JP4654432B2

JP4654432B2 - 機械受容（ＳｔｒｅｔｃｈＡｃｔｉｖａｔｅｄ）チャネルの活性化抑制剤

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Publication number: JP4654432B2
Application number: JP2004323916A
Authority: JP
Inventors: 恵治成瀬; 正博曽我部
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2004-11-08
Filing date: 2004-11-08
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2024-11-08
Also published as: JP2006131570A

Description

本発明は、機械受容（Stretch Activated；ＳＡ）チャネルの活性化を抑制するペプチドや、該ペプチド又は該ペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とするＳＡチャネルの活性化抑制剤や循環器病疾患の治療薬、前記ペプチドを標的とした循環器病疾患の判定方法、ＳＡチャネルの活性化抑制剤のスクリーニング方法に関する。

あらゆる細胞は多様な機械刺激（張力、圧力、ズリ応力など）に対して様々な応答を示すが、その仕組みにはよく分かっていない。その最大の理由は、機械刺激の受容体（センサー）の分子実体や作動原理が不明な点にある。機械受容（Stretch Activated：ＳＡ）チャネルは、細胞膜の伸展で活性化されるイオンチャネルの総称であり、１９８４年に発見された新しい型のイオンチャネル（例えば、非特許文献１参照）で、電位依存性チャネル、受容体型チャネルに次いで第３のグループを作るものと予想されている。ただし広範なイオン選択性と被刺激性（電位、リガンド刺激にも応じるものがある）を併せ持つので、遺伝子レベルでファミリーを構成するとは考えにくい。これ以外に膜伸展で不活性化されるＳＩ（Stretch Inactivated）チャネルや、膜が凹む刺激にのみ応じるＰＳ（Pressure Sensitive）チャネル、あるいはズリ応力で活性化するものもあり、これらはあわせてＭＳ（mechano−sensitive）チャネルあるいはＭＧ（Mechano-gated）チャネルと呼ばれている。

これらのチャネルのうち、現在高次構造が分かっているのは細菌のＭｓｃＬ（閉構造）（例えば、非特許文献２参照）とＭｓｃＳチャネル（開構造）（例えば、非特許文献３参照）のみであるが、点突然変異体とパッチクランプ法、あるいは分子動力学によるメカノゲーティング機構の詳細な研究が進行中である。細菌のＭＳチャネルは脂質２重膜上に再構成された状態でも伸展感受性を失わないので、膜伸展で増加する膜張力を直接感じて開口するものと考えられており、張力感知部位の同定も行われている（例えば、非特許文献４参照）（図１）。一方真核生物のＭＳチャネルとしては、酵母由来のＭｉｄ１チャネル（例えば、非特許文献５参照）をはじめとして、ＭＥＣ／ＤＥＧファミリーあるいはＴＲＰファミリーに属するチャネルが、ＭＳチャネル候補として数多く報告されている。例えば、線虫の機械受容に関連するＭＥＣ／ＤＥＧファミリーに属する膜２回貫通型イオンチャネル（例えば、非特許文献６参照）、ＢＮＣ１（Brain Sodium Channel 1）と皮膚毛包受容器の関連（例えば、非特許文献７参照）、ＴＲＰチャネルファミリーに属するＮＯＰＭＣ（no mechanreceptor potential C）とショウジョウバエの機械感覚毛との関連（例えば、非特許文献８参照）、あるいはＶＲ−ＯＡＣ（vanilloid receptor−related osmotically activated channel）と呼ばれる浸透圧感受性チャネルと皮膚や聴器における機械受容との関連などが指摘されている（例えば、非特許文献９参照）。ごく最近では、ショウジョウバエ聴覚器におけるＤｍＣＧ５８４２（ＴＲＰＶのメンバー）（例えば、非特許文献１０参照）、あるいはマウス心筋のＴＲＰＶ２（例えば、非特許文献１１参照）、さらには、マウス痛覚器（高閥値機械受容器）とＴＲＰＶ４の関連（例えば、非特許文献１２参照）など、ＴＲＰＶサブファミリーとＭＳチャネルの密接な関連を指摘する報告が増えている。

