JP4810657B2 - 基質感応膜素材およびそれを用いた酵素センサー - Google Patents

Description

本発明は、溶液中の基質を酵素反応により検知する酵素センサーの原材料である基質感応膜素材に関するものである。

酵素センサーは、医療分野で患者の血糖値等の計測、食品製造分野での品質管理、環境保全分野での環境計測などの際に、様々な測定対象物質の量を検出するためのものである。

酵素センサーは、酵素と測定対象物質である基質との特異的な高選択的反応による物理的または化学的変化を、電気信号、光、または熱に変換して検出するというものである。

このような酵素センサーとして、例えば、特許文献１に、酵素への検体の供給部、酵素への酸素供給部、ポリアクリルアミドゲル状電解質含浸ポリカーボネートと電極との電荷伝達体および酵素を含んでおり、検体中の電極活性物量を酵素反応生成物によって生じる電流で検出する検出部を有するバイオセンサーが、開示されている。また、非特許文献１に、アセトニトリル中の基質のカテコールへ反応させる酵素のチロシナーゼを含む非可塑性ポリアクリルアミドメンブランでコーティングした白金ディスク電極が、開示されている。

親水性高分子のポリアクリルアミドが含有する酵素と、非水溶媒のみに溶解している基質との間で起こる酵素反応を検出する非水溶液系の酵素センサーは、水溶液系の酵素センサーに比べ応答速度が遅く、再現性に欠けるという問題があった。

特開２００４−１０１２２２号公報 「アナリティカル サイエンシズ(AnalyticalSciences)」、日本分析化学会、２００１年９月、第１７巻、ｐ．１０５５−１０５８

本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、溶媒中で酵素により反応する基質を検出し、また、当該酵素反応の進行に関わる酵素活性・酵素反応速度等の諸因子の特定を迅速・高感度かつ高精度に行なうことができ、再現性に優れており、簡便な構成の酵素センサーを作製するために使用される原材料となる基質感応膜素材を提供し、またこのセンサーを有効にするための電気化学測定系を提供することを目的とする。

前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の基質感応膜素材は、カルボキシル基含有ポリ（メタ）アクリルアミドの該カルボキシル基およびシクロデキストリンの水酸基でエステル結合している高分子化合物と、基質を反応させる酵素とが、含有されていることを特徴とする。

この素材は、酵素がこの高分子化合物によって固定化され、それの酵素固定場で酵素反応を起こし易くする疎水性の反応場が構築されるという基質感応性膜の担体を、形成するものである。

請求項２に記載の基質感応膜素材は、請求項１を限定するもので、前記シクロデキストリンが、γ−シクロデキストリンであることを特徴とする。

請求項３に記載の基質感応膜素材は、請求項１を限定するもので、前記カルボキシル基含有ポリ（メタ）アクリルアミドが、ポリ（メタ）アクリルアミドのアミド基の一部加水分解物、または（メタ）アクリルアミドと（メタ）アクリル酸との共重合物であることを特徴とする。

請求項４に記載の基質感応膜素材は、請求項１を限定するもので、前記酵素が、前記基質を酸化還元反応させるものであることを特徴とする。

請求項５に記載の基質感応膜素材は、請求項４を限定するもので、前記酵素が、チロシナーゼであることを特徴とする。

請求項６ に記載の酵素センサーは、請求項１ に記載の基質感応膜素材で電極基材上に膜状に形成され、そこに前記酵素を固定しつつ前記高分子化合物と共に露出させている基質感応膜により、被覆されている作用電極と、参照電極と、対極とを有していることを特徴とする。

この酵素センサーは、基質感応膜中の疎水性の酵素固定場で特異的な高選択的酵素反応を起こし易くし、その変化を電気信号により高感度で再現性よく検出するというものである。

請求項７ に記載の酵素センサーは、請求項６ を限定するもので、前記基質と有機溶媒とを含む溶液に、前記作用電極と、前記参照電極と、前記対極とが、浸漬されていることを特徴とする。

請求項８に記載の酵素センサーは、請求項７を限定するもので、該有機溶媒が、非プロトン性溶媒であることを特徴とする。非プロトン性溶媒は、例えばアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである。

基質感応膜素材は、酵素と、溶液中の基質とりわけ非水溶液にのみ溶解する基質との反応速度が迅速となるものである。この素材で被覆された電極を有する酵素センサーは、応答速度が迅速で、かつ高感度・高精度であり、再現性に優れるので、信頼性が高い。しかも簡便な構成であるので、製造効率が高い。

以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

基質感応膜素材は、以下のようにして調製される。

先ず、その原材料であるカルボキシル基含有ポリ（メタ）アクリルアミドは、数平均分子量２０万のポリアクリルアミドまたはポリメタクリルアミドを、部分的に加水分解することにより合成される。

