JP4444564B2

JP4444564B2 - 三重螺旋相互作用によるターゲット二本鎖ｄｎａ配列の精製及び検出方法

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Publication number: JP4444564B2
Application number: JP2002575316A
Authority: JP
Inventors: ブランシユ，フランシス; カムロン，ベアトリス
Original assignee: サントリオン
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2002-03-25
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2022-03-25
Also published as: KR20090094870A; JP2004523245A; WO2002077274A2; PL365208A1; NZ528507A; AU2002253261C1; CN1498276A; KR101002499B1; HUP0303632A3; AU2002253261C9; KR20030088464A; IL158017A; IL158017A0; EP1370692A2; CA2440133A1; WO2002077274A3; NO20034184D0; NO20034184L; MXPA03008642A; BR0208292A

Description

本発明は三重螺旋型の構造を形成することが可能な新規ターゲットＤＮＡ配列と、ＤＮＡの新規精製方法に関する。より詳細には、本発明の精製方法はターゲットＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを利用する。本発明の方法は医薬品質の二本鎖ＤＮＡを高収率で精製することができるので特に有用であることが判明した。

本発明は前記特定ターゲット配列を含むＤＮＡ分子を検出、定量、単離又は選別するための新規方法にも関する。

本発明の精製方法は主に特定ターゲットＤＮＡ配列と天然又は修飾塩基から構成されるオリゴヌクレオチドの三重螺旋相互作用に基づく。

ホモピリミジンオリゴヌクレオチドはＤＮＡ二重螺旋の大きな溝で特異的に相互作用し、三重螺旋と呼ばれる三本鎖構造を局所的に形成できることが示されている（Ｍｏｓｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８（１９８７）６４５；Ｐｏｖｓｉｚら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．１１１（１９８９）３０５９）。これらのオリゴヌクレオチドはオリゴプリン−オリゴピリミジン配列即ち一方の鎖にオリゴプリン配列をもち、相補鎖にオリゴピリミジン配列をもつ領域でＤＮＡ二重螺旋を選択的に認識し、そこに局所的に三重螺旋を形成する。第３のホモピリミジンオリゴヌクレオチド鎖の塩基はワトソン−クリック塩基対のプリンと共に水素結合（フーグスティーン型結合）を形成する。

同様に、ホモプリンオリゴヌクレオチドとホモプリン−ホモピリミジン二本鎖ＤＮＡの間にも三重螺旋型の構造を形成することができる。この種の構造では、オリゴヌクレオチドのプリン塩基は二本鎖ＤＮＡのプリン塩基と逆フーグスティーン型結合を形成する。

これらの部位特異的三重螺旋相互作用は特にＬｏｏｎｅｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１（１９８８）４５６）やＨｅｌｅｎｅら（ＢＢＡ１０４９（１９９０）９９；ＷＯ９５／１８２２３）により利用されており、前者は所定遺伝子の発現を調節するために利用しており、後者はプロモーター又はコーディング領域に存在するターゲット配列とオリゴヌクレオチド間の三重螺旋構造の形成を記載しており、開始及び／又は伸長レベルで恐らくＲＮＡポリメラーゼの阻害作用によりこれらの遺伝子の発現プロフィルを調節できるとしている。

ＤＮＡ分子を他の成分と混合した複合混合物からプラスミドＤＮＡを精製するためにこの種の三重螺旋相互作用を利用することもプラスミドＤＮＡの精製に関して国際出願ＷＯ９６／１８７４４に記載されている。より詳細には、同出願はターゲットＤＮＡの特定配列とハイブリダイゼーションにより三重螺旋を形成することが可能なオリゴヌクレオチドを共有結合した担体に複合混合物を接触させることからなる二本鎖ＤＮＡの精製方法を記載している。

精製を目的としたこの三重螺旋型特異的相互作用では、特異性はオリゴヌクレオチドから構成される第３鎖のチミン（Ｔ）塩基と二本鎖ＤＮＡのＡＴ塩基対の間のフーグスティーン型水素結合により対合し、Ｔ^＊ＡＴトライアドを形成することに起因する。同様に、第３鎖に配置されたプロトン化シトシンは二本鎖ＤＮＡのＧＣ塩基対と対合し、^＋Ｃ^＊ＧＣトライアドを形成する（Ｓｕｎら，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎＳｔｒｕｃＢｉｏｌ．３（１９９３）３４５）。これらのＴ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣトライアド（カノニカルトライアドと言う）は三重螺旋の最大安定性を確保することが従来認められている。しかし、三重螺旋の安定化には例えばシトシンの百分率、ｐＨ、媒質の塩度及び三重螺旋の環境等の多数の他の因子も関わっている。所謂非カノニカル（即ちＴ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣトライアドとは異なる）トライアドを導入すると三重螺旋のレベルに相当の構造変形を生じ、必然的に相当不安定になることも広く記載されている。更に、各種非カノニカルトライアドの導入も比較試験の範囲で検討されており（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，９３９７；Ｆｏｓｓｅｌｌａら，（１９９３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２１，４５１１；Ｇｏｖｅｒｓら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ（１９９７）２５，３７８７）、導入した非カノニカルトライアドの種類に応じて三重螺旋の不安定化が変動することも分かっている。

この方法は医薬品質のターゲットＤＮＡを迅速且つ効率的に精製することができるが、精製しようとするＤＮＡの２鎖の一方に十分長い配列、好ましくは完全なホモプリン配列が存在している必要があり、更にこの配列は第３のＤＮＡ鎖に相補的でなければならない。この配列は精製が所望されるターゲット二本鎖ＤＮＡ配列に天然に存在するものでもよいし、人工的に挿入してもよい。

本発明者らは非カノニカルトライアドの形成をもたらすオリゴヌクレオチドの塩基と相補的ではない塩基が存在するにも拘わらず、主にプリン塩基から構成されないターゲットＤＮＡ配列を一方の鎖にもつＤＮＡ分子が第３のＤＮＡ鎖と安定な三重螺旋構造を形成できることを今般意外にも発見した。

より詳細に説明すると、本発明者らが新規に同定したターゲット二本鎖ＤＮＡ配列は所定数のピリミジン塩基を割り込ませたホモプリン配列を一方の鎖に含む。本発明者らはこれらの不完全なホモプリン−ホモピリミジンＤＮＡ配列を使用すると、これらの配列を含むＤＮＡ分子を三重螺旋相互作用により効率的に精製できることも発見した。

新規に同定された配列は更に、これらの配列を含むＤＮＡ分子を検出、定量、単離又は選別するのにも特に有用である。

従って、本発明は一般式：
５’−（Ｒ）_ｎ−（Ｎ）_ｔ−（Ｒ’）_ｍ−３’
（式中、ＲとＲ’はプリン塩基のみから構成されるヌクレオチド配列を表し、ｎとｍは８以下の整数であり、ｎ＋ｍの和は６以上であり、Ｎはプリン塩基とピリミジン塩基の両者を含むヌクレオチド配列であり、ｔは７以下の整数である）をもつ配列を一方の鎖に含む新規ターゲットＤＮＡ配列に関し、前記ＤＮＡ配列は第３のＤＮＡ鎖と相互作用して三重螺旋を形成することが可能である。

