JP4800932B2 - カルシウムイオンリーク抑制物 - Google Patents

Description

本発明は、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリークを抑制する作用を有するポリペプチド及びそれらを有効成分とする医薬組成物に関する。また、本発明は、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク誘導に対してカルシウムイオンリークを抑制する作用を亢進又は抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。

心筋の収縮には心筋細胞内のカルシウムイオンの流れが重要であるが、近年、心筋細胞内のカルシウムイオンの調節異常（カルシウムハンドリング異常）が心不全の発症と深く関連していることを示す報告が数多くなされている（非特許文献１及び２参照）。心筋細胞内のカルシウムイオンの流れはおおよそ以下のようになる。心筋にはカルシウムイオンのプールとして筋小胞体が存在し、細胞外からのカルシウムイオン流入がきっかけとなって、筋小胞体からリアノジン受容体（ｒｙａｎｏｄｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＲｙＲ）を通って細胞質内にカルシウムイオンが放出される。これにより細胞質のカルシウムイオン濃度が上昇し、心筋収縮が起こる。一方、心筋の拡張には細胞質のカルシウムイオン濃度の低下が必要であるが、それは筋小胞体カルシウム−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）によるカルシウムイオンの筋小胞体への再取り込みによって達成される。最初に細胞外から取り込まれた余分なカルシウムイオンはナトリウム−カルシウム交換ポンプ（ＮＣＸ）により細胞外へ排出される。最近カルシウムハンドリング異常との関連で注目を浴びているのは心筋細胞内のカルシウムイオンプールとしての筋小胞体で、心不全では筋小胞体内のカルシウムイオンが枯渇していることが示されている。従って、筋小胞体のカルシウムイオンを正常化することを目指した、新たなコンセプトの抗心不全薬、抗不整脈薬が可能であると考えられる。

カルシウムハンドリング異常の機序としては、従来ＳＥＲＣＡの活性低下が着目されてきた。実際、ＳＥＲＣＡの過剰発現により心収縮能、及び、弛緩能の改善が認められる（非特許文献３参照）。その一方、心不全患者で必ずしもＳＥＲＣＡ量・活性に変化が見られない（非特許文献４参照）ことなどから、近年、ＳＥＲＣＡ異常以外の機構として、ＲｙＲの関与も着目されるようになってきた。

ＲｙＲは、麦角アルカロイドであるリアノジンと特異的に結合するタンパク質であり、約５，０００のアミノ酸からなるサブユニットの４量体構造を有し、Ｎ末端側がフット構造を形成し、Ｃ末端側はチャネルを形成していると考えられている。ＲｙＲには、骨格筋、脳（特に、小脳）に局在するＲｙＲ１；心筋、平滑筋、脳（全般）に局在するＲｙＲ２；及び脳（特に、海馬、視床）、平滑筋、骨格筋に存在するＲｙＲ３の３つのサブタイプがある。本発明におけるリアノジン受容体は、これらをすべて含むものであるが、好ましくは、ＲｙＲ２である。ＲｙＲ２は上記したように約５，０００のアミノ酸のサブユニット４個からなるホモテトラマーであり、サブユニット１個当たりに１分子のＦＫ５０６結合タンパク質１２．６（ＦＫＢＰ１２．６）が結合している。ＲｙＲ２は、ＦＫＢＰ１２．６の結合により構造が安定し、逆に、ＦＫＢＰ１２．６が解離することにより筋小胞体よりカルシウムイオンを細胞質へ放出すると考えられている。

一方、プロテインキナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ：ＰＫＡ）によりリン酸化されることで、ＲｙＲ２からＦＫＢＰ１２．６が解離することがわかっているが、心不全患者ではＰＫＡによる過リン酸化によってＦＫＢＰ１２．６の６０％以上が解離しており、その結果としてＲｙＲ２のカルシウムイオン感受性が亢進、すなわち、カルシウムイオンの筋小胞体からの異常なリークが生じている（非特許文献５参照）。

また、幾つかの心臓関連疾患〔ＣＰＶＴ（運動誘発性心室頻拍）、ＦＰＶＴ（家族性多型心室頻拍）、ＡＲＶＤ（不整脈源性右室異形成）〕でＲｙＲ２の変異が見られており（非特許文献６参照）、実際、イン・ビトロ系で、ＣＰＶＴ変異によりＦＫＢＰ１２．６に対するアフィニティーが低下し、リン酸化に対する感受性が亢進することが示されている（非特許文献７参照）。

さらに、高頻度右室ペーシングによるイヌ心不全モデルの左室心筋の筋小胞体を用いた実験でも、心不全ではＲｙＲ２からの異常なカルシウムイオンリークが認められ、そのカルシウムイオンリーク異常はＦＫＢＰ１２．６の化学量論的組成（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ）の低下に伴うＲｙＲ２の構造変化に起因することが示されている（非特許文献８参照）。

最近、１，４−ベンゾチアゼピン誘導体のＪＴＶ５１９が、ＲｙＲ２からの異常なカルシウムイオンリークを正常化することが見出された（非特許文献９参照）。ＪＴＶ５１９は虚血障害治療薬として開発され、臨床試験が行われた。ヤノ（Ｙａｎｏ， Ｍ．）らによれば、ＲｙＲ２がＪＴＶ５１９の効率的なターゲットであり、ＲｙＲ２スタビライザー（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）効果によってカルシウムハンドリングを是正する新しいコンセプトの薬剤開発が可能であると思われる。

そこで、ＪＴＶ５１９同様の作用（ＲｙＲ２スタビライザー作用）を有し、かつ、副作用のない物質の開発が当業界で望まれている。

Ｂｅｕｃｋｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ８５， １０４６−１０５５ （１９９２） Ｇｗａｔｈｍｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ， ６１， ７０−７６ （１９８７） Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ， ８３， １２０５−１２１４ （１９９８） Ｍｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ７６， ４３４−４４１ （１９９８） Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １０１， ３６５−３７６ （２０００） Ｍａｒｋｓ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０６， ８−１０ （２００２） Ｗｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １１３， ８２９−８４０ （２００３） Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０２， ２１３１−２１３６ （２０００） Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０７， ４７７−４８４ （２００３）

前述したように、例えば心筋の筋小胞体におけるカルシウムイオンリーク誘導のようなカルシウムハンドリング異常を改善又は抑制することによって心筋の機能改善をもたらす新たな物質が提供できれば、これらは、心筋の小胞体におけるカルシウムハンドリング調節機構の解明、心不全機構の解明、小胞体におけるカルシウムイオンリーク制御異常の改善に有用である。

また、カルシウムイオンリーク抑制作用を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現産物が提供されれば、これらは、心不全、心筋症、弁膜症、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、不整脈、高血圧症、末梢循環障害、糖尿病、記憶障害、脳梗塞、悪性高熱症等の細胞内におけるカルシウム制御異常（カルシウムハンドリング異常）に関わる疾患などの治療及び予防剤として期待できると共に、細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用を促進又は抑制する候補化合物のスクリーニングも可能となる。

従って、本発明は、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリークを抑制する作用を有するポリペプチド、ポリヌクレオチドの発現物、それらを有効成分とする医薬組成物を提供すると共に、これらポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現物を利用して、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用を亢進又は抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記観点から、小胞体のカルシウムイオンリーク抑制作用を有する新規な物質の探索を目的として、まず、ＲｙＲ２の構造異常を正常化すると考えられる治療ペプチドとして、小胞体のカルシウムイオンリーク抑制作用を有するポリペプチドの探索を行った。その結果、ＲｙＲ２の配列番号２１１４番目から２１４９番目に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドが新たに小胞体のカルシウムイオンリーク抑制作用を有することが判明した。本発明者らは、さらにこのアミノ酸配列を基に様々な長さのアミノ酸配列を有するポリペプチドを調製し、その中の幾つかのポリペプチドが当該作用を有することを見出し、ここに発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）
（ａ）配列番号３〜９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号３〜９のいずれかで示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群より選ばれ、標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用を有するポリペプチドを提供するものである。

また、本発明は、以下の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）
（ｃ）配列番号３〜９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）上記（ｃ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、且つ発現可能なポリヌクレオチド
（ｅ）上記（ｃ）のポリヌクレオチドと８０％以上相同するＤＮＡ配列からなり、且つ発現可能なポリヌクレオチド
からなる群より選ばれ、その発現物が標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用を有するポリヌクレオチドを提供するものである。

また、本発明は、上記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現物を有効成分として含有する医薬組成物を提供するものである。