高分子化合物は、重量比で２０〜1：１０〜１のカルボキシル基含有ポリ（メタ）アクリルアミドとγ−シクロデキストリンとを、エステル結合させることにより合成される。

基質感応膜素材は、高分子化合物２０〜５０重量部、および基質であるカテコールに酵素反応する酵素であるチロシナーゼ１〜２重量部を、混練することにより得られる。

この基質感応膜素材を用いた酵素センサー１は、実施例に対応する図１を参照して説明すると、以下の通りである。

酵素センサー１は、反応容器を塞ぐポリテトラフルオロエチレン製栓１６に作用電極１７と参照電極１５とが貫通したものである。容器に、カテコールのアセトニトリル溶液１０が入っている。作用電極１７と参照電極１５との先端が、反応容器内へ到達し、この溶液１０に浸漬されている。

作用電極１７は、図２に示すとおり、ポリテトラフルオロエチレン製管２３の内空の下端に、白金製基板である２ｍｍ径の白金棒２５が絞り挿入されている。その基板２５の最下端に、基質感応膜素材の塗布により形成された基質感応膜２６が０．１〜０．２ｍｍの厚さで被覆されている。この膜２６から、酵素と高分子化合物中のシクロデキストリンとが、露出し、溶液１０に接触している。一方基板２５の最上端で導線であるステンレスリード線２１が銀含有ペースト２４で接合されている。ポリテトラフルオロエチレン製管２３の内空の上端に挿入されたシリコン製栓２２から、このステンレスリード線２１が引き出されている。

参照電極１５は、図１に示すとおり、導線に繋がるＡｇ／Ａｇ^＋参照電極であり、塩橋１８を介して容器内で溶液１０に接触している。

作用電極１７と参照電極１５との導線は、検知機器に繋がっている。検知機器は、関数発生機１３・ポテンショスタット１２・Ｘ−Ｙレコーダー１１に接続されている。

基質を含有する非水溶液の少量を滴下するミクロビュレット１４がポリテトラフルオロエチレン製栓１６を貫通し、その先端の滴下孔が、溶液１０よりも上方にまで達している。また、電気化学測定セルを構成するための対極１９としての白金線がポリテトラフルオロエチレン製栓１６を貫通し、その先端が溶液１０に浸漬されている。

容器の底に、ポリテトラフルオロエチレンで磁石が被覆された撹拌子２０が、設置されている。

酵素センサー１の作用について、酵素反応機構を示す図３を参照して説明する。アセトニトリル溶液１０中で拡散しているカテコールが、基質感応膜２６から露出している酵素に接触する。すると、カテコールが酵素チロシナーゼ酸化の作用で酸化されｏ−キノンになって電極に拡散され、電極で還元される。この電極反応により電子が電気回路に流れる結果、検出機器で電圧と電流が検出される。カテコールの濃度に応じた電流が検出されるので、その量からカテコールの濃度を算出することができ、また、当該酵素反応の進行に関わる諸因子（酵素活性・酵素反応速度）の特定をすることができる。

アセトニトリル溶液のような非水溶液中のカテコールが、高感度で再現性よく検出されるメカニズムは、詳細が必ずしも明らかでないが、以下の通りであると推察される。基質感応膜にエステル結合した籠状のγ−シクロデキストリン（高分子化合物の化学構造式の模式を示す図４、γ−シクロデキストリンの化学構造式を示す図５、γ−シクロデキストリンの略立体構造を示す図６を参照）によって包接されている酵素に、カテコールが近接する結果、酵素反応を起こし易くする疎水性の反応場が形成され、チロシナーゼとの疎水的な酵素反応が迅速かつ確実に進行するためであると、考えられる。

なお、基質がアセトニトリルに溶解したカテコールの例を示したが、基質がＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解したカテキン、ピロガロール、３，４−ジヒドロキシトルエン、ドーパミンのようなジヒドロキシ芳香族化合物であっても同様である。

以下に、酵素センサーを試作した例、およびカテコールとチロシナーゼとの酵素反応をアンペロメトリーにより検討し、最大酵素反応速度とミカエリス定数とを特定した結果を、示す。

（実施例）
１．高分子化合物の調製
カルボキシル基含有ポリアクリルアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ社製：製品番号１９０９３−４）２ｇと、γ−シクロデキストリン（ナカライテスク株式会社製：製品番号１００３２−５１）０．１ｇとを、リパーゼを触媒として、ｎ−ヘプタン中、５０℃で９４時間反応してエステル結合させることにより、高分子化合物２ｇを得た（図４参照）。なお、本反応は次の文献に依拠しておこなった。H.H.Pattekhan and S. Divakar,
Indian J. Chem., Vol.41B, May 2002,pp.1025-1027.