従って、ターゲットＤＮＡ配列の夫々５’及び３’部分に位置するホモプリン配列Ｒ及びＲ’は全長６以上である。これらの配列はＴ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣカノニカルトライアドから構成される三重螺旋構造を形成するために第３鎖と相互作用することが可能なアデニン及びグアニン塩基を含む。ホモプリン配列Ｒ及びＲ’は少なくとも合計２個のグアニンと少なくとも２個のアデニンを含むことが好ましい。これらのプリン配列は（ＡＡＧ）型のモチーフを含むことが更に好ましい。

中心配列Ｎの長さｔはプリン及びピリミジン塩基対７以下であり、本発明によると、非カノニカルトライアドを形成するために第３のＤＮＡ鎖と相互作用することが可能である。中心配列Ｎの長さは１以上７以下が好ましい。中心配列Ｎの長さは２以上７以下がより好ましい。

「カノニカルトライアド」なる用語は二本鎖ＤＮＡのＡＴ及びＧＣダブレットがＴ及び^＋Ｃ塩基と相互作用して夫々Ｔ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣトライアドとなる２個のヌクレオチドトライアドを意味する。これらの２個のトライアドは１６個の既存トライアドのうちで最大の安定性をもつ。

「非カノニカルトライアド」なる用語は他の１４個のヌクレオチドトライアドを意味する。これらのトライアドは二本鎖ＤＮＡと第３のＤＮＡ鎖の非特異的な相互作用により形成され、Ｔ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣカノニカルトライアドよりも安定性が低い。夫々ターゲット配列のＣＧ又はＧＣダブレットと第３鎖のチミン（Ｔ）の相互作用により形成されるＴ^＊ＣＧ及びＴ^＊ＧＣ非カノニカルトライアド、ターゲット配列のＣＧダブレットと第３鎖のグアニン（Ｇ）の相互作用により形成されるＧ^＊ＣＧ非カノニカルトライアド、夫々ターゲット配列のＡＴ及びＴＡダブレットと第３鎖に配置されたシトシン（Ｃ）の相互作用により形成されるＣ^＊ＡＴ及びＣ^＊ＴＡ非カノニカルトライアド、ＣＧダブレットと第３鎖のグアニン（Ｇ）の相互作用により形成されるＧ^＊ＣＧ非カノニカルトライアド、又はＴＡダブレットと第３鎖のチミン（Ｔ）の相互作用により形成されるＴ^＊ＴＡを特に挙げることができる。

当然のことながら、５’及び３’プリン末端と同様に、中心配列Ｎも夫々ＡＴ及びＧＣダブレットと第３のＤＮＡ鎖に配置されたチミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）塩基の相互作用によりＴ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣカノニカルトライアドを形成することができる。

中心配列Ｎは最大６個の非カノニカルトライアドを形成するプリン及びピリミジン塩基を含むことが好ましい。中心部分とオリゴヌクレオチドの相互作用により形成される非カノニカルトライアドはＴ^＊ＣＧ、Ｔ^＊ＧＣ、Ｃ^＊ＡＴ及びＣ^＊ＴＡ非カノニカルトライアドから選択されることが好ましい。これらのトライアドの好適分布例としては、１個のＣ^＊ＡＴと１個のＣ^＊ＴＡと２個のＴ^＊ＣＧと２個のＴ^＊ＧＣを含む６個の非カノニカルトライアドの形成、２個のＣ^＊ＡＴと３個のＴ^＊ＣＧを含む５個の非カノニカルトライアドの形成、又は２個のＴ^＊ＧＣと１個のＣ^＊ＡＴを含む３個の非カノニカルトライアドの形成が挙げられる。数個のＴ^＊ＴＡ非カノニカルトライアドが存在していてもよいが、この場合には三重螺旋に連続して配置されない。

中心配列はＴ^＊ＣＧ及びＣ^＊ＴＡ又はＧ^＊ＴＡ非カノニカルトライアドを形成する最大３個のＣ又はＴピリミジン塩基を含むことが好ましい。３個のピリミジン塩基は連続せず、第３のＤＮＡ鎖と相互作用してＴ^＊ＣＧ及びＣ^＊ＡＴ非カノニカルトライアドとＴ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣカノニカルトライアドを形成することができるＡ又はＧプリン塩基により分離されていることが好ましい。

本発明の１特定態様によると、ターゲット二本鎖ＤＮＡ配列は配列５’−ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１）である。

本発明の二本鎖ＤＮＡ配列と相互作用することが可能な第３のＤＮＡ鎖は例えばオリゴヌクレオチド又は局所非対合状態の別の二本鎖ＤＮＡの鎖とすることができ、以下の塩基を含むことができる。
−ターゲット二本鎖ＤＮＡ配列のＡＴダブレットとＴ^＊ＡＴカノニカルトライアドを形成すると共に、ターゲットＤＮＡ配列の夫々ＣＧ及びＧＣダブレットとＴ^＊ＣＧ及びＴ^＊ＧＣ非カノニカルトライアドを形成することが可能なチミン（Ｔ）（Ｓｏｙｆｅｒら，ｉｎＴｒｉｐｌｅＨｅｌｉｃａｌＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（１９９６）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．１５１−１９３）；
−二本鎖ＤＮＡのＴＡダブレットとＧ^＊ＴＡトライアドを形成することが可能なグアニン（Ｇ）（Ｓｏｙｆｅｒら，ｉｎＴｒｉｐｌｅＨｅｌｉｃａｌＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（１９９６）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．１５１−１９３）；
−ターゲット二本鎖ＤＮＡの夫々ＧＣ、ＡＴ及びＴＡダブレットと^＋Ｃ^＊ＧＣ（プロトン化
シトシン^＋Ｃ）又はＣ^＊ＡＴ及びＣ^＊ＴＡ非カノニカルトライアドを形成することが可能なシトシン（Ｃ）；並びに
−ターゲット配列のＡＵ又はＡＴ塩基対とトリプレットを形成することが可能なウラシル（Ｂａｔｅｓら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２３（１９９５）３６２７）。

使用する第３のＤＮＡ鎖はシトシンリッチなホモピリミジン配列を含むことが好ましく、シトシンは酸性ｐＨでプロトン化状態で存在しており、三重螺旋を安定化する。このようなオリゴヌクレオチドは例えば（ＣＣＴ）ｎ配列、（ＣＴ）ｎ配列又は（ＣＴＴ）ｎ配列を含むことができ、ここでｎは１〜２０の整数である。（ＣＴ）ｎもしくは（ＣＴＴ）ｎ型の配列、又は（ＣＣＴ）、（ＣＴ）もしくは（ＣＴＴ）モチーフを結合した配列を使用すると特に有利である。

第３のＤＮＡ鎖がオリゴヌクレオチドとして存在している場合には、天然でもよいし（即ち未修飾天然塩基から構成されていてもよいし）、化学的に修飾されていてもよい。特に、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対して耐性にするかもしくは保護するか又は特定配列に対するその親和性を高めるように所定箇所を化学修飾されていると有利である。

