JP4624977B2 - 妊娠障害診断マーカーとしての血中ｍＲＮＡ - Google Patents
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Description
本発明は、妊娠障害診断マーカーとしての血中ｍＲＮＡに関する。
［０００１］
（関連出願）
本出願は、２００３年１月１７日に申請された米国仮出願第６０，４４０，９０６号に対して優先権を主張する。その内容はこの参照により開示に含まれる。
（関連出願）
本出願は、２００３年１月１７日に申請された米国仮出願第６０，４４０，９０６号に対して優先権を主張する。その内容はこの参照により開示に含まれる。
［０００２］
絨毛生検（ＣＶＳ）や羊水穿刺などの処置により胎児から分離された細胞を用いて出生前診断が日常的に行われている。しかしながら、これら従来の方法は侵襲性で、非常に慎重に処理しても母親と胎児両方にかなりの危険を伴う（非特許文献１）。
絨毛生検（ＣＶＳ）や羊水穿刺などの処置により胎児から分離された細胞を用いて出生前診断が日常的に行われている。しかしながら、これら従来の方法は侵襲性で、非常に慎重に処理しても母親と胎児両方にかなりの危険を伴う（非特許文献１）。
［０００３］
さまざまなタイプの胎児細胞を母体循環系から得ることができるという発見（非特許文献２）および、さらに重要なことに、血中遊離胎児ＤＮＡを母体血漿または血清中で検出できるという発見（非特許文献３）を受けて、これら侵襲的方法に代わるものが出生前スクリーニング（たとえば胎児異常の検出）のために開発された。胎児細胞の分離および濃縮に必要なステップと比較して、母体血中の胎児ＤＮＡ量は、血漿や血清の複雑な処理をしなくとも、遺伝子分析には十分であることが示された。その後、胎児のＲｈＤ遺伝子型特定（非特許文献４）、胎児の性決定（非特許文献５）、および様々な胎児障害の診断（非特許文献６、非特許文献７、および非特許文献８）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を基本とした技術を用いて母体血中の胎児ＤＮＡを検出することにより達成されている。
さまざまなタイプの胎児細胞を母体循環系から得ることができるという発見（非特許文献２）および、さらに重要なことに、血中遊離胎児ＤＮＡを母体血漿または血清中で検出できるという発見（非特許文献３）を受けて、これら侵襲的方法に代わるものが出生前スクリーニング（たとえば胎児異常の検出）のために開発された。胎児細胞の分離および濃縮に必要なステップと比較して、母体血中の胎児ＤＮＡ量は、血漿や血清の複雑な処理をしなくとも、遺伝子分析には十分であることが示された。その後、胎児のＲｈＤ遺伝子型特定（非特許文献４）、胎児の性決定（非特許文献５）、および様々な胎児障害の診断（非特許文献６、非特許文献７、および非特許文献８）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を基本とした技術を用いて母体血中の胎児ＤＮＡを検出することにより達成されている。
［０００４］
さらに、母体血漿／血清中の胎児ＤＮＡの量的異常も、子癇前症（非特許文献９および非特許文献１０）、胎児２１トリソミー（非特許文献１１および非特許文献１２）および妊娠悪阻（非特許文献１３）において報告されている。出生前遺伝子分析のための母体血中胎児核酸の検出も、特許文献１に開示されている。
さらに、母体血漿／血清中の胎児ＤＮＡの量的異常も、子癇前症（非特許文献９および非特許文献１０）、胎児２１トリソミー（非特許文献１１および非特許文献１２）および妊娠悪阻（非特許文献１３）において報告されている。出生前遺伝子分析のための母体血中胎児核酸の検出も、特許文献１に開示されている。
［０００５］
胎児ＤＮＡを分析する際に、研究者はしばしば男性の胎児にのみ存在するＹ染色体マーカーを胎児特異的マーカーとして用いることがあった。この方法は、この技術の応用範囲を男性の胎児を妊娠している、妊婦の５０％に狭めていた。さらに、他の遺伝的多型を利用することによって、胎児ＤＮＡに基づいた分析をより複雑にしていた。母体血漿中の胎児ＲＮＡの発見は、これら制限を回避する新しい方法を提供する（非特許文献１４）。
胎児ＤＮＡを分析する際に、研究者はしばしば男性の胎児にのみ存在するＹ染色体マーカーを胎児特異的マーカーとして用いることがあった。この方法は、この技術の応用範囲を男性の胎児を妊娠している、妊婦の５０％に狭めていた。さらに、他の遺伝的多型を利用することによって、胎児ＤＮＡに基づいた分析をより複雑にしていた。母体血漿中の胎児ＲＮＡの発見は、これら制限を回避する新しい方法を提供する（非特許文献１４）。
［０００６］
さらに最近では、特許文献２が、母体血中胎児ＲＮＡの検出に基づいた非侵襲性の技術を開示する。本発明は初めて、母体血中に存在する特定のｍＲＮＡ種（ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンβサブユニット（ｈＣＧ−β）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｈＣＲＨ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）、ＫｉＳＳ−１転移抑制遺伝子（ＫＩＳＳ１）、組織因子経路インヒビター２（ＴＰＦＩ２）、胎盤特異的遺伝子１（ＰＬＡＣ１）、あるいはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするものを含んでいる）の量を、妊娠検出のためだけでなく、子癇前症、胎児の染色体
異常、および早期陣痛などの妊娠障害の監視、診断または予測用マーカーとして使用できることを開示する。
米国特許第６，２５８，５４０号
米国特許出願第０９／８７６，００５号
タボールら、ランセット１：１２８７−１２９３、１９８６年
ヨハンセンら、出生前診断１５：９２１−９３１、１９９５年
ローら、ランセット３５０：４８５−４８７、１９９７年
ローら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン３３９：１７３４−１７３８、１９９８年
ローら、人類遺伝学９０：４８３−４８８、１９９３年
アミクッチら、臨床化学４６：３０１−３０２、２０００年
サイトウら、ランセット３５６：１１７０、２０００年
チウら、ランセット３６０：９９８−１０００、２００２年
ローら、臨床化学４５：１８４−１８８、１９９９年
チョンら、アメリカ産婦人科ジャーナル１８４：４１４−４１９、２００１年
ローら、臨床化学４５：１７４７−１７５１、１９９９年
チョンら、出生前診断２０：７９５−７９８、２０００年
セキザワら、臨床化学４７：２１６４−２１６５、２００１年
プーンら、臨床化学４６：１８３２−１８３４、２０００年
さらに最近では、特許文献２が、母体血中胎児ＲＮＡの検出に基づいた非侵襲性の技術を開示する。本発明は初めて、母体血中に存在する特定のｍＲＮＡ種（ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンβサブユニット（ｈＣＧ−β）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｈＣＲＨ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）、ＫｉＳＳ−１転移抑制遺伝子（ＫＩＳＳ１）、組織因子経路インヒビター２（ＴＰＦＩ２）、胎盤特異的遺伝子１（ＰＬＡＣ１）、あるいはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするものを含んでいる）の量を、妊娠検出のためだけでなく、子癇前症、胎児の染色体
異常、および早期陣痛などの妊娠障害の監視、診断または予測用マーカーとして使用できることを開示する。
本発明の目的は、母体血に含まれる１つまたはそれ以上の血中ｍＲＮＡ種の定量により、子癇前症、胎児の染色体異常、および早期陣痛などの妊娠障害を監視、診断または予測する新しい方法、女性の妊娠を検出する方法、ならびに妊娠に関連する病気／妊娠用の、診断／検出キットを提供することである。
（発明の簡単な概要）
［０００７］
本発明は、母体血に含まれる１つまたはそれ以上の血中ｍＲＮＡ種の定量により、子癇前症、胎児の染色体異常、および早期陣痛などの妊娠障害を監視、診断または予測する新しい方法を提供する。女性の妊娠を検出する方法も同じ方法論に基づいて提供する。該ｍＲＮＡは、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンβサブユニット（ｈＣＧ−β）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｈＣＲＨ）、ＫｉＳＳ−１転移抑制遺伝子（ＫＩＳＳ１）、組織因子経路インヒビター２（ＴＰＦＩ２）、胎盤特異的遺伝子１（ＰＬＡＣ１）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などの胎児または母体由来のタンパク質をコードしてもよい。本発明に基づいた、妊娠に関連する病気／妊娠用の、診断／検出キットも提供する。
［０００７］
本発明は、母体血に含まれる１つまたはそれ以上の血中ｍＲＮＡ種の定量により、子癇前症、胎児の染色体異常、および早期陣痛などの妊娠障害を監視、診断または予測する新しい方法を提供する。女性の妊娠を検出する方法も同じ方法論に基づいて提供する。該ｍＲＮＡは、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンβサブユニット（ｈＣＧ−β）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｈＣＲＨ）、ＫｉＳＳ−１転移抑制遺伝子（ＫＩＳＳ１）、組織因子経路インヒビター２（ＴＰＦＩ２）、胎盤特異的遺伝子１（ＰＬＡＣ１）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などの胎児または母体由来のタンパク質をコードしてもよい。本発明に基づいた、妊娠に関連する病気／妊娠用の、診断／検出キットも提供する。
［０００８］
本発明の一態様は、妊婦の子癇前症を診断、監視、または予測する方法に関する。この方法は複数のステップを備え、第１ステップでは、妊婦の血液中に存在する１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定する。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。第２ステップでは、第１ステップから得られたｍＲＮＡ量を、子癇前症ではない平均的女性の血液中の同一タンパク質をコードしているｍＲＮＡ量を表す標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加または減少により、子癇前症の存在や、その症状が現れる危険性が高いことが示される。
本発明の一態様は、妊婦の子癇前症を診断、監視、または予測する方法に関する。この方法は複数のステップを備え、第１ステップでは、妊婦の血液中に存在する１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定する。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。第２ステップでは、第１ステップから得られたｍＲＮＡ量を、子癇前症ではない平均的女性の血液中の同一タンパク質をコードしているｍＲＮＡ量を表す標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加または減少により、子癇前症の存在や、その症状が現れる危険性が高いことが示される。
［０００９］
ある実施例では、この方法でマーカーとして用いられる該ｍＲＮＡはｈＣＲＨまたはＧＡＰＤＨをコードする。ある実施例では、該方法の第１ステップは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって行われる。しかし、他方では、この第１ステップはポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法または質量分析を用いて行われる。ある実施例では、妊婦は妊娠第１期であるのに対し、他方では、女性は妊娠第２期または妊娠第３期である。ある実施例では、該方法の第１ステップで用いられる前に、妊婦の血液は無細胞化される。ある実施例では、血漿または血清が該方法の第１ステップで用いられる。ある実施例では、標準対照からのｍＲＮＡ量の増加は２倍をこえる。
ある実施例では、この方法でマーカーとして用いられる該ｍＲＮＡはｈＣＲＨまたはＧＡＰＤＨをコードする。ある実施例では、該方法の第１ステップは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって行われる。しかし、他方では、この第１ステップはポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法または質量分析を用いて行われる。ある実施例では、妊婦は妊娠第１期であるのに対し、他方では、女性は妊娠第２期または妊娠第３期である。ある実施例では、該方法の第１ステップで用いられる前に、妊婦の血液は無細胞化される。ある実施例では、血漿または血清が該方法の第１ステップで用いられる。ある実施例では、標準対照からのｍＲＮＡ量の増加は２倍をこえる。
［００１０］
本発明の方法は、子癇など、子癇前症よりも重症の臨床経過の診断、監視、あるいは予測にも使用できる。
本発明の方法は、子癇など、子癇前症よりも重症の臨床経過の診断、監視、あるいは予測にも使用できる。
［００１１］
同様に、本発明は、妊婦の子癇前症を監視、診断または予測するためのキットに関する。該キットは、妊婦の血液中の１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーを備える。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。該キットは、さらに子癇前症ではない平均的妊婦の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照を備える。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーに加えて、あるいはその代わりに、定量的にｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するために使用できる１つまたはそれ以上のプローブを備えてもよい。
同様に、本発明は、妊婦の子癇前症を監視、診断または予測するためのキットに関する。該キットは、妊婦の血液中の１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーを備える。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。該キットは、さらに子癇前症ではない平均的妊婦の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照を備える。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーに加えて、あるいはその代わりに、定量的にｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するために使用できる１つまたはそれ以上のプローブを備えてもよい。
［００１２］
本発明のもう１つの態様は、妊婦から染色体異常（１８トリソミーまたは２１トリソミーなど）を有する胎児を検出する方法に関する。この方法は複数のステップを備え、第１ステップでは、妊婦の血液中に存在する１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定する。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。第２ステップでは、第１ステップから得られたｍＲＮＡ量を、染色体正常胎児を妊娠している平均的妊婦の血液中の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加または減少は、異数体の胎児を妊娠している危険性が高いことを示す。
本発明のもう１つの態様は、妊婦から染色体異常（１８トリソミーまたは２１トリソミーなど）を有する胎児を検出する方法に関する。この方法は複数のステップを備え、第１ステップでは、妊婦の血液中に存在する１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定する。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。第２ステップでは、第１ステップから得られたｍＲＮＡ量を、染色体正常胎児を妊娠している平均的妊婦の血液中の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加または減少は、異数体の胎児を妊娠している危険性が高いことを示す。
［００１３］
ある実施例では、該方法でマーカーとして用いられる該ｍＲＮＡはｈＣＧ―βをコードする。ある実施例では、該方法の第１ステップはＲＴ−ＰＣＲによって行われる。しかし、他方では、この第１ステップはポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法または質量分析法を用いて行われる。ある実施例では、妊婦は妊娠第１期である。しかし、他方では、女性は妊娠第２期または妊娠第３期である。ある実施例では、該方法の第１ステップで用いられる前に、妊婦の血液は無細胞化される。ある実施例では、血漿あるいは血清が該方法の第１ステップで用いられる。ある実施例では、増加は少なくとも２倍である。他の実施例では、減少は少なくとも５０％である。
ある実施例では、該方法でマーカーとして用いられる該ｍＲＮＡはｈＣＧ―βをコードする。ある実施例では、該方法の第１ステップはＲＴ−ＰＣＲによって行われる。しかし、他方では、この第１ステップはポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法または質量分析法を用いて行われる。ある実施例では、妊婦は妊娠第１期である。しかし、他方では、女性は妊娠第２期または妊娠第３期である。ある実施例では、該方法の第１ステップで用いられる前に、妊婦の血液は無細胞化される。ある実施例では、血漿あるいは血清が該方法の第１ステップで用いられる。ある実施例では、増加は少なくとも２倍である。他の実施例では、減少は少なくとも５０％である。
［００１４］
同様に、本発明は、妊婦から染色体異常（１８トリソミーまたは２１トリソミーなど）を有する胎児の存在を検出するためのキットに関する。該キットは、妊婦の血液中の１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーを備
える。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。該キットは、染色体正常胎児を妊娠している平均的妊婦の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照も備える。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーに加えて、あるいはその代わりに、定量的にｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するために使用できる１つまたはそれ以上のプローブを備えてもよい。
同様に、本発明は、妊婦から染色体異常（１８トリソミーまたは２１トリソミーなど）を有する胎児の存在を検出するためのキットに関する。該キットは、妊婦の血液中の１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーを備
える。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。該キットは、染色体正常胎児を妊娠している平均的妊婦の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照も備える。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーに加えて、あるいはその代わりに、定量的にｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するために使用できる１つまたはそれ以上のプローブを備えてもよい。
［００１５］
本発明のさらなる態様は、妊婦の早期陣痛を診断、監視、または予測する方法に関する。この方法は複数のステップを備え、第１ステップでは、妊婦の血液中に存在する１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種を定量的に測定する。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。第２ステップでは、第１ステップから得られたｍＲＮＡ量を、満期分娩する（または満期分娩するであろう）平均的女性の血液中の同一たんぱく質をコードしているｍＲＮＡ量を表す標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加または減少は、早期陣痛であるか、早期陣痛の症状が現れる危険性が高いことを示す。
本発明のさらなる態様は、妊婦の早期陣痛を診断、監視、または予測する方法に関する。この方法は複数のステップを備え、第１ステップでは、妊婦の血液中に存在する１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種を定量的に測定する。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。第２ステップでは、第１ステップから得られたｍＲＮＡ量を、満期分娩する（または満期分娩するであろう）平均的女性の血液中の同一たんぱく質をコードしているｍＲＮＡ量を表す標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加または減少は、早期陣痛であるか、早期陣痛の症状が現れる危険性が高いことを示す。
［００１６］
ある実施例では、該方法の第１ステップはＲＴ−ＰＣＲによって行われる。しかし、他方では、この第１ステップはポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法または質量分析法を用いて行われる。ある実施例では、妊婦は妊娠第１期である。しかし、他方では、女性は妊娠第２期または妊娠第３期である。ある実施例では、該方法の第１ステップで用いられる前に、妊婦の血液は無細胞化される。ある実施例では、血漿または血清が該方法の第１ステップで用いられる。ある実施例では、標準対照からのｍＲＮＡ量の増加は２倍をこえる。他の実施例では、減少は少なくとも５０％である。
ある実施例では、該方法の第１ステップはＲＴ−ＰＣＲによって行われる。しかし、他方では、この第１ステップはポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法または質量分析法を用いて行われる。ある実施例では、妊婦は妊娠第１期である。しかし、他方では、女性は妊娠第２期または妊娠第３期である。ある実施例では、該方法の第１ステップで用いられる前に、妊婦の血液は無細胞化される。ある実施例では、血漿または血清が該方法の第１ステップで用いられる。ある実施例では、標準対照からのｍＲＮＡ量の増加は２倍をこえる。他の実施例では、減少は少なくとも５０％である。
［００１７］
同様に、本発明は、妊婦の早期陣痛を監視、診断または予測するためのキットに関する。該キットは、妊婦の血液中の１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーを備える。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。該キットは、満期分娩する（または満期分娩するであろう）平均的妊婦の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照も備える。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーに加えて、あるいはその代わりに、定量的にｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するために使用できる１つまたはそれ以上のプローブを備えてもよい。
同様に、本発明は、妊婦の早期陣痛を監視、診断または予測するためのキットに関する。該キットは、妊婦の血液中の１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーを備える。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードしてもよい。該キットは、満期分娩する（または満期分娩するであろう）平均的妊婦の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照も備える。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーに加えて、あるいはその代わりに、定量的にｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するために使用できる１つまたはそれ以上のプローブを備えてもよい。
［００１８］
本発明のさらなる態様は、女性の妊娠を検出する方法に関する。この方法は複数のステップを備え、第１ステップでは、女性の血液中に存在する１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種を定量的に測定する。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、あるいはＰＬＡＣ１をコードしてもよい。第２ステップでは、第１ステップから得られたｍＲＮＡ量を、健康な平均的非妊娠女性の血液中の同一タンパク質をコードしているｍＲＮＡ量を表す標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加は妊娠を示す。
本発明のさらなる態様は、女性の妊娠を検出する方法に関する。この方法は複数のステップを備え、第１ステップでは、女性の血液中に存在する１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種を定量的に測定する。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、あるいはＰＬＡＣ１をコードしてもよい。第２ステップでは、第１ステップから得られたｍＲＮＡ量を、健康な平均的非妊娠女性の血液中の同一タンパク質をコードしているｍＲＮＡ量を表す標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加は妊娠を示す。
［００１９］
ある実施例では、該方法の第１ステップはＲＴ−ＰＣＲによって行われる。しかし、他方では、この第１ステップはポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法または質量分
析法を用いて行われる。ある実施例では、該方法の第１ステップで用いられる前に、女性の血液は無細胞化される。ある実施例では、血漿または血清が該方法の第１ステップで用いられる。ある実施例では、標準対照からのｍＲＮＡ量の増加は２倍をこえる。他の実施例では、減少は少なくとも５０％である。
ある実施例では、該方法の第１ステップはＲＴ−ＰＣＲによって行われる。しかし、他方では、この第１ステップはポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法または質量分
析法を用いて行われる。ある実施例では、該方法の第１ステップで用いられる前に、女性の血液は無細胞化される。ある実施例では、血漿または血清が該方法の第１ステップで用いられる。ある実施例では、標準対照からのｍＲＮＡ量の増加は２倍をこえる。他の実施例では、減少は少なくとも５０％である。
［００２０］
同様に、本発明は、女性の妊娠を検出するためのキットに関する。該キットは、妊婦の血液中の１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーを備える。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、あるいはＰＬＡＣ１をコードしてもよい。該キットは、健康な平均的非妊娠女性の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照も備える。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーに加えて、あるいはその代わりに、定量的にｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、あるいはＰＬＡＣ１をコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するために使用できる１つまたはそれ以上のプローブを備えてもよい。
同様に、本発明は、女性の妊娠を検出するためのキットに関する。該キットは、妊婦の血液中の１つまたはそれ以上の特定のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーを備える。該ｍＲＮＡはｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、あるいはＰＬＡＣ１をコードしてもよい。該キットは、健康な平均的非妊娠女性の同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を表す標準対照も備える。本発明のキットは、ＰＣＲプライマーに加えて、あるいはその代わりに、定量的にｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、あるいはＰＬＡＣ１をコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するために使用できる１つまたはそれ以上のプローブを備えてもよい。
（定義）
［００３０］
本明細書で用いられる「子癇前症」という用語は、妊娠中に生じる病気を指す。その主な症状は、尿中のタンパク質の存在および浮腫（膨潤）をしばしば伴う、様々な型の高血圧である。子癇前症、は時に妊娠中毒症と呼ばれ、発作を伴う子癇前症であり「子癇」と呼ばれる、より重症の障害と関係がある。これらの症状は出産直後または妊娠２０週以前に現れることがあるが、通常、妊娠後半（２０週以降）に現れる。
［００３０］
本明細書で用いられる「子癇前症」という用語は、妊娠中に生じる病気を指す。その主な症状は、尿中のタンパク質の存在および浮腫（膨潤）をしばしば伴う、様々な型の高血圧である。子癇前症、は時に妊娠中毒症と呼ばれ、発作を伴う子癇前症であり「子癇」と呼ばれる、より重症の障害と関係がある。これらの症状は出産直後または妊娠２０週以前に現れることがあるが、通常、妊娠後半（２０週以降）に現れる。
［００３１］
本明細書で用いられる「染色体異常」という用語は、染色体数が通常のハプロイドの染色体数の正確な倍数でない染色体異常の状態を指し、しばしば、染色体が増えたり、１つ欠損していたりする。染色体異常の最も一般的な症例は、追加の染色体が１つ存在するトリソミーである。例えば、１８トリソミーは、３つめの第１８染色体が細胞中に見出される染色体異常であり、２１トリソミー患者の細胞中には３つめの第２１染色体が存在する。
本明細書で用いられる「染色体異常」という用語は、染色体数が通常のハプロイドの染色体数の正確な倍数でない染色体異常の状態を指し、しばしば、染色体が増えたり、１つ欠損していたりする。染色体異常の最も一般的な症例は、追加の染色体が１つ存在するトリソミーである。例えば、１８トリソミーは、３つめの第１８染色体が細胞中に見出される染色体異常であり、２１トリソミー患者の細胞中には３つめの第２１染色体が存在する。
［００３２］
異数性とは対照的に、「染色体正常」とは、染色体の数が、ハプロイドに含まれる染色体の数の２倍であるなど、ハプロイドの染色体数の正確な倍数であり、各染色体が同数存在する（性染色体、例えば、２つの異なる性染色体ＸおよびＹが１コピーずつ存在するヒト男性の場合性染色体は除く）状態をあらわす。
異数性とは対照的に、「染色体正常」とは、染色体の数が、ハプロイドに含まれる染色体の数の２倍であるなど、ハプロイドの染色体数の正確な倍数であり、各染色体が同数存在する（性染色体、例えば、２つの異なる性染色体ＸおよびＹが１コピーずつ存在するヒト男性の場合性染色体は除く）状態をあらわす。
［００３３］
本明細書で用いられる「早期陣痛」あるいは「早産の陣痛」という用語は、約４０週の十分な妊娠期間の３週間以上前に陣痛が始まり、治療をしなければしばしば早産を引き起こす状態を指す。対照的に、本願で用いられる「満期分娩する（または満期分娩するであろう）」妊婦は、早期陣痛を起こすことなく十分な妊娠期間まで胎児を妊娠している妊婦を指す。
本明細書で用いられる「早期陣痛」あるいは「早産の陣痛」という用語は、約４０週の十分な妊娠期間の３週間以上前に陣痛が始まり、治療をしなければしばしば早産を引き起こす状態を指す。対照的に、本願で用いられる「満期分娩する（または満期分娩するであろう）」妊婦は、早期陣痛を起こすことなく十分な妊娠期間まで胎児を妊娠している妊婦を指す。
［００３４］
本明細書で用いられる「血液」という用語は、妊婦または妊娠の可能性を検査しようとしている女性からの血液サンプルまたは調製物を指す。該用語は、全血、または、造血性細胞または任意の母体もしくは胎児由来の他のタイプの血小板などの細胞を基本的に含んでいない任意の血液画分を包含する。「血液」は、通常、母体または胎児由来のＲＮＡを
含む可能性のある特定の物質を含まない。「血液」の具体例には血漿および血清が挙げられる。基本的に細胞を含まない血液サンプルは「無細胞の」とも呼ばれ、この場合血小板は通常存在しない。
本明細書で用いられる「血液」という用語は、妊婦または妊娠の可能性を検査しようとしている女性からの血液サンプルまたは調製物を指す。該用語は、全血、または、造血性細胞または任意の母体もしくは胎児由来の他のタイプの血小板などの細胞を基本的に含んでいない任意の血液画分を包含する。「血液」は、通常、母体または胎児由来のＲＮＡを
含む可能性のある特定の物質を含まない。「血液」の具体例には血漿および血清が挙げられる。基本的に細胞を含まない血液サンプルは「無細胞の」とも呼ばれ、この場合血小板は通常存在しない。
［００３５］
子癇前症ではない、染色体正常胎児を妊娠している、または早期陣痛の症状が現れない（であろう）妊婦を表す文脈で用いた「平均」という用語は、ある特性、例えば、子癇前症ではない、染色体正常胎児を妊娠している、または早期陣痛の症状が現れない（であろう）任意に選ばれた女性グループを表す、母体血中に含まれる１つまたはそれ以上の特定の胎児タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルなどを指す。この選択されたグループは、これらの女性の胎児の特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの平均レベルが、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦の母集団のｍＲＮＡレベルを適切な精度で反映するように、十分な人数の女性で構成されなければならない。さらに、上記選択されたグループの女性の妊娠期間は、子癇前症、胎児の染色体異常、あるいは早期陣痛の徴候のために血液を検査する女性の妊娠期間と同様でなければならない。本発明を実施するための好ましい妊娠期間は、検査する障害により変えてもよい。例えば、好ましくは妊娠第２期に、妊婦の子癇前症の危険性を検査する。一方、胎児の染色体異常はできるだけ早くスクリーニングして診断することが好ましい。さらに、検査に好ましい妊娠時期は、検査に用いられるｍＲＮＡマーカーによって変えてもよい。例えば、ｈＰＬ ｍＲＮＡは３つの妊娠３半期すべてを通じて検出できる。一方、ｈＣＲＨ ｍＲＮＡは妊娠の経過に伴い漸増的に検出できるようになる。
子癇前症ではない、染色体正常胎児を妊娠している、または早期陣痛の症状が現れない（であろう）妊婦を表す文脈で用いた「平均」という用語は、ある特性、例えば、子癇前症ではない、染色体正常胎児を妊娠している、または早期陣痛の症状が現れない（であろう）任意に選ばれた女性グループを表す、母体血中に含まれる１つまたはそれ以上の特定の胎児タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルなどを指す。この選択されたグループは、これらの女性の胎児の特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの平均レベルが、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦の母集団のｍＲＮＡレベルを適切な精度で反映するように、十分な人数の女性で構成されなければならない。さらに、上記選択されたグループの女性の妊娠期間は、子癇前症、胎児の染色体異常、あるいは早期陣痛の徴候のために血液を検査する女性の妊娠期間と同様でなければならない。本発明を実施するための好ましい妊娠期間は、検査する障害により変えてもよい。例えば、好ましくは妊娠第２期に、妊婦の子癇前症の危険性を検査する。一方、胎児の染色体異常はできるだけ早くスクリーニングして診断することが好ましい。さらに、検査に好ましい妊娠時期は、検査に用いられるｍＲＮＡマーカーによって変えてもよい。例えば、ｈＰＬ ｍＲＮＡは３つの妊娠３半期すべてを通じて検出できる。一方、ｈＣＲＨ ｍＲＮＡは妊娠の経過に伴い漸増的に検出できるようになる。
［００３６］
用語「平均」は、特定のｍＲＮＡ種の量であって任意に選ばれた健康な非妊娠女性のグループの血液中に含まれる量を表すｍＲＮＡ量を指すために用いてもよい。
用語「平均」は、特定のｍＲＮＡ種の量であって任意に選ばれた健康な非妊娠女性のグループの血液中に含まれる量を表すｍＲＮＡ量を指すために用いてもよい。
［００３７］
本明細書で用いられるヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンβサブユニット（ｈＣＧ―β）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｈＣＲＨ）、ＫｉＳＳ−１転移抑制遺伝子（ＫＩＳＳ１）、組織因子経路インヒビター２（ＴＰＦＩ２）、胎盤特異的遺伝子１（ＰＬＡＣ１）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７３７．２、ＮＭ＿０２２６４０、ＮＭ＿０００７５６、Ｕ４３５２７、ＮＭ＿００６５２８、ＢＣ０２２３３５、およびＢＣ０１４０８５などにそれぞれ記述された配列などの遺伝子（そのバリアントと突然変異体を含む）および、そのポリヌクレオチド転写物を指す。文脈によっては、これら用語は、これら遺伝子によってコードされたタンパク質を指してもよい。
本明細書で用いられるヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンβサブユニット（ｈＣＧ―β）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｈＣＲＨ）、ＫｉＳＳ−１転移抑制遺伝子（ＫＩＳＳ１）、組織因子経路インヒビター２（ＴＰＦＩ２）、胎盤特異的遺伝子１（ＰＬＡＣ１）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７３７．２、ＮＭ＿０２２６４０、ＮＭ＿０００７５６、Ｕ４３５２７、ＮＭ＿００６５２８、ＢＣ０２２３３５、およびＢＣ０１４０８５などにそれぞれ記述された配列などの遺伝子（そのバリアントと突然変異体を含む）および、そのポリヌクレオチド転写物を指す。文脈によっては、これら用語は、これら遺伝子によってコードされたタンパク質を指してもよい。
［００３８］
本明細書で用いられる「標準対照」は、特定のタンパク質（例えばｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨ）をコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するための本発明の方法の使用に適しているサンプルを指す。そのようなサンプルは、先に述べたように、子癇前症ではない、染色体正常胎児を妊娠する、または早期陣痛の症状が現れない（であろう）平均的妊婦のｍＲＮＡの平均レベルを厳密に反映する、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの既知量を含んでいる。同様に、「標準対照」は、健康な平均的非妊娠女性から得てもよい。
本明細書で用いられる「標準対照」は、特定のタンパク質（例えばｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨ）をコードするｍＲＮＡ量を定量的に測定するための本発明の方法の使用に適しているサンプルを指す。そのようなサンプルは、先に述べたように、子癇前症ではない、染色体正常胎児を妊娠する、または早期陣痛の症状が現れない（であろう）平均的妊婦のｍＲＮＡの平均レベルを厳密に反映する、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの既知量を含んでいる。同様に、「標準対照」は、健康な平均的非妊娠女性から得てもよい。
［００３９］
本明細書で用いられる「標準対照に比べてｍＲＮＡ量が増加あるいは減少」とは、標準対照に比べて量がプラスまたはマイナスに変化することを指す。増加は、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍である。
同じく、減少は、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
本明細書で用いられる「標準対照に比べてｍＲＮＡ量が増加あるいは減少」とは、標準対照に比べて量がプラスまたはマイナスに変化することを指す。増加は、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍である。
同じく、減少は、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
［００４０］
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、既知の配列のポリヌクレオチドプローブとワトソン−クリック型塩基対を形成する能力に基づき、ポリヌクレオチドの存在および／または量を検出する方法を指す。そのようなハイブリダイゼーション法の具体例にはサザンブロッティングおよびノーザンブロッティングが挙げられる。
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、既知の配列のポリヌクレオチドプローブとワトソン−クリック型塩基対を形成する能力に基づき、ポリヌクレオチドの存在および／または量を検出する方法を指す。そのようなハイブリダイゼーション法の具体例にはサザンブロッティングおよびノーザンブロッティングが挙げられる。
［００４１］
本明細書で用いられる「ＰＣＲプライマー」は、ｈＣＧ‐β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、またはＧＡＰＤＨなどの目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ由来のヌクレオチド配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用できるオリゴヌクレオチドを指す。上記で指定したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を増幅するためのＰＣＲプライマーのうち少なくとも１つは、タンパク質に対して配列特異的でなければならない。
本明細書で用いられる「ＰＣＲプライマー」は、ｈＣＧ‐β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、またはＧＡＰＤＨなどの目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ由来のヌクレオチド配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用できるオリゴヌクレオチドを指す。上記で指定したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を増幅するためのＰＣＲプライマーのうち少なくとも１つは、タンパク質に対して配列特異的でなければならない。
（発明の詳細な説明）
Ｉ． はじめに
［００４２］
本発明は、１つまたはそれ以上のさまざまなｍＲＮＡ種（つまり、女性の血液中にあるｈＣＧ‐β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨなどをコードするｍＲＮＡ種）のレベルを分析することにより、女性の妊娠検出だけでなく妊婦の子癇前症、胎児の染色体異常（１８トリソミーと２１トリソミーなど）、および早期陣痛を診断、監視、または予測するための方法およびキットを初めて提供する。
Ｉ． はじめに
［００４２］
本発明は、１つまたはそれ以上のさまざまなｍＲＮＡ種（つまり、女性の血液中にあるｈＣＧ‐β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨなどをコードするｍＲＮＡ種）のレベルを分析することにより、女性の妊娠検出だけでなく妊婦の子癇前症、胎児の染色体異常（１８トリソミーと２１トリソミーなど）、および早期陣痛を診断、監視、または予測するための方法およびキットを初めて提供する。
［００４３］
本発明によれば、母体血サンプル中のｈＣＧ‐β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡ量を、好ましくは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）などの増幅方法に続いて定量的に測定することができる。その後、上記で指定した１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種の量を、同様の妊娠期間で妊娠障害のない平均的妊婦について表す同種のｍＲＮＡレベルの標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加または減少は、障害の存在や、障害が現れる危険性が高いことを示す。それにより、本発明は、非侵襲性で性別や多型性に依存しない子癇前症、胎児の染色体異常、および早期陣痛の診断のための新奇な方法を提供する。
本発明によれば、母体血サンプル中のｈＣＧ‐β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡ量を、好ましくは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）などの増幅方法に続いて定量的に測定することができる。その後、上記で指定した１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種の量を、同様の妊娠期間で妊娠障害のない平均的妊婦について表す同種のｍＲＮＡレベルの標準対照と比較する。該ｍＲＮＡレベルの増加または減少は、障害の存在や、障害が現れる危険性が高いことを示す。それにより、本発明は、非侵襲性で性別や多型性に依存しない子癇前症、胎児の染色体異常、および早期陣痛の診断のための新奇な方法を提供する。
［００４４］
同様の方法を活用し、女性の血液中のｈＣＧ‐β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、あるいはＰＬＡＣ１をコードする該ｍＲＮＡ種の１つまたはそれ以上のレベルを、平均的非妊娠女性から得て設定した対照値と比較することにより、本発明を妊娠検出に用いてもよい。
同様の方法を活用し、女性の血液中のｈＣＧ‐β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、あるいはＰＬＡＣ１をコードする該ｍＲＮＡ種の１つまたはそれ以上のレベルを、平均的非妊娠女性から得て設定した対照値と比較することにより、本発明を妊娠検出に用いてもよい。
ＩＩ． 血液サンプルの調製
Ａ． 血液サンプルの採取
［００４５］
本発明を実施する第１のステップは、本発明にかかる方法を用いて検査するのに適した妊娠期間の妊婦または、妊娠の可能性を検査しようとしている女性から血液サンプルを得ることである。先に述べたように、検査した障害および用いた該ｍＲＮＡマーカーによって、適切な妊娠期間に変えてもよい。女性からの採血は、病院あるいは診療所で通常用い
られる標準的なプロトコールに従って行われる。末梢血の適正量（例えば、５〜２０ｍｌ）を、次の調製に先立って標準操作法に従って集め、貯蔵してもよい。
Ａ． 血液サンプルの採取
［００４５］
本発明を実施する第１のステップは、本発明にかかる方法を用いて検査するのに適した妊娠期間の妊婦または、妊娠の可能性を検査しようとしている女性から血液サンプルを得ることである。先に述べたように、検査した障害および用いた該ｍＲＮＡマーカーによって、適切な妊娠期間に変えてもよい。女性からの採血は、病院あるいは診療所で通常用い
られる標準的なプロトコールに従って行われる。末梢血の適正量（例えば、５〜２０ｍｌ）を、次の調製に先立って標準操作法に従って集め、貯蔵してもよい。
Ｂ． 無細胞血液サンプルの調製
［００４６］
本発明に適切な女性の血液の血清または血漿は、周知の方法で採取することができる。例えば、女性の血液をＥＤＴＡ入りチューブ、あるいは血液凝固を防ぐＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＳＴ（ベクトン・ディキンソン、フランクリンレイクス、ニュージャージー）などの特殊な商品で採取し、そして血漿を、遠心分離により全血から採取する。一方、血清は血液凝固に続く遠心分離によって得られる。遠心分離は通常、冷却し（例えば、約４〜１０℃で）、適切な速度（例えば、１，５００〜３，０００×ｇ）で行う。ＲＮＡ抽出用の新しいチューブに移す前に、血漿または血清を再度遠心分離ステップにかけてもよい。
［００４６］
本発明に適切な女性の血液の血清または血漿は、周知の方法で採取することができる。例えば、女性の血液をＥＤＴＡ入りチューブ、あるいは血液凝固を防ぐＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＳＴ（ベクトン・ディキンソン、フランクリンレイクス、ニュージャージー）などの特殊な商品で採取し、そして血漿を、遠心分離により全血から採取する。一方、血清は血液凝固に続く遠心分離によって得られる。遠心分離は通常、冷却し（例えば、約４〜１０℃で）、適切な速度（例えば、１，５００〜３，０００×ｇ）で行う。ＲＮＡ抽出用の新しいチューブに移す前に、血漿または血清を再度遠心分離ステップにかけてもよい。
ＩＩＩ．女性の血液中のｍＲＮＡ量の定量
Ａ． ｍＲＮＡの抽出
［００４７］
生体試料からｍＲＮＡを抽出する方法が数多くある。同様に、一般的なｍＲＮＡ調製法は（例えば、サンブルックおよびラッセル、分子クローニング、実験手引書第３版、２００１年記述）、以下のＴｒｉｚｏｌ（商品名）試薬（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（商標）ダイレクトｍＲＮＡキット（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニ・キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）、およびＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）シリーズ９６００（商標）（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）など、様々な市販の試薬あるいはキットを、女性の血液サンプルからｍＲＮＡを得るために用いてもよい。これら方法を２つ以上組み合わせて用いてもよい。
Ａ． ｍＲＮＡの抽出
［００４７］
生体試料からｍＲＮＡを抽出する方法が数多くある。同様に、一般的なｍＲＮＡ調製法は（例えば、サンブルックおよびラッセル、分子クローニング、実験手引書第３版、２００１年記述）、以下のＴｒｉｚｏｌ（商品名）試薬（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（商標）ダイレクトｍＲＮＡキット（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニ・キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）、およびＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）シリーズ９６００（商標）（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）など、様々な市販の試薬あるいはキットを、女性の血液サンプルからｍＲＮＡを得るために用いてもよい。これら方法を２つ以上組み合わせて用いてもよい。
［００４８］
ＲＮＡ調製の際、混入ＤＮＡをすべて除去することが重要である。したがって、増幅および定量ステップでは、注意深くサンプルを取扱い、ＤＮＡ分解酵素により完全に処理し、適切な陰性対照を用いるべきである。
ＲＮＡ調製の際、混入ＤＮＡをすべて除去することが重要である。したがって、増幅および定量ステップでは、注意深くサンプルを取扱い、ＤＮＡ分解酵素により完全に処理し、適切な陰性対照を用いるべきである。
Ｂ． ＰＣＲに基づいたｍＲＮＡレベルの定量
［００４９］
一旦、ｍＲＮＡを女性の血液サンプルから抽出すれば、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、ｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨ）を定量してもよい。該ｍＲＮＡレベルを測定する好ましい方法は増幅に基づいた方法（例えばＰＣＲ）である。
［００４９］
一旦、ｍＲＮＡを女性の血液サンプルから抽出すれば、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、ｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨ）を定量してもよい。該ｍＲＮＡレベルを測定する好ましい方法は増幅に基づいた方法（例えばＰＣＲ）である。
［００５０］
増幅ステップの前に、目的の該ｍＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を合成しなければならない。これは、別々のステップとして逆転写により行われてもよいし、ＲＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の変法である、同種の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）として行ってもよい。リボ核酸のＰＣＲ増幅に適している方法は、ロメオとロトバルト、診断分子生物学：原理と応用、ｐｐ．４０１−４０６；パーシンガーら編集、メイヨー基金、ロチェスター、ミネソタ、１９９３年；エッガーら、臨床微生物学３３：１４４２−１４４７、１９９５年および米国特許第５，０７５，２１２号に記載されている。
増幅ステップの前に、目的の該ｍＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を合成しなければならない。これは、別々のステップとして逆転写により行われてもよいし、ＲＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の変法である、同種の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）として行ってもよい。リボ核酸のＰＣＲ増幅に適している方法は、ロメオとロトバルト、診断分子生物学：原理と応用、ｐｐ．４０１−４０６；パーシンガーら編集、メイヨー基金、ロチェスター、ミネソタ、１９９３年；エッガーら、臨床微生物学３３：１４４２−１４４７、１９９５年および米国特許第５，０７５，２１２号に記載されている。
［００５１］
ＰＣＲの一般法は当技術分野で周知であるため、ここでは詳細に説明しない。ＰＣＲ法の評価、実験計画、およびプライマー設計における原則について、例えば、イニスら、ＰＣＲ実験計画：方法および応用の手引、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９９０年を参照すること。同様に、ＰＣＲ試薬および実験計画は、ロッシュ・モレキュラー・システムズなどの商用ベンダーから入手可能である。
ＰＣＲの一般法は当技術分野で周知であるため、ここでは詳細に説明しない。ＰＣＲ法の評価、実験計画、およびプライマー設計における原則について、例えば、イニスら、ＰＣＲ実験計画：方法および応用の手引、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９９０年を参照すること。同様に、ＰＣＲ試薬および実験計画は、ロッシュ・モレキュラー・システムズなどの商用ベンダーから入手可能である。
［００５２］
通常ＰＣＲは、熱安定酵素により自動プロセスとしてよく行われる。このプロセスでは、変性領域、プライマーアニーリング領域、および伸張反応領域を通じて、反応液の温度が自動的に繰り返される。この目的に特に適した機械は市販で入手可能である。
通常ＰＣＲは、熱安定酵素により自動プロセスとしてよく行われる。このプロセスでは、変性領域、プライマーアニーリング領域、および伸張反応領域を通じて、反応液の温度が自動的に繰り返される。この目的に特に適した機械は市販で入手可能である。
［００５３］
本発明を実施するのに目的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅が通常用いられる。しかしながら、任意の既知の方法で母体血サンプル中のこれらｍＲＮＡ種を、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、および３ＳＲ（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法もしくはＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法など、各々十分に増幅する既知の任意の方法で増幅してもよいと当業者は認識するであろう。さらに最近高度に発展した分岐鎖ＤＮＡ法を母体血中のｍＲＮＡマーカー量の定量に用いてもよい。臨床サンプル中の核酸配列を直接計量するための分岐鎖ＤＮＡシグナル増幅法の評価については、ノルテ、応用臨床化学３３：２０１−２３５、１９９８年を参照のこと。
本発明を実施するのに目的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅が通常用いられる。しかしながら、任意の既知の方法で母体血サンプル中のこれらｍＲＮＡ種を、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、および３ＳＲ（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法もしくはＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法など、各々十分に増幅する既知の任意の方法で増幅してもよいと当業者は認識するであろう。さらに最近高度に発展した分岐鎖ＤＮＡ法を母体血中のｍＲＮＡマーカー量の定量に用いてもよい。臨床サンプル中の核酸配列を直接計量するための分岐鎖ＤＮＡシグナル増幅法の評価については、ノルテ、応用臨床化学３３：２０１−２３５、１９９８年を参照のこと。
Ｃ． 他の計量的手法
［００５４］
当業者に周知のように、他の標準的技法でも目的の該ｍＲＮＡを検出できる。増幅ステップは通常、検出ステップより先に行うが、増幅は本発明の該方法に必須ではない。例えば、増幅ステップにより始められたか否かにかかわらず、該ｍＲＮＡをサイズ分画（例えば、ゲル電気泳動法）により同定しもよい。周知技術（上述のサンブルックおよびラッセルの文献）に従い、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルにサンプルを流し、臭化エチジウムでラベルした後に標準対照と同じ大きさのバンドがあれば、目的ｍＲＮＡが存在することを示しており、目的ｍＲＮＡ量をバンドの強度に基づいて対照と比較してもよい。あるいは、プローブのシグナル強度に基づき、ｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、またはＧＡＰＤＨなどをコードするｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド・プローブを、同様のｍＲＮＡ種の存在を検出するためおよび、標準対照と比較してｍＲＮＡを定量するために使用できる。
［００５４］
当業者に周知のように、他の標準的技法でも目的の該ｍＲＮＡを検出できる。増幅ステップは通常、検出ステップより先に行うが、増幅は本発明の該方法に必須ではない。例えば、増幅ステップにより始められたか否かにかかわらず、該ｍＲＮＡをサイズ分画（例えば、ゲル電気泳動法）により同定しもよい。周知技術（上述のサンブルックおよびラッセルの文献）に従い、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルにサンプルを流し、臭化エチジウムでラベルした後に標準対照と同じ大きさのバンドがあれば、目的ｍＲＮＡが存在することを示しており、目的ｍＲＮＡ量をバンドの強度に基づいて対照と比較してもよい。あるいは、プローブのシグナル強度に基づき、ｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、またはＧＡＰＤＨなどをコードするｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド・プローブを、同様のｍＲＮＡ種の存在を検出するためおよび、標準対照と比較してｍＲＮＡを定量するために使用できる。
［００５５］
配列特異的プローブハイブリダイゼーションは、他種の核酸を含んでなる特定の核酸を検出する周知の方法である。十分に厳格な（ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件下では、プローブは、実質的に相補的な配列にのみ限定的にハイブリダイズする。配列ミスマッチ量を変えるため、ハイブリダイゼーション条件を緩和してもよい。
配列特異的プローブハイブリダイゼーションは、他種の核酸を含んでなる特定の核酸を検出する周知の方法である。十分に厳格な（ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件下では、プローブは、実質的に相補的な配列にのみ限定的にハイブリダイズする。配列ミスマッチ量を変えるため、ハイブリダイゼーション条件を緩和してもよい。
［００５６］
当技術分野において周知の多くのハイブリダイゼーション・フォーマットは、液相、固相、あるいは混合相ハイブリダイゼーション分析を含み、これらに限定されない。以下の文献は、様々なハイブリダイゼーション分析フォーマットの概観を提供する（シンガーら、生物技術４：２３０、１９８６年；ハーゼら、ウイルス学の方法論、ｐｐ．１８９−２２６、１９８４年；ウィルキンソン、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ウィルキンソン編集、ＩＲＬ出版、オックスフォード大学出版、オクスフォード；およびハメスと
ヒギンズ編集、核酸ハイブリダイゼーション：実践的な研究方法、ＩＲＬ出版、１９８７年）。
当技術分野において周知の多くのハイブリダイゼーション・フォーマットは、液相、固相、あるいは混合相ハイブリダイゼーション分析を含み、これらに限定されない。以下の文献は、様々なハイブリダイゼーション分析フォーマットの概観を提供する（シンガーら、生物技術４：２３０、１９８６年；ハーゼら、ウイルス学の方法論、ｐｐ．１８９−２２６、１９８４年；ウィルキンソン、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ウィルキンソン編集、ＩＲＬ出版、オックスフォード大学出版、オクスフォード；およびハメスと
ヒギンズ編集、核酸ハイブリダイゼーション：実践的な研究方法、ＩＲＬ出版、１９８７年）。
［００５７］
ハイブリダイゼーション複合体は周知の技術によって検出される。また、該検出は本発明の重大な態様ではない。ハイブリダイズされた核酸の存在を検出するために通常用いられるいくつかの方法のうちのいずれかにより、目的核酸に限定的にハイブリダイズすることができる核酸プローブ（つまり、該目的核酸のｍＲＮＡあるいは増幅されたＤＮＡ）をラベル化することができる。通常の検出方法の１つは、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、あるいは３２Ｐでラベル化したプローブ等を用いて、オートラジオグラフィーを使用する方法である。選択したアイソトープの合成し易さ、安定性および半減期を考慮した研究優先度により、放射性同位体を選択する。他のラベルは、合成物（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン）を含んでおり、その合成物は、蛍光体、化学発光剤、および酵素でラベル化したアンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）あるいは抗体に結合する。また、プローブを蛍光体、化学発光剤あるいは酵素などのラベルと直接結合することができる。要求感度、プローブとの結合のし易さ、安定性要件、および入手可能な機器により、ラベルを選択する。
ハイブリダイゼーション複合体は周知の技術によって検出される。また、該検出は本発明の重大な態様ではない。ハイブリダイズされた核酸の存在を検出するために通常用いられるいくつかの方法のうちのいずれかにより、目的核酸に限定的にハイブリダイズすることができる核酸プローブ（つまり、該目的核酸のｍＲＮＡあるいは増幅されたＤＮＡ）をラベル化することができる。通常の検出方法の１つは、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、あるいは３２Ｐでラベル化したプローブ等を用いて、オートラジオグラフィーを使用する方法である。選択したアイソトープの合成し易さ、安定性および半減期を考慮した研究優先度により、放射性同位体を選択する。他のラベルは、合成物（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン）を含んでおり、その合成物は、蛍光体、化学発光剤、および酵素でラベル化したアンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）あるいは抗体に結合する。また、プローブを蛍光体、化学発光剤あるいは酵素などのラベルと直接結合することができる。要求感度、プローブとの結合のし易さ、安定性要件、および入手可能な機器により、ラベルを選択する。
［００５８］
本発明の実施に必要なプローブおよびプライマーは、周知の技術を用いて合成およびラベル化することができる。プローブおよびプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、ニーダム−バンデバンターら、核酸研究１２：６１５９−６１６８、１９８４年に記載された自動シンセサイザーを用い、ビューケージとカルタース、四面体レター、２２：１８５９−１８６２、１９８１年で初めて記載された固相ホスホアミダイトトリエステル法によって化学的に合成してもよい。従来のアクリルアミドゲル電気泳動またはピアソンとレニエ、染色体ジャーナル、２５５：１３７−１４９、１９８３年に記載された陰イオン交換ＨＰＬＣによりオリゴヌクレオチドを精製する。
本発明の実施に必要なプローブおよびプライマーは、周知の技術を用いて合成およびラベル化することができる。プローブおよびプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、ニーダム−バンデバンターら、核酸研究１２：６１５９−６１６８、１９８４年に記載された自動シンセサイザーを用い、ビューケージとカルタース、四面体レター、２２：１８５９−１８６２、１９８１年で初めて記載された固相ホスホアミダイトトリエステル法によって化学的に合成してもよい。従来のアクリルアミドゲル電気泳動またはピアソンとレニエ、染色体ジャーナル、２５５：１３７−１４９、１９８３年に記載された陰イオン交換ＨＰＬＣによりオリゴヌクレオチドを精製する。
ＩＶ． 標準対照の設定
［００５９］
標準対照を設定するために、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦のグループを最初に選ばなければならない。これら女性は妊娠期間が同じで、その妊娠期間は本発明の方法を用いる子癇前症、胎児の染色体異常、および早期陣痛などの病気の検査に適していなければならない。同様に、標準対照は健康な非妊娠女性のグループのサンプルを用いて設定される。
［００５９］
標準対照を設定するために、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦のグループを最初に選ばなければならない。これら女性は妊娠期間が同じで、その妊娠期間は本発明の方法を用いる子癇前症、胎児の染色体異常、および早期陣痛などの病気の検査に適していなければならない。同様に、標準対照は健康な非妊娠女性のグループのサンプルを用いて設定される。
［００６０］
選ばれた妊婦、および妊婦が妊娠している胎児の健康状態は、日常使用され、よく確立した方法によって確認するべきである。その方法は、女性の血圧の監視、分娩開始の記録、およびＣＶＳもしくは羊水穿刺による胎児の遺伝子分析を含み、これらに限定されない。
選ばれた妊婦、および妊婦が妊娠している胎児の健康状態は、日常使用され、よく確立した方法によって確認するべきである。その方法は、女性の血圧の監視、分娩開始の記録、およびＣＶＳもしくは羊水穿刺による胎児の遺伝子分析を含み、これらに限定されない。
［００６１］
さらに、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦あるいは健康な非妊娠女性の選択されたグループは、グループから計算されたｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの平均値が、健康な胎児を妊娠している健康な女性、または健康な非妊娠女性の母集団の間の正常値または平均値の典型であると合理的に見なせるように、適切な体格でなければならない。望ましくは、選択されるグループは少なくとも１０人の女性を含む。
さらに、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦あるいは健康な非妊娠女性の選択されたグループは、グループから計算されたｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの平均値が、健康な胎児を妊娠している健康な女性、または健康な非妊娠女性の母集団の間の正常値または平均値の典型であると合理的に見なせるように、適切な体格でなければならない。望ましくは、選択されるグループは少なくとも１０人の女性を含む。
［００６２］
選ばれたグループの各女性の個々の値に基づき、任意の１つのタンパク質をコードするｍＲＮＡ量の平均値が設定されれば、この値を該ｍＲＮＡ種の標準とみなす。したがって、同種同量のｍＲＮＡを含むどの血液サンプルも標準対照として使用できる。同種ｍＲＮＡについて設定された平均濃度により、ｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡを含む溶液を人為的に作成し、標準対照として使用できる。
選ばれたグループの各女性の個々の値に基づき、任意の１つのタンパク質をコードするｍＲＮＡ量の平均値が設定されれば、この値を該ｍＲＮＡ種の標準とみなす。したがって、同種同量のｍＲＮＡを含むどの血液サンプルも標準対照として使用できる。同種ｍＲＮＡについて設定された平均濃度により、ｈＣＧ―β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、ＰＬＡＣ１、あるいはＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡを含む溶液を人為的に作成し、標準対照として使用できる。
［００６３］
以下の実施例は、限定されるものではなく、単に例示として提供される。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正し得る様々な重要ではないパラメーターを容易に認識するものと思われる。
以下の実施例は、限定されるものではなく、単に例示として提供される。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正し得る様々な重要ではないパラメーターを容易に認識するものと思われる。
実施例１：子癇前症の女性のｈＣＲＨ ｍＲＮＡレベルの増加
Ａ． 方法
（被験者）
［００６４］
末梢血サンプルは、香港英国皇太子病院（Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）産婦人科に通う妊婦から、告知に基づく同意および研究倫理委員会の承認を得て集めた。
Ａ． 方法
（被験者）
［００６４］
末梢血サンプルは、香港英国皇太子病院（Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）産婦人科に通う妊婦から、告知に基づく同意および研究倫理委員会の承認を得て集めた。
［００６５］
この研究の第１部では、血液サンプルは妊娠第３期の１０人の健康な妊婦から得られた。同プロジェクトの第２部では、合併症を伴わない４人の妊婦を選択的帝王切開術直前に募集した。末梢血サンプルは、分娩直前、および出産２時間後にこれら被験者から得た。研究の第３部では、２つの患者群：（ａ）１２人の子癇前症の女性および（ｂ）１０人の対照妊婦を調査した。子癇前症および対照群の妊娠期間の中央値は、それぞれ３７週および３８週であった。子癇前症は、持続性拡張期血圧上昇が、１回目が＞１１０ｍｍＨｇまたは、少なくとも４時間間隔で２回目以降が＞９０ｍｍＨｇで、高血圧症の履歴のない女性が著しいタンパク尿を呈することを基準にして定義した。タンパク尿が＞０．３ｇ／日、または少なくとも４時間ごとに集めた２つの無菌採取した中間尿標本について尿検査（ディップスティック）を行い、≧２＋であれば著しいタンパク尿と定義した。対照群は、先在内科疾患または産前合併症のない妊婦を含む。
この研究の第１部では、血液サンプルは妊娠第３期の１０人の健康な妊婦から得られた。同プロジェクトの第２部では、合併症を伴わない４人の妊婦を選択的帝王切開術直前に募集した。末梢血サンプルは、分娩直前、および出産２時間後にこれら被験者から得た。研究の第３部では、２つの患者群：（ａ）１２人の子癇前症の女性および（ｂ）１０人の対照妊婦を調査した。子癇前症および対照群の妊娠期間の中央値は、それぞれ３７週および３８週であった。子癇前症は、持続性拡張期血圧上昇が、１回目が＞１１０ｍｍＨｇまたは、少なくとも４時間間隔で２回目以降が＞９０ｍｍＨｇで、高血圧症の履歴のない女性が著しいタンパク尿を呈することを基準にして定義した。タンパク尿が＞０．３ｇ／日、または少なくとも４時間ごとに集めた２つの無菌採取した中間尿標本について尿検査（ディップスティック）を行い、≧２＋であれば著しいタンパク尿と定義した。対照群は、先在内科疾患または産前合併症のない妊婦を含む。
（血液サンプルの処理）
［００６６］
血液サンプルは、以前報告した実験計画（ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年）によって処理した。手短に言えば、血液サンプル１０ｍＬをＥＤＴＡ入りチューブに集め、４℃、１６００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、血漿を普通のポリプロピレン・チューブへ慎重に移した。血液サンプル１０ｍＬをＥＤＴＡ入りチューブに集め、４℃、１６０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを新しいポリプロピレン・チューブへ集めた。
［００６６］
血液サンプルは、以前報告した実験計画（ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年）によって処理した。手短に言えば、血液サンプル１０ｍＬをＥＤＴＡ入りチューブに集め、４℃、１６００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、血漿を普通のポリプロピレン・チューブへ慎重に移した。血液サンプル１０ｍＬをＥＤＴＡ入りチューブに集め、４℃、１６０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを新しいポリプロピレン・チューブへ集めた。
（ＲＮＡ抽出）
［００６７］
上述のンらの文献に記載されたように、血漿１．６ｍＬを、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名）ＬＳ試薬（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）２ｍＬおよびクロロホルム０．４ｍＬと混合した。その混合物を４℃、１１，９００×ｇで１５分間遠心分離し、水層を新しいチューブに移した。１容量の７０％エタノールを１容量の水層に加えた。そ
の後、その混合物をＲＮｅａｓｙミニ・カラム（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）にかけ、メーカーの推奨に従って処理した。ＲＮＡ分解酵素を含まない水３０μＬで全ＲＮＡを溶離し、−８０℃で貯蔵した。混入ＤＮＡをすべて除去するため、ＤＮＡ分解酵素処理（ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を行った。
［００６７］
上述のンらの文献に記載されたように、血漿１．６ｍＬを、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名）ＬＳ試薬（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）２ｍＬおよびクロロホルム０．４ｍＬと混合した。その混合物を４℃、１１，９００×ｇで１５分間遠心分離し、水層を新しいチューブに移した。１容量の７０％エタノールを１容量の水層に加えた。そ
の後、その混合物をＲＮｅａｓｙミニ・カラム（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）にかけ、メーカーの推奨に従って処理した。ＲＮＡ分解酵素を含まない水３０μＬで全ＲＮＡを溶離し、−８０℃で貯蔵した。混入ＤＮＡをすべて除去するため、ＤＮＡ分解酵素処理（ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を行った。
（リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ）
［００６８］
上述のンらの文献による実験計画に従い、ワンステップ・リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを全ｍＲＮＡの定量に用いた。ＣＲＨプライマー配列は５’−ＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴ−３’（フォワード）（配列番号１）および５’−ＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＧ−３’（リバース）（配列番号２）であった。また、二重ラベル化した蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号３）であった。８９ｂｐ ＣＲＨアンプリコン（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿０００７５６）を特定する高速液体クロマトグラフィーで精製された単鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ジェンセット・オリゴ、シンガポール）の連続希釈により、１×１０７コピーから１×１０１コピーまでの濃度範囲でＣＲＨ ｍＲＮＡ定量用較正曲線を作成した。ＣＲＨ ｍＲＮＡの絶対濃度をコピー／ｍＬ（血漿）と表す。ＣＲＨの較正のための合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は５’−ＧＧＡＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号４）であった。先に述べたようにしてＧＡＰＤＨ定量用較正曲線を作成し、結果をｐｇ／ｍｌ（血漿）と表した（ンら、上記）。
［００６８］
上述のンらの文献による実験計画に従い、ワンステップ・リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを全ｍＲＮＡの定量に用いた。ＣＲＨプライマー配列は５’−ＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴ−３’（フォワード）（配列番号１）および５’−ＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＧ−３’（リバース）（配列番号２）であった。また、二重ラベル化した蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号３）であった。８９ｂｐ ＣＲＨアンプリコン（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿０００７５６）を特定する高速液体クロマトグラフィーで精製された単鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ジェンセット・オリゴ、シンガポール）の連続希釈により、１×１０７コピーから１×１０１コピーまでの濃度範囲でＣＲＨ ｍＲＮＡ定量用較正曲線を作成した。ＣＲＨ ｍＲＮＡの絶対濃度をコピー／ｍＬ（血漿）と表す。ＣＲＨの較正のための合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は５’−ＧＧＡＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号４）であった。先に述べたようにしてＧＡＰＤＨ定量用較正曲線を作成し、結果をｐｇ／ｍｌ（血漿）と表した（ンら、上記）。
［００６９］
メーカーの説明書（ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ試薬セット、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）に従い、ＲＴ−ＰＣＲ反応を反応量２５μＬに設定した。蛍光プローブ（ジェンセット・オリゴ）は１００ｎＭの濃度で用いた。ＰＣＲプライマー（ジェンセット・オリゴ）は濃度２００ｎＭでＣＲＨ系およびＧＡＰＤＨ系の両方に用いた。抽出した血漿ＲＮＡ５μＬを増幅に用いた。各サンプルを二連で分析し、対応する較正曲線を各分析と平行して作成した。さらに、ｒＴｔｈポリメラーゼの代わりにＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）酵素（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）を用いることにより、サンプルがＤＮＡに対して陰性であることを確認するテストを実施した。この対照分析では増幅は認められず、それぞれのｍＲＮＡ分析の特異性を示した。すべての分析に複数の陰性の水ブランクも含めた。
メーカーの説明書（ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ試薬セット、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）に従い、ＲＴ−ＰＣＲ反応を反応量２５μＬに設定した。蛍光プローブ（ジェンセット・オリゴ）は１００ｎＭの濃度で用いた。ＰＣＲプライマー（ジェンセット・オリゴ）は濃度２００ｎＭでＣＲＨ系およびＧＡＰＤＨ系の両方に用いた。抽出した血漿ＲＮＡ５μＬを増幅に用いた。各サンプルを二連で分析し、対応する較正曲線を各分析と平行して作成した。さらに、ｒＴｔｈポリメラーゼの代わりにＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）酵素（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）を用いることにより、サンプルがＤＮＡに対して陰性であることを確認するテストを実施した。この対照分析では増幅は認められず、それぞれのｍＲＮＡ分析の特異性を示した。すべての分析に複数の陰性の水ブランクも含めた。
［００７０］
ＣＲＨおよびＧＡＰＤＨ分析に用いた温度特性は以下のとおりである、ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように、５０℃で２分間反応が始まり、その後６０℃で３０分間逆転写が続く。９５℃で５分間変性した後、９４℃で２０秒間変性しＣＲＨとＧＡＰＤＨ系用にそれぞれ５８℃と６２℃で１分間アニーリング／伸張を行うＰＣＲを４０サイクル行った。
ＣＲＨおよびＧＡＰＤＨ分析に用いた温度特性は以下のとおりである、ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように、５０℃で２分間反応が始まり、その後６０℃で３０分間逆転写が続く。９５℃で５分間変性した後、９４℃で２０秒間変性しＣＲＨとＧＡＰＤＨ系用にそれぞれ５８℃と６２℃で１分間アニーリング／伸張を行うＰＣＲを４０サイクル行った。
（統計分析）
［００７１］
統計分析はシグマ・スタット２．０３ソフトウェア（ＳＰＳＳ）を用いて行った。
［００７１］
統計分析はシグマ・スタット２．０３ソフトウェア（ＳＰＳＳ）を用いて行った。
Ｂ． 結果
（リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲの設定）
［００７２］
ＣＲＨ ＲＴ−ＰＣＲ分析の定量性能を測定するために、我々は、ＣＲＨ配列に基づいた合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの連続希釈キャリブレータを増幅するためにこの系を用いた。先のデータにより、同様の単鎖オリゴヌクレオチドが逆転写ステップの生産物を確実に模倣し、Ｔ７転写ＲＮＡを用いて得られたものと同一の較正曲線を作成することが示されている（バスティン、分子内分泌学ジャーナル２５：１６９−１９３、２０００年）。ＣＲＨ増幅系の較正曲線は２．５×１０１から１×１０６コピーまでのダイナミックレンジを示し、相関係数は０．９８３であった。これら分析の増幅ステップの感度はＣＲＨのターゲットの２５コピーを検出するのに十分であった。ＲＮＡ抽出、逆転写および増幅ステップに関するすべての分析操作法の精度を測定するため、我々は健康な妊婦（妊娠期間：３８週）の血漿サンプルから１０回分のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡサンプルをＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。ＣＲＨ ｍＲＮＡに対するこれら複製分析のＣｔ値の変動係数は、２．８％であった。リアルタイム定量ＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲ分析の開発および性能は、ンらの上記文献にすでに記載されている。
（リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲの設定）
［００７２］
ＣＲＨ ＲＴ−ＰＣＲ分析の定量性能を測定するために、我々は、ＣＲＨ配列に基づいた合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの連続希釈キャリブレータを増幅するためにこの系を用いた。先のデータにより、同様の単鎖オリゴヌクレオチドが逆転写ステップの生産物を確実に模倣し、Ｔ７転写ＲＮＡを用いて得られたものと同一の較正曲線を作成することが示されている（バスティン、分子内分泌学ジャーナル２５：１６９−１９３、２０００年）。ＣＲＨ増幅系の較正曲線は２．５×１０１から１×１０６コピーまでのダイナミックレンジを示し、相関係数は０．９８３であった。これら分析の増幅ステップの感度はＣＲＨのターゲットの２５コピーを検出するのに十分であった。ＲＮＡ抽出、逆転写および増幅ステップに関するすべての分析操作法の精度を測定するため、我々は健康な妊婦（妊娠期間：３８週）の血漿サンプルから１０回分のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡサンプルをＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。ＣＲＨ ｍＲＮＡに対するこれら複製分析のＣｔ値の変動係数は、２．８％であった。リアルタイム定量ＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲ分析の開発および性能は、ンらの上記文献にすでに記載されている。
（母体血漿中のＣＲＨ ｍＲＮＡの検出率）
［００７３］
ＣＲＨ ｍＲＮＡ転写物が母体血漿中で検出できたか検査するため、妊娠第３期（妊娠期間３７〜４１週間）の１０人の妊婦の血漿サンプルをＣＲＨ ＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した。検査したサンプルすべてＣＲＨ ｍＲＮＡが検出され、血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡの濃度の中央値は７３コピー／ｍＬ（四分位範囲：５１〜１７７）であった。陽性対照として、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡがこれらすべての血漿サンプルから検出された。
［００７３］
ＣＲＨ ｍＲＮＡ転写物が母体血漿中で検出できたか検査するため、妊娠第３期（妊娠期間３７〜４１週間）の１０人の妊婦の血漿サンプルをＣＲＨ ＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した。検査したサンプルすべてＣＲＨ ｍＲＮＡが検出され、血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡの濃度の中央値は７３コピー／ｍＬ（四分位範囲：５１〜１７７）であった。陽性対照として、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡがこれらすべての血漿サンプルから検出された。
（分娩後の母体血漿のＣＲＨ ｍＲＮＡのクリアランス）
［００７４］
母体血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡが胎子胎盤系に由来することを実証するために、我々は、４人の女性の出産前および出産２時間後の血漿をＣＲＨ ｍＲＮＡ用に分析した。それにより、ＣＲＨ ｍＲＮＡが４つすべての分娩前の母体血漿サンプルから検出された。対照的に、ＣＲＨ ｍＲＮＡは出産後のサンプルのいずれからも検出されなかった。ＧＡＰＤＨ
ｍＲＮＡはすべての血漿サンプル中で検出でき、それによりサンプルの品質を実証している。該データは図１のＡおよびＢで示される。
［００７４］
母体血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡが胎子胎盤系に由来することを実証するために、我々は、４人の女性の出産前および出産２時間後の血漿をＣＲＨ ｍＲＮＡ用に分析した。それにより、ＣＲＨ ｍＲＮＡが４つすべての分娩前の母体血漿サンプルから検出された。対照的に、ＣＲＨ ｍＲＮＡは出産後のサンプルのいずれからも検出されなかった。ＧＡＰＤＨ
ｍＲＮＡはすべての血漿サンプル中で検出でき、それによりサンプルの品質を実証している。該データは図１のＡおよびＢで示される。
（子癇前症の妊婦の血漿中のＣＲＨ ｍＲＮＡの定量分析）
［００７５］
子癇前症と対照妊婦の母体血漿中のＣＲＨ ｍＲＮＡ濃度を比較するため、妊娠期間が一致した１２人の子癇前症の女性および１０人の対照妊婦から血漿サンプルを得た。図２は、子癇前症の女性および対照妊婦の血漿中のＣＲＨ ｍＲＮＡ濃度の中央値がそれぞれ１０７０コピー／ｍＬ（四分位範囲、５３５〜１４６８）および１０２コピー／ｍＬ（四分位範囲、５１〜１５８）であったことを示す。血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡ濃度の中央値は子癇前症のほうが対照妊婦より１０．５倍高かった（マン−ホイットニー検定、Ｐ＜０．００１）。
［００７５］
子癇前症と対照妊婦の母体血漿中のＣＲＨ ｍＲＮＡ濃度を比較するため、妊娠期間が一致した１２人の子癇前症の女性および１０人の対照妊婦から血漿サンプルを得た。図２は、子癇前症の女性および対照妊婦の血漿中のＣＲＨ ｍＲＮＡ濃度の中央値がそれぞれ１０７０コピー／ｍＬ（四分位範囲、５３５〜１４６８）および１０２コピー／ｍＬ（四分位範囲、５１〜１５８）であったことを示す。血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡ濃度の中央値は子癇前症のほうが対照妊婦より１０．５倍高かった（マン−ホイットニー検定、Ｐ＜０．００１）。
Ｃ． 結論
［００７６］
血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡは、子癇前症の新しい分子マーカーである。母体血漿胎児ＤＮＡ分析と比較して、血漿ＲＮＡ分析は性別や多型性に依存していないという利点がある。血漿ＲＮＡ分析により、究極的に、まだ生まれない胎児の非侵襲性遺伝子形質発現プロファイリングが可能になるものと思われる。
［００７６］
血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡは、子癇前症の新しい分子マーカーである。母体血漿胎児ＤＮＡ分析と比較して、血漿ＲＮＡ分析は性別や多型性に依存していないという利点がある。血漿ＲＮＡ分析により、究極的に、まだ生まれない胎児の非侵襲性遺伝子形質発現プロファイリングが可能になるものと思われる。
実施例２：妊婦の血漿中のｈＰＬおよびｈＣＲＨ‐βｍＲＮＡの検出
Ａ． 方法
（被験者）
［００７７］
血液サンプル１５ｍｌは、香港英国皇太子病院（Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）産婦人科に通い、告知に基づく同意および研究倫理委員会の承認を得ている、合併症のない単生児妊娠をしている健康な女性から集めた。
Ａ． 方法
（被験者）
［００７７］
血液サンプル１５ｍｌは、香港英国皇太子病院（Ｐｒｉｎｃｅ ｏｆ Ｗａｌｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）産婦人科に通い、告知に基づく同意および研究倫理委員会の承認を得ている、合併症のない単生児妊娠をしている健康な女性から集めた。
（血液サンプルの処理）
［００７８］
血液サンプルをＥＤＴＡ入りおよび普通のチューブに集め、４℃、１６００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、血漿および血清を普通のポリプロピレン・チューブへ慎重に移した。血清サンプルはｈＰＬおよびｈＣＧ―β・タンパク質用免疫測定のために−２０℃で貯蔵した。血漿サンプル１０ｍＬをＥＤＴＡ入りチューブに集め、４℃、１６０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを新しいポリプロピレン・チューブへ集めた。胎盤組織サンプルはすべて、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）安定化溶液（アンビオン、オースティン、テキサス）中に直ちに貯蔵し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。濾過実験用に、血漿サンプルを３部に分割した：２つは０．４５μｍまたは５μｍのいずれかの細孔径のフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ；ミリポア中国リミテッド、香港）に別々に通過させた。３つめの分割物は濾過しなかった。
［００７８］
血液サンプルをＥＤＴＡ入りおよび普通のチューブに集め、４℃、１６００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、血漿および血清を普通のポリプロピレン・チューブへ慎重に移した。血清サンプルはｈＰＬおよびｈＣＧ―β・タンパク質用免疫測定のために−２０℃で貯蔵した。血漿サンプル１０ｍＬをＥＤＴＡ入りチューブに集め、４℃、１６０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを新しいポリプロピレン・チューブへ集めた。胎盤組織サンプルはすべて、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）安定化溶液（アンビオン、オースティン、テキサス）中に直ちに貯蔵し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。濾過実験用に、血漿サンプルを３部に分割した：２つは０．４５μｍまたは５μｍのいずれかの細孔径のフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ；ミリポア中国リミテッド、香港）に別々に通過させた。３つめの分割物は濾過しなかった。
（ＲＮＡ抽出）
［００７９］
血漿サンプルのために、上述のンらの実験計画に従い、血漿１．６ｍＬを、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名）ＬＳ試薬（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）２ｍＬおよびクロロホルム０．４ｍＬと混合した。胎盤組織については、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名）試薬（インビトロジェン）でサンプルを均質化し、その後メーカーの推奨に従ってクロロホルムを加えた。その混合物を４℃、１１，９００×ｇで１５分間遠心分離し、水層を新しいチューブに移した。１容量の７０％エタノールを１容量の水層に加えた。その後、その混合物をＲＮｅａｓｙミニ・カラム（ＲＮｅａｓｙミニ・キット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）にかけ、メーカーの推奨に従って処理した。ＲＮＡ分解酵素を含まない水３０μＬで全ＲＮＡを溶離し、−８０℃で貯蔵した。混入ＤＮＡをすべて除去するため、ＤＮＡ分解酵素処理を行った（ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）。
［００７９］
血漿サンプルのために、上述のンらの実験計画に従い、血漿１．６ｍＬを、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名）ＬＳ試薬（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）２ｍＬおよびクロロホルム０．４ｍＬと混合した。胎盤組織については、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名）試薬（インビトロジェン）でサンプルを均質化し、その後メーカーの推奨に従ってクロロホルムを加えた。その混合物を４℃、１１，９００×ｇで１５分間遠心分離し、水層を新しいチューブに移した。１容量の７０％エタノールを１容量の水層に加えた。その後、その混合物をＲＮｅａｓｙミニ・カラム（ＲＮｅａｓｙミニ・キット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）にかけ、メーカーの推奨に従って処理した。ＲＮＡ分解酵素を含まない水３０μＬで全ＲＮＡを溶離し、−８０℃で貯蔵した。混入ＤＮＡをすべて除去するため、ＤＮＡ分解酵素処理を行った（ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）。
（リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ）
［００８０］
上述のンらの文献に記載されたように、ワンステップ・リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを全ｍＲＮＡの定量に用いた。ｈＰＬ、ｈＣＧ‐βおよびＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲ分析用プライマーはイントロンにわたるものとした。ｈＰＬプライマー配列は５’−ＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＣ−３’（センス）（配列番号５）および５’−ＴＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧ−３’（アンチセンス）（配列番号６）であった
。また、二重ラベル化した蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＴＴＣＴＧＴＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号７）であった。ｈＣＧ‐β・プライマー配列は５’−ＣＴＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣ−３’（センス）（配列番号９）および５’−ＴＧＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣ−３’（アンチセンス）（配列番号１０）であった。また、二重ラベル化した蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号１１）であった。ｈＰＬおよびｈＣＧ‐βアンプリコンを特定する高速液体クロマトグラフィーで精製された単鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ジェンセット・オリゴ、シンガポール）の連続希釈法により、１×１０７コピーから１×１０１コピーまでの濃度範囲でｈＰＬおよびｈＣＧ‐β定量用較正曲線を作成した。これら分析は、それぞれ１００コピーのキャリブレータ・ターゲットを検出することができた。ｈＰＬおよびｈＣＧ‐βＲＮＡの絶対濃度をコピー／ｍｌ（血漿）と表した。上記データは、同様の単鎖オリゴヌクレオチドが逆転写ステップの生産物を確実に模倣し、Ｔ７転写ＲＮＡを用いて得られたもの（バスティン、スープラ）と同一の較正曲線を作成することを示した。ｈＰＬおよびｈＣＧ‐β較正のための合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ５’−ＴＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＧＴＣＧＧＡＡＴＡＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴＧＣ−３’（配列番号８）および５’−ＧＡＴＧＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＧＧＴＡＧＴＴＧＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＧＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣ−３’（配列番号１２）であった。先に上述のンらの文献に記載されたように、ＧＡＰＤＨ定量用較正曲線を作成し、結果をｐｇ／ｍｌ（血漿）と表した。
［００８０］
上述のンらの文献に記載されたように、ワンステップ・リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを全ｍＲＮＡの定量に用いた。ｈＰＬ、ｈＣＧ‐βおよびＧＡＰＤＨ ＲＴ−ＰＣＲ分析用プライマーはイントロンにわたるものとした。ｈＰＬプライマー配列は５’−ＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＣ−３’（センス）（配列番号５）および５’−ＴＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧ−３’（アンチセンス）（配列番号６）であった
。また、二重ラベル化した蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＴＴＣＴＧＴＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号７）であった。ｈＣＧ‐β・プライマー配列は５’−ＣＴＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣ−３’（センス）（配列番号９）および５’−ＴＧＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣ−３’（アンチセンス）（配列番号１０）であった。また、二重ラベル化した蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号１１）であった。ｈＰＬおよびｈＣＧ‐βアンプリコンを特定する高速液体クロマトグラフィーで精製された単鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ジェンセット・オリゴ、シンガポール）の連続希釈法により、１×１０７コピーから１×１０１コピーまでの濃度範囲でｈＰＬおよびｈＣＧ‐β定量用較正曲線を作成した。これら分析は、それぞれ１００コピーのキャリブレータ・ターゲットを検出することができた。ｈＰＬおよびｈＣＧ‐βＲＮＡの絶対濃度をコピー／ｍｌ（血漿）と表した。上記データは、同様の単鎖オリゴヌクレオチドが逆転写ステップの生産物を確実に模倣し、Ｔ７転写ＲＮＡを用いて得られたもの（バスティン、スープラ）と同一の較正曲線を作成することを示した。ｈＰＬおよびｈＣＧ‐β較正のための合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ５’−ＴＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＧＴＣＧＧＡＡＴＡＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴＧＣ−３’（配列番号８）および５’−ＧＡＴＧＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＧＧＴＡＧＴＴＧＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＧＣＧＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣ−３’（配列番号１２）であった。先に上述のンらの文献に記載されたように、ＧＡＰＤＨ定量用較正曲線を作成し、結果をｐｇ／ｍｌ（血漿）と表した。
［００８１］
メーカーの説明書（ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ試薬セット、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）に従い、ＲＴ−ＰＣＲ反応の反応量を５０μＬに設定した。蛍光プローブ（ジェンセット・オリゴ）は１００ｎＭの濃度で用いた。ＰＣＲプライマー（ジェンセット・オリゴ）はｈＰＬ用に３００ｎＭおよびｈＣＧ‐βとＧＡＰＤＨ用に２００ｎＭの濃度で用いた。抽出された血漿ＲＮＡ５μｌおよび抽出された全胎盤ＲＮＡ０．１ｎｇを増幅に用いた。各サンプルを二連で分析した。また、各分析と平行して対応する較正曲線を作成した。さらに、それらがＤＮＡに対して陰性であることを確認するため、ｒＴｔｈポリメラーゼの代わりにＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）酵素（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）を用いることにより、サンプルをテストした。この対照分析では増幅は認められず、各ｍＲＮＡ分析の特異性を示した。すべての分析に複数の陰性の水ブランクも含めた。
メーカーの説明書（ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ試薬セット、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）に従い、ＲＴ−ＰＣＲ反応の反応量を５０μＬに設定した。蛍光プローブ（ジェンセット・オリゴ）は１００ｎＭの濃度で用いた。ＰＣＲプライマー（ジェンセット・オリゴ）はｈＰＬ用に３００ｎＭおよびｈＣＧ‐βとＧＡＰＤＨ用に２００ｎＭの濃度で用いた。抽出された血漿ＲＮＡ５μｌおよび抽出された全胎盤ＲＮＡ０．１ｎｇを増幅に用いた。各サンプルを二連で分析した。また、各分析と平行して対応する較正曲線を作成した。さらに、それらがＤＮＡに対して陰性であることを確認するため、ｒＴｔｈポリメラーゼの代わりにＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）酵素（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）を用いることにより、サンプルをテストした。この対照分析では増幅は認められず、各ｍＲＮＡ分析の特異性を示した。すべての分析に複数の陰性の水ブランクも含めた。
［００８２］
ｈＰＬ、ｈＣＧ‐βおよびＧＡＰＤＨ分析に用いた温度特性は以下のとおりである、ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように、５０℃で２分間反応が始まり、その後６０℃で３０分間逆転写が続く。９５℃で５分間変性した後、９４℃で２０秒間変性し、ｈＰＬ、ｈＣＧ―βおよびＧＡＰＤＨ用にそれぞれ５６℃、５８℃および６０℃で１分間アニーリング／伸張を行うＰＣＲを４０サイクル行った。
ｈＰＬ、ｈＣＧ‐βおよびＧＡＰＤＨ分析に用いた温度特性は以下のとおりである、ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように、５０℃で２分間反応が始まり、その後６０℃で３０分間逆転写が続く。９５℃で５分間変性した後、９４℃で２０秒間変性し、ｈＰＬ、ｈＣＧ―βおよびＧＡＰＤＨ用にそれぞれ５６℃、５８℃および６０℃で１分間アニーリング／伸張を行うＰＣＲを４０サイクル行った。
［００８３］
反復してＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ分析することにより、ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡに対する分析システムのＣｔ値の変動係数がそれぞれ２．３％および３．２％であることが示された。
反復してＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ分析することにより、ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡに対する分析システムのＣｔ値の変動係数がそれぞれ２．３％および３．２％であることが示された。
（タンパク質分析）
［００８４］
放射免疫定量法（ダイアグノスティック・プロダクツ、ロサンジェルス、カリフォルニア）および電気化学発光免疫測定法（ロッシュ・モジュールＥ１７０）により母体血清のｈＰＬおよびｈＣＧタンパク質濃度をそれぞれ測定した。
［００８４］
放射免疫定量法（ダイアグノスティック・プロダクツ、ロサンジェルス、カリフォルニア）および電気化学発光免疫測定法（ロッシュ・モジュールＥ１７０）により母体血清のｈＰＬおよびｈＣＧタンパク質濃度をそれぞれ測定した。
Ｂ． 結果
（母体血中の胎盤ｍＲＮＡの検出率および安定性）
［００８５］
我々は、１０人の妊婦（妊娠期間７〜１４週間）から末梢血サンプルを得た。各被験者の血液サンプルの半分について、研究室到着と同時に直ちに血漿採取およびＲＮＡ抽出を行った（瀉血後１時間以内）。ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡ転写物が母体血漿中で
検出可能か調べるために、我々はそれぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で、抽出されたＲＮＡを分析した。我々は、１０個すべての血漿サンプルのｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡシグナルを観察した。これら結果は、胎盤のｍＲＮＡが妊婦の血漿中で実際に検出できることを実証した。陽性対照として、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡもこれらすべての血清サンプルから検出された。
（母体血中の胎盤ｍＲＮＡの検出率および安定性）
［００８５］
我々は、１０人の妊婦（妊娠期間７〜１４週間）から末梢血サンプルを得た。各被験者の血液サンプルの半分について、研究室到着と同時に直ちに血漿採取およびＲＮＡ抽出を行った（瀉血後１時間以内）。ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡ転写物が母体血漿中で
検出可能か調べるために、我々はそれぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で、抽出されたＲＮＡを分析した。我々は、１０個すべての血漿サンプルのｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡシグナルを観察した。これら結果は、胎盤のｍＲＮＡが妊婦の血漿中で実際に検出できることを実証した。陽性対照として、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡもこれらすべての血清サンプルから検出された。
［００８６］
母体血中の胎盤ｍＲＮＡの安定性を調査するため、これら各母体血サンプルの残りのアリコートを室温で２４時間放置した。その後、我々はこれらサンプルからＲＮＡを抽出し、ｈＰＬ、ｈＣＧ―β、およびＧＡＰＤＨ転写物のレベルを測定した。ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡ転写物のレベルにおいて有意差は観察されなかったが、一方、２４時間室温で放置されていたサンプルは、すぐに処理したものよりもＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが著しく高かった（ウィルコクソン検定：Ｐ＝０．７７０（ｈＰＬ調査用）；Ｐ＝０．２７５（ｈＣＧ―β調査用）；Ｐ＜０．０５（ＧＡＰＤＨ調査用））。これら結果は、血漿中のｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡが室温で２４時間以内では安定していたことを示す。
母体血中の胎盤ｍＲＮＡの安定性を調査するため、これら各母体血サンプルの残りのアリコートを室温で２４時間放置した。その後、我々はこれらサンプルからＲＮＡを抽出し、ｈＰＬ、ｈＣＧ―β、およびＧＡＰＤＨ転写物のレベルを測定した。ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡ転写物のレベルにおいて有意差は観察されなかったが、一方、２４時間室温で放置されていたサンプルは、すぐに処理したものよりもＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが著しく高かった（ウィルコクソン検定：Ｐ＝０．７７０（ｈＰＬ調査用）；Ｐ＝０．２７５（ｈＣＧ―β調査用）；Ｐ＜０．０５（ＧＡＰＤＨ調査用））。これら結果は、血漿中のｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡが室温で２４時間以内では安定していたことを示す。
（妊娠期間による血中胎盤ｍＲＮＡの変化）
［００８７］
我々は妊娠段階の異なる３９人の妊婦から血漿サンプルを得た。妊娠第３期に検査した１００％（３９／３９）のすべての血漿においてｈＰＬ ｍＲＮＡを検出した。ｈＣＧ―β ｍＲＮＡについて、妊娠第１期（妊娠期間：７週から１４週）のサンプルの検出率は１００％（１４／１４）、妊娠第２期（妊娠期間：１５週から２３週）のサンプルの検出率は４２％（５／１２）、および妊娠第３期（妊娠期間：３５週から４１週）のサンプルの検出率は７．７％（１/ １３）であった。妊娠第１期の血漿サンプル、では、ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡレベルの中央値は、それぞれ２６７１（四分位範囲：３７５〜６２１７）および１２０５コピー／ｍｌ（四分位範囲：５６６〜１９２７）であった（図３Ａおよび３Ｂ）。妊娠第２期の血漿ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡレベルの中央値は、それぞれ４７８４（四分位範囲：２６７９〜１０１３９）および０コピー／ｍＬ（四分位範囲：０から１２５）であった。妊娠第３期の血漿サンプルでは、血漿ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡレベルの中央値は、それぞれ１３８６９（四分位範囲：７８２９〜２７４３４）および０コピー／ｍＬ（四分位範囲：０から０）であった。全般的に、血中ｈＰＬおよびｈＣＧ−β ｍＲＮＡレベルは、それぞれ妊娠期間とともに増加および減少傾向を示す。対応するｈＰＬおよびｈＣＧ―βタンパク質レベルも測定した（図３Ａおよび３Ｂ）。血中ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡの妊娠期間全体における変化は、対応するタンパク質が示した傾向との類似点を示す（ピアソン相関分析、ｒ＝０．６２２；Ｐ＜０．００１（ｈＰＬ用）、およびｒ＝０．７８４；Ｐ＜０．００１（ｈＣＧ―β用）、図３Ｃおよび３Ｄ）。
［００８７］
我々は妊娠段階の異なる３９人の妊婦から血漿サンプルを得た。妊娠第３期に検査した１００％（３９／３９）のすべての血漿においてｈＰＬ ｍＲＮＡを検出した。ｈＣＧ―β ｍＲＮＡについて、妊娠第１期（妊娠期間：７週から１４週）のサンプルの検出率は１００％（１４／１４）、妊娠第２期（妊娠期間：１５週から２３週）のサンプルの検出率は４２％（５／１２）、および妊娠第３期（妊娠期間：３５週から４１週）のサンプルの検出率は７．７％（１/ １３）であった。妊娠第１期の血漿サンプル、では、ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡレベルの中央値は、それぞれ２６７１（四分位範囲：３７５〜６２１７）および１２０５コピー／ｍｌ（四分位範囲：５６６〜１９２７）であった（図３Ａおよび３Ｂ）。妊娠第２期の血漿ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡレベルの中央値は、それぞれ４７８４（四分位範囲：２６７９〜１０１３９）および０コピー／ｍＬ（四分位範囲：０から１２５）であった。妊娠第３期の血漿サンプルでは、血漿ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡレベルの中央値は、それぞれ１３８６９（四分位範囲：７８２９〜２７４３４）および０コピー／ｍＬ（四分位範囲：０から０）であった。全般的に、血中ｈＰＬおよびｈＣＧ−β ｍＲＮＡレベルは、それぞれ妊娠期間とともに増加および減少傾向を示す。対応するｈＰＬおよびｈＣＧ―βタンパク質レベルも測定した（図３Ａおよび３Ｂ）。血中ｈＰＬおよびｈＣＧ―β ｍＲＮＡの妊娠期間全体における変化は、対応するタンパク質が示した傾向との類似点を示す（ピアソン相関分析、ｒ＝０．６２２；Ｐ＜０．００１（ｈＰＬ用）、およびｒ＝０．７８４；Ｐ＜０．００１（ｈＣＧ―β用）、図３Ｃおよび３Ｄ）。
（分娩後の母体血漿からの胎盤ｍＲＮＡの急速なクリアランス）
［００８８］
我々は次に、分娩により母体血漿から胎盤ｍＲＮＡのクリアランスが生じるか調べた。妊娠第３期（調査された被験者の妊娠期間：３８〜４２週）の母体血漿中ｈＰＬ ｍＲＮＡが比較的豊富であるため、我々はターゲットとしてｈＰＬ ｍＲＮＡを選んだ。８つの分娩前血漿サンプルでは、ｈＰＬ ｍＲＮＡ転写物レベルの中央値は５０００４コピー／ｍｌであった。ｈＰＬ ｍＲＮＡは分娩２４時間後の分娩後のサンプルのいずれにおいても検出されなかった（図４Ａ）。対照として、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが出産前および出産後の血漿サンプルすべてにおいて検出された（図４Ｂ）。母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルの系統的な変化は観察されなかった（ウィルコクソン検定、Ｐ＝０．３１３）。我々は次に、さらに短い分娩後の時点（２時間）を調べた場合、血中ｈＰＬ ｍＲＮＡのクリアランスを観察できるか調べた。この２番目の調査のために募集された１３人の被験者
では、分娩前のｈＰＬ ｍＲＮＡレベルの中央値は２４４９９コピー／ｍｌであった（図４Ｃ）。１３人の女性のうち９人は、分娩２時間後で検出可能な血漿胎盤ＲＮＡがなかった。残りの被験者は、分娩後２時間以内に母体血漿中胎児ＲＮＡの約６６−９７％が消失した。我々はすべての血漿サンプル中でＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを検出し、それによりサンプルの品質を実証した（図４Ｄ）。母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルの系統的な変化は観察されなかった（ウィルコクソン検定、Ｐ＝１．０００）。
［００８８］
我々は次に、分娩により母体血漿から胎盤ｍＲＮＡのクリアランスが生じるか調べた。妊娠第３期（調査された被験者の妊娠期間：３８〜４２週）の母体血漿中ｈＰＬ ｍＲＮＡが比較的豊富であるため、我々はターゲットとしてｈＰＬ ｍＲＮＡを選んだ。８つの分娩前血漿サンプルでは、ｈＰＬ ｍＲＮＡ転写物レベルの中央値は５０００４コピー／ｍｌであった。ｈＰＬ ｍＲＮＡは分娩２４時間後の分娩後のサンプルのいずれにおいても検出されなかった（図４Ａ）。対照として、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが出産前および出産後の血漿サンプルすべてにおいて検出された（図４Ｂ）。母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルの系統的な変化は観察されなかった（ウィルコクソン検定、Ｐ＝０．３１３）。我々は次に、さらに短い分娩後の時点（２時間）を調べた場合、血中ｈＰＬ ｍＲＮＡのクリアランスを観察できるか調べた。この２番目の調査のために募集された１３人の被験者
では、分娩前のｈＰＬ ｍＲＮＡレベルの中央値は２４４９９コピー／ｍｌであった（図４Ｃ）。１３人の女性のうち９人は、分娩２時間後で検出可能な血漿胎盤ＲＮＡがなかった。残りの被験者は、分娩後２時間以内に母体血漿中胎児ＲＮＡの約６６−９７％が消失した。我々はすべての血漿サンプル中でＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを検出し、それによりサンプルの品質を実証した（図４Ｄ）。母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルの系統的な変化は観察されなかった（ウィルコクソン検定、Ｐ＝１．０００）。
実施例３：子癇前症の女性の母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの増加
［００８９］
英国皇太子病院で産婦人科に通う妊婦を、告知に基づく同意を得て募集した。実施例１で示すような基準を用いて子癇前症を診断した。
［００８９］
英国皇太子病院で産婦人科に通う妊婦を、告知に基づく同意を得て募集した。実施例１で示すような基準を用いて子癇前症を診断した。
Ａ．方法
［００９０］
実施例１に示すように、母体血サンプルをヘパリン処理したチューブに集め、処理した。実施例１に示すように、血漿ＲＮＡを抽出し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルを定量した。Ｂ．結果
［００９１］
対照群と比較した場合、子癇前症グループで母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ濃度の増加が観察された。対照および子癇前症の被験者の母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ濃度の中央値は、それぞれ７０ｐｇ／ｍｌおよび２８１ｐｇ／ｍｌであった。違いは統計的に有意である（マン−ホイットニー検定、ｐ＜０．００５）（図５）。
［００９０］
実施例１に示すように、母体血サンプルをヘパリン処理したチューブに集め、処理した。実施例１に示すように、血漿ＲＮＡを抽出し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルを定量した。Ｂ．結果
［００９１］
対照群と比較した場合、子癇前症グループで母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ濃度の増加が観察された。対照および子癇前症の被験者の母体血漿ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ濃度の中央値は、それぞれ７０ｐｇ／ｍｌおよび２８１ｐｇ／ｍｌであった。違いは統計的に有意である（マン−ホイットニー検定、ｐ＜０．００５）（図５）。
Ｃ．結論
［００９２］
血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡは、新しい非侵襲性の子癇前症マーカーである。
［００９２］
血漿ＣＲＨ ｍＲＮＡは、新しい非侵襲性の子癇前症マーカーである。
実施例４：異数体妊娠における母体血清中ｈＣＧβ ｍＲＮＡの濃度
Ａ．方法
［００９３］
２００３年１月から８月に調査した１４１人の妊婦から集めた妊娠第１期の血清サンプルのβｈＣＧ ｍＲＮＡ濃度を、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。調査した被験者全員について、胎児の染色体分析のために絨毛生検（ＣＶＳ）を実施した。母体血サンプルはすべてＣＶＳ直前に採取した。血液サンプルを普通のチューブに集め、４℃、１６００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、血清を普通のポリプロピレン・チューブに移した。直ちに血清３．２ｍＬを４ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中に貯蔵し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。先に記述されたように（ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年）、遺伝子組換ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡミニ・キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて血清ＲＮＡを１．６ｍＬの血清から抽出した。ＲＮＡ分解酵素を含まない水３０μＬで全ＲＮＡを溶離し、−８０℃で貯蔵した。混入ＤＮＡをすべて除去するため、ＤＮＡ分解酵素処理を行った（ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）。
Ａ．方法
［００９３］
２００３年１月から８月に調査した１４１人の妊婦から集めた妊娠第１期の血清サンプルのβｈＣＧ ｍＲＮＡ濃度を、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。調査した被験者全員について、胎児の染色体分析のために絨毛生検（ＣＶＳ）を実施した。母体血サンプルはすべてＣＶＳ直前に採取した。血液サンプルを普通のチューブに集め、４℃、１６００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、血清を普通のポリプロピレン・チューブに移した。直ちに血清３．２ｍＬを４ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中に貯蔵し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。先に記述されたように（ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年）、遺伝子組換ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡミニ・キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて血清ＲＮＡを１．６ｍＬの血清から抽出した。ＲＮＡ分解酵素を含まない水３０μＬで全ＲＮＡを溶離し、−８０℃で貯蔵した。混入ＤＮＡをすべて除去するため、ＤＮＡ分解酵素処理を行った（ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）。
［００９４］
ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年に記載されるように、ワンステップ・リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲをβｈＣＧ ｍＲＮＡの定量に用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応は反応量２５μＬに設定した。プライマーと蛍光プローブは、それぞれ３００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で用いた。抽出した血清ＲＮＡ６μＬを増幅に用いた。分析に用いた温度特性は以下のとおりである：ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように５０℃で２分間反応を開始し、その後６０℃で３０分間逆転写を行った。
９５℃で５分間変性した後、９４℃で２０秒間変性し、５７℃で１分間アニーリング／伸張を行うＰＣＲを４０サイクル行った。分析の精度、直線性、および精度は、ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年で設定された。合成オリゴヌクレオチドが１００コピー程度反応液中で検出できた。血清ｈＣＧβ ｍＲＮＡの濃度をコピー／ｍＬ（血清）と表した。回収実験を行わなかったので、報告された濃度（コピー／ｍＬ）は最小推定値であった。
ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年に記載されるように、ワンステップ・リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲをβｈＣＧ ｍＲＮＡの定量に用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応は反応量２５μＬに設定した。プライマーと蛍光プローブは、それぞれ３００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で用いた。抽出した血清ＲＮＡ６μＬを増幅に用いた。分析に用いた温度特性は以下のとおりである：ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように５０℃で２分間反応を開始し、その後６０℃で３０分間逆転写を行った。
９５℃で５分間変性した後、９４℃で２０秒間変性し、５７℃で１分間アニーリング／伸張を行うＰＣＲを４０サイクル行った。分析の精度、直線性、および精度は、ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年で設定された。合成オリゴヌクレオチドが１００コピー程度反応液中で検出できた。血清ｈＣＧβ ｍＲＮＡの濃度をコピー／ｍＬ（血清）と表した。回収実験を行わなかったので、報告された濃度（コピー／ｍＬ）は最小推定値であった。
［００９５］
募集した１４９人の妊婦中、１５人の女性が、２１トリソミーの胎児を妊娠し、１１人が１８トリソミーの胎児を妊娠していた。残る１２３人は正倍数性の胎児を妊娠しており、対照となった。対照の妊娠期間中央値は１２．５週（範囲：１１．２〜１４．３週）であった。２１トリソミーおよび１８トリソミーの妊娠期間中央値は、それぞれ１２．５週（範囲：１２．１〜１４．２週）および１２．３週（範囲：１１．４〜１４．１週）であった。妊娠期間の有意差は、３つの同齢集団中で観察されなかった（クラスカル−ヴァリス、Ｐ＝０．７０６）。
募集した１４９人の妊婦中、１５人の女性が、２１トリソミーの胎児を妊娠し、１１人が１８トリソミーの胎児を妊娠していた。残る１２３人は正倍数性の胎児を妊娠しており、対照となった。対照の妊娠期間中央値は１２．５週（範囲：１１．２〜１４．３週）であった。２１トリソミーおよび１８トリソミーの妊娠期間中央値は、それぞれ１２．５週（範囲：１２．１〜１４．２週）および１２．３週（範囲：１１．４〜１４．１週）であった。妊娠期間の有意差は、３つの同齢集団中で観察されなかった（クラスカル−ヴァリス、Ｐ＝０．７０６）。
Ｂ．結果
［００９６］
調査する１４９人の母体血清サンプルについてｈＣＧβ ｍＲＮＡを定量した。１４９人のうち１４０人の妊婦（９４％）の母体血清中ｈＣＧβ ｍＲＮＡを検出することができた。対照の同齢集団では、ｈＣＧβ ｍＲＮＡの検出率は９６．７％（１２３人中１１９人）であった。２１トリソミーおよび１８トリソミー同齢集団に関しては、検出率はそれぞれ９３．３％（１５人中１４人）および６３．６％（１１人中７人）であった。３つの同齢集団の血清ｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃度の中央値は、対照同齢集団が６１０８コピー／ｍＬ（四分位範囲：２８６７〜１９２４９コピー／ｍＬ）、２１トリソミー同齢集団が１３１６５コピー／ｍＬ（四分位範囲：４４０３〜２５２６５コピー／ｍＬ）、および１８トリソミー同齢集団が６５２コピー／ｍＬ（四分位範囲：０〜１１６６２コピー／ｍＬ）であった（図６）。３つの同齢集団の間のｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃度の中央値の差は、統計的に有意である（クラスカル−ヴァリス、Ｐ＝０．０２４）。多重対比較を行い、１８トリソミーと対照例の間（ダン検定、Ｐ＜０．０５）および１８トリソミーと２１トリソミー（ダン検定、Ｐ＜０．０５）の間で有意差が観察されることを示した。標本数が制限されているので、２１トリソミーおよび対照例（ダン検定、Ｐ＜０．０５）の血清ｈＣＧβ
ｍＲＮＡ濃度の間で統計的有意差は観察されなかった。しかしながら、標本数がもっと多ければ、統計的有意性の違いを確立するだろう。
［００９６］
調査する１４９人の母体血清サンプルについてｈＣＧβ ｍＲＮＡを定量した。１４９人のうち１４０人の妊婦（９４％）の母体血清中ｈＣＧβ ｍＲＮＡを検出することができた。対照の同齢集団では、ｈＣＧβ ｍＲＮＡの検出率は９６．７％（１２３人中１１９人）であった。２１トリソミーおよび１８トリソミー同齢集団に関しては、検出率はそれぞれ９３．３％（１５人中１４人）および６３．６％（１１人中７人）であった。３つの同齢集団の血清ｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃度の中央値は、対照同齢集団が６１０８コピー／ｍＬ（四分位範囲：２８６７〜１９２４９コピー／ｍＬ）、２１トリソミー同齢集団が１３１６５コピー／ｍＬ（四分位範囲：４４０３〜２５２６５コピー／ｍＬ）、および１８トリソミー同齢集団が６５２コピー／ｍＬ（四分位範囲：０〜１１６６２コピー／ｍＬ）であった（図６）。３つの同齢集団の間のｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃度の中央値の差は、統計的に有意である（クラスカル−ヴァリス、Ｐ＝０．０２４）。多重対比較を行い、１８トリソミーと対照例の間（ダン検定、Ｐ＜０．０５）および１８トリソミーと２１トリソミー（ダン検定、Ｐ＜０．０５）の間で有意差が観察されることを示した。標本数が制限されているので、２１トリソミーおよび対照例（ダン検定、Ｐ＜０．０５）の血清ｈＣＧβ
ｍＲＮＡ濃度の間で統計的有意差は観察されなかった。しかしながら、標本数がもっと多ければ、統計的有意性の違いを確立するだろう。
Ｃ．結論
［００９７］
本研究は、血中ｈＣＧβｍＲＮＡが妊娠第１期の妊婦の血清中で容易かつ確実に９４％の検出率で検出できることを確認した。これらデータは、１８トリソミー妊娠の血清ｈＣＧ βｍＲＮＡ濃度の中央値が対照妊娠の濃度の中央値の約１０％であり、統計的有意差が観察されたことを証明する。一方、これらデータは、２１トリソミー妊娠の血清ｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃度の中央値が対照妊娠の濃度の中央値の２．２の倍だったが、統計的有意差は標本数の制限により観察されなかった。そのような統計的有意差はより大規模の研究に期待される。これらデータは、１８トリソミー妊娠の妊娠第１期血清中の血中ｈＣＧβ
ｍＲＮＡ濃度は著しく減少するが、２１トリソミー妊娠の血中ｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃度は上昇することを初めて証明する。
［００９７］
本研究は、血中ｈＣＧβｍＲＮＡが妊娠第１期の妊婦の血清中で容易かつ確実に９４％の検出率で検出できることを確認した。これらデータは、１８トリソミー妊娠の血清ｈＣＧ βｍＲＮＡ濃度の中央値が対照妊娠の濃度の中央値の約１０％であり、統計的有意差が観察されたことを証明する。一方、これらデータは、２１トリソミー妊娠の血清ｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃度の中央値が対照妊娠の濃度の中央値の２．２の倍だったが、統計的有意差は標本数の制限により観察されなかった。そのような統計的有意差はより大規模の研究に期待される。これらデータは、１８トリソミー妊娠の妊娠第１期血清中の血中ｈＣＧβ
ｍＲＮＡ濃度は著しく減少するが、２１トリソミー妊娠の血中ｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃度は上昇することを初めて証明する。
［００９８］
これらデータは、異数体（例えば、１８トリソミー、２１トリソミー妊娠）予測用マーカーとしての血中ｈＣＧβ ｍＲＮＡが診断に役立つことを示す。ｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃
度は１８トリソミーと対照症例との間で重なることがこの研究で観察された。これは、１８トリソミー妊娠の唯一の予測因子として母体血清ｈＣＧβｍＲＮＡを測定する場合、感度および特異性が比較的低い可能性があることを示唆する。診断感度および特異性を高めるため、マーカー（ｈＰＬ、ｈＣＲＨ、ＫｉＳＳ−１、ＴＰＦＩ２、およびＰＬＡＣ１など）を追加してｈＣＧβと併用することができる。
これらデータは、異数体（例えば、１８トリソミー、２１トリソミー妊娠）予測用マーカーとしての血中ｈＣＧβ ｍＲＮＡが診断に役立つことを示す。ｈＣＧβ ｍＲＮＡ濃
度は１８トリソミーと対照症例との間で重なることがこの研究で観察された。これは、１８トリソミー妊娠の唯一の予測因子として母体血清ｈＣＧβｍＲＮＡを測定する場合、感度および特異性が比較的低い可能性があることを示唆する。診断感度および特異性を高めるため、マーカー（ｈＰＬ、ｈＣＲＨ、ＫｉＳＳ−１、ＴＰＦＩ２、およびＰＬＡＣ１など）を追加してｈＣＧβと併用することができる。
実施例５：母体血漿中胎盤ｍＲＮＡの同定
Ａ．方法
［００９９］
研究は２段階で行った。最初に、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイを用いて、妊娠第１期および妊娠第３期両方の胎盤組織遺伝子の発現プロファイルを系統的に同定した。この後、同定した６つの母体血漿中胎盤発現遺伝子を検出するため、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）に基づいて多くの分析を行った。調査したＲＮＡ転写物について、母体血漿中における検出率および血漿と胎盤組織とのＲＮＡ転写物レベルの相関両方を評価した。この研究で用いる胎盤と血液サンプルはすべて、香港英国皇太子病院の産婦人科に通う、合併症を伴わない健康な女性から告知に基づく同意を得て集めた。
Ａ．方法
［００９９］
研究は２段階で行った。最初に、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイを用いて、妊娠第１期および妊娠第３期両方の胎盤組織遺伝子の発現プロファイルを系統的に同定した。この後、同定した６つの母体血漿中胎盤発現遺伝子を検出するため、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）に基づいて多くの分析を行った。調査したＲＮＡ転写物について、母体血漿中における検出率および血漿と胎盤組織とのＲＮＡ転写物レベルの相関両方を評価した。この研究で用いる胎盤と血液サンプルはすべて、香港英国皇太子病院の産婦人科に通う、合併症を伴わない健康な女性から告知に基づく同意を得て集めた。
（胎盤遺伝子発現プロファイルの同定）
［０１００］
妊娠第１期（妊娠期間：９〜１２週）および妊娠第３期（妊娠期間：３８〜４０週）の各々５つの胎盤組織サンプルを、それぞれ中絶前または選択的帝王切開分娩直後の絨毛生検（ＣＶＳ）によって妊婦から得た。胎盤組織サンプルはすべて、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（アンビオン（登録商標）、オースティン、テキサス）中に直ちに貯蔵し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。末梢血６ｍＬを組織収集と同時に集め、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡチューブ（プレアナリティクス、ホンブレチコン、スイス）中に貯蔵した。
［０１００］
妊娠第１期（妊娠期間：９〜１２週）および妊娠第３期（妊娠期間：３８〜４０週）の各々５つの胎盤組織サンプルを、それぞれ中絶前または選択的帝王切開分娩直後の絨毛生検（ＣＶＳ）によって妊婦から得た。胎盤組織サンプルはすべて、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（アンビオン（登録商標）、オースティン、テキサス）中に直ちに貯蔵し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。末梢血６ｍＬを組織収集と同時に集め、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡチューブ（プレアナリティクス、ホンブレチコン、スイス）中に貯蔵した。
［０１０１］
胎盤組織の全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）と共に抽出し、ＲＮｅａｓｙミニ・キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）のメーカーの実験計画書に従い精製した。末梢血の全ＲＮＡは、メーカーの説明書に従って、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキット（プレアナリティクス、ホンブレチコン、スイス）により同梱されたＤＮＡ分解酵素処理剤（ＲＮＡ分解酵素なしのＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）と共に抽出した。
胎盤組織の全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）と共に抽出し、ＲＮｅａｓｙミニ・キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）のメーカーの実験計画書に従い精製した。末梢血の全ＲＮＡは、メーカーの説明書に従って、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキット（プレアナリティクス、ホンブレチコン、スイス）により同梱されたＤＮＡ分解酵素処理剤（ＲＮＡ分解酵素なしのＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）と共に抽出した。
［０１０２］
各サンプルについては、抽出したＲＮＡ１０マイクログラムをラベルし、メーカーの説明書に従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３Ａ配列（ヒトゲノムＵ１３３Ａ配列）（アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、各配列は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）フルイディクス・ステーション４００（アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア）中で洗浄および染色した。チップを遺伝子配列スキャナ（アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア）で走査し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ・パッケージプログラム５．０（アフィメトリックス）で解析した。
各サンプルについては、抽出したＲＮＡ１０マイクログラムをラベルし、メーカーの説明書に従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３Ａ配列（ヒトゲノムＵ１３３Ａ配列）（アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、各配列は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）フルイディクス・ステーション４００（アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア）中で洗浄および染色した。チップを遺伝子配列スキャナ（アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア）で走査し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ・パッケージプログラム５．０（アフィメトリックス）で解析した。
（リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲによる母体血漿中の胎盤発現ＲＮＡ転写物の量的評価）
［０１０３］
妊娠第１期および妊娠第３期の妊婦それぞれ１０人から胎盤および母体全血サンプルを対にして集めた。分娩前後の１０人の妊婦の末梢血サンプルも募集した。胎盤組織を上述
のように処理した。血液サンプル１２ｍＬをＥＤＴＡチューブに集め、４℃で１０分間、１６００×ｇで遠心分離した。その後、血漿を普通のポリプロピレン・チューブへ慎重に移した。血漿サンプルを４℃、１６００×ｇで１０分間再度遠心分離した。新たなポリプロピレン・チューブで上澄みを集めた。ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年で先に述べられたように、母体血漿からＲＮＡを抽出した。汚染ＤＮＡをすべて除去するため、ＤＮＡ分解酵素処理（ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を行った。
［０１０３］
妊娠第１期および妊娠第３期の妊婦それぞれ１０人から胎盤および母体全血サンプルを対にして集めた。分娩前後の１０人の妊婦の末梢血サンプルも募集した。胎盤組織を上述
のように処理した。血液サンプル１２ｍＬをＥＤＴＡチューブに集め、４℃で１０分間、１６００×ｇで遠心分離した。その後、血漿を普通のポリプロピレン・チューブへ慎重に移した。血漿サンプルを４℃、１６００×ｇで１０分間再度遠心分離した。新たなポリプロピレン・チューブで上澄みを集めた。ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年で先に述べられたように、母体血漿からＲＮＡを抽出した。汚染ＤＮＡをすべて除去するため、ＤＮＡ分解酵素処理（ＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素セット、キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を行った。
［０１０４］
本研究は、胎盤マイクロアレイの遺伝子発現プロファイルから同定された、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンβサブユニット（βｈＣＧ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、組織因子経路インヒビター２（ＴＦＰＩ２）、ＫｉＳＳ−１転移抑制遺伝子（ＫＩＳＳ１）および胎盤特異的遺伝子１（ＰＬＡＣ１）を含む６つの胎盤発現ｍＲＮＡ転写物の評価に注目した。２つの胎盤非特異的転写物、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβヘモグロビン（βグロビン）ｍＲＮＡの定量分析を対照として行った。
本研究は、胎盤マイクロアレイの遺伝子発現プロファイルから同定された、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモンβサブユニット（βｈＣＧ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、組織因子経路インヒビター２（ＴＦＰＩ２）、ＫｉＳＳ−１転移抑制遺伝子（ＫＩＳＳ１）および胎盤特異的遺伝子１（ＰＬＡＣ１）を含む６つの胎盤発現ｍＲＮＡ転写物の評価に注目した。２つの胎盤非特異的転写物、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβヘモグロビン（βグロビン）ｍＲＮＡの定量分析を対照として行った。
［０１０５］
ＧＡＰＤＨ、ｈＰＬ、ｈＣＧβ、およびＣＲＨ ｍＲＮＡ検出のためのＱＲＴ−ＰＣＲ分析は先に記載されている（ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年；ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年；およびンら、臨床化学４９：７２７−７３１、２００３年）。ＴＦＰＩ２分析用プライマー配列は５’−ＡＣＡＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣ−３’（センス）（配列番号１３）および５’−ＣＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＴＴ−３’（アンチセンス）（配列番号１４）であった。また、２重ラベル化蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号１５）であった。ＦＡＭとＴＡＭＲＡはそれぞれ６−カルボキシフルオレセインおよび６−カルボキシテトラメチルローダミンである。ＫＩＳＳ１定量用プライマー配列は５’−ＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡ−３’（センス）（配列番号１７）および５’−ＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’（アンチセンス）（配列番号１８）であった。また、２重ラベル化蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＴＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号１９）であった。ＰＬＡＣ１分析プライマー配列は５’−ＡＴＴＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡ−３’（センス）（配列番号２１）および５’−ＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＴＡＡＴＧＡＡＣＣＡ−３’（アンチセンス）（配列番号２２）であった。また、２重ラベル化蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＡＡＧＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２３）であった。β‐グロビン分析用プライマー配列は５’−ＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣ−３’（センス）（配列番号２５）および５’ＧＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＴＧ−３’（アンチセンス）（配列番号２６）であった
。また、蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＣＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２７）であった。
ＧＡＰＤＨ、ｈＰＬ、ｈＣＧβ、およびＣＲＨ ｍＲＮＡ検出のためのＱＲＴ−ＰＣＲ分析は先に記載されている（ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年；ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年；およびンら、臨床化学４９：７２７−７３１、２００３年）。ＴＦＰＩ２分析用プライマー配列は５’−ＡＣＡＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣ−３’（センス）（配列番号１３）および５’−ＣＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＴＴ−３’（アンチセンス）（配列番号１４）であった。また、２重ラベル化蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号１５）であった。ＦＡＭとＴＡＭＲＡはそれぞれ６−カルボキシフルオレセインおよび６−カルボキシテトラメチルローダミンである。ＫＩＳＳ１定量用プライマー配列は５’−ＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡ−３’（センス）（配列番号１７）および５’−ＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’（アンチセンス）（配列番号１８）であった。また、２重ラベル化蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＴＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号１９）であった。ＰＬＡＣ１分析プライマー配列は５’−ＡＴＴＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡ−３’（センス）（配列番号２１）および５’−ＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＴＡＡＴＧＡＡＣＣＡ−３’（アンチセンス）（配列番号２２）であった。また、２重ラベル化蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＡＡＧＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２３）であった。β‐グロビン分析用プライマー配列は５’−ＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣ−３’（センス）（配列番号２５）および５’ＧＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＴＧ−３’（アンチセンス）（配列番号２６）であった
。また、蛍光プローブは５’−（ＦＡＭ）ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＣＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２７）であった。
［０１０６］
バスティンら、分子内分泌学ジャーナル、２５：１６９−１９３、２０００年（ジェンセット・オリゴ、シンガポール）に記述されたように各アンプリコンに対して特異的で濃度が１×１０６コピーから１０コピーの、高速液体クロマトグラフィー精製した単鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの階段希釈により、ｈＰＬ、βｈＣＧ、ＣＲＨ、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、ＰＬＡＣ１およびβ‐グロビンｍＲＮＡ定量用較正曲線を作成した。ｈＰＬ、βｈＣＧおよびＣＲＨの較正用合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列が、先に述べられている（ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年およびンら、臨床化学４９：７２７−７３１、２００３年参照）。ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、ＰＬＡＣ１、およびβ‐グロビンキャリブレータ用合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ５’−ＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＴＴＴＧＣＣＧＧＣＴＧ−３’（配列番号１６）、５’−ＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＴＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号２０）、５’−ＡＣＡＡＡＴＴＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号２４）および５−ＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号２８）であった。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを除き、すべての転写物の絶対濃度は、胎盤組織および母体血漿それぞれについて、コピー／ｎｇ（全胎盤ＲＮＡ）およびコピー／ｍｌ（血漿）と表した。ＧＡＰＤＨ定量用の較正曲線は、ヒトの全ＲＮＡの階段希釈により作成した（ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年）。
バスティンら、分子内分泌学ジャーナル、２５：１６９−１９３、２０００年（ジェンセット・オリゴ、シンガポール）に記述されたように各アンプリコンに対して特異的で濃度が１×１０６コピーから１０コピーの、高速液体クロマトグラフィー精製した単鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの階段希釈により、ｈＰＬ、βｈＣＧ、ＣＲＨ、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、ＰＬＡＣ１およびβ‐グロビンｍＲＮＡ定量用較正曲線を作成した。ｈＰＬ、βｈＣＧおよびＣＲＨの較正用合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列が、先に述べられている（ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年およびンら、臨床化学４９：７２７−７３１、２００３年参照）。ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、ＰＬＡＣ１、およびβ‐グロビンキャリブレータ用合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ５’−ＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＴＴＴＧＣＣＧＧＣＴＧ−３’（配列番号１６）、５’−ＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＴＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号２０）、５’−ＡＣＡＡＡＴＴＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号２４）および５−ＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号２８）であった。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを除き、すべての転写物の絶対濃度は、胎盤組織および母体血漿それぞれについて、コピー／ｎｇ（全胎盤ＲＮＡ）およびコピー／ｍｌ（血漿）と表した。ＧＡＰＤＨ定量用の較正曲線は、ヒトの全ＲＮＡの階段希釈により作成した（ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年）。
［０１０７］
メーカーの説明書（ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ試薬セット、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア、アメリカ）に従い、ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を反応量５０μｌに設定した。サーマルサイクラーおよび蛍光検出器（ＡＢＩプリズム７７００、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア、アメリカ）を組み合わせてＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＧＡＰＤＨ、ｈＰＬ、βｈＣＧおよびＣＲＨ ＱＲＴ−ＰＣＲ分析用の反応条件は先に記載されている（ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年；ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３の、２００３年；およびンら、臨床化学４９：７２７−７３１、２００３年）。他の３つの転写物について、ＰＣＲプライマー（ジェンセット・オリゴ、シンガポール）は、ＴＦＰＩ２およびβ‐グロビンの場合２００ｎＭ、ＫＩＳＳ１の場合３００ｎＭ、およびＰＬＡＣ１の場合４００ｎＭの濃度で用いた。蛍光プローブ（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア、アメリカ）は、ＴＦＰＩ２の場合８０ｎＭ、ＫＩＳＳ１の場合１５０ｎＭ、ＰＬＡＣ１の場合２００ｎＭおよびβ‐グロビンの場合３００ｎＭの濃度で用いた。ＱＲＴ−ＰＣＲを行う前に、抽出した胎盤組織ＲＮＡ中の混入ＤＮＡをメーカーの推奨に従って、ＤＮａｓｅＩ（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）処理により除去した。抽出された胎盤ＲＮＡ０．４ｎｇおよび抽出した血漿ＲＮＡ６μｌを増幅に用いた。すべての分析に複数の陰性の水ブランクも含めた。
メーカーの説明書（ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ試薬セット、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア、アメリカ）に従い、ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を反応量５０μｌに設定した。サーマルサイクラーおよび蛍光検出器（ＡＢＩプリズム７７００、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア、アメリカ）を組み合わせてＱＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＧＡＰＤＨ、ｈＰＬ、βｈＣＧおよびＣＲＨ ＱＲＴ−ＰＣＲ分析用の反応条件は先に記載されている（ンら、臨床化学４８：１２１２−１２１７、２００２年；ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３の、２００３年；およびンら、臨床化学４９：７２７−７３１、２００３年）。他の３つの転写物について、ＰＣＲプライマー（ジェンセット・オリゴ、シンガポール）は、ＴＦＰＩ２およびβ‐グロビンの場合２００ｎＭ、ＫＩＳＳ１の場合３００ｎＭ、およびＰＬＡＣ１の場合４００ｎＭの濃度で用いた。蛍光プローブ（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア、アメリカ）は、ＴＦＰＩ２の場合８０ｎＭ、ＫＩＳＳ１の場合１５０ｎＭ、ＰＬＡＣ１の場合２００ｎＭおよびβ‐グロビンの場合３００ｎＭの濃度で用いた。ＱＲＴ−ＰＣＲを行う前に、抽出した胎盤組織ＲＮＡ中の混入ＤＮＡをメーカーの推奨に従って、ＤＮａｓｅＩ（インビトロジェン、カールスバード、カリフォルニア）処理により除去した。抽出された胎盤ＲＮＡ０．４ｎｇおよび抽出した血漿ＲＮＡ６μｌを増幅に用いた。すべての分析に複数の陰性の水ブランクも含めた。
［０１０８］
ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、ＰＬＡＣ１およびβ‐グロビンｍＲＮＡの分析に用いた温度特性は以下のとおりである：ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように５０℃で２分間反応が始まり、その後６０℃で３０分間逆転写が続く。９５℃で５分間変性した後、９２℃で１５秒間変性し、ＰＬＡＣ１の場合５６℃、ＴＦＰＩ２とＫＩＳＳ１の場合５７℃およびβ‐グロビンの場合５８℃で１分間アニーリング／伸張を行うＰＣＲを４０サイクル行った。
ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、ＰＬＡＣ１およびβ‐グロビンｍＲＮＡの分析に用いた温度特性は以下のとおりである：ウラシルＮ−グリコシラーゼが作用するように５０℃で２分間反応が始まり、その後６０℃で３０分間逆転写が続く。９５℃で５分間変性した後、９２℃で１５秒間変性し、ＰＬＡＣ１の場合５６℃、ＴＦＰＩ２とＫＩＳＳ１の場合５７℃およびβ‐グロビンの場合５８℃で１分間アニーリング／伸張を行うＰＣＲを４０サイクル行った。
［０１０９］
シグマ・スタット２．０３ソフトウェア（ＳＰＳＳ）を用いて統計分析を行った。
Ｂ．結果
（対になった胎盤組織および母体血サンプルの高密度オリゴヌクレオチド・アレイ分析による胎盤特異的遺伝子の同定）
［０１１０］
各組織試料についてマイクロアレイ分析を行うことにより、５つの妊娠第１期ＣＶＳおよび５つの成熟胎盤の遺伝子発現プロファイルを得た。それぞれ合計７２２６および８８
７１の遺伝子転写物が、ＣＶＳサンプルおよび成熟胎盤で発現することが分かった。正常な人の血漿中ＤＮＡは、主に造血細胞に由来することが先に報告されている（リュイら、臨床化学４８：４２１−４２７、２００２年）。それにより、多くの母体血漿中のバックグラウンド母体核酸も造血区画から生じると仮定される。本研究の最終目的が母体血漿中ＲＮＡ分子中の胎児特異的胎盤発現転写物を同定することだったので、本発明者はさらに、対になった母体全血の遺伝子発現プロファイルを得て、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ・パッケージプログラム５．０ソフトウェア（アフィメトリックス）を用いて、これらプロファイルを対応する胎盤組織の遺伝子発現プロファイルと比較した。妊娠初期の胎児特異的胎盤発現転写物は、５つすべての比較において、対応する全血サンプルと比較した場合に、その発現レベルがＣＶＳ組織内で「増加した」転写物を選ぶことにより同定した。対になった母体の全血サンプルと比較した場合、妊娠後期の胎児の特異的な転写物も成熟胎盤から同様に同定された。これら手順の後、胎盤組織および母体血細胞の両方で高度に発現した転写物は除去され、結果として、第１および第３妊娠期間についてそれぞれ１２４５および１７４３の転写物パネルが同定された。次に、これら２枚のパネル上の転写物を、５つのＣＶＳまたは５つの成熟胎盤組織マイクロアレイ形質発現シグナルの中央値に従って降順でソートした（妊娠初期および後期に高度に発現した転写物上位５０を示す補足表ＡおよびＢを参照）。結果として生じた２つのパネルには、胎児特異的マーカーとして母体血漿で検出可能な候補転写物が存在する。そのような胎児特異的マーカーの同定に用いる手法を図１に要約する。今まで母体血漿中で検出できることが分かっていた３つのｍＲＮＡ転写物（すなわち、ｈＰＬ、βｈＣＧ、およびＣＲＨ）が表中に存在するという事実は、この方法に独自の確証を与える。先の研究は、胎盤と母体血漿における遺伝子発現レベルについての情報を含んでいないため、表に同定した３つの新奇なマーカー（すなわち、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、ＰＬＡＣ１）に加え、これら３つの転写物を次の分析に含めた。胎盤組織と母体血漿との間の相対的な遺伝子発現プロファイルを比較するために、表の種々の位置から転写物を選択した。これら６つの転写物のマイクロアレイ形質発現シグナル強度の中央値を表１に要約する。最初に各転写物のシグナル強度をすべてのアレイの全体的な強度の全体的な尺度構成にてらして目標強度値５００とし、５つのＣＶＳおよび５つの出産時胎盤組織について尺度調整した転写物強度の中央値を測定した。
シグマ・スタット２．０３ソフトウェア（ＳＰＳＳ）を用いて統計分析を行った。
Ｂ．結果
（対になった胎盤組織および母体血サンプルの高密度オリゴヌクレオチド・アレイ分析による胎盤特異的遺伝子の同定）
［０１１０］
各組織試料についてマイクロアレイ分析を行うことにより、５つの妊娠第１期ＣＶＳおよび５つの成熟胎盤の遺伝子発現プロファイルを得た。それぞれ合計７２２６および８８
７１の遺伝子転写物が、ＣＶＳサンプルおよび成熟胎盤で発現することが分かった。正常な人の血漿中ＤＮＡは、主に造血細胞に由来することが先に報告されている（リュイら、臨床化学４８：４２１−４２７、２００２年）。それにより、多くの母体血漿中のバックグラウンド母体核酸も造血区画から生じると仮定される。本研究の最終目的が母体血漿中ＲＮＡ分子中の胎児特異的胎盤発現転写物を同定することだったので、本発明者はさらに、対になった母体全血の遺伝子発現プロファイルを得て、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ・パッケージプログラム５．０ソフトウェア（アフィメトリックス）を用いて、これらプロファイルを対応する胎盤組織の遺伝子発現プロファイルと比較した。妊娠初期の胎児特異的胎盤発現転写物は、５つすべての比較において、対応する全血サンプルと比較した場合に、その発現レベルがＣＶＳ組織内で「増加した」転写物を選ぶことにより同定した。対になった母体の全血サンプルと比較した場合、妊娠後期の胎児の特異的な転写物も成熟胎盤から同様に同定された。これら手順の後、胎盤組織および母体血細胞の両方で高度に発現した転写物は除去され、結果として、第１および第３妊娠期間についてそれぞれ１２４５および１７４３の転写物パネルが同定された。次に、これら２枚のパネル上の転写物を、５つのＣＶＳまたは５つの成熟胎盤組織マイクロアレイ形質発現シグナルの中央値に従って降順でソートした（妊娠初期および後期に高度に発現した転写物上位５０を示す補足表ＡおよびＢを参照）。結果として生じた２つのパネルには、胎児特異的マーカーとして母体血漿で検出可能な候補転写物が存在する。そのような胎児特異的マーカーの同定に用いる手法を図１に要約する。今まで母体血漿中で検出できることが分かっていた３つのｍＲＮＡ転写物（すなわち、ｈＰＬ、βｈＣＧ、およびＣＲＨ）が表中に存在するという事実は、この方法に独自の確証を与える。先の研究は、胎盤と母体血漿における遺伝子発現レベルについての情報を含んでいないため、表に同定した３つの新奇なマーカー（すなわち、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、ＰＬＡＣ１）に加え、これら３つの転写物を次の分析に含めた。胎盤組織と母体血漿との間の相対的な遺伝子発現プロファイルを比較するために、表の種々の位置から転写物を選択した。これら６つの転写物のマイクロアレイ形質発現シグナル強度の中央値を表１に要約する。最初に各転写物のシグナル強度をすべてのアレイの全体的な強度の全体的な尺度構成にてらして目標強度値５００とし、５つのＣＶＳおよび５つの出産時胎盤組織について尺度調整した転写物強度の中央値を測定した。
（母体血漿中の胎盤発現転写物測定のためのリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲ分析の開発）
［０１１１］
ワンステップ・リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲ分析を６回行った。それぞれ１０人の妊娠第１および第３期の妊婦からの対になった胎盤組織および血漿サンプルについて、６つの選択した胎盤ｍＲＮＡ転写物量をＱＲＴ−ＰＣＲにより定量した。すべての症例の胎盤組織から６つの転写物を検出できた。妊娠第１期および第３期両方の母体血漿中転写物の検出率および濃度の中央値を表１に要約する。これら結果は、マイクロアレイ分析で同定された、選択胎盤発現遺伝子転写物のうちかなりの割合を、確かに母体血漿中で検出できることを証明している。一般に、転写物のマイクロアレイ・シグナル強度の中央値が相対的に高ければ高いほど、母体血漿中でより容易に検出できる。一方、母体血漿濃度中央値が０コピーであれば、６つの調査した胎盤発現遺伝子の中で最も少ない転写物であることを示す（すなわち妊娠第１期のＰＬＡＣ１および妊娠第３期のｈＣＧβもしくはＰＬＡＣ１）。従って、これらデータは、発現レベルがマイクロアレイ・シグナルのしきい値を越えれば、母体血漿中で確実に胎盤発現転写物を検出できることを示唆する。
［０１１１］
ワンステップ・リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲ分析を６回行った。それぞれ１０人の妊娠第１および第３期の妊婦からの対になった胎盤組織および血漿サンプルについて、６つの選択した胎盤ｍＲＮＡ転写物量をＱＲＴ−ＰＣＲにより定量した。すべての症例の胎盤組織から６つの転写物を検出できた。妊娠第１期および第３期両方の母体血漿中転写物の検出率および濃度の中央値を表１に要約する。これら結果は、マイクロアレイ分析で同定された、選択胎盤発現遺伝子転写物のうちかなりの割合を、確かに母体血漿中で検出できることを証明している。一般に、転写物のマイクロアレイ・シグナル強度の中央値が相対的に高ければ高いほど、母体血漿中でより容易に検出できる。一方、母体血漿濃度中央値が０コピーであれば、６つの調査した胎盤発現遺伝子の中で最も少ない転写物であることを示す（すなわち妊娠第１期のＰＬＡＣ１および妊娠第３期のｈＣＧβもしくはＰＬＡＣ１）。従って、これらデータは、発現レベルがマイクロアレイ・シグナルのしきい値を越えれば、母体血漿中で確実に胎盤発現転写物を検出できることを示唆する。
（分娩後の母体血漿中胎盤発現転写物のクリアランス）
［０１１２］
もし調査した転写物が妊娠に特異的ならば、それらが分娩後の母体血漿から消失するのではないかと予想されるだろう。先の研究で示すように（ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年；およびンら、臨床化学４９：７２７−７３
１、２００３年）、ｈＰＬおよびＣＲＨ ｍＲＮＡ分子は分娩後の母体血漿から急速に消失した。母体血漿由来のＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、およびＰＬＡＣ１ ｍＲＮＡのクリアランスを調べるために、１０人の妊婦から血漿サンプルを分娩前および分娩２４時間後に採取した。分娩前の血漿サンプルでは、ＴＦＰＩ２およびＫＩＳＳ１ ｍＲＮＡ濃度の中央値はそれぞれ１１２コピー／ｍｌおよび８８コピー／ｍｌであった。両方の転写物は、分娩後の血漿サンプルのいずれからも検出されなかった（ＴＦＰＩ２およびＫＩＳＳ１ ｍＲＮＡについてはそれぞれ図８ＡおよびＢ）。ＰＬＡＣ１ ｍＲＮＡについては、転写物は、１０例中４例の分娩前血漿サンプルで検出された。一方、シグナルは、分娩後のサンプルのうちのいずれからも検出されなかった（図８Ｃ）。対照として、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが出産前および出産後の血漿サンプルすべてにおいて検出され、濃度の系統的な変化はない（ウィルコクソン検定、Ｐ＝０．５６３）。
［０１１２］
もし調査した転写物が妊娠に特異的ならば、それらが分娩後の母体血漿から消失するのではないかと予想されるだろう。先の研究で示すように（ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年；およびンら、臨床化学４９：７２７−７３
１、２００３年）、ｈＰＬおよびＣＲＨ ｍＲＮＡ分子は分娩後の母体血漿から急速に消失した。母体血漿由来のＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、およびＰＬＡＣ１ ｍＲＮＡのクリアランスを調べるために、１０人の妊婦から血漿サンプルを分娩前および分娩２４時間後に採取した。分娩前の血漿サンプルでは、ＴＦＰＩ２およびＫＩＳＳ１ ｍＲＮＡ濃度の中央値はそれぞれ１１２コピー／ｍｌおよび８８コピー／ｍｌであった。両方の転写物は、分娩後の血漿サンプルのいずれからも検出されなかった（ＴＦＰＩ２およびＫＩＳＳ１ ｍＲＮＡについてはそれぞれ図８ＡおよびＢ）。ＰＬＡＣ１ ｍＲＮＡについては、転写物は、１０例中４例の分娩前血漿サンプルで検出された。一方、シグナルは、分娩後のサンプルのうちのいずれからも検出されなかった（図８Ｃ）。対照として、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡが出産前および出産後の血漿サンプルすべてにおいて検出され、濃度の系統的な変化はない（ウィルコクソン検定、Ｐ＝０．５６３）。
（胎盤の遺伝子発現の非侵襲的プロファイリングのための母体血漿中ｍＲＮＡ分析の検証）
［０１１３］
母体血漿中の胎盤転写物レベルの測定により胎盤中の遺伝子発現レベルを間接的に測定できるという直接的な証拠を探求した。ＱＲＴ−ＰＣＲにより、ｈＰＬ、ｈＣＧβ、ＣＲＨ、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、およびＰＬＡＣ１ ｍＲＮＡについて、それぞれ１０人の妊娠第１および第３期の妊婦からの対になった胎盤組織および血漿サンプルを解析した。これら母体血漿中転写物レベルが、実際に胎盤中のそれぞれのレベルを反映しているのであれば、胎盤および母体血漿のこれら転写物の相対濃度の間に正相関がなければならないと推論する。これら転写物の相対レベルを示す１つの実践的な方法は、通常の胎盤特異的転写物に関してそれらのレベルを標準化することだろう。妊娠中は終始ｈＰＬ ｍＲＮＡが検出できたので、ｈＰＬ ｍＲＮＡを基準に選んだ（ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年）。各胎盤または血漿サンプル中の転写物レベルを対応する同一サンプル中のｈＰＬ ｍＲＮＡレベルで割ることにより、各転写物の標準レベルを算出した。母体血漿中で検出できた転写物のみを比較した。ＰＬＡＣ１およびｈＣＧβは、妊娠第１および第３期の一連の母体血漿サンプルで全く検出できなかったので、それらは各分析に含めなかった。図９Ａおよび９Ｂは、対になった胎盤および母体血漿中のｈＣＧβ、ＣＲＨ、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、およびＰＬＡＣ１ ｍＲＮＡの標準転写物レベルのプロットを示す。妊娠第１期（スピアマン相関分析、ｒ＝０．４５２、Ｐ＜０．０５）および第３期（スピアマン相関分析、ｒ＝０．６６１、Ｐ＜０．０５）両方の胎盤および母体血漿の結果の間で正相関があった。対照として、２つの胎盤非特異的ｍＲＮＡ転写物も分析した（妊娠第３期のβ‐グロビンおよび妊娠第１期および第３期両方のＧＡＰＤＨサンプル）。図９Ａおよび９Ｂを見て分かるように、これら胎盤非特異的転写物は、明らかに胎盤特異的転写物で示された相関的な傾向に従わなかった。これらデータは、胎盤の遺伝子発現を評価するために母体血漿から測定した胎盤特異的ｍＲＮＡレベルを用いることができることを示唆する。
［０１１３］
母体血漿中の胎盤転写物レベルの測定により胎盤中の遺伝子発現レベルを間接的に測定できるという直接的な証拠を探求した。ＱＲＴ−ＰＣＲにより、ｈＰＬ、ｈＣＧβ、ＣＲＨ、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、およびＰＬＡＣ１ ｍＲＮＡについて、それぞれ１０人の妊娠第１および第３期の妊婦からの対になった胎盤組織および血漿サンプルを解析した。これら母体血漿中転写物レベルが、実際に胎盤中のそれぞれのレベルを反映しているのであれば、胎盤および母体血漿のこれら転写物の相対濃度の間に正相関がなければならないと推論する。これら転写物の相対レベルを示す１つの実践的な方法は、通常の胎盤特異的転写物に関してそれらのレベルを標準化することだろう。妊娠中は終始ｈＰＬ ｍＲＮＡが検出できたので、ｈＰＬ ｍＲＮＡを基準に選んだ（ンら、米国科学アカデミー紀要、１００：４７４８−４７５３、２００３年）。各胎盤または血漿サンプル中の転写物レベルを対応する同一サンプル中のｈＰＬ ｍＲＮＡレベルで割ることにより、各転写物の標準レベルを算出した。母体血漿中で検出できた転写物のみを比較した。ＰＬＡＣ１およびｈＣＧβは、妊娠第１および第３期の一連の母体血漿サンプルで全く検出できなかったので、それらは各分析に含めなかった。図９Ａおよび９Ｂは、対になった胎盤および母体血漿中のｈＣＧβ、ＣＲＨ、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、およびＰＬＡＣ１ ｍＲＮＡの標準転写物レベルのプロットを示す。妊娠第１期（スピアマン相関分析、ｒ＝０．４５２、Ｐ＜０．０５）および第３期（スピアマン相関分析、ｒ＝０．６６１、Ｐ＜０．０５）両方の胎盤および母体血漿の結果の間で正相関があった。対照として、２つの胎盤非特異的ｍＲＮＡ転写物も分析した（妊娠第３期のβ‐グロビンおよび妊娠第１期および第３期両方のＧＡＰＤＨサンプル）。図９Ａおよび９Ｂを見て分かるように、これら胎盤非特異的転写物は、明らかに胎盤特異的転写物で示された相関的な傾向に従わなかった。これらデータは、胎盤の遺伝子発現を評価するために母体血漿から測定した胎盤特異的ｍＲＮＡレベルを用いることができることを示唆する。
Ｃ．結論
［０１１４］
母体血漿中の胎児特異的ＲＮＡマーカーの大規模パネルを系統的に同定できるようになる手法を開発した（図７）。この手法は、胎盤は母体血漿中の血中胎児ＲＮＡの重要な供給源であり、かつ正常な個体の血漿ＤＮＡの主な血液源であるという先の発見に基づいて考案した。胎盤発現転写物の大規模パネルを系統的に同定し、かつ母体血漿検出に関して胎児特異的である可能性のある転写物を選ぶため、潜在的なターゲットとして捨てられている血球で発現した遺伝子の高密度オリゴヌクレオチド・マイクロアレイを行った（補足表ＡおよびＢ）。先に同定された３つの血漿中胎盤特異的ｍＲＮＡマーカー（ｈＰＬ、ｈＣＧβ、およびＣＲＨをコードしている）はターゲットリストに存在し、転写物選択手法に独自の確証を与えた。さらに、今まで非侵襲的な出生前監視が行われていなかった、表
に同定した３つのｍＲＮＡマーカー（すなわち、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、およびＰＬＡＣ１）も、それらの胎盤組織発現レベルが一定のしきい値より高ければ、ＱＲＴ−ＰＣＲにより母体血漿中で検出できた。分娩後の母体血漿からそれらが急速に消失することは、胎盤特異性を裏づけている。これら研究結果は、母体血漿中の胎児特異的転写物の同定に用いた手法の有効性をさらに裏付ける。
［０１１４］
母体血漿中の胎児特異的ＲＮＡマーカーの大規模パネルを系統的に同定できるようになる手法を開発した（図７）。この手法は、胎盤は母体血漿中の血中胎児ＲＮＡの重要な供給源であり、かつ正常な個体の血漿ＤＮＡの主な血液源であるという先の発見に基づいて考案した。胎盤発現転写物の大規模パネルを系統的に同定し、かつ母体血漿検出に関して胎児特異的である可能性のある転写物を選ぶため、潜在的なターゲットとして捨てられている血球で発現した遺伝子の高密度オリゴヌクレオチド・マイクロアレイを行った（補足表ＡおよびＢ）。先に同定された３つの血漿中胎盤特異的ｍＲＮＡマーカー（ｈＰＬ、ｈＣＧβ、およびＣＲＨをコードしている）はターゲットリストに存在し、転写物選択手法に独自の確証を与えた。さらに、今まで非侵襲的な出生前監視が行われていなかった、表
に同定した３つのｍＲＮＡマーカー（すなわち、ＴＦＰＩ２、ＫＩＳＳ１、およびＰＬＡＣ１）も、それらの胎盤組織発現レベルが一定のしきい値より高ければ、ＱＲＴ−ＰＣＲにより母体血漿中で検出できた。分娩後の母体血漿からそれらが急速に消失することは、胎盤特異性を裏づけている。これら研究結果は、母体血漿中の胎児特異的転写物の同定に用いた手法の有効性をさらに裏付ける。
［０１１５］
胎盤特異的ｍＲＮＡ種とは対照的に、胎盤非特異的転写物（すなわち、ＧＡＰＤＨ、β−グロビン）の血漿および胎盤の標準ｍＲＮＡレベルの間には相関がなかった。胎盤特異的転写物と比較して、ＧＡＰＤＨおよびβ−グロビンｍＲＮＡは母体血漿中に相対的に多く存在した。それは、母体組織（例えば造血細胞）からの胎盤非特異的転写物が寄与していると解釈できるかもしれない。
胎盤特異的ｍＲＮＡ種とは対照的に、胎盤非特異的転写物（すなわち、ＧＡＰＤＨ、β−グロビン）の血漿および胎盤の標準ｍＲＮＡレベルの間には相関がなかった。胎盤特異的転写物と比較して、ＧＡＰＤＨおよびβ−グロビンｍＲＮＡは母体血漿中に相対的に多く存在した。それは、母体組織（例えば造血細胞）からの胎盤非特異的転写物が寄与していると解釈できるかもしれない。
［０１１６］
結論として、母体血漿中の血中胎盤ｍＲＮＡを、妊娠検出および非侵襲性の出生前遺伝子発現プロファイリングに利用できることを証明した。この研究はさらに、この目的に用いる新しい胎盤ｍＲＮＡマーカーを迅速かつ系統的に同定するためのマイクロアレイに基づいた方法を概説した。この開発は、２１トリソミーおよび子癇前症など胎盤病理学に関連していることが判明していた病気の研究および監視用の新しいマーカーの生成に特別な影響を及ぼす。さらに、この研究の結果は、妊娠に関連する病気以外に影響を及ぼす可能性がある。例えば、腫瘍関連ｍＲＮＡが癌患者の血漿／血清中で検出されたので（ローら、臨床化学４５：１２９２−１２９４、１９９９年；およびシルヴら、内臓、５０：５３０−５３４、２００２年などを参照）、新しい血漿、ＲＮＡに基づいた腫瘍マーカーを迅速に生成するために同様の方法を用いることができる。
結論として、母体血漿中の血中胎盤ｍＲＮＡを、妊娠検出および非侵襲性の出生前遺伝子発現プロファイリングに利用できることを証明した。この研究はさらに、この目的に用いる新しい胎盤ｍＲＮＡマーカーを迅速かつ系統的に同定するためのマイクロアレイに基づいた方法を概説した。この開発は、２１トリソミーおよび子癇前症など胎盤病理学に関連していることが判明していた病気の研究および監視用の新しいマーカーの生成に特別な影響を及ぼす。さらに、この研究の結果は、妊娠に関連する病気以外に影響を及ぼす可能性がある。例えば、腫瘍関連ｍＲＮＡが癌患者の血漿／血清中で検出されたので（ローら、臨床化学４５：１２９２−１２９４、１９９９年；およびシルヴら、内臓、５０：５３０−５３４、２００２年などを参照）、新しい血漿、ＲＮＡに基づいた腫瘍マーカーを迅速に生成するために同様の方法を用いることができる。
［０１１７］
本出願で引用されたすべての特許、特許出願、および他の刊行物は、参照により全体として開示に含まれる。
本出願で引用されたすべての特許、特許出願、および他の刊行物は、参照により全体として開示に含まれる。
Claims (7)
- 妊婦の子癇前症を監視、診断または予測するためのキットであって、
（ｉ）妊婦の血液中の１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種の量を定量的に測定するためのＰＣＲプライマーであって、該ｍＲＮＡ種はヒト副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｈＣＲＨ）をコードするｍＲＮＡであることを特徴とするＰＣＲプライマーと、
（ｉｉ）子癇前症ではない妊婦の血液中のｈＣＲＨをコードする平均ｍＲＮＡ量を表す標準対照と
を備えるキット。 - 前記ＰＣＲは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である請求項１に記載のキット。
- 妊婦は妊娠第１期であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
- 妊婦は妊娠第２期または第３期であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
- 妊婦の血液は無細胞であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
- 妊婦の血液は血漿であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
- 妊婦の血液は血清であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
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