JP4558005B2

JP4558005B2 - 新規オリゴ糖及びその製造方法

Info

Publication number: JP4558005B2
Application number: JP2007140344A
Authority: JP
Inventors: 秀紀岡田; 昭山森; 直樹川添; 徳夫塩見; 秀一小野寺
Original assignee: 大高酵素株式会社
Priority date: 2007-05-28
Filing date: 2007-05-28
Publication date: 2010-10-06
Anticipated expiration: 2027-05-28
Also published as: JP2008290995A

Description

本発明は、新規オリゴ糖及びその製造方法に関し、詳しくはショ糖のフルクトース残基の１位に、グルコース又はガラクトースがβ−結合した新規オリゴ糖に関する。

ショ糖のフルクトース残基の１位にガラクトースがα−結合したオリゴ糖（非特許文献１）、３位にガラクトースがα−結合したオリゴ糖（非特許文献２）、及び６位にガラクトースがα−結合したオリゴ糖（プランテオース：非特許文献３）が知られている。また、ショ糖のフルクトース残基の６位にガラクトースがβ−結合したオリゴ糖（非特許文献４）も知られている。また、ショ糖のフルクトース残基の３位にグルコースがα−結合したオリゴ糖（メレジトース：非特許文献５）及び６位にグルコースがα−結合したオリゴ糖（イソメレジトース）も知られている。

これらのオリゴ糖の機能性についてはあまり調べられていない。なお、ショ糖のグルコース残基にガラクトースが結合してなる、ラフィノース、ラクトスクロースについては、免疫賦活作用、アトピー性皮膚炎改善効果等が知られている。
しかしながら、ショ糖のフルクトース残基の１位にβ−結合したオリゴ糖は報告されていない。

J.E.Courtois and U.Ariyoshi, Bull.Soc.Chim.Bio.42,757(1960) J.E.Courtois, P.Le Dizet and F.Petek, Bull.Soc.Chim.Bio.41,1261(1959) N.Wattiez and M.Hans, Bull.Acad.Roy.Med.Belg.8,386(1943) J.H.Pauzur, J.M.Marsh and C.L.Tipton, J.Biol.Chem.233,277(1958) C.S.Hudson, Advances in Carbohydrate Chemistry 2,2(1946)

本発明は、新規な構造を持つオリゴ糖を提供することを課題とする。

本発明者は、植物エキス発酵液中の新規オリゴ糖について検索し、分離し、ＴＯＦ−ＭＳ分析、メチル化糖のＧＣ分析およびＮＭＲ分析した結果、いかなる標品とも一致しない未知のオリゴ糖を検出した。このオリゴ糖は植物エキス発酵液の発酵前ではほとんど見られず、発酵熟成後に検出される。

即ち、本発明の新規オリゴ糖は、下記一般式（１）で表される化合物である。本発明のオリゴ糖はショ糖のフルクトース残基の１位にグルコースまたはガラクトースがβ−結合したものである。

（式中、Ｒは、位置番号１でβ−結合するグルコース又は位置番号１でβ−結合するガラクトースを表す。）

前記一般式（１）に属する具体的な本発明のオリゴ糖は、下記式（２）で表される１^F−β−グルコシルスクロースであり、ショ糖のフルクトース残基の１位にグルコースがβ−結合したオリゴ糖である。

前記一般式（１）に属する別の具体的な本発明のオリゴ糖は、下記式（３）で表される１^F−β−ガラクトシルスクロースであり、ショ糖のフルクトース残基の１位にガラクトースがβ−結合したオリゴ糖である。

本発明のオリゴ糖の製造方法は、植物を切断したものに原料重量の１／１０量以上２倍量以下、好ましくは、１／５量以上２倍量以下、最も好ましくは、１／４量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に前記式（１）〜式（３）で表される本発明の何れかのオリゴ糖を生成させ、得られた植物発酵エキス中からオリゴ糖を採取することを特徴とする。