本発明によると、「オリゴヌクレオチド」なる用語はヌクレアーゼ耐性を高める目的で主鎖を修飾した任意ヌクレオシド鎖を意味する。可能な修飾としては、ＤＮＡと三重螺旋を形成することが可能なホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｘｏｄｏら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２２（１９９４）３３２２）と、ホルムアセタール又はホスホン酸メチル主鎖をもつオリゴヌクレオチド（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３（１９９１）７７６７）が挙げられる。同様にＤＮＡと三重螺旋を形成することができるヌクレオチドのαアノマーと合成したオリゴヌクレオチドを使用することも可能である（ＬｅＤｏａｎら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１５（１９８７）７７４９）。主鎖の別の修飾はホスホロアミダイト結合である。例えばＧｒｙａｚｎｏｖら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６（１９９４）３１４３）により記載されているホスホロアミダイトＮ３’−Ｐ５’ヌクレオチド間結合が挙げられ、ＤＮＡと特に安定な三重螺旋を形成するオリゴヌクレオチドが得られる。他の主鎖修飾としては、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボース、又はホスホジエステルの使用も挙げることができる（Ｓｕｎら，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎｉｎＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３（１９９３）３１４３）。更に、リン主鎖をＰＮＡ（ペプチド核酸）のようにポリアミド主鎖で置換しても三重螺旋を形成することができる（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４（１９９１），１４９７；Ｋｉｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５（１９９３）６４７７−６４８１）。

第３鎖のチミンを５−ブロモウラシルで置換してもよく、それによってＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドの親和性を増すことができる（Ｐｏｖｓｉｃら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１（１９８９）３０５９）。第３鎖は更に非天然塩基を含んでいてもよく、例えば７−デアザ−２’−デオキシキサントシン（Ｍｉｌｌｉｇａｎら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１（１９９３）３２７）、１−（２−デオキシ−α−Ｄ−リボフラノシル）−３−メチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（Ｋｏｈら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４（１９９２）１４７０）、８−オキソアデニン、２−アミノプリン、２’−Ｏ−メチルプソイドイソシチジン又は当業者に公知の他の任意修飾（Ｓｕｎら，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎｉｎＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３（１９９３）３４５）が挙げられる。

第３鎖の他の修飾の目的は、特に第３鎖と特定配列の相互作用及び／又は親和性を改善することである。特に、本発明の完全に有利な修飾はオリゴヌクレオチドの５位シトシンのメチル化である。こうしてメチル化したオリゴヌクレオチドは中性に近いｐＨ範囲（≧５；Ｘｏｄｏら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９（１９９１）５６２５）で特定配列と安定な三重螺旋を形成する優れた特性をもつ。従って、従来技術のオリゴヌクレオチドよりも高いｐＨ、即ちプラスミドＤＮＡの分解の危険が非常に少ないｐＨで操作することが可能になる。

長さは相互作用の所望選択性及び安定性に応じて当業者により個別的に調整することができる。

本発明の第の３ＤＮＡ鎖は任意公知方法により合成することができる。特に、核酸合成器により製造することができる。当業者に公知の他の任意方法も当然使用できる。

これらの第３のＤＮＡ鎖又はこれらのオリゴヌクレオチドは上述のように両側を２個のホモプリン領域Ｒ及びＲ’で挟まれた７ヌクレオチド長以下の混合（ピリミジン−プリン）内部領域Ｎを含む特定二本鎖ＤＮＡ配列と三重螺旋を形成することができる。このようなホモプリン領域は例えばＧＡＡ型モチーフを含むことができる。

例えば、以下の配列：

から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドと三重螺旋を形成することが可能な配列５’−ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１）に対応するターゲット二本鎖ＤＮＡ配列を挙げることができる。

三重螺旋の形成は場合によりこの構造の安定化を助長し得るＭｇ^２＋イオンの存在下に得ることができる（Ｖａｓｑｕｅｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４（１９９５）７２４３；Ｂｅａｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１（１９９１）１３６０）。

１好適態様によると、本発明のターゲットＤＮＡ配列は二本鎖ＤＮＡに天然に存在するものとすることができ、その場合には例えば治療又は実験用遺伝子やマーカー遺伝子等の目的遺伝子の配列中に存在するこのような配列と三重螺旋を形成することが可能なオリゴヌクレオチドを使用すると特に有利である。この点では、本発明者らは種々の目的遺伝子のヌクレオチド配列を分析し、（ＣＴＴ）ｎ型のオリゴヌクレオチドとの三重螺旋相互作用の安定性を試験した処、これらの遺伝子の所定領域はＴ^＊ＣＧ、Ｔ^＊ＧＣ、Ｃ^＊ＡＴ、Ｃ^＊ＴＡ及びＴ^＊ＴＡ等の非カノニカルトライアドの存在にも拘わらず安定な三重螺旋を形成することを示すことができた。

二本鎖ＤＮＡに天然に存在する配列としては、ヒトＦＧＦ１遺伝子（Ｊａｙｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３（１９８６）５４１）の配列に存在する配列５’−ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’（ＩＤ１と言う）（配列番号１）、凝血に関与するＩＸ因子をコードするヒト遺伝子（Ｋｕｒａｃｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９（１９８２）６４６１）の配列５’−ＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号６）、分泌アルカリホスファターゼＳｅＡＰ遺伝子（Ｍｉｌｌａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１（１９８６）３１１２）の配列５’−ＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号７）及び５’−ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号８）、ヒトα−フェトプロテインｈαＦＰ遺伝子（Ｇｉｂｂｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６（１９８７）１３３２）の配列５’−ＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号９）、再狭窄を抑制するヒトＧＡＸ遺伝子（Ｇｏｒｓｋｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３（１９９３）３７２２）の配列５’−ＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号１０）、並びにヒトＶＥＧＦＢ−１６７遺伝子（Ｏｌｏｆｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（１９８６）１９３１０）の配列５’−ＧＧＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号１３）を挙げることができる。治療又は実験用遺伝子に存在する配列と三重螺旋を形成すると、ターゲット配列は二本鎖ＤＮＡ分子に天然に存在しており、ターゲット二本鎖ＤＮＡ分子又はこの遺伝子をもつプラスミドに人工特定配列を組込むように修飾する必要がないので特に有利である。あるいは、ターゲット配列を二本鎖ＤＮＡに人工的に導入してもよい。

本発明の第２の側面は二本鎖ＤＮＡの精製方法にあり、この方法によると、他の成分との混合物としてＤＮＡを含む溶液を上記のような第３のＤＮＡ鎖と接触させるが、この場合、第３のＤＮＡ鎖は上記のような二本鎖ＤＮＡに存在する特定配列とハイブリダイゼーションにより三重螺旋を形成することが可能なオリゴヌクレオチドが好ましい。担体に固定したオリゴヌクレオチドに二本鎖ＤＮＡを溶液中で接触させることが好ましい。オリゴヌクレオチドを前記担体に安定に共有又は非共有結合させるとより好ましい。従って、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を接触させる段階は、精製が所望される二本鎖ＤＮＡを効率的且つ迅速に得るために、オリゴヌクレオチドを結合した担体上に他の成分と混合したＤＮＡの溶液を通すと有利である。

このような担体は当業者に周知であり、例えばビーズもしくは微粒子（例えばラテックス粒子）又は他の任意懸濁担体から構成する。天然又は合成起源のポリマー型分子にオリゴヌクレオチドをグラフトしてもよい。オリゴヌクレオチドを結合するポリマーは二本鎖ＤＮＡと三重螺旋を形成後に溶液から容易に分離できるような性質をもつことが好ましい。天然ポリマーとしてはタンパク質、脂質、糖及びポリオールを挙げることができる。合成ポリマーとしてはポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、スチレン誘導体及び感熱ポリマー（例えば低温では可溶性であるが、相転移温度を越えると不溶性になるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）型化合物）が挙げられる（Ｔ．Ｍｏｒｉら，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７２（２００１）２６１）。

