JP4441180B2 - ウイルス由来抗微生物ペプチド - Google Patents
ウイルス由来抗微生物ペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP4441180B2 JP4441180B2 JP2002578400A JP2002578400A JP4441180B2 JP 4441180 B2 JP4441180 B2 JP 4441180B2 JP 2002578400 A JP2002578400 A JP 2002578400A JP 2002578400 A JP2002578400 A JP 2002578400A JP 4441180 B2 JP4441180 B2 JP 4441180B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- sequence number
- peptides
- seq
- antimicrobial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 title abstract description 47
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 title abstract description 47
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 title description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 269
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 31
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 31
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 13
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 11
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 5
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 108
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 abstract description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 15
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 abstract description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 abstract description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 2
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 abstract 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 101100439902 Arabidopsis thaliana CLE19 gene Proteins 0.000 description 39
- 101100020745 Arabidopsis thaliana LLP gene Proteins 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 18
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 17
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 16
- 102100038608 Cathelicidin antimicrobial peptide Human genes 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000011160 research Methods 0.000 description 13
- 101000741320 Homo sapiens Cathelicidin antimicrobial peptide Proteins 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 12
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 12
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 12
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 12
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 11
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 9
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 8
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 8
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000002815 broth microdilution Methods 0.000 description 7
- POIUWJQBRNEFGX-XAMSXPGMSA-N cathelicidin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C1=CC=CC=C1 POIUWJQBRNEFGX-XAMSXPGMSA-N 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 6
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 6
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 6
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 102000014509 cathelicidin Human genes 0.000 description 6
- 108060001132 cathelicidin Proteins 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 201000001223 septic arthritis Diseases 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 6
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 6
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 5
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 4
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 4
- 206010011763 Cystic fibrosis lung Diseases 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003100 Magainin Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 108700022109 ropocamptide Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 206010033072 otitis externa Diseases 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 2
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 description 2
- 108050004290 Cecropin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000605894 Porphyromonas Species 0.000 description 2
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 2
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002725 anti-mycoplasma Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229940045505 klebsiella pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- RMBMWXHVTXYPQN-UHFFFAOYSA-N 1-[3-[(1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)methyl]phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1CC1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 RMBMWXHVTXYPQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010060968 Arthritis infective Diseases 0.000 description 1
- 241001480043 Arthrodermataceae Species 0.000 description 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010051548 Burn infection Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 101000749287 Clitocybe nebularis Clitocypin Proteins 0.000 description 1
- 101000767029 Clitocybe nebularis Clitocypin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 1
- 229940094664 Cysteine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101710178505 Defensin-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 241001480035 Epidermophyton Species 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010039659 FALL 39 Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241001501603 Haemophilus aegyptius Species 0.000 description 1
- 241000590017 Helicobacter felis Species 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 101800004761 Magainin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- YLCXGBZIZBEVPZ-UHFFFAOYSA-N Medazepam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N(C)CCN=C1C1=CC=CC=C1 YLCXGBZIZBEVPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001480037 Microsporum Species 0.000 description 1
- 241000588628 Moraxella sp. Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204048 Mycoplasma hominis Species 0.000 description 1
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 101710142466 Phosphoenolpyruvate synthase regulatory protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710200473 Putative phosphoenolpyruvate synthase regulatory protein Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 241001149962 Sporothrix Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 description 1
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 241000223238 Trichophyton Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012387 aerosolization Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000011482 antibacterial activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 1
- 238000013096 assay test Methods 0.000 description 1
- RHISNKCGUDDGEG-UHFFFAOYSA-N bactenecin Chemical compound CCC(C)C1NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N)CSSCC(C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC1=O RHISNKCGUDDGEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016341 bactenecin Proteins 0.000 description 1