植物発酵エキスは、以下の様に製造される。植物原料としては、リンゴ、ニンジン、大根、キャベツ、セロリ、キュウリ、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草、ナシ、ミカンの皮、トマト、ピーマン、ブラックマッペモヤシ、ナス、レンコン、カボチャ、シイタケ、ショウガ、レタス、ニンニク、三つ葉、ウド、アスパラガス、熊笹、クローバー、昆布、フキノトウ、タンポポ、オオバコ、エンドウモヤシ、スギ葉、パセリ、カブ、パイナップル、ブドウ、イチゴ、イタドリの若芽、アサツキ、白菜、エノキタケ、サラダ菜、シュンギク、ヨモギ、セリ、ニラ、トドマツ葉、青シソ、ワカメ等が挙げられ、これらの植物原料のうち２種以上、好ましくは、多種類が用いられる。

上記植物原料の配合割合として、例えばリンゴでは植物原料総重量の０．１から５０％、ニンジンでは０．１から５０％、大根では０．０５から４０％、キャベツでは０．０５から４０％、セロリやキュウリでは０．０１から３０％、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草では０．０１から３０％とすることが望ましいが、特に制限されるものではない。

これらの植物原料を１〜５ｃｍ幅、好ましくは１〜４ｃｍ幅、最も好ましくは２〜３ｃｍ幅に切断し、全ての原料を杉樽中に入れ、これに、ショ糖を混合し、圧搾せずに浸透圧を利用して、３日間から３週間抽出する。ショ糖の混合割合については、全体として１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにし、好ましくは、植物原料とほぼ等量のショ糖を添加して混合することが望ましい。同時に、数ｐｐｍ程度の濃度となるように若干量の食塩を添加混合してもよい。

圧搾せずに回収した抽出エキスを３７℃で暗所で保存すると主として酵母（例えば、Saccharomyces 属に属する微生物、Pichia属に属する微生物）および乳酸球菌（例えば、Leuconostoc 属に属する微生物）により自然発酵する。発酵後、さらに３７℃で約半年間以上熟成させると褐色、粘稠性液体の植物発酵エキスが得られる。得られた植物発酵エキスから以下のようにして、本発明のオリゴ糖を採取することができる。或いは、得られた植物発酵エキスを食品とすることができる。

植物発酵エキスをカラムクロマトグラフィーに通し、溶出することにより本発明のオリゴ糖を採取することができる。得られたオリゴ糖をさらにＨＰＬＣにかけることにより分離、精製し、凍結乾燥することにより、精製された粉末状の本発明のオリゴ糖を得ることができる。

本発明のオリゴ糖は、新規化合物として有用であり、オリゴ糖として食品素材、医薬素材に有用性がある。

植物発酵エキスの調製
植物抽出エキスの原料として以下の配合の材料を２〜３ｃｍ幅に切断したものを使用した。

リンゴ植物原料総重量の２０％
ニンジン同１６％
大根同１２％
キャベツ同１０％
セロリ同９％
キュウリ同９％
バナナ同６％
玉ねぎ同６％
ゴボウ同６％
ホウレン草同６％

上記配合の植物原料を杉樽中にいれ、該原料とほぼ等量のショ糖を加えて混合し、該ショ糖の浸透圧を利用して杉樽中で一週間抽出する。圧搾せずに回収した抽出液を３７℃で暗所で保存することにより、主として酵母（例えば、Saccharomyces 属に属する微生物、Pichia属に属する微生物）および乳酸球菌（例えば、Leuconostoc 属に属する微生物）により自然発酵する。発酵後、さらに３７℃で約半年間以上熟成させると褐色、粘稠性液体の植物発酵エキスを得た。

未知の糖成分の分画、精製
発酵後の植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィー（４．５ｃｍ×３５ｃｍ）に添加し、エタノールのステップワイズグラジエントで溶出した。未知の糖１及び糖２は、１５％エタノールで順次溶出された。さらにＡｍｉｄｅ−８０（東ソー；カラムサイズ：７．８ｍｍ×３０ｃｍ、溶出：８０％アセトニトリル、カラム温度：８０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）およびＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（東ソー：カラムサイズ：４．６ｍｍ×２５ｃｍ、溶出：蒸留水、カラム温度: 室温、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）を用いたＨＰＬＣにより分離、精製し、糖１及び糖２の各々の凍結乾燥粉末を得た。図１にクロマトグラフィーのチャートを示す。