本発明の精製方法はｉ）ホモピリミジンオリゴヌクレオチドと安定な三重螺旋を形成するに十分な長さのホモプリン配列を含まないＤＮＡ分子のみならず、ｉｉ）ホモプリン配列に数個のピリミジン塩基が割り込んだＤＮＡ分子も精製できるので特に有利である。より多くの種類のＤＮＡ分子を精製できることに加え、この方法は迅速であり、特に高い収率と純度が得られる。

更に、他の核酸、タンパク質、内毒素（例えばリポ多糖）、ヌクレアーゼ等を含む複合混合物からＤＮＡ分子を精製できると共に、医薬品質の精製ＤＮＡが得られる。

担体に共有結合させるためには、オリゴヌクレオチドを一般に機能化する。即ち、５’又は３’位をチオール、アミン又はカルボキシル末端基で修飾してもよい。特に、チオール、アミン又はカルボキシル基を加えると、例えばジスルフィド、マレイミド、アミン、カルボキシル、エステル、エポキシド、臭化シアン又はアルデヒド基をもつ担体にオリゴヌクレオチドを結合することが可能になる。これらの結合はオリゴヌクレオチドと担体のジスルフィド、チオエステル、エステル、アミド又はアミン結合の設定により形成される。例えば二官能カップリング剤等の当業者に公知の他の任意方法も使用することができる。

更に、結合したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを改善するためには、オリゴヌクレオチドが「アーム」と「スペーサー」塩基配列を含むようにすると有利である。実際にアームを使用すると担体から選択した距離にオリゴヌクレオチドを結合でき、ＤＮＡとの相互作用条件を改善できる。アームは１〜１８、好ましくは６〜１２個のＣＨ_２型基を含む線状炭素鎖と、カラムに結合させるアミンから構成すると有利である。アームはオリゴヌクレオチド又はハイブリダイゼーションに関与しない塩基から構成される「スペーサー」のリン酸に結合する。従って、「スペーサー」はプリン塩基を含むことができる。例えば、「スペーサー」はＧＡＧＧ配列を含むことができる。

精製担体に結合したオリゴヌクレオチドは例えば配列５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（ＧＡＧＧ（ＣＴＴ）_７；配列番号１１）をもつことができ、ＧＡＧＧ塩基は三重螺旋構造に関与していないが、オリゴヌクレオチドとカップリングアームの間にスペースを形成することができる。

本発明を実施するには種々の担体を使用することができる。機能化クロマトグラフィー担体でもよいし、バルク又はプレパックカラムでもよいし、機能化プラスチック表面又は磁性もしくは非磁性の機能化ラテックスビーズでもよい。ゲル透過用クロマトグラフィー担体が好ましい。例えば、利用可能なクロマトグラフィー担体はアガロース、アクリルアミド又はデキストランやその誘導体（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）等）、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）等のポリマー、又はグラフトもしくは非グラフトシリカである。クロマトグラフィーカラムはこの特定態様に適した密度のクロマトグラフィー担体を使用し、拡散式でも潅流式でもよく、所謂「流動層」系でも「発泡」系でもよい。

本発明の方法は任意種の二本鎖ＤＮＡを精製するために使用することができる。例えばミニサークル（Ｄａｒｑｕｅｔら，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６（１９９９）２０９）等の環状ＤＮＡ、線状フラグメント、又は一般に１種以上の治療又は実験用遺伝子をもつプラスミドである。このプラスミドは例えば条件型の複製起点（例えばＳｏｕｂｒｉｅｒら，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６（１９９９）１４８２に記載されているｐＣＯＲプラスミド）、マーカー遺伝子等も含むことができる。本発明の方法は細胞溶解液に直接適用することができる。この態様では、形質転換後に細胞培養して増幅したプラスミドを細胞溶解後に直接精製する。本発明の方法は透明溶解液（即ち細胞溶解液の中和と遠心分離後に得られる上清）に適用することもできる。当然のことながら、公知方法を使用して予備精製した溶液に適用することもできる。本方法は種々の配列のＤＮＡを含む混合物から目的配列をもつ線状又は環状ＤＮＡを精製することもできる。本発明の方法は二本鎖ＲＮＡの精製に使用することもできる。

細胞溶解液は原核細胞の溶解液でも真核細胞の溶解液でもよい。原核細胞としては例えば大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌又はストレプトミセス属細菌が挙げられる。真核細胞としては、動物細胞、酵母、真菌等が挙げられ、具体的にはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、又はＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＲＣ５、２９３等の細胞が挙げられる。

本発明の方法は非常に高純度のプラスミドＤＮＡを迅速且つ簡単に得られるので特に有利である。特に、実施例に例証するように、本方法は断片化染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、内毒素、タンパク質又はヌクレアーゼ等の汚染成分からプラスミドＤＮＡを効率的に分離することができる。

本発明の方法はＤＮＡ分子、特に商業的規模で生産及び精製され、医薬用に適合可能な純度を必要とするＦＧＦ１遺伝子等の治療用遺伝子を精製及び純化するのにも有用である。

第３の側面によると、本発明は少なくとも１種の上記ターゲット配列を含む二本鎖ＤＮＡ分子の検出、定量及び選別方法として、ａ）前記分子を含む疑いのある溶液を第３のＤＮＡ鎖、例えば標識オリゴヌクレオチドと接触させて安定な三重螺旋を形成し、ｂ）二本鎖ＤＮＡと第３のＤＮＡ鎖の間に場合により形成される複合体を検出することからなる方法に関する。

本方法は例えばゲノム内の特定ＤＮＡ配列の検出又は特定配列の選別を可能にすることによりゲノム分析の範囲で特に有用である。

本発明のこの側面によると、第３のＤＮＡ鎖又はオリゴヌクレオチドは分光学、光化学、生化学、免疫化学又は化学的手段により検出可能なマーカーで標識することができる。

例えば、このようなマーカーは放射性同位体（^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓ）又は蛍光分子（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）から構成することができる。

マーカーはプライマー伸長又は５’もしくは３’末端添加によりマーカー分子をポリヌクレオチドに加えることにより実施することが好ましい。

非放射性マーカーの例は特に仏国特許第ＦＲ７８１０９７５号又はＵｒｄｅａら（１９８８，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１１：４９３７−４９５７）やＳａｎｃｈｅｚ−ｐｅｓｃａｄｏｒら（１９８８；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６（１０）：１９３４−１９３８）の論文に記載されている。

本発明のこの特定側面によると、第３のＤＮＡ鎖又はオリゴヌクレオチドも上述のように担体に固定してもよい。

本発明の第４の側面は複合混合物における本発明の二本鎖ＤＮＡの存在を精製及び／又は検出するためのパック又はキットとして、１種以上の上記オリゴヌクレオチドを含むものに関する。オリゴヌクレオチドは担体に固定してもよいし、及び／又は検出可能なマーカーを加えてもよい。

本発明のこの側面によると、上記検出キットは目的ターゲット二本鎖ＤＮＡ配列を検出するために使用可能な複数の本発明のオリゴヌクレオチドを含む。

即ち、担体に固定したオリゴヌクレオチドは「ＤＮＡチップ」等のマトリックスに整列させることができる。このような整列マトリックスは特に米国特許第５，１４３，８５４号とＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１５０７０号及び９２／１００９２号に記載されている。