しかしながら報告されている電気生理学のデータや個人的情報によれば、これらのチャネルの異所的発現効率が良好でないため、まだ詳細な電気生理学的解析に耐えうる状況にはないようである。これまでしばしば指摘されているように、これらのチャネルの膜での発現や機能の発揮には細胞膜裏打ち骨格や骨格関連タンパク質の協力が必要なのかもしれない（例えば、非特許文献１３，１４参照）。事実ＴＲＰＶ４のＣＨＯ細胞での機能的発現量はマイクロフィラメント会合タンパク質ＭＡＰ７によって著しく増大するという報告がある（例えば、非特許文献１５参照）。これらに比較して、高等生物の各種臓器に発現する２Ｐ（ポア）ドメインＫチャネル（ＴＲＥＫ／ＴＲＡＡＫファミリー）（例えば、非特許文献１６参照）や本発明者らが最近クローニングした心筋や血管平滑筋に発現するｂｉｇＫｃａチャネル型のＳＡＫＣＡ（例えば、特許文献１、非特許文献１７，１８参照）は、発現効率が高く安定した伸展感受性を示すので、ほぼ間違いなくＭＳチャネルであると断言できる。

心臓に対する過度の伸展刺激は自動能の亢進、不整脈・細動の誘発、ＡＮＰ、ＢＮＰ分泌亢進、あるいは肥大などの様々な応答を引き起こす。心肥大については、これまでに多くの研究がなされており、ＰＫＣの下流でのＥＲＫの活性化や、Ｃａ^２＋流入などの関与が言われてきたが、ごく最近アンジオテンシンＩＩとは無関係にＡＴ１受容体が機械刺激で活性化され、その下流でＥＲＫの活性化が起こることが示された（例えば、非特許文献１９参照）。しかし肝心の機械受容体はまだ謎である。一方HansenらはＳＡチャネルと伸展誘発性不整脈の関係について興味深い結果を報告している（例えば、非特許文献２０参照）。彼らはイヌ摘出心室を用いて伸展依存性不整脈を再現性よく誘発できるモデルを調整し、その不整脈がＳＡチャネルのブロッカーであるガドリニウム（Ｇｄ^３＋）でほぼ完全に抑えられることを示した。彼らはこの結果から、不整脈の発生機序（ＳＡチャネルの活性化による脱分極で説明可能）もＧｄ^３＋による抑制も、陽イオン選択性のＳＡチャネルによって統一的に説明できるとしている。確かに心筋細胞には１２０ｐＳの陽イオン選択性のＳＡチャネルが報告されている（例えば、非特許文献２１参照）。しかしその後、心筋には数種類のカリウム選択性や陰イオン選択性のＳＡチャネルも見つかっているので（例えば、非特許文献２２〜２４参照）このように単純に割り切れるか否かは慎重な検討が必要である。また後述するように最近発見された蜘蛛毒由来のＭＳチャネルブロッカーＧｓＭＴｘ−４が伸展誘発性の心房細動に抑制効果があることが報告され注目されている（例えば、非特許文献２５参照）。心臓には伸展刺激以外にズリ応力、経壁圧力も負荷されているがその効果については研究が進んでいない。また前述したように岩田ら（例えば、非特許文献１１参照）はマウス心筋にＭＳチャネルとして働くと思われるＴＲＰＶ２の発現を報告しているが、成体の正常心筋細胞膜での発現やその機能については今後の課題である。心筋と並んで最もよく研究されてきたのは、血管内皮細胞とメカニカルストレスの関係である。内皮細胞には陽イオン選択性のＳＡチャネル（約３５ｐＳ）活性が報告されており（例えば、非特許文献２６参照）、このチャネルの活性化による細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇が確認されている（例えば、非特許文献２７参照）。拍動による血管の周期的伸展がこのチャネルを活性化して細胞形態のリモデリングや接着力の強化に寄与するという報告がある（例えば、非特許文献２８，２９参照）。血管平滑筋にも同様なＳＡチャネルが発現しており、伸展誘発性の収縮に寄与するらしい。血管内皮細胞のＳＡチャネルの分子実体の解明は多くの研究者が待ち望んでいるがいまだに謎である。また、ズリ応力に応答するＫチャネルがずいぶん以前に報告されているが（例えば、非特許文献３０参照）、その後目覚しい進展はない。