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 108010007004 cathelin Proteins 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 1
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037304 dermatophytes Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007893 endotoxin activity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 244000000058 gram-negative pathogen Species 0.000 description 1
- 244000000059 gram-positive pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- USSYUMHVHQSYNA-SLDJZXPVSA-N indolicidin Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 USSYUMHVHQSYNA-SLDJZXPVSA-N 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- MGIUUAHJVPPFEV-ABXDCCGRSA-N magainin ii Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MGIUUAHJVPPFEV-ABXDCCGRSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940124561 microbicide Drugs 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- -1 or elixir Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940055019 propionibacterium acne Drugs 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 244000000033 sexually transmitted pathogen Species 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
抗微生物薬の開発は、今世紀において、感染症による罹患率及び死亡率の著しい減少をもたらした。この重要な公衆衛生上の貢献は、主として、病原菌に特有の特定の栄養素、細胞壁、DNA、RNA及びタンパク質生合成経路を標的とする抗生物質の広範な使用によるものである。しかし、近年、現在利用可能な抗微生物薬に、もはや感受性ではない細菌株の出現により、感染症に対処する能力が脅かされている（Files, 1999, Chest. 115:3S-8Sを参照されたい）。公衆衛生の維持の観点からは、有効な感染症対処法が適切に保たれるためには、これらの出現耐性菌を克服するために新規抗微生物薬を開発する必要がある。
多種多様な宿主由来抗微生物ペプチド群が、可能な新規治療剤として注目されている（Hancock, R. E., 1999, Drugs 57:469-473を参照されたい）。これらのペプチドは、感染に対する脊椎動物の先天免疫において重要な役割を果たす。例えば、カチオン性抗微生物ペプチドは全好中球タンパク質の18重量％をも構成する。それらは、損傷粘膜表面上にも高濃度で見出される。一般に、これらの宿主由来カチオン性ペプチドは以下の4つの構造カテゴリー：（i）複数のジスルフィド結合により安定化されたβシート構造（例えば、ヒトデフェンシン1）、（ii）共有結合により安定化されたループ構造（例えば、バクテネシン）、（iii）トリプトファン（Trp）に富む伸長らせん状ペプチド（例えば、インドリシジン）、及び（iv）両親媒性αヘリックス（例えば、マガイニン及びセクロピン）のうちの1つに該当する（Hwang及びVogel, 1998, Biochemistry & Cell Biology 76:235-246を参照されたい）。最近、これらの構造モチーフのすべてを有し、感染に対する宿主防御において明らかに重要である新規クラスの抗微生物ペプチドであるカテリシジン（cathelicidin）が報告された（Ganz及びLehrer, 1997, Current Opinion in Hematology 4:53-58）。
カテリシジンは、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス及びブタにおいて報告されている、高度に保存されたN末端プロペプチドセグメントを有するプレプロペプチドに由来する分子の著しく多様な集積体である（Hwang及びVogel, 1998, Biochemistry & Cell Biology 76:235-246を参照されたい）。約100アミノ酸の保存プロペプチドセグメントは、推定システインプロテアーゼインヒビターであるブタタンパク質カテリン（cathelin）と配列類似性を有する（したがって、ファミリー名である）。そのC末端ドメインは、それが関連している宿主及び組織に応じて、前記のものの1つに類似した抗微生物ペプチドモチーフをコードしている。カテリシジンは好中球顆粒内にプロペプチド（この形態では抗微生物活性を欠く）として貯蔵され、好中球活性化がエラスターゼ媒介エンドタンパク質分解切断及び該C末端抗微生物ペプチドの生成をもたらす。FALL-39、hCAP18、LL-37又はCAMPとも称されるヒトカテリシジンは、そのプロセシングされた（活性）形態では、37アミノ酸の両親媒性αらせんカチオン性ペプチドである（Zanetti, Gennaro及びRomeo, 1995, FEBS Letters 374:1-5を参照されたい）。LL-37の発現は炎症部位の角化細胞、及びヒト好中球、精巣細胞、呼吸上皮において検出されている。
該αらせんクラスの両親媒性カチオン性ペプチドは、μg/mL範囲（他の抗微生物薬と同等のレベル）の最小殺菌濃度（MBC）を示し、広範囲のグラム陰性及びグラム陽性病原菌（多数の抗生物質に対して高耐性であるものを含む）を殺す（Hancock, R. E., 1999, Drugs 57:469-473）。これらのペプチドが細菌を殺すメカニズムは、まず、負に荷電した細菌表面に結合し、これらの結合ペプチドが細菌膜内に侵入して、その構造の完全性を破壊することによる2工程の過程で進行する。グラム陰性生物の場合には、カチオン性抗微生物ペプチドは、リポ多糖（LPS）に結合してその内毒素活性を解毒するという更なる利点を有する（Scott, Yan, 及びHancock, 1999, Infection & Immunity 67:2005-2009を参照されたい）。両親媒性カチオン性αらせん抗微生物ペプチドの特徴は、それが、少なくとも+2の実効正電荷を有する親水性面を示す両親媒性二次構造にフォールディングされうることにある。アミノ酸配列の多種多様な組合せが、あるペプチドがこの特徴的構造を得ることを可能にする。その結果、これまでに、何百もの宿主由来両親媒性カチオン性αらせんペプチドの全てが一定の配列相同性を一次配列比較のレベルで示すことが報告されている（Hwang及びVogel, 1998, Biochemistry & Cell Biology 76:235-246を参照されたい）。
細菌を殺すという特別な目的で発生した宿主由来抗微生物ペプチドとは対照的に、宿主由来ペプチドと同じ目的で発生したのではないレンチウイルス膜貫通（TM）タンパク質細胞質尾部の異なるセグメントに由来する新規クラスの抗微生物ペプチドが報告されている（Bearyら, 1998, Journal of Peptide Research 51:75-79; Comardelleら, 1997, AIDS Research & Human Retroviruses 13:1525-1532; Millerら, 1993, AIDS research & Human Retroviruses 9:1057-1066; Millerら, 1993, Virology 196:89-1000; Tenczaら, 1995, Virology 69:5199-5202; Tenczaら, 1997, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41:2394-2398; Tenczaら, 1997, AIDS Research & Human Retroviruses 13:263-269; Yuanら, 1995, Biochemistry 34:10690-10696を参照されたい）。これらのペプチドはレンチウイルス溶解ペプチド（LLP）と称され、原型LLPはLLP1（HIV-1ウイルス分離株HXB2R Envのアミノ酸828-856）である。LLP1は、αらせんとしてモデル化したとき、明瞭な限定されたカチオン性及び疎水性面を有する両親媒性のHIV-1 TMタンパク質C末端部分にコードされる28残基に由来する。現在までに文献に記載されている多数の抗微生物ペプチドのなかで、LLP1は、マガイニン及びヒトカテリシジンLL37に化学的に最も相同である。
LLP1は、そのカルモジュリン結合及び抗微生物特性に関して研究されている。LLP1は宿主細胞Ca2+飽和カルモジュリンにナノモルに近いアフィニティーで結合し、この特性はT細胞活性化の抑制に関連しており、このことは、これらのペプチドが炎症応答を抑制しうることを示唆している（Bearyら, 1998, Journal of Peptide Research 51:75-79; Millerら, 1993, AIDS Research & Human Retroviruses 9:1057-1066; Tenczaら, 1995, Virology 69:5199-5202; Tenczaら, 1997, AIDS Research & Human Retroviruses 13:263-269; Yuanら, 1995, Biochemistry 34:10690-10696を参照されたい）。LLP1の抗細菌活性は、多様なグラム陰性及び陽性菌分離株を調べることにより研究されてきた。この分析は、LLP1が、マガイニン-2と同等又はそれより強力な抗細菌活性を有することを示している。これらの分離株は、メチシリン及びバンコマイシン耐性株、ならびに多数の抗生物質に高耐性である他の株を含んでいた（Tenczaら, 1997, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41:2394-2398を参照されたい）。LLP1による細菌の溶菌は迅速であり、1×105 コロニー形成単位のPseudomonas aeruginosa又はStaphylococcus aureusの懸濁液を60秒以内の曝露でほぼ滅菌する（Tenczaら, 1997, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41:2394-2398を参照されたい）。LLP1の作用メカニズムは、負に荷電した細菌膜を、そしてそれより低度ではあるが中性哺乳類細胞膜を損なうものであると考えられている。哺乳類細胞膜よりも細菌細胞に対して該ペプチドが偏向することが、その選択毒性の基礎を形成する。
LLP1中の単一アミノ酸の変化は、そのカルモジュリン結合及び抗細菌活性に著しい影響を及ぼす（Tenczaら, 1995, Virology 69:5199-5202; Tenczaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41）。一般に、親LLP1配列中の塩基性残基から酸性残基へのアミノ酸置換は、カルモジュリン結合及び殺菌活性を減少させる。同様に、単一の疎水性残基から親水性残基への改変も、これらの活性の両方を減少させた。さらに、LLP1親配列中に見出される単一のCysのジスルフィド結合形成による二量体化は、S. aureusに対するその活性を有意に増加させた（Tenczaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41を参照されたい）。最後に、21残基へのLLP1二量体の長さの減少は（ペプチド ビス-TL1）、その抗細菌活性を有意に減少させることなくその赤血球溶解活性を減少させた（Tenczaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41を参照されたい）。これらのデータは、効力及び選択性の向上のためにLLP1親配列が改変されうることを示唆している。この改変の可能性は、本発明の基礎を形成するものである。
（発明の概要）
本発明は、抗微生物活性を有するペプチド（「抗微生物ペプチド」）に関する。本発明の1つの実施形態においては、HIV-1ウイルス分離株HXB2R Envのアミノ酸828-856に対応するLLP1ペプチド親配列に由来し、それらの類似体である、3つの抗微生物ペプチドが記載されており、該抗微生物ペプチドはSA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）及びWLSA-5（配列番号3）を含む（後記表1を参照されたい）。他のLLP1ペプチド類似体の抗微生物活性は既に報告されている（Tenczaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41, Montelaroらの米国特許第5,714,577号及びMontelaroらの米国特許5,945,507号を参照されたい）。
本発明は、抗微生物活性を有するペプチド（「抗微生物ペプチド」）に関する。本発明の1つの実施形態においては、HIV-1ウイルス分離株HXB2R Envのアミノ酸828-856に対応するLLP1ペプチド親配列に由来し、それらの類似体である、3つの抗微生物ペプチドが記載されており、該抗微生物ペプチドはSA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）及びWLSA-5（配列番号3）を含む（後記表1を参照されたい）。他のLLP1ペプチド類似体の抗微生物活性は既に報告されている（Tenczaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41, Montelaroらの米国特許第5,714,577号及びMontelaroらの米国特許5,945,507号を参照されたい）。
本発明のもう1つの実施形態においては、該抗微生物ペプチドは、以下の原理：（i）両親媒性を最適化する、（ii）荷電面上のアルギニン（Arg）及び／又は疎水性面上のバリン（Val）もしくはトリプトファン（Trp）を別のアミノ酸で置換する、及び（iii）ペプチド長を増加させる、に基づく修飾を有するLLP1類似体（本発明では、LBUペプチドと総称され、例えば、LBU-2, 配列番号4; LBU-3, 配列番号5; LBU-3.5, 配列番号6; LBU-4, 配列番号7; WLBU-1, 配列番号8, WLBU-2, 配列番号9, WLBU-3, 配列番号10; 及びWLBU-4, 配列番号11が挙げられる; 表1を参照されたい）である。LBUペプチドは親LLP1から著しく逸脱し、例えば、LBU-2及びLBU-3は親LLP1配列から90％以上逸脱している。
