の免疫認識の特異性を利用することにより，薬剤の標的細胞へのデリバリーを増強するであろう。
"薬学的組成物"または"医薬処方"との用語は，細胞または患者，好ましくはヒトへの投与（例えば全身投与）に適した形の組成物または処方を表す。適当な形は，部分的には，用途または侵入経路（例えば，経口，経皮，または注入）により異なる。そのような形は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリマーが標的とする細胞）に到達することを妨害する形であってはならない。
本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の好ましい態様の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。
好ましい態様の説明
まず図面を簡単に説明する。
図面：
図１は，化学的に安定化されたリボザイムモチーフの例を示す。ＨＨＲｚは，ハンマーヘッドリボザイムモチーフを表す（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）；ＮＣＨＲｚはＮＣＨリボザイムモチーフを表す（Ｌｕｄｗｉｇ＆Ｓｐｒｏａｔ，国際公開ＷＯ９８／５８０５８）；Ｇ切断剤はＧ切断剤リボザイムモチーフを表す（Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６，４１１６−４１２０，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／１６８７１）。Ｎまたはｎは，独立して，ヌクレオチドを表し，これは同一であっても異なっていてもよく，互いに相補性を有する；ｒＩはリボイノシンヌクレオチドを表す；矢印は標的中の切断の部位を示す。ＨＨＲｚおよびＮＣＨＲｚの４位は，２’−Ｃ−アリル修飾を有するものとして示されているが，当業者は，そのような修飾がリボザイムの活性を有意に阻害しない限り，この位置を当該技術分野においてよく知られる他の修飾で修飾することができることを理解するであろう。
図２は，化学的に安定化されたアンバーザイムリボザイムモチーフの例を示す（例えば，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／５５８５７を参照）。
図３は，化学的に安定化されたチンザイムＡリボザイムモチーフの例を示す（例えば，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／５５８５７を参照）。
図４は，Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９７，ＰＮＡＳ，９４，４２６２）により記載されるＤＮＡザイムモチーフの例を示す。
図５は，本発明の葉酸コンジュゲートの合成スキームを示す。
図６は，本発明のフルダラビン−葉酸コンジュゲート分子の代表例を示す。
図７は，核酸分子を合成後修飾して葉酸コンジュゲートを製造する合成スキームを示す。
図８は，本発明の保護プテロイン酸シントンを生成する合成スキームを示す。
図９は，本発明の２−ジチオピリジル活性化葉酸シントンを生成する合成スキームを示す。
図１０は，オリゴヌクレオチドまたは核酸−葉酸コンジュゲートを生成する合成スキームを示す。
図１１は，オリゴヌクレオチドまたは核酸−葉酸コンジュゲートを生成する別の合成スキームを示す。
図１２は，核酸分子を合成後修飾して葉酸コンジュゲートを製造する別の合成スキームを示す。
図１３は，本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン−２’−アミノウリジンホスホルアミダイトコンジュゲートを合成する合成スキームの非限定的例を示す。
図１４は，本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン−Ｄ−トレオニノールホスホルアミダイトコンジュゲートを合成する合成スキームの非限定的例を示す。
図１５は，本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン酵素的核酸コンジュゲートの非限定的例を示す。例に示されるＷは，生物分解性リンカー，例えば，リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸ダイマー，トリマー，またはテトラマーを表す。
図１６は，本発明のドデカン酸由来コンジュゲートリンカーを合成する合成スキームの非限定的例を示す。
図１７は，本発明のオキシム結合核酸／ペプチドコンジュゲートを合成する合成スキームの非限定的例を示す。
図１８は，本発明のリン脂質由来核酸コンジュゲートの非限定的例を示す。例に示されるＷは，生物分解性リンカー，例えば，リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸ダイマー，トリマー，またはテトラマーを表す。
図１９は，本発明のリン脂質由来酵素的核酸コンジュゲートを製造する合成スキームの非限定的例を示す。
図２０は，本発明のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）由来酵素的核酸コンジュゲートを製造する合成スキームの非限定的例を示す。
図２１は，ＰＥＧコンジュゲート化酵素的核酸分子のＰＫデータを，対応する非コンジュゲート化酵素的核酸分子と比較して示す。グラフは，３０ｍｇ／ｋｇのＡｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）または４０−ｋＤａ−ＰＥＧ−Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）を投与したマウスにおける血清濃度の経時変化である。Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）レベルはハイブリダイゼーション法を用いて定量した。
図２２は，リン脂質コンジュゲート化酵素的核酸分子のＰＫデータを，対応する非コンジュゲート化酵素的核酸分子と比較して示す。
図２３は，本発明のポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン酵素的核酸コンジュゲートを製造する合成スキームの非限定的例を示す。
図２４ａ−ｂは，オキシムおよびモルホリノ結合生物分解性リンカーを利用してＰＥＧへのペプチドまたは蛋白質コンジュゲートを合成する合成方法の非限定的例である。
図２５は，オキシムおよびホスホルアミデート結合を用いて生物分解性リンカーを利用してＰＥＧへのペプチドまたは蛋白質コンジュゲートを合成する合成方法の非限定的例である。
図２６ａ−ｂは，ホスホルアミデート結合を用いて生物分解性リンカーを利用してＰＥＧへのペプチドまたは蛋白質コンジュゲートを合成する合成方法の非限定的例である。
図２７は，本発明のリン脂質由来蛋白質／ペプチドコンジュゲートの非限定的例を示す。例に示されるＷは，生物分解性リンカー，例えば，リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸ダイマー，トリマー，またはテトラマーを表す。
図２８は，本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンペプチド／蛋白質コンジュゲートの非限定的例を示す。示されている例は，ペプチドについてのものである。例に示されるＷは，生物分解性リンカー，例えば，リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸ダイマー，トリマー，またはテトラマーを表す。
図２９は，ホスホルアミデート結合を用いる蛋白質ホスホルアミダイトのＰＥＧコンジュゲート化核酸リンカーへのカップリングにより，生物分解性リンカーを利用してＰＥＧへのペプチドまたは蛋白質コンジュゲートを合成する合成方法の非限定的例である。
使用方法
本発明の組成物およびコンジュゲートは，薬品を投与するために用いることができる。医薬品は，患者において，疾病状態を予防し，発症を阻害し，または治療する（症状をある程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）。
一般に，本発明の化合物は，安定剤，緩衝液等を用いてまたは用いずに医薬組成物を形成することにより，任意の標準的な手段により導入する。リポソームデリバリーメカニズムを利用するために，リポソームを形成する標準的なプロトコルにしたがうことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用には錠剤，カプセルまたはエリキシルとして；直腸投与用には座剤として；滅菌溶液として；注入投与の用には懸濁液として，処方し使用することができる。
本発明はまた，記載される化合物の，好ましくはデリバリーされるべき分子との組み合わせにおける，薬学的に許容しうる処方を含む。これらの処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
１つの態様においては，本発明は，本発明の化合物を，ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ−修飾，または長期間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む組成物中で使用することを特徴とする。別の態様においては，本発明は，ポリエチレングリコールに共有結合させた本発明の化合物を使用することを特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのような組成物は，おそらくは脈管新生標的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環組成物は，特に，ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べて，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９２）。長期間循環組成物はまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織，例えば肝臓および脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて，カチオン性リポソームと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。
本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を組成物中に含ませることができる。そのような薬剤の例としては，限定されないが，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を組成物中に含ませてもよい。
薬学的に有効な用量とは，疾患状態の予防，発症の阻害または治療（症状をある程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学的に有効な用量は，疾患の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。さらに，本発明の化合物およびその処方は，胎児の母親に投与することにより胎児に投与することができる。
本発明の化合物およびその処方は，慣用的な無毒性の薬学的に許容しうる担体，アジュバントおよびベヒクルを含む用量単位処方中で，経口的に，局所的に，非経口的に，吸入またはスプレーにより，または直腸に投与することができる。本明細書において用いる場合，非経口的との用語には，経皮，皮下，血管内（例えば，静脈内），筋肉内，または包膜内注射または注入の手法等が含まれる。さらに，本発明の核酸分子および薬学的に許容しうる担体を含む医薬処方が提供される。１またはそれ以上の本発明の核酸分子は，１またはそれ以上の無毒性の薬学的に許容しうる担体および／または希釈剤，および／またはアジュバント，および所望の場合には他の活性成分とともに存在することができる。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物は，経口使用に適した形，例えば，錠剤，トローチ剤，菱形剤，水性または油性懸濁液，分散可能な粉体または顆粒，乳剤，硬カプセルまたは軟カプセル，またはシロップまたはエリキシル剤の形であることができる。
経口で使用することが意図される組成物は，医薬組成物の製造について当該技術分野において知られる任意の方法にしたがって製造することができ，そのような組成物は，薬学的に洗練された口に合う製品を提供するために，１またはそれ以上のそのような甘味剤，芳香剤，着色剤または保存剤を含んでいてもよい。錠剤は，錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容しうる賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は，例えば，不活性希釈剤，例えば，炭酸カルシウム，炭酸ナトリウム，ラクトース，リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；顆粒化剤および崩壊剤，例えば，コーンスターチ，またはアルギン酸；結合剤，例えば，デンプン，ゼラチンまたはアラビアゴム，および潤滑剤，例えば，ステアリン酸マグネシウム，ステアリン酸またはタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく，既知の手法により被覆してもよい。場合によっては，既知の手法によりそのような被覆を調製して，崩壊および胃腸管における吸収を遅延させ，このことによりより長い期間の持続作用を与えることができる。例えば，遅延用材料，例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを用いることができる。
経口使用のための処方は，活性成分が不活性固体希釈剤，例えば，炭酸カルシウム，リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル，または活性成分が水または油状媒体，例えば，ピーナッツ油，液体パラフィンまたはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルであってもよい。
水性懸濁液は，水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含む。そのような賦形剤は，懸濁剤，例えば，カルボキシメチルセルロースナトリウム，メチルセルロース，ヒドロプロピル−メチルセルロース，アルギン酸ナトリウム，ポリビニルピロリドン，トララガントガムおよびアラビアゴムである。分散剤または湿潤剤は，天然に生ずるホフファチド，例えば，レシチン，またはアルキレンオキサイドと脂肪酸との縮合生成物，例えば，ステアリン酸ポリオキシエチレン，またはエチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物，例えば，ヘプタデカエチレンオキシセタノール，またはエチレンオキサイドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物，例えば，ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート，またはエチレンオキサイドと脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物，例えば，ポリエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。水性懸濁液はまた，１またはそれ以上の保存剤，例えば，エチル−，またはｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート，１またはそれ以上の着色剤，１またはそれ以上の芳香剤，および１またはそれ以上の甘味剤，例えばショ糖またはサッカリンを含んでいてもよい。
油性懸濁液は，活性成分を植物油，例えば，アラキス油，オリーブ油，ゴマ油またはココナッツ油，または無機油，例えば液体パラフィン中に懸濁させることにより処方することができる。油性懸濁液は，増粘剤，例えば，密ロウ，硬パラフィンまたはセチルアルコールを含むことができる。甘味剤および芳香剤を加えて，口に合う経口製品を得ることができる。これらの組成物は，抗酸化剤，例えばアスコルビン酸を加えることにより保存することができる。
水を加えることにより水性懸濁液を製造するのに適した分散可能な粉体および顆粒は，活性成分を，分散剤または湿潤剤，懸濁剤および１またはそれ以上の保存剤との混合物中で与える。適当な分散剤または湿潤剤または懸濁剤は，上で例示したとおりである。さらに別の賦形剤，例えば，甘味剤，芳香剤および着色剤が存在していてもよい。
本発明の医薬組成物はまた，水中油エマルジョンの形であってもよい。油相は，植物油またはミネラルオイルまたはこれらの混合物であってもよい。適当な乳化剤としては，天然に生ずるガム，例えば，アラビアゴムまたはトラガガントゴム，天然に生ずるホスファチド類，例えば，大豆，レクチン，および脂肪酸から誘導されるエステルまたは部分エステルおよびヘキシトール，無水物，例えば，ソルビタンモノオレエート，および前記部分エステルとエチレンオキサイドとの縮合生成物，例えば，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エマルジョンは，甘味料および芳香剤を含んでいてもよい。