心臓は体内の中で最も活発に収縮−弛緩を繰り返す臓器で、その機能にはmechano-electric-feedbackが重要なことは以前から指摘されている。ところが肝心の機械センサーについては何も分かっていない。そこで機械センサーとして最も可能性の高いＭＳチャネルのパッチクランプ法によるスクリーニングが鶏胚から単離した培養心筋細胞を使って行われた（例えば、非特許文献２２参照）。その後我々も同様の標本を使って再スクリーニングを行い、１種類の陽イオンチャネルと４種類のＫチャネルの計５種類のＭＳチャネルを同定するとともに、最も観測頻度が高い大きなコンダクタンスのＫチャネルがカルシウム依存性ＢｉｇＫ（ＢＫ）チャネルに一致することを発見した。このチャネルはＢＫチャネルの特徴である（細胞内）Ｃａ^２＋依存性と電位依存性に加えて、伸展依存性と細胞内ＡＴＰ依存性を併せ持っているので当初、ＳＡＫca、ＡＴＰチャネルと命名した（例えば、非特許文献２３参照）。これは心筋における最初のＢＫチャネルの報告である。ＢＫチャネルはｓｉｏｌと呼ばれる遺伝子によってコードされるタンパク質であることが分かっているので（例えば、非特許文献３１参照）、本発明者らは、ＢＫチャネルに対するdegenerate primersを用いて鶏胚心筋細胞から調製したライブラリーを元にＳＡＫca、ＡＴＰチャネルの遺伝子クローニングを試みた。その結果、既知のＢＫチャネルと非常に高い相同性を持ちＣ末に５９アミノ酸残基から成るＳＴＲＥＸ（Stress-Axis-Regulated-Exon）（例えば、非特許文献３２参照）と呼ばれる特異的配列が挿入されたsplicing variant（１１７２残基）の同定に成功し、改めてＳＡＫＣＡと命名した（Ｆｉｇ．２ａ）。ここでいうstressは機械的なそれではなく、生理的・心理的ストレスの意味であり、そのようなストレスが負荷されるとこの挿入配列をもつＢＫチャネルがアップレギュレーションされることが知られている（例えば、非特許文献３３参照）。この遺伝子をＣＨＯ細胞に一過性に発現すると、心筋細胞と同様の、２８０ｐＳ（１４０ｍＭＫ）のコンダクタンスをもつＳＡＢＫｃａチャネルが再現性よく観測された。また、ＳＴＲＥＸ配列に対する抗体を作成し、免疫組織学を行ったところ心筋や血管平滑筋に強い発現が認められた。

ＢＫチャネルは一般的にチャネルの基本特性を総て備えたαサブユニットとそのゲーティング特性を修飾するβサブユニットからなり、我々がクローニングしたのは前者である。両サブユニットの共発現の結果などから、αサブユニットのみで、天然のＳＡＫｃａチャネルのほぼ総ての性質を再現できた。ここではαサブユニットのみの結果を紹介する（例えば、非特許文献１７参照）。これまでに、幾つかの細胞・組織において伸展刺激依存性のＢＫチャネルが報告されている。多くの場合、パッチ膜に共存するカルシウム透過性ＳＡチャネルの活性化に伴うカルシウム上昇で間接的にＢＫチャネルが活性化されるようであるが（例えば、非特許文献３４参照）、中には膜伸展が直接活性化するという報告もある（例えば、非特許文献３５参照）。一方、数多くの種・細胞からＢＫチャネル及びそのsplicing variant（ＳＴＲＥＸ挿入も含む）がクローン化されているが（例えば、非特許文献３６参照）、伸展感受性と分子構造の関連に関しての報告は全くない。

前記のように、本発明者らは、上記特許文献１において、細胞膜伸展刺激に対して活性化するカルシウム依存性カリウム透過性機械受容（ＳＡＫＣＡ）チャネルタンパク質の遺伝子を新規にクローニングし、その発現によって１１７２個のアミノ酸からなるＳＡチャネルタンパク質（図１参照）を取得し、このＳＡＫＣＡチャネルがＳＴＲＥＸ配列を含むこと、ＳＴＲＥＸ配列が伸展感受性に重要であることを明らかにしている。

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本発明の課題は、ＳＡチャネルの活性化を抑制するペプチドや、該ペプチド又は該ペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とするＳＡチャネルの活性化抑制剤や循環器病疾患の治療薬、前記ペプチドを標的とした循環器病疾患の判定方法、ＳＡチャネルの活性化抑制剤のスクリーニング方法を提供することにある。