また、本発明は、被験物質の存在下及び非存在下に、前記ポリペプチドによる、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニスト又は該抑制作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明は、被験物質の存在下及び非存在下に、前記ポリヌクレオチドの発現物による、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニスト又は該抑制作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明は、以下の工程（１）〜（５）
（１）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程
（２）被験物質の存在下及び非存在下に、該標的細胞の小胞体にＦＫ５０６を添加して、カルシウムイオンリークを誘導する工程
（３）被験物質の存在下及び非存在下での標的細胞の小胞体からのカルシウムイオンリークをカルシウムイオン・インディケーターにより計測し、小胞体からのカルシウムイオン流出の変化量をそれぞれ求める工程
（４）被験物質の非存在下に、非形質転換細胞の小胞体にＦＫ５０６を添加して、カルシウムイオンリークを誘導させた小胞体からのカルシウムイオンリークをカルシウムイオン・インディケーターにより計測し、小胞体の外側におけるカルシウムイオンの値を基準値として、上記（３）で求められた各値と該基準値との差を求める工程
（５）被験物質の存在下における基準値との差が、被験物質の非存在下における基準値との差と比べて、小である場合に、該被験物質を候補物質として選択する工程
を含む、前記ポリペプチドによる標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用を増強する候補物質のスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明は、以下の工程（１）〜（５）
（１）前記ポリヌクレオチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程
（２）被験物質の存在下及び非存在下に、該標的細胞に小胞体にＦＫ５０６を添加してカルシウムイオンリークを誘導する工程
（３）被験物質の存在下及び非存在下での標的細胞の小胞体におけるポリヌクレオチド発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、それぞれ求める工程
（４）被験物質の存在下における上記発現量を、被験物質の非存在下における同発現量と対比する工程
（５）被験物質の存在下における発現量が、非存在下における発現量に比して増加している場合に、該被験物質を候補物質として選択する工程
を含む、前記ポリヌクレオチドの発現物による標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用を増強する候補物質のスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明は、以下の工程（１）〜（５）
（１）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程
（２）被験物質の存在下及び非存在下に、該標的細胞の小胞体にＦＫ５０６を添加してカルシウムイオンリークを誘導する工程
（３）被験物質の存在下及び非存在下での標的細胞におけるポリペプチド産生量を、該ポリペプチドに対する抗体を用いて、それぞれ求める工程
（４）被験物質の存在下における産生量と、被験物質の非存在下における産生量とを対比する工程
（５）被験物質の存在下における産生量が、被験物質の非存在下における産生量に比して増加している場合に、該被験物質を候補物質として選択する工程
を含む、前記ポリペプチドによる標的細胞におけるカルシウムイオンリーク抑制作用を増強する候補物質をスクリーニングする方法を提供するものである。

更に、本発明は、標的細胞における前記ポリペプチド及び前記ポリヌクレオチドの発現物からなる群より選ばれる少なくとも１種と、ＦＫ５０６とを構成成分として含有することを特徴とする、該ポリペプチド又は発現物による標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用に対するアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングするためのスクリーニング用キットを提供するものである。

本発明のポリペプチドは、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリークを抑制する作用を有し、細胞内におけるカルシウムハンドリング異常に関わる疾患などの治療及び予防剤として有用である。また、このポリペプチドを利用して、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリークを抑制する作用を亢進又は抑制する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。

イヌ心筋由来の心筋小胞体におけるＦＫ５０６処理によるカルシウムイオンリーク誘導に対する合成したポリペプチドの効果を示す図である。 イヌ心筋由来の心筋小胞体におけるＦＫ５０６処理によるカルシウムイオンリーク誘導に対する合成したポリペプチドの効果を示す図である。 イヌ心筋由来の心筋小胞体におけるＦＫ５０６処理によるカルシウムイオンリーク誘導に対する合成したポリペプチドの効果を示す図である。 イヌ心筋由来の心筋小胞体におけるＦＫ５０６処理によるカルシウムイオンリーク誘導に対する合成したポリペプチドの効果を示す図である。 イヌ心筋由来の心筋小胞体におけるＦＫ５０６処理によるカルシウムイオンリーク誘導に対する合成したポリペプチドの効果を示す図である。

〔定義〕
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３８： ９ （１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。

本明細書において遺伝子とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに制限されるものではない。従って、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ分子）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）及び該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、合成ＤＮＡ、並びにそれらの断片のいずれもが含まれる。

また、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ分子）は、機能領域の別を問うものではなく、発現抑制領域、コード領域、リーダ配列、エキソン及びイントロンのいずれか少なくとも一つを含むことができる。ポリヌクレオチドには、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれる。ＤＮＡ分子には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡが含まれる。特定アミノ酸配列を有するポリペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチドには、それらの断片、同族体、誘導体及び変異体が含まれる。

ポリヌクレオチドの変異体（変異体ＤＮＡ）には、天然に存在するアレル変異体；天然に存在しない変異体；欠失、置換、付加及び挿入がなされた変異体などが含まれる。但し、これらの変異体は、変異前のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能と実質的に同じ機能を有するポリペプチドをコードするものとする。

ポリペプチドの変異（アミノ酸配列の改変）は、天然において生じるもの、例えば突然変異、翻訳後の修飾などにより生じるものである必要はなく、天然由来の遺伝子（例えば本発明のリアノジン受容体遺伝子の断片）を利用して人為的に生じさせたものであってもよい。上記ポリペプチドの変異体は、アレル体、ホモログ、天然の変異体などであって、少なくとも８０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％が、変異前のポリペプチドと相同するものが含まれる。

変異体ＤＮＡは、これによりコードされるアミノ酸についてサイレント（変異した核酸配列によってコードされるアミノ酸残基に変化がない）であるか又は保存的である。保存的なアミノ酸置換の例を以下に示す。

元のアミノ酸残基 保存的な置換アミノ酸残基
Ａｌａ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｇｌｎ又はＨｉｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ａｓｎ又はＧｌｎ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ又はＶａｌ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ又はＶａｌ
Ｌｙｓ Ａｒｇ、Ａｓｎ又はＧｌｕ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ又はＩｌｅ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ又はＰｈｅ
Ｖａｌ Ｉｌｅ又はＬｅｕ

一般にＣｙｓ残基をコードする１又はそれ以上のコドンは、特定ポリペプチドのジスルフィド結合に影響を与える。

蛋白質の特性に変化を与えると一般的に考えられるアミノ酸残基の置換には、以下のものが含まれる。

ａ） 疎水性残基の親水性残基への置換、例えばＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ又はＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、
ｂ） Ｃｙｓ及びＰｒｏ以外のアミノ酸残基のＣｙｓ 又はＰｒｏへの置換、
ｃ） 電気的陽性側鎖を有している残基、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの、電気的陰性残基、例えば、Ｇｌｕ又はＡｓｐへの置換、
ｄ） 非常に大きな側鎖を有しているアミノ酸残基、例えばＰｈｅのＧｌｙのような側鎖を有しないアミノ酸残基への置換。

〔１〕本発明ポリペプチド
本発明のポリペプチド（及び本発明スクリーニング方法に利用するポリペプチド；以下、単に「本発明ポリペプチド」という）は、下記の（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号３〜９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）上記ポリペプチドの相同物、即ち、配列番号３〜９のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
であって、標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用を有するものである。

配列番号３に示されるポリペプチドは、「Ｒ２Ｐ」と名付けられ、ヒトリアノジン受容体タイプ２（ｈＲｙＲ２）のアミノ酸配列の２１１４番目から２１４９番目に相当する３６のアミノ酸配列からなる。そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２０に示されるとおりである。前記リアノジン受容体タイプ２をコードするＤＮＡは、配列番号２に示すとおり１４９０１塩基からなり、該ＤＮＡでコードされるアミノ酸配列は配列番号１に示される４９６７のアミノ酸配列からなっている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ ００１０３５）。

また、配列番号４で示されるポリペプチドは、Ｒ２Ｐ（配列番号３）のＮ末端側にメチオニン・セリン・バリンの３つのアミノ酸が付加されたＭＳＶ−Ｒ２Ｐ（Ｍ＋２１１２−２１４９）であり、配列番号５、６及び７で示されるポリペプチドは、Ｒ２ＰのＣ末端側のアミノ酸がそれぞれ６個、１１個及び１６個欠失したＲＰ１−３０（２１１４−２１４３）、ＲＰ１−２５（２１１４−２１３８）及びＲＰ１−２０（２１１４−２１３３）であり、配列番号８で示されるポリペプチドは、Ｒ２ＰのＮ末端側の１２アミノ酸及びＣ末端側の４アミノ酸が欠失したＲＰ１３−３２（２１２６−２１４５）であり、配列番号９で示されるポリペプチドは、Ｒ２ＰのＮ末端側の１６アミノ酸が欠失したＲＰ１７−３６（２１３０−２１４９）である。これらをコードするＤＮＡ配列は、配列番号２１〜２６に示すとおりである。

前記（ｂ）として示した配列番号３〜９のいずれかで示されるアミノ酸配列における改変、即ち「欠失、挿入、置換又は付加」の程度及びそれらの位置は、改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号３〜９のいずれか、特に配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｒ２Ｐ）と実質的に同質の活性を有するもの（同効物）であれば、特に制限されない。上記改変の程度は、通常１から複数個程度であるのが好ましいが、後記実施例に示されるように、配列番号４〜９に示されるポリペプチドにおいてもカルシウムイオンリーク抑制活性が認められ、これらのＲ２Ｐからの改変の程度から、本発明においては、複数個とは、アミノ酸の２〜２０個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加した程度をいう。また、特にこの改変の程度は、アミノ酸配列における配列番号３のポリペプチドとのアミノ酸の一致する部分における相同性が、例えば約８０％以上であるのが好ましく、更には約９５％以上、特に約９８％以上であるのが好ましい。

なお、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの相同性は、配列分析ソフトウェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用した測定（Ｃｌｕｓｔａｌ， Ｖ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５， ３０７−３１８ （１９９４））によって解析することができる。相同性解析の最も好ましく且つ簡便な方法としては、コンピューターにより読取り可能な媒体（例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブ、ＤＶＤなど）に配列を記憶させ、次いでその記憶された配列を使用して、よく知られた検索手段に従い既知の配列データベースを検索する方法を例示することができる。既知の配列データベースの具体例には、以下のものが含まれる。

・ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）
・Ｇｅｎｅｂａｎｋ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ． ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｗｅｂ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／Ｉｎｄｅｘ．ｈｔｌｍ）
・ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＥＭＢＬ） （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｂｉ ｄｏｃｓ／ｅｍｂｌ ｄｂ．ｈｔｍｌ）

相同性解析には多数の検索アルゴリズムが利用可能である。その一例としては、ＢＬＡＳＴプログラムと称されるプログラムが挙げられる。このプログラムには５つのＢＬＡＳＴ手段がある。そのうちの３つ（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸ）は、ヌクレオチド配列の照会用に設計されたものであり、残りの２つ（ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮ）は、蛋白質配列の照会用に設計されたものである（Ｃｏｕｌｓｏｎ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２：７６−８０ （１９９４）； Ｂｉｒｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， １：５４３−５５９ （１９９７））。

更に追加的なプログラム、例えば配列アライメントプログラム、より遠縁の配列を同定するためのプログラムなどが、同定された配列の分析のために当技術分野において利用可能である。

本発明ポリペプチドは、例えば、ヒト細胞、特にヒトの心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、脳神経細胞、神経芽細胞、膵β細胞、あるいはヒト組織、特にヒトの心臓、動脈・静脈血管骨格筋、平滑筋、大脳（大脳皮質）、小脳、膵臓などを起源とするヒト細胞ないし組織由来ポリペプチドであってもよく、またそのアミノ酸配列情報に従って、化学合成して得られるポリペプチドであってもよい。また、前記（ｂ）として示した本発明ポリペプチド（ａ）の相同物には、カルシウムイオンリーク抑制活性を有する、酵母、線虫、植物組織及びヒト以外の哺乳動物を起源とする蛋白質も含まれる。該哺乳動物としては、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、マウス、ラット、ウサギなどを例示できる。

本発明ポリペプチドが有する、前記標的細胞におけるカルシウムイオンリーク抑制作用は、より詳しくは、細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク誘導によって生じる細胞内のカルシウム増加を抑制し、小胞体へカルシウムイオンの取り込みを増加させることでカルシウムイオンリークを抑制し、細胞におけるカルシウムハンドリング異常（制御異常）を改善する作用である。また前記細胞の小胞体としては、筋小胞体を例示できる。上記筋小胞体の具体例としては、正常心筋又は不全心筋から調製された筋小胞体、血管平滑筋から調製された筋小胞体、骨格筋から調製された筋小胞体などが挙げられる。該作用は、結果として、例えば、心臓の筋肉組織においては、心筋収縮力を改善し、心不全や不整脈を改善に導くと期待される。

該作用は、言い換えるとリアノジン受容体機能を安定化させる作用ともいえる。即ち、正常状態（健常個体における正常組織若しくは正常細胞における状態）のリアノジン受容体機能を維持することを意味する。ここで、リアノジン受容体機能とは、筋小胞体内のカルシウムイオンの貯蔵量を維持すべく、カルシウムイオンのリークを抑制（制御）する機能及び筋小胞体からのカルシウムイオンのシグナル発信を調節する機能ともいうことが出来る。従って、リアノジン受容体機能を維持するとは、正常な筋肉の収縮・弛緩を行うのに十分なリアノジン受容体の開閉が、膜電位変化などの生理的刺激に伴って生じ、カルシウムイオンのシグナル発信を発信するのに十分なカルシウムイオン濃度が筋小胞体内に貯蔵されている状態を維持することをいう。

前記リアノジン受容体機能の安定化や機能維持は、ＲｙＲとＦＫＢＰ１２．６との間の結合強度が低下するのを抑制すること、該リアノジン受容体のリン酸化を抑制すること、該リアノジン受容体の構造維持を図ること、などにより成し遂げられる。

尚、前記相同物におけるこの作用は、配列番号３〜９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのそれと実質的に同質であればよい。ここで、「実質的に同質」とは、その作用が、生理化学的性質において又は薬理学的性質において同質であることを示すものであり、該カルシウムイオンリーク抑制作用の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

また、前記（ｂ）として示した改変されたアミノ酸配列からなる本発明ポリペプチドは、カルシウムイオンリーク抑制作用のほかに、例えば該ペプチド本来の活性（例えば該ペプチドがリアノジン受容体スタビライザーの場合は、その受容体活性安定化作用又は受容体活性維持作用）、抗原性、免疫原性活性などにおいても、改変前のアミノ酸配列、即ち配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、実質的に同質であるのが好ましい。

本明細書において、ポリペプチド（ａ）及び（ｂ）が有する、カルシウムイオンリーク抑制作用、カルシウムハンドリング異常（制御異常）改善作用、リアノジン受容体機能安定化作用、リアノジン受容体機能維持（改善）作用、リアノジン受容体とＦＫ５０６結合タンパク質との結合強度低下抑制作用、リアノジン受容体リン酸化抑制作用、リアノジン受容体構造維持作用等の活性を、以下単に「カルシウムイオンリーク抑制活性」という。

本発明ポリペプチドの有するカルシウムイオンリーク抑制作用は、本発明ポリペプチドの発現能を付与した細胞ないし組織に、カルシウムイオンリークを誘導する物質を投与した際、該細胞ないし組織が元の（発現能を付与していない）細胞ないし組織と対比して、カルシウムイオンリークが抑制されているか、小胞体内のカルシウムイオン濃度が上昇していることをいう。より具体的には、本発明ポリペプチドの有するカルシウムイオンリーク抑制作用は、例えばＦＫ５０６などのリアノジン受容体とＦＫＢＰ１２．６の結合を解離させカルシウムイオンを細胞へ放出させる物質によって誘導される、或いはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）がリアノジン受容体をリン酸化することでリアノジン受容体とＦＫＢＰ１２．６の結合を解離させる物質によって誘導される、細胞又は組織における小胞体のカルシウムイオンリークに対する抑制作用ということができる。

本発明ポリペプチドは、上記したようにヒトリアノジン受容体タイプ２アミノ酸配列の部分配列ペプチドであり、ヒトリアノジン受容体は、ヒト組織の様々な組織においてその発現が観察されている。前記ヒトリアノジン受容体は、骨格筋、脳（特に、小脳）に局在するＲｙＲ１；心筋、平滑筋、脳（全般）に局在するＲｙＲ２；及び脳（特に、海馬、視床）、平滑筋、骨格筋に存在するＲｙＲ３の３つのサブタイプが確認されており、最近では、糖尿病モデル動物でＲｙＲ２の機能不全や発現低下が報告されており〔Ｂｉｄａｓｅｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ６０， １３５６−１３６４ （２００１）； Ｏｋａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ４０， １４８５−１４９１（１９９７）〕、糖尿病の病態への関与が示唆されている。

本発明ポリペプチドの細胞又は組織における小胞体のカルシウムイオンリークに対する抑制作用によれば、それを有効成分とする医薬として使用可能である。カルシウムイオンリークと各種疾患との関連について以下に示される各種の報告があり、それらによれば、本発明ポリペプチドを有効成分とする医薬として、これらの疾患に対して使用できる可能性が考えられる。

心不全： 心不全は、様々な心疾患の終末像としての症候群であり、原疾患によらず拡張期の細胞質でのカルシウム濃度の上昇が報告されている。このカルシウムオーバーロードにはリアノジン受容体からのカルシウムリークが深く関与しており（非特許文献８）、これを抑制する物質の利用は、今までにない新しい心不全の有力な治療戦略となり得る。

心筋症： 肥大型心筋症では、肥大の進行とカルシウム調節蛋白であるカルシニューリンに深い関係があることが判明している〔Ｓｕｓｓｍａｎ Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１：１６９０−１６９３（１９９８）〕。細胞内カルシウムオーバーロードの抑制は、心肥大の進行抑制に効果があると考えられる。心筋症も最終的には心筋収縮力の低下、心不全へと進行する。上記のように心不全ではカルシウムリークが深く関与しており（非特許文献８）、これを抑制する物質の利用は、新しい心不全の有力な治療戦略となり得る。

弁膜症： 心臓弁膜症は、弁膜の閉鎖不全あるいは狭窄を生じ、慢性的に心臓に負荷がかかり、最終的には心不全に至る疾患である。最終的には心筋収縮力の低下、心不全へと進行する。上記のように心不全ではカルシウムリークが深く関与しており（非特許文献８）、これを抑制する物質の利用は、新しい心不全の有力な治療戦略となり得る。

虚血性心疾患： 虚血再潅流時には筋小胞体のみならずＮＣＸ、ミトコンドリアなどに多くの異常が生じ、結果的に細胞内は著明なカルシウムオーバーロードとなることが知られている。このカルシウムオーバーロードに対しリアノジン受容体が果たす役割の大きさについてはいまだ明確ではないが、本発明者らが、先に心不全においてリアノジン受容体に作用することを示したＪＴＶ５１９は、虚血再潅流障害に効果があることが知られており〔Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． Ｒｅｓ．， ２５：３０３−９（２００２）〕、カルシウムリークの抑制が虚血性心疾患の再潅流障害にも有効であろうことが伺われ、カルシウムリークを抑制する物質には、虚血性心疾患に対する新しい治療剤としての可能性が考えられる。