オリゴヌクレオチドを高密度に固定した担体マトリックスは例えば米国特許第５，４１２，０８７号とＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１１９９５号に記載されている。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、以下の実施例は例示に過ぎず、発明を限定するものではない。

一般クローニング及び分子生物学技術
制限酵素消化、ゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントライゲーション、大腸菌での形質転換、核酸の沈降、シーケンシング等の慣用分子生物学技術は文献に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら，（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。制限酵素はＮｅｗ−ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ（Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手した。

オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社の自動ＤＮＡ合成器３９４を製造業者の指示に従って使用することにより、α位をシアノエチル基で保護したホスホロアミダイトの化学を使用して合成する（Ｓｉｎｈａら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１２（１９８４）４５３９；Ｇｉｌｅｓ（１９８５））。

アフィニティーゲルを合成するために使用したオリゴヌクレオチドはＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）又はＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，ベルギー）製品を改変せずに使用する。

ｐＣＯＲプラスミドを複製することが可能な菌株とこれらのプラスミドの増殖及び選択条件は文献に記載されている（Ｓｏｕｂｒｉｅｒら，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６（１９９９）１４８２）。

プラスミドの構築
１．１プラスミドｐＸＬ３１７９（ｐＣＯＲ−ＦＧＦ１）
図１に示すプラスミドｐＸＬ３１７９はプラスミドｐＸＬ２７７４（ＷＯ９７／１０３４３；Ｓｏｕｂｒｉｅｒら，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６（１９９９）１４８２）に由来するベクターであり、ヒトサイトメガロウイルスの初期領域（ｈＣＭＶＩＥＥ／Ｐ）とＳＶ４０ウイルスの後期領域のポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０後期ポリＡ；ＧｅｎｂａｎｋＳＣ４ＣＧ）に由来するプロモーターの制御下にヒト繊維芽細胞インターフェロンシグナルペプチドとＦＧＦ１（繊維芽細胞増殖因子１）ｃＤＮＡの融合体（ｓｐ−ＦＧＦ１，Ｊｏｕａｎｎｅａｕら，ＰＮＡＳ８８（１９９１）２８９３）をコードする遺伝子を導入した。

１．２プラスミドｐＸＬ３２９６（ｐＣＯＲ）
プラスミドｐＸＬ３２９６はプラスミドｐＸＬ３１７９に由来し、ｓｐ−ＦＧＦ１遺伝子の配列をプラスミドｐＵＣ２８（Ｂｅｎｅｓら，Ｇｅｎｅ１３０（１９９３）１５１）の多重クローニングブイで置換した。プラスミドｐＸＬ３２９６を図２に示す。

１．３プラスミドｐＸＬ３４２６（ｐＣＯＲ−ＩＤ１）
プラスミドｐＸＬ３４２６はプラスミドｐＸＬ３２９６に由来し、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ部位間に配列５’−ＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣ−３’を挿入した。プラスミドｐＸＬ３４２６を図３に示す。

ターゲット配列をもつ他のプラスミドの構築
プラスミドｐＸＬ３６７５はプラスミドｐＸＬ３２９６に由来し、ＨｐａＩ及びＸｂａＩ部位間に配列５’−ＧＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧ−３’を挿入し、プラスミドｐＸＬ３６７６もプラスミドｐＸＬ３２９６に由来し、ＨｐａＩ及びＸｂａＩ部位間に配列５’−ＧＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧ−３’を挿入し、更にプラスミドｐＸＬ３７１３はｐＸＬ３２９６のＨｐａＩ及びＸｂａＩ部位間にＤＮＡ配列５’−ＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧ−３’を挿入した。こうして構築したプラスミドをＣｓＣｌ塩化物グラジエントにより精製し、シーケンシングによりインサートの配列を確認した。以下の実施例ではこれらの調製物を使用した。

安定な三重螺旋を形成するＦＧＦ１遺伝子の２０量体内部配列の同定
以下の実施例に記載するような種々のプラスミドを標準化条件下に三重螺旋相互作用アフィニティークロマトグラフィーにかけた。アフィニティー担体はクロマトグラフィー担体Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−１０００ＳＦ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して以下のように合成した。第１段階では、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に分散したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−１０００ゲルをメタ過ヨウ素酸ナトリウム（３ｍＭ，２０℃、１時間）で活性化した後、第２段階でタンパク質の結合について記載されている手順（Ｈｏｒｎｓｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ９３（１９８６）８３）と同様の手順に従ってアスコルビン酸（５ｍＭ）の存在下に還元アミノ化によりその５’−ＮＨ_２末端部分を介して活性化マトリックスのアルデヒド基に結合させた。すなわち本発明に報告する全実験では、オリゴヌクレオチドをこの一般手順に従って結合させた。全オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの５’末端にＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−機能化アームをもつ。

オリゴヌクレオチドと二本鎖ＤＮＡの三重螺旋構造の形成を立証し、その安定性を測定する全実験は以下の条件下に実施した。各実験で２ｍＭＮａＣｌを加えた５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）６ｍｌに精製プラスミド３００μｇを溶かし、本発明のオリゴヌクレオチドで機能化したアフィニティーゲル１ｍｌを充填したＨＲ５／５カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に流速３０ｃｍ／ｈで注入した。カラムを同一緩衝液５ｍｌで洗浄後、０．５ｍＭＥＤＴＡを加えた１００ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌカラム緩衝液（ｐＨ９．０）３ｍｌでプラスミドを溶離し、ｐＨ９．０緩衝液で溶出したプラスミドの量をｉ）溶液の２６０ｎｍ吸光度の測定とｉｉ）ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＧｅｎＰａｋ−Ｆａｘカラム上のアニオン交換クロマトグラフィーにより定量した（Ｍａｒｑｕｅｔら，ＢｉｏＰｈａｒｍ，８（１９９５）２６）。

オリゴヌクレオチド５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−ＴＴ（ＣＴＴ）_６−３’（配列番号２）で機能化したカラムを使用すると、下表１に示す精製結果から明らかなように、ヒトＦＧＦ１遺伝子の配列を含まず、該当カラムに固定していない対照プラスミド（ｐＸＬ３２９６）とは対照的に、完全ＦＧＦ１遺伝子（ｐＸＬ３１７９）又はヒトＦＧＦ１遺伝子の内部ＩＤ１配列（ｐＸＬ３４２６）を含むプラスミドでは安定な三重螺旋が形成される。

プラスミドｐＸＬ３４２６の配列は寸法を減らしながらＦＧＦ１遺伝子の種々のフラグメントをサブクローニングすることにより同定した。従って、ＦＧＦ１遺伝子の内部配列ＩＤ１である５’−ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１）は使用した配列番号２の配列のオリゴヌクレオチドと安定な三重螺旋構造を形成する。得られる三重螺旋構造は７個のトライアド（そのうち６個は非カノニカルであり、より具体的にはＴ^＊ＧＣトライアド２個とＴ^＊ＣＧトライアド２個とＣ^＊ＡＴトライアド１個とＣ^＊ＴＡトライアド１個を含む）の内部領域（Ｔ）により隔てられた６単位（Ｒ，５’側）と７単位（Ｒ’，３’側）の長さのＴ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣカノニカルトライアドを形成するピリミジン−プリン−ピリミジン（Ｐｙ^＊ＰｕＰｙ）型の２つの領域を含む。