ＳＴＲＥＸ配列ではシステインに富むので、まずＥＲＡ配列を中心にしたＳＴＲＥＸと未知のタンパク質Ｘとの特異的結合の可能性が考えられ、さらにその未知タンパク質Ｘとの結合がＳＡ活性の実現に必須であるという仮説が考えられる。すなわち、ＳＡＫＣＡは何らかの様式で膜の伸展を感じる必要があるのだが、これまでの２次構造予測からはその責任部位であるＳＴＲＥＸは細胞質側に露出していて、直接には細胞膜と相互作用しそうもない。そこでＣＨＯ細胞にＳＡＫＣＡと過剰なＳＴＲＥＸ−ＧＦＰ融合タンパク質を共発現させたところ、まずＳＴＲＥＸ−ＧＦＰの細胞膜局在が確認され、ＳＴＲＥＸのパートナーが膜会合タンパク質である可能性が出てきた。より重要なことは、ＳＴＲＥＸ−ＧＦＰの過剰共発現でＳＡＫＣＡのＳＡ活性が著しく阻害されたことである。すなわち、導入された過剰なＳＴＲＥＸがＳＡＫＣＡのＳＴＲＥＸと競合して未知タンパク質ＸとＳＡＫＣＡ−ＳＴＲＥＸの結合を阻害したと考えられた。さらにＳＴＲＥＸ配列のうち６７２位のＡＬＡを中心にした様々な配列の７アミノ酸ペプチドを合成し、細胞質側からのＳＡＫＣＡチャネルに対する影響を調べたところＥＲＡを含むＬＥＲＡＦＰＬ配列（配列番号１）のみがＳＡ活性を強く抑制することを見い出した。

次の課題は、謎の仲介タンパク質Ｘの同定である。本発明者らはＬＥＲＡＦＰＬ配列の阻害特異性を利用してこのタンパク質を精製できないかと考え、この配列を含む様々なペプチドを固定した親和性カラムを調整し、心筋細胞の溶解物に適用した。その結果、ＬＥＲＡＦＰＬ配列カラムに特異的に結合する分子量約５０ｋＤａのタンパク質を精製することができた。質量分析器でペプチド配列を決定したところ、仮想的タンパク質Ｘがユビキタスタンパク質の一つであるペプチド延長因子ＥＦ１−αであることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなり、機械受容（Stretch Activated）チャネルの活性化を抑制するペプチドや、（２）上記（１）記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチドや、（３）ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなるペプチド又は該ペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とする機械受容（Stretch Activated）チャネルの活性化抑制剤に関する。

さらに本発明は、（４）インビトロで、ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと被検物質とを接触させ、その結合の程度を測定・評価することを特徴とする機械受容（Stretch Activated）チャネルの活性化抑制剤のスクリーニング方法に関する。

本発明によると、ＳＡチャネルの活性化を抑制するペプチドや、該ペプチド又は該ペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とするＳＡチャネルの活性化抑制剤や循環器病疾患の治療薬、前記ペプチドを標的とした循環器病疾患の判定方法、ＳＡチャネルの活性化抑制剤のスクリーニング方法を提供することができる。

本発明のＳＡチャネルの活性化を抑制するペプチドとしては、ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチドであれば特に制限されず、かかるペプチド化学合成により調製することができる。例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のペプチドを合成することができる他、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成することもできる。

本発明の融合ペプチドとしては、上記本発明のペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。

本発明のＳＡチャネルの活性化抑制剤としては、ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなるペプチド又は該ペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とするものであれば特に制限されず、かかるＤＮＡとしては配列番号２に示される塩基配列ＣＴＴＧＡＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＴＴを具体的に例示することができる。ＳＡＫＣＡは、心筋の他、血管平滑筋、気管支平滑筋、内臓平滑筋など平滑筋細胞が存在するところに発現しており、また腎臓でも発現するといわれていることから、本発明のＳＡチャネルの活性化抑制剤は、循環器疾患以外に、呼吸器疾患や内臓疾患などの予防・治療薬として利用しうる可能性がある。