化学構造の決定
前記工程において分離、精製した糖１、糖２の各々について、機器分析を行い、その化学構造を以下のように決定した。分離した糖１、糖２をＰｏｓｉｔｉｖｅイオンモードで質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）した結果、糖１及び糖２の何れも、ｍ／ｚ５２７の〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺のピークを与えた（糖１について図２に、糖２について図３にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果のチャートを示す。）。

糖１を酸加水分解後、ＨＰＡＥＣ分析し、構成糖を調査したところ、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は２：１であった。従って糖１はグルコース２分子とフルクトース１分子からなる３糖類であると決定した。糖２を同様に調査した結果、グルコース、フルクトース、ガラクトースから構成され、モル比は１：１：１であった。従って糖２はグルコース１分子、フルクトース１分子、ガラクトース１分子からなる３糖類であると決定した。

糖１をＨａｋｏｍｏｒｉの方法でメチル化しメタノール分解した試料をＧＣ分析した結果、ｍｅｔｈｙｌ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−
ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ｍｅｔｈｙｌ３，４，６−ｔｒｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−
ｆｒｕｃｔｏｓｉｄｅが検出された。糖２を同様に試験した結果、ｍｅｔｈｙｌ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ｍｅｔｈｙｌ３，４，６−ｔｒｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｉｄｅ、ｍｅｔｈｙｌ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、が検出された。

次に、糖１について１次元プロトンＮＭＲ、１次元カーボンＮＭＲ、並びに２次元ＮＭＲとしてＣＯＳＹ、Ｅ−ＨＳＱＣ、ＣＴ−ＨＭＢＣを行った。それらのチャートを図４〜図８に示す。糖２について１次元プロトンＮＭＲ、１次元カーボンＮＭＲ、並びに２次元ＮＭＲとしてＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ、ＣＴ−ＨＭＢＣを行った。それらのチャートを図９〜図１４に示す。
また糖１のケミカルシフトを表１に、糖２のケミカルシフトを表２に示す。

以上の結果から糖１は、前記式（１）で表される新規化合物である１^F−β−グルコシルスクロース、糖２は、前記式（２）で表される新規化合物である１^F−β−ガラクトシルスクロースであると決定した。

本発明のオリゴ糖は、食品素材、医薬品素材の用途としての利用が期待できる。

植物エキス発酵液を活性炭カラムにかけて、１５％エタノールで溶出した画分をＡｍｉｄｅ−８０カラムで分離したチャートを示す。糖１についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果のチャートを示す。糖２についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果のチャートを示す。糖１について１次元プロトンＮＭＲの結果のチャートを示す。糖１について１次元カーボンＮＭＲの結果のチャートを示す。糖１について２次元ＮＭＲとしてＣＯＳＹの結果のチャートを示す。糖１について２次元ＮＭＲとしてＥ−ＨＳＱＣの結果のチャートを示す。糖１について２次元ＮＭＲとしてＣＴ−ＨＭＢＣの結果のチャートを示す。糖２について１次元プロトンＮＭＲの結果のチャートを示す。糖２について１次元カーボンＮＭＲの結果のチャートを示す。糖２について２次元ＮＭＲとしてＣＯＳＹの結果のチャートを示す。糖２について２次元ＮＭＲとしてＨＳＱＣの結果のチャートを示す。糖２について２次元ＮＭＲとしてＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹの結果のチャートを示す。糖２について２次元ＮＭＲとしてＣＴ−ＨＭＢＣの結果のチャートを示す。

Claims

下記一般式（１）で表されるオリゴ糖。

（式中、Ｒは、位置番号１でβ−結合するグルコース、又は位置番号１でβ−結合するガラクトースを表す。）
請求項１記載のオリゴ糖が、下記式（２）で表される１^F−β−グルコシルスクロース。
請求項１記載のオリゴ糖が、下記式（３）で表される１^F−β−ガラクトシルスクロース。
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項１乃至３の何れか１項に記載のオリゴ糖を生成させ、生成されたオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。