本発明のLLP1類似体ペプチド及びLBUペプチド（本明細書中では「改変LLP」（eLLP）と総称する）は、既に報告されているLLP1類似体と比較して広い活性スペクトル（すなわち、高耐性細菌を殺す能力）及び増加した効力（すなわち、細菌を殺すのに必要なモル濃度が低い）を有する。本発明のeLLPは、生理塩濃度下で微生物に対して高度に抑制性であり、滑液の存在下で機能し、動物モデルにおいて最低限の毒性しか示さない。その結果、eLLPは、選択的抗微生物薬として定義することができる。また、本発明のペプチドは、細菌膜を破壊することにより機能し、固相に結合している場合にも活性である。これらのペプチドは、細菌生物膜核形成を予防することが有利な人工器官又はカテーテルのような無菌デバイスのコーティング剤として有用であるために、固相に結合しているときにもこれらのペプチドが活性を維持しうることは、通常の抗生物質と比較した場合の顕著な利点である。
（詳細な説明）
LLP1の抗細菌活性が報告されて以来（Tenczaら, 1997, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41:2394-2398を参照されたい）、効力を増強し（すなわち、それらのモル殺菌活性を増加させ）臨床分離株に対する活性スペクトルを広げるために親配列を改変することにより、多種多様なLLP1類似体が製造されている（例えば、Montelaroらの米国特許第5,714,577号及びMontelaroらの米国特許第5,945,507号及びTenczaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33041を参照されたい）。これは、モデル化αらせん（ヘリックス）の親水性及び疎水性面を最適化することにより達成されている。本発明は、LLP1ペプチド類似体SA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）及びWLSA-5（配列番号3）である3つの抗微生物ペプチドに関する（前記表1を参照されたい）。また、本発明は、以下の原理：（i）両親媒性を最適化する、（ii）荷電面上のArg及び疎水性面上のValで置換する、（iii）ペプチド長を増加させる、及び（iv）ValをTrpで反復的に置換する、に基づく修飾を有するLLP1類似体である抗微生物ペプチド（本発明では、LBUペプチドと総称され、例えば、LBU-1（配列番号4）; LBU-2（配列番号5）; LBU-3（配列番号6）; LBU-3.5（配列番号7）; LBU-4（配列番号8）; WLBU-1（配列番号9）; WLBU-2（配列番号10）; WLBU-3（配列番号11）;及びWLBU-4（配列番号12）が挙げられる; 表1を参照されたい）に関する。本発明のLLP1ペプチド類似体及びLBUペプチドは、本発明ではeLLPと称される。SA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）、WLSA-5（配列番号3）、LBU-4（配列番号7）及びWLBU-4（配列番号12）の組成を、αらせん構造としてモデル化された場合のそれらの配列を図1及び2に記載し、親ペプチドLLP1と比較する。
LLP1の抗細菌活性が報告されて以来（Tenczaら, 1997, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41:2394-2398を参照されたい）、効力を増強し（すなわち、それらのモル殺菌活性を増加させ）臨床分離株に対する活性スペクトルを広げるために親配列を改変することにより、多種多様なLLP1類似体が製造されている（例えば、Montelaroらの米国特許第5,714,577号及びMontelaroらの米国特許第5,945,507号及びTenczaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33041を参照されたい）。これは、モデル化αらせん（ヘリックス）の親水性及び疎水性面を最適化することにより達成されている。本発明は、LLP1ペプチド類似体SA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）及びWLSA-5（配列番号3）である3つの抗微生物ペプチドに関する（前記表1を参照されたい）。また、本発明は、以下の原理：（i）両親媒性を最適化する、（ii）荷電面上のArg及び疎水性面上のValで置換する、（iii）ペプチド長を増加させる、及び（iv）ValをTrpで反復的に置換する、に基づく修飾を有するLLP1類似体である抗微生物ペプチド（本発明では、LBUペプチドと総称され、例えば、LBU-1（配列番号4）; LBU-2（配列番号5）; LBU-3（配列番号6）; LBU-3.5（配列番号7）; LBU-4（配列番号8）; WLBU-1（配列番号9）; WLBU-2（配列番号10）; WLBU-3（配列番号11）;及びWLBU-4（配列番号12）が挙げられる; 表1を参照されたい）に関する。本発明のLLP1ペプチド類似体及びLBUペプチドは、本発明ではeLLPと称される。SA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）、WLSA-5（配列番号3）、LBU-4（配列番号7）及びWLBU-4（配列番号12）の組成を、αらせん構造としてモデル化された場合のそれらの配列を図1及び2に記載し、親ペプチドLLP1と比較する。
SA-5と称されるペプチドにおいては、LLP1親配列の親水性面上にモデル化されたグリシン（Gly）及び2つのグルタミン酸（Glu）残基が3つのアルギニン残基により置換されており、この配列の疎水性面上にモデル化されたプロリン（Pro）がバリン（Val）により置換されている。このペプチドの生成の基礎をなす原理は、元のLLP1配列のカチオン性両親媒性特性を最適化することにある。
LSA-5と称されるペプチドは、増加した長さのLLP誘導体の活性を調べることにより、LLP1のトランケート化（末端切断型）誘導体の効力を記載した従来の報告（Tenozaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33041を参照されたい）と比較される。LSA-5は、1ターンだけモデル化αらせんの長さを延長しており、両親媒性のArgに富むカチオン性特性を維持している。
Hwang及びVogel（Biochemistry & Cell Biology 76:235-246 (1998)）の構造研究によれば、Trp残基は、細菌膜内に最適にインターカレーションすることが示されている。しかし、Trpが生物膜内にインターカレートしうることは、Trpを含有する特定のペプチドが細菌膜を選択的に破壊することを意味するものではない。WLSA-5ペプチドは、LSA-5の疎水性面上の4つの残基をTrp残基により置換することにより誘導した。
また、本発明は、以下の原理：（i）両親媒性を最適化する、（ii）荷電面上のArg及び疎水性面上のValで置換する、（iii）ペプチド長を増加させる、及び（iv）ValをTrpで反復的に置換する、に基づく修飾を含むLLP類似体ペプチドに関する。これらの原理に従い修飾されたペプチドは、本発明では、溶菌塩基単位（Lytic Base Unit）(LBU）ペプチドと称される。例えば、ペプチドLBU-2及びLBU-3は、少なくとも24残基の長さを有する最大両親媒性αらせん特性を与えるよう設計されたArg及びVal残基の重合体として構成される。
本発明のペプチドの抗微生物活性は、後記実施例において考察する。
本発明の抗微生物ペプチドは、それらの配列及びそれらが由来する起源の点で特有である。既に報告されているLLP1配列中の微妙な変化及びペプチドの長さの増加が活性の効力及びスペクトルを劇的に改善しうることは自明ではないであろう。さらに、LBUペプチドは完全に改変されており、いずれの天然配列に基づくものでもない。
Staphylococcus aureus、メチシリン耐性S. aureus、及びPseudomonas aeruginosaを含む細菌域に対するeLLP SA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）、WLSA-5（配列番号3）、LBU-1（配列番号4）、LBU-2（配列番号5）、LBU-3（配列番号6）、LBU-3（配列番号7）、LBU-4（配列番号8）、WLBU-1（配列番号9）、WLBU-2（配列番号10）、WLBU-3（配列番号11）及びWLBU-4（配列番号12）の活性を、後記表2に要約する。
表2は、ナノモル濃度で表されたペプチドのMBCを示す。これらの結果は、これらのeLLPの抗微生物効力を示している。これらのペプチドの活性は、高い最小殺菌濃度（MBC、後記実施例2を参照されたい）に示されるとおり、同等又は低い活性を有しうる他の抗細菌ペプチドと比較して優れている。表2は、種々の生物に対する及び種々の塩条件におけるeLLPのMBC（ナノモルで表されている）を示す。
本発明において「eLLP」と総称される本発明の抗微生物ペプチドは、多様な微生物に対して抗微生物活性を示し、HIV-1ウイルス分離株HXB2R Env TMのアミノ酸828-856に対応するLLP1ペプチドの類似体である。eLLPは、Argに富む配列を含み、これは、二次構造でモデル化された場合に、高い両親媒性及び疎水性モーメントを示す。eLLPは微生物に対して高度に抑制性であるが、哺乳類細胞に対してはそれほど有意には毒性ではない。その結果、これらのペプチドは選択的抗微生物薬として特徴づけられうる。また、本発明のeLLPは、以下の原理：（i）両親媒性を最適化する、（ii）荷電面上のArg及び疎水性面上のValもしくはTrpで置換する、及び（iii）ペプチド長を増加させる、に基づく修飾を含むLLP1ペプチド類似体（本発明ではLBUペプチドと総称される）を含む。
本発明で用いる「抗微生物」なる語は、細菌、真菌、原生動物及びウイルスのような微生物の増殖を妨げ、抑制し又は破綻させる本発明のペプチドの能力を意味する。本発明で用いる「ペプチド」なる語は、ペプチド結合により互いに連結された少なくとも2つの連続的アミノ酸のオリゴマーを意味する。
本発明のeLLPは、微生物に対して選択毒性を示す親ペプチドLLP1の構造的及び機能的類似体である。本発明で用いる「類似体」なる語は、親ペプチドのアミノ酸配列中の置換、再編成、欠失、付加及び／又は化学的修飾を含有し該親ペプチドの構造的及び機能的特性を保有するペプチドを意味する。
本発明のeLLPは、公知抗微生物非LLPペプチド（例えば、マガイニン又はカテリシジン）に対する有意な一次配列相同性を欠く。eLLPは、正に荷電した残基に富み、両親媒性αらせんを形成すると予想される。該両親媒性αらせんは、特有かつ強力な抗微生物活性を本発明のペプチドに付与する。本発明の抗微生物ペプチドを特徴づける構造的特性には、とりわけ、三次元両親媒性αらせん構造を形成しうることが含まれる（Eisenberg及びWesson, 1990, Biopolymers 29: 171-177）。両親媒性αらせん構造は、3.6アミノ酸残基が該らせんの1ターンを完成するよう配置された残基を含む。よく知られたタンパク質フォールディングの制約に基づくこの配置に基づき、アミノ酸配列を調べることにより両親媒性の推定を行うことが可能である。
本発明の1つの実施形態においては、この「理想的」両親媒性αらせんモチーフの最適化が、本発明のeLLPを作製するために用いる原理の1つである。本発明のもう1つの実施形態においては、親水性面上のArg残基及び疎水性面上のTrp又はVal残基の置換が、本発明のeLLPを作製するために用いる原理の1つである。本発明の抗微生物ペプチドは更に、Ala、Gly、Ile又はPhe、及び一般的な両親媒性αらせん構造内で許容されうる他のアミノ酸残基を含有しうる。これらの残基は、ペプチドの効力及び選択性を増強する構造を付与するが、それは実験によってのみ測定される。本発明の幾つかのeLLPは、1つのCysを含有するが、Cysはジスルフィド結合を形成しうるため、Cys残基を含有するペプチド（例えば、ビス-eLLP）をジスルフィド連結二量体ペプチドとすることにより、その効力の増強をもたらしうる。Cysの位置は、そのようなものとしてモデル化された場合に、該両親媒性αらせん構造の親水性及び疎水性面の境界上に存在する。そのようなCys残基の置換は当業者に自明ではなく、実験的に決定されなければならない。これは、例えば、ペプチド構造のコンピューターモデリングを使用して、過度な実験を行うことなく当業者により達成されうる。例えば、本発明のペプチドを設計するために、「ヘリカル・ホイール（Helical Wheel）」（Genetics Computer Group, Madison, Wis.）のようなコンピューターモデリングプログラムを用いることができる。もう1つの実施形態においては、本発明のペプチドの長さを増加させて、それらの抗微生物活性を改善することが可能である。
本発明のeLLPは、それらの機能特性において特有である。該抗微生物ペプチドの特有の構造は、細菌に対する選択性を維持する一方で高い効力を付与する。該抗微生物ペプチドの効力は、マガイニン又はカテリシジンの場合と比較して非常に優れている。eLLPはグラム陽性及びグラム陰性菌を迅速に殺菌し、Listeria monocytogenes、Bacillus subtilis、Enterococcus faecalis（バンコマイシン感受性（VSEF）及びバンコマイシン耐性（VREF）株を含む）、Enterococcus faecium（バンコマイシン感受性（VSEF）及びバンコマイシン耐性（VREF）株を含む）、Staphylococcus aureus（メチシリン感受性（MSSA）及びメチシリン耐性（MRSA）株を含む）、Staphylococcus epidermidis（メチシリン感受性（MSSE）及びメチシリン耐性（MRSE）株を含む）、Staplaylococcus salivarius、Corynebacterium minutissium、Corynebacterium pseudodiphtheriae、Corynebacterium stratium、コリネバクテリウム（Corynebacterium）G1群、コリネバクテリウム（Corynebacterium）G2群、Streptococcus pneumonia（ペニシリン耐性（PSRP）株を含む）、Streptococcus mitis及びStreptococcus sanguisのようなグラム陽性菌；大腸菌、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Burkholderia cepacia、Serratia marcescens、Haemophilus influenzae、モラクセラ属菌（Moraxella sp.）、Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrhoeae、Salmonella typhimurium、アクチノマイセス属菌（Actinomyces spp.）、ポルフィロモナス属菌（Porphyromonas spp.）、Prevotella melaninogenicus、Helicobacter pylori、Helicobacter felis、及びCampylobacter jejuniなどのグラム陰性菌を含むが、これらに限定されるものではない。広い活性スペクトルを示す。機能特性には、哺乳類細胞に対して最低限の毒性しか伴わない選択的抗微生物活性も含まれる。したがって、本明細書における教示及び指針に基づき、当業者は、所望の効力及び選択性を有する本発明の範囲内のこれらのeLLPを容易に設計することが可能である。