本発明の循環器疾患の予防・治療薬としては、ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなるペプチド又は該ペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とするものであれば特に制限されず、循環器病疾患としては、不整脈、高血圧症、心筋症、動脈硬化、心筋梗塞等を挙げることができる。本発明の循環器疾患の予防・治療薬として、本発明のＳＡチャネルの活性化を抑制するペプチドを有効成分として用いる場合、心臓等の細胞内にを導入する方法としては、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用いることができる。また、本発明の循環器疾患の予防・治療薬として、本発明のＳＡチャネルの活性化を抑制するペプチドをコードするＤＮＡを有効成分として用いる場合、該ＤＮＡを適当な発現ベクターにインテグレイトし、かかるベクターをエレクトロポレーション、超音波、遺伝子銃、ハイドロダイナミクスインジェクションにより細胞内に導入する方法や、デンドリティックポリリジン等の遺伝子キャリアー分子を用いて遺伝子デリバリーすることにより細胞内に本発明のペプチドを発現させることができる。また製剤とする場合、生理的食塩水アルコール等の溶剤、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の溶解補助剤、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、レシチン等の懸濁化剤、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の緩衝剤などを配合することができる。

本発明の循環器疾患の判定方法としては、ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなるペプチド部分を標的とする方法であれば特に制限されず、具体的には、ヒトＳＴＲＥＸ配列（図２参照）におけるＬＥＲＡＦＰＬ相当部分の塩基配列を調べ、該塩基配列がコードするアミノ酸配列がＬＥＲＡＦＰＬと異なっている場合、例えばＬＥＲＴＦＰＬ（配列番号３）、ＬＧＲＡＦＰＬ（配列番号４）、ＬＡＰＥＦＲＬ（配列番号５）等の変異が認められた場合、伸展感受性が低く、不整脈、低血圧症等の循環器病疾患の可能性が大きい。

本発明のＳＡチャネルの活性化抑制剤のスクリーニング方法としては、インビトロで、ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと被検物質とを接触させ、その結合の程度を測定・評価する方法であれば特に制限されず、本発明のペプチドと被検物質とを接触させ、その結合の程度を測定・評価する方法としては、ＮＨＳ活性化ＨｉＴｒａｐカラムに結合させたＬＥＲＡＦＰＬに被検物質を接触・結合させるアフィニティークロマトグラフィーを利用する方法の他、ツーハイブリッド法やファージディスプレー法等を具体的に挙げることができる。このスクリーニング方法で得られるタンパク質等の物質は、ＳＡチャネルのＳＴＲＥＸ配列におけるＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列部分と結合し、ＳＴＲＥＸ配列におけるＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列部分がＥＦ−１と結合するのを防ぐことにより、ＳＡチャネルの活性化を抑制することが可能となることから、不整脈、高血圧症、心筋症、動脈硬化、心筋梗塞等の循環器病疾患の予防・治療薬として期待できる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（ＳＴＲＥＸと膜会合コンポーネントとの相互作用）
ＳＴＲＥＸは、システイン及びプロリンに富むというその性質から他の分子と相互作用することが示唆されており（Saito et al., 1997）、従ってＳＴＲＥＸ配列が膜会合コンポーネントと直接又は間接に相互作用し、膜内の強度を感知している可能性を想定しても不自然ではない。この伸展感受性には上記の相互作用が必要であることから考察すると、ＥＲＡ配列を有するＳＴＲＥＸが過剰になると結合パートナーを占有することになり、その結果、ＳＡＫ_ＣａＣ内ＳＴＲＥＸのパートナーとの結合がブロックされる（図３Ａ、図式）。かかる仮説を実証するために本発明者らは、ＳＡＫ_Ｃａ発現ＣＨＯ細胞において、トリＳＴＲＥＸ（ＥＲＡを含む）−ＥＧＦＰ融合タンパク質を過剰発現させた。図３Ａに示すように、ＧＦＰシグナルは膜で検出され、ＳＴＲＥＸ−ＧＦＰが細胞質膜に局在することが示唆された。さらに興味深いことに、ＳＡＫ_ＣａＣの伸展感受性は顕著に抑制されており、ＳＡＫ_ＣａＣの伸展感受性には、ＳＴＲＥＸ配列及び数種の膜会合タンパク質との相互作用が重要であることが示唆された（図３Ｂ）。このことは、切除したinside-outパッチにＬＥＲＡＦＰＬペプチドのＳＴＲＥＸ断片を塗布すると、ＳＡＫ_ＣａＣの伸展感受性が顕著に抑制される一方で、ＬＥＲＴＦＰＬ、ＬＧＲＡＦＰＬ及びＬＡＥＦＲＬ等、他のペプチドを用いても伸展感受性は抑制されなかったとの観察結果によって裏付けられている（図４Ａ．Ｂ）。

（ＳＴＲＥＸ結合するタンパク質の単離と質量分析器を用いての同定）
伸展感受性には、ＳＴＲＥＸと未知のコンポーネントが会合することが重要であることが示唆されることから、本発明者らは、ＳＴＲＥＸペプチド及びトリ心臓抽出液を用いてインビトロ結合分析を行った。製造者マニュアルに従い、ＳＴＲＥＸペプチド（ＬＥＲＡＦＰＬ、ＬＥＲＴＦＰＬ、ＬＧＲＡＦＰＬ、ＬＡＰＥＦＲＬ；各１ｍｇ）を、ＮＨＳ活性化ＨｉＴｒａｐカラム（１ｍｌ）（Amersham Biosciences社製）に交差結合させた。１％ＮＰ４０、２５ｍＭのトリス、プロテイナーゼインヒビター（Roche社製、complete, Mini, Protease inhibitor cocktail tablets）を含む溶解緩衝液（ｐＨ７．４０）において、４℃でトリ胚心臓（生後１２日（１２Ｄ））をホモジェナイズし、その後、１５０００×ｇ、４℃、２０分間の条件下で遠心分離にかけた。上清（タンパク質１ｍｇ）を上記カラムに適用し、１％ＮＰ４０、１００ｍＭのグリシンを含む溶液（ｐＨ３．０）を用いて結合したタンパク質を溶出させた。

溶出タンパク質を直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、シルバー染色又はクマシーブルー染色を施し、質量分析器による分析及びin-gelタンパク質分解に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の結果、トリＳＴＲＥＸにおいてのみ、明確な分子量（４２ｋＤａ及び５０ｋＤａ）を有するバンドが認められ、マウス、ウサギ及び混合型ＳＴＲＥＸでは認められなかった（図５Ａ、左図）。ゲル内の染色タンパク質のバンドを清潔なレーザー刃で切断し、ゲル内のタンパク質を１０ｍＭのＤＴＴで減少させ、１０ｍＭの重炭酸アンモニウム中において１００ｍＭのヨードアセタミドで修飾した。１０ｍＭの重炭酸アンモニウム中において５０％アセトニトリルでゲル片を処理し、タンパク質の染色を除去し、ゲル片を乾燥させた。乾燥したゲル片を、３００ｎｇのトリプシン（Promega社製）を含む１０ｍＭの重炭酸アンモニウムで再水和させた。かかるゲル片を一晩３７℃でインキュベートし、得られたペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリルを用いて回収した。

上記トリプシンペプチドを溶解させ、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソース及びＭＡＧＩＣ２００２液体クロマトグラフィーシステム（Michrom BioResources社製）を備えたＬＣＱイオントラップ（ＩＴ）質量分析器（ThermoFinnigan社製）にかけて分析した。質量分析データを用い、マスコットサーチエンジンを利用して、タンパク質データベースを検索した。すなわち、質量分析アプローチと配列データベース検索法を組み合わせ、トリＳＴＲＥＸ（ＬＥＲＡＦＰＬ）と会合するタンパク質を分析した。スペクトラムにおけるシグナルは、ゲル中トリプシン消化によってタンパク質から産生したトリプシンペプチドに相当するものだった。測定したペプチド質量を用い、類似のトリプシンペプチド質量マップをもたらすタンパク質を求めて配列データベース（マスコットサーチエンジン；Mascot search engines）を検索した。４２ｋＤａのタンパク質はアクチンであると同定され、５０ｋＤａのタンパク質は、ＥＦ−１αであると同定された。抗ＥＦ−１α抗体を用いた免疫ブロッティングの結果、５０ｋＤａの精製タンパク質がＥＦ−１であることがさらに確認された（図５Ａ、右図）。

（ｓｉＲＮＡトランスフェクション及び細胞培養）
ＳＡＫ_ＣａＣの伸展感受性におけるＥＦ−１の役割を調べるために、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用い、培養トリ胚心筋におけるＥＦ−１の発現を消失させた。ＥＦ−１をコードするｍＲＮＡのコード領域と、コントロールとしての蛍ルシフェラーゼをそれぞれ標的とするｓｉＲＮＡデュプレックス（duplex）における機械感受性の抑制能を調べた。ＥＦ−１（Gallus gallus elongation factor 1 alpha）ｃＤＮＡ配列（アクセッションナンバー：Ｌ００６７７）に対するトリＥＦ−１のｓｉＲＮＡは、B-Bridge International Inc.（San Jose, CA）が設計したもので、Dharmaconで合成した。実験で使用した配列は以下のとおり：５’−ＣＣＡＵＧＵＧＵＧＵＵＧＡＧＡＧＣＵＵ−３’（ＯＲＦ中の１２２６−１２４４ヌクレオチド）。また、標的配列の位置は、開始コドンの１番目のヌクレオチドとの関連で決定した。蛍（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子のｓｉＲＮＡをコントロールとした。このｓｉＲＮＡを、ｓｉＦＥＣＴＯＲ（B-Bridge International Inc.社製）を用いて培養トリ胚心筋細胞にトランスフェクトした。