２．基質感応膜素材の調製
この高分子化合物０．１ｇと、チロシナーゼ（ナカライテスク株式会社製：製品番号２０８−１１５３１）０．００１ｇとを、水に溶解することにより、基質感応膜素材を得た。

３．作用電極の作製
基質感応膜素材を、直径２ｍｍの白金ディスク基板に塗布し、窒素ガスで水を気化した後、シリカゲルデシケータ内で２時間乾燥することにより、厚さ約０．２ｍｍの基質感応膜で被覆された白金ディスクを得た。これを用い、図２に示すような作用電極を作製した。

４．酵素センサーの試作
この作用電極と、実験ごとに作成したＡｇ／Ａｇ^＋（対銀・銀イオン）参照電極とを用い、図１に示すような測定セルを構成した。

５．アセトニトリル中でのカテコールのアンペロメトリー
アセトニトリル中のカテコールの濃度を順次増して行き、酵素反応によって生成するカテコールの酸化物が、−０．７５Ｖ（対銀・銀イオン参照電極）に設定された作用電極の白金表面で還元される際に生じる電流を記録した。その結果を図７に示す。なお図８に比較のため、デキストリンを含まない感応膜を用いた場合のアンペロメトリーの結果を示す。図７から明らかな通り、デキストリンを含有するセンサーがその効力を保持していることが証明された。

６．カテコールのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数プロット
得られた結果から、カテコール濃度の逆数と電流値の逆数との関係をグラフにする。その結果を図９に示す。得られた直線の縦軸との接点と、横軸との接点から、それぞれ酵素反応速度因子が得られる。図９から明らかな通り、酵素反応の速度因子を精度良く、簡便に得られることが証明された。

本発明の基質感応性膜素材は、溶液、特に水不含有の溶液中の基質を検出するための酵素センサーの原材料に用いられる。これを用いた酵素センサーは、生体機能物質の酸化還元、電子移動、活性度、触媒能力等の評価に用いることができる高性能センサーであるから、新規な酵素反応系の研究開発、医薬品の研究開発に有用である。

本発明を適用する酵素センサーの実施の一例を示す概要図である。 本発明を適用する酵素センサー中の作用電極を示す側面断面図である。 本発明を適用する酵素センサーが動作する際の酵素反応機構の一例を示す図である。 本発明を適用する酵素センサーの基質感応膜素材である、カルボキシル基含有ポリアクリルアミドにシクロデキストリンをエステル結合させた高分子化合物の化学構造式の模式図である。 γ−シクロデキストリンの化学構造式を示す図である。 γ−シクロデキストリンの略立体構造を示す図である。 本発明を適用する酵素センサーを用い、アセトニトリル中のカテコールのアンペロメトリーを測定したときのチャートを示す図である。 本発明を適用する酵素センサーと同型で、基質感応膜素材にシクロデキストリンを含まない酵素センサーを用い、アセトニトリル中のカテコールのアンペロメトリーを測定したときのチャートを示す図である。 本発明を適用する酵素センサーを用いてカテコール濃度変化に伴う電流値変化を測定したときのカテコールのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数プロットを示す図である。

符号の説明

１は酵素センサー、１０は溶液、１１はＸ−Ｙレコーダー、１２はポテンショスタット、１３は関数発生機、１４はミクロビュレット、１５は参照電極、１６はポリテトラフルオロエチレン製栓、１７は作用電極、１８は塩橋、１９は対極、２０はポリテトラフルオロエチレン被覆攪拌子、２１はステンレスリード線、２２はシリコン製栓、２３はポリテトラフルオロエチレン製管、２４は銀ぺースト、２５は白金棒（２ｍｍ径）、２６は基質感応膜である。

Claims (8)

1. カルボキシル基含有ポリ（ メタ） アクリルアミドの該カルボキシル基およびシクロデキストリンの水酸基でエステル結合している高分子化合物と、基質を反応させる酵素とが、
   含有されていることを特徴とする基質感応膜素材。
2. 前記シクロデキストリンが、γ − シクロデキストリンであることを特徴とする請求項１に記載の基質感応膜素材。
3. 前記カルボキシル基含有ポリ（ メタ） アクリルアミドが、ポリ（ メタ）
   アクリルアミドのアミド基の一部加水分解物、または（ メタ） アクリルアミドと（ メタ） アクリル酸との共重合物であることを特徴とする請求項１ に記載の基質感応膜素材。
4. 前記酵素が、前記基質を酸化還元反応させるものであることを特徴とする請求項１
   に記載の基質感応膜素材。
5. 前記酵素が、チロシナーゼであることを特徴とする請求項４ に記載の基質感応膜素材。
6. 請求項１ に記載の基質感応膜素材で電極基材上に膜状に形成され、そこに前記酵素を固定しつつ前記高分子化合物と共に露出させている基質感応膜により、被覆されている作用電極と、参照電極と、対極とを有していることを特徴とする酵素センサー。
7. 前記基質と有機溶媒とを含む溶液に、前記作用電極と、前記参照電極と、前記対極とが、浸漬されていることを特徴とする請求項６
   に記載の酵素センサー。
8. 前記有機溶媒が、非プロトン性溶媒であることを特徴とする請求項７ に記載の酵素センサー。