個々の抗微生物ペプチド及び／又は他の細胞溶解性ペプチドの類似体も本発明の範囲内である。該類似体は、本明細書に記載の構造的及び機能的特性を保有する。本発明のもう1つの実施形態においては、D-アミノ酸が、L-アミノ酸の代わりに使用されることが可能であり、代謝安定性の増強をもたらしうる。なぜなら、D-アミノ酸を含有するペプチドは、L-アミノ酸から構成されるペプチドを一般には切断する哺乳類プロテアーゼに対して抵抗性であるからである。例えば、D-アミノ酸を含有するセクロピン類似体は抗細菌活性を示す（Merrifieldら, Antimicrobial Peptides, Ciba Foundation Symposium, Wiley, Chichester, 5-26,1994）。本発明はまた、LLP1親ペプチドより長いペプチド類似体に関する。これらのペプチドは、モル当たりで比較した場合にLLP1親配列より強力でありうる。該ペプチドは、より広い活性スペクトルを示す。前記のとおり、抗微生物ペプチド中にCys残基が含有されていることは、二量体ペプチドを安定化しうる分子内又は分子間ジスルフィド結合の形成の促進において有用であり、S. aureusのような或る微生物病原体に対する抗微生物効力を改善する。
本発明の抗微生物ペプチドは、高塩条件下及び生物流体中で非常に活性でありうる（実施例4及び図3〜6を参照されたい）。生理的NaCl濃度において活性を維持する該ペプチドの能力は、該ペプチドが脊椎動物宿主の生理的流体中で抗微生物活性を示すのを可能にする。
本発明のペプチドは、例えばMillerら（AIDS Research & Human Retroviruses 7:511-519 (1991)）により記載されているような当業者に公知の手動又は自動操作を用いる、又はAdvanced Chemtech Model 200（Advanced Chemtech, Louisville, Ky.）を用いる、又はFmoc合成プロトコール（Fontenotら, 1991, Peptide Research 4:19-25）でMillipore 9050+（Millipore, Bedford, Mass.）自動合成装置を若しくは他の入手可能な装置を用いる古典的なメリフィールド固相合成技術により合成することができる。切断及び脱保護の後、合成ペプチドを、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー及び当業者に公知の任意の逆相カラム/HPLC系により精製することができる。また、ヌクレオチドに基づくペプチド設計のための当業者に周知の技術を用いる標準的な組換えDNA技術によっても、ペプチドを合成することができる（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1995)。親ペプチドからペプチド類似体を製造するために、例えば、部位特異的突然変異誘発又はオリゴヌクレオチド合成を用いることができる。また、該ペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸組成分析ならびに各アミノ酸の手動及び自動エドマン分解及び決定、HPLC分析又はマススペクトロメトリーにより確認し同定することができる。該ペプチドのN末端アミノ酸は遊離アミノ基を含有していたりアセチル化されていることが可能であり、該ペプチドのC末端アミノ酸はアミド化、脂質化されていたり遊離カルボキシル基を含むことが可能である。当業者に公知のペプチド末端の他の修飾も本発明の範囲内である。
ペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性は、関心のある残基を改変又は置換することにより試験することができる。例えば、分子内又は分子間ジスルフィド結合の形成に関与しうるCys残基の要件は、Cysから別のアミノ酸（例えば、そのような結合を形成し得ないチロシン）への変異により試験することができる。Cysは、例えば、還元及びカルボキシアミド化（この場合、システインの硫黄原子にアミド基が付加される）によりジスルフィド結合の形成を妨げるよう化学的に改変することができる（Creighton, T. E.編, Protein Structure: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989）。逆に、そのような結合がペプチドの抗微生物活性に関与するか否かを評価するために、ペプチド中のCys残基を酸化状態（すなわち、ジスルフィド結合の形態）で維持することができる。そのような酸化は、例えば、空気酸化法（Ellman, G. L., Arch. Biochem.82: 70-77,1959）又はDMSO酸化（Tamら, J. Am. Chem. Soc. 113: 6657-6662, 1991）により行うことができる。同様に、疎水性面上でTrp残基で置換することができる（例えば、WLSA-5ペプチド（配列番号3））。
本発明の抗微生物ペプチドをそれらの好ましい構造的特性に基づき設計するためには、コンピューターモデリングが有用である。直鎖状配列から両親媒性らせん構造を予想するための当技術分野で公知の標準的な方法はアイゼンバーグアルゴリズム（Eisenbergら, Biopolymers 27: 171-177,1990）であり、本発明のペプチドをモデル化するのに有用である。ペプチド配列は、予想される二次構造、疎水性モーメント及び両親媒性に関して、当業者に利用可能なプログラム（例えば、インターネットから入手可能なもの）を使用して分析される。二次構造（Chouら, Adv. Enz. 47: 45-146, 1978; Garnierら, J. Mol. Biol. 120: 97, 1978）又は疎水性モーメント（Eisenbergら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 140-144, 1984）を予測するアルゴリズムを一般に使用するこれらのプログラムを使用することが可能である。
ペプチド濃度は、標準的なニンヒドリン比色アッセイを用いて定量する（後記実施例1を参照されたい）。市販の（Dupont）なニンヒドリン試薬と組み合わされた漸増容量のロイシンストックの570nmにおける吸光度を分光光度計で読取り、Leu標準体による標準曲線を作成する。ペプチドサンプルの読取り値をロイシン標準曲線と比較して、各サンプル中のペプチドの量を定量する。あるいは、該ペプチドがその配列中にTrpを含有する場合には、モル吸光係数ε280 = 5500-1 m・cm-1を使用するUV分光法により、ペプチド濃度を測定することができる。
原核及び真核細胞の生存性に対する本発明の抗微生物ペプチドの効果は、該ペプチドへの曝露又は処理の後の生存を測定する任意の方法によりアッセイすることができる。スクリーニング目的には、標準的な細菌ブロス希釈アッセイを用い、赤血球溶解アッセイと比較することができる（Tenczaら, 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41を参照されたい）。しかし、最終的には、この選択毒性比較は、原核細胞及び真核細胞の両方をコインキュベーション中に（すなわち、同一条件下で）ペプチドにさらす際に行うべきである。また、酵母、マイコプラズマ及びウイルスを含む他の病原体の生存性に対する該抗微生物ペプチドの効果を試験することも可能である。
本発明のペプチドの抗細菌特性は、例えば溶菌アッセイ（実施例1）から、ならびに、とりわけ、増殖抑制アッセイ（Blondelieら, Biochemistry 31:12688, 1992）、蛍光に基づく細菌生存性アッセイ（例えば、Molecular Probes BacLight）、フローサイトメトリー分析（Arroyoら, J. Virol. 69:4095-4102, 1995）及び当業者に公知の他の標準的なアッセイを含む他の方法により測定することができる。
本発明のペプチドの抗真菌特性の測定は、当業者に良く知られた技術（Selitrennikoff, C., Screening for Antifungal Drugs, in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelsteinら編, Butterworth-Heinemann, Boston, 1992）により行うことができる。本発明のペプチドの抗ウイルス特性の測定は、例えば、当技術分野で認められている標準的なインビトロアッセイ（例えば、Wildら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10537-10541, 1992）におけるウイルスのプラーク形成を抑制するペプチドの能力による当業者に良く知られた技術により行うことができる。
該ペプチドに関する最小殺菌濃度（MBC）値（すなわち、試験されている微生物サンプルの99.9％を殺すのに必要なペプチドの濃度）を導くためには、微生物標的の増殖抑制のためのアッセイを用いることができる。この値は、特定の生物又は生物群に対する特定の抗微生物薬（例えば、抗生物質）の有効性を表すものとして当業者に良く知られている。ペプチドのMBCを検出するためのアッセイにおいては、ペプチドを用いない対照実験と比較した、ペプチドに曝露後の細菌集団の増殖抑制をコロニー形成単位（cfu）の数に関して測定ればよい。
本発明の抗微生物ペプチドの有効性の同定及び測定において有用なもう1つのパラメーターは、ペプチドの抗微生物活性のキネティクスの測定である。そのような測定は、本発明のアッセイのいずれかを行い微生物活性を時間の相関因子として測定することにより行うことができる。好ましい実施形態においては、該ペプチドは、微生物を効率的に殺すキネティクスを示す。
本発明の抗微生物ペプチドは、標的微生物に対する選択毒性及び哺乳類細胞に対する最小の毒性を示す。哺乳類細胞上での本発明のペプチドの毒性の測定は、好ましくは、組織培養アッセイを用いて行う。哺乳類細胞の場合、そのようなアッセイ方法には、とりわけ、トリパンブルー排除及びMTTアッセイ（Mooreら, 1994, Peptide Research 7:265-269）が含まれる。膜透過性の変化に際して特定の細胞型が特定の代謝産物を放出しうる場合には、その特定の代謝産物（例えば、赤血球の溶解の際のヘモグロビンの放出）をアッセイすることができる（Srinivasら, 1992, Journal of Biological Chemistry 267:7121-7127を参照されたい）。また、密着結合を形成している細胞単層の経上皮抵抗（Rte）の破壊をモニターすることができる（図9を参照されたい）。本発明のペプチドは、好ましくは、初代細胞、例えば、偏光（polarized）培養内のヒト気管支上皮（HBE）細胞又は当業者により通常使用される他の初代細胞培養を使用して試験する。永久的形質転換細胞系（例えば、Jurkat細胞）を使用することも可能である。
eLLPの治療能の測定においては、細菌、真菌、原生動物又はウイルスサンプルに対するMBCが、哺乳類細胞に対して観察されるMBCより低いことをもって、選択的抗微生物性とする。本発明のペプチドの抗微生物活性の特徴づけは、前記のとおり、細菌、真菌、原生動物又はウイルスなどの培養しアッセイしうる任意の微生物を使用して行うことができる。
グラム陽性及びグラム陰性の両方の微生物に対する殺菌活性を測定するためには、本発明のペプチドに関する抗細菌アッセイを行うことができる。大腸菌（E. coli）及びP. aeruginosaは、グラム陰性生物の具体例である。S. aureusはグラム陰性微生物のモデルとして使用することが可能であり、これは重要な臨床標的である。なぜなら、ほとんどの株は、ほとんどの全身性抗生物質治療に対して無反応性だからである。メチシリン耐性S. aureusは、抗生物質耐性モデル生物として使用することができる。E. faecalis、特に、臨床現場（例えば、病院）で見出されるバンコマイシン耐性分離株をアッセイすることが可能である。S. marcescensは、眼及び他の局所感染源であり、容易にアッセイすることができる。該ペプチドは、外耳感染症（外耳炎）の治療において又はNeisseria gonorrhoeaeにより引き起こされるような性感染症の治療において使用することができる。本発明のペプチドの標的となりうる粘膜表面上の細胞外にしばしば見出される他の細菌病原体は、Streptococcus pneumonia、Streptococcus pyogenes、B群ストレプトコッカス、Gardnerella vaginalis、Klebsiella pneumoniae、アシネトバクター属菌（Acinetobacter spp.）、Haemophilus aegyptius、Haemophilus influenzae、S. epidermis、Propionibacterium acnes、及び口内病原体、例えば、アクチノマイセス属菌（Actinomyces spp.）、ポルフィロモナス属菌（Porphyromonas spp.）、及びPrevotella melaninogenicusを含むが、これらに限定されるものではない。他の微生物病原体も、これらのペプチドの標的となることがあり、これらの微生物病原体及びそれらが引き起こす感染症は当業者に公知である。
マイコプラズマは、グラム陽性祖先からゲノム減数により退行的に進化したと考えられる真正細菌であるモリキューテス綱に属する。古典的な細菌とは異なり、それらは細胞壁を有さず、その代わりに単一の3層膜により囲まれており、本発明の或るペプチドに感受性でありうる。本発明のペプチドの抗マイコプラズマ活性を試験するためには、抗マイコプラズマアッセイを行うことができる。マイコプラズマのヒト病原体は、Mycoplasma pneumoniae（呼吸器病原体）、Mycoplasma hominis（泌尿性器病原体）、及びUreaplasma urealyticum（泌尿性器病原体）を含む。本発明のペプチドは、マイコプラズマ感染に関連した疾患を治療するために使用することができる。また、マイコプラズマ汚染は、in vitroで細胞を培養する際に頻繁に生じる問題であり、それを有効に排除することは非常に困難である。したがって、本発明のペプチドは、組織培養内のマイコプラズマ汚染を選択的に排除するのに有用でありうる。
真菌も、本発明の特定のペプチドに感受性でありうる。なぜなら、それらの膜は、ヒト細胞内では見いだされないエルゴステロールを含有するからである。この相違を治療用途において利用して、真菌を選択的に抑制するがヒト又は哺乳類膜の機能を妨げない本発明のペプチドを設計することが可能である。選択的抗真菌膜標的化のメカニズムの前例は、例えば、エルゴステロールに結合し該膜内に孔を形成する抗真菌剤アンホテリシンBの使用において見出される（Goodmanら, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Macmillan Publishing, New York, 1985）。限定するものではないが、皮膚糸状菌、酵母、二形性真菌及び糸状菌を含むすべての真菌が、これらのペプチドの潜在的な標的とみなされうる。本発明のペプチドの標的となりうる特定の真菌病原体は、ミクロスポルム属菌（Microsporum spp.）、エピデルモフィトン属菌（Epidermophyton spp.）、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、トリコフィトン属菌（Trichophyton spp.）、Sporothrix schenkii及びAspergillus fumigatusならびに当業者に公知の他の病原体を含むが、これらに限定されるものではない。