シロップおよびエリキシルは，甘味剤，例えば，グリセロール，プロピレングリコール，ソルビトール，グルコースまたはショ糖を用いて処方することができる。このような処方はまた，粘滑剤，保存剤および甘味料および着色料を含んでいてもよい。医薬組成物は，滅菌した注射可能な水性または油性の懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は，上述した適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて，当該技術分野において知られるように処方することができる。滅菌した注射可能な製品はまた，無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌した注射可能な溶液または懸濁液，例えば，１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることのできる許容可能なベヒクルおよび溶媒の例は，水，リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに，滅菌し，凝固させた油を溶媒または懸濁媒体として便利に用いることができる。この目的のためには，任意の非刺激性の凝固させた油，例えば，合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを用いることができる。さらに，脂肪酸，例えば，オレイン酸を注射可能な薬剤の製造において用いることができる。
本発明の化合物はまた，例えば，薬剤の直腸投与用に，座剤の形で投与することができる。これらの組成物は，薬剤を，通常の温度では固体であるが直腸温度では液体であり，したがって直腸中で溶融して薬剤を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することにより製造することができる。そのような材料としては，カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明の化合物は，滅菌媒体中で非経口的に投与することができる。薬剤は，使用するベヒクルおよび濃度に応じて，ベヒクル中に懸濁されていてもよく，溶解されていてもよい。アジュバント，例えば局所麻酔剤，保存剤および緩衝剤をベヒクル中に溶解することも有利である。
上述した状態の治療には，体重１キログラムあたり１日あたり約０．１ｍｇ−約１４０ｍｇのオーダーの投与量レベルが有用である（患者あたり１日あたり約０．５ｍｇ−約７ｇ）。担体物質と組み合わせて１回投与量形を生成することができる活性成分の量は，治療される宿主および投与の特定のモードに依存して様々であろう。投与量単位形は，一般に，約１ｍｇ−約５００ｍｇの活性成分を含むであろう。
しかし，特定の患者についての特定の投与量レベルは，種々の因子，例えば，用いる特定の化合物の活性，年齢，体重，一般的健康状態，性別，食事，投与時間，投与経路，および排出速度，薬剤の組み合わせ，および治療をしている特定の疾病の重篤性に依存することが理解されるであろう。
ヒト以外の動物に投与するためには，組成物を動物飼料または飲料水に加えてもよい。動物が治療上適当な量の組成物を飼料とともに接種できるよう，動物飼料および飲用水組成物を処方することが便利であろう。飼料または飲料水に加えるように組成物をプレミックスとして製造することも便利であろう。
本発明の化合物はまた，他の治療用化合物と組み合わせて患者に投与して，全体的治療効果を高めることができる。ある適応症の治療に複数の化合物を用いることにより，副作用の存在を低下させながら有益な効果を高めることができる。
核酸分子の合成
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，好ましくは，小さい核酸モチーフ（"小さい"とは，１００ヌクレオチド以下の長さ，好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ，最も好ましくは５０ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフ，例えば，アンチセンスオリゴヌクレオチド，ハンマーヘッドまたはＮＣＨリボザイムを表す）が外的デリバリーに用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため，核酸が蛋白質および／またはＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の例示的分子は化学的に合成するが，他の分子も同様に合成することができる。
オリゴヌクレオチド（例えば，アンチセンスＧｅｎｅＢｌｏｃｓ）は，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開９９／５４４５９，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許６，００１，３１１に記載されるような，当該技術分野において知られるプロトコルを用いて合成する（これらの参考文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する）。オリゴヌクレオチドの合成には，一般の核酸保護基およびカップリング基，例えば５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定的例においては，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で，０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで，２’−Ｏメチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程，および２’−デオキシヌクレオチドについては４５秒間のカップリング工程で，小スケールの合成を行う。表ＩＩは，合成サイクルで用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。非限定的例においては，２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトおよび１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。非限定的例においては，デオキシ残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して２２倍過剰（４０μＬの０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイトおよび７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔeｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりであるがこれらに限定されない：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９ｍＭ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のために，ボーケージ試薬（３Ｈ１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの脱保護は以下のように行う：ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から除去する。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。当業者に知られる標準的な乾燥または凍結乾燥法を用いることができる。
ある種の酵素的核酸分子等の通常のＲＮＡについて用いられる合成の方法は，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９；に記載の方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定的例においては，小スケールの合成は，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分間のカップリング工程を，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行う。表ＩＩは，合成サイクルにおいて用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）のホスホルアミダイトおよび７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。リボ残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３．２μｕｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミダイトおよび１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９ｍＭ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））であった。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成した。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のために，ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
ＲＮＡの脱保護は，２ポットプロトコルまたは１ポットプロトコルのいずれかを用いて行う。２ポットプロトコルについては，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から除去する。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μＬ ＴＥＡおよび１．０ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ，ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し，６５℃に加熱する。１．５時間後，オリゴマーを１．５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3で急冷する。
あるいは，１ポットプロトコルのためには，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で，６５℃で１５分間懸濁する。バイアルを室温にする。ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え，バイアルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し，次に１．５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3で急冷する。
トリチルオンオリゴマーの精製のためには，急冷したＮＨ4ＨＣＯ3溶液を，アセトニトリル，続いて５０ｍＭ ＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後，ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し，１Ｍ ＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄する。次に，３０％アセトニトリルでオリゴヌクレオチドを溶出する。
不活性ハンマーヘッドリボザイムまたは減弱化対照（ＢＡＣ）オリゴヌクレオチド）は，Ｇ５をＵで，Ａ１４をＵで置換することにより合成する（番号付けは，Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２による）。同様に，他の酵素的核酸分子に１またはそれ以上のヌクレオチド置換を導入して分子を不活性化し，そのような分子は負の対照として働くことができる。
平均段階カップリング収率は，典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。当業者は，合成のスケールは，上述の例より大きくまたは小さく，例えば，限定されないが，９６ウエルのフォーマットに適合させることができること，および，重要なすべては，反応において用いられる化学物質の比率であることを認識するであろう。
あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成して，合成後に例えばライゲーションにより一緒につなげてもよい（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，２０４）。
本発明の核酸分子は，広範囲に修飾して，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｈによる修飾により安定性を高める（概説としてはＵｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ１７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。リボザイムは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により精製し，水に再懸濁する。
本発明の核酸分子の活性の最適化
血清リボヌクレアーゼによる分解を防止する修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有する，化学的に合成された核酸分子は，その抗力が高まるであろう（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照。上述の参考文献はすべて，本明細書に記載される核酸分子の塩基，リン酸および／または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載する。細胞中におけるその抗力を増強する修飾，およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するために核酸分子から塩基を除去することが望ましい（これらのすべての刊行物は本明細書の一部としてここに引用する）。
当該技術分野には，そのヌクレアーゼ安定性および効力を有意に増強することができる，核酸分子（例えば酵素的核酸分子）中に導入することができる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。例えば，オリゴヌクレオチドは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより，安定性を高め，および／または生物学的活性を増強するために修飾される（総説については，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＴＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ３５，１４０９０を参照）。核酸分子の糖修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，７１６，８２４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２７，０５３；Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願６０／０８２，４０４，１９９８年４月２０日出願；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；およびＢｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０を参照，これらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。これらの刊行物は，触媒活性を阻害することなく，糖，塩基および／またはリン酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を記載しており，本明細書の一部としてここに引用する。このような教示の観点から，本明細書に記載されるものと同様の修飾を用いて，本発明の核酸分子を修飾することができる。
ホスホロチオエート，ホスホロチオエート，および／または５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を改良するが，これらの修飾が多すぎるとある種の毒性を引き起こしうる。したがって，核酸分子を設計する場合，これらのヌクレオチド間結合の量は最小にすべきである。特定の理論に拘束されるものではないが，これらの結合の濃度を減少させると，毒性が低下し，これらの分子の効力が増加し特異性が高くなるはずである。
活性を維持するかまたは増強させる化学的修飾を有する核酸分子が提供される。そのような核酸はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対してより耐性が高い。したがって，細胞中でおよび／またはインビボで，活性は顕著に低下しないはずである。外的にデリバリーされた治療用核酸分子（例えば，酵素的核酸分子およびアンチセンス核酸分子）は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが低下するのに充分長い時間標的ＲＮＡの翻訳が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。この時間は，疾病状態に依存して数時間から数日まで様々であろう。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９（本明細書の一部としてここに引用する））により，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強させることにより，核酸分子を修飾する可能性が拡大した。
本発明の核酸に基づく分子の使用は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数のアンチセンスまたは酵素的核酸分子，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた酵素的核酸分子，または分子（異なるモチーフを含む）および／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。核酸分子を用いる患者の治療にはまた，異なる種類の核酸分子の組み合わせが含まれる。
別の態様においては，酵素的活性を維持するかまたは増強させる化学修飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対してより耐性が高い。したがって，細胞中でおよび／またはインビボで，活性は顕著に低下しないはずである。本明細書に例示されるように，そのような酵素的核酸は，全体の活性が１０倍低下したとしても，細胞内でおよび／またはインビボで有用である（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。そのような酵素的核酸は，本明細書において全ＲＮＡのリボザイムまたは全ＤＮＡのＤＮＡザイムの酵素的活性を"維持する"と称される。
別の観点においては，核酸分子は５’および／または３’−キャップ構造を含む。
別の態様においては，３’−キャップとしては，例えば，４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト成分が挙げられる（より詳細には，Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。
１つの態様においては，本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾された酵素的核酸分子を特徴とし，これは１またはそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスホネート，モルホリノ，アミデート，カルバメート，カルボキシメチル，アセトアミデート，ポリアミド，スルホネート，スルホンアミド，スルファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，および／またはアルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照。これらの参考文献は本明細書の一部としてここに引用する。
本発明について記載される２’−修飾ヌクレオチドに関して，"アミノ"とは，２’−ＮＨ2または２’−Ｏ−ＮＨ2を意味し，これは修飾されていてもされていなくてもよい。そのような修飾基は，例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６７２，６９５およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／２８３１７（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）にそれぞれ記載されている。
核酸（例えば，アンチセンスおよびリボザイム）構造に対する種々の修飾を作成して，これらの分子の有用性を高めることができる。例えば，このような修飾は，製品寿命，インビトロの半減期，安定性，およびそのようなオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さを高め，例えば，細胞膜の透過性を高め，標的とする細胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
これらの分子の使用は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数の酵素的核酸分子，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた酵素的核酸分子，または酵素的核酸分子（異なる酵素的核酸分子モチーフを含む）および／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。核酸分子を用いる患者の治療にはまた，異なる種類の核酸分子の組み合わせが含まれる。１またはそれ以上の標的に対する酵素的核酸分子（異なる酵素的核酸分子モチーフを含む），アンチセンスおよび／または２−５Ａキメラ分子の混合物を含む療法を案出して，疾病の症状を軽減することができる。
適応症
本発明の化合物および組成物を用いて治療することができる特定の疾病状態には，限定されないが，癌および癌性状態，例えば，乳，肺，前立腺，結腸直腸，脳，食道，胃，膀胱，膵臓，子宮頚部，頭頚部，および卵巣癌，黒色腫，リンパ腫，神経膠腫，多剤耐性癌，および／またはウイルス感染，例えば，ＨＩＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＣＭＶ，ＲＳＶ，ＨＳＶ，ポリオウイルス，インフルエンザ，ライノウイルス，西ナイル熱ウイルス，エボラウイルス，口蹄疫ウイルス，およびパピローマウイルス感染が含まれる。
本発明の分子は，他の既知の方法，療法，または薬剤と組み合わせて用いることができる。例えば，モノクローナル抗体（例えば，ｍＡｂ ＩＭＣ Ｃ２２５，ｍＡＢ ＡＢＸ−ＥＧＦ）治療，チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩｓ），例えば，ＯＳＩ−７７４およびＺＤ１８３９，化学療法，および／または放射線療法の使用はすべて，本発明の化合物と組み合わせるかまたは一緒に用いることができる方法の非限定的例である。本発明の核酸分子と組み合わせることができる慣用的な化学療法には，癌細胞を殺すための細胞毒性薬剤の種々の組み合わせが含まれる。これらの薬剤には，限定されないが，パクリタキセル（タキソール），ドセタキセル，シスプラチン，メトトレキセート，シクロホスファミド，ドキソルビシン，フルオロウラシル，カルボプラチン，エダトレキセート，ゲムシタビン，ビノレルビンなどが含まれる。当業者は，同様にして他の薬剤化合物および療法を本発明の化合物と容易に組み合わせることができ，したがって本発明の範囲内であることを理解するであろう。
診断用途
本発明の化合物，例えば核酸コンジュゲート分子を診断手段として使用し，疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査するか，または細胞において疾病関連ＲＮＡの存在を検出することができる。例えば，酵素的核酸分子の活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により，分子のいずれの領域においても，標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載される酵素的核酸分子コンジュゲートを複数使用することにより，インビトロならびに細胞および組織におけるＲＮＡの構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。酵素的核酸分子による標的ＲＮＡの切断を使用して，遺伝子の発現を阻害し，疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割を（本質的に）明らかにすることができる。このようにして，他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにすることができる。これらの実験は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数の酵素的核酸分子，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた酵素的核酸分子，酵素的核酸分子および／または他の化学的または生物学的分子と組み合わせた間欠的治療）。本発明の酵素的核酸分子の他のインビトロにおける用途は当該技術分野においてよく知られており，これには，疾病に関連する状態に関係するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは，標準的な方法論を使用して酵素的核酸分子で処理した後，切断産物の存在を判定することにより検出する。
特定の例においては，コンジュゲートとして細胞にデリバリーされ，野生型または変異体型の標的ＲＮＡのみを切断する酵素的核酸分子をアッセイに使用する。第１の酵素的核酸分子を用いて試料中の野生型ＲＮＡの存在を同定し，第２の酵素的核酸分子を用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定する。反応対照として野生型および変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方の酵素的核酸分子で切断し，反応における酵素的核酸分子の相対効率および“非標的”ＲＮＡ種を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は，試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従ってそれぞれの分析は２つの酵素的核酸分子，２つの基質，および１つの未知の試料を必要とし，これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在をＲＮａｓｅ保護アッセイを使用して確認し，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異体ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るために，必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物が表現型の発生に関与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば，ＲＮＡレベルの定性的比較で十分であり，初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても，より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。本発明により企図される，診断用途における酵素的核酸分子の使用は，Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８３４，１８６および５，７４１，６７９，Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５８９，３３２，Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，８７１，９１４，Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，国際公開ＷＯ００／２４９３１，Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ００／２６２２６および９８／２７１０４，およびＳｕｌｌｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／２９８４２により詳細に記載されている。
追加の用途
コンジュゲートとして細胞にデリバリーされる本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は，ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡの研究のために有するものと同様の多くの適用をＲＮＡの研究のために有する（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。例えば，制限フラグメントのパターンを使用して２つの関連するＲＮＡ間の配列の関係を確立することができ，大型のＲＮＡを研究のためにより有用なサイズのフラグメントに特異的に切断することができる。酵素的核酸分子の配列特異性を操作できることは未知の配列のＲＮＡの切断に理想的である。出願人は，細菌，微生物，真菌，ウイルス，および真核生物系，例えば植物または哺乳動物細胞において，標的遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートするために核酸分子を用いることを記載する。
実施例１：Ｏ 1 −（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−（６−（Ｎ−α−ＯＦｍ−Ｌ−グルタミル）−アミノカプロイル））−Ｄ−トレオニノール−Ｎ 2 −ｉＢｕ−Ｎ 10 −ＴＦＡ−プテロイン酸コンジュゲート３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（２０）の合成（図５）
一般
すべての反応は，アルゴンの正圧下で無水溶媒中で行った。市販の試薬および無水溶媒をさらに精製することなく用いた。1Ｈ（４００．０３５ＭＨｚ）および31Ｐ（１６１．９４７ＭＨｚ）のＮＭＲスペクトルは，特に記載しない限りＣＤＣｌ3中で測定し，化学シフトｐｐｍはそれぞれＴＭＳおよびＨ3ＰＯ4を表す。分析的薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は，Ｍｅｒｃｋ Ａｒｔ．５５５４ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ254プレートで行い，びフラッシュカラムクロマトグラフィーはＭｅｒｃｋ０．０４０−０．０６３ｍｍシリカゲル６０を用いた。
Ｎ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノカプロイル）−Ｄ−トレオニノール（１３）
Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノカプロン酸（１０ｇ，２８．３０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．２６ｇ，２８．３０ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５．８４ｇ，２８．３ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。反応混合物を室温（約２３℃）で一夜撹拌し，沈殿した１，３−ジシクロヘキシルウレアを濾別した。濾液にＤ−トレオニノール（２．９８ｇ，２８．３０ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で一夜撹拌した。溶液を真空下で約半分の用量とし，残渣を約ｍｍｌの酢酸エチルで希釈し，約ｘｍｌの５％ＮａＨＣＯ3で抽出し，次にブラインで洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発させてシロップを得，酢酸エチル中メタノールの１−１０％勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりクロマトグラフィーを行った。生成物を含む画分をプールし，蒸発させて，白色固体（９．９４ｇ，８０％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6−Ｄ2Ｏ）δ７．９７−７．３０（ｍ，８Ｈ，芳香族），４．３４（ｄ，Ｊ＝６．８０，２Ｈ，Ｆｍ），４．２６（ｔ，Ｊ＝６．８０，１Ｈ，Ｆｍ），３．９（ｍ，１Ｈ，Ｈ３Ｔｈｒ），３．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ２Ｔｈｒ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，Ｊ＝７．０，１Ｈ，Ｈ１Ｔｈｒ），３．３５（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，Ｊ＝６．２，１Ｈ，Ｈ１’Ｔｈｒ），３．０１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＡｃｐ），２．１７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨＡｃｐ），１．５４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．２７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．０４（ｄ，Ｊ＝６．４，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ／ＥＳＩ+ｍ／ｚ４４１．０（Ｍ＋Ｈ）+
Ｏ1−（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノカプロイル）−Ｄ−トレオニノール（１４）
乾燥ピリジン（８０ｍｌ）中の１３（６ｇ，１３．６２ｍｍｏｌ）の溶液に，ｐ−アニシルクロロジフェニルメタン（６ｇ，１９．４３ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で一夜撹拌した。メタノール（２０ｍｌ）を加え，溶液を真空下で濃縮した。残留シロップを約ｘｍｌのジクロロメタンと約ｘｍｌの５％ＮａＨＣＯ3との間に分配し，有機層をブラインで洗浄し，乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発乾固させた。ジクロロメタン中メタノールの１−３％の勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより，１４を白色泡状物として得た（６ｇ，６２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ７．９７−６．９４（ｍ，２２Ｈ，芳香族），４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２，ＯＨ），４．３５（ｄ，Ｊ＝６．８，２Ｈ，Ｆｍ），４．２７（ｔ，Ｊ＝６．８，１Ｈ，Ｆｍ），３．９７（ｍ，２Ｈ，Ｈ２，Ｈ３Ｔｈｒ），３．８０（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），３．１３（ｄｄ，Ｊ＝８．４，Ｊ＝５．６，１Ｈ，Ｈ１Ｔｈｒ），３．０１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＡｃｐ），２．９２（ｍ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，Ｊ＝６．４，１Ｈ，Ｈ１’Ｔｈｒ），２．２１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨＡｃｐ），１．５７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．０２（ｄ，Ｊ＝５．６，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ／ＥＳＩ+ｍ／ｚ７３５．５（Ｍ＋Ｎａ）+
Ｏ1−（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−（６−アミノカプロイル）−Ｄ−トレオニノール（１５）
１４（９．１ｇ，１２．７７ｍｍｏｌ）をピペリジン（１０ｍｌ）を含むＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解し，反応混合物を室温で約１時間保持した。真空下で溶媒を除去し，残渣をジクロロメタン中メタノールの１−１０％の勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して，１５をシロップとして得た（４．４６ｇ，７１％）。1Ｈ−ＮＭＲδ７．４８−６．９２（ｍ，１４Ｈ，芳香族），６．１６（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ，ＮＨ），４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３Ｔｈｒ），４．０２（ｍ，１Ｈ，Ｈ２Ｔｈｒ），３．８６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），３．５０（ｄｄ，Ｊ＝９．７，Ｊ＝４．４，１Ｈ，Ｈ１Ｔｈｒ），３．３７（ｄｄ，Ｊ＝９．７，Ｊ＝３．４，１Ｈ，Ｈ１’Ｔｈｒ），２．７８（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＡｃｐ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．６，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨＡｃｐ），１．７６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．５６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．５０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．２１（ｄ，Ｊ＝６．４，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ／ＥＳＩ+ｍ／ｚ４９１．５（Ｍ＋Ｈ）+
Ｏ1−（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−（６−（Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−α−ＯＦｍ−Ｌ−グルタミル）アミノカプロイル））−Ｄ−トレオニノール（１６）
Ｎ−Ｂｏｃ−α−ＯＦｍ−グルタミン酸（Ｂａｃｈｅｍ）（１．９１ｇ，４．４８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５１８ｍｇ，４．５０ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（９２８ｍｇ，４．５０ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で一夜撹拌した。１，３−ジシクロヘキシルウレアを濾別し，濾液に１５（２ｇ，４．０８ｍｍｏｌ）およびピリジン（２ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し，次に真空下で濃縮した。残渣を酢酸エチルと５％Ｎａ2ＨＣＯ3との間に分配し，有機層を先に記載されたようにブラインで抽出し，乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発させて，シロップを得た。ジクロロメタン中メタノールの２−１０％勾配を用いるカラムクロマトグラフィーにより，１６を白色泡状物として得た（３．４ｇ，９３％）。1Ｈ−ＮＭＲδ７．８６−６．９１（ｍ，２２Ｈ，芳香族），６．１３（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ，ＮＨ），５．９３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），５．４３（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ，ＮＨ），４．６３（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，Ｊ＝６．４，１Ｈ，Ｆｍ），４．５４（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，Ｊ＝６．４，１Ｈ，Ｆｍ），４．３８（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ），４．３（ｔ，Ｊ＝６．４，１Ｈ，Ｆｍ），４．１８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３Ｔｈｒ），４．０１（ｍ，１Ｈ，Ｈ２Ｔｈｒ），３．８８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝９．５，Ｊ＝４．４，１Ｈ，Ｈ１Ｔｈｒ），３．３７（ｄｄ，Ｊ＝９．５，Ｊ＝３．８，１Ｈ，Ｈ１’Ｔｈｒ），３．３２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＡｃｐ），３．０９（ｂｒｓ，１Ｈ，ＯＨ），２．３２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨＡｃｐ），２．１７（ｍ，３Ｈ，Ｇｌｕ），１．９７（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ），１．７７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．６１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ａｃｐ），１．５２（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ），１．２１（ｄ，Ｊ＝６．４，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ／ＥＳＩ+ｍ／ｚ９２０．５（Ｍ＋Ｎａ）+
Ｎ−（６−（Ｎ−α−ＯＦｍ−Ｌ−グルタミル）アミノカプロイル））−Ｄ−トレオニノール塩酸（１７）
１６（２ｇ，２．２３ｍｍｏｌ）をアニソール（１０ｍｌ）を含むメタノール（３０ｍｌ）に溶解し，この溶液にｘｍｌのジオキサン中４ＭＨＣｌを加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し，次に真空下で濃縮した。残渣をエタノールに溶解し，ｘｍｌのエーテルを加えることにより生成物を沈殿させた。沈殿物をエーテルで洗浄し，乾燥して，１７を無色泡状物（１ｇ，８０％）として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6−Ｄ2Ｏ）δ７．９７−７．４０（ｍ，８Ｈ，芳香族），４．７０（ｍ，１Ｈ，Ｆｍ），４．５５（ｍ，１Ｈ，Ｆｍ），４．４０（ｔ，Ｊ＝６．４，１Ｈ，Ｆｍ），４．１４（ｔ，Ｊ＝６．６，１Ｈ，Ｇｌｕ），３．９０（ｄｄ，Ｊ＝２．８，Ｊ＝６．４，１Ｈ，Ｈ３Ｔｈｒ），３．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ２Ｔｈｒ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，Ｊ＝７．０，１Ｈ，Ｈ１Ｔｈｒ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，Ｊ＝６．２，１Ｈ，Ｈ１’Ｔｈｒ），３．０７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＡｃｐ），２．１７ｍ，３Ｈ），１．９３（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｍ，２Ｈ），１．０４（ｄ，Ｊ＝６．４，３ＨＴｈｒ）．ＭＳ／ＥＳＩ+ｍ／ｚ５２６．５（Ｍ＋Ｈ）+
Ｎ−（６−（Ｎ−α−ＯＦｍ−Ｌ−グルタミル）アミノカプロイル））−Ｄ−トレオニノール−Ｎ2−ｉＢｕ−Ｎ10−ＴＦＡ−プテロイン酸コンジュゲート（１８）
ＤＭＦ（５ｍｌ）のＮ2−ｉＢｕ−Ｎ10−ＴＦＡ−プテロイン酸1（４８０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）の溶液に，１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ），ＥＤＣＩ（２８８ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）および１７（遊離塩基，６３１ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し，約３ｍｌに濃縮し，シリカゲルのカラムに負荷した。ジクロロメタン，次にジクロロメタン中メタノールの１−２０％の勾配で溶出して，１８（０．５ｇ，５１％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6−Ｄ2Ｏ）δ９．０９（ｄ，Ｊ＝６．８，１Ｈ，ＮＨ），８．９６（ｓ，１Ｈ，Ｈ７プテロイン酸），８．０２−７．１９（ｍ，１３Ｈ，芳香族，ＮＨ），５．３０（ｓ，２Ｈ，プテロイン酸），４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ），４．４１（ｄ，Ｊ＝６．８，２Ｈ，Ｆｍ），４．２９（ｔ，Ｊ＝６．８，１Ｈ，Ｆｍ），３．８９（ｄｄ，Ｊ＝６．２，Ｊ＝２．８，１Ｈ，Ｈ３Ｔｈｒ），３．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ２Ｔｈｒ），３．４８（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，Ｊ＝７．０，１Ｈ，ＨＩＴｈｒ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，Ｊ＝６．２，１Ｈ，Ｈ１’Ｔｈｒ），３．０６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＡｃｐ），２．８４（ｍ，１Ｈ，ｉＢｕ），２．２５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨＡｃｐ），２．１６（ｍ，３Ｈ，Ｇｌｕ），１．９９（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ），１．５２（ｍ，２ＨＡｃｐ），１．４２（ｍ，２ＨＡｃｐ），１．２７（ｍ，２ＨＡｃｐ），１．２０（ｓ，３Ｈ，ｉＢｕ），１．１９（ｓ，３Ｈ，ｉＢｕ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．２，３ＨＴｈｒ）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ９８４．５（Ｍ−Ｈ）-
Ｏ1−（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−（６−（Ｎ−α−ＯＦｍ−Ｌ−グルタミル）アミノカプロイル））−Ｄ−トレオニノール−Ｎ2−ｉＢｕ−Ｎ10−ＴＦＡ−プテロイン酸コンジュゲート（１９）
乾燥ピリジン（１５ｍｌ）中のコンジュゲート１８（１ｇ，１．０１ｍｍｏｌ）の溶液に，ｐ−アニシルクロロジフェニルメタン（４０５ｍｇ）を加え，反応混合物を水分から保護しながら室温で一夜撹拌した。メタノール（３ｍｌ）を加え，反応混合物を真空下で濃縮して，シロップを得た。残渣をジクロロメタンと５％ＮａＨＣＯ3との間に分配し，有機層をブラインで洗浄し，乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発乾固させた。ジクロロメタン中メタノールの０．５−１０％勾配を用いるカラムクロマトグラフィーにより，１９を無色泡状物（０．５ｇ，３９％）として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6−Ｄ2Ｏ）δ９．０９（ｄ，Ｊ＝６．８，１Ｈ，ＮＨ），８．９４（ｓ，１Ｈ，Ｈ７プテロイン酸），８．００−６．９３（ｍ，２７Ｈ，芳香族，ＮＨ），５．３０（ｓ，２Ｈ，プテロイン酸），４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ），４．４０（ｄ，Ｊ＝６．８，２Ｈ，Ｆｍ），４．２９（ｔ，Ｊ＝６．８，１Ｈ，Ｆｍ），３．９４（ｍ，２Ｈ，Ｈ３，Ｈ２Ｔｈｒ），３．７９（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），３．１１（ｄｄ，Ｊ＝８．６，Ｊ＝５．８，１Ｈ，Ｈ１Ｔｈｒ），３．０４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯＡｃｐ），２．９１（ｄｄ，Ｊ＝８．６，Ｊ＝６．４，１Ｈ，Ｈ１’Ｔｈｒ），２．８５（ｍ，１Ｈ，ｉＢｕ），２．２５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨＡｃｐ），２．１９（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ），２．１３（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ），１．９８（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ），１．５５（ｍ，２ＨＡｃｐ），１．４２（ｍ，２ＨＡｃｐ），１．２９（ｍ，２ＨＡｃｐ），１．２０（ｓ，３Ｈ，ｉＢＵ），１．１８（ｓ，３Ｈ，ｉＢｕ），１．００（ｄ，Ｊ＝６．４，３ＨＴｈｒ）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ１２５７．０（Ｍ−Ｈ）-
Ｏ1−モノメトキシトリチル）−Ｎ−（６−Ｎ−α−ＯＦｍ−Ｌ−グルタミルアミノカプロイル））−Ｄ−トレオニノール−Ｎ2−ｉＢｕ−Ｎ10−ＴＦＡ−プテロイン酸コンジュゲート
３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（２０）
ジクロロメタン（２ｍｌ）中の１９（５００ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ）の溶液に，２−シアノエチルテトライソプロピルホスホルジアミダイト（１５２μＬ，０．４８ｍｍｏｌ）を加え，次にピリジニウムトリフルオロ酢酸（９３ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し，次にヘキサン中でシリカゲルのカラムに負荷した。酢酸エチル−ヘキサン１：１，次に１％ピリジンの存在下で酢酸エチルおよび酢酸エチル−アセトン１：１を用いて溶出して，２０を無色泡状物（４８０ｍｇ，８３％）として得た。31ＰＮＭＲ δ１４９．４（ｓ），１４９．０（ｓ）
実施例２：２−ジチオピリジル活性化葉酸（３０）の合成（図９）
システアミン修飾葉酸３０の合成は図９に示される。モノメトキシトリチルシステアミン２１は，システアミンのチオール基をトリフルオロ酢酸中４−メトキシトリチルアルコールで選択的トリチル化することにより製造した。２１をＰｙＢＯＰの存在下でＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）とペプチドカップリングさせて，高収率で２２を得た。Ｎ−Ｆｍｏｃ基をピペリジンで穏やかに除去して，２３を得た。２３をｐ−（４−メトキシトリチル）アミノ安息香酸（ピリジン中ｐ−アミノ安息香酸と塩化４−メトキシトリチルとの反応により製造）と縮合させて，完全に保護されたコンジュゲート２４を得た。Ｎ−ＭＭＴｒ基を酢酸で選択的に切断して，２５を定量的収率で得た。２５とＮ2−ｉＢｕ−６−ホルミルプテリン２６，との間にシッフ塩基を形成させ9，ボラン−ピリジン複合体による還元を良好な収率で進行させて，完全に保護されたシステアミン−葉酸付加物２７を得た12。２７の保護基を塩基および酸で連続して切断して，チオール誘導体２９を得た。２９を２，２−ジピリジルジスルフィドでチオール交換反応を行い，所望のＳ−ピリジル活性化シントン３０を黄色粉体として得た。ＴＥＡ＋塩として単離：Ｄ2Ｏ中の１０の1ＨＮＭＲスペクトル：δ８．６８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−７），８．１０（ｄ，Ｊ＝３．６，１Ｈ，ｐｙｒ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．８，２Ｈ，ＰＡＢＡ），７．４３（ｍ，１Ｈ，ｐｙｒ），７．０４（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ，ｐｙｒ），６．９３（ｍ，１Ｈ，ｐｙｒ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ，ＰＡＢＡ），４．６０（ｓ，２Ｈ，６−ＣＨ2），４．２８（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ），３．３０−３．０８（ｍ，２Ｈ，システアミン），３．０５（ｍ，６Ｈ，ＴＥＡ），２．３７（ｍ，２Ｈ，システアミン），２．１０（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｕ），１．２０（ｍ，９Ｈ，ＴＥＡ）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ６０８．０２［Ｍ−Ｈ］-
３０をそのＴＥＡ+またはＮａ+塩として単離することにより，これがＤＭＳＯおよび／または水に溶解性となることに注目すべきである。このことは，コンジュゲーション反応において用いるのに重要な要件である。
実施例３：酵素的核酸の合成後コンジュゲーションによる核酸−葉酸コンジュゲート（３３）の形成（図１０）
オリゴヌクレオチド合成，脱保護および精製は，本明細書に記載されるように行った。５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を成長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖の５’末端に最後のホスホルアミダイトとしてカップリングさせた。固体支持体から切断し，塩基を脱保護した後，ジスルフィド修飾酵素的核酸分子３１（図１０）を，イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元してチオール基のマスクをはずして３２を得，これをゲル濾過により精製し，直ちに３０とコンジュゲート化した。得られたコンジュゲート３３を，ゲル濾過により過剰の葉酸から分離し，次に５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）中アセトニトリルの勾配を用いてＲＰ ＨＰＬＣにより精製した。脱塩は，ＲＰ ＨＰＬＣにより行った。４００ｍｇのジスルフィド修飾酵素的核酸分子３１で反応を行って，２００−２５０ｍｇ（５０−６０％収率）のコンジュゲート３３を得た。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより構造を確認した：１３［Ｍ−Ｈ］-１２０８４．７４（計算値１２０８３．８２）。この合成の別の方法は図１１に示される。
実施例２および３に示されるように，葉酸−システアミン付加物は，拡張可能な溶液相合成で良好な合計収率で製造することができる。この新規ターゲティングリガンドのチオール修飾オリゴヌクレオチドへのジスルフィドコンジュゲーションは，数グラムスケール合成に適している。９原子のスペーサーは，葉酸と，結合したオリゴヌクレオチドカーゴとの間に有用な空間的距離を提供する。重要なことには，ジスルフィド結合を介する葉酸のオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションは，蛋白質薬剤の細胞質への機能的侵入に必要であると示唆されている分子間距離を与えるはずである。
実施例４：ガラクトースおよびＮ−アセチル−ガラクトースアミンコンジュゲートの合成（図１３，１４および１５）
オリゴヌクレオチドの任意の所望の位置に取り込ませるのに適したヌクレオシドおよび非ヌクレオシド−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンコンジュゲートの両方を設計した。これらのモノマーの複数の取り込みにより，"グリコシドクラスター効果"を得ることができる。
すべての反応は，アルゴンの正圧下で無水溶媒中で行った。市販の試薬および無水溶媒はさらに精製することなく用いた。Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンはＰｆａｎｓｔｉｅｌ（Ｗａｕｋｅｇａｎ，ＥＬ）から，葉酸はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から，Ｄ−トレオニノールはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から，Ｎ−Ｂｏｃ−α−ＯＦｍグルタミン酸はＢａｃｈｅｍから購入した。1Ｈ（４００．０３５ＭＨｚ）および31Ｐ（１６１．９４７ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルは，特に記載しない限りＣＤＣｌ3中で測定し，化学シフトのｐｐｍはそれぞれＴＭＳおよびＨ3ＰＯ4を表す。分析的薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はＭｅｒｃｋ Ａｒｔ．５５５４ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ254プレートを用いて行い，フラッシュカラムクロマトグラフィーはＭｅｒｃｋ０．０４０−０．０６３ｍｍシリカゲル６０を用いて行った。ＲＮＡ合成，脱保護および精製の一般的方法は本明細書に記載されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒスペクトル計で測定した。エレクトロスプレイ質量スペクトルはＰＥ／Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３６５装置で測定した。
２’−（Ｎ−Ｌ−リシル）アミノ−５’−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシウリジン（２）
２’−（Ｎ−α，ε−ビス−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシル）アミノ−５’−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシウリジン（１）（４ｇ，３．５８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解し，ジエチルアミン（４ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で５時間撹拌し，次に濃縮（オイルポンプ）してシロップを得た。残渣をエタノールに溶解し，エーテルを加えて生成物を沈殿させた（１．８ｇ，７５％）。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6−Ｄ2０）δ７．７０（ｄ，Ｊ6,5＝８．４，１Ｈ，Ｈ６），７．４８−６．９５（ｍ，１３Ｈ，芳香族），５．９３（ｄ，Ｊ1',2'＝８．４，１Ｈ，Ｈ１’），５．４１（ｄ，Ｊ5,6＝８．４，１Ｈ，Ｈ５），４，６２（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），４．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ3',2'＝６．０，Ｈ３’），３．８１（ｓ，６Ｈ，２ｘＯＭｅ），３．３０（ｍ，４Ｈ，２Ｈ５’，ＣＨ2），１．６０−１．２０（ｍ，６Ｈ，３ｘＣＨ2）．ＭＳ／ＥＳＩ+ｍ／ｚ６７４．０（Ｍ＋Ｈ）+
Ｎ−アセチル−１，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（３）
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン（６．７７ｇ，３０．６０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２００ｍｌ）に懸濁し，トリエチルアミン（５０ｍｌ，３５９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を氷浴中で冷却し，無水酢酸（５０ｍｌ，５３０ｍｍｏｌ）を冷却しながら滴加した。懸濁液は徐々に透明になり，次にこれを室温で２時間撹拌した。次にこれを氷浴中で冷却し，メタノール（６０ｍｌ）を加え，１５分間撹拌を続けた。混合物を減圧下で濃縮し，残渣をジクロロメタンと１Ｎ ＨＣｌとの間に分配した。有機層を５％ＮａＨＣＯ3で２回，次にブラインで洗浄し，乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発乾固させて，１０ｇ（８４％）の３を無色泡状物として得た。1ＨＮＭＲは公表されているデータと一致した（Ｆｉｎｄｅｉｓ，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４３，４７７−４８５）。
２−アセトアミド−３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−クロロ−Ｄ−ガラクトピラノース（４）
この化合物は，３から，Ｆｉｎｄｅｉｓ（上掲）に記載されているようにして製造した。
ベンジル１２−ヒドロキシドデカノエート（５）
１２−ヒドロキシドデカン酸（１０．６５ｇ，４９．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（７０ｍｌ）中の冷却（０℃）撹拌溶液に，ＤＢＵ（８．２ｍｌ，５４．１ｍｍｏｌ）を加え，次に臭化ベンジル（６．４４ｍｌ，５４．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一夜放置し，次に減圧下で濃縮し，１ＮＨＣｌとエーテルとの間に分配した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ3で洗浄し，Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し，蒸発させた。ヘキサン中酢酸エチルの２０−３０％勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより，ベンジルエステルを白色粉体（１４．１ｇ，９３．４％）として得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータは公開されている値と一致した33。
１２’−ベンジルヒドロキシドデカノイル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（６）
１−クロロ糖４（４．２６ｇ，１１．６７ｍｍｏｌ）およびベンジル１２−ヒドロキシドデカノエート（５）（４．３ｇ，１３．０３ｍｍｏｌ）をニトロメタン−トルエン１：１（１２２ｍｌ）にアルゴン下で溶解し，Ｈｇ（ＣＮ）2（３．５１ｇ，１３．８９ｍｍｏｌ）および粉体モレキュラーシーブ４Ａ（１．２６ｇ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し，濾過し，濾液を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンとブラインとの間に分配し，有機層をブラインで，次に０．５ＭＫＢｒで洗浄し，乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発させてシロップを得た。ヘキサン中アセトンの１５−３０％勾配を用いるフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより，生成物６を無色泡状物（６ｇ，８１％）として得た。1Ｈ−ＮＭＲδ７．４３（ｍ，５Ｈ，フェニル），５．６０（ｄ，１Ｈ，ＪNH,2＝８．８，ＮＨ），５．４４（ｄ，Ｊ4,3＝３．２，１Ｈ，Ｈ４），５．４０（ｄｄ，Ｊ3,4＝３．２，Ｊ3,2＝１０．８，１Ｈ，Ｈ３），５．１９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2Ｐｈ），４．８０（ｄ，Ｊ1,2＝８．０，１Ｈ，Ｈ１），４．２３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），３．９９（ｍ，３Ｈ，Ｈ２，Ｈ６），３．５６（ｍ，１Ｈ，Ｈ５），２．４３（ｔ，Ｊ＝７．２，２Ｈ，ＣＨ2），２．２２（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）．２．１２（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．６４（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ2），１．３３（ｂｒｍ，１４Ｈ，７ｘＣＨ2）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ６３４．５（Ｍ−Ｈ）-
１２’−ヒドロキシドデカノイル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（７）
コンジュゲート６（２ｇ，３．１４ｍｍｏｌ））をエタノール（５０ｍｌ）に溶解し，５％Ｐｄ−Ｃ（０．３ｇ）を加えた。反応混合物を４５ｐｓｉのＨ2で一夜水素化し，触媒を濾別し，濾液を蒸発乾固させて，純粋な７（１．７ｇ，定量的）を白色泡状物として得た。1Ｈ−ＮＭＲδ５．７３（ｄ，１Ｈ，ＪNH,2＝８．４，ＮＨ），５．４４（ｄ，Ｊ4,3＝３．０，１Ｈ，Ｈ４），５．４０（ｄｄ，Ｊ3,4＝３．０，Ｊ3,2＝１１．２，１Ｈ，Ｈ３），４．７８（ｄ，Ｊ1,2＝８．８，１Ｈ，Ｈ１），４．２１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），４．０２（ｍ，３Ｈ，Ｈ２，Ｈ６），３．５５（ｍ，１Ｈ，Ｈ５），２．４２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．２３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０９（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０４（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．６９（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ2），１．３６（ｂｒ，ｍ，１４Ｈ，７ｘＣＨ2）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ５４４．０（Ｍ−Ｈ）-
２’−（Ｎ−α，ε−ビス−（１２’−ヒドロキシドデカノイル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース）−Ｌ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−５’−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルウリジン（９）
７（１．０５ｇ，１．９２ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ中に溶解し，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２７ｇ，２．３５ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．５５ｇ，２．６７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌し，次にセライトパッドを通して濾過し，濾液を減圧下で濃縮した。粗ＮＨＳｕエステル８をジイソプロピルエチルアミン（０．６７ｍｌ，３．８５ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＤＭＦ（１３ｍｌ）に溶解し，この溶液にヌクレオシド２（０．６４ｇ，０．９５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌し，次に減圧下で濃縮した。残渣を水とジクロロメタンとの間に分配し，水性層をジクロロメタンで抽出し，有機層を合わせ，乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発させて，シロップを得た。酢酸エチル中メタノールの２−３％勾配を用いるフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより，９を無色泡状物として得た（１．０４ｇ，６３％）。1ＨＮＭＲδ７．４２（ｄ，Ｊ6,5＝８．４，１Ｈ，Ｈ６Ｕｒｄ），７．５３−６．９７（ｍ，１３Ｈ，芳香族），６．１２（ｄ，Ｊ1',2'＝８．０，１Ｈ，Ｈ−１’），５．４１（ｍ，３Ｈ，Ｈ５Ｕｒｄ，Ｈ４ＮＡｃＧａｌ），５．１５（ｄｄ，Ｊ3,4＝３．６，Ｊ3,2＝１１．２，２Ｈ，Ｈ３ＮＡｃＧａｌ），４．８７（ｄｄ，Ｊ2',3'＝５．６，Ｊ2',1'＝８．０，１Ｈ，Ｈ２’），４．６３（ｄ，Ｊ1,2＝８．０，２Ｈ，Ｈ１ＮＡｃＧａｌ），４．４２（ｄ，Ｊ3',2'＝５．６，１Ｈ，Ｈ３’），４．２９−４．０４（ｍ，９Ｈ，Ｈ４’，Ｈ２ＮＡｃＧａｌ，Ｈ５ＮａｃＧａｌ，ＯＣＨ2），３．９５−３．８２（ｍ，８Ｈ，Ｈ６ＮＡｃＧａｌ，２ｘＯＭｅ），３．６２−３．４２（ｍ，４Ｈ，Ｈ５’，Ｈ６ＮＡｃＧａｌ），３．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．４０−１．９７（ｍ，２８Ｈ，ＣＨ2，Ａｃ），１．９５−１．３０（ｍ，５０Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ１７２７．０（Ｍ−Ｈ）-
２’−（Ｎ−α，ε−ビス−（１２’−ヒドロキシドデカノイル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース）−Ｌ−リシル）−アミノ−２’−デオキシ−５’−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルウリジン３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１０）
コンジュゲート９（０．８７ｇ，０．５０ｍｍｏｌ）をアルゴン下で乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し，ジイソプロピルエチルアミン（０．３６ｍｌ，２．０７ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（２１μＬ，０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を０℃に冷却し，２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．１９ｍｌ，０．８５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し，次に０℃に冷却して，無水エタノール（０．５ｍｌ）で急冷した。１０分間撹拌した後，溶液を減圧下で濃縮し（４０℃），残渣をジクロロメタンに溶解し，ヘキサン−酢酸エチル１：１，次に酢酸エチル，最後に酢酸エチル−アセトン１：１（１％トリエチルアミンを溶媒に加えた）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って，ホスホルアミダイト１０（６８０ｍｇ，６９％）を得た。
31Ｐ−ＮＭＲδ１５２．０（ｓ），１４９．３（ｓ）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ１９２８．０（Ｍ−Ｈ）-
Ｎ−（１２’−ヒドロキシドデカノイル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース）−Ｄ−トレオニノール（１１）
１２’−ヒドロキシドデカノイル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース７（８５０ｍｇ，１．５６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し，この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２１５ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３８６ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌し，沈殿物を濾別し，濾液にＤ−トレオニノール（１９７ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一夜撹拌し，真空下で濃縮した。残渣をジクロロメタンと５％ＮａＨＣＯ3との間に分配し，有機層をブラインで洗浄し，乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発させて，シロップを得た。ジクロロメタン中メタノールの１−１０％勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより，１１を無色油状物として得た（０．７ｇ，７１％）。1Ｈ−ＮＭＲδ６．３５（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ，ＮＨ），５．７７（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ，ＮＨ），５．４４（ｄ，Ｊ4,3＝３．６，１Ｈ，Ｈ４），５．３７（ｄｄ，Ｊ3,4＝３．６，Ｊ3,2＝１１．２，１Ｈ，Ｈ３），４．７７（ｄ，Ｊ1,2＝８．０，１Ｈ，Ｈ１），４．２８−４．１８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ2，ＣＨ），４．０７−３．８７（ｍ，６Ｈ），３．５５（ｍ，１Ｈ，Ｈ５），３．０９（ｄ，Ｊ＝３．２，１Ｈ，ＯＨ），３．０２（ｔ，Ｊ＝４．６，１Ｈ，ＯＨ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．４，２Ｈ，ＣＨ2），２．２３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１０（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０４（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７６−１．６１（ｍ，２ｘＣＨ2），１．３５（ｍ，１４Ｈ，７ｘＣＨ2），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．４，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）-
１−Ｏ−（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−（１２’−ヒドロキシドデカノイル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース）−Ｄ−トレオニノール（１２）
乾燥ピリジン（１０ｍｌ）中の１１（６８０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）の溶液に，ｐ−アニシルクロロトリフェニルメタン（４３０ｍｇ，１．３９ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を水分から保護しながら一夜撹拌した。メタノール（３ｍｌ）を加え，溶液を１５分間撹拌し，真空下で蒸発させた。残渣をジクロロメタンと５％ＮａＨＣＯ3との間に分配し，有機層をブラインで洗浄し，乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4），蒸発させてシロップを得た。ジクロロメタン中メタノールの１−３％勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより１２を白色泡状物として得た（０．７５ｇ，７７％）。1Ｈ−ＮＭＲδ７．４８−６．９２（ｍ，１４Ｈ，芳香族），６．１５（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ，ＮＨ），５．５６（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ，ＮＨ），５．４５（ｄ，Ｊ4,3＝３．２，１Ｈ，Ｈ４），５．４０（ｄｄ，Ｊ3,4＝３．２，Ｊ3,2＝１１．２，１Ｈ，Ｈ３），４．８０（ｄ，Ｊ1,2＝８．０，１Ｈ，Ｈ１），４．３−４．１３（ｍ，３Ｈ，ＣＨ2，ＣＨ），４．２５−３．９２（ｍ，４Ｈ，Ｈ６，Ｈ２，ＣＨ），３．８９（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ），３．５４（ｍ，２Ｈ，Ｈ５，ＣＨ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝３．４，Ｊ＝９．８，１Ｈ，ＣＨ），３．１２（ｄ，Ｊ＝２．８，１Ｈ，ＯＨ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．６，２Ｈ，ＣＨ2），２．２２（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．１３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８０−１．５５（ｍ，２ｘＣＨ2），１．３７（ｍ，１４Ｈ，７ｘＣＨ2），１．２１（ｄ，Ｊ＝６．４，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ／ＥＳＩ-ｍ／ｚ９０３．５（Ｍ−Ｈ）-
１−Ｏ−（４−モノメトキシトリチル）−Ｎ−（１２’−ヒドロキシドデカノイル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース）−Ｄ−トレオニノール３−Ｏ−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（１３）
コンジュゲート１２（１．２ｇ，１．３３ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）にアルゴン下で溶解し，ジイソプロピルエチルアミン（０．９４ｍｌ，５．４０ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（５５μＬ，０．６９ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を０℃に冷却し，２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−クロロホスホルアミダイト（０．５１ｍｌ，２．２９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間撹拌し，次に０℃に冷却し，無水エタノール（０．５ｍｌ）で急冷した。１０分間撹拌した後，溶液を減圧下で濃縮し（４０℃），残渣をジクロロメタンに溶解し，シリカゲルのカラムでヘキサン中酢酸エチルの５０−８０％勾配（１％トリエチルアミン）を用いてクロマトグラフィーを行って，ホスホルアミダイト１３（１．２ｇ，８２％）を得た。31Ｐ−ＮＭＲδ１４９．４１（ｓ），１４９．２３（ｓ）
オリゴヌクレオチド合成
ホスホルアミダイト１０および１３を，標準的２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオシドホスホルアミダイトとともに用いた。合成は，３９４（ＡＢＩ）合成機で，改変した２．５μｍスケールのプロトコルを用いて，２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護ヌクレオシドについては５分間のカップリング工程を，２’−Ｏ−メチルヌクレオシドについては２．５分間のカップリング工程を用いて行った。放出されたトリチルカチオンの測定に基づいて，ホスホルアミダイト１０のカップリング効率は５０％より低かったが，ホスホルアミダイト１３のカップリング効率は，典型的には９５％より高かった。合成が完了した後に，オリゴヌクレオチドを脱保護した。５’−トリチル基はオリゴマーに結合させたままにして，精製を容易にした。固体支持体からの切断および保護基の脱離は本明細書に記載されるようにして行ったが，ただし，メチルアミン処理の前にＦｍ保護を除去するためにＤＭＦ中２０％ピペリジンを１５分間用いた。ＳＥＰ−ＰＡＫＣ−１８吸着剤の短いカラムを用いて，５’−トリチル化オリゴマーをより短い（トリチルオフ）失敗配列から分離した。カラム上で１％トリフルオロ酢酸で処理することにより，結合したトリチル化オリゴマーを脱トリチル化し，トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液で中和し，次に溶出した。逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。ホスホルアミダイト１３を用いて合成することができるＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンコンジュゲートの例は，図１５に示される。
リボザイムコンジュゲートの構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより確認した。
モノマー合成
２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンコンジュゲート
ビス−Ｆｍｏｃ保護リシンリンカーは，ＥＥＤＱ触媒ペプチドカップリングを用いて２’−アミノ−２’−デオキシウリジンの２−アミノ基に結合させた。５’−ＯＨを４，４’−ジメトキシトリチル基で保護して１を得，次にジエチルアミンでＮ−Ｆｍｏｃ基を切断して，シントン２を高い合計収率で得た。
２−アセトアミド−３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−クロロ−Ｄ−ガラクトピラノース４は，報告されている方法（Ｆｉｎｄｅｉｓ（上掲））をわずかに改変して合成した。水銀塩を触媒として４を１２−ヒドロキシドデカン酸５のベンジルエステルでグリコシル化して，グリコシド６を８１％の収率で得た。ベンジル保護基を水素化分解して，７を定量的収率で得た。糖誘導体とヌクレオシドシントンとのカップリングは，７のカルボン酸官能基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル８として予め活性化し，次にリシル−２’−アミノウリジンコンジュゲート２にカップリングさせることにより行った。次に，最終的なコンジュゲート９を標準的条件下でホスフィチル化して，ホスホルアミダイト１０を６９％の収率で得た。
Ｄ−トレオニノール−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンコンジュゲート
上述と同様の方法を用いて，Ｄ−トレオニノールを７にカップリングさせて，コンジュゲート１１を良好な収率で得た。モノメトキシトリチル化，続いてホスフィチル化して，所望のホスホルアミダイト１３を得た。
実施例２：オキシム結合核酸／ペプチドコンジュゲートの合成（図１６および１７）
１２−ヒドロキシドデカン酸ベンジルエステル
臭化ベンジル（１０．２８ｍｌ，８６．４５ｍｍｏｌ）を，０℃で激しく撹拌しながら，純粋なＤＭＦ（１２０ｍｌ）中の１２−ヒドロキシドデカン酸（１７ｇ，７８．５９ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（１２．９３ｍｌ，８６．４５ｍｍｏｌ）の溶液に滴加した。添加が完了した後，反応混合物を室温まで暖め，撹拌しながら一夜放置した。ＴＬＣ（ヘキサン−酢酸エチル３：１）は，出発物質が完全に変換されたことを示した。ＤＭＦを減圧下で除去し，残渣をエチルエーテルと１ＮＨＣｌとの間に分配した。有機相を分離し，飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾別し，濾液を蒸発乾固させた。残渣をヘキサンから結晶化して，２１．１５ｇ（９２％）の表題化合物を白色粉体として得た。
１２−Ｏ−Ｎ−フタロイル−ドデカン酸ベンジルエステル（１５）
ジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ，１６．９６ｍｌ，１０７．７ｍｍｏｌ）を，−２０℃から−３０℃で撹拌しながら純粋なＴＨＦ（２５０ｍｌ）中の１２−ヒドロキシドデカン酸ベンジルエステル（２１ｇ，７１．８ｍｍｏｌ），トリフェニルホスフィン（２８．２９ｇ，１０７．７ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（１２．８８ｇ，７８．９８ｍｍｏｌ）の混合物に滴加した。反応混合物をこの温度でさらに２−３時間撹拌し，その後，ＴＬＣ（ヘキサン−酢酸エチル３：１）は反応の完了を示した。溶媒を真空下で除去し，残渣をエーテル（２５０ｍｌ）で処理した。形成されたトリフェニルホスフィンオキシドの沈殿物を濾別し，母液を蒸発乾固させ，残渣を塩化メチレンに溶解し，ヘキサン−酢酸エチル（７：３）でシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。適当な画分をプールし，蒸発乾固させて，２６．５ｇ（８４．４％）の化合物１５を得た。
１２−Ｏ−Ｎ−フタロイル−ドデカン酸（１６）
化合物１５（２６．２ｇ，５９．９ｍｍｏｌ）を２２５ｍｌのエタノール−酢酸エチル（３．５：１）混合物に溶解し，１０％Ｐｄ／Ｃ（２．６ｇ）を加えた。反応混合物をＰａｒｒ装置で３時間水素化した。反応混合物をセライトを通して濾過し，蒸発乾固させた。残渣をメタノールから結晶化させて，１５．６４ｇ（７５％）の化合物１６を得た。
１２−Ｏ−Ｎ−フタロイル−ドデカン酸２，３−ジ−ヒドロキシ−プロピルアミド（１８）
純粋なＤＭＦ（１５０ｍｌ）中の，化合物１６（１５．０３ｇ，４４．０４ｍｍｏｌ），ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．９ｇ，５２．８５ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６．０８ｇ，５２．８５ｍｍｏｌ）の混合物を室温で一夜撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン−メタノール９：１）は，出発物質が完全に変換されて，ＮＨＳエステル１７が形成されたことを示した。次に，アミノプロパンジオール（４．０１ｇ，４４ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温でさらに２時間撹拌した。形成されたジシクロヘキシルウレアの沈殿物を濾過により除去し，濾液を減圧下で蒸発させた。残渣を酢酸エチルと飽和水性炭酸水素ナトリウムとの間に分配させた。全混合物を濾過して不溶性物質を除去し，透明な層を分離した。有機相を真空下で結晶物質が形成されるまで濃縮した。沈殿物を濾別し，冷酢酸エチルで洗浄して，１０．８６ｇの化合物１７を得た。合わせた母液および洗浄液を蒸発乾固させ，酢酸エチルから結晶化させて，３．２１ｇの化合物１８を得た。合計収量１４．０７ｇ（７３．５％）。
１２−Ｏ−Ｎ−フタロイル−ドデカン酸２−ヒドロキシ−３−ジメトキシトリチルオキシ−プロピルアミド（１９）
塩化ジメトキシトリチル（１２．０７ｇ，３５．６２ｍｍｏｌ）を，０℃で純粋なピリジン（１３０ｍｌ）中の化合物１８（１４．０７ｇ，３２．３８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。反応溶液を０℃で一夜保持した。次に，これをＭｅＯＨ（１０ｍｌ）で急冷し，蒸発乾固させた。残渣を塩化メチレンに溶解し，飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し，硫酸ナトリウムで乾燥し，蒸発乾固させた。残渣を，ヘキサン中アセトンの段階勾配（３：７から１：１）を溶出液として用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。適当な画分をプールし，蒸発させて，１４．７３ｇ（６２％）の化合物１９を無色油状物として得た。
１２−Ｏ−Ｎ−フタロイル−ドデカン酸２−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホスホルアミダイト）−３−ジメトキシトリチルオキシ−プロピルアミド（２０）
Ｓａｎｇｈｖｉら（２０００，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１７５−８１）にしたがってホスフィチル化した。０．５％のトリエチルアミンを含むヘキサン中アセトンの段階勾配（１：４から３：７）を用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率約８２％，無色油状物。
ペプチドの酸化
ペプチド（３．３ｍｇ，３．３ｐｍｏｌ）を１０ｍＭ ＡｃＯＮａに溶解し，２当量の過ヨウ素酸ナトリウム（１００ｍＭ水溶液）を加えた。最終反応用量は０．５ｍｌであった。１０分後，反応混合物を，分析的ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ５ｕ Ｃ１８ ３００Ａ（１５０ｘ４．６ｍｍ）カラム；溶媒Ａ：５０ｍＭ Ｋ3ＰＯ4（ｐＨ３）；溶媒Ｂ：ＭｅＣＮ中３０％溶媒Ａ；勾配Ｂ，３０分間）を用いて精製した。適当な画分をプールし，ＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮乾固した。収率：定量的。
Ｈｅｒｚｙｍｅ−ＯＮＨ 2 −リンカーとＮ−グリオキシルペプチドのコンジュゲーション反応（図１７）
５’末端リンカーを有するＨｅｒｚｙｍｅ（配列番号１３）（１００ＯＤ）を５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ３，反応用量１ｍｌ）中の酸化ペプチド（３−５当量）と混合し，室温で２４−４８時間保持した。反応混合物を分析的ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ５ｕ Ｃ１８３００Ａ（１５０ｘ４．６ｍｍ）カラム；溶媒Ａ：１０ｍＭＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：１０ｍＭＴＥＡＡ／ＭｅＣＮ）を用いて精製した。適当な画分をプールし，ＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮乾固して，所望のコンジュゲートを得た。ＥＳＭＳ：計算値：１２６９９，実測値：１２６９８。
実施例５：リン脂質酵素的核酸コンジュゲートの合成（図１９）
リン脂質酵素的核酸コンジュゲート（図１９を参照）は，ＡＢＩ３９４合成機での固相オリゴヌクレオチド合成の間に，標準的合成化学を用いて，酵素的核酸分子（Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標），配列番号２４）の５’末端にＣ１８Ｈ３７ホスホルアミダイトをカップリングさせることにより製造した。３’−ＡｄＴ−ジ−グリセロール−５’（Ａはアデノシンであり，ｄＴは２’−デオキシチミジンであり，ジ−グリセロールはジ−ＤＭＴ−グリセロールリンカーである（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓカタログ番号ＣＬＰ−５２１５））を含む５’末端リンカーを用いて，標準的合成化学を用いて２つのＣ１８Ｈ３７ホスホルアミダイトを酵素的核酸分子に結合させた。さらに追加の当量のＣ１８Ｈ３７ホスホルアミダイトを用いてビスカップリングを行った。同様にして，図１８に示される他の核酸コンジュゲートを同様の方法論にしたがって製造することができる。
実施例６：ＰＥＧ酵素的核酸コンジュゲートの合成（図２０）
４０Ｋ−ＰＥＧ酵素的核酸コンジュゲート（図２０を参照）は，ＰＥＧ誘導体（Ｓｈｅａｒ−Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ，ＣＡＴ番号ＰＥＧ２−ＮＨＳ）を酵素的核酸分子（Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標），配列番号２４）の５’末端に合成後Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルカップリングさせることにより製造した。３’−ＡｄＴ−Ｃ６−アミン−５’（Ａはアデノシンであり，ｄＴ−Ｃ６−アミンはＣ５連結６炭素アミンリンカーを有する２’−デオキシチミジンである）を含む５’末端リンカー（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号１０−１０３９−０５）を用いて，ＰＥＧ誘導体をＮＨＳカップリング化学を用いて酵素的核酸分子に結合させる。
５’末端にＣ６ｄＴ−ＮＨ2を有するアンジオザイム（登録商標）を合成し，本明細書に記載される標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いて脱保護した。次に粗サンプルを逆相カラムに負荷し，塩化ナトリウム溶液（０．５Ｍ）ですすいだ。次に塩化ナトリウムの濃度が０に近くなるまでサンプルをカラム上で水で脱塩した。アセトニトリルを用いてカラムからサンプルを溶出させた。次に粗生成物を濃縮し，凍結乾燥した。
５’−アミノリンカー（５０ｍｇ）を有する粗物質（Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標））をホウ酸ナトリウム緩衝液（１．０ｍＬ，ｐＨ９．０）に溶解した。ＰＥＧ ＮＨＳエステル（２００ｍｇ）を無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解した。次に，Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）緩衝液をＰＥＧ ＮＨＳエステル溶液に加えた。混合物をただちに５分間ボルテックスした。酢酸ナトリウム緩衝液（５ｍＬ，ｐＨ５．２）を用いて反応を急冷した。次に，コンジュゲートした物質を，イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーにより精製した。
実施例７：ＰＥＧリボザイム酸コンジュゲートの薬物動態学（図２１）
４８匹の雌Ｃ５７Ｂ１／６マウスに，３０ｍｇ／ｋｇのＡｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）および３０ｍｇ／ｋｇのＡｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）／４０ＫＰＥＧコンジュゲートを１回皮下（ＳＣ）ボーラスとして投与した。リボザイム注入の２４時間後に血漿を回収した。血漿サンプルを，ハイブリダイゼーションアッセイにより，全長リボザイムについて分析した。
Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）の５’および３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドを，一方のオリゴがビオチンを有し，他方のオリゴがＦＩＴＣを有するように合成した。ビオチンオリゴおよびＦＴＴＣ標識オリゴの対を１μｇ／ｍｌで既知濃度のＡｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）とともに７５℃で５分間インキュベートした。室温で１０分後，混合物を９６ウエルプレートのストレプトアビジン被覆ウエルに２時間結合させた。プレートをＴｒｉｓ−食塩水および界面活性剤で洗浄し，ペルオキシダーゼ標識抗ＦＴＴＣ抗体を加えた。１時間後，ウエルを洗浄し，酵素反応を発色させ，ＥＬＩＳＡプレートリーダーで読んだ。結果を図２１に示す。
実施例８：リン脂質リボザイムコンジュゲートの薬物動態学（図２２）
７２匹の雌Ｃ５７Ｂ１／６マウスに，３０ｍｇ／ｋｇのＡｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）およびリン脂質とコンジュゲート化した３０ｍｇ／ｋｇのＡｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）を１回静脈内（４）ボーラスとして投与した（図１９）。リボザイム注入の３時間後，血漿を採取した。血漿サンプルをハイブリダイゼーションアッセイにより全長リボザイムについて分析した。
Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）の５’および３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドを，一方のオリゴにビオチン，他方のオリゴにＦＩＴＣを有するよう合成した。ビオチンオリゴおよびＦＩＴＣ標識オリゴの対を１μｇ／ｍｌで既知の濃度のＡｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）とともに７５℃で５分間インキュベートする。室温で１０分間インキュベートした後，混合物を９６ウエルプレートのストレプトアビジン被覆ウエルに２時間結合させる。プレートをＴｒｉｓ−食塩水および界面活性剤で洗浄し，ペルオキシダーゼ標識抗ＦＩＴＣ抗体を加える。１時間後，ウエルを洗浄し，酵素反応を発色させ，次にＥＬＩＳＡプレートリーダーで読む。結果は図２２に示される。
実施例９：生物分解性リンカーを有する蛋白質またはペプチドコンジュゲートの合成（図２４−２６，および２９）
蛋白質およびペプチドは，オキシムおよびモルホリノ結合を用いて，本発明の生物分解性核酸リンカー分子を介して，種々の分子，例えばＰＥＧにコンジュゲート化することができる。例えば，治療用抗体をＰＥＧにコンジュゲート化させて，改良することができる。図２４は，生物分解性リンカーを用いてＰＥＧにコンジュゲート化させたペプチドまたは蛋白質を合成する合成法の非限定的例を示す。示されている例は，蛋白質コンジュゲート用のものである。他のコンジュゲートは，蛋白質またはペプチドをＰＥＧ以外の分子，例えば，小分子，トキシン，放射性同位体，ペプチドまたは他の蛋白質にコンジュゲート化して，同様の様式で合成することができる。
（ａ）目的とする蛋白質，例えば，抗体またはインターフェロンを，過ヨウ素酸ナトリウム等で酸化される末端セリンまたはトレオニン成分を有するように合成する。次に，酸化された蛋白質を，生物分解性であるように設計された核酸リンカー分子，例えば，オキシアミノ（Ｏ−ＮＨ2）官能基を含むシチジン−デオキシチミジン，シチジン−デオキシウリジン，アデノシン−デオキシチミジン，またはアデノシン−デオキシウリジンダイマーにカップリングさせる。他の生物分解性核酸リンカー，例えば生物分解性であるように設計された他のダイマー，トリマー，テトラマー等を同様に用いることができる。示される例は５’−オキシアミノ成分を利用しているが，他の例では，核酸分子中の他の位置で，例えば，２’位，３’位，または核酸塩基位置でオキシアミノを用いることができる；
（ｂ）次に，蛋白質／核酸コンジュゲートを酸化してジアルデヒド官能基を生成し，アミノ基を含むＰＥＧ分子（Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ），例えば，アミノリンカーを有するＰＥＧ分子にカップリングさせる。他のアミノ含有分子は，図面に示されるように，例えば，小分子，トキシン，または放射性同位体標識分子にコンジュゲート化することができる。
蛋白質およびペプチドは，オキシムおよびホスホルアミデート結合を用いて本発明の生物分解性核酸リンカー分子を介してＰＥＧ等の種々の分子とコンジュゲート化することができる。図２５は，生物分解性リンカーを用いてＰＥＧにコンジュゲート化したペプチドまたは蛋白質を合成する合成方法の非限定的例を示す。示される例は，蛋白質コンジュゲート用のものである。他のコンジュゲートは，蛋白質またはペプチドをＰＥＧ以外の分子，例えば，小分子，トキシン，放射性同位体，ペプチドまたは他の蛋白質にコンジュゲート化して，同様に合成することができる。目的とする蛋白質，例えば，抗体またはインターフェロンを，過ヨウ素酸ナトリウム等で酸化される末端セリンまたはトレオニン成分を有するように合成する。次に酸化した蛋白質を，生物分解性であるように設計された核酸リンカー分子，例えば，オキシアミノ（Ｏ−ＮＨ2官能基および末端リン酸基を含むシチジン−デオキシチミジン，シチジン−デオキシウリジン，アデノシン−デオキシチミジン，またはアデノシン−デオキシウリジンダイマーにカップリングさせる。末端リン酸基は，化学的リン酸化試薬，例えば，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１９０９−０２，１０−１９１３−０２，１０−１９１４−０２，および１０−１９１８−０２を用いて，核酸分子の合成の間に導入することができる。他の生物分解性核酸リンカー，例えば，生物分解性であるように設計された他のダイマー，トリマー，テトラマー等を同様に用いることができる。示される例においては５’−オキシアミノ成分を使用しているが，他の例では，核酸分子中の他の位置，例えば，２’位，５’位，または核酸塩基位置においてオキシアミノを用いることができる。次に蛋白質／核酸コンジュゲートの末端リン酸基を活性化試薬，例えば，ＮＭＩおよび／またはテトラゾールで活性化し，アミノ基（Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ）を含むＰＥＧ分子，例えば，アミノリンカーを有するＰＥＧ分子にカップリングさせる。他のアミノ含有分子，例えば，分子，トキシン，または放射性同位体標識分子は，図面に示されるようにコンジュゲート化することができる。
蛋白質およびペプチドは，ホスホルアミデート結合を用いて本発明の生物分解性核酸リンカー分子を介して，ＰＥＧ等の種々の分子とコンジュゲート化することができる。図２６は，生物分解性リンカーを用いてＰＥＧにコンジュゲート化させたペプチドまたは蛋白質を合成する合成方法の非限定的例を示す。示される例は，蛋白質コンジュゲートについてのものである。他のコンジュゲートは，蛋白質またはペプチドをＰＥＧ以外の分子，例えば，小分子，トキシン，放射性同位体，ペプチドまたは他の蛋白質にコンジュゲート化して，同様に合成することができる。
（ａ）生物分解性であるように設計された核酸リンカー分子，例えば，シチジン−デオキシチミジン，シチジン−デオキシウリジン，アデノシン−デオキシチミジン，またはアデノシン−デオキシウリジンダイマーを，末端リン酸基を有するように合成する。他の生物分解性核酸リンカー，例えば，生物分解性であるように設計された他のダイマー，トリマー，テトラマーを同様に用いることができる。次に，蛋白質／核酸コンジュゲート末端リン酸基を活性化試薬，例えば，ＮＭＩおよび／またはテトラゾールで活性化し，アミノ基（Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ）を含むＰＥＧ分子，例えばアミノリンカーを有するＰＥＧ分子とカップリングさせる。図に示されるように，他のアミノ含有分子，例えば，小分子，トキシン，または放射性同位体標識分子をコンジュゲート化させることができる。末端保護基，例えば，ジメトキシトリチル基をコンジュゲートから除去し，ホスフィチル化試薬，例えば，Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルクロロホスホルアミダイトを用いて末端ホスファイト基を導入する。
（ｂ）次に，ＰＥＧ／核酸コンジュゲートを，アミノ基，例えば，ペプチドまたは蛋白質の適切に保護されたアミノ末端またはアミノ側鎖を含むペプチドまたは蛋白質に，またはアミノリンカーを介してカップリングさせる。次に，コンジュゲートを酸化し，保護基を除去して，生物分解性リンカーを含む蛋白質／ＰＥＧコンジュゲートを得る。
蛋白質およびペプチドは，カップリングした蛋白質に基づくホスホルアミダイトからのホスホルアミデート結合を用いて，本発明の生物分解性核酸リンカー分子を介して，種々の分子，例えばＰＥＧとコンジュゲート化することができる。図２９は，生物分解性リンカーを用いてＰＥＧにコンジュゲート化したペプチドまたは蛋白質を合成する合成方法の非限定的例を示す。ここで示される例は蛋白質コンジュゲート用のものである。同様にして，他のコンジュゲート，例えばＰＥＧ以外の分子，例えば，小分子，トキシン，放射性同位体，ペプチドまたは他の蛋白質にコンジュゲート化した蛋白質またはペプチドを合成することができる。目的とする蛋白質，例えば抗体またはインターフェロンを，Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルクロロホスホルアミダイト等でホスフィチル化される末端セリン，トレオニンまたはチロシン成分を有するように合成する。次に，ホスフィチル化した蛋白質を，生物分解性であるように設計した核酸リンカー分子，例えば，図１８に示されるようなコンジュゲート化ＰＥＧ分子を含むシチジン−デオキシチミジン，シチジン−デオキシウリジン，アデノシン−デオキシチミジン，またはアデノシン−デオキシウリジンダイマーにカップリングさせる。他の生物分解性核酸リンカー，例えば，生物分解性であるように設計された他のダイマー，トリマー，テトラマー等を同様にして用いることができる。
実施例１０：ＨＢＶを標的とするガラクトースアミンリボザイムコンジュゲート
Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡ（ＨＢＶ）に対するヌクレアーゼ耐性リボザイム（ＨｅｐＢｚｙｍｅ（登録商標））は，前臨床開発の初期段階にある。ＨｅｐＢｚｙｍｅは，Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの部位２７３を標的としており，ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおいて，血清ＨＢＶレベルを用量依存的様式で統計学的に有意に減少させた（３０および１００ｍｇ／ｋｇ／日）。アシアロ糖蛋白質レセプターを標的とすることにより肝臓取込を改良しようとして，一連の５分枝鎖ガラクトースアミン残基をＨｅｐＢｚｙｍｅの５’末端にリン酸結合を介して結合させた（Ｇａｌ−ＨｅｐＢｚｙｍｅ）。ＨｅｐＢｚｙｍｅに及ぼすガラクトースアミンコンジュゲーションの影響を，３０ｍｇ／ｋｇの１回ＳＣボーラス投与後のマウスの血漿，肝臓および腎臓における32Ｐ標識ＨｅｐＢｚｙｍｅおよびＧａｌ−ＨｅｐＢｚｙｍｅの定量により評価した。無傷のリボザイムの血漿への配置は，Ｇａｌ−ＨｅｐＢｚｙｍｅとＨｅｐＢｚｙｍｅとで同様であった。肝臓における無傷のリボザイムの最大観察濃度（Ｃmax）には約３倍の増加が認められた（Ｇａｌ−ＨｅｐＢｚｙｍｅ（６．１±１．８ｎｇ／ｍｇ）対ＨｅｐＢｚｙｍｅ（２．２±０．８ｎｇ／ｍｇ）（ｐ＜０．０５）。Ｇａｌ−ＨｅｐＢｚｙｍｅの曲線の下の面積（ＡＵＣａｌｌ）もまた約２倍増加した。さらに，無傷のリボザイムのＡＵＣallは肝臓において実質的に減少した（約４０％）。無傷のＧａｌ−ＨｅｐＢｚｙｍｅの肝臓におけるＣmaxの有意な増加に加え，リボザイム同等物の合計数の増加が認められ，このことは，無傷のリボザイムおよび代謝産物の両方について，肝臓におけるアシアロ糖蛋白質レセプターおよびガラクトース特異的レセプターに対する親和性が増加したことを示唆する。これらのデータは，リボザイムとガラクトースアミンとのコンジュゲーションによりより望ましい配置プロファイルを有する化合物が生ずることを示し，改良されたインビボ薬物動態学および生物学的分布を有するコンジュゲート化リボザイムの用途を例証する。
当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される方法および組成物は，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。
表１
天然に存在するリボザイムの特徴
グループＩイントロン
・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。
・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。
・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび５’グアノシンを有する切断産物を生成する。
・活性構造のフォールディングおよび維持を助けるために，場合により，蛋白質の補因子をさらに必要とする。
・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィラのｒＲＮＡ，真菌ミトコンドリア，葉緑体，ファージＴ４，らん藻類，その他において，介在配列として見出されている。
・主要な構造上の特徴は，系統発生比較，突然変異原性および生化学的研究によってほぼ確立されている［１，２］。
・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［３，４，５，６］。
・リボザイムのフォールディングおよび基質ドッキングに関する研究が進行中［７，８，９］。
・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１０，１１］。
・このリボザイムは，結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ため，標的ＲＮＡ切断に対して非常に非特異的になる場合があるが，テトラヒメナのグループＩイントロンは，「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラクシダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されている［１２］。
ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ）
・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。
・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。
・ｔＲＮＡ前駆体を切断し，成熟ｔＲＮＡを形成する［１３］。
・反応メカニズム：恐らくはＭ2+−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび５’リン酸を有する切断産物を生成する。
・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサブユニットは，細菌，酵母，齧歯類および霊長類から配列決定されている。
・外部ガイド配列（ＥＧＳ）と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって，内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することが可能である［１４，１５］。
・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１６，１７］。
グループＩＩイントロン
・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。
・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１８，１９］。
・配列要求性は完全には決定されていない。
・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ，および３’−５’および２’−５’分岐点を含む「ラリアット」ＲＮＡを有する切断産物を生成する。
・ＲＮＡの切断および結合に加えて，ＤＮＡ切断への関与が実証された［２０，２１］唯一の天然リボザイムである。
・主要な構造上の特徴は，系統発生比較によってほぼ確立されている［２２］。
・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２３］。
・力学的フレームワークは検討中である［２４］。
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ
・サイズ：約１４４ヌクレオチド。
・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２５］。
・配列要求性は完全には決定されていない。
・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。
・このクラスは１種しか知られていない。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡに見出されている。
ハンマーヘッド・リボザイム（本文を参照のこと）
・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。
・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。
・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する多くの植物病原体（ウィルソイド）において見出されている。
・２つの結晶構造を含め，本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。［２６，２７］
・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性が実証された。［２８］
・２つまたはそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている。［２９］
・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。［３０］
ヘアピンリボザイム
・サイズ：約５０ヌクレオチド。
・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。
・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと，切断部位の３’側で可変数のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィルスおよびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。
・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［３１，３２，３３，３４］。
・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはインビトロ選択による工学処理が可能である［３５］。
・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３６］。
・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３７，３８］。
デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム
・サイズ：約６０ヌクレオチド。
・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３９］。
・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが，切断部位の５’側の配列は要求されない。フォールディングされたリボザイムはシュードノット構造を含む［４１］。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。
・環状のＨＤＶは活性があり，ヌクレアーゼ安定性が増加している［４２］。
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図１は，化学的に安定化されたリボザイムモチーフの例を示す。 図２は，化学的に安定化されたアンバーザイムリボザイムモチーフの例を示す。 図３は，化学的に安定化されたチンザイムＡリボザイムモチーフの例を示す。 図４は，ＤＮＡザイムモチーフの例を示す。 図５は，本発明の葉酸コンジュゲートの合成スキームを示す。 図６は，本発明のフルダラビン−葉酸コンジュゲート分子の代表例を示す。 図７は，核酸分子を合成後修飾して葉酸コンジュゲートを製造する合成スキームを示す。 図８は，本発明の保護プテロイン酸シントンを生成する合成スキームを示す。 図９は，本発明の２−ジチオピリジル活性化葉酸シントンを生成する合成スキームを示す。 図１０は，オリゴヌクレオチドまたは核酸−葉酸コンジュゲートを生成する合成スキームを示す。 図１１は，オリゴヌクレオチドまたは核酸−葉酸コンジュゲートを生成する別の合成スキームを示す。 図１２は，核酸分子を合成後修飾して葉酸コンジュゲートを製造する別の合成スキームを示す。 図１３は，本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン−２’−アミノウリジンホスホルアミダイトコンジュゲートを合成する合成スキームの非限定的例を示す。 図１４は，本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン−Ｄ−トレオニノールホスホルアミダイトコンジュゲートを合成する合成スキームの非限定的例を示す。 図１５は，本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン酵素的核酸コンジュゲートの非限定的例を示す。 図１６は，本発明のドデカン酸由来コンジュゲートリンカーを合成する合成スキームの非限定的例を示す。 図１７は，本発明のオキシム結合核酸／ペプチドコンジュゲートを合成する合成スキームの非限定的例を示す。 図１８は，本発明のリン脂質由来核酸コンジュゲートの非限定的例を示す。 図１９は，本発明のリン脂質由来酵素的核酸コンジュゲートを製造する合成スキームの非限定的例を示す。 図２０は，本発明のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）由来酵素的核酸コンジュゲートを製造する合成スキームの非限定的例を示す。 図２１は，ＰＥＧコンジュゲート化酵素的核酸分子のＰＫデータを，対応する非コンジュゲート化酵素的核酸分子と比較して示す。 図２２は，リン脂質コンジュゲート化酵素的核酸分子のＰＫデータを，対応する非コンジュゲート化酵素的核酸分子と比較して示す。 図２３は，本発明のポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミン酵素的核酸コンジュゲートを製造する合成スキームの非限定的例を示す。 図２４は，オキシムおよびモルホリノ結合生物分解性リンカーを利用してＰＥＧへのペプチドまたは蛋白質コンジュゲートを合成する合成方法の非限定的例である。 図２５は，オキシムおよびホスホルアミデート結合を用いて生物分解性リンカーを利用してＰＥＧへのペプチドまたは蛋白質コンジュゲートを合成する合成方法の非限定的例である。 図２６は，ホスホルアミデート結合を用いて生物分解性リンカーを利用してＰＥＧへのペプチドまたは蛋白質コンジュゲートを合成する合成方法の非限定的例である。 図２７は，本発明のリン脂質由来蛋白質／ペプチドコンジュゲートの非限定的例を示す。 図２８は，本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンペプチド／蛋白質コンジュゲートの非限定的例を示す。 図２９は，生物分解性リンカーを利用してＰＥＧへのペプチドまたは蛋白質コンジュゲートを合成する合成方法の非限定的例である。

Claims (13)

  1. 式５：
    ［式中、Ｒ 1 は、トリチルまたは置換トリチル基から選ばれる酸不安定性保護基または水素であり、Ｒ 4 は、ｔｅｒｔ−ブチル、Ｆｍ（フルオレニルーメトキシ）、アリール基、トリチルまたは置換トリチル基から選ばれる酸不安定性保護基、または水素であり、各Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6 およびＲ8は、独立して、水素、アルキルまたは、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、ベンゾイル、ベンジル、フタロイル、トリフルオロアセチル、ＦＭＯＣおよびモノメトキシトリチル基から選ばれる窒素保護基であり、Ｒ 7 は、水素、アルキル、ジメチルホルムアミドまたは、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、ベンゾイル、ベンジル、フタロイル、トリフルオロアセチル、ＦＭＯＣおよびモノメトキシトリチル基から選ばれる窒素保護基であり、各"ｎ"は、独立して、０−２００の整数であり、Ｒ12は、直鎖または分枝鎖のアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり、および各Ｒ9およびＲ10は、独立して、Ｎ(Ｒ 14 )(Ｒ 15 )で示される窒素含有基（但し、Ｒ 14 とＲ 15 は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであるか、もしくは、Ｒ 14 とＲ 15 はいっしょになって、４−７個の原子を含み、かつ３個までの複素原子を有する、複素環、置換複素環、ヘテロシクロアリール、置換シクロヘテロアリールを形成する）、シアノアルコキシ、アルコキシ、アリールオキシ、またはアルキル基である］
    を有する化合物。
  2. トリチルまたは置換トリチル基から選ばれる酸不安定性保護基が、ジメトキシトリチルまたはモノメトキシトリチル基である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ 3 が水素である、請求項１または２に記載の化合物。
  4. Ｒ 4 がｔｅｒｔ−ブチル、Ｆｍ（フルオレニルーメトキシ）、またはアリール基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
  5. Ｒ 5 が水素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
  6. Ｒ 6 がＴＦＡ（トリフルオロアセチル）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
  7. Ｒ 7 がイソブチリル、ジメチルホルムアミド、または水素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
  8. Ｒ 8 が水素である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
  9. Ｒ 9 が ＯＣＨ 2 ＣＨ 2 ＣＮ（オキシエチルシアノ）である 、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
  10. Ｒ 12 がアルキルである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
  11. Ｒ 12 がメチルまたはエチルである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
  12. 各"ｎ"が、独立して、０−４の整数である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
  13. 下式で示される化合物またはその塩。
    Ｆｍ：フルオレニル−メトキシ
    ＴＦＡ：トリフルオロアセチル
    ｉＢｕ：イソブチリル
    ｉＰｒ：イソプロピル
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