心筋梗塞： 上記虚血性心疾患同様、カルシウムリークの抑制は、虚血性心疾患の再潅流障害にも有効であろうと考えられる。また心筋梗塞後の患者における心不全の予防にもカルシウムリークの抑制が有効であろうと考えられることから、カルシウムリークを抑制する物質には、新しい心筋梗塞治療剤としての可能性が考えられる。

狭心症： 上記虚血性心疾患同様、カルシウムリークの抑制が虚血性心疾患の再潅流障害にも有効であろうと考えられることから、カルシウムリークを抑制する物質には、新しい狭心症治療剤としての可能性が考えられる。

不整脈： 心筋型リアノジン受容体の突然変異は、チャネルの性質としてはカルシウムリークを起こしやすくなり、また疾患の表現形としては致死的不整脈を生じる〔Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ．， ５４：２５７−６７（２００３）〕。この事実からもリアノジン受容体を介したカルシウムリークと致死的不整脈には深い関係があると考えられ、カルシウムリークを抑制する物質の利用は、新しい不整脈の治療戦略となり得る。

高血圧症及び末梢循環障害： 動脈硬化発症には、血管平滑筋での細胞内でのカルシウムイオン濃度の上昇が関係している。通常、血管平滑筋における細胞内カルシウムイオンの調節はＩＰ３受容体が行っているが、最近、リアノジン受容体も血管平滑筋に分布し、そのカルシウムイオン濃度調節に関与していることがわかってきた〔Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ８９：１０５１−１０６７（２００１）〕。リアノジン受容体からのカルシウムリークの抑制が血管壁の動脈硬化をも抑制できる可能性がある。これらのことより、カルシウムリークを抑制する物質には、高血圧症及び末梢循環障害改善剤としての可能性が考えられる。

糖尿病： β細胞におけるインスリン分泌には、ＦＫＢＰ１２．６を介したリアノジン受容体からのカルシウム放出が深く関係している〔Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：３１３３−６（１９９７）〕。リアノジン受容体からのカルシウムリークを抑制する物質には、インスリン分泌を正常化し、糖尿病を治療できる可能性がある。

記憶障害： アルツハイマー病において、リアノジン受容体の異常が報告されており〔Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ９２：４９９−５１３（１９９９）〕。これを是正する物質は、アルツハイマー病あるいは記憶障害の治療につながる可能性がある。

脳梗塞： 脳虚血時の細胞死には、細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇が深く関与している。脳の神経細胞の小胞体にはリアノジン受容体も多数存在しており、リアノジン受容体の抑制薬であるダントロレンが脳虚血時の神経細胞死を抑制したとの報告もある〔Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ．， １５８：１０５−１０８（１９９３）〕。従ってリアノジン受容体からのカルシウムリークを抑制する物質が脳虚血時の神経細胞死を大幅に減少させる可能性があり、当該物質には脳梗塞の治療剤としての可能性が考えられる。

悪性高熱症： 悪性高熱症は、骨格筋型リアノジン受容体の突然変異によってリアノジン受容体がハロセンなどの麻酔薬に対する感受性を増大させてしまう結果、麻酔時にリアノジン受容体からのカルシウムイオン放出を招き、高熱、筋拘縮を生じる致死的遺伝疾患である。ハロセンに対する異常な感受性増大は、骨格筋型リアノジン受容体のチャネル制御ドメインが関与しており、カルシウムハンドリング異常を調節する物質がリアノジン受容体の安定化を促し、悪性高熱症に対する新しい治療薬となり得る可能性がある。

以上のように、心不全、心筋症、弁膜症、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、不整脈、高血圧症、末梢循環障害、糖尿病、記憶障害、脳梗塞、悪性高熱症などの発症と、小胞体のカルシウムイオンのリーク抑制との関係が、それらに関与する小胞体カルシウムイオンのリーク抑制作用と共に報告されており、本発明ポリペプチドにおける小胞体のカルシウムイオンのリーク抑制作用は、該ポリペプチド自体がこのような標的細胞における筋小胞体のカルシウムイオンのリークを抑制して、上記各種の疾患の治療、予防に有用であることを示唆している。

〔２〕本発明ポリヌクレオチド（ＤＮＡ分子）
また、本発明のポリヌクレオチドは、下記の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）
（ｃ）配列番号３〜９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）上記（ｃ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得、且つ発現可能なポリヌクレオチド
（ｅ）上記（ｃ）のポリヌクレオチドと８０％以上相同するＤＮＡ配列からなり、且つ発現可能なポリヌクレオチド
であって、その発現物が標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用を有するポリヌクレオチドである。

本発明ポリヌクレオチド（以下、「本発明ＤＮＡ分子」という）のうち、上記ポリヌクレオチド（ｃ）は、配列番号２０〜２６で示されるＤＮＡ配列又はその相補鎖を含むポリヌクレオチドからなるＤＮＡ分子を挙げることができる。

他の本発明ＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）には、（ｄ）上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用を発現可能なポリヌクレオチドが包含される。ここで「ストリンジェントな条件」とは、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、５０℃でハイブリダイズし、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中、６０℃での洗浄によっても脱離しない条件を挙げることができる。

更に他の本発明ＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）には、（ｅ）上記ポリヌクレオチドと８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上、相同するＤＮＡ配列からなり且つ標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用（特に筋小胞体における標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用）を発現可能なポリヌクレオチドが含まれる。

これらのポリヌクレオチド（以下、「改変体」ということがある）は、標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用（特に筋小胞体における標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用）を発現可能であることをその必須の要件とする。該要件は、換言すれば、これらのポリヌクレオチド（改変体）を挿入した組換え体発現ベクターで形質転換した形質転換体が、その発現物として、標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用（特に筋小胞体における標的細胞においてカルシウムイオンリーク抑制作用）を有する蛋白を発現できることである。

上記改変体には、配列番号３〜９、特に配列番号３において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列（改変されたアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子が包含される。該改変体は、その利用によって改変前の本発明ＤＮＡ分子が検出できるものであってもよい。

本発明ＤＮＡ分子には、更に、配列番号２０〜２６で示されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド（ＲｙＲ２遺伝子断片）の相同物も包含される。ここで「ＲｙＲ２遺伝子断片の相同物」とは、前記配列番号２０〜２６で示されるＤＮＡ配列と配列相同性を有し、構造的特徴並びにポリヌクレオチドの発現パターンにおける共通性及び生物学的機能の類似性より、ひとつのＤＮＡ分子ファミリーと認識される一連の関連ＤＮＡ分子を意味する。これにはＲｙＲ２遺伝子断片に対するアレル体（対立遺伝子）も含まれる。

アミノ酸配列の改変（変異）などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることがある。また天然由来のＤＮＡ分子（例えば本発明のＲｙＲ２遺伝子断片）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明ＤＮＡ分子は、このような改変、変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ＤＮＡ分子を包含する。

上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５４， ３５０， ３６７−３８２ （１９８７）；同１００， ４６８ （１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２， ９４４１ （１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編， ｐ１０５ （１９８６）〕などの遺伝子工学的手法；リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法などの化学合成手段〔Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８９， ４８０１ （１９６７）；同９１， ３３５０ （１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５０， １７８ （１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ２２， １８５９ （１９８１）；同２４， ２４５ （１９８３）〕及びそれらの組合せが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法又はトリエステル法による化学合成で行うこともでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該相補鎖を化学合成した一本鎖とアニーリングさせるか、又は適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて該相補鎖を化学合成した一本鎖に付加することによって得ることができる。

本発明ＤＮＡ分子（例えばヒトＲｙＲ２遺伝子断片）の具体的一態様である配列番号２０〜２６で示されるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、配列番号３〜９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの各アミノ酸残基をコードする各コドンの一つの組合せ例である。本発明ＤＮＡ分子は、かかる特定のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択したＤＮＡ配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができる。その際には例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ｎｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ９， ４３ （１９８１）〕。

〔３〕本発明ＤＮＡ分子の製造
本発明ＤＮＡ分子は、本明細書に開示された本発明のポリヌクレオチドのＲｙＲ２遺伝子の部分核酸配列断片の具体例についての配列情報に基づいて、或いはＲｙＲ２アミノ酸配列の部分配列の情報に基づいて、該配列がコードする核酸配列に相当するＤＮＡ分子をそのまま合成する化学的ＤＮＡ合成法、或いは一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ （１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。

例えば、ＤＮＡ分子をそのまま合成する化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を用いて自動合成機により容易に合成できる。

また、遺伝子工学的手法による製造は、具体的には、本発明ＤＮＡ分子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから本発明のＤＮＡ分子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択して実施できる〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ７８， ６６１３ （１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２２， ７７８ （１９８３）など〕。

上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示することができる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離及び精製、ｃＤＮＡの取得及びそのクローニングなどは、いずれも常法に従って実施することができる。また、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは市販されている。本発明遺伝子の製造は、それら市販のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）などから市販されている各種ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー、特にヒトの心臓のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを用いて実施することもできる。

本発明ＤＮＡ分子をｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的方法としては、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法など、及びこれらの組合せを例示することができる。

上記において用いられるプローブとしては、本発明ＤＮＡ分子のＤＮＡ配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的である。また、既に取得された本発明遺伝子及びその断片も上記プローブとして有利に利用できる。更に、本発明ＤＮＡ分子のＤＮＡ配列情報に基づき設定したセンス・プライマー及びアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることもできる。