DNAウイルス及びRNAウイルスの両方が本発明の抗微生物ペプチドの標的となりうる。本発明の特定の実施形態においては、該ペプチドは膜構造体を標的としそれを破壊しうるため、包膜ウイルスは該ペプチドの抗ウイルス作用に感受性でありうる。すべてのウイルスが潜在的な標的であるが、例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、バキュロウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス及びフラビウイルスのような包膜ウイルスは、本発明の抗微生物ペプチドに特に感受性でありうる。本発明の好ましい実施形態においては、該ウイルスは、レンチウイルス、例えばHIV-1、ヘルペスウイルス、例えばHSV、又はオルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルスよりなる群から選ばれる。特に好ましい実施形態においては、該ウイルスはHIV-1である。なぜなら、それは粘膜表面上に広がり、HIV-1及び他の性感染症病原体に対して活性な合成ペプチドのような殺微生物物質の局所投与により処置されうるからである（後記実施例5を参照されたい）。
また、該ペプチドのメカニズム及びそれらの生化学的標的の更なる解明は、細胞質の及び／又は外壁膜の含有物において改変された細菌、真菌、マイコプラズマ及びウイルスの同質遺伝子突然変異体の使用から達成されるかもしれない。特定の膜構成成分に対して最適に抑制性である特定の設計体を同定するために、本発明のペプチド類似体を、これらの突然変異体に対して特異的に試験することができる。
本発明のペプチドは、例えば、嚢胞性線維症肺感染（後記実施例3を参照されたい）、関節敗血症（後記実施例4を参照されたい）、眼感染症、歯周病、STD、外耳炎、皮膚感染症、熱傷感染症、膣感染症及び糖尿病性足潰瘍のような特定の微生物感染症の抑制又は治療に有用でありうる。
さらに、本発明のペプチドは、微生物のコロニー形成を抑制するのに有用でありうる。例えば、該ペプチドは、ウイルスベクターを使用するトランスフェクションを介して運搬され、in vivoで真核細胞により発現されうる。該細胞内での該ペプチドの継続的発現及びそれらの環境中への分泌は、微生物のコロニー形成を妨げ、微生物感染を予防しうる。これは、嚢胞性線維症に関与する細菌のコロニー形成を抑制しうる本発明のペプチドを気道上皮細胞へ運搬することにより嚢胞性線維症を予防するのに有用でありうる。該ペプチドを発現する細胞は、或る範囲の病原性微生物のコロニー形成を継続的に阻止しうることが可能である。
また、特定の微生物感染症の抑制又は治療に関する本発明の抗微生物ペプチドの評価は、ヒト又は他の哺乳動物におけるそのような感染症に関連していると当業者に認められた感染症の動物モデルの使用を伴いうる。後記実施例3は、ペプチドの選択毒性が試験されうる嚢胞性線維症肺感染症の細胞培養モデルを記載している。後記実施例4は、抗微生物ペプチドを評価するために使用しうる関節敗血症の動物モデルを記載している。
抗生物質としてのeLLPの使用の利点には、膜構造体を標的とする抗生物質に対する耐性メカニズムを微生物が発達させることがより困難であると考えられうることが含まれる。他の微生物病原体が、（通常の抗生物質とは対照的に）これらの物質にさらされたことがないことは、更なる利点である。本発明のペプチドの前記の特性を考慮すると、微生物により引き起こされた宿主における感染過程の治療に本発明の抗微生物ペプチドを使用しうることが意図される。
本発明のペプチドの全身投与は宿主における免疫原性応答を誘導しうる。したがって、全身投与された場合の該ペプチドの免疫原性を減少させるために、ポリエチレングリコール処理のような当技術分野で公知の技術を用いることができる。
本発明のもう1つの実施形態は、これらのペプチドがそれらのN末端アミノ基を介して固相基体に結合したまま機能するのを可能にする該ペプチドの作用の表面活性メカニズムである。本発明のペプチドは、固相基体に結合している場合に活性である（実施例4、表3を参照されたい）。したがって、本発明のペプチドは、人工器官（例えば、人工関節及び肢）のような移植装置上のコーティング剤として有用である。該ペプチドは、人工臓器及び眼内レンズ上のコーティング剤としても有用でありうる。
本発明のeLLPは、単一のアミノ基及び遊離スルフヒドリル基を有しうる。これらの官能基は、誘導体化表面への特異的結合を可能にする。例えば、適当に誘導体化された表面を本発明のeLLPのN末端アミノ基に結合させるために、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）化学を用いることができる。あるいは、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル（MBS, Pierce Chemical, Rockford, IL）を使用して、遊離カルボキシル基で誘導体化された表面をeLLPのCys残基上の遊離スルフヒドリル基に架橋することが可能であろう。ペプチドを誘導体化表面に結合させるための他の方法は当業者に公知である。
また、本発明のeLLPは、ペプチド-カーゴ（cargo、積荷）複合体に関する。この場合、本発明のペプチドは、標的微生物へのカーゴの運搬が可能となるようカーゴに結合されていてもよい。該カーゴは、抗微生物活性を有する因子を含むことが可能であり、本発明のeLLPの効力を改善し及び／又は本発明のeLLPの抗微生物活性を増加しうる。例えば、eLLPを、リゾチームのような抗細菌酵素又はペニシリンのような抗生物質に架橋して、それらの効力を増強することが可能である。本発明のペプチドをカーゴに結合させるための他の方法は当業者に周知である。
本発明のもう1つの態様は、治癒を促進するための時間及び条件下で本発明のペプチドを患者に投与することにより、感染過程を排除する方法に関する。本発明の特定の態様においては、これらのペプチドの高い効力及び迅速な殺菌活性は、それらを、縫合前の創傷の滅菌及び手術又は他の侵襲的方法において装置を使用する前の該装置の滅菌のような予防療法において使用するための魅力的な候補とする。それらの微生物特異性は、本発明のペプチドを、組織培養内の望ましくない微生物増殖の抑制において特に有用なものとする（特に、組換えタンパク質又は遺伝子治療に使用するベクターの製造に使用される場合）。本発明のもう1つの実施形態においては、該ペプチドは、宿主細胞又は微生物内への運搬を促進する1以上の他の薬物との組合せ製剤において使用することができる（例えば、実施例4、図12を参照されたい）。
本発明はまた、治療的に有効な量（細胞培養又は宿主個体から標的微生物を最小限に抑制したり又は排除するのに十分なペプチド（又はペプチドの組合せ）の量）で宿主に投与しうる、有効成分として該抗微生物ペプチドの1以上を含有する生理的組成物に関する。
該生理的組成物は、治療的に有効な用量の本発明の抗微生物ペプチドの少なくとも1つと、製薬上許容される担体とを含有する。本発明はまた、本発明の組成物を使用する、宿主における微生物感染症の治療方法に関する。そのような治療は、そのような治療を要する個体に、治療的に有効な量の生理的組成物を投与することを含む。そのような組成物は、筋肉内又は静脈内経路により非経口的に投与することが可能であるが、十中八九は、エアゾール化、皮下投与又は経口、局所及び鼻腔内投与により投与される場合に最も有用であろう。好ましくは、本発明のペプチドを含有する生理的組成物を、微生物により引き起こされる表面感染の排除のために局所的に適用する。局所医薬組成物において使用する場合には、該ペプチド有効成分を該組成物の0.001〜20％（w/v）の濃度で使用することができる。
局所的に適用する場合には、該ペプチド組成物を担体及び／又はアジュバントのような他の成分と組合せることができる。また、該ペプチドの拡散を最小限に抑えるために、アルブミンのようなタンパク質担体又は人工インプラントに該ペプチドを共有結合させることができる。そのような他の成分の性質に対する制限は無い。ただし、それらは、製薬上許容され、意図される投与に有効であり、該組成物の有効成分を分解させ得ないものでなければならない。本発明のペプチド組成物を局所感染部位に適用する場合、それらは刺激物（それはスカベンジャー細胞の流入を刺激するであろう）として作用する可能性がある。また、該ペプチド組成物は、軟膏剤又は坐剤（好ましくは、精製コラーゲンと組合されている）の形態でありうる。また、該ペプチド組成物を、好ましくは液体又は半液体形態で、経皮パッチ、硬膏及び包帯に含浸させることができる。
本発明のペプチドはまた、感染過程の治癒を促進させるために全身投与することができる。全身適用する場合には、該ペプチド組成物は、経腸投与のための液体、丸剤、錠剤、トローチ剤など、又は非経口注射のための液体形態として製剤化することができる。該ペプチド（又はペプチド-タンパク質コンジュゲート）は、当業者に公知の担体及び／又はアジュバントのような他の成分と組合せることができる。そのような他の成分の性質に対する制限は無い。ただし、それらは、生理的に許容され、それらの意図される投与に有効であり、該組成物の有効成分を分解させ得ないものでなければならない。注射に適した生理的形態には、無菌水溶液又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液の用時調製用の無菌粉末が含まれる。いずれの場合においても、最終的な溶液形態は無菌であり流動性でなければならない。当技術分野において公知の典型的な担体には、例えば、水緩衝化水溶液（すなわち、生体適合性バッファー）、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、それらの適当な混合物、界面活性剤又は植物油を含有する溶媒又は分散媒が含まれる。滅菌は、濾過、又は抗細菌もしくは抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸又はチメロサール）の添加を含む（これらに限定されるものではない）当技術分野において認められた技術により達成することができる。さらに、例えば糖のような等張剤を本組成物に含有させることが可能である。本ペプチドを含有する無菌注射溶液の製造は、必要な量のこれらの化合物を、必要に応じて前記の種々の成分と共に、適当な溶媒に含有させ、ついで滅菌、好ましくは濾過滅菌することにより達成される。
本発明のペプチドを経口投与する場合には、該ペプチドの有効量を含有するその生理的組成物はまた、不活性希釈剤、同化可能な可食担体などを含有したり、硬又は軟ゼラチンカプセル剤としたり、圧縮して錠剤としたり、あるいはエリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤などにすることが可能である。したがって、本ペプチドは、簡便かつ有効な投与のために、治療的に有効な量の適当な製薬上許容される担体と共に医薬上有効な量で配合される。
感染を抑制するために本発明の方法において使用するペプチドの厳密な有効量は、抗生物質の活性の性質及び感染過程の性質を理解している当業者により、過度な実験を伴わずに決定できる。使用しなければならない抗生物質ペプチド（例えば、本発明のペプチド）の量は、感染の程度及び治療すべき微生物に応じて様々となりうる。投与用の複合製剤の単位体積当たりの本発明のペプチドの量も、当業者により、過度な実験を伴わずに決定されうる。しかし、一般には、該ペプチドは、好ましくは、複合組成物の1ml当たり少なくとも約1.0ナノグラム、より好ましくは、1ml当たり約1.0ミリグラムまでの量で存在すべきであると記載できる。全身用量も、患者の年齢、体重及び状態ならびに投与経路に左右される。例えば、ヒト成人への投与のための適当な用量は、約0.01〜約100mg/kg体重の範囲となりうる。好ましい用量は、約0.5〜約5.0mg/kg体重の範囲となりうる。本発明で用いる生理的に許容される担体には、任意の溶媒、分散媒、コーティング剤などが含まれる。そのような媒体及び物質の使用は当技術分野において周知である。
本発明の抗微生物ペプチド組成物は、進行中の感染過程を排除するよう設計されているため、該組成物の連続的な適用又は断続的な再適用を行うか又はそれが好ましいかもしれない。本発明の実施は、特に示さない限り、当技術分野の技量の範囲内である合成有機化学、タンパク質化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び薬理学の通常の技術を用いる。そのような技術は文献に十分に説明されている（例えば、Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practices, 2nd edition, Springer-Verlag, 1987; Methods in Enzymology, S. Colwick及びN. Kaplan編, Academic Press; Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1995; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985を参照されたい）。
以下の実施例は本発明を更に詳しく例示するものであり、本発明を限定するものではない。
（実施例１） eLLPの設計及び合成
eLLPの設計
前記の原理を用いて、予想される両親媒性αらせん構造を有するArgに富む親水性面及びより理想的な疎水性面を作製するためのLLP1親配列の残基の改変に基づく合成を目的として、ペプチド配列を設計した。1つの場合、すなわち、WLSA-5（配列番号3）の場合には、活性の効力及びスペクトルを増強するためにTrp残基を含有させた（図1）。図2に示すように、LBU-2（配列番号5）及びLBU-3（配列番号6）の場合には、親水性面及び疎水性面上にそれぞれArg残基及びVal残基よりなる理想化された両親媒性αらせん構造を設計した。
eLLPの設計
前記の原理を用いて、予想される両親媒性αらせん構造を有するArgに富む親水性面及びより理想的な疎水性面を作製するためのLLP1親配列の残基の改変に基づく合成を目的として、ペプチド配列を設計した。1つの場合、すなわち、WLSA-5（配列番号3）の場合には、活性の効力及びスペクトルを増強するためにTrp残基を含有させた（図1）。図2に示すように、LBU-2（配列番号5）及びLBU-3（配列番号6）の場合には、親水性面及び疎水性面上にそれぞれArg残基及びVal残基よりなる理想化された両親媒性αらせん構造を設計した。
ペプチド合成
