JP4798663B2 - 新規血管新生抑制因子 - Google Patents

Description

本発明は、血管新生抑制剤及び血管新生誘導剤に関する。また、本発明は、血管新生抑制剤及び血管新生誘導剤のスクリーニング方法並びにキットに関する。

血管新生とは、動物の組織又は器官において既存の細静脈、毛細血管からの血管内皮細胞の遊走、増殖及び管腔形成により新しい血管脈が生成される現象をいう。一般に、胎児期、幼児期及び成長期には新たな血管が形成され伸長するが、成長期を過ぎると体内で血管新生が起こる場面は限定される。すなわち、血管新生は黄体形成、排卵、胚発生、胎盤形成等の通常の生理条件下で観察され、損傷の治癒、炎症の修復過程でも起こる。このように、血管新生は健常な状態で発生し、組織の回復に重要な役割を担っている。また、心筋梗塞などの虚血性心疾患や閉塞性動脈硬化症、バージャー病などの末梢性血管疾患の治療にも血管新生の促進は有効であることが明らかになっている。その他、骨髄細胞の移植によって血管新生を誘導し、動脈硬化の治療を行ったという報告もなされている（非特許文献１参照）。血管新生を誘導することはこれら疾患の予防及び治療に重要である。

逆に、糖尿病等多くの慢性疾患において毛細血管が増加して組織に重篤な損傷をもたらすことも知られている。また、悪性腫瘍が増殖する際には、腫瘍細胞の増殖に必要な栄養や酸素を得るために腫瘍細胞が自ら血管新生促進因子による血管の新生を誘導し、新生された血管を通して栄養分を得て腫瘍細胞はさらに増殖する。他の臓器や部位への転移も血管新生を誘導し、血流にのって腫瘍細胞が移動する。このように、血管新生が病因になり又は病態の悪化に関与している疾患として、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は悪性新生物等が報告されている（非特許文献２参照）。血管新生を阻害することはこれら疾患の予防及び治療に重要である。

ＡＫ０２２５６７（配列番号：１）、ＢＣ０５１８５６（配列番号：３）、ＢＣ０５３８３６（配列番号：５）及びＢＣ０２８１９４（配列番号：７）は、コードされているタンパク質と共にＧｅｎＢａｎｋのＤａｔａｂａｓｅに公開されている。しかしながら、これらの遺伝子と血管新生との関連についての報告はない。

Tateishi-Yuyama, Eら、ザ ランセット（The LANCET）、３６０巻、４２７−４３５頁（２００２） Carmeliet, Pら、ネイチャー（Nature）、４０７巻、２４９−２５７頁（２０００）

本発明は新規血管抑制因子に関連する血管新生抑制剤及び血管新生誘導剤を提供する。また、新規血管新生抑制因子を用いた血管新生抑制剤及び血管新生誘導剤の効率的なスクリーニング方法並びに前記スクリーニング方法を簡便かつ迅速に行ないうるスクリーニング用キットを提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、ＡＫ０２２５６７タンパク質が新規な血管新生抑制因子であることを見出した。また、ＡＫ０２２５６７タンパク質と同じ遺伝子から得られる３つのスプライシングバリアント、ＢＣ０５１８５６タンパク質（配列番号：４）、ＢＣ０５３８３６タンパク質（配列番号：６）及びＢＣ０２８１９４タンパク質（配列番号：８）も、血管新生抑制作用を有することを見出した。さらに、新規スプライシングバリアント（配列番号：１０）を見出した。上記５つのタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、それらに対する中和抗体等が、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤として使用することができることを見出し、本発明を完成させた。

なお、ＡＫ０２２５６７タンパク質（配列番号：２）は、血管新生抑制因子であることが知られているVasohibinタンパク質（配列番号：１２、国際公開第０２／０９０５４６号パンフレット）との相同性が５８％であった。

ＡＫ０２２５６７タンパク質とVasohibinタンパク質には、以下の差異がある。
すなわち、Vasohibinタンパク質は血管内皮細胞で発現が見られるのに対し、ＡＫ０２２５６７タンパク質は血管内皮細胞で発現が認められない、Vasohibinタンパク質はヒト胎児及びヒト成体の脳、胎盤において発現が確認されているのに対し、AK０２２５６７タンパク質はヒト胎児において発現が認められるが、ヒト成体では脳、胎盤等の組織において発現が確認されていない、といった差異がある。

本発明は、
（１）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質、血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチド又はそれらの塩を含有する血管新生抑制剤、
（２）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質若しくは血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド又は血管新生抑制作用を有するタンパク質をコードするその断片を含有する、血管新生を抑制するための発現ベクター、
（３）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質若しくは血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は血管新生抑制作用を有するタンパク質をコードするその断片を含有する、血管新生を誘導するための発現ベクター、
（４）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質、血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチド又はそれらの塩に対する中和抗体を含有する血管新生誘導剤、
（５）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質、血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチド若しくはそれらの塩の血管新生抑制活性を促進する化合物又はその塩を選択することを特徴とする血管新生抑制剤のスクリーニング方法、
（６）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質若しくは血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチドの遺伝子の発現を促進する化合物又はその塩を選択することを特徴とする血管新生抑制剤のスクリーニング方法、
（７）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質、血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチド若しくはそれらの塩の血管新生抑制活性を抑制する化合物又はその塩を選択することを特徴とする血管新生誘導剤のスクリーニング方法、
（８）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質若しくは血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチドの遺伝子の発現を抑制する化合物又はその塩を選択することを特徴とする血管新生誘導剤のスクリーニング方法、
（９）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質、血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチド又はそれらの塩を含有する、請求項５〜８のいずれかに記載の方法に使用するためのスクリーニング用キット、
（１０）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用をするタンパク質若しくは血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項５〜８のいずれかに記載の方法に使用するためのスクリーニング用キット、
（１１）請求項１若しくは４記載の血管新生抑制剤又は請求項２若しくは３記載の血管新生を抑制するための発現ベクターを用いることを特徴とする、血管新生抑制方法、
（１２）請求項１若しくは４記載の血管新生抑制剤又は請求項２若しくは３記載の血管新生を抑制するための発現ベクターを投与することを特徴とする血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は悪性新生生物の治療方法、
（１３）血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は悪性新生生物の予防剤又は治療剤を製造するための、配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質、血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチド又はそれらの塩の使用、
（１４）血管新生、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は悪性新生生物の予防剤又は治療剤を製造するための、配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質若しくは血管新生抑制作用を有するそれらの部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド又は血管新生抑制作用を有するタンパク質をコードするその断片の使用、を包含する。

配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質は血管新生抑制作用を持つ。そのため、該タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド等は血管新生抑制剤として使用することができる。該タンパク質及び該ポリヌクレオチドに対する中和抗体は、血管新生誘導剤として使用することができる。また、該タンパク質、ポリヌクレオチド、中和抗体等を用いて、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤をスクリーニングすることができる。スクリーニングにより得られた化合物は血管新生関連疾患の予防剤又は治療剤として安全に使用することができる。

本発明タンパク質をコードする遺伝子の５つのバリアント Ｖａｒｉａｎｔ ５とＶａｓｏｈｉｂｉｎのアミノ酸相同性 バキュロウイルスによるＶａｒｉａｎｔ １の発現と精製 Ｉｎ ｖｉｖｏの血管新生に対するＶａｒｉａｎｔ １の抑制効果

本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。

「血管新生」とは、既存の血管から血管内皮細胞が出芽し、組織に進入する形で毛細血管が形成される現象を意味する。形成過程は１）プロテアーゼによる血管基底膜の消化、２）血管内皮細胞の遊走・増殖、３）管腔形成の順に進行する。

「血管新生関連疾患」としては、動脈硬化、高血圧、狭心症、閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性血管障害、血管奇形等の血管性疾患、肝炎、肺炎、糸球体腎炎、甲状腺炎、骨髄炎、滑膜炎、骨破壊、軟骨破壊、リウマチ、喘息、サルコイドーシス、クロウー深瀬症候群、パンヌス、アレルギー性浮腫、潰瘍、腹水、腹膜硬化、組織癒着等の炎症性疾患、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性等の眼内血管新生性疾患、子宮機能不全、胎盤機能不全、卵巣機能過亢進、濾胞性嚢胞等の生殖器官系疾患、網膜症、脳卒中、血管性痴呆、アルツハイマー病等の中枢神経系疾患、固形癌、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫及び造血器腫瘍等の悪性新生物が例示される。

「血管新生抑制剤」は、新規血管新生抑制作用を持つ、配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質の働きを利用又は促進することによって血管新生を抑制する働きを持つ。配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド等を含有するものと、該タンパク質等を使用したスクリーニングによって得られた、該タンパク質の血管新生抑制作用を促進する働きを持つ化合物又はその塩等を含有するものが挙げられる。該血管新生抑制剤は、前記疾患の中で、血管新生が起こることにより症状が重篤になり得る疾患の予防剤又は治療剤として使用することができる。該血管新生抑制剤が有効である疾患としては、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患又は悪性新生物等が挙げられる。

「血管新生誘導剤」は、新規血管新生抑制作用を持つ、配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質の働きを抑制することによって血管新生を誘導する働きを持つ。該タンパク質等又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチド等を認識する中和抗体を含有するもの、該タンパク質等を使用したスクリーニングによって得られた、該タンパク質の血管新生抑制作用を抑制する働きを持つ化合物又はその塩等を含有するものが挙げられる。該血管新生誘導剤は、前記疾患の中で、血管新生が起こることにより症状が軽減し得る疾患の予防剤又は治療剤として使用することができる。該血管新生誘導剤が有効である疾患としては、損傷の治癒、炎症の修復、虚血性心疾患や末梢性血管疾患、動脈硬化等が挙げられる。

「配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質」（以下、「本発明のタンパク質」と称することもある。）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくはガン細胞等）若しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋等に由来するタンパク質であってもよい。

「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、（A）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（B）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（C）配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、又は（D）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が欠失、置換又は付加されている場合、その欠失、置換又は付加の位置としては、特に限定されない。但し、本発明に使用されるタンパク質は、欠失、置換又は付加によっても、血管新生抑制作用を有するポリペプチドである。配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。

「タンパク質の部分ペプチド」としては、前記本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチド等が用いられる。

また、「部分ペプチド」は、血管新生抑制作用を有していれば、そのアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、又は、そのアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が置換し、又は、そのアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加されていてもよい。配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。

「タンパク質又は部分ペプチドの塩」としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。

「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、本発明のタンパク質をコードしているポリヌクレオチドの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、アデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）のみからなる配列は除外される。「ポリヌクレオチドの断片」とは、配列番号１、３、５、７及び９に記載の塩基配列中の連続した塩基配列であって、例えば、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、５０個、１００個、５００個、１０００個等からなる塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

本明細書において「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは、８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、更に好ましくは、９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。

「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、抗体の全部又はその断片、誘導体、結合体、修飾体等も含有される。好ましくは、本発明のタンパク質又はその部分ペプチドを認識する抗体であり、より好ましくは、該タンパク質を特異的に認識する抗体であり、さらに好ましくは単一特異的に認識する抗体である。さらに、本発明のタンパク質の血管新生抑制作用を阻害する働きを持つ中和抗体が好ましい。そのような抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよい。かかる抗体又はその断片は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。

本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明の遺伝子」と称することもある。）の取得方法、該タンパク質の作製方法、該タンパク質に対する中和抗体の作製方法等を以下に具体的に記載する。

（１）本発明の遺伝子の取得方法
ヒト脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、これら組織由来のヒト正常細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製することによって、本発明の遺伝子を取得することができる。特に、ヒト胎盤あるいはヒト臍帯静脈内皮細胞から取得するのが好ましい。

ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔｓ（ストラタジーン社製）等を用いる方法が挙げられる。

該方法により取得されるｃＤＮＡとして、例えば、配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等を挙げることができ、具体的には、配列番号：１、３、５、７及び９からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ等を挙げることができる。該ｃＤＮＡは、本発明の遺伝子を適当な発現ベクターに組み込んだ発現用プラスミドの作製に使用することができる。発現ベクター、発現用プラスミドの使用方法等については「本発明のタンパク質の作製方法」に後述する。前記発現用プラスミドとしては、例えば、後述の実施例２に記載したプラスミドを挙げることができる。

また、アミノ酸配列に基づいて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを化学合成することによってもＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。

さらに、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー（配列番号：１３）及びアンチセンスプライマー（配列番号：１４）として用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。

（２）本発明のタンパク質の作製方法
本発明のタンパク質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法等を用い、例えば、以下の方法により、本発明の遺伝子を宿主細胞中で発現させ、作製することができる。

本発明のタンパク質をコードする全長ＤＮＡを基にして、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該タンパク質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは該タンパク質の生産率を向上させるうえで有用である。該ＤＮＡ断片、又は全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（発現用プラスミド）を作製する。該発現用プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明のタンパク質を生産する形質転換体を得ることができる。

宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、本発明のタンパク質の遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。

（ｉ）原核生物を宿主として用いる場合
本発明のタンパク質の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（ロシュダイアグノスティックス社製）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）、ｐＫＫ２３３-２（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ-１（プロメガ社製）、ｐＱＥ-８（キアゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＡＬ-ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８-１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）．）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃａｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２７７（１９８９）．）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）．）、ｐＥＧ４００（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０）．）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ-５４０７）、ｐＴｒｓ３２(ＦＥＲＭ ＢＰ-５４０８)、ｐＧＨＡ２(ＦＥＲＭ ＢＰ-４００)、ｐＧＫＡ２(ＦＥＲＭ Ｂ-６７９８)、ｐＰＡ１（特開昭６３-２３３７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３-２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）等を例示することができる。

プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば、６〜１８塩基に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の遺伝子の発現において転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の原核生物が挙げられ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属としてＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＭＣ１０００株、ＫＹ３２７６株、Ｗ１４８５株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｎｏ．４９株、Ｗ３１１０株、ＮＹ４９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株及びＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株等が、Ｓｅｒｒａｔｉａ属として、Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ株、Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ株、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ株等が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株等が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ株、Ｂ．Ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６８）株、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６６）株等が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３０３２）株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６７）株、Ｃ．ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８６９）株、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８７０）株等が、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｍ．ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１５３５４）株等が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属として、Ｓ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ株等が例示される。

発現用プラスミドの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）．）、リン酸カルシウム法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）．）、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）．やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）．に記載の方法等が挙げられる。

（ｉｉ）酵母を宿主として用いる場合
宿主として酵母を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ：３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ：３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ：３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。

プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいずれのものでもよく、例えば、ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＨＯ５（酸性フォスファターゼ）プロモーター、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１（ガラキトースキナーゼ）プロモーター、ＧＡＬ１０（ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ）プロモーター、ＭＦα１（αフェロモン）プロモーター、ＣＵＰ１（メタロチオネイン）プロモーター等が挙げられる。

宿主としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ｐｏｍｂｅ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ種、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ種及びＰｉｃｈｉａ属、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種等が挙げられる。

発現用プラスミドの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２（１９９０）．）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）．）、酢酸リチウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）．及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍy ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）．）記載の方法等が挙げられる。

（ｉｉｉ）動物細胞を宿主として用いる場合
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６（ロシュダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）．）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（ｐＡＭｏＰＲＳＡ）（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）．）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０５）等を用いることができる。

プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー株マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｌｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ｈＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。

宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）及びＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）及びＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等を例示することができる。

発現用プラスミドの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）．）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．、Ｖｉｌｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）．）が挙げられる。

（ｉｖ）植物細胞を宿主として用いる場合
宿主として植物細胞又は植物個体を用いる場合、公知の方法（組織培養，２０（１９９４）．、組織培養，２１（１９９５）．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５、４５（１９９７）．）に準じて本発明のタンパク質を生産することができる。発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。

宿主としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞が例示される。

発現用プラスミドの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。

（ｖ）昆虫細胞を宿主として用いる場合
宿主として昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（インビトロジェン社製）等が、感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するバキュロウイルス（Ｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡ等が挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９２）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）．等に記載の方法が用いられる。

昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含む発現ベクター及び昆虫細胞への感染用のバキュロウイルスＤＮＡを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞に感染することにより本発明のタンパク質を発現することができる。

宿主に用いる昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）由来株細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（イラクサキンウワバ）由来株細胞等が挙げられ、具体的には、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来細胞としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）、Ｓｆ２１（卵巣細胞）等が、Ｔ．ｎｉ由来細胞株としては、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（卵細胞、インビトロジェン社製）等が例示される。

発現用プラスミドの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｃｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）．）等を挙げることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）．）等も用いることができる。

（ｖｉ）培養方法
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現用プラスミドを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該タンパク質を産生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を作製することができる。形質転換体が、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育又は栽培し、該タンパク質を産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を作製することができる。

宿主が動物個体の場合、例えば、本発明の遺伝子を保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該プラスミドのコードする本発明のタンパク質を該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該タンパク質を回収することにより、本発明のタンパク質を作製することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げることができる。

宿主が植物個体の場合、例えば、本発明の遺伝子を保有するトランスジェニック植物を栽培し、該プラスミドのコードする本発明のタンパク質を該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該タンパク質を回収することにより、本発明のタンパク質を作製することができる。

宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、例えば、本発明の遺伝子を保有する形質転換体を培地中で培養し、該プラスミドのコードする本発明のタンパク質を培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該タンパク質を回収することにより、本発明のタンパク質を作製することができる。

本発明のタンパク質の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクト及び塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。

炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。

無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。

培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。

本発明のタンパク質作製用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）．）、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）．）、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）．）、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）．）又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）等を添加した培地等が用いられる。

培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ ＣＯ_２存在下等の条件で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ ＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）．）等を用いることができる。

（ｖｉｉ）作製方法
本発明のタンパク質は、形質転換体を培養し、培養液から本発明のタンパク質を単離・精製することにより作製することができる。本発明のタンパク質の単離・精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離・精製方法やＳａｎｄｌｅｒらの糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）を用いることができる。

本発明のタンパク質が溶解性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離等の方法で細胞又は菌体と培地に分離する。本発明のタンパク質が宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞又は菌体をＳＴＥ溶液等の適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等で細胞又は菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。

本発明のタンパク質の分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等を含んでいてもよい。

得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離・精製方法は自体公知の各種分離・精製方法を組合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモウニウム等による塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースクロマトグラフィー、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、ブチルセファロース等の疎水性クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法等の各種電気泳動等が例示される。アフィニティークロマトグラフィーは、本発明のタンパク質に対する抗体を用いることによっても行うことができる。

本発明のタンパク質が不溶性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記同様に細胞又は菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等の界面活性剤等の可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈又は透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離・精製方法により精製標品を得ることができる。

また、本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）．）。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロテインＡ、ＦＬＡＧ等が例示される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）．、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１２８８（１９９０）．、特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１）。プロテインＡを使用する場合、本発明のタンパク質とプロテインＡの融合タンパク質を生産し、イムノグロブリンＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。ＦＬＡＧペプチドを使用する場合、本発明のタンパク質とＦＬＡＧの融合タンパク質を生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。

本発明のタンパク質は、公知の方法に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することができる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１）．）。

本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）等のペプチド合成機器をにより化学合成することができる。

本発明のタンパク質の構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば、遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明のタンパク質の活性は、後述の実施例３に述べる方法によって測定することができる。

（３）変異型ポリペプチドの作製方法
本発明のタンパク質のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）．、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）．、ＷＯ ８５／００８１７、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）．等に記載の方法に準じて調製することができる。

（４）本発明のタンパク質を認識する中和抗体の作製
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
本発明のタンパク質又はその一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lavoratory (1988)〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清より、下記方法によりポリクローナル抗体を分離、精製することができる。抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、又はＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ又はＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独又は組み合わせて処理する方法が挙げられる。

（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた本発明のタンパク質の部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス又はラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。 該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウス又はラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276,269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔RPMI-1640培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）及び牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０⁷個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム １．８３ｇ、リン酸一カリウム ０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水 １リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００） ２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０^-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０^-5Ｍ）及びアミノプテリン（４×１０^-7Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Antibodies, A Laboratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に述べられている 酵素免疫測定法により、本発明のタンパク質の部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。

本発明はまた、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤のスクリーニング方法に関する。該スクリーニング方法は、被検物質である化合物又はその塩の存在下、本発明のタンパク質若しくは遺伝子の動態を検出又は測定することを１つの特徴とする。

すなわち、血管新生抑制作用を持つ本発明のタンパク質又は遺伝子の動態に対する被検物質による影響を調べることにより、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤として有効な物質のスクリーニングを効率的に行なうものである。本発明のタンパク質又は遺伝子の動態に対する被検物質による影響は、被検物質の非存在下における該動態を対照として調べるのが好適である。

また、本発明のスクリーニング方法は、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の候補化合物の薬理評価に用いることができる。

前記被検物質である化合物又はその塩としては、低分子化合物、高分子化合物、ポリペプチド又はその誘導体、核酸又はその誘導体等が挙げられる。かかる化合物又はその塩は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られた変異体ポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られた変異体核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。核酸としては、本発明の遺伝子に対するＲＮＡｉを誘発しうるｓｉＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡ、リボザイム等も含まれる。

本発明のスクリーニング方法は、「本発明のタンパク質又は遺伝子の動態」を検出又は測定対象とすることにより行う。
本発明のスクリーニング方法における検出又は測定対象の「本発明のタンパク質又は遺伝子の動態」としては、例えば、該タンパク質とそのリガンドとの結合の有無；該遺伝子の発現、具体的には、該発現の有無や該発現の変動等が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法としては、検出又は測定対象の「本発明のタンパク質又は遺伝子の動態」に応じて、大きく３つの実施態様がある。

本発明のスクリーニング方法の第１の実施態様としては、
（Ｉ）本発明のタンパク質と、被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該タンパク質と被検物質との結合を検出し、それにより、該タンパク質と結合する被検物質を、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記タンパク質への結合を介して当該タンパク質の機能に作用する物質を選択することができるため、選択された候補化合物は、直接的かつ特異的に前記タンパク質に結合してその機能を調節するという特徴的な性質を有する。

なお、ここで使用される本発明のタンパク質には、当該タンパク質そのもの又はその部分ペプチド；前記タンパク質のアミノ酸配列において、少なくとも１アミノ酸の変異を有し、かつ前記タンパク質と同等の作用を有するタンパク質又はその部分ペプチド等も含まれる。

前記ステップ（Ｉ）において、前記タンパク質と被検物質との接触は、例えば、該タンパク質の本来の機能を妨げない溶液中において、前記タンパク質と被検物質とを混合し、適切な反応条件（例えば、反応温度、反応時間等）の下、維持する（すなわち、両者を反応させる）ことにより行なわれうる。

前記「タンパク質の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液が挙げられる。

ステップ（Ｉ）における反応条件としては、特に限定されないが、例えば、前記溶液中、通常、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくはｐＨ７．０〜９．０、より好ましくはｐＨ７．５〜８．５、さらに好ましくはｐＨ８．０で、通常、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃、さらに好ましくは２５℃、通常、１分間〜１時間、好ましくは３〜３０分間、より好ましくは５〜２０分間、さらに好ましくは１０分間維持すること等が挙げられる。

ついで、ステップ（ＩＩ）において、前記タンパク質と被検物質との結合を検出し、該結合の有無を調べる。

結合は、例えば、前記のようにしてステップ（Ｉ）で前記タンパク質と、例えば、放射性物質により標識した被検物質とを反応させた後の溶液に含まれる該タンパク質の放射活性を、大過剰の非放射性被検物質との競合下において解析することにより検出することができる。さらに、本発明のタンパク質に結合した状態で細胞刺激活性、例えばＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジンの取込によるＤＮＡ合成を促進する活性又は抑制する活性、細胞遊走活性などを測定するか、血管内皮細胞の管腔形成を顕微鏡などで視覚的に測定する方法等によって本発明のタンパク質の活性の変化を検出することができる。活性変化が検出された場合、使用された被検物質を血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の候補化合物として選択する。

また、ステップ（Ｉ）とステップ（ＩＩ）を連続した工程により実施してもよい。かかる態様は、例えば、被検物質を保持した担体へのバインディングアッセイ等を利用することにより実施することができる。

本発明のスクリーニング方法の第２の実施態様としては、
（Ｉ’）本発明のタンパク質の結合物質の存在下、本発明のタンパク質と、被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ＩＩ’）前記ステップ（Ｉ’）の後、該結合物質とタンパク質との結合量を検出し、それにより、該結合物質とタンパク質との結合量を変化させる被検物質を、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記結合物質とタンパク質との結合を阻害又は促進することによって当該タンパク質の機能に作用する物質を選択することができるため、選択された候補化合物は、前記結合物質とタンパク質との結合に関与して該タンパク質の機能を調節するという特徴的な性質を有する。このように選択される候補化合物としては、（ａ）結合物質と本発明のタンパク質との結合を介する細胞刺激活性、例えば、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取込みによるＤＮＡ合成を促進する活性または抑制する活性、細胞遊走活性などを促進する活性または抑制する活性などの増強あるいは減少させる物質、（ｂ）結合物質と本発明のタンパク質との結合力を増強する物質あるいは減少させる物質が挙げられる。

なお、ここで使用される本発明のタンパク質、反応条件等は上記第１の実施態様と同様である。

結合量は、例えば、前記のようにしてステップ（Ｉ’）で例えば、放射性物質により標識した前記結合物質の存在下で、本発明タンパク質と被検物質とを反応させた後の溶液に含まれる該結合物質の放射活性を、大過剰の非放射性被検物質との競合下において解析することにより検出することができる。例えば、細胞刺激活性などを測定することにより比較することを特徴とする。結合量の変化が検出された場合、使用された被検物質を血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の候補化合物として選択する。

本発明のスクリーニング方法の第３の実施態様としては、
（Ｉ’’）本発明の遺伝子を細胞に導入するステップ、
（ＩＩ’’）被検物質の存在下、前記ステップ（Ｉ’’）で得られた細胞において前記遺伝子を発現させるステップ、並びに
（ＩＩＩ’’）被検物質の非存在下の場合と比較して、前記遺伝子の発現の有無を検出し、又は前記遺伝子の発現の変動を測定し、それにより、該遺伝子の発現の変化をもたらす被検物質を血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法が挙げられる。

前記ステップ（Ｉ’’）において、本発明の遺伝子を細胞に導入するには、例えば、該遺伝子の発現調節領域として知られる発現調節性エレメントの下流かつその支配下に、該遺伝子が動作可能に連結されてなる核酸構築物を用いて行なうのが好適である。前記発現調節性エレメントとしては、例えば、Oncogene, 1996, Vol.13, 143-149に記載されている。

前記「核酸構築物」は、前記発現調節性エレメント及び本発明の遺伝子を慣用の発現ベクターのクローニング部位に挿入することにより簡便に構築されうる。当該ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。

なお、ここで使用される本発明の遺伝子には、当該遺伝子そのもの；前記遺伝子のアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ本発明のタンパク質と同等の作用を有するタンパク質をコードする遺伝子；前記遺伝子の塩基配列において、少なくとも１塩基の変異を有し、かつ前記タンパク質と同等の作用を有するタンパク質をコードする遺伝子；前記遺伝子の塩基配列と少なくとも６０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ本発明のタンパク質と同等の作用を有するタンパク質をコードする遺伝子等も含まれる。

また、前記核酸構築物には、本発明の遺伝子の代替として、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、あるいはルシフェラーゼ等、既にそれらの翻訳産物の存在量が定量可能である遺伝子を使用することもできる。

なお、本発明の種々の態様において、その構成上、本発明の遺伝子の発現を必須とする場合、当該遺伝子の発現において用いられるベクター、核酸構築物を導入する宿主細胞等は、それらの任意の組み合わせにより、前記遺伝子の発現が達成されうるのであれば、それらはどのような生物種由来のものであってもよい。具体例及び細胞への前記核酸構築物の導入方法、前記核酸構築物が導入された形質転換体の培養方法等は、上記タンパク質の作製方法の形質転換体に関する記載と同様である。本発明の遺伝子が真核生物に由来するものである点、及び本発明において提供される治療剤又は予防剤等が真核生物、中でも哺乳動物、特にヒトにおいて好適に使用されうる点を考慮すれば、前記遺伝子の発現に使用される宿主細胞としては動物細胞であるのが好適である。

また、本実施態様においては、前記核酸構築物が導入された安定な細胞系を用いる場合、ステップ（Ｉ’’）は、省略してもよい。

ついで、ステップ（ＩＩ’’）において、被検物質の存在下、前記ステップ（Ｉ’’）で得られた細胞において本発明の遺伝子を発現させる。

当該工程は、例えば、被検物質を含有した培地を用いて、前記ステップ（Ｉ’’）で得られた細胞を培養することにより行なわれうる。培養条件は上記タンパク質の作製方法の形質転換体培養条件と同様である。

続いて、ステップ（ＩＩＩ’’）において、被検物質の非存在下の場合と比較して、前記遺伝子の発現の有無を検出し、又は前記遺伝子の発現の変動を測定し、それにより、該遺伝子の発現の変化をもたらす被検物質を血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の候補化合物として選択する。

なお、「被検物質の非存在下の場合」とは、ステップ（ＩＩ’’）において、被検物質の非存在下にステップ（Ｉ’’）で得られた細胞において前記遺伝子を発現させた場合をいい、被検物質の存在下における前記遺伝子の発現の変化を把握するための基準となる。具体的には、かかる場合の細胞、又は該細胞の抽出液等を対照として用いる。

前記遺伝子の発現の有無を検出し、又はその発現の変動を測定した結果、対照と比較して該遺伝子の発現の変化が認められた時、例えば、対照において前記遺伝子の発現が見られた場合に、被検物質と接触させた細胞において前記遺伝子の発現が対照に比べて発現レベルが上昇した時、すなわち、対照と比較して前記遺伝子の発現が増加した時、該被検物質が血管新生抑制剤の候補化合物であると判定され、該被検物質を血管新生抑制剤の候補化合物として選択する。例えば、対照において前記遺伝子の発現が見られた場合に、被検物質と接触させた細胞において前記遺伝子の発現が検出されないか、又は対照に比べて発現レベルが低下した時、すなわち、対照と比較して前記遺伝子の発現が減少した時、該被検物質が血管新生誘導剤の候補化合物であると判定され、該被検物質を血管新生誘導剤の候補化合物として選択する。

選択された候補化合物は、細胞レベルにおいて前記遺伝子の発現を転写レベルで促進又は抑制するという特徴的な性質を有するものと考えられ、前記遺伝子の発現を特異的に促進又は抑制することができるという優れた効果を発揮する。

遺伝子の発現の有無の検出、又はその発現の変動の測定は、該遺伝子のｍＲＮＡ量又はタンパク質の量を指標として測定するのが好適である。ｍＲＮＡの検出を行う分子生物学的測定方法又はタンパク質の検出を行う免疫学的測定方法であればいかなる方法でもよい。例えば、分子生物学的測定方法としてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、ドットブロット法、マイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法等が例示される。免疫学的測定方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、 ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等が例示される。以下に詳細に記載する。

（１）分子生物学的測定方法
本発明の遺伝子より調製したオリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡを定量することで本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現量を定量することができる。

本発明のタンパク質若しくはその部分ペプチドを発現する形質転換体からのｍＲＮＡを定量する場合も、該形質転換体から当該分野で周知慣用の常法によりｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロットハイブリダイゼーション法等でｍＲＮＡを定量・解析することができる。

ＰＣＲに用いられる「プライマー対」としては、本発明のタンパク質をコードする核酸若しくは該核酸に特徴的な配列部分からなる核酸の５’末端のセンス配列に対応するプライマーと３’末端のアンチセンス配列に対応するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、配列番号：１、３、５、７及び９に記載の塩基配列の全部又はその特徴的な部分配列を増幅可能なものであるのが好適である。より具体的には、例えば、配列番号：１、３、５、７及び９に記載の塩基配列を有する核酸からなる群より選ばれたプライマー対等が挙げられる。プライマー対の具体例としては、特に限定はないが、配列番号：１３及び１４のプライマー対等が挙げられる。かかるプライマーは、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されたプライマーであってもよい。増幅産物の検出は、慣用のアガロースゲル電気泳動等において、臭化エチジウムや蛍光物質による可視化、標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。

ノーザンブロット法の場合、被検対象の個体由来の被検試料を、例えば、前記配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を検出するプローブを用い、ハイブリッドの形成若しくはその量を測定し、対照試料における結果と比較することにより、本発明のタンパク質の遺伝子の発現レベルを評価することができる。

マイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法の場合、被検対象の個体由来の被検試料を、例えば、前記配列番号：２、４、６、８及び１０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を検出するプローブを少なくとも１つ以上含んだマイクロアレイ又はマクロアレイを用い、ハイブリッドの形成若しくはその量を測定し、対照試料における結果と比較することにより、本発明のタンパク質の遺伝子の発現レベルを評価することができる。

ノーザンブロット法やマイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法に用いられる「プローブ」としては、配列番号：１、３、５、７及び９からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸を検出するために使用される核酸が挙げられる。プローブとして用いられる核酸は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。かかる核酸は、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されていてもよい。

（２）本発明のタンパク質の免疫学的検出方法
本発明のタンパク質の免疫学的検出方法としては、該タンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体を直接又は間接的に酵素、蛍光物質、放射性同位体、ラテックス等に結合した標識体を用いることにより該タンパク質又はその部分ペプチドを測定する方法が挙げられる。そのような測定方法として、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素標識により検出するＥＬＩＳＡ法や化学発光法、ルミノールやＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光標識を検出するＦＩＴＣ法、^１２５Ｉ等の放射性同位体標識を検出するＲＩＡ法、ラテックスに結合したラテックス凝集法等が例示される。

また、そのような測定方法として、ウェスタンブロット法及び免疫組織染色等も例示される。

さらに、そのような測定方法を用いることにより本発明のタンパク質又はその部分ペプチドを定量することもできる。

免疫学的検出方法に使用する抗体は固相支持体に固定されていても良く、結合したポリペプチドを、レポーター基を有する二次抗体又は試薬を用いて検出することもできる。また、本発明のタンパク質をレポーター基で標識し、抗体及び試料と共に反応させた後、固定抗体と結合させられる、競合法によっても検出できる。試料の本発明のタンパク質による同標識ポリペプチドと抗体との結合を阻害する程度は、試料の固定抗体との反応性により示され、試料中の本発明のタンパク質の濃度を算出することができる。固相支持体としては、抗体が付着できる、当業者に公知の任意の物質であれば何れのものでもよく、例えば、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース膜等のメンブレン、ビーズ、ディスク、例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス又はポリスチレン又はポリ塩化ビニル等の可塑性物質が挙げられる。磁性粒子又は繊維光学センサー（ＵＳ ５３５９６８１等）も用いることが可能である。抗体の支持体への固相方法は、当該分野に公知の方法を用いることができる。本明細書において、「固相」とは、吸着等の物理的方法又は抗体と支持体上の官能基との共有結合による化学的方法による固定を意味する。抗体と支持体上の官能基は直接結合しても良いが、架橋剤等を介して結合してもよい。

物理的方法による固定は、適切な緩衝液中で適宜希釈した抗体を支持体、好ましくは、マイクロタイタープレート又はメンブレンと適切な時間の間接触させることにより達成され得る。接触時間は、温度により変化するが、代表的には、約１時間と１日の間である。ポリスチレン又はポリ塩化ビニル等のプラスチック製のマイクロタイタープレートの各ウェルに約１０ｎｇから約１μｇ、好ましくは、約１００〜２００ｎｇの抗体を添加し抗体を固定する。

化学的方法による固定は、支持体と抗体の官能基、例えば、水酸基又はアミノ基の両方に反応する二官能性試薬と支持体を反応させることにより達成され得る。例えば、抗体は、適切なポリマーコートを有する支持体に、ベンゾキノンを用いるか又は支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミン及び活性水素との縮合により、共有結合することで固相することができる。このような手法は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９１）Ａ１２〜Ａ１３を参照して行うことができる。

抗体を固相した支持体は他のポリペプチドの物理的吸着を阻害するために当業者に公知の方法で、適切なブロッキング剤、例えば、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ ２０（シグマアルドリッチ社製）等により処理を行う。

抗体固相支持体と試料を反応させ、本発明のタンパク質と抗体を結合させる。試料は、適切な希釈液、例えば、ＰＢＳ等で適宜希釈してもよい。試料と抗体の反応時間は、試料中の本発明のタンパク質の存在を検出するに十分な時間で、好ましくは、結合ポリペプチド及び非結合ポリペプチドとの間の平衡に達成する結合レベルの少なくとも９５％の結合レベルに達成する時間である。平衡に達成する時間は、経時的に結合レベルを測定することにより容易に決定することができる。結合ポリペプチド以外は適切な緩衝液、例えば、ＰＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）等で固相支持体を洗浄することにより除去することができる。標識された二次抗体と固相支持体を反応させる。標識としては、好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性同位体、発色物質、蛍光物質等が用いられる。抗体と標識との結合は、当業者に公知の方法により行うことができる。二次抗体は、固相抗体と本発明のタンパク質との複合体に結合するのに十分な時間反応を行う。適切な時間は、結合レベルを経時的に測定することにより容易に決定することができる。非結合二次抗体は適切な緩衝液、例えば、ＰＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）等で固相支持体を洗浄することにより除去することができる。二次抗体の標識を検出する方法は、標識の種類によって異なる。標識として放射性同位体を用いる場合、シンチレーションカウンターやオートラジオグラフィーによる検出が用いられる。標識として色素、発色物質及び蛍光物質等を用いる場合、分光光度計による検出が用いられる。標識として酵素を用いる場合、それに対する基質を添加し、一定時間反応後における生成物を分光光度計等で検出する。標識と二次抗体は直接結合されていても良いが、アビジン−ビオチン等により間接的に結合したものを用いてもよい。その場合、一方を二次抗体に結合し、他方を標識することにより検出することが可能となる。

本発明の「スクリーニングキット」には少なくとも本発明のタンパク質又はその一部、本発明の遺伝子又はその一部、該遺伝子を保持してなる核酸構築物、該遺伝子が導入された細胞、本発明のタンパク質の抗体等が含まれている。

本発明のスクリーニング用キットとしては、具体的には、
− 本発明のタンパク質を含有してなるキット、
− 本発明の遺伝子を含む核酸構築物を含有してなるキット、
− 本発明の遺伝子が導入された細胞を含有してなるキット、
− 本発明のタンパク質に対する抗体又はその断片を含有してなるキット、
等が挙げられる。

また、各キットには、所望により、本発明のスクリーニング方法に好適に使用されうる前記プローブ及び／又はプライマー対を含有させてもよい。さらには、所望により検出用試薬、緩衝液、標準物質、本発明のスクリーニング方法を実施するための説明書等を含有させてもよい。

本発明のタンパク質、本発明の中和抗体若しくは上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物等から選択される少なくとも１つを含有する血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤は、予防又は治療剤として該物質単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。本発明の血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤は、血管新生関連疾患に対し、本発明のタンパク質の発現そのもの（血管新生抑制作用を持つ）又は該タンパク質の発現に対する作用（例えば、該発現に対して促進的又は抑制的に働く）を介して治療又は予防効果を発揮する。

本発明の血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤は、前記タンパク質、中和抗体又は化合物を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。

錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等のような天然産出植物油等を溶解又は懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖や補助薬を含むＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のアルコール類、ポリソルベート８０やＨＣＯ−５０等非イオン性界面活性剤等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。

また、上記血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤剤は、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等の無痛化剤、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等の安定剤、ベンジルアルコール、フェノール等の保存剤、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等の哺乳動物に対して投与することができる。

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。

経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等が挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該物質そのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には、乳糖、グリセリン等が例示される。該物質及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

また、本発明の血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与方法としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、１回若しくは複数回投与すること等が挙げられる。投与期間も特に限定されるものではない。

本発明の血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤の薬理評価は、例えば、血管新生関連疾患モデルマウスに、本発明の血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤を投与し、非投与動物に比べ、投与動物において、血管新生関連疾患の改善が見られた場合を指標として評価する方法により行なうことができる。

また、本発明の血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤は、食品又は飼料に添加して用いてもよい。「食品」及び「飼料」とは、栄養素を１種以上含む天然物及びその加工品をいい、あらゆる飲食物を含む。本発明の血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤が配合された食品及び飼料は、血管新生が関係する疾患の予防及び／又は治療のための健康補助用機能性食品として有用である。

本発明の遺伝子若しくは上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物（核酸又はその誘導体）等から選択される少なくとも一つを含有する、血管新生を抑制するための発現ベクター又は血管新生を誘導するための発現ベクターは、血管新生関連疾患に対し、治療又は予防効果を発揮する。

本発明の発現ベクターの作製方法、細胞における発現方法等は上記「本発明の遺伝子の取得方法」及び「本タンパク質の作製方法」に記載の発現ベクターと同様である。

本発明の発現ベクターは安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。遺伝子治療に用いる際には、ヒトを含む哺乳動物の細胞内で蛋白質を発現でき、かつ、安全性の高いＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスベクター又はプラスミドベクターを用いるのが好ましい。遺伝子治療に好ましいウイルスベクターとしては，アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等が挙げられる。遺伝子治療に好ましいプラスミドとしては、ｐＣＡＧＧＳ[Gene,108,193-200(1991)]、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）等が挙げられる。

本発明の発現ベクターの患者への導入方法としては、該ベクターを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある［日経サイエンス、４月号、２０−４５（１９９４）、月間薬事、３６、２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２、１５（１９９４）］。本発明では、ｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましい。

ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、標的臓器などに応じた適当な投与経路により投与される。例えば、病変の認められる組織に直接局所投与するか又は静脈、動脈、皮下、筋肉内、腹腔内、内視鏡的、エアロゾル的等により投与することも可能である。投与方法としては静脈内又は腹腔内投与が好ましい。また、病変の見られる組織の直接注射も好ましい。核磁気共鳴撮像又はコンピューター断層撮影等の当該技術分野で利用できる任意のものを使用して病変の見られる組織を撮影し、例えば、定位注射により本発明のベクターを投与することができる。

なお、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡにシグナル配列を付加することにより、分泌蛋白質となり、局所投与する必要は必ずしもなく、細胞内で産生、分泌された蛋白質が遠く離れた標的臓器に作用し、血管新生抑制作用を生ずる。従って、病理組織以外の正常組織内又は正常細胞内への投与も可能である。なお、ヒトに投与する場合は静脈内投与又は筋肉内投与が好ましい。

本発明のベクターの製剤（遺伝子治療剤）の形態としては、上記の各投与形態にあった種々の製剤形態をとることができる。例えば、有効成分である本発明のＤＮＡを含有する注射剤とした場合、当該注射剤は常法により調整することができる。遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であれば、特に制限されず、蒸留水、塩化ナトリウム、又は塩化ナトリウムと無機塩等との混合物の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられ得る。また、常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチン若しくは非イオン性界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調整してもよい。これらの注射剤を粉末化、凍結乾燥等の操作により用事溶解用製剤とすることもできる。

製剤中のＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、投与部位、投与回数、所望治療期間、患者の年齢、体重等により異なり、適宜調整することができるが、通常患者（体重６０ｋｇとして）においては一般に本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの重量にして約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇである。

以下実施例は、例示のために提供され、そして限定するためではない。遺伝子操作的手法として、特に断らない限りＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｐｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）．に記載されている方法を用いた。

血管新生抑制因子Vasohibinの相同遺伝子の検索
これまでに我々が発見した血管新生抑制因子Vasohibin（J. Clin. Invest.，１１４（７）， ８９８‐９０７，２００４）の構造的な類似遺伝子を探索する目的で、Vasohibin cDNAの塩基配列（ＫＩＡＡ１０３６、Acc# NM_014909、配列番号：１１）をESTクラスター・データベースであるAssEST（メイズ社製）でBlastx検索することにより、同配列がコードし得るアミノ酸の相同性検索を行ったところ、Vasohibinタンパク質（配列番号：１２）がＡＫ０２２５６７タンパク質（配列番号：２）と５８％の相同性を有することが判明した。さらに、このＡＫ０２２５６７遺伝子の塩基配列（配列番号：１）をもとに米国NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベースで相同性検索を行ったところ、機能未知タンパク質ＦＬＪ１２５０５をコードする遺伝子として登録されたＢＣ０５１８５６（配列番号：３）、ＢＣ０５３８３６（配列番号：５）およびＢＣ０２８１９４（配列番号：７）が見出された。これら３つの遺伝子およびＡＫ０２２５６７遺伝子の塩基配列をヒト・ゲノム・データベースEnsemblで検索したところ、これらの遺伝子はいずれも1番染色体長腕1q32.3に存在し、選択的スプライシングによって生成された４種類のバリアントであることが判明したため、ＡＫ０２２５６７をバリアント１、ＢＣ０５１８５６をバリアント２、ＢＣ０５３８３６をバリアント３、ＢＣ０２８１９４をバリアント４とした（図１）。

本発明の遺伝子がVasohibin同様HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）において発現しているかを配列番号：１３及び１４からなるプライマーを用いたRT-PCRによって確認したところ、バリアント１、２、３及び４から予想されるよりも大きなDNA断片が検出された。このDNA断片の塩基配列を決定したところ新たな選択的スプライシング受けていることが判明し（配列番号：９）、これをバリアント５とした（図１）。５つのバリアントの内、バリアント５にコードされるアミノ酸配列（配列番号：１０）がV asohibinのアミノ酸配列にもっとも相同性が高かった（図２）。

バキュロウイルスによる本発明のタンパク質の発現および精製
バリアント１のC末端に３ｘFLAG配列を付加したものをコードするｃDNAを、昆虫細胞発現用ベクターであるpFASTBac１（インビトロジェン社）に挿入し、昆虫細胞発現用プラスミドpFASTBac1036を構築した。昆虫細胞での発現にはBac-To-Bac Baculovirus Expression Systems（インビトロジェン社）を使用し、操作なども付属のマニュアルに従った。すなわち、構築したpFASTBac1036プラスミドをDH10Bac E.coli に形質転換し、組換えBacmidDNAを得た。次にこのBacmidDNAをCELLFECTIN試薬（インビトロジェン社）によってSf9細胞に遺伝子導入し、組換えバキュロウイルスを得た。このウイルス溶液0.5 ｍｌを１.5×１０^６個／mlの濃度で50mlのSf9細胞に感染させるという割合で使用することとした。感染後９６時間培養し、遠心によって細胞を回収した。

FLAG付加の本発明のタンパク質の昆虫細胞による発現確認は、このSf9細胞の抽出液とHRP標識した坑FLAG M2 mAb抗体（シグマ社）を利用したウエスタンブロットによって行った。初めに、細胞を５mLのりん酸緩衝生理食塩水（PBS）にて１回洗浄した後、５mlのLysis 溶液（0.15 M NaCl，0.1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、1 mM DTT、0.1 mM amidinophenyl methansulufonyl fluride hydrochloride、0.1% NP-40を含む、50 mM Tris-HCl, pH 7.4）にて懸濁後、MICROCON（HEART SYSTEMS社製）にて超音波処理を氷冷しながら１５秒間４回行った後、14,500 x gにて20分間遠心し、上清に等量のLysis溶液を加えたものをライセート溶液とした。ウェスタンブロットは0.5μｌをLaemliの方法にしたがって、SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜（テフコ社）に電気的に転写した後、５％スキムミルクを含んだTBS中にてブロッキングし、HRP標識した抗FLAG M2 mAbと反応させた。0.05％TritonX-100を含んだTBS（0.15 M NaClを含むTris-HCl, pH 7.4）にて１０分間３回洗浄後、ECL-Plus試薬（アマシャム ファルマシア社）によって化学発光させ、それをHyperfilmECLフィルム（アマシャム ファルマシア社）に感光させることによって検出した。

FLAG付加の本発明のタンパク質の精製はライセート溶液を0.1% NP-40を含むTBSにて平衡化した抗FLAG M2アフィニティゲルカラム（Sigma社）に添加後、同溶液にて洗浄を行い、溶出液（0.1% NP-40を含むGly-HCl, pH 3.5）（1ml/画分）にて溶出し、ただちに1 M Tris-HCl, pH 8.0にて中和（溶出液1 mlに対し、20μl）することによって行った。精製画分のウェスタンブロットあるいはSDS-PAGE後のBio-Safe Coomassie（Bio-Rad社）による染色により約37 kDaのバンドが確認された（図３）。さらに、SDS-PAGEおよびPVDFメンブレン（BIO-RAD社）への転写後、このバンドを溶出しBLase消化したペプチド断片について、アミノ酸シークエンサーを用いてこのポリペプチドの部分アミノ酸配列を解析したところ、配列番号：２に含まれるアミノ酸配列と一致したことから、このタンパク質が本発明のタンパク質であることが確認された。

本発明のタンパク質によるin vivoにおける血管新生抑制効果
本発明のタンパク質がVasohibin同様の血管新生抑制能を有するかをJ. Immunol.１７０：５７０４−５７１１,（２００３）及びFASAB J. １８：３００−３１０,（２００４）に記載の方法に従いマウスの角膜マイクロポケット・アッセイにより検討した。０．３μgのハイドロン試薬（IFN Sciences社）に８０ngのFGF-2 タンパク質（fibroblast growth factor-2, BD Biosciences社）を混合し、さらに５ngのVasohibinあるいは本発明のタンパク質を加え、ＢＡＬＢ／ｃ雄マウスの角膜に移植した。７日後、角膜に伸長した新生血管を写真撮影し、画像解析ソフトNational Institutes of Health（NIH）imageにより血管新生の定量分析を行った。その結果、FGF-2によって誘導される血管新生が本発明のタンパク質の存在下では有意に抑制され、この効果はVasohibinによる血管新生抑制とほぼ同等のものであることが分かった（図４）。

本発明のタンパク質の発現を誘導する低分子化合物のスクリーニング法
市販の96穴プレート（例えばCostar社製 96 Well Cell Culture Cluster）にヒト前立腺癌細胞株であるPC-3細胞を、10% 仔牛血清を含むDMEM培地にて1.5〜2.0 x 10⁴ cells/well(100μl/well)で撒き、一晩静置培養する。仔牛血清を含まないDMEM培地100mlに置換え、10% DMSOにて溶解した低分子化合物をそれぞれ1〜5μl添加し（終濃度1〜5mg/ml）、さらに20時間静置培養する。対象としては、化合物を含まない10% DMSOを用いる。反応後、培養上清を回収し、上清中の本発明のタンパク質の量をELISAで測定し、発現誘導の有無を確認する。ELISAは、本発明のタンパク質に対する抗体を固相したイムノプレート（例えばNunc社製、イムノモジュール）に、回収した培養上清50μlとアッセイ緩衝液（例えば、0.5% BSAを含む100mM PBS溶液）50μlを添加し、4℃で終夜反応する。洗浄液（例えば、0.05% Tween20を含む生理食塩水）で3回洗浄後、本発明のタンパク質の別の部位を認識する抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識物を1μg/ml濃度で100μl添加し、室温で3時間静置する。洗浄液で3回洗浄後、呈色剤のTMB溶液を100μl添加し、室温で30分反応させる。反応後、0.18N 硫酸溶液100μlを添加し、反応を停止する。450nmにおける吸光度を測定し、同時に測定した本発明のタンパク質の組換え体の吸光度から、上清中の本発明のタンパク量の量を算出する。10％DMSOのみを加えた対象と比較して、本発明のタンパク質の量が多く検出されたサンプルに加えていた低分子化合物を血管新生抑制剤の候補化合物であると判定する。

本発明のタンパク質及び遺伝子等は血管新生抑制剤として使用することができる。該タンパク質等に対する抗体は、血管新生誘導剤として使用することができる。また、該タンパク質、遺伝子、抗体等を用いて、血管新生抑制剤又は血管新生誘導剤をスクリーニングすることができる。

配列番号：１３は、ＡＫ０２２５６７（配列番号：１）のＲＴ−ＰＣＲフォワードプライマーを示す。

配列番号：１４は、ＡＫ０２２５６７（配列番号：１）のＲＴ−ＰＣＲリバースプライマーを示す。

Claims (3)

1. 配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１乃至５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質、又はそれらの塩を含有する血管新生抑制剤。
2. 配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１乃至５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、血管新生を抑制するための発現ベクター。
3. 配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと９５パーセント以上の相同性を有し、かつ血管新生抑制作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、血管新生を抑制するための発現ベクター。

Images