ＦＧＦ１遺伝子の２０量体内部配列ＩＤ１で三重螺旋構造の安定性に必要な塩基の同定
内部配列ＩＤ１に基づいて４種のオリゴヌクレオチドを調製した。そのうちの２種はＩＤ１の５’側からヌクレオチド７又は１３個を欠失し、他の２種は３’側からヌクレオチド７又は１４個を欠失する。オリゴヌクレオチド５’−ＴＴ（ＣＴＴ）_６−３’（配列番号２）又はオリゴヌクレオチドＦＲＢ３６、ＦＲＢ３８、ＦＲＢ３９もしくはＦＲＢ４０を使用して機能化した三重螺旋相互作用カラムでプラスミドｐＸＬ３４２６をクロマトグラフィーにかけた。その後、カラムに保持された各プラスミドの量を測定することにより種々の切断内部配列ＩＤ１と共に形成された三重螺旋構造の安定性を試験した。

上記表２に示す結果から明らかなように、５’−ＴＴ（ＣＴＴ）_６−３’型のオリゴヌクレオチドと安定な三重螺旋構造を形成するためにはｐＸＬ３４２６（２０量体）のＩＤ１配列全体が必要である。特に、５’及び３’末端の２個のＰｙ^＊ＰｕＰｙ部分と中心部分は最終構造の安定性に非常に大きく且つ協調的に寄与する。

三重螺旋の安定性に及ぼすカノニカルトライアドと非カノニカルトライアド数の影響
オリゴヌクレオチド５’−ＴＴ（ＣＴＴ）_６−３’（配列番号２）の配列を改変し、これらの各種オリゴヌクレオチド（ＦＲＢ１５、ＦＲＢ１６及びＦＲＢ１７）がプラスミドｐＸＬ３４２６の内部配列ＩＤ１（５’−ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’；配列番号１）と安定な三重螺旋を形成する能力を試験した。

上記表３に示す結果から明らかなように、三重螺旋構造の中央内部領域ＮにおけるＴ^＊ＡＴ及び^＋Ｃ^＊ＧＣカノニカルトライアドの数を増すと同時に非カノニカルトライアド数を減らすようにオリゴヌクレオチドの配列を改変することにより三重螺旋構造の安定性を増すことができる。

三重螺旋構造の安定性に及ぼす非カノニカルトライアドの影響
オリゴヌクレオチド５’−ＴＴ（ＣＴＴ）_６−３’（配列番号２）と安定な三重螺旋を形成することが可能なＦＧＦ１遺伝子の内部配列ＩＤ１（配列番号１）を含むプラスミドｐＸＬ３４２６の配列を改変し、２個の連続する同一のＴ^＊ＧＣ型非カノニカルトライアドと５’側の１個のＣ^＊ＡＴ非カノニカルトライアドを中心領域Ｎに導入した。別の実験ではＣ^＊ＡＴ、Ｔ^＊ＧＣ、Ｔ^＊ＧＣ、Ｃ^＊ＡＴ及びＴ^＊ＧＣの５個の連続する非カノニカルトライアドを導入した（ｐＸＬ３６７６）。最後に、２個の連続するＴ^＊ＴＡ型非カノニカルトライアドと５’側の１個のＣ^＊ＴＡ非カノニカルトライアドを導入するようにプラスミドｐＸＬ３４２６を改変した（ｐＸ３７１３）。

上記表４に示す各種プラスミドの精製結果から明らかなように、非カノニカル中心領域がＴ^＊ＣＧ、Ｔ^＊ＧＣ、Ｃ^＊ＡＴ及びＣ^＊ＴＡ型のトライアドを形成するときに安定な三重螺旋構造が形成される。アフィニティーゲルに対するプラスミドｐＸＬ３６７５及びｐＸＬ３６７６の結合収率から明らかなように、非カノニカルＴ^＊ＧＣトライアドを連続して２個導入する場合にも安定な三重螺旋が形成され、その場合には前後は問わず、即ち前後のトライアドはカノニカル型でも非カノニカル型でもよい。他方、２個の連続するＴ^＊ＴＡ型トライアドと１個のＣ^＊ＴＡトライアドを連続して導入すると、三重螺旋構造は完全に不安定化する。

ＳｅＡＰ、ｈαＦＰ、ＦＩＸ及びＧＡＸ遺伝子をコードするカセットを含むプラスミドの構築
本発明の組成物の活性を立証するためにこれらの実験で使用した遺伝子は例えばＦＩＸ因子をコードするヒト遺伝子（Ｋｕｒａｃｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９（１９８２）６４６１）、分泌アルカリホスファターゼＳｅＡＰをコードするヒト遺伝子（Ｍｉｌｌａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１（１９８６）３１１２）、α−フェトプロテインをコードするヒト遺伝子ｈαＦＰ（Ｇｉｂｂｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６（１９８７）１３３２）、及びＧＡＸをコードするヒト遺伝子（Ｇｏｒｓｋｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３（１９９３）３７２２）である。プラスミド又はｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してこれらの遺伝子をＰＣＲ増幅した後、ｐＸＬ３２９６に由来するｐＣＯＲプラスミドの真核ＣＭＶＥ／Ｐプロモーターの下流でＳＶ４０後期ポリＡシグナル配列の上流にクローニングした。分泌アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）をコードする遺伝子はｐＸＬ３２９６に由来するｐＣＯＲプラスミドに導入してプラスミドｐＸＬ３４０２（図４）を作製した。α−フェトプロテイン（ｈαＦＰ）をコードする遺伝子はｐＸＬ３２９６に由来するｐＣＯＲプラスミドに導入してプラスミドｐＸＬ３６７８（図５）を作製した。ＧＡＸをコードする遺伝子はｐＸＬ３２９６に由来するｐＣＯＲプラスミドに導入してプラスミドｐＸＬ３２０７（図６）を作製した。ＦＩＸ因子をコードする遺伝子はｐＸＬ３２９６に由来するｐＣＯＲプラスミドに導入してプラスミドｐＸＬ３３８８（図７）を作製した。

各種目的遺伝子と安定な三重螺旋構造を形成するための５’−（ＣＴＴ）_７−３’型オリゴヌクレオチドの使用
各種遺伝子をもつプラスミドで得られる容量を測定することにより、オリゴヌクレオチド５’−ＴＴ（ＣＴＴ）_６−３’（配列番号２）で機能化した三重螺旋相互作用ゲルと各種配列の相互作用を検討した。試験した遺伝子はｉ）ＩＸ因子をコードするヒト遺伝子、ｉｉ）分泌アルカリホスファターゼＳｅＡＰの遺伝子、ｉｉｉ）α−フェトプロテイン（αＦＰ）のヒト遺伝子及びｉｖ）ヒトＧＡＸ遺伝子であった。

上記表５に示す結果から明らかなように、（ＣＴＴ）_ｎ型のオリゴヌクレオチドを使用すると、目的遺伝子がオリゴヌクレオチドに相補的な５’−（ＧＡＡ）_ｎ−３’型のターゲット配列を含まない場合でも目的配列と安定な三重螺旋構造を形成することが可能である。Ｔ^＊ＣＧ、Ｃ^＊ＣＧ、Ｔ^＊ＧＣ及びＣ^＊ＡＴ型のトライアドに含まれる塩基がターゲット配列の中心部に存在していても三重螺旋構造に影響なく、孤立Ｔ^＊ＴＡトライアド（ＧＡＸ遺伝子）が存在していても同様である。

内部配列ＩＤ１（５’−ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’；配列番号１）を含むプラスミドを精製するための５’−（ＣＴＴ）_７−３’型オリゴヌクレオチドで機能化したカラムの使用
５’−（ＣＴＴ）_７−３’型のオリゴヌクレオチドで機能化した三重螺旋相互作用アフィニティークロマトグラフィー担体を使用し、実施例８に基づいて上記５’−（Ｒ）_ｎ−（Ｎ）_ｔ−（Ｒ’）_ｍ−３’型の配列をもつプラスミドの精製可能性について試験した。

（配列５’−ＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’をもつヒトＦＧＦ１遺伝子を含む）プラスミドｐＸＬ３１７９をオリゴヌクレオチド５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−（ＣＴＴ）_７−３’で機能化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００相互作用カラムでクロマトグラフィーにかけた。このために、実施例３に記載したようにＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１００ＳＦに共有結合したオリゴヌクレオチド５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−（ＣＴＴ）_７−３’を含むアフィニティーカラム１０ｍｌに５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ４．５）６０ｍｌ中９．４０ｍｇのプラスミドｐＸＬ３１７９を流速３０ｃｍ／ｈで注入した。カラムを同一緩衝液５容量で洗浄後、結合したプラスミドを１００ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，０．５ｍＭＥＤＴＡ緩衝液２カラム容量で溶離し、ＵＶ吸光度（２６０ｎｍ）の測定とＧｅｎＰａｋ−Ｆａｘカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上でイオン交換クロマトグラフィーにより定量した。初期調製物と精製フラクション中の大腸菌ゲノムＤＮＡ含量をＷＯ９６／１８７４４に記載されているようにＰＣＲにより測定した。溶出フラクション（溶出収率８４％）中に７．９４ｍｇのプラスミドｐＸＬ３１７９が検出され、大腸菌ゲノムＤＮＡによる汚染率は記載したアフィニティークロマトグラフィーでは７．８％から０．２％に低下した。同様に、ＲＮＡによる汚染率も出発プラスミド中の４３％から精製後のプラスミド中では０．２％に低下した。

各種プラスミドｐＸＬ３１７９調製物をオリゴヌクレオチド５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−（ＣＴＴ）_７−３’で機能化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００アフィニティーカラムでクロマトグラフィーにかけた他の各種実験では、ゲノムＤＮＡ含量は０．２％から０．００７％、０．７％から０．０１％、７．１％から０．２％、又は７．８％から０．１％に低下した。

治療用遺伝子ヒトＶＥＧＦＢ−１６７と安定な三重螺旋構造を形成するための５’−ＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴ−３’型（配列番号１２）のオリゴヌクレオチドの使用
ヒトＶＥＧＦＢ−１６７遺伝子（図８）（Ｏｌｏｆｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（１９８６）１９３１０）をもつプラスミドｐＸＬ３５７９で得られる容量を測定することにより、治療用遺伝子（ヒトＶＥＧＦＢ−１６７）の内部配列とオリゴヌクレオチド５’−ＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴ−３’型（配列番号１２）で機能化した三重螺旋相互作用担体の相互作用を試験した。図８に示すプラスミドｐＸＬ３５７９はヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅したＶＥＧＦＢ−１６７遺伝子を含み、ｐＸＬ３２９６の多重クローニング部位のＮｓｉＩ及びＸｂａＩ部位の間に真核プロモーターＣＭＶＥ／Ｐ（−５２２／＋７４）の下流でＳＶ４０後期ポリＡシグナル配列の上流にクローニングした。

上記表６に示す結果から明らかなように、５’−（Ｒ）_ｎ−（Ｎ）_ｔ−（Ｒ’）_ｍ−３’型の配列（例えばこの場合はヒトＶＥＧＦＢ−１６７遺伝子の領域５’−ＧＧＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＡ−３’ （配列番号１３））を標的としてオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド５’−ＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２））を使用すると、目的遺伝子の領域と安定な三重螺旋構造を形成することができる。更に、ヒトＶＥＧＦＢ−１６７遺伝子はオリゴヌクレオチド５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（表６）によりターゲットされるホモプリン配列５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ−３’を含むが、オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴ−３’との間に得られる相互作用はホモピリミジンオリゴヌクレオチドての間に得られる相互作用よりも非常に優れている。同様に、ホモプリン内部配列５’−ＧＧＡＧＧＡＡ−３’はオリゴヌクレオチド５’−ＣＣＴＣＣＴＴ−３’と安定な三重螺旋を形成できるほど十分に長くない。

従って、本実施例は被験二本鎖ＤＮＡが更に少なくとも１個の相当な長さのホモプリン構造を示す場合でも５’−（Ｒ）_ｎ−（Ｎ）_ｔ−（Ｒ’）_ｍ−３’型の配列が安定な三重螺旋構造を形成できることを明らかに示すものである。

改変ＶＥＧＦＢ−１８６のｃＤＮＡでターゲット配列と安定な三重螺旋構造を形成することにより非欠失ＶＥＧＦＢ−１８６のｃＤＮＡを分離するための５’ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣ−３’（配列番号１４）型オリゴヌクレオチドの使用
ヒトＶＥＧＦＢ−１８６遺伝子の発酵生産段階中にこの遺伝子は特にエキソン６Ａのレベルにおいて転位及び遺伝子欠失の場であることが認められた。そこで、逐次突然変異誘発ＰＣＲにより翻訳開始点＋１に対して５１０（Ａ／Ｃ）、５１３（Ｃ／Ｔ）、５１６（Ａ／Ｔ）、５１９（Ｃ／Ｔ）及び５２２（Ｃ／Ｔ）のレベルにサイレント点突然変異を導入した。アミノ酸１７０〜１７４に含まれるタンパク質ＶＥＧＦＢ−１８６のアミノ酸配列は変わらない。他方、こうして改変したＶＥＧＦＢ−１８６遺伝子（ＶＥＧＦＢ−１８６ｍ）は配列５’ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣ−３’（配列番号１４）のオリゴヌクレオチドと安定な三重螺旋構造を形成することができる本発明のターゲットｃＤＮＡ配列５’−ＡＧＧＡＧＣＧＧＧＡＧ−３（配列番号１５）をもつ。この安定な三重螺旋相互作用は本発明の方法を実施し、発酵生産後に転位及び欠失していない改変ＶＥＧＦＢ−１８６遺伝子を分離するために有利に使用される。

改変ＶＥＧＦＢ−１８６遺伝子の三重螺旋相互作用による精製方法を例証するために、図９に示すような２種のプラスミドｐＸＬ３６０１及びｐＸＬ３９７７を使用した。遺伝子ＶＥＧＦＢ−１８６をまずヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅した後、ｐＸＬ３２９６（実施例１．２）の多重クローニング部位のＮｓｉＩ及びＸｂａＩ部位間で真核プロモーターＣＭＶＥ／Ｐ（−５２２／＋７４）の下流でＳＶ４０ウイルスの後期領域のポリアデニル化シグナルの上流にクローニングし、プラスミドｐＸＬ３６０１を作製した。このプラスミドを逐次突然変異誘発ＰＣＲにより改変し、上述のようにＶＥＧＦＢ−１８６遺伝子をエキソン６Ａのレベルで改変したプラスミドｐＸＬ３９７７を作製した。

改変ヒトＶＥＧＦＢ−１８６遺伝子（図９）をもつプラスミドｐＸＬ３９７７で得られる容量を測定することにより、オリゴヌクレオチド５’ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣ−３’（配列番号１４）で機能化した三重螺旋相互作用担体を使用してＶＥＧＦＢ−１８６ｍ遺伝子におけるターゲット配列５’−ＡＧＧＡＧＣＧＧＧＡＧ−３（配列番号１５）の相互作用を試験した。ＶＥＧＦＢ−１８６ｍの配列にはＶＥＧＦＢ−１６７の配列が含まれているので、実施例１０に記載したようなヒトＶＥＧＦＢ−１６７遺伝子を含むプラスミドｐＸＬ３５７９を陰性対照として使用する。

上記表７に示す結果から明らかなように、５’−（Ｒ）_ｎ−（Ｎ）_ｔ−（Ｒ’）_ｍ−３’型の配列（この場合はヒト改変ＶＥＧＦＢ−１８６遺伝子の領域５’−ＡＧＧＡＧＣＧＧＧＡＧ−３（配列番号１５））を標的としてオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド（配列番号１４））を使用すると、目的遺伝子の領域と安定な三重螺旋構造を形成することができ、従って有効に精製することができる。改変ヒトＶＥＧＦＢ−１８６遺伝子の精製にはオリゴヌクレオチド５’−ＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣ−３’（配列番号１６）も利用することができる。

プラスミドｐＸＬ３１７９の模式図。プラスミドｐＸＬ３２９６の模式図。プラスミドｐＸＬ３４２６の模式図。プラスミドｐＸＬ３４０２の模式図。プラスミドｐＸＬ３６７８の模式図。プラスミドｐＸＬ３２０７の模式図。プラスミドｐＸＬ３３８８の模式図。プラスミドｐＸＬ３５７９の模式図。プラスミドｐＸＬ３６０１及びｐＸＬ３９７７の模式図。

配列表

Claims

二本鎖ＤＮＡ分子の精製方法であって、
当該二本鎖ＤＮＡ分子を第３のＤＮＡ鎖と接触させることを特徴とし、
当該二本鎖ＤＮＡ分子は環状ＤＮＡであり、かつ、
一般式：
５’−（Ｒ）_ｎ−（Ｎ）_ｔ−（Ｒ’）_ｍ−３’
（式中、ＲとＲ’はプリン塩基のみから構成されるヌクレオチド配列を表し、ｎとｍは８以下の整数であり、ｎ＋ｍの和は６以上であり、Ｎはプリン塩基とピリミジン塩基を併有するヌクレオチド配列であり、ｔは７以下の整数である）の少なくとも１個のターゲット配列を含むものであり、当該ＤＮＡ配列は第３のＤＮＡ鎖と相互作用して三重螺旋を形成することが可能である前記方法。
Ｎ領域と第３のＤＮＡ鎖の相互作用により最大６個の非カノニカルトライアドが形成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
こうして形成される非カノニカルトライアドがＴ^＊ＣＧ、Ｔ^＊ＧＣ、Ｃ^＊ＡＴ及びＣ^＊ＴＡトライアドから選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
Ｒ及びＲ’領域が少なくとも合計２個のグアニン（Ｇ）を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ及びＲ’領域が少なくとも２個のアデニンを含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ及びＲ’領域が第３のＤＮＡ鎖と共にＴ^＊ＡＴ及び＋Ｃ^＊ＧＣから選択されるカノニカルトライアドを形成することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
第３のＤＮＡ鎖がホモピリミジン型であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
第３のＤＮＡ鎖がポリＣＴＴ配列を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
第３のＤＮＡ鎖がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記二本鎖ＤＮＡ分子上に存在するターゲット配列が配列番号１の配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが配列番号２〜５の配列のオリゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
ターゲット配列が二本鎖ＤＮＡ分子上に天然に存在するか又は二本鎖ＤＮＡ分子に人工的に導入したターゲット配列であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
ＤＮＡ分子上に天然に存在するターゲット配列が治療又は実験用遺伝子のコーディング配列に存在することを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
ターゲットＤＮＡ配列がヒトＦＧＦ１遺伝子に含まれる配列番号１の配列の全部又は一部を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
ターゲットＤＮＡ配列がＩＸ因子をコードするヒト遺伝子に含まれる配列番号６の配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
ターゲットＤＮＡ配列が分泌アルカリホスファターゼのヒト遺伝子に含まれる配列番号７又は８の配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
ターゲットＤＮＡ配列がα−フェトプロテイン（αＦＰ）のヒト遺伝子に含まれる配列番号９の配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
ターゲットＤＮＡ配列がヒトＧＡＸ遺伝子に含まれる配列番号１０の配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
ターゲットＤＮＡ配列がヒトＶＥＧＦＢ１６７遺伝子に含まれる配列番号１３の配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが担体に安定に共有又は非共有結合していることを特徴とする請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが天然又は合成ポリマーにグラフトしていることを特徴とする請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
担体が機能化したラテックスビーズ、プラスチック表面及びクロマトグラフィー担体から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
クロマトグラフィー担体がゲル透過用担体であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
前記二本鎖ＤＮＡ分子を含む溶液が細胞溶解液であることを特徴とする請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
細胞溶解液が透明溶解液であることを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
二本鎖ＤＮＡ分子が予備精製されていることを特徴とする請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが配列ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号１１）をもつことを特徴とする請求項１９から２５のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドがジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド又はアミン結合を介して担体に結合していることを特徴とする請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが炭素鎖（ＣＨ_２）_ｎ（式中、ｎは１〜１８の整数である）から構成されるアームを介して担体に結合しており、前記アームがリン酸を介してオリゴヌクレオチドに結合し、アミン結合を介して担体に結合していることを特徴とする請求項１９から２７のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼに対して耐性になるかもしくはヌクレアーゼから保護されるか又は特定配列に対するその親和性が高められるように少なくとも１箇所を化学修飾されていることを特徴とする請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドがシトシンの少なくとも１個を５’位メチル化した配列を含むことを特徴とする請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
他の成分との混合物として前記二本鎖ＤＮＡを含む溶液を前記オリゴヌクレオチドを共有結合した担体に接触させる少なくとも１段階を含むことを特徴とする請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
他の成分との混合物として前記二本鎖ＤＮＡを含む溶液を前記オリゴヌクレオチドを共有結合したクロマトグラフィー担体上に通すことを特徴とする請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
前記第３のＤＮＡ鎖又は前記オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
二本鎖ＤＮＡの検出方法であって、
当該二本鎖ＤＮＡ分子を含む疑いのある溶液を、二本鎖ＤＮＡのターゲット配列とハイブリダイゼーションにより三重螺旋を形成することが可能な標識された第３のＤＮＡ鎖と接触させることを特徴とし、
当該ターゲット配列が
一般式：
５’−（Ｒ）_ｎ−（Ｎ）_ｔ−（Ｒ’）_ｍ−３’
（式中、ＲとＲ’はプリン塩基のみから構成されるヌクレオチド配列を表し、ｎとｍは８以下の整数であり、ｎ＋ｍの和は６以上であり、Ｎはプリン塩基とピリミジン塩基を併有するヌクレオチド配列であり、ｔは７以下の整数である）を有し、前記二本鎖ＤＮＡが環状ＤＮＡである前記方法。