プローブとして用いられるヌクレオチドは、配列番号２０に対応する部分ヌクレオチドであって、少なくとも１５個の連続したＤＮＡ、好ましくは少なくとも２０個の連続したＤＮＡ、より好ましくは少なくとも３０個の連続したＤＮＡを有するものである。前記した本発明ＤＮＡ分子の製造のための陽性クローン自体もプローブとして用いることができる。

本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０， １３５０ （１９８５）〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得難い場合には、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６）， ３５ （１９９４）〕、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ． Ａ． Ｆｒｏｈｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ８， ８９９８ （１９８８）〕などの採用が好適である。

ＰＣＲ法の実施の際に用いられるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定し、常法に従って合成することができる。尚、ＰＣＲ法で増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法に従い例えばゲル電気泳動法などによって実施することができる。

上記で得られる本発明ＤＮＡ分子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ７４， ５４６３ （１９７７）〕、マキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ６５， ４９９ （１９８０）〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、そのＤＮＡ配列を決定することができる。

〔４〕本発明ポリペプチドの遺伝子工学的製造
本発明ポリペプチド（発現物）は、本発明遺伝子を利用して、通常の遺伝子工学的手法（例えばＳｃｉｅｎｃｅ， ２２４， １４３１ （１９８４）； Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １３０， ６９２ （１９８５）； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ８０， ５９９０ （１９８３）など）に従って、該遺伝子の発現物として又はこれを含む蛋白質として、容易に、大量に且つ安定して製造することができる。より詳細には、所望の蛋白質をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的蛋白質を回収することにより、本発明ポリペプチド（発現物）を得ることができる。

本発明は、本発明ＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）によってコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの製造のための、例えば本発明ＤＮＡ分子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して本発明ポリペプチドを製造する方法などをも提供する。

上記において、宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができる。例えば原核生物の宿主は、大腸菌、枯草菌などの一般的に用いられるもののいずれでもよい。好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株を利用できる。真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母などの細胞が含まれる。前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ， ２３： １７５ （１９８１）〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ７７： ４２１６ （１９８０）〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。

原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡＬ−Ｐ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを例示できる。

脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ〔Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １： ８５４ （１９８１）〕などが例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Ｃｌｏｎｔｒｅｃｈ社）、ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の動物細胞用ベクター；ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。

また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ８０： １ （１９８３）〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＰＩＣＺα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが包含される。

プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。

尚、本発明ＤＮＡ分子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを例示できる。

また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列などが例示できる。これらの配列には、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列（ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ）、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン（ＨＡ）・タグが含まれる。

所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。

得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外又は細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。

該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。

かくして得られる組換え蛋白質（本発明ポリペプチド）は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９ 頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２５（２５）， ８２７４ （１９８６）； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６３， ３１３ （１９８７）など参照〕により分離、精製できる。

該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明ポリペプチドに対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。

尚、本発明ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの設計に際しては、配列番号２に示されるＲｙＲ２遺伝子のＤＮＡ配列を利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。

また、ＲｙＲ２遺伝子によりコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしアミノ酸配列を置換、挿入、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法を採用することができる。

〔５〕本発明発現物
本発明医薬組成物において有効成分とする本発明ポリヌクレオチドの発現物（及び本発明スクリーニング方法に利用する同発現物）（以下、単に「本発明発現物」という）は、前記〔４〕に示した遺伝子工学的手法により得ることができる。

本発明発現物も、前記〔１〕項に記載した本発明ポリペプチドと同様、標的細胞におけるカルシウムイオンリーク抑制作用（特に筋小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用）を有し、前述した治療又は予防剤として有用である。

〔６〕本発明ポリペプチドの化学合成
本発明ポリペプチドは、配列番号３〜９に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することもできる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。

ペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明ポリペプチドの合成は、そのいずれによってもよい。

ペプチド合成に採用される縮合法も常法に従うことができる。例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法などに従うことができる。

これら各方法に利用される溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることの知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチルなど及びこれらの混合溶媒などを挙げることができる。

なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸ないしペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。

また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基などで保護してもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。

保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明ポリペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。

かくして得られる本発明ポリペプチドは、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製することができる。

〔７〕本発明医薬組成物
本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチド又は本発明発現物を有効成分とする。該医薬組成物は、例えば標的細胞のカルシウムイオンリーク抑制作用（特に筋小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用）を有する医薬組成物として、又はカルシウムハンドリング（制御）改善剤として有用である。また、上記カルシウムイオンリーク抑制剤及びカルシウムハンドリング（制御）改善剤としての作用により、心不全、心筋症、弁膜症、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、不整脈、高血圧症、末梢循環障害、糖尿病、記憶障害、脳梗塞、悪性高熱症などに対する治療剤及び予防剤としても有用である。

より詳しくは、本発明医薬組成物において有効成分とする本発明ポリペプチド及び本発明発現物（例えばＲ２Ｐ）は、例えばＦＫ５０６によってそれらに特有の筋小胞体におけるカルシウムイオンのリークが誘導された該カルシウムイオンリークを抑制する作用を有しており、この作用ないし活性を、各種細胞のカルシウムイオンリーク抑制及びカルシウムハンドリング異常に関連する疾患の処置に利用することができる。かかるカルシウムイオンリーク誘導、及びカルシウムハンドリング異常の影響を受ける標的細胞としては、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、脳神経細胞、神経芽細胞、膵β細胞などを挙げることができる。これらの細胞を含む重要な組織としては、心臓、動脈血管、筋肉組織、小脳、大脳皮質、中脳、脳下垂体などの脳神経組織、膵臓、膵臓などを挙げることができる。

上記筋小胞体としては、正常心筋又は不全心筋から調製された筋小胞体、血管平滑筋から調製された筋小胞体、骨格筋から調製された筋小胞体などが挙げられる。

本発明医薬組成物における有効成分である本発明ポリペプチド又は本発明発現物には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明ポリペプチド又は本発明発現物と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナプシレートなどが例示される。

本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチド若しくは本発明発現物又はそれらの塩を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な医薬担体ないし希釈剤と共に含有させて医薬製剤形態に調製される。

該医薬製剤の調製に利用される医薬担体としては、製剤形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。特に好ましい医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用される各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。

上記において安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示できる。これらは単独で又は界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。糖類としても、特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類；マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール；ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類；デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類など及びそれらの誘導体などを使用できる。界面活性剤としても、特に限定はなく、イオン性及び非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。その具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。セルロース誘導体としても、特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。

上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。Ｌ−アミノ酸の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。

本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、製剤中に約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度が含まれる量とするのが適当である。

本発明医薬組成物中には、また各種の添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸及び／又はそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。

本発明医薬組成物は、溶液製剤として調製できるほかに、これを凍結乾燥し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製される凍結乾燥剤形態とすることも可能である。

本発明医薬組成物の投与単位形態は、治療目的に応じて適宜選択できる。その代表例には、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態及び溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形ないし調製することができる。尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。

本発明医薬組成物の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独で又はブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下若しくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。

本発明医薬組成物中に含有される有効成分の投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１回又は数回に分けて投与することができる。

〔８〕カルシウムイオンリーク抑制作用促進物質（アゴニスト）及び阻害物質（アンタゴニスト）のスクリーニング
本発明は、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用（又はカルシウムハンドリング異常改善作用）を促進又は阻害する候補化合物をスクリーニングする方法をも提供する。

該方法は、被験物質の存在下及び非存在下に、本発明ポリペプチド又は本発明ポリヌクレオチドの発現物による、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用（又はカルシウムハンドリング異常改善作用）の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニスト又は該抑制作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする。

ここで、ポリペプチドの標的細胞における（特に小胞体における）カルシウムイオンリーク抑制作用又はカルシウムハンドリング異常改善作用の抑制の程度は、例えば、本発明のペプチドの存在下・非存在下、及び被験物質の存在下・非存在下における心筋由来の小胞体におけるカルシウムイオンの取り込み量を測定し、次いで小胞体にＦＫ５０６を添加して、リアノジン受容体とＦＫＢＰ１２．６の結合を解離させ、カルシウムイオンリークを誘導した後、ＦＫ５０６により誘導される細胞又は組織における小胞体のカルシウムイオンのリークに対する抑制作用をカルシウムイオン・インディケーターにより検出することにより筋小胞体からのカルシウムイオンの流出の減少量として求められる。

本発明ポリペプチド及び本発明発現物の標的細胞におけるカルシウムイオンリーク抑制作用（特に筋小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用）又はカルシウムハンドリング異常改善作用の検出は、公知の方法によって行うことができる。

更に詳しくは、カルシウムイオンリークの誘導及びその抑制作用の検出は、例えば
（１）筋小胞体からのカルシウムイオンのリーク及びその抑制作用は、例えば、Ｍ． Ｙａｎｏ ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０２， ２１３１−２１３６ （２０００）に記載の方法に従って測定することができる。

具体的には、例えば、本発明ペプチド又は本発明発現物の存在下、非存在下における心筋由来の小胞体におけるカルシウムイオンの取り込み量を測定し、次いでＦＫ５０６を添加して、リアノジン受容体とＦＫＢＰ１２．６の結合を解離させ、カルシウムイオンリークを誘導した後、ＦＫ５０６により誘導される細胞又は組織における小胞体のカルシウムイオンのリークに対する抑制作用をカルシウムイオン・インディケーターにより検出することができる。