標的タンパク質が実際に前記胚心筋細胞から除去されたことを明らかにするために、抗ＥＦ−１α抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。図５Ｂに示すように、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡデュプレックスで処理したコントロール細胞の場合と比べ、ＥＦ−１αに対するｓｉＲＮＡデュプレックスを用いた場合にＥＦ−１αタンパク質の発現は顕著に減少した。アクチンの発現はｓｉＲＮＡ処理によって影響されなかった。

ｓｉＲＮＡ−ルシフェラーゼで処理した細胞におけるＳＡＫ_ＣａＣの伸展感受性は影響を受けなかったが、ｓｉＲＮＡ−ＥＦ−１αで処理した細胞における伸展感受性は顕著に抑制された（図５Ｃ）。

以上の結果から、ＳＡＫ_ＣａＣの伸展感受性にＥＦ−１αが重要な役割を担っていることが示唆される。

トリ心臓由来のＳＡＫＣＡチャネルの推定アミノ酸配列を示し、枠内はＳＴＲＥＸ配列を示す図である。トリ、ヒト、マウス及びウサギの各ＳＴＲＥＸのアミノ酸配列を示す図である。黒文字は分岐を示す図である。ＳＴＲＥＸが膜結合コンポーネントに結合することの重要性を示す図である。（Ａ）ＳＡＫ_Ｃａ及びＳＴＲＥＸ−ＧＦＰで共トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の共焦点蛍光画像（左）及びＤＩＣ画像（右）である。（Ｂ）ＳＴＲＥＸ−ＧＦＰの共存下又は不在下におけるinside-outパッチでのＳＡＫ_Ｃａの開口可能性を示す図である（−４０ｍｍＨｇ、＋１０ｍＶ、ｎ＝６）。（Ａ）１ｍｇ／ｍｌのＳＴＲＥＸペプチド（ＬＥＲＡＦＰＬ：−４０ｍＶ）の塗布前（左）及び塗布後（右）におけるＳＡＫ_Ｃａ発現ＣＨＯ細胞から単離したinside-outパッチにみるチャネル活性の代表的な単一チャネルのトレースを示す図である。（Ｂ）１ｍｇ／ｍｌのＳＴＲＥＸペプチド各種及び混合ペプチド配列の塗布前（コントロール）及び塗布後におけるＳＡＫ_Ｃａの開口可能性を示す（−４０ｍｍＨｇ、＋１０ｍＶ、ｎ＝６）。ＳＴＲＥＸ結合タンパク質の同定を示す図である。（Ａ）トリ胚心臓抽出液のＳＴＲＥＸ結合タンパク質のシルバー染色（左）、及び抗ＥＦ−１αを用いたウエスタンブロッティング（右）を示す代表的な図である。（Ｂ）ｓｉＲＮＡデュプレックスによりＥＦ−１αが消失することを示す図である。ウエスタンブロッティングの結果、トリ胚心筋ではＥＦ−１αが効率よく消失することが示されたが、アクチンは消失しなかった。（Ｃ）ｓｉＲＮＡデュプレックスによりＥＦ−１αを消失させた結果、ＳＡＫ_Ｃａの伸展感受性が消失した（−４０ｍｍＨｇ、＋１０ｍＶ、ｎ＝３）。

Claims

ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなり、機械受容（Stretch Activated）チャネルの活性化を抑制するペプチド。
請求項１記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド。
ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなるペプチド又は該ペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とする機械受容（Stretch Activated）チャネルの活性化抑制剤。
インビトロで、ＬＥＲＡＦＰＬに示されるアミノ酸配列からなるペプチドと被検物質とを接触させ、その結合の程度を測定・評価することを特徴とする機械受容（Stretch Activated）チャネルの活性化抑制剤のスクリーニング方法。