Advanced Chemtechモデル200（Advanced Chemtech, Louisville, Ky.）又はMillipore 9050+（Millipore, Bedford, Mass.）自動ペプチド合成装置をFmoc合成プロトコールで使用し、既に記載されているとおりに（Miller, Jaynes及びMontelaro, AIDS Research & Human Retroviruses 7:511-519ならびにFontenotら, Peptide Research 4:19-25を参照されたい）、ペプチドを合成した。切断及び脱保護の後、Vydac C18又はC4カラム（The Separations Group, Hesperia, Calif.）上の逆相HPLCにより、合成ペプチドを特徴づけ精製した。各ペプチドが何であるかを質量分析により確認した（University of Pittsburgh Protein & Peptide Core Facility）。
Advanced Chemtechモデル200（Advanced Chemtech, Louisville, Ky.）又はMillipore 9050+（Millipore, Bedford, Mass.）自動ペプチド合成装置をFmoc合成プロトコールで使用し、既に記載されているとおりに（Miller, Jaynes及びMontelaro, AIDS Research & Human Retroviruses 7:511-519ならびにFontenotら, Peptide Research 4:19-25を参照されたい）、ペプチドを合成した。切断及び脱保護の後、Vydac C18又はC4カラム（The Separations Group, Hesperia, Calif.）上の逆相HPLCにより、合成ペプチドを特徴づけ精製した。各ペプチドが何であるかを質量分析により確認した（University of Pittsburgh Protein & Peptide Core Facility）。
ペプチドの定量
定量的ニンヒドリンアッセイにより、ペプチドの濃度を測定した。簡潔に説明すると、5〜60nmolのペプチドを含有するサンプルに、Sarinら（Analytical Biochemistry 117:147-157）に記載のとおりに調製したニンヒドリン試薬A、B及びCを加えた。0〜60nmolのロイシンよりなる、通常のアミノ酸組成分析により検量したロイシン標準溶液を平行して調製して、標準曲線を作成した。100℃で10分間にわたるインキュベーションの際に生成した紫色を、96ウェルプレートの3重ウェルに移された1:1 イソプロパノール/水中での希釈、及びマイクロウェルプレートリーダー（Dynatech, Chantilly, Va.）上でのAbs570の測定により定量した。ペプチドの濃度を、該標準曲線との比較により測定し、各ペプチドに結合した遊離アミノ基の数に関して補正した。
定量的ニンヒドリンアッセイにより、ペプチドの濃度を測定した。簡潔に説明すると、5〜60nmolのペプチドを含有するサンプルに、Sarinら（Analytical Biochemistry 117:147-157）に記載のとおりに調製したニンヒドリン試薬A、B及びCを加えた。0〜60nmolのロイシンよりなる、通常のアミノ酸組成分析により検量したロイシン標準溶液を平行して調製して、標準曲線を作成した。100℃で10分間にわたるインキュベーションの際に生成した紫色を、96ウェルプレートの3重ウェルに移された1:1 イソプロパノール/水中での希釈、及びマイクロウェルプレートリーダー（Dynatech, Chantilly, Va.）上でのAbs570の測定により定量した。ペプチドの濃度を、該標準曲線との比較により測定し、各ペプチドに結合した遊離アミノ基の数に関して補正した。
（実施例２） in vitro溶菌アッセイを用いるペプチドの評価
試験サンプル
この研究に使用したペプチドは前記のとおりであり、前記とおりに製造される。これらの実験に使用した細菌分離株のパネルは、グラム陽性及びグラム陰性の両方の臨床分離株を含むものであった。与えられた細菌分離株を後記のとおりに調製し、与えられたeLLPに後記のとおりにさらした。
試験サンプル
この研究に使用したペプチドは前記のとおりであり、前記とおりに製造される。これらの実験に使用した細菌分離株のパネルは、グラム陽性及びグラム陰性の両方の臨床分離株を含むものであった。与えられた細菌分離株を後記のとおりに調製し、与えられたeLLPに後記のとおりにさらした。
溶菌アッセイ
既に報告されている（Lehrer, R. I., M. E. Selsted, D. Szklarek及びF. J. 1983. Infect. Immun. 42:10-4,1983; Miller, M. A., R. F. Garry, J. M. Jaynes及びR. C. Montelaro, AIDS Res Hum Retroviruses 7:511-519,1991）方法と同様の方法で溶菌アッセイを行った。細菌懸濁液をLBブロス（Luria-Bertani Broth）中で中期対数増殖期まで培養し、遠心分離と10mM リン酸バッファーへの懸濁を2サイクル行って洗浄した。該懸濁液のAbs600を10mMリン酸バッファーで調節して、希釈後に、5〜10×105 cfu/mLが該アッセイにおいて処理されるようにした。希釈剤として10mMリン酸バッファー（pH 7.2）を使用して2倍希釈（100μM〜100nM）したペプチドと共に、細菌を96ウェルプレート中で1時間インキュベートした。細菌の10倍希釈を1:1000まで行い、各条件からの100μlのアリコートをトリプシンダイズ寒天プレート（Difco, Detroit, Mich.）の表面上に広げ、それを一晩インキュベートした。生存細菌のコロニー（cfu、コロニー形成単位）を計数し、未処理対照と比較して、各条件下でのペプチド誘導性殺菌の量を測定した。log殺菌は、ペプチドでの処理の前及び後に存在するcfuの比率の対数と定義される。最小殺菌濃度MBCは、99.9％（3 log）の殺菌が達成されたペプチド濃度である（Pearsonら, Antimicrob. Agents Chemother. 18:699-708,1980）。
既に報告されている（Lehrer, R. I., M. E. Selsted, D. Szklarek及びF. J. 1983. Infect. Immun. 42:10-4,1983; Miller, M. A., R. F. Garry, J. M. Jaynes及びR. C. Montelaro, AIDS Res Hum Retroviruses 7:511-519,1991）方法と同様の方法で溶菌アッセイを行った。細菌懸濁液をLBブロス（Luria-Bertani Broth）中で中期対数増殖期まで培養し、遠心分離と10mM リン酸バッファーへの懸濁を2サイクル行って洗浄した。該懸濁液のAbs600を10mMリン酸バッファーで調節して、希釈後に、5〜10×105 cfu/mLが該アッセイにおいて処理されるようにした。希釈剤として10mMリン酸バッファー（pH 7.2）を使用して2倍希釈（100μM〜100nM）したペプチドと共に、細菌を96ウェルプレート中で1時間インキュベートした。細菌の10倍希釈を1:1000まで行い、各条件からの100μlのアリコートをトリプシンダイズ寒天プレート（Difco, Detroit, Mich.）の表面上に広げ、それを一晩インキュベートした。生存細菌のコロニー（cfu、コロニー形成単位）を計数し、未処理対照と比較して、各条件下でのペプチド誘導性殺菌の量を測定した。log殺菌は、ペプチドでの処理の前及び後に存在するcfuの比率の対数と定義される。最小殺菌濃度MBCは、99.9％（3 log）の殺菌が達成されたペプチド濃度である（Pearsonら, Antimicrob. Agents Chemother. 18:699-708,1980）。
結果
代表的なグラム陽性（S. aureus）及びグラム陰性（P. aeruginosa）臨床分離株を、本発明に記載のペプチドを調べるための指標細菌として使用した。S. aureus及びP. aeruginosaに関するLL37及びWLSA-5（配列番号3）の殺菌曲線を図3及び4に示す。これらの結果は、本発明に記載のその他のペプチドを反映している。この分析は、eLLP及びLBUが、該指標細菌の殺菌において宿主由来抗微生物ペプチドLL37と同等に有効であることを示した。
代表的なグラム陽性（S. aureus）及びグラム陰性（P. aeruginosa）臨床分離株を、本発明に記載のペプチドを調べるための指標細菌として使用した。S. aureus及びP. aeruginosaに関するLL37及びWLSA-5（配列番号3）の殺菌曲線を図3及び4に示す。これらの結果は、本発明に記載のその他のペプチドを反映している。この分析は、eLLP及びLBUが、該指標細菌の殺菌において宿主由来抗微生物ペプチドLL37と同等に有効であることを示した。
多数の宿主由来抗微生物ペプチドの弱点は、生理的（150mM）NaCl濃度におけるそれらの活性の減少にある。Friedrichら, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43:1542-1548を参照されたい。ペプチドWLSA-5（配列番号3）及びLL37を、前記の2つの指標株に対して生理的NaClにおいて試験した。これらの実験の結果を図5及び6に示す。これらの実験の結果は、S. aureusを試験細菌として使用した場合にはWLSA-5（配列番号3）がLL37と同じようにはNaClにより影響されないことを示した。P. aeruginosaの殺菌は、いずれのペプチドに関してもNaClの添加により影響されなかった。これらの分析は、イオンの存在に対してeLLPが宿主由来抗微生物ペプチドほどには感受性でないことを示唆している。本発明のeLLP及びLBUの活性を、より広い臨床細菌分離株において比較した。これらは、リン酸バッファーのみ（低塩）及び150mM NaClを含有するリン酸バッファー（生理的条件）においてそれらのMBCを比較し、表2にまとめた。この表は抗微生物活性のスペクトル及び効力に関するものであるため、当業者であれば、該表を詳細に検討することにより、eLLP及びLBUの活性が宿主由来抗微生物ペプチドより優れていると結論づけるであろう。
（実施例３） 選択毒性の嚢胞性線維症細胞培養モデル
細菌細胞の調製
Burkholderia cepacia及びP. aeruginosa分離株を臨床微生物学実験室から入手し、実施例2に記載のブロス希釈法を用いてアッセイした。
細菌細胞の調製
Burkholderia cepacia及びP. aeruginosa分離株を臨床微生物学実験室から入手し、実施例2に記載のブロス希釈法を用いてアッセイした。
真核細胞の調製
空気-液界面上のヒト気管支上皮（HBE）細胞（CF（嚢胞性線維症）及び非CF）の分化初代細胞培養を、抗生物質を含有しない培地内で調製した。Zabner, J.ら, 1996, J. Virol. 70:6994-7003を参照されたい。これらのフィルターをP. aeruginosaと共にインキュベートし、ついで洗浄して非付着性細菌を除去した。ついで個々のフィルターを漸増濃度のペプチドにさらした。生存性細菌を遊離させるために、トリプシン/EDTAを加え、これらの調製物を標準的な細菌学的培地上にプレーティングして細菌の生存を定量した。経上皮抵抗を測定することにより、同様に調製された細胞をペプチドの毒性に関してモニターした。このモデルの利点は、それが、細菌対宿主細胞に関するペプチドの選択毒性を同一条件下で測定しうることにある。
空気-液界面上のヒト気管支上皮（HBE）細胞（CF（嚢胞性線維症）及び非CF）の分化初代細胞培養を、抗生物質を含有しない培地内で調製した。Zabner, J.ら, 1996, J. Virol. 70:6994-7003を参照されたい。これらのフィルターをP. aeruginosaと共にインキュベートし、ついで洗浄して非付着性細菌を除去した。ついで個々のフィルターを漸増濃度のペプチドにさらした。生存性細菌を遊離させるために、トリプシン/EDTAを加え、これらの調製物を標準的な細菌学的培地上にプレーティングして細菌の生存を定量した。経上皮抵抗を測定することにより、同様に調製された細胞をペプチドの毒性に関してモニターした。このモデルの利点は、それが、細菌対宿主細胞に関するペプチドの選択毒性を同一条件下で測定しうることにある。
結果
LLP-1及びその誘導体SA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）及びWLSA-5（配列番号3）を、CF気道疾患に典型的には関連している病原体、すなわち、S. aureus、P. aeruginosa及びB. cepaciaに対するそれらの殺菌活性に関して試験した。低塩（10mMリン酸バッファー（PB））及び生理的塩（150mM NaClを含有する10mM PB）濃度を、実施例2に記載の標準的なブロス希釈アッセイを用いてペプチド活性が試験される生存可能な条件として用いた。図3〜6で示されたのと同様の殺菌曲線を作成し、前記のとおりにMBC値を求めた。S. aureus及びP. aeruginosaのMBC値を表2にまとめる。試験したペプチドのうちWLSA-5（配列番号3）は、これらの2つの指標株に対して、低塩及び生理的塩条件中でその活性を維持した。
LLP-1及びその誘導体SA-5（配列番号1）、LSA-5（配列番号2）及びWLSA-5（配列番号3）を、CF気道疾患に典型的には関連している病原体、すなわち、S. aureus、P. aeruginosa及びB. cepaciaに対するそれらの殺菌活性に関して試験した。低塩（10mMリン酸バッファー（PB））及び生理的塩（150mM NaClを含有する10mM PB）濃度を、実施例2に記載の標準的なブロス希釈アッセイを用いてペプチド活性が試験される生存可能な条件として用いた。図3〜6で示されたのと同様の殺菌曲線を作成し、前記のとおりにMBC値を求めた。S. aureus及びP. aeruginosaのMBC値を表2にまとめる。試験したペプチドのうちWLSA-5（配列番号3）は、これらの2つの指標株に対して、低塩及び生理的塩条件中でその活性を維持した。
CF気道疾患に関連している重要な細菌病原体であるB. cepaciaに対する活性に関して、WLSA-5（配列番号3）を試験し、LSA-5（配列番号2）と比較した。図7に示すとおり、B. cepaciaに対して、WLSA-5（配列番号3）はLSA-5（配列番号2）より有意に活性であった。一般には、この生物はほとんどの抗微生物ペプチドの活性に対して耐性であると報告されており、したがって、WLSA-5（配列番号3）は顕著なin vitro活性を示すと考えられる。この活性が、図7で試験したB. cepaciaの臨床分離株に特異的であるのか、多様なB. cepacia分離株全般に適用可能なのかを試験するために、調査研究を計画した。この研究のために、一群の十分に特徴づけられたB. cepaciaゲノム変種（genomovars）を入手し、25μMのWLSA-5（配列番号3）による殺菌に対する感受性に関して試験した。これを宿主抗微生物ペプチドLL37と同一濃度で比較した。図8に示すデータは、これらの条件下での処理の後に生存した生物の数として表されている。該結果は、この群内のすべての細菌株の殺菌において、WLSA-5（配列番号3）がLL37と同等又はそれより優れていることを示した。この知見は、WLSA-5（配列番号3）が、CF状態（B. cepaciaは、CF患者において肺疾患を急発させる主要病原体である）において投与された場合に有効でありうることを示唆している。