より詳しくは、筋小胞体を、遊離カルシウム濃度０．３μｍｏｌ／Ｌのカルシウムを含む緩衝液でインキュベートし、得られた混合物に、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰを添加することにより、カルシウムイオンの細胞への取り込みを開始し、カルシウムイオン量の取り込みのタイムコースを、カルシウムイオン・インディケーターとしてフルオ３（ｆｌｕｏ ３）を用いて、励起波長４８０ｎｍ、発光波長５３０ｎｍにおける吸光度を吸光度計により測定し、カルシウムイオンの取り込みがプラトーに達した後、本発明ペプチド又は本発明発現物の存在下、非存在下におけるＦＫ５０６を添加後のカルシウムイオンのリークをカルシウムイオン・インディケーターにより測定することによりカルシウムイオンのリーク抑制作用を検出することができる。また、上記方法において、カルシウムイオンリークを誘導剤として、ＦＫ５０６に代えて、ラパマイシンを用いてもよい。

また、本発明にいう「カルシウムイオンリーク抑制活性」には、小胞体のカルシウムイオンリーク抑制作用のほか、カルシウムハンドリング異常（制御異常）改善作用、リアノジン受容体機能安定化作用、リアノジン受容体機能維持（改善）作用、リアノジン受容体とＦＫ５０６結合タンパク質との結合強度低下抑制作用、リアノジン受容体リン酸化抑制作用、及び／又はリアノジン受容体構造維持作用を有するポリペプチドが有する活性をも含むことから、更に、以下の検出方法を例示することができる。

（２）リアノジン受容体リン酸化抑制作用の検出としては、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）がリアノジン受容体をリン酸化することで、リアノジン受容体とＦＫＢＰ１２．６の結合を解離させて、カルシウムイオンリークを誘導する物質により誘導される細胞又は組織における小胞体のカルシウムイオンリークに対する抑制作用を検出することが可能である。

即ち、本発明ペプチド又は本発明発現物の上記リアノジン受容体のリン酸化抑制作用は、例えば、本発明ペプチド又は本発明発現物の存在下、非存在下におけるプロテインキナーゼＡを介するリン酸化の度合いを測定することができる〔例えば、Ｓｔｅｖｅｎ Ｏ， Ｍａｒｘら、Ｃｅｌｌ， １０１， ３６５−３７６ （２０００） 、又はＲｅｉｋｅｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ４４４−４５３ （２００３）を参照〕。

（３）リアノジン受容体構造維持作用による本発明ペプチド又は本発明発現物によるリアノジン受容体の構造維持作用の検出は、例えば、ヤノ（Ｙａｎｏ， Ｍ．）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０２， ２１３１−２１３６ （２０００）に記載の方法に従って、小胞体におけるＭＣＡ蛍光強度の変化を観察することによって検出することができる。

（４）リアノジン受容体とＦＫ５０６結合タンパク質との結合強度低下抑制作用としては、本発明ペプチド又は本発明発現物によるリアノジン受容体（ＲｙＲ）と ＦＫ５０６結合タンパク質１２．６（ＦＫＢＰ１２．６）との結合強度低下抑制作用は、例えば、表面プラズモン解析などにより、ＲｙＲとＦＫＢＰ１２．６との間の結合強度を測定することにより、測定することができる。

具体的には、例えば、ＲｙＲ又はＦＫＢＰ１２．６を固定化したチップに、対応してＦＫＢＰ１２．６又はＲｙＲを含有した本発明ペプチド若しくは本発明発現物の含有溶液又は非含有溶液を、一定の流速で送液し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化により、ＲｙＲとＦＫＢＰ１２．６とからなる複合体の形成を示すセンサーグラムを得、それぞれの条件下におけるセンサーグラムから結合速度を求め、それらの比較により、結合速度を求め、それにより、結合強度の低下の抑制を測定することができる。

（５）カルシウムハンドリング異常（制御異常）改善作用の検出は、少なくとも上記（１）〜（４）の各検出方法のいずれかの方法を用いて、リアノジン受容体の安定化を介したカルシウムイオンの筋小胞体内外への移動異常に基づく筋小胞体内におけるカルシウムイオン濃度の変化やそれに対応する細胞の変化を検出し、正常状態へ向かうか否かを検出することができる。

また、本発明は、以下の（１）〜（５）の工程を含む、本発明ポリペプチドによる、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用（又はカルシウムハンドリング異常改善作用）を増強する候補物質のスクリーニング方法を提供する。
（１）本発明ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程
（２）被験物質の存在下及び非存在下に、該標的細胞の小胞体にＦＫ５０６を添加して、カルシウムイオンリークを誘導する工程
（３）被験物質の存在下及び非存在下での標的細胞の小胞体からのカルシウムイオンリークをカルシウムイオン・インディケーターにより計測し、小胞体からのカルシウムイオン流出の変化量をそれぞれ求める工程
（４）被験物質の非存在下に、非形質転換細胞の小胞体にＦＫ５０６を添加して、カルシウムイオンリークを誘導させた小胞体からのカルシウムイオンリークをカルシウムイオン・インディケーターにより計測し、小胞体の外側におけるカルシウムイオンの値を基準値として、上記（３）で求められた各値と該基準値との差を求める工程
（５）被験物質の存在下における基準値との差が、被験物質の非存在下における基準値との差と比べて、小である場合に、該被験物質を候補物質として選択する工程

更に本発明は、以下の（１）〜（５）の工程を含む、本発明発現物による、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用（又はカルシウムハンドリング異常改善作用）を増強する候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
（１）本発明ポリヌクレオチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程
（２）被験物質の存在下及び非存在下に、該標的細胞に小胞体にＦＫ５０６を添加してカルシウムイオンリークを誘導する工程
（３）被験物質の存在下及び非存在下での上記標的細胞の小胞体におけるポリヌクレオチド発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、それぞれ求める工程
（４）被験物質の存在下における上記発現量を、被験物質の非存在下における同発現量と対比する工程
（５）被験物質の存在下における発現量が、非存在下における発現量に比して増加している場合に、該被験物質を候補物質として選択する工程

更に本発明は、以下の（１）〜（５）の工程を含む、本発明ポリペプチドによる、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用（又はカルシウムハンドリング異常改善作用）を増強する候補物質のスクリーニング方法を提供する。
（１）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程
（２）被験物質の存在下及び非存在下に、該標的細胞の小胞体にＦＫ５０６を添加してカルシウムイオンリークを誘導する工程
（３）被験物質の存在下及び非存在下での標的細胞におけるポリペプチド産生量を、該ポリペプチドに対する抗体を用いて、それぞれ求める工程
（４）被験物質の非存在下における産生量と、被験物質の存在下における産生量とを対比する工程
（５）被験物質の存在下における産生量が非存在下におけるそれに比して増加している場合に、該被験物質を候補物質として選択する工程

これらのスクリーニング方法において、配列番号３〜９で示される本発明ポリペプチド（例えば、配列番号３のＲ２Ｐ若しくはＲ２Ｐポリヌクレオチド発現物、以下、これらを単に「Ｒ２Ｐ」という）の発現量ないし産生量は、該ポリペプチドに対する抗体を、被験物質を含む被験液中で標識化されたＲ２Ｐと競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＲ２Ｐの割合として測定することができる。また、被験液と担体上に不溶化した抗体及び標識化された別の異なる抗Ｒ２Ｐ抗体とを同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによっても、被験液中のＲ２Ｐを定量することが可能である。

本発明スクリーニング方法によれば、Ｒ２Ｐとリガンドとの結合を、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー及び天然物混合物中で評価することができる。

Ｒ２Ｐが有する、カルシウムイオンリークを抑制し、細胞におけるカルシウムハンドリング異常（制御異常）を改善する作用の促進若しくは亢進剤、又は阻害（インヒビター）若しくは低下剤は、天然の基質又はリガンドであってもよく、それらの構造的又は機能的模擬体であってもよい。

本発明スクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニング技術を応用することができる。この技術の応用によれば、例えば、カルシウムイオンリーク抑制剤又はカルシウムイオンリーク促進剤、或いは細胞の筋小胞体におけるカルシウムハンドリング異常（制御異常）の改善促進剤又は改善抑制剤に関するスクリーニングにおいては、合成反応混合物、細胞画分、例えば小胞体、膜、細胞エンベロープ、細胞壁又はこれらのいずれかの調製物（Ｒ２Ｐと該ポリペプチドの標識リガンドを含むもの）を、スクリーニングされる被験物質の存在下又は不存在下でインキュベートする。該被験物質がＲ２Ｐを作動させるか又はＲ２Ｐの作用に拮抗するかは、該標識リガンドの結合の減少により検出される。Ｒ２Ｐの作用を誘導することなくカルシウムイオンリークを抑制するか、或いはカルシウムハンドリング異常（制御異常）を改善する被験物質が良好なカルシウムイオンリーク抑制剤、又はカルシウムハンドリング異常（制御異常）の改善剤である可能性が高い。一方、Ｒ２Ｐに結合してカルシウムイオンリークを増加させる化合物は、Ｒ２Ｐの阻害剤とみなされる。Ｒ２Ｐの活性レベルの検出は、比色標識など（これに限定されるものではない）のレポーター系、ポリヌクレオチド又はポリペプチド活性の変化に応答するレポーター遺伝子の組込み及び当技術分野で公知の結合アッセイを用いることにより実施され得る。

Ｒ２Ｐ又は他の変異物（ＭＳＶ−Ｒ２Ｐ、ＲＰ１−２０、ＲＰ１３−３２、ＲＰ１７−３６、ＲＰ１−３０、ＲＰ１−２５）及びその他のカルシウムイオンリーク抑制剤（例えば、ＪＴＶ５１９、ジルチアゼムなどのカルシウム拮抗剤、プロプラノールなどのβ遮断薬）を、それらに結合する化合物と組合せる競合アッセイも、カルシウムイオンリーク抑制又は促進剤、或いはカルシウムハンドリング異常（制御異常）改善剤又はカルシウムハンドリング異常（制御異常）増加剤としての候補化合物のスクリーニングに用いることができる。

本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（薬剤候補化合物）は、カルシウムイオンリーク抑制活性促進物質（特にカルシウムイオンリーク抑制物質又はカルシウムハンドリング異常（制御異常）改善物質：アゴニスト）及びカルシウムイオンリーク抑制活性抑制物質（特にカルシウムイオンリーク促進物質又はカルシウムハンドリング異常（制御異常）増加物質：アンタゴニスト）の両者を含んでいる。即ち、アゴニストは、本発明スクリーニング系において、その存在によって測定されるカルシウムイオンリーク抑制活性を上昇させる物質であり、アンタゴニストは、逆にその存在によって測定されるカルシウムイオンリーク抑制活性を低下させる物質である。

これら被験物質の具体例には、例えばオリゴペプチド、蛋白質、抗体、ＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、非ペプチド性化合物（合成化合物）、発酵生産物、細胞抽出液（植物抽出液、動物組織抽出液など）、血漿などが含まれる。これらの物質は新たに開発されたものであっても、既知物質であってもよい。

カルシウムイオンリーク抑制物質には、例えばＲ２Ｐに結合してその活性を増加する無機又は有機の低分子化合物、天然若しくは合成の又は遺伝子組換え技術により調製されたペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。また、生体内に直接に又は組換えベクターに挿入された形態で投与されるＲ２ＰをコードするＤＮＡに対するセンスＤＮＡ分子も含まれる。

カルシウムイオンリーク促進物質には、Ｒ２Ｐにより誘導される活性（カルシウムイオンリーク抑制活性）を誘導することなく、Ｒ２Ｐが結合する分子の同一部位に結合してＲ２Ｐの作用をその結合の阻止により妨げる作用を奏し得る有機又は無機の低分子化合物、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アンチセンスＤＮＡ分子（例えば、Ｏｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ５６： ５６０ （１９９１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８）を参照）、ＲＮＡインターフェアランス効果を有するＲＮＡ分子（例えば、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ， Ａ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１８， ３８−３９（２００２）を参照）などが含まれる。

本発明スクリーニング方法に従ってスクリーニングされるカルシウムイオンリーク抑制活性を活性化又は阻害する作用を有する候補物質の評価は、次の如くして行うことができる。即ち、カルシウムイオンリーク抑制活性がコントロール（被験物質非存在）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進している場合、該候補物質はカルシウムイオンリーク抑制活性を促進する化合物として選択することができる。一方、例えば、カルシウムイオンリーク抑制活性がコントロール（被験物質非存在）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害されている場合、該被験物質はカルシウムイオンリーク抑制活性を阻害する化合物として選択することができる。

本発明スクリーニング方法により得られるカルシウムイオンリーク抑制活性を促進する物質は、本発明ポリペプチド又は本発明発現物と同様、カルシウムイオンリーク抑制又はカルシウムハンドリング異常によって生ずる細胞の異常に関連する疾患に対する医薬組成物の有効成分として有用である。

また、本発明スクリーニング方法により得られるカルシウムイオンリーク抑制活性を促進する物質は、筋小胞体からのカルシウムイオンの流出量を減少させることにより、筋小胞体内のカルシウムイオン濃度を増加し、細胞における筋肉収縮・弛緩機能異常、或いは筋肉収縮・弛緩機能障害を改善すると考えられることから、これを有効成分とする筋小胞体のカルシウムイオン増量剤として、医薬品分野をはじめとする各種の分野で有用である。

上記筋小胞体のカルシウムイオン増量剤、小胞体の該カルシウムイオンリーク抑制活性促進剤、筋小胞体のカルシウムハンドリング異常（制御異常）改善剤は、それぞれの作用を示す有効量を適当な製剤学的担体と共に含有する医薬組成物として、上記各疾患に適用することができる。

該医薬組成物において有効成分として利用する筋小胞体のカルシウムイオン促進物、小胞体のカルシウムイオンリーク抑制活性促進物、筋小胞体のカルシウムハンドリング異常（制御異常）改善物質は、医薬的に許容される塩とすることができる。この塩の種類、その調製法、医薬組成物の調製法、医薬組成物に利用される希釈剤、賦形剤などの医薬担体、医薬組成物の投与単位形態、投与経路、投与方法などは、前記本発明ポリペプチド又は本発明発現物を有効成分とする医薬組成物において詳述したそれらと、同様のものとすることができる。

医薬組成物中に含有させるべき有効成分の量及びその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般には、投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１回又は数回に分けて投与することができる。

〔９〕スクリーニング用キット
更に本発明は、標的細胞における本発明ポリペプチド及び本発明ポリヌクレオチドの発現物からなる群から選ばれる少なくとも１種と、ＦＫ５０６とを構成成分として含有することを特徴とする、該ポリペプチド又は発現物の標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用に対するアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングするためのスクリーニング用キットを提供する。

本発明スクリーニング用キットの一具体例は、本発明ポリペプチド（例えば、配列番号３〜９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）又は本発明発現物（例えば、配列番号２０〜２６に示されるＤＮＡ配列のポリヌクレオチドの発現物）と、筋小胞体におけるカルシウムイオンのリークを誘導する物質（即ちリアノジン受容体とＦＫ５０６結合タンパク質との結合を解離させるか、リアノジン受容体リン酸化を促進させることにより、筋小胞体内にカルシウムイオンのリーク誘導を促すことによって、筋小胞体のカルシウムイオンの取り込みを減少させカルシウムハンドリング（制御）異常を惹起し、結果として細胞における筋肉収縮・弛緩機能異常、或いは筋肉収縮・弛緩機能障害に導く物質）であるＦＫ５０６を必須構成成分として含むことが重要であって、他はこの種スクリーニング用キットと同様とすることができる。例えば、小胞体のカルシウムイオンリーク抑制活性（カルシウムハンドリング異常改善）を有するＲ２Ｐ等と共に、任意成分として、細胞培養液、反応希釈液、染色剤、緩衝液、固定液、洗浄剤などの各種試薬類を含むキットを挙げることができる。

本発明キットの具体例としては、次の構成１〜４からなるものを挙げることができる。

構成１． 標的細胞（標的Ｒ２Ｐ発現細胞、測定対象とする細胞にＲ２Ｐをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ分子）が導入されて形質転換された細胞）を、０．５×１０^５〜１×１０^５細胞／ウエルでＥＧＴＡ−Ｃａバッファを含むＭＯＰＳ緩衝液などを用いて６０ｍｍディッシュで５％炭酸ガス下に３７℃で培養したもの、
構成２． 小胞体におけるカルシウムイオンリーク誘導物（ＦＫ５０６）
構成３． カルシウム取り込み誘導物（例えば、ＡＴＰなど）及びカルシウムイオン指示薬（例えば、ｆｌｕｏ３など）
構成４． カルシウムＡＴＰアーゼ阻害剤（例えば、タプシガーギンなど）

本発明のスクリーニング用キットを利用したスクリーニング方法においては、供試化合物（被験物質、薬剤候補化合物）を加えたウエル単位視野当たりの標的細胞におけるカルシウムイオンの流出の変化量として検出し、供試化合物を加えていないコントロールのウエルにおける同細胞におけるカルシウムイオンの流出の変化量との有意差検定を行えばよい。

リアノジン受容体のカルシウム放出活性の測定は、上記以外にも、例えば単一チャンネル記録により開口頻度を測定する方法によってその頻度の変化数として評価、検出することもできる〔Ｒｅｉｋｅｎら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ４４４−４５３ （２００３）〕。

これらの測定、評価は、常法に従って実施することができる。

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明を限定するものではない。

本発明者らは、小胞体のカルシウムイオンリーク抑制作用を有する新規な物質の探索を目的として、まず、ＲｙＲ２の構造異常を正常化すると考えられる治療ペプチドとして、複数個のポリペプチドを合成し、小胞体のカルシウムイオンリーク抑制作用を有するポリペプチドの探索を行った。

（ａ）ポリペプチドの合成：
ポリペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル：９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）法による固相合成法により合成した。

活性化試薬は、ＴＢＴＵ〔２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ〕、ＨＯＢｔ〔１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ ｈｙｄｒａｔｅ〕を用い、反応方法は連続フロー方式で行った。

合成されたポリペプチドはヒトリアノジン受容体２（ｈＲｙＲ２：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ ００１０３５）のＮ末端からＣ末端に向けて、以下の配列に相当する合成ポリペプチドを得た。

ＤＲ３−１ ：ペプチド配列番号１８５２−１８７１ 配列番号１７
ＤＲ３−２ ：ペプチド配列番号１８６１−１８８０ 配列番号１８
ＤＲ３−３ ：ペプチド配列番号１８７１−１８９０ 配列番号１９
Ｒ２ ２０６８／８７ ：ペプチド配列番号２０６８−２０８７ 配列番号１３
Ｒ２ＪＮ２８ ：ペプチド配列番号２０８６−２１１３ 配列番号１４
Ｒ２ＪＦ ：ペプチド配列番号２０８６−２１３３ 配列番号１５
Ｒ２Ｐ ：ペプチド配列番号２１１４−２１４９ 配列番号 ３
Ｒ２ ２１５０／８５：ペプチド配列番号２１５０−２１８５ 配列番号１６

（ｂ）カルシウムイオンリーク抑制活性測定：
カルシウムイオンリーク抑制活性の測定は、ヤノ（Ｙａｎｏ， Ｍ．）らの方法に従って実施した〔Ｙａｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０２， ２１３１−２１３６ （２０００）〕。

まず、クラニアス（Ｋｒａｎｉａｓ）らの方法に従って、犬の心筋由来の筋小胞体を調製した〔Ｋｒａｎｉａｓ Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， ７０９， ２８−３７ （１９８２）〕。

次いで０．２ｍｇ／ｍＬの筋小胞体を０．１５ｍＭ グルコン酸カリウム、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ−カルシウム緩衝液（遊離カルシウム：カルシウムイオン＝０．３μＭ）及び１０ｍＭ ＮａＮ_３を含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．８）０．５ｍＬ中でインキュベートした。

得られた混合物に対して、蛍光値が安定した後に、０．５ｍＭのＡＴＰ（シグマ社製）及び０．５ｍＭの塩化マグネシウムを添加することにより、カルシウムイオンの取り込みを開始させた。カルシウムイオンの取り込みのタイムコースを測定した。カルシウムイオンの取り込み測定は、カルシウムイオン指示薬としてｆｌｕｏ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用い、励起波長４８０ｎｍ、発光波長５３０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光光度計により測定した。

カルシウムイオンの取り込みが定常状態に達したところで１μＭのタプシガーギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ：和光純薬社製）を加え、筋小胞体カルシウム−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）活性を阻害し、ＳＥＲＣＡの影響を排除した。ＡＴＰを添加する前の蛍光の値とＡＴＰによる能動的取り込み終了時、すなわち、取り込みが定常状態に達したときの値との差を１００％とした。従って、タプシガーギンを加えても蛍光の値が変化しない場合は０％となる〔なお、正常心筋由来の筋小胞体において１０〜２０％程度のリークは起こることがあると報告されている；Ｄｏｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０５， １３７４−１３７９（２００２）〕。

カルシウムイオンリーク誘導コントロールとして、タプシガーギンと３０μＭのＦＫ５０６（藤沢薬品工業社製）同時添加により誘発されたカルシウムイオンリークをカルシウムイオン指示薬により測定した。

カルシウムイオンリーク抑制活性のコントロールとしては、タプシガーギン、ＦＫ５０６投与と同時にカルシウムイオンリーク抑制活性を有する０．３μＭのＪＴＶ−５１９（ＪＴ社より分与された）を添加した場合におけるカルシウムイオンリークをカルシウムイオン指示薬により測定した。

タプシガーギン、ＦＫ５０６投与と同時に０．１μＭ、０．３μＭ、１．０μＭの各濃度の前記（ａ）で得られたポリペプチドと３０μＭ／ＬのＦＫ５０６を添加した場合におけるリアノジン受容体からのカルシウムイオンリーク誘導に対する抑制効果をカルシウムイオン指示薬により同様に測定した。

その結果を図１〜３に示す。図の縦軸はタプシガーギン、ＦＫ５０６、ペプチド等の添加から２０秒後の値を示した。データは、２〜３回測定した結果の平均値を示す。

図１〜３に示されるように、合成したポリペプチドのうち、ヒトリアノジン受容体２のペプチド配列番号２１１４−２１４９に相当する配列番号３で示されるＲ２Ｐが、濃度依存的にカルシウムイオンリークを抑制した。また１．０μＭのＲ２Ｐポリペプチド濃度において、カルシウムイオンリーク抑制作用を有することが知られている０．３μＭのＪＴＶ５１９と同等のカルシウムイオンリーク抑制効果を示した。

（ｃ）Ｒ２Ｐ関連ペプチドによるカルシウムイオンリーク抑制効果の検討：
上記実験において、ヒトリアノジン受容体２のペプチド配列番号２１１４−２１４９に相当する配列番号３で示されるＲ２Ｐにカルシウムイオンリーク抑制効果が確認されたことから、本発明者らは、さらにＲ２Ｐの部分ペプチド、あるいはＲ２Ｐの変異体として以下に示される配列のペプチドを合成し、それらのカルシウムイオンリーク抑制効果の有無について、カルシウムイオンリーク抑制効果を検討した。

すなわち、Ｒ２ＰのＮ末端に３アミノ酸を導入したペプチド（配列番号４）、Ｎ末端、Ｃ末端、Ｎ末端及びＣ末端の両者が欠失した部分配列ペプチド（配列番号５〜９及び１１）、一部のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体（配列番号１２）、ＲＰ１−２０の配列に対して逆向きの配列からなる変異体（配列番号１０）を合成し、上記（ｂ）と同様の方法に従ってそれらのカルシウムイオンリーク抑制効果を検討した。その結果を図４及び５に示す。

合成したペプチド：
ＭＳＶ−Ｒ２Ｐ ：ペプチド配列番号Ｍ＋２１１２−２１４９ 配列番号 ４
ＲＰ１−３０ ：ペプチド配列番号２１１４−２１４３ 配列番号 ５
ＲＰ１−２５ ：ペプチド配列番号２１１４−２１３８ 配列番号 ６
ＲＰ１−２０ ：ペプチド配列番号２１１４−２１３３ 配列番号 ７
ＲＰ１３−３２ ：ペプチド配列番号２１２６−２１４５ 配列番号 ８
ＲＰ１７−３６ ：ペプチド配列番号２１３０−２１４９ 配列番号 ９
ＲＰ１−２０ＲＥＶ：ペプチド配列番号２１３３−２１１４ 配列番号１０
ＲＰ１−１０ ：ペプチド配列番号２１１４−２１２３ 配列番号１１
Ｒ２ＭＰ ：ペプチド配列番号２１１４−２１４９（Ｖ２１３２Ｍ）
配列番号１２

その結果、配列番号４で示されるＭＳＶ−ＲＰ２、配列番号５で示されるＲＰ１−３０、配列番号６で示されるＲＰ１−２５、配列番号７で示されるＲＰ１−２０、配列番号８で示されるＲＰ１３−３２、及び配列番号９で示されるＲＰ１７−３６のポリペプチドが濃度依存的にカルシウムイオンリーク抑制効果を有することが判明した。しかしながら、カルシウムイオンリーク抑制活性の程度はＲ２Ｐに比較すると弱かった。

なお、合成した全ての変異体ペプチド、Ｒ２Ｐの前後の配列、及びＤＲ３領域由来の合成ポリペプチドには、カルシウムイオンリーク抑制効果は観られなかった。またＲ２Ｐ １−２０のＮ末端にカルシウムイオンリーク抑制効果の見られなかった配列番号１４で示されたペプチドを導入した配列番号１５で示されるＲ２ＪＦペプチドにも効果は見られなかった（図２）。

コントロールとして用いられたＪＴＶ−５１９は心不全心筋の筋小胞体からのカルシウムイオンリークを濃度依存的に抑制し、該ＪＴＶ−５１９は、頻脈誘発性イヌ心不全モデルにおける心機能改善作用を有し、正常イヌにおける心機能に影響を与えないことが知られている。

本発明のＲ２Ｐポリペプチドとその変異体を有効成分とする医薬は、カルシウムイオンリークを濃度依存的に抑制することから、ＪＴＶ−５１９と同様の作用効果を有することが考えられ、従って、筋小胞体からのカルシウムイオンリークの誘導やカルシウムハンドリング異常を原因とする筋肉収縮・弛緩機能障害が発症の原因となる疾患の治療又は予防剤として期待できる。

Claims (9)

1. 配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
2. 配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
3. 請求項１記載のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
4. 請求項２記載のポリヌクレオチドの発現物を有効成分として含有する医薬組成物。
5. 心不全、心筋症、弁膜症、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、不整脈及び高血圧症からなる群より選ばれる疾患の治療剤である請求項３又は４記載の医薬組成物。
6. 被験物質の存在下及び非存在下に、請求項１記載のポリペプチドによる、標的細胞としてのヒト心筋細胞又はヒト平滑筋細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニスト又は該抑制作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法（ただし、被験物質をヒトに投与する場合を除く）。
7. ポリペプチドによる標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用の程度が、被験物質の存在下及び非存在下に小胞体にFK506を添加して、カルシウムイオンリークをカルシウムイオン・インディケーターにより計測し、小胞体からのカルシウムイオン流出の減少量として求められるものである請求項６記載のスクリーニング方法。
8. 被験物質の存在下及び非存在下に、請求項２記載のポリヌクレオチドの発現物による、標的細胞としてのヒト心筋細胞又はヒト平滑筋細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強するアゴニスト又は該抑制作用を低減させるアンタゴニストを選択することを特徴とする、標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法（ただし、被験物質をヒトに投与する場合を除く）。
9. ヒト心筋細胞又はヒト平滑筋細胞のいずれかの標的細胞における請求項１記載のポリペプチドと、FK506とを構成成分として含有することを特徴とする、該ポリペプチドによる標的細胞の小胞体におけるカルシウムイオンリーク抑制作用に対するアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングするためのスクリーニング用キット。

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