前記のin vitroでの知見に基づき、WLSA-5（配列番号3）を、より正確にその選択毒性を評価する構想で試験した。このアッセイのために、分化した初代ヒト気道上皮細胞を利用する細菌付着の細胞培養モデルを確立した。これらの細胞をP. aeruginosaの標準接種物にさらし、共培養内の細菌及び上皮細胞を種々の濃度の試験ペプチドで処理した。ペプチド曝露の後に上皮細胞に結合した生存性細菌の相関因子として、ペプチドの殺菌能をモニターする。上皮細胞毒性を評価するために、経上皮抵抗の測定を行った。培養内の分化気道上皮細胞は、該単層が上皮細胞損傷のような事象により損なわれていない限り電流に無反応性の密着結合を形成する。したがって、ペプチド毒性の高感度な尺度として経上皮抵抗の測定を用いることができる。図9は、漸増濃度のWLSA-5（配列番号3）を共培養内の結合P. aeruginosa及び上皮細胞に加えた実験の結果を示す。細菌生存性の減少及び経上皮抵抗（Rte）の増加がペプチド濃度の相関的要素として示された。細菌数の2桁の減少は、50％未満の経上皮抵抗の変化を引き起こした。さらに、経上皮抵抗に対するWLSA-5（配列番号3）の効果は一過性であり、LL37と有意には異ならなかった。これらのデータは、WLSA-5（配列番号3）がCF状態における選択細菌毒性を示すことを示唆している。
（実施例４） 敗血症性関節炎のウサギ関節モデル
LSA-5（配列番号2）は、関節感染症の一般的な2つの原因因子であるS. aureus（表2）及びS. epidermisに対してin vitroで非常に活性であり、滑液の存在はLSA-5（配列番号2）の活性を明らかに弱めるもののLSA-5は例えば関節滑膜に由来する生物学的流体の存在下で機能しうることを、本発明者らは示した（図10）。本発明者らは、これらの知見を敗血症性関節炎動物モデルに拡張した。この研究においては、2.5kgのニュージーランド白色ウサギの一方の膝に1×105 コロニー形成単位の臨床S. aureus分離株（ペニシリンには耐性であるがメチシリン、セファロスポリン及びクリンダマイシンには感受性である株）を接種することにより、関節敗血症を誘発させた。このモデルを使用して、敗血症性関節炎の症状（例えば、滑膜の分解）をモニターし、感染後の関節の変性を抑制する抗微生物薬の能力を評価することができる。この適用においては、該細菌感染は、1時間にわたり確立させた。この時点で、該関節を評価し、リン酸バッファー（PB）に溶かした漸増濃度のLSA-5（配列番号2）（0、50、100及び200μM）を関節内に投与した。LSA-5（配列番号2）の点滴注入の0時間後及び1時間後、滑液の希釈液をLB寒天にプレーティングすることにより、関節流体に付着した細菌の濃度を確立した。この実験の結果は、1時間後の検査で、未ペプチド処理関節と比較してコロニー形成単位の用量依存的減少を示した（図11）。
LSA-5（配列番号2）は、関節感染症の一般的な2つの原因因子であるS. aureus（表2）及びS. epidermisに対してin vitroで非常に活性であり、滑液の存在はLSA-5（配列番号2）の活性を明らかに弱めるもののLSA-5は例えば関節滑膜に由来する生物学的流体の存在下で機能しうることを、本発明者らは示した（図10）。本発明者らは、これらの知見を敗血症性関節炎動物モデルに拡張した。この研究においては、2.5kgのニュージーランド白色ウサギの一方の膝に1×105 コロニー形成単位の臨床S. aureus分離株（ペニシリンには耐性であるがメチシリン、セファロスポリン及びクリンダマイシンには感受性である株）を接種することにより、関節敗血症を誘発させた。このモデルを使用して、敗血症性関節炎の症状（例えば、滑膜の分解）をモニターし、感染後の関節の変性を抑制する抗微生物薬の能力を評価することができる。この適用においては、該細菌感染は、1時間にわたり確立させた。この時点で、該関節を評価し、リン酸バッファー（PB）に溶かした漸増濃度のLSA-5（配列番号2）（0、50、100及び200μM）を関節内に投与した。LSA-5（配列番号2）の点滴注入の0時間後及び1時間後、滑液の希釈液をLB寒天にプレーティングすることにより、関節流体に付着した細菌の濃度を確立した。この実験の結果は、1時間後の検査で、未ペプチド処理関節と比較してコロニー形成単位の用量依存的減少を示した（図11）。
LSA-5（配列番号2）の連続投与がこのウサギモデルにおける細菌負荷の抑制に有効でありうることを示すために、時間0及び1時間における150μM LSA-5（配列番号2）の2通りのペプチド処理投与を評価した。処理の1時間後の細菌負荷の測定は、該ペプチド処理関節においては、ペプチドの不存在下のリン酸バッファーで処理した関節と比較して、有意な減少を示した。これを、標準的な0.35％ ネオマイシン又はネオマイシンとLSA-5（配列番号2）との組合せの複数回の注入と比較した。これらの製剤のそれぞれの投与は、時間0、1及び2時間に関節内に行った。LSA-5（配列番号2）又はネオマイシンのみで処理した群と比較して、LSA-5/ネオマイシンの組合せで処理した関節からは、実質的に、より少数の細菌が回収されたことを、この実験の結果は示した（図12）。さらに、これらの動物実験のすべてにおいて、ペプチドを単独で投与した場合、有害な毒性は何ら認められなかった。これらのデータは、敗血症性関節炎に関連した慢性感染に類似しており、局所処理が初期に有効でありうることを示唆している。
敗血症性関節炎に関連したeLLPの潜在的に重要な1つの用途として、人工関節のような固相基体に結合している場合のその活性が挙げられる。これを検討するために、LSA-5（配列番号2）のアミノ末端基をAffigel（商標）15（Biorad, Hercules, CA）樹脂に共有結合させた。この透過性固体支持体を小さなカラム内に配置し、a×106 細菌/mLの1mLの懸濁液にさらした。該溶液を重力により該カラムに通過させ、溶出液を集め、生存細菌の数に関して定量した。陰性対照として、LSA-5（配列番号2）の代わりに非抗微生物ペプチドを結合させた以外は同じカラムを調製した。結果を後記表3にまとめる。該結果は、P. aeruginosa又はS. aureusの懸濁液がいずれも、該カラムへの曝露により完全に滅菌されたことを示している。これに対して、非抗微生物ペプチド対照カラムへの曝露の後では、生存細菌の減少は全く認められなかった。さらに、同じLSA-5（配列番号2）カラムを細菌懸濁液に繰返しさらすことが可能であり、それは、6回の通過まで、活性を維持した。これらのデータは、敗血症性関節炎を引き起こす関節置換手術で観察される生物膜形成の核形成を抑制するために、人工関節を本発明のeLLPでコーティングしうるという可能性を示唆している。
（実施例５） HIV-1の感染力の抑制
本発明のペプチドが或る真核細胞膜に対して活性であった（例えば、赤血球を溶解することが示された）という観察に基づき、本発明のペプチドは包膜ウイルスの感染力の抑制において活性でありうると推測された。この見解を立証する証拠は、カチオン性宿主由来抗微生物ペプチドに関して既に示されているのと同様に（Wachinger, M.ら, (1998) Journal of General Virology 79:731-40; Wachinger, M., T. Saermark及びV. Erfle (1992) FEBS letters 309:235-41 ; Robinson, W. E., Jr., B. McDougall, D. Tran及びM. E. Selsted 1 (998) Journal of Leukocyte Biology 63:94-100; Yasin, B.ら (2000) European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 19:187-94）HIV-1の感染力を抑制するLLP1ペプチドLSA-5（配列番号2）の能力を研究することにより得られた。
本発明のペプチドが或る真核細胞膜に対して活性であった（例えば、赤血球を溶解することが示された）という観察に基づき、本発明のペプチドは包膜ウイルスの感染力の抑制において活性でありうると推測された。この見解を立証する証拠は、カチオン性宿主由来抗微生物ペプチドに関して既に示されているのと同様に（Wachinger, M.ら, (1998) Journal of General Virology 79:731-40; Wachinger, M., T. Saermark及びV. Erfle (1992) FEBS letters 309:235-41 ; Robinson, W. E., Jr., B. McDougall, D. Tran及びM. E. Selsted 1 (998) Journal of Leukocyte Biology 63:94-100; Yasin, B.ら (2000) European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 19:187-94）HIV-1の感染力を抑制するLLP1ペプチドLSA-5（配列番号2）の能力を研究することにより得られた。
本実施例においては、ヒト末梢血単球（PBMC）を健康なボランティアから得て、1×105 生存細胞/mL培地の濃度で培養内で維持した。これらの細胞をフィトヘマグルチニン（PHA）の添加により刺激した。これに、標準力価の精製HIV-1（IIIB株）ビリオンをPBMCに加えて、ウイルスへの曝露の5日後、14,000 pg/mLのp24抗原シグナルを得た。
LLPペプチドLSA-5（配列番号2）がHIV-1活性を抑制しうるか否かを試験するために、0.1〜100μMの濃度のLSA-5を、前記のとおりに測定された標準力価のウイルスと共に30分間にわたりインキュベートした。ペプチドへの曝露の後に生存しているビリオンを100,000×gで60分間の超遠心分離により単離した。ウイルスペレットを使用して、前記のとおりに調製されたPHA刺激PBMCに感染させた。感染の5日後、p24抗原のレベルを測定し、非ペプチド処理対照と比較した。該データを、ペプチド処理HIV-1感染細胞に結合しているp24抗原と非ペプチド処理HIV-1感染細胞に結合しているp24抗原との比率として表して、抑制率（％）と称される値を得た。
図13に示すとおり、100μMでのLSA-5処理ビリオンのみが、HIV-1の感染力を約100％減少させた。10μMでは、HIV-1の感染力は75％まで減少した。1及び0.1μMでは、LSA-5のこの抑制活性が急激に減少した。本発明に記載の他のペプチドを使用する本明細書に記載されていない実験は、赤血球に対して高い溶血活性を有することが認められたペプチドが、モル基準で、HIV-1ビリオンに対して、低い溶血活性を有するものより活性であることを示している。これらのデータは、本発明のLLPペプチドが包膜ウイルス（特にHIV-1）に対して活性であり、この状況における効力の増強のために改変されうることを示している。
Claims (31)
- RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号5）、
VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号6）、
RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号7）、
RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号8）、
RVVRVVRRWVRR（配列番号9）、
RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号10）、
VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号11）、及び
RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV（配列番号12）
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるペプチド。 - アミノ酸配列RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号5）からなる、請求項1記載のペプチド。
- 請求項２記載のペプチドと担体とを含んでなる組成物。
- アミノ酸配列VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号6）からなる、請求項1記載のペプチド。
- 請求項４記載のペプチドと担体とを含んでなる組成物。
- アミノ酸配列RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号7）からなる、請求項1記載のペプチド。
- 請求項６記載のペプチドと担体とを含んでなる組成物。
- アミノ酸配列RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号8）からなる、請求項1記載のペプチド。
- 請求項８記載のペプチドと担体とを含んでなる組成物。
- アミノ酸配列RVVRVVRRWVRR（配列番号9）からなる、請求項1記載のペプチド。
- 請求項１０記載のペプチドと担体とを含んでなる組成物。
- アミノ酸配列RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号10）からなる、請求項1記載のペプチド。
- 請求項１２記載のペプチドと担体とを含んでなる組成物。
- アミノ酸配列VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号11）からなる、請求項1記載のペプチド。
- 請求項１４記載のペプチドと担体とを含んでなる組成物。
- アミノ酸配列RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV（配列番号12）からなる、請求項1記載のペプチド。
- 請求項１６記載のペプチドと担体とを含んでなる組成物。
- ペプチドが抗細菌活性を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが低塩中で抗細菌活性を有する、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが生理的塩中で抗細菌活性を有する、請求項1記載のペプチド。
- RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号5）、
VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号6）、
RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号7）、
RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号8）、
RVVRVVRRWVRR（配列番号9）、
RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号10）、
VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号11）、及び
RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV（配列番号12）
よりなる群から選ばれる少なくとも1つのペプチドを含んでなる固相基体。 - 固相基体が人工器官である、請求項２１記載の固相基体。
- 人工器官が人工関節である、請求項２２記載の固相基体。
- RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号5）、
VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号6）、
RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号7）、
RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号8）、
RVVRVVRRWVRR（配列番号9）、
RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号10）、
VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号11）、及び
RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV（配列番号12）
よりなる群から選ばれるペプチドと結合している抗細菌酵素または抗生物質を含んでなるペプチド-カーゴ複合体。 - RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号5）、
VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号6）、
RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号7）、
RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号8）、
RVVRVVRRWVRR（配列番号9）、
RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号10）、
VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号11）、及び
RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV（配列番号12）
よりなる群から選ばれる少なくとも1つのペプチドの、細菌の増殖の抑制に有効な量を、哺乳類細胞に添加することを含んでなる、in vitroにおける細胞培養において細菌の増殖を抑制するための方法。 - 被験対象における細菌の増殖を抑制するための医薬組成物であって、
RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号5）、
VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号6）、
RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号7）、
RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR（配列番号8）、
RVVRVVRRWVRR（配列番号9）、
RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号10）、
VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR（配列番号11）、及び
RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV（配列番号12）
よりなる群から選ばれる少なくとも1つのペプチドを含んでなる前記医薬組成物。 - ペプチドを経腸的、局所的又は非経口的に投与する、請求項２６記載の医薬組成物。
- ペプチドが固相基体に結合している、請求項２６記載の医薬組成物。
- 細菌が抗生物質に対して耐性である、請求項２６記載の医薬組成物。
- ペプチドが固相基体に結合している、請求項２５記載の方法。
- 細菌が抗生物質に対して耐性である、請求項２５記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/785,059 US6835713B2 (en) | 2001-02-16 | 2001-02-16 | Virus derived antimicrobial peptides |
| US09/785,058 US20030036627A1 (en) | 2001-02-16 | 2001-02-16 | Virus derived antimicrobial peptides |
| PCT/US2002/004432 WO2002066608A2 (en) | 2001-02-16 | 2002-02-13 | Virus derived antimicrobial peptides |
| PCT/US2002/004812 WO2002079397A2 (en) | 2001-02-16 | 2002-02-19 | Virus derived antimicrobial peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005505498A JP2005505498A (ja) | 2005-02-24 |
| JP4441180B2 true JP4441180B2 (ja) | 2010-03-31 |
Family
ID=27359123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002578400A Expired - Lifetime JP4441180B2 (ja) | 2001-02-16 | 2002-02-19 | ウイルス由来抗微生物ペプチド |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1368050B1 (ja) |
| JP (1) | JP4441180B2 (ja) |
| AT (1) | ATE405284T1 (ja) |
| AU (1) | AU2002255562A1 (ja) |
| CA (1) | CA2438787C (ja) |
| DE (1) | DE60228420D1 (ja) |
| DK (1) | DK1368050T3 (ja) |
| ES (1) | ES2312565T3 (ja) |
| PT (1) | PT1368050E (ja) |
| WO (1) | WO2002079397A2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8172395B2 (en) * | 2002-12-03 | 2012-05-08 | Novartis Ag | Medical devices having antimicrobial coatings thereon |
| US7452856B2 (en) * | 2004-07-06 | 2008-11-18 | Seikagaku Corporation | Antibacterial peptide |
| WO2018160997A1 (en) * | 2017-03-03 | 2018-09-07 | Peptilogics, Inc. | Engineered antimicrobial amphiphilic peptides and methods of use |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714577A (en) * | 1996-01-26 | 1998-02-03 | University Of Pittsburgh | Antimicrobial peptides |
-
2002
- 2002-02-19 WO PCT/US2002/004812 patent/WO2002079397A2/en not_active Ceased
- 2002-02-19 EP EP02724964A patent/EP1368050B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-19 JP JP2002578400A patent/JP4441180B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-19 CA CA2438787A patent/CA2438787C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-19 AU AU2002255562A patent/AU2002255562A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-19 AT AT02724964T patent/ATE405284T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-02-19 DE DE60228420T patent/DE60228420D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-19 ES ES02724964T patent/ES2312565T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-19 DK DK02724964T patent/DK1368050T3/da active
- 2002-02-19 PT PT02724964T patent/PT1368050E/pt unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE405284T1 (de) | 2008-09-15 |
| JP2005505498A (ja) | 2005-02-24 |
| WO2002079397A3 (en) | 2003-04-24 |
| DK1368050T3 (da) | 2008-12-01 |
| DE60228420D1 (de) | 2008-10-02 |
| AU2002255562A1 (en) | 2002-10-15 |
| EP1368050A2 (en) | 2003-12-10 |
| EP1368050A4 (en) | 2005-08-03 |
| PT1368050E (pt) | 2008-12-03 |
| EP1368050B1 (en) | 2008-08-20 |
| ES2312565T3 (es) | 2009-03-01 |
| WO2002079397A2 (en) | 2002-10-10 |
| CA2438787A1 (en) | 2002-10-10 |
| CA2438787C (en) | 2011-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6887847B2 (en) | Virus derived antimicrobial peptides | |
| US6835713B2 (en) | Virus derived antimicrobial peptides | |
| EP2176420B1 (en) | Virus derived antimicrobial peptides | |
| US5714577A (en) | Antimicrobial peptides | |
| Ong et al. | Effect of stereochemistry, chain length and sequence pattern on antimicrobial properties of short synthetic β-sheet forming peptide amphiphiles | |
| US12037372B2 (en) | Bioactive peptides derived from snakes | |
| US9273096B2 (en) | Amphiphilic peptides comprising the formula I: (X1Y1X2Y2)n, and uses thereof | |
| US20030036627A1 (en) | Virus derived antimicrobial peptides | |
| WO2014060610A2 (en) | Antimicrobial peptides | |
| KR20180037185A (ko) | 광범위의 항감염성 펩티드 | |
| JP4441180B2 (ja) | ウイルス由来抗微生物ペプチド | |
| Zucca et al. | New antimicrobial frontiers | |
| Son et al. | Effects of C-terminal residues of 12-mer peptides on antibacterial efficacy and mechanism | |
| JP6506317B2 (ja) | ペプチドおよびその使用 | |
| WO2016146037A1 (zh) | 用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用 | |
| US20150072922A1 (en) | Rnase 7 antimicrobial peptides | |
| CN107849103A (zh) | 新抗微生物肽、它们的变体和用途 | |
| CA2360381A1 (en) | Methods for treating cystic fibrosis | |
| CN116234818A (zh) | 用于治疗耐药微生物的防御素片段衍生脂肽 | |
| CN113226349A (zh) | 抗微生物肽及其使用方法 | |
| CN107949568A (zh) | 新抗微生物肽、它们的变体和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050203 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071218 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080311 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080318 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080618 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090602 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090825 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090901 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091002 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091215 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100108 